ES2271580T3 - Utilizacion de carbamoilfosfato sintetasa 1 (cps 1) y sus fragmentos para el diagnostico de enfermedades inflamatorias. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para el reconocimiento precoz y el reconocimiento median- te diagnóstico diferencial, para el pronóstico del curso y la evaluación del grado de severidad y la evaluación del curso del tratamiento concomitante de la septi- cemia, caracterizado porque se determina en la circulación de un paciente humano la presencia y/o la cantidad de carbamoilfostato sintetasa 1 (CPS 1) y a partir de la detección y/o la cantidad de CPS 1 se extraen conclusiones con res- pecto a la existencia del curso esperado, del grado de severidad de la septicemia o del éxito de su tratamiento terapéutico.
Description
Utilización de carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS
1) y sus fragmentos para el diagnóstico de enfermedades
inflamatorias y septicemia.
La presente invención se refiere a aplicaciones
del enzima carbamoilfosfato sintetasa 1 (E.C. 6.3.4.16, de ahora en
adelante siempre abreviado como CPS 1) y nuevos fragmentos del mismo
para el diagnóstico médico de la septicemia. Se basa en la
detección por primera vez de la aparición de fragmentos del CPS 1 en
el tejido hepático de primates, en los que se generó
experimentalmente septicemia o inflamación sistémica mediante la
administración de toxinas, así como la detección final de
concentraciones de CPS 1 muy elevadas en la circulación de los
pacientes septicémicos.
La presente invención tiene su origen en
intensos trabajos de investigación del solicitante junto con otros
perfeccionamientos del diagnóstico y el tratamiento de inflamaciones
e infecciones, en especial inflamaciones de etilogía infecciosa y
septicemia.
Se designan como inflamaciones de forma general
determinadas reacciones fisiológicas de un organismo ante diversos
efectos exteriores como por ejemplo heridas, quemaduras, alergenos,
infecciones por microorganismos tales como bacterias y hongos y
virus, ante tejidos alógenos que desencadenan reacciones de rechazo,
o ante determinados estados endógenos desencadenantes de
inflamación del cuerpo, como por ejemplo en enfermedades
autoinmunes y cáncer. Las inflamaciones pueden presentarse como
reacciones del cuerpo inofensivas y localmente limitadas, pero
también son características típicas de numerosas enfermedades
crónicas y agudas graves de distintos tejidos, órganos y partes de
órganos y tejidos.
Las inflamaciones locales son por lo general
parte de la reacción inmunológica sana del cuerpo frente a efectos
perjudiciales, y con ello parte del mecanismo de defensa del
organismo que ayuda al mantenimiento de la vida. Sin embargo,
cuando las inflamaciones forman parte de una reacción errónea del
cuerpo ante determinados procesos endógenos tales como, por
ejemplo, enfermedades autoinmunes, y/o de naturaleza crónica, o si
alcanzan una determinada magnitud sistémica, como en el caso del
síndrome de inflamación sistémica (Systemic Inflammatory Response
Síndrome, SIRS), o en el caso de una septicemia grave atribuible a
causas infecciosas, se descontrolan los procesos fisiológicos
típicos de las reacciones inflamatorias y se convierten en un suceso
patológico propio, a menudo muy peligroso.
Se sabe hoy que la aparición y el curso de los
procesos inflamatorios son controlados por un número considerable
de sustancias, en su mayoría de naturaleza proteínica o peptídica, o
que vienen acompañados por la aparición, más o menos limitada en el
tiempo, de determinadas biomoléculas. Entre las sustancias endógenas
que acompañan a las reacciones inflamatorias se cuentan en especial
aquellas que pueden contarse entre las citoquinas, los mediadores,
las sustancias vasoactivas, las proteínas de fase aguda y/o los
reguladores hormonales. La reacción inflamatoria constituye una
reacción fisiológica compleja en la que participan tanto las
sustancias endógenas activadoras del proceso inflamatorio (por
ejemplo TNF-\alpha) como también sustancias
desactivadoras (por ejemplo interleu-
cina-10).
cina-10).
En las inflamaciones sistémicas como en el caso
de una septicemia o de un shock séptico, las reacciones en cascada
específicas de la inflamación se extienden de manera descontrolada a
todo el cuerpo y se vuelven, en el sentido de una respuesta inmune
excesiva, amenazantes para la vida. Para los conocimientos actuales
sobre la aparición y el posible papel de cada uno de los grupos de
sustancias endógenas específicas de la inflamación se remite, por
ejemplo, a A. Beishuizen, et al., "Endogenous Mediators in
Sepsis and Septic SOC", Advances in Clinical Chemistry, Vol. 33,
1999, 55-131; y Gabay, et al., "Acute
Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation",
The New England Journal of Medicine, Vol. 340, No. 6, 1999,
448-454. Puesto que en los últimos años ha cambiado
la comprensión de la septicemia y de las enfermedades inflamatorias
sistémicas emparentadas, y con ello también las definiciones
admitidas, se remite también a K. Reinhart, et al., "Sepsis
und septischer Schock", en Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, New Cork, 2001, 756-760; donde se da una
definición moderna del concepto de septicemia. Dentro del marco de
la presente solicitud, los conceptos de septicemia o de
enfermedades inflamatorias se utilizan basándose en las definiciones
que han podido obtenerse de las tres citas bibliográficas
anteriores.
Mientras que, al menos en el ámbito europeo, la
infección bacteriana sistémica detectable mediante un cultivo
positivo en sangre caracterizó durante mucho tiempo el concepto de
septicemia, la septicemia se entiende hoy sobre todo como una
inflamación sistémica que tiene causas infecciosas, pero que como
suceso patológico presenta grandes similitudes con las
inflamaciones sistémicas desencadenadas por otras causas. El citado
cambio en la comprensión de la septicemia se corresponde con las
modificaciones en los planteamientos diagnósticos. Así, la
detección directa de agentes patógenos bacterianos se sustituyó o
completó mediante controles complejos de parámetros fisiológicos y
en tiempo más reciente, en especial, también por la detección de
determinadas sustancias endógenas participantes en el suceso
septicémico o inflamatorio, es decir, "biomarcadores"
específicos.
Del gran número de mediadores y proteínas de
fase aguda de las que se sabe que participan en el suceso
inflamatorio, para fines de diagnóstico son apropiados en especial
aquellos cuya aparición es muy específica de las enfermedades
inflamatorias o de determinadas fases de enfermedades inflamatorias,
cuyas concentraciones varían de manera drástica y diagnósticamente
significativa y que, además, presentan las estabilidades necesarias
para las determinaciones rutinarias y que alcanzan valores de
concentración elevados. Para fines diagnósticos aparece en un primer
plano la correlación probada entre suceso patológico (inflamación,
septicemia) y el correspondiente biomarcador, sin que tenga que
conocerse su papel en la compleja cascada de sustancias endógenas
participantes en el suceso inflamatorio.
Una sustancia endógena de este tipo
especialmente adecuada como biomarcador de septicemia es
procalcitonina. La procalcitonina es una prohormona cuyas
concentraciones en suero alcanzan valores muy elevados bajo las
condiciones de una inflamación sistémica de etiología infecciosa
(septicemia), mientras que en las personas sanas prácticamente es
indetectable. Además, valores elevados de procalcitonina se alcanzan
en un estadio relativamente temprano de una septicemia, de tal
manera que la determinación de procalcitonina es adecuada también
para la detección precoz de una septicemia y para diferenciar
tempranamente una septicemia de origen infeccioso de una
inflamación grave debida a otras causas. La determinación de
procalcitonina como marcador de la septicemia es objeto de la
publicación M. Assicot, et al., "High serum procalcitonin
concentrations in patients with sepsis and infection", The
Lancet, vol. 341, No. 8844, 1993, 515-518; y las
patentes DE 42 27 454 C2 ó EP 0 656 121 B1 ó US 5,639,617. Para
completar la presente descripción se remite de manera expresa a las
citadas patentes y a la bibliografía indicada en las citadas
publicaciones.
La disponibilidad del marcador de septicemia
procalcitonina ha dado grandes impulsos a la investigación de la
septicemia y actualmente se están realizando grandes esfuerzos para
encontrar otros biomarcadores que puedan completar la determinación
de procalcitonina y/o que para fines de un diagnóstico precoz o un
diagnóstico diferencial puedan proporcionar información adicional.
Sin embargo, la búsqueda de potenciales nuevos biomarcadores de
septicemia se ve dificultada por el hecho de que a menudo se sabe
muy poco, o nada, sobre el funcionamiento exacto o los motivos
precisos de la aparición de determinadas sustancias endógenas que
participan en el suceso inflamatorio o septicémico.
Los resultados de la comprobación experimental
de un fecundo planteamiento puramente hipotético para determinar
otros potenciales marcadores de la septicemia se encuentran en DE
198 47 690 A1 ó WO 00/22439. Allí se indica que en la septicemia no
sólo aumenta la concentración de la prohormona procalcitonina, sino
que también pueden observarse concentraciones significativamente
elevadas para otras sustancias que muestran la inmunorreactividad
de la prohormona. Mientras que el fenómeno descrito está bien
documentado, se desconocen en gran medida las causas del aumento de
las concentraciones de las distintas sustancias correspondientes en
la septicemia.
En la presente solicitud se informa sobre un
resultado de otro fecundo planteamiento puramente hipotético para
la búsqueda de otras biomoléculas específicas de la inflamación o de
la septicemia. También estos estudios experimentales parten de la
determinación de procalcitina en relación con reacciones
inflamatorias sistémicas de etiología infecciosa. Así, pronto se
observó que en la septicemia la procalcitonina evidentemente no se
forma de la misma manera que cuando es precursor de la hormona
calcitonina. Se observaron así niveles altos de procalcitonina
incluso en pacientes a los que se les había extirpado el tiroides.
Por ese motivo, el tiroides no puede ser el órgano en el que se
forma o se vierte la procalcitonia en la septicemia. En las
publicaciones H. Redl, et al., "Procalcitonin release
patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to
cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28. No. 11,
3659-3663; y H. Redl, et al.,
"Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis
1998; 2:243-253; se informa sobre los resultados de
estudios experimentales que deberían servir para aclarar la
formación de procalcitonina en la septicemia. En los citados
trabajos se genera mediante la administración de endotoxinas una
septicemia artificial en primates (papiones) y se determina en qué
estados generados experimentalmente se alcanzan las mayores
concentraciones de procalcitonina en sangre. Un perfeccionamiento
del modelo de experimento animal descrito en los mencionados
trabajos sirve, dentro del marco de la presente solicitud, para
determinar biomarcadores endógenos específicos de la septicemia de
naturaleza péptica o proteínica cuya aparición es característica de
la septicemia o de determinadas formas de la septicemia y que, por
consiguiente, hacen posible un diagnóstico específico de la
septicemia. Por ese motivo, debido a la gran similitud de la
fisiología de primates y seres humanos y a la elevada reactividad
cruzada con muchos reactivos humanos terapéuticos y diagnósticos,
se eligió el modelo de primates.
Ya que las sustancias formadas en las
inflamaciones son parte de las complejas reacciones en cascada del
cuerpo, las sustancias de este tipo no son sólo además de interés
diagnóstico sino que en la actualidad se intenta, con grandes
esfuerzos, intervenir terapéuticamente en el suceso inflamatorio
influyendo sobre la formación y/o la concentración de sustancias
individuales de este tipo para detener lo antes posible la extensión
de la inflamación sistémica observada, por ejemplo, en la
septicemia. En este sentido deben considerarse también como
objetivos terapéuticos potenciales las sustancias endógenas que
participan de manera demostrable en el suceso inflamatorio. A pesar
de los resultados hasta la fecha bastante decepcionantes de los
planteamientos terapéuticos de este tipo, sigue teniendo un gran
interés identificar biomoléculas endógenas lo más específicas
posible de la inflamación o la septicemia no descritas hasta la
fecha en ese contexto, que también como objetivos terapéuticos abren
nuevas perspectivas de éxito para el control terapéutico de la
septicemia.
La presente invención se basa en que en primates
y en seres humanos durante la septicemia pueden detectarse en la
circulación concentraciones claramente elevadas del enzima
carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1), así como fragmentos del mismo,
y en concreto a diferencia de individuos de control no tratados o
personas sanas en los que no se encontraron, lo cual hace del CPS 1
que sea adecuado para el diagnóstico de la septicemia.
Los procedimientos diagnósticos in vitro,
que son accesibles debido a la aparición constatada de CPS 1 y sus
fragmentos en la simulación experimental de la septicemia, así como
a la detección de concentraciones de CPS 1 - inmunorreactividad
claramente elevadas en sueros de septicémicos, se reivindican en las
reivindicaciones 1 a 10.
Tal como se explicará a continuación con más
detalle en la parte experimental, el punto de partida de la
invención fue la comprobación de que después de desencadenar
experimentalmente una septicemia artificial en papiones mediante la
administración de endotoxinas (LPS de Salmonella Typhimurium)
y el tratamiento electroforético bidimensional en gel del tejido
hepático de los animales tratados, pudo encontrarse un grupo de
spots de proteína vecinos identificables sólo en los animales
tratados. Los productos proteínicos correspondientes a los spots
con masas molares (determinadas mediante electroforesis en gel) de
aproximadamente 68 kDa, 69 kDa y 70 kDa \pm 3 kDa se aislaron a
partir del gel de electroforesis, se analizaron mediante
espectrometría de masas y se identificaron como fragmentos solubles
de CPS 1.
A continuación, utilizando un inmunoensayo que
reconocía los citados fragmentos, se constató que en la circulación
de los pacientes septicémicos se encontraron en concentraciones muy
elevadas componentes con inmunorreactividad de estos fragmentos,
resultando ser estos componentes en una identificación más precisa
(entre otras cosas, separación y determinación del peso molecular),
al menos en su mayoría, enzima CPS 1 completa o como mínimo casi
completa.
En el análisis por espectrometría de masas de
tres spots de proteína aislados del gel, que como tales presentaban
una intensidad relativamente baja, mediante espectrometría de masas
en tándem a partir de los tres spots de proteína se identificaron
secuencias parciales de péptidos cortas y parcialmente idénticas
("tags") que en forma idéntica volvieron a encontrarse en la
secuencia del CPS 1 humano (SEQ ID NO: 6), comprendiendo los
péptidos identificados de manera concreta secuencias de aminoácidos
de la zona N-terminal del aminoácido CPS 1 hasta
la posición 624 del CPS 1 (SEQ ID NO: 6).
Debido a la identidad de los fragmentos
identificados mediante espectrometría de masas con las secuencias
parciales procedentes de la parte N-terminal del CPS
1, la identificación de los spots de proteína analizados como
fragmentos de CPS 1 se considera unívoca según criterios
reconocidos.
La identificación de las proteínas, encontradas
en el tejido hepático de papiones sólo después de provocar
septicemia o inflamación, como fragmentos de la parte
N-terminal del CPS 1 tiene un gran interés
científico, diagnóstico y terapéutico.
La posterior demostración de que en la
circulación de los pacientes septicémicos humanos se observan
concentraciones fuertemente elevadas de una o varias especies con
la inmunorreactividad de los fragmentos de CPS 1 identificados, que
no obstante resultaron ser la enzima CPS 1 completa o al menos
esencialmente completa y que eventualmente puede haber también una
forma solubilizada especial, incrementa el valor de los primeros
hallazgos descritos.
Hasta la fecha, el CPS 1 o los fragmentos de CPS
1 no han desempeñado prácticamente ningún papel en el diagnóstico
médico. No obstante, el enzima CPS 1 (E.C. 6.3.4.16) mismo es bien
conocido desde hace tiempo. Cataliza la transformación de amoniaco,
bicarbonato y 2 ATP formando carbamoilfosfato en la primera etapa
del ciclo de la urea. Desempeña también un determinado papel en la
biosíntesis de la arginina que, por su parte, es un sustrato para la
biosíntesis de NO, por ejemplo en caso de un shock por endotoxinas
(véase Shoko Tabuchi et al., Regulation of Genes for
Inductible Nitric Oxide Synthase and Urea Cycle Enzymes in Rat Liver
in Endotoxin SOC, Biochemical and Biophysical Research
Communications 268, 221-224 (2000)). El CPS 1 debe
diferenciarse del enzima citosólico CPS 2 (E.C. 6.3.5.5) que
igualmente desempeña un papel en el ciclo de la urea, aunque trata
el sustrato glutamina. Se sabe que CPS 1 está localizado en las
mitocondrias y que en el tejido hepático está presente en esta forma
en grandes cantidades (supone aproximadamente el
2-6% de la proteína total del hígado). Su secuencia
de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) y su localización genética se conocen
desde hace tiempo (véase Haraguchi Y. et al., Cloning and
sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I:
molecular análisis of hyperammonemia, Gene 1991, Nov. 1; 107 (2):-
335-340). Acerca de su papel fisiológico puede
remitirse a artículos de revisión tales como por ejemplo H.M. Holder
et al., Carbamoyl phosphate synthetase: an amazing
biochemical odyssey from substrate to product, CMLS, Cell.Mol.Life
Sci. 56 (1999) 507-522 y la bibliografía allí
referenciada, así como a la introducción de la publicación de Mikiko
Ozaki et al., Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay of Carbamoylphosphate Synthetase I: Plasma Enzyme in Rat
Experimental Hepatitis and Its Clearance, Enzyme Protein 1994,
95:48:213-221.
En un trabajo de Ardawi M S M en: Clinical
Science (1992) 82, 709-716 se estudia el cambio de
actividad de los enzimas hepáticos en ratas septicémicas. Allí se
analizan por un lado los cambios en la concentración de metabolitos
formados por los enzimas hepáticos en la sangre de ratas. Se analizó
la actividad de los enzimas del ciclo de la urea tal como CPS 1 en
el tejido hepático. No se describió la aparición de CPS 1 o una
determinación de CPS 1 en la circulación.
Según Shojo Tabuchi et al., loc.cit., en
los hígados de rata con shock de endotoxina (LPS) artificial no se
observa ningún aumento del enzima (proteína). Según Li Yin et
al., Participation of different cell types in the restitutive
response of the rat liver to periportal injury induced by allyl
alcohol, Journal of Hepatology 1999, 31: 497-507,
en una lesión hepática provocada por alcohol alílico se observó en
los análisis histológicos, al cabo de tres días, un aumento de la
expresión de CPS 1 en todos los hepatocitos.
Se demostró además que en el modelo de ratas, en
caso de una hepatitis aguda generada experimentalmente mediante la
administración de galactosamina se encuentra en el plasma de las
ratas una actividad inmunológica del CPS 1 fuertemente incrementada
(verificado con un ELISA con IgG anti-CPS 1 de rata
procedente de conejos) y en concreto 24-48 h
después del tratamiento con la galactosamina desencadenante de la
hepatitis. Durante la hepatitis aguda se reconoce en el plasma de
rata también un aumento de los fragmentos de CPS 1 con masas molares
de aproximadamente 140 y 125 kDa, sin ninguna otra caracterización
más precisa (asignación de secuencias), mientras que en un análisis
concomitante por inmuno-blotting en muestras humanas
procedentes de autopsia no pudieron observarse fragmentos de CPS 1
con inmunorreactividad CPS 1 (Mikiko Ozaki et al., loc.
cit.).
A partir de los hallazgos en la bibliografía no
puede deducirse una idoneidad del CPS 1 esencialmente completo y de
los fragmentos de CPS 1 solubles, en especial de los fragmentos con
masas molares de 68-70 kDa \pm 3 kDa procedentes
de la parte N-terminal del CPS 1, como biomarcadores
para el diagnóstico de inflamaciones y de la septicemia en seres
humanos, que puedan determinarse en el suero o plasma humanos.
Debido al aumento demostrado en la formación del
CPS 1 humano en la septicemia, y de fragmentos de CPS 1 en papiones
con una septicemia generada experimentalmente, y concretamente a
diferencia de pacientes o animales sanos o sin tratar en cuya
circulación o el tejido hepático no se detectaron fragmentos de este
tipo, a pesar de un tratamiento y almacenamiento idénticos, el CPS
1 y sus fragmentos son adecuados para fines diagnósticos. Si para
la detección según un procedimiento inmunodiagnóstico en sí conocido
se necesitan CPS 1 y sus fragmentos como reactivos o para generar
determinados anticuerpos específicos, los fragmentos se fabrican
sintéticamente o por tecnología genética como productos de
recombinación según procedimientos que se encuentran al estado
actual de la técnica.
Además, los fragmentos de CPS 1 necesarios
pueden utilizarse también, según procedimientos conocidos del estado
moderno de la técnica, para producir anticuerpos monoclonales o
policlonales específicos que son adecuados como medios auxiliares
para la determinación diagnóstica de los péptidos según la invención
y/o también como potenciales remedios terapéuticos. La producción de
anticuerpos monoclonales o policlonales apropiados contra secuencias
parciales de péptidos conocidas forma parte del estado actual de la
técnica.
En la determinación de CPS 1 o fragmentos de CPS
1 en sueros de pacientes puede procederse fundamentalmente del modo
descrito, por ejemplo para la determinación selectiva de
procalcitonina, en P. P. Ghillani, et al., "Monoclonal
antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene
products", The Journal of Immunology, vol. 141, No. 9, 1988,
3156-3163; y P. P. Ghillani, et al.,
"Identification and Measurement of Calcitonin Precursors in Serum
of Patients with Malignant Diseases", Cancer research, vol. 49,
No. 23, 1989, 6845-6851; remitiéndose de manera
expresa y como complemento también a las técnicas de inmunización
allí descritas, que constituyen una posibilidad para la obtención
de anticuerpos monoclonales también contra secuencias parciales del
CPS 1. Las variaciones de las técnicas descritas y/o otras técnicas
de inmunización las puede obtener el técnico de obras estándar y
publicaciones pertinentes y utilizarlas en consecuencia. Un
inmunoensayo preferido para la determinación de CPS 1 en líquidos
biológicos humanos, en especial plasma o suero humanos, se
describirá a continuación en la parte experimental, junto con los
resultados de medición allí obtenidos y la caracterización más
precisa de los productos analizados detectados.
Como utilización en el sentido de la presente
solicitud debe considerarse también una utilización de CPS 1 o
fragmentos de CPS 1 solubles como componentes (reactivos) de un kit
de ensayo, o una utilización para producir componentes del ensayo,
por ejemplo anticuerpos policlonales o monoclonales que están
previstos por lo general también, por ejemplo, en forma
inmovilizada y/o marcada en los kits de ensayo.
Hay que citar también de manera expresa la
producción de anticuerpos CPS 1 aplicando técnicas de la
inmunización genética directa con ADN. Cae dentro del marco de la
presente invención utilizar para la inmunización, por ejemplo, un
ADNc de CPS 1 o fragmentos del CPS 1 deseado, ya que se ha
demostrado en el pasado que mediante las técnicas de inmunización
de este tipo se puede ampliar el espectro de anticuerpos que pueden
obtenerse.
Se señala además expresamente que en la
determinación según la invención de CPS 1 o fragmentos de CPS 1
procedentes de la parte N-terminal de la secuencia
de CPS 1, según el diseño del ensayo también puede suceder que se
determinen solos o conjuntamente, por ejemplo, otras porciones más
largas de CPS 1 soluble que eventualmente estén presentes al mismo
tiempo en el líquido biológico y que contienen estos fragmentos, o
también formas del CPS 1 completo (que normalmente está localizado
en las mitocondrias) presentes en forma soluble. También los
procedimientos de este tipo deben entenderse, en el sentido de la
presente invención, como procedimientos según la invención para
determinar CPS 1 o fragmentos de CPS 1.
Basándose en estos resultados, el CPS 1 según
SEQ ID NO: 6 o formas solubles del mismo o péptidos parciales
solubles del mismo, por ejemplo los que contienen o están
constituidos por una de las secuencias parciales de SEQ ID NO: 1
hasta SED ID NO: 5 y/o otras secuencias parciales del extremo N de
CPS 1, pueden servir de péptidos marcadores específicos
(biomarcadores) para la detección diagnóstica y para controlar el
curso de inflamaciones e infecciones (en particular, como
procalcitonina, también de infecciones sistémicas del tipo de la
septicemia).
La determinación del CPS 1 en la circulación
puede producirse para fines diagnósticos, en determinadas
circunstancias también indirectamente como determinación de una
actividad enzimática que equivale a la actividad del CPS 1 o la
actividad residual de los fragmentos de CPS 1.
Es posible, además, realizar con otros
marcadores la determinación de CPS 1 y/o fragmentos de CPS 1 como
marcadores pronósticos y marcadores para controlar el curso de la
enfermedad de inflamaciones, en especial de inflamaciones
sistémicas, y de septicemia en el marco de una medición
combinada.
Junto a una combinación con una medición de
procalcitonina puede tomarse en consideración especialmente una
combinación de la medición de CPS 1 con la determinación de otros
marcadores para septicemia e inflamaciones sistémicas, y
concretamente en especial con CA 19-9, CA 125, S100B
o proteínas S100A partícipes en la regulación de inflamaciones, o
con la determinación de los nuevos marcadores de septicemia
inflamina (DE 101 19 804.3) y CHP (DE 101 31 922.3), descritos en
la solicitud de patente alemana del solicitante de fecha anterior no
publicada y que se mencionará más adelante, de la proteína
LASP-1 y/o con la determinación de fragmentos
solubles de citoqueratina, en especial de los recientemente
descubiertos fragmentos solubles de citoqueratina 1 (sCY1F; DE 101
30 985.6) así como los conocidos marcadores de tumores
CYFRA-21 o TPS y/o una o más de las prohormonas
antes mencionadas. También puede haber prevista una determinación
simultánea del conocido parámetro de la inflamación proteína
c-reactiva (CRP). Debido a estos nuevos resultados
descritos en esta y en otras solicitudes análogas del solicitante,
para el diagnóstico fino de la septicemia puede considerarse en
general, además, una combinación con mediciones de biomoléculas
conocidas o por descubrir que sean adecuadas como marcadores de
inflamación específicos de tejidos u órganos.
La determinación de CPS 1 realmente dicha puede
producirse de cualquier modo apropiado, en sí conocido,
prefiriéndose los inmunensayos de un diseño de ensayo adecuado.
En una forma de realización preferida, la
determinación por inmunodiagnosis se realiza como inmunoensayo
heterogéneo de tipo sándwich, en el que el anticuerpo se inmoviliza
en una fase sólida cualquiera, por ejemplo las paredes de un tubo de
ensayo revestidas (por ejemplo de poliestirol; "Coated Tubes";
CT) o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestirol, o en
partículas, por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro
anticuerpo lleva un resto que constituye una etiqueta directamente
detectable o que permite un enlace selectivo con una etiqueta y que
sirve para la detección de las estructuras de tipo sándwich
formadas. También es posible una inmovilización posterior o
retrasada temporalmente utilizando fases sólidas apropiadas.
Pueden aplicarse fundamentalmente todas las
técnicas de marcaje utilizables en los ensayos del tipo citado,
entre las que se cuentan los marcajes con radioisótopos, enzimas,
etiquetas de fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia
y marcajes cromáticos detectables ópticamente de manera directa,
como por ejemplo átomos de oro y partículas de colorante como los
que se utilizan en especial para los llamados
Point-of-Care (POC) o tests
rápidos. Los dos anticuerpos pueden presentar también, en el caso de
inmunoensayos heterogéneos de tipo sándwich, piezas de un sistema
de detección del tipo descrito a continuación en relación con los
ensayos homogéneos.
Por consiguiente, está dentro del marco de la
presente invención configurar el procedimiento según la invención
también como test rápido.
El procedimiento según la invención puede
configurarse, además, como procedimiento homogéneo en el que los
complejos de tipo sándwich formados a partir de los dos anticuerpos
y el CPS 1 que hay que detectar permanecen suspendidos en la fase
líquida. En un caso de este tipo se prefiere marcar ambos
anticuerpos con piezas de un sistema de detección que entonces,
cuando ambos anticuerpos se integran en un único sándwich, permite
generar o desencadenar una señal. Las técnicas de este tipo pueden
configurarse especialmente como procedimientos de detección por
intensificación o por atenuación de la fluorescencia. Un
procedimiento de este tipo especialmente preferido se refiere a la
utilización de reactivos detectores que deben utilizarse por pares,
tal como se describen por ejemplo en
US-A-4 822 733,
EP-B1-180 492 ó
EP-B1-539 477 y el estado actual de
la técnica allí citado. Permiten una medición, que comprende
selectivamente sólo productos de reacción que contienen ambos
componentes de marcaje en un único inmunocomplejo, directamente en
la mezcla de reacción. Como ejemplo se remite a la tecnología
ofrecida bajo las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate
Emisión) o KRYPTOR®, que ponen en práctica las teoría de las
solicitudes antes mencionadas.
El contenido de las citadas solicitudes más
antiguas del solicitante debe considerarse, tomando referencia
expresa a esta solicitudes, como parte de la exposición de la
presente solicitud.
La localización e identificación de los
fragmentos de CPS 1, así como la determinación de sustancias con la
inmunorreactividad de estos fragmentos en la circulación humana, que
después resultan ser el enzima CPS 1 al menos esencialmente completo
o una forma soluble del mismo, se describirán continuación con más
detalles, tomándose como referencia el protocolo de secuencias
adjunto. Las figuras muestran:
Fig. 1 Vistas de geles de electroforesis
bidimensional que permiten comparar los modelos de spot de proteínas
citoplasmáticas de hepatocitos de un papión sano (A) con las
proteínas de los hepatocitos de un papión 5h después de una
septicemia (B) inducida mediante administración de LPS. La flecha
muestra las posiciones de los tres productos específicos de la
septicemia según la invención (fragmentos de CPS 1), que en la
representación (B) se resaltan mediante un círculo.
Fig. 2 Los resultados de la medición de la
inmunorreactividad de CPS 1 en plasmas de personas normales sanas y
pacientes con septicemia con un inmunoensayo descrito con más
exactitud en la parte experimental, indicando la línea discontinua
el límite inferior de detección del test.
Fig. 3 Bandas de Western-Blot de
muestras de plasma utilizando antisueros anti-CPS.
Se aplicaron (panel A) muestras de personas normales
(N1-N3) y pacientes septicémicos
(S1-S3). Para la detección de CPS 1 se utilizó una
mezcla de antisueros frente a dos epítopos CPS 1 definidos (Pos.
184-199 y 245-257 del CPS 1 según
SEQ ID NO: 6). La especificidad de la reacción se verificó incubando
previamente en un segundo planteamiento (panel B) los antisueros con
un exceso de péptidos que se habían utilizado para la inmunización o
la obtención de antisueros. Se muestran las posiciones de los
marcadores de peso molecular.
Fig. 4 Un inmunocromatograma de CPS 1 de una
cromatografía de filtración de gel de plasma de septicemia. Se
cromatografiaron 100 \mul de un plasma septicémico sobre una
columna de Bio-Sil SEC-400HPLC. Se
recogieron fracciones de 1 ml cada una y se midió la
inmunorreactividad CPS-1 de cada una de las
fracciones. Se indican las posiciones de estándares de magnitud que
se cromatografiaron en una carrera separada.
Basándose en los ensayos realizados con papiones
para estimular el vertido de procalcitonina mediante inyecciones de
endotoxinas (véase H. Redl, et al., "Procalcitonin release
patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to
cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28. No. 11,
3659-3663; y H. Redl, et al.,
"Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis
1998; 2:243-253) se administraron por vía
intravenosa a papiones (machos, aproximadamente 2 años de edad, 27
a 29 kg de peso) 100 \mug LPS (lipopolisacárido de Salmonella
Typhimurium, fuente de referencia: Sigma) por kg de peso
corporal a cada uno. Entre 5 y 5,5 h después de la inyección se
sacrificaron los animales inyectándoles por vía intravenosa 10 ml de
Doletal. Dentro de los 60 minutos posteriores a su muerte se
disecaron todos los órganos/tejidos y se estabilizaron por
congelación en nitrógeno líquido.
En el tratamiento posterior se mezclaron
muestras de los distintos tejidos ultracongelados (1 g), bajo
enfriamiento con nitrógeno, con 1,5 ml de tampón A (50 nM Tris/HCl,
pH 7,1, 100 mM KCl, 20% glicerol) y se pulverizaron en un mortero
de porcelana hasta convertirlos en harina (véase J. Klose,
"Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and
Human for 2-D Electrophoresis", en: Methods in
Molecular Biology, Vol. 112: 2-D Proteome Análisis
Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Después de una posterior
centrifugación de 1 hora a 100.000 g y +4ºC, se recogió el
sobrenadante obtenido y se almacenó a -80ºC hasta su
tratamiento.
Puesto que los ensayos con las muestras
anteriormente obtenidas habían dado por resultado que las mayores
cantidades de procalcitonina se encontraran en el tejido hepático de
animales tratados, para buscar nuevos biomarcadores específicos de
la septicemia se trabajó con extractos de proteína procedentes de
hígado de papión.
Dentro del marco de un análisis del proteoma se
utilizaron extractos de proteína citoplasmática de hepatocitos de
papiones sanos (controles) por un lado y por otro lado de papiones a
los que se había inyectado LPS. En la electroforesis bidimensional
preliminar de análisis en gel se ajustó extracto de hígado
conteniendo 100 \mug de proteína con 9M urea, 70 mM DTT y 2%
Ampholyt pH 2-4, y después se separó mediante
electroforesis bidimensional de análisis en gel tal como se
describe en J. Klose, et al.
"Two-dimensional electrophoresis of proteins: An
updated protocol and implications for a functional analysis of the
genome", Electrophoresis 1995, 16, 1034-1059. La
visualización de la proteína en el gel de electroforesis
bidimensional se realizó mediante tinción con plata (véase J.
Heukeshoven, et al., "Improved silver staining procedure
for fase staining in Phast-System Development Unit.
I. Staining of sodium dodecyl gels", Electrophoresis 1988, 9,
28-32.
Para la evaluación se compararon las muestras de
spot de proteínas de las muestras de animales sin tratar con las
muestras de spot de proteínas resultantes de las muestras de tejido
hepático de animales tratados. Para más estudios analíticos se
seleccionaron sustancias que no aparecían en ninguna muestra de
control pero sí en todos los animales tratados. La Figura 1 muestras
una comparación de los geles de electroforesis bidimensional para
una muestra de control (A) y una muestra de un animal tratado (B),
destacándose mediante una flecha y un círculo tres spots adicionales
de proteína en (B) con masas molares de aproximadamente 68 kDa, 69
kDa y 70 kDa (\pm 3 kDa) y puntos isoeléctricos de aproximadamente
6,0, 5,8 y 5,6 respectivamente.
Las nuevas proteínas específicas identificadas
en las muestras de spots de proteína de la electroforesis
bidimensional en gel se prepararon después por medio de
electroforesis bidimensional en gel preparativa, utilizando 350
\mug de proteína (véase de nuevo (10)). En la electroforesis
bidimensional en gel preparativa la tinción se realizó por medio de
Coomassie Brilliant Blue G250 (véase Neuhoff, et al.,
"Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including
isoelectric focusing gels with clear background at nanogram
sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G250 and
R-250", Electrophoresis 1988, 9,
255-262).
Los spots de proteína preseleccionados para el
análisis posterior se recortaron del gel.
Utilizando los métodos descritos en A. Otto,
et al., "Identification of human myocardial proteins
separated by two-dimensional electrophoresis using
an effective sample preparation for mass spectrometry",
Electrophoresis 1996, 17, 1643-1650, se digirieron
con tripsina los spots de proteína y después se analizaron mediante
espectromicroscopía de masas empleando análisis espectrométricos de
masas tal como se describen y discuten, por ejemplo, en G.
Neubauer, et al., "Mass spectrometry and
EST-databases searching allows characterization of
the multi-protein spliceosome complex", en:
nature genetics vol. 20, 1998, 46-50; J. Lingner,
et al., "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic
Subunit of Telomerase", en: Science, Vol. 276, 1997,
561-567; M. Mann, et al., "Use of mass
spectrometry-derived data to annotate nucleotide and
protein sequence databases", en: TRENDS in Biochemical Sciences,
Vol. 26, 1, 2001, 54-61.
Fragmentos de la digestión con tripsina de los
tres spots de proteína se sometieron, después de un ESI
(ElectroSprayIonisierung), también a una espectrometría de masas en
tándem. Se utilizó un espectrómetro de masas Q-TOF
con una fuente de iones denominada
nanoflow-Z-Spray de la empresa
Micromass, R.U. Se trabajó conforme a las instrucciones de trabajo
del fabricante del aparato.
Tal como se muestra en las Figuras 1(A) y
1(B), en los extractos de hepatocitos de papiones a los que
se administró una inyección de LPS se encuentran, entre otros, tres
nuevos spots de proteína para los que se estimaron, basándose en
los datos de la electroforesis en gel comparados con sustancias
marcadoras de peso molecular conocido, pesos moleculares de
aproximadamente 68 kDa, 69 kDa y 70 kDA (\pm 3 kDa), mientras que
a partir de la posición relativa de las proteínas procedentes de la
primera dimensión se calcularon puntos isoeléctricos
correspondientes de aproximadamente 6,0, 5,8 y 5,6 respectivamente,
es decir, puntos isoeléctricos en el rango de aproximadamente 5,5 a
6,1.
Estas proteínas se analizaron mediante
espectrometría de masas del modo anteriormente descrito.
A partir de los "espectros madre" de las
tres proteínas digeridas con tripsina se identificaron fragmentos
individuales ("tags") mediante espectroscopia de masas en
tándem. Los espectros de masa obtenidos para estos fragmentos
pudieron evaluarse aritméticamente de un modo en sí conocido y
dieron los siguientes resultados (desde el punto de vista de la
espectrometría de masas no es posible diferenciar entre los
aminoácidos leucina (L) e isoleucina (I) así como entre los
aminoácidos lisina (K) y glutamina (Q); las secuencias siguientes
tienen en consideración, por lo tanto, la asignación al espectro
conocido del CPS 1 completo según SEQ ID NO: 6):
Spot de proteína a 70 kDa (\pm 3 kDa):
Fragmento 70/1: | GQNQPVLNITN | (SEG ID NO: 1) |
Fragmento 70/2: | NQPVLNI | (SEG ID NO: 2) |
Fragmento 70/3: | AQTAHIVLEDGTK | (SEG ID NO: 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Spot de proteína a 69 kDa (\pm 3 kDa):
Fragmento 69/1: | GQNQPVLNITN | (SEG ID NO: 1) |
Fragmento 69/2: | TAHI | (SEG ID NO: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
Spot de proteína a 68 kDa (\pm 3 kDa):
Fragmento 68/1: | NQPVLNI | (SEG ID NO: 2) |
Fragmento 68/2: | AFAMTNQILVEK | (SEG ID NO: 5) |
Las anteriores secuencias parciales según SEQ ID
NO: 1 a SEQ ID NO: 5 pudieron identificarse como secuencias
parciales de la secuencia del CPS 1 humano, que se encuentra en
NiceProt View of SWISS PROT: P31327, con una cadena de aminoácidos
de una longitud de 1500 aminoácidos y una correspondiente masa molar
aritmética (sin tener en cuenta eventuales modificaciones
posteriores a la traducción) de 164,939 kDa (SEQ ID NO: 6). Se
obtuvo la siguiente asignación de los péptidos parciales:
SEQ ID NO: 1 | aminoácidos 317 - 327 |
SEQ ID NO: 2 | aminoácidos 319 - 325 |
SEQ ID NO: 3 | aminoácidos 43 - 55 |
SEQ ID NO: 4 | aminoácidos 45 - 48 |
SEQ ID NO: 5 | aminoácidos 613 - 624 |
Los aminoácidos encontrados abarcan una sección
desde los aminoácidos 43 a los aminoácidos 624, es decir, una parte
esencial de la porción amino-terminal del CPS 1.
Completando habría que señalar que las
secuencias encontradas no pueden asignarse al enzima citosólico CPS
2 emparentado.
Deducido a partir de la secuencia de aminoácidos
conocida del CPS 1 humano se eligieron dos zonas (Pos.
184-199: zona 1 del péptido; SEQ ID NO: 7; Pos.
245-257: zona 2 del péptido; SEQ ID NO: 8).
Completado cada uno en un resto de cisteína
N-terminal, ambas zonas se sintetizaron químicamente
como péptidos solubles según procedimientos estándar, se depuraron,
se controló su calidad mediante espectrometría de masas y Reversed
Phase HPLC y se liofilizaron en alícuotas (empresa JERINI AG,
Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos
son:
Péptido PCEN17: | CEFEGQPVDFVDPNKQN | SED ID NO: 7 |
Péptido PCVD14: | CVPWNHDFTKMEYD | SED ID NO: 8 |
El material estándar recombinante se obtuvo de
la empresa In Vivo GMBH (Henningsdorf, Alemania). Se trataba
de un extracto celular crudo de una cepa de E. coli, que
exprimió la zona N-terminal recombinante de CPS 1
humano (Pos. 1-640 de SEQ ID NO: 6), completado en
un strep-tag N-terminal. Se atribuyó
al extracto una concentración arbitraria de CPS 1.
Mediante MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)
se conjugaron los anteriores péptidos
PCEN17 y PCVD14 en la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (véanse las instrucciones de trabajo "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers", empresa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Con estos conjugados se inmunizaron ovejas según el siguiente esquema: cada oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado (los datos sobre masas se refieren a la porción de péptido del conjugado) y a continuación 4 veces por semana 50 \mug de conjugado (los datos sobre masas se refieren a la porción de péptido del conjugado). Comenzando el cuarto mes después del inicio de la inmunización se extrajeron a cada oveja 4 veces por semana 700 ml de sangre y de ellas se obtuvo antisuero por centrifugación. Las conjugaciones, las inmunizaciones y la obtención de antisueros los realizó la empresa MicroPharm, Carmarthenshire, R.U.
PCEN17 y PCVD14 en la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (véanse las instrucciones de trabajo "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers", empresa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Con estos conjugados se inmunizaron ovejas según el siguiente esquema: cada oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado (los datos sobre masas se refieren a la porción de péptido del conjugado) y a continuación 4 veces por semana 50 \mug de conjugado (los datos sobre masas se refieren a la porción de péptido del conjugado). Comenzando el cuarto mes después del inicio de la inmunización se extrajeron a cada oveja 4 veces por semana 700 ml de sangre y de ellas se obtuvo antisuero por centrifugación. Las conjugaciones, las inmunizaciones y la obtención de antisueros los realizó la empresa MicroPharm, Carmarthenshire, R.U.
En un procedimiento de 1 paso se prepararon los
anticuerpos específicos del péptido que se habían obtenido
partiendo del cuarto mes después de la inmunización.
Primero se acoplaron los péptidos PCEN17 y
PCVD14 a gel Sulfo-Link (véanse las instrucciones
de trabajo "SulfoLink Kit", empresa PIERCE, Rockford, IL,
EE.UU.). Para cada uno de los acoplamientos se utilizaron 5 mg de
péptido por cada 5 ml de gel.
La depuración por afinidad de anticuerpos
específicos del péptido a partir de antisueros de oveja frente a
ambos péptidos, se realizó de la siguiente manera:
Las columnas de péptido se lavaron tres veces de
manera alterna con 10 ml de tampón de elución (50 mM ácido cítrico,
pH 2.2) y de tampón de enlace (100 mM fosfato sódico, 0,1% Twenn, pH
6.8). Se filtraron 100 ml de los antisueros por 0,2 \mum y se
mezclaron con el material existente en las columnas. Se lavó
entonces cuantitativamente el gel con 10 ml de tampón de enlace
procedente de la columna. La incubación se realizó durante la noche
a temperatura ambiente y con basculamiento. Los preparados se
llevaron cuantitativamente a columnas vacías (NAP 25, Pharmacia,
vaciados). Se eliminaron las cantidades pasadas. Finalmente se lavó
con 250 ml de tampón de enlace para eliminar cualquier proteína
(contenido en proteínas del eluado de lavado < 0,02 A280 nm). En
las columnas lavadas se añadió tampón de elución y se recogieron
fracciones de 1 ml cada una. De cada fracción se determinó el
contenido en proteína mediante el método BCA (véanse las
instrucciones de trabajo, empresa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Se
hizo un pool con las fracciones con una concentración de
proteían> 0,8 mg/ml. Después de la determinación de la proteína
del pool resultaron por el método BCA rendimientos de 27 mg para el
anticuerpo anti-PCEN17 y 33 mg para el anticuerpo
anti-PCVD14.
A través de una columna de filtración en gel
NAP-5 (Pharmacia) se cambió el tamponado de 500
\mul del anticuerpo anti-PCEN17 depurado (véase
arriba) en 1 ml de 100 mM tampón de fosfato potásico (pH 8.0) según
las instrucciones de trabajo. La determinación de la concentración
de proteína de la solución de anticuerpos dio un valor de 1,5
mg/ml.
Para el marcado con quimioluminiscencia del
anticuerpo se mezclaron 67 \mul de la solución de anticuerpos con
10 \mul de
MA70-Akridinium-NHS-Ester
(1 mg/ml; empresa HOECHST Behring) y se incubaron 15 minutos a
temperatura ambiente. Se añadieron después 423 \mul de 1 M glicina
y se incubó otros 10 minutos. Finalmente se cambió el tamponado del
preparado de marcado a través de una columna de filtración en gel
NAP-5 (Pharmacia) en 1 ml de medio de paso A (50 mM
fosfato potásico, 100 mM NaCl, pH 7.4) según las instrucciones de
trabajo y se eliminaron los componentes de bajo peso molecular.
Para separar los últimos restos de etiquetas no ligadas a
anticuerpos se realizó una HPLC-filtración en gel
(columna: Waters Protein Pak SW300). Se aplicó la muestra y se
cromatografió a una velocidad de flujo de 1 ml/min con medio de paso
A. Con un fotómetro de flujo se midieron las longitudes de onda 280
nm y 368 nm. La proporción de absorción 368 nm/280 nm como medida
del grado de marcaje del anticuerpo fue de 0.10 en el pico. Se
recogieron las fracciones conteniendo anticuerpos monómeros (tiempo
de retención 8-10 min) y se reunieron en 3 ml de
fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, 5% de Bovines FERUM Albumin,
0,1% azida de sodio, pH 7.4.
Tubos de ensayo de poliestirol de 5 ml
irradiados (empresa Graiger) se revistieron de la siguiente manera
con anticuerpo anti-PCVD14 purificado: se diluyeron
los anticuerpos en 50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH7,8 hasta una
concentración de 6.6 \mug/ml. En cada tubo se pipetearon 300
\mul de esta solución. Se incubaron los tubos durante 20 horas a
22ºC. Se aspiró la solución. Después se llenó cada tubo con 4.2 ml
de fosfato sódico 10 mM, 2% Karion FP, 0,3% Bovines Serum Albumin,
pH 6.5. Después de 20 horas se aspiró la solución. Finalmente se
secaron los tubos en una estufa de vacío.
Se elaboró un tampón de ensayo de la composición
siguiente:
100 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl, 5% Bovines
Serum Albumin, 0,1% IgG de oveja inespec., 0,1% azida de sodio, pH
7.4.
Como material estándar sirvió CPS 1 humano
recombinante exprimido en E. coli en forma de un extracto
crudo de E. coli, conteniendo la totalidad de la proteína
intracelular soluble. Este extracto se diluyó de manera seriada en
suero normal de caballo (empresa SIGMA). Al estándar así obtenido se
le atribuyeron concentraciones arbitrarias según su dilución.
En cada uno los tubos de ensayo arriba
mencionados se pipetearon 50 \mul de estándar o de la muestra así
como 200 \mul de tampón de ensayo. Se incubó durante 18 horas a
22ºC con agitación. Después se lavó 4 x con 1 ml de solución de
lavado (0,1% Tween 20) por cada tubo. Se pipetearon después en cada
tubo 200 \mul de tampón de ensayo conteniendo 0,5 millones de RLU
del anticuerpo trazador marcado con MA70. Se incubó durante dos
horas a 22ºC con agitación. Después se lavó 4 x con 1 ml de solución
de lavado (0,1% Tween 20) por cada tubo, se dejó escurrir y la
quimioluminiscencia ligada a cada tubo se midió en un luminómetro
(empresa BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos BRHMS AG).
Utilizando el software MultiCalc (Spline Fit) se
leyó la concentración en la inmunorreactividad CPS 1. Los
resultados se muestran en la Figura 2. Se observa una clara
diferencia entre las personas sanas y los pacientes de
septicemia.
Para una caracterización molecular más precisa
de la inmunorreactividad CPS 1 en plasmas de septicemia se
analizaron muestras de plasmas de este tipo mediante la técnica
Western Blot.
Se fundió un gel separador SDS al 7,5% para una
PROTEAN II xi Cell (empresa BIO-RAD) según las
instrucciones de la empresa Bio-Rad:
- 11,25 ml 1 M Tris pH 8,8
- + 7,5 ml 30% Acrilamida/bisacrilamida (29:1), empresa Biorad
- + 10,79 ml Milli-Q-Wasser
- + 300 \mul 10% SDS
- + 150 \mul 10% APS
- + 15 \mul TEMED
Tras aplicar encima una capa de agua y
polimerizar, se fundió un gel colector SDS al 5% de la siguiente
manera:
- 1,25 ml 1 M Tris pH 6,8
- + 1,33 ml 30% Acrilamida/bisacrilamida (29:1), empresa Biorad
- + 7,26 ml Milli-Q-Wasser
- + 100 \mul 10% SDS
- + 50 \mul 10% APS
- + 10 \mul TEMED
Se pipetaron 5 ml de la solución de gel colector
sobre el gel separador, se montó el peine y se dejo polimerizar.
5 \mul de muestras de plasma EDTA de cada una
de tres personas de control sanas y tres pacientes de septicemia se
mezclaron con 20 \mul PBS, 2,5 \mul de glicerina y 5 \mul de
Cracking buffer (120 mM Tris/HCl, pH 6,4, 2% SDS, 20% glicerina, 20%
\beta-mercaptoetanol, 0,002% azul de bromofenol),
se incubaron 10 minutos a 90ºC y después se aplicaron. Como
marcadores de peso molecular se aplicaron 10 \mul de Rainbow
Marker RPN 756 (empresa Pharmacia).
Como cámara se utilizó una PROTEAN II xi Cell
(empresa BIO-RAD). El tampón de electroforesis fue:
25 mM Tris/HCl, 90 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,6. Las condiciones de
electroforesis fueron: 45 min a 46V/16 mA, 30 min a 120 V/50 mA, 150
min a 150V/56 mA, 90 min a 190 V/45 mA.
Como tampón de Blot se utilizó: 25 mM Tris, 192
mM glicina, 1% SDS, 20% metanol, pH 8,3. La lámina Blot fue lámina
Blot de nitrocelulosa Protran BA83, 13 x 13 cm (empresa Schleicher
& Schuell). El aparato de Blot fue un
Semi-Dry-Blotter (modelo Pegasus de
la empresa Phase).
Se incubó el gel 10 min en tampón Blot, se
aplicó sobre la lámina Blot y se recubrió con varias capas de papel
cromatográfico Whatman 3MM (empapadas en tampón Blot). Después se
aplicó la técnica Blot (0,8 mA/cm^{2} de superficie del gel, 70
min).
La lámina Blot se saturó en 150 ml
PBS-Tween-solución de proteína (PBS,
0,3% Tween, 1,5% BSA, 50 \mug/ml IgG de ratón inespec.) durante
la noche a 4ºC con agitación. Se añadieron a la solución 30 \mul
de antisuero de oveja anti PCEN17 o anti PCVD14 (fabricación del
antisuero, véase anteriormente) y se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente y con agitación. Se decantó la solución y se
lavó con agitación la lámina Blot 4 x 10 min en 300 ml
PBS-Tween-solución de proteína. Se
añadió después el anticuerpo secundario: 30 \mul de conjugado de
IgG antioveja de ratón monoclonal-fosfatasa alcalina
(empresa Sigma, A8062), diluido en 150 ml de
PBS-Tween-solución de proteína. Se
incubó durante 90 minutos con agitación a temperatura ambiente. Se
decantó a continuación y se lavó con agitación durante 10 min con
150 ml de PBS-Tween-solución de
proteína. Después se decantó y se lavó con agitación 2 x 10 min con
150 ml de tampón de lavado (100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM
NaCl).
Se fabricó la solución de sustrato de la
siguiente manera: 100 ml de tampón revelador (100 mM Tris/HCl, pH
9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) + 350 \mul de una solución de 50 mg
BCIP
(5-bromo-4-cloro-3
indolilfosfato, empresa Sigma) por ml 100% dimetilformamida, + 450
\mul de una solución de 100 mg NBT (Nitro blue tetrazolium,
empresa Sigma) por ml 70% dimetilformamida.
La solución de sustrato se aplicó sobre una
lámina Blot. Después de 5 minutos se finalizó la reacción de tinción
lavando la lámina Blot en agua. Los resultados se muestran en la
Figura 3 (panel A).
En un planteamiento paralelo se añadieron a la
solución con los antisueros primarios (antisuero de oveja anti
PCEN17 o anti PCVD14) los correspondientes péptidos inmunogénicos
PCEN17 y PCVD14 en una concentración final de 2 \mug/ml y se hizo
una incubación previa de 30 min. Los resultados se muestran en la
Figura 3 (panel B), tomándose referencia expresa a las leyendas de
esta Figura 3.
Para determinar el peso molecular aparente de la
inmunorreactividad CPS 1 a partir de plasma de septicemia en
solución se fraccionó un plasma de este tipo mediante una
HPLC-filtración en gel y se midió la
inmunorreactividad CPS1 en las fracciones. Se calibraron las
columnas mediante una cromatografía por separado de estándares
(Bio-Rad-Standard: Cat.No.
151-1901). Se utilizó una columna
Bio-Sil SEC-400 (7,8x300 mm Ser.No.
415949) de la empresa Bio-Rad. El medio de paso fue
300 mM fosfato potásico, 0,1% NaN_{3}, pH 7,0. Del plasma de
septicemia se cromatografiaron 100 \mul, se recogieron fracciones
de 1 ml y cada 50 \mul de ellas se midieron en inmunoensayo
(realización, véase anteriormente). Los resultados obtenidos
(reactividad/fracción) se representan en la Figura 4, tomándose
referencia expresa a las leyendas de esta Figura 4.
Los resultados de las mediciones de la
inmunorreactividad CPS 1 en plasmas humanos o los análisis sobre
especies responsables de la inmunorreactividad observada, se pueden
resumir de la siguiente manera:
Mediante el inmunoensayo sandwich descrito se
demostró que los plasmas de pacientes septicémicos presentan
concentraciones fuertemente elevadas de inmunorreactividad CPS 1,
mientras que en los plasmas de personas sanas no se detectó CPS 1
(Figura 2).
La inmunorreactividad CPS 1 circulante en los
plasmas septicémicos evidentemente consiste en esencia en el enzima
CPS 1 intacto o una forma del mismo con mayor solubilidad:
Tres plasmas septicémicos analizados mostraron
en el Western-Blot una banda CPS específica en
aproximadamente 150 kDa (Fig. 3). Esto equivale aproximadamente al
peso molecular de unos 160 kDa calculados para el CPS 1 intacto
basándose en la secuencia de aminoácidos conocida.
La HPLC-filtración en gel mostró
que la inmunorreactividad CPS 1 del plasma de septicemia analizado
en la solución presenta un peso molecular de aproximadamente 200
kDa (+/- 50 kDa) (Figura 4).
La medición de CPS 1 en plasma/suero humano no
se ha descrito hasta la fecha, ni para pacientes con septicemia ni
para otros agentes patológicos. Únicamente en un modelo experimental
con ratas para la hepatitis aguda se midió el CPS 1 en plasma
(véase anteriormente Ozaki et al., 1996). Sin embargo, las
condiciones con ratas no son comparables evidentemente a las de los
seres humanos, puesto que en las citadas publicaciones para los
animales sanos se detectaron ya concentraciones de CPS de
1-2 \mug/ml, mientras que las mediciones descritas
de plasmas humanos de personas sanas del solicitante dieron valores
por debajo del límite de detección (estimado aproximadamente en
0,5 ng/ml).
Sorprendentemente, para los pacientes de
septicemia se demostró un aumento masivo de la inmunorreactividad
CPS 1 en plasma. Se sabe que en la septicemia se produce una lesión
de las mitocondrias (Crouser ED et al.,
Endotoxin-induced mitochondrial damage correlates
with impaired respiratory activity; Crit Care Med. 2002 Feb;
30(2): 276-84). Una lesión de este tipo en
relación con necrosis o apoptosis podría ser la causa del paso de
CPS 1 desde la matriz mitocondrial hacia la circulación sanguínea.
Ya que el CPS 1 se exprime casi exclusivamente en el hígado y
constituye allí una parte notable del total de la proteína soluble,
la medición del CPS 1 podría ser especialmente apropiada para
mostrar lesiones del hígado en caso de septicemia severa u otras
condiciones, por ejemplo en el marco de un fallo multiorgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Verwendungen der Carbamoylphosphat
Synthetase 1 (CPS 1) und ihrer Fragmente für die Diagnose von
Entzündungserkrankungen und Sepsis
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3695PCT AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 02008841.5 EP
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<151>
2002-04-19
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<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primat (Pavian)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Asn Gln Pro Val Lau Asn Ile Thr
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primat (Pavian)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gln Pro Val Leu Asn Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primat (Pavian)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Thr Ala His Ile Val Leu Glu Asp Gly
Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Primat (Pavian)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala His Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Primat (Pavian)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Ala Met Thr Asn Gln Ile Lau Val Glu
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic Peptide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Glu Phe Glu Gly Gln Pro Val Asp Phe Val
Asp Pro Asn Lys Gln}
\sac{Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial Sequence
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic Peptide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met
Glu Tyr Asp}
Claims (10)
1. Procedimiento in vitro para el
reconocimiento precoz y el reconocimiento mediante diagnóstico
diferencial, para el pronóstico del curso y la evaluación del grado
de severidad y la evaluación del curso del tratamiento concomitante
de la septicemia, caracterizado porque se determina en la
circulación de un paciente humano la presencia y/o la cantidad de
carbamoilfostato sintetasa 1 (CPS 1) y a partir de la detección y/o
la cantidad de CPS 1 se extraen conclusiones con respecto a la
existencia del curso esperado, del grado de severidad de la
septicemia o del éxito de su tratamiento terapéutico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las secuencias de CPS 1 utilizadas en la
determinación son secuencias de fragmentos de una parte
N-terminal del CPS 1 que comprende los aminoácidos 1
hasta aproximadamente 630 de la secuencia completa de CPS 1 (SEQ ID
NO: 6).
3. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3, caracterizado porque la inmunorreactividad CPS 1
determinada puede asignarse como mínimo parcialmente a componentes
del plasma con una masa molar de 200 kDa \pm 50 kDa determinada
mediante electroforesis en gel, y/o a componentes con una masa molar
de 68 a 70 kDa \pm 3 kDa y puntos isoeléctricos en un dominio de
5,5 a 6,1.
4. Procedimiento según unas de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las secuencias
de CPS 1 utilizadas con fines de ensayo contienen como mínimo 2
secuencias parciales de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ
ID NO: 8.
5. Procedimiento según unas de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es un
procedimiento de determinación inmunodiagnóstico.
6. Procedimiento según unas de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la determinación
de los CPS 1 solubles se produce como determinación de la actividad
enzimática de CPS 1 en sangre, plasma sanguíneo o suero.
7. Procedimiento según unas de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se realiza para
el diagnóstico de septicemia dentro del marco de una determinación
multiplarámetros, en la que se determina al menos otro parámetro de
septicemia y se obtiene un resultado de medición en forma de una
expresión de cómo mínimo dos magnitudes de medición, que se valora
para el diagnóstico fino de la septicemia.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque en el marco de la determinación
multiparámetros, junto a como mínimo un fragmento de CPS 1, se
determina como mínimo un parámetro más que se elige del grupo
formado por procalcitonina, CA 19-9, CA 125, S100B,
proteínas S100A, fragmentos de citoqueratina solubles, en especial
CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1
soluble (sCY1F), los péptidos inflamina, CHP, LASP-1
y la inmunorreactividad péptido-prohormona y la
proteína c-reactiva (CRP).
9. Procedimiento según las reivindicaciones 7 u
8, caracterizado porque la determinación multiparámetros se
realiza como determinación simultánea por medio de un dispositivo
medidor de tecnología de chips o un dispositivo medidor de
inmunocromatografía.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la evaluación de los resultados de
medición complejos obtenidos con el dispositivo medidor se realiza
con ayuda de un programa de ordenador.
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