WO2008006927A1 - Secuencias peptídicas y nucleotídicas de anisakis spp. anticuerpos que reconocen dichas secuencias y usos de los mismos - Google Patents

Secuencias peptídicas y nucleotídicas de anisakis spp. anticuerpos que reconocen dichas secuencias y usos de los mismos Download PDF

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Definitions

  • This invention relates to the field of diagnosis, prevention and therapy of human and animal infections by species of the Anisakis genus. This invention also relates to the detection of Anisakis antigens in food.
  • the genus Anisakis (family Anisakidae) includes nematode parasites that belong to several related species. Through the use of morphological and genetic / molecular markers, 8 species of Anisakis are currently recognized, including: a) the twin species Anisakis simplex "in the strict sense” (Rudolphi, 1809), A. pegreffi (Campana-Rouget and Biocca , 1955) and A. simplex C (Nascetti et al., 1986, Mattiucci et al., 2002), formerly included in the A. simplex complex; b) A.
  • Anisakis species reach sexual maturity in the stomach of cetaceans and, less frequently, in pinpipeds. These mammals can be infected by ingestion of a) paratenic hosts, that is, fish (mainly teleost) and cephalopods (mainly squid), which house the third larval phase of the parasite (L3), and b) by ingestion of krill, as intermediate, which It also houses L3 larvae (for example, whales).
  • Anisakis L3 larvae Like marine mammals, humans can also be infected by Anisakis L3 larvae by ingesting fish and raw squid carrying the parasite, which produces a clinical disease called anisakiosis or anisakiasis. Very often, several fish dishes are considered high risk for infection with Anisakis species. These include sushi and Japanese sashimi, sauteed or smoked German herring, Scandinavian gravlax, Hawaiian lomi-lomi, South American cebiche and Spanish pickled anchovies ("pickled anchovies").
  • Anisakis L3 larvae When Anisakis L3 larvae infect humans, they often cause gastrointestinal symptoms that may be associated with allergic reactions of varying severity. Depending on the location of the larvae and the dominant symptoms, four main clinical forms of anisakiosis (gastric / gastroallergic, intestinal, extragastrointestinal and allergic) have been presented in humans. In the gastric (acute) form of anisakiosis, the larva penetrates the gastric wall and a clinical course characterized by acute epigastric pain, nausea and vomiting is observed a few hours after ingestion of fish containing live Anisakis L3 larvae. Endoscopic studies often reveal lesions consisting of punctate hemorrhages, petechiae and erosion at the site of penetration. In addition, allergic symptoms (i.e.
  • urticaria / angioedema and sometimes anaphylaxis can also be observed in approximately 10% of cases.
  • the combination of gastric infection and allergic symptoms was called "gastroallergic anisakiosis" (Daschner et al., 2000).
  • Some patients may develop a subacute or chronic form whose clinical manifestations include epigastric pain, dyspepsia, vomiting and anorexia, which may persist for several months or even years.
  • the larva In the intestinal form of the anisakiosis, the larva penetrates the intestinal wall, frequently at the level of the terminal ileum. In acute cases, the presence of abdominal pain is often observed (usually 24-48 hours after ingestion of contaminated fish), accompanied by nausea, vomiting, abdominal swelling, induration and rhythm deviation. bowel established with constipation or diarrhea.
  • the macroscopic observation of infected tissues in case of intestinal anisakiosis reveals phlegmous lesions characterized by severe local edema, petechiae, hyperemia and diffuse inflammation of the serous and mesentery. These lesions can cause obstruction and proximal dilation of the intestine. In a significant number of patients, abdominal ascites fluid with a high eosinophil content can be found.
  • subacute or chronic intestinal anisakiosis the granulomatous changes induced by the larvae lead to a thickening of the wall, luminal stenosis and chronic abdominal symptoms.
  • allergic anisakiosis is reserved for patients who have allergic reactions after infection with Anisakis larvae, but without gastric or intestinal symptoms. Frequently, the first symptoms appear very soon, in the first hours after ingestion of contaminated fish and the clinical course follows the general pattern for type I allergic reactions. Its severity varies from a simple hives or angioedema to anaphylactic shock.
  • the endoscopic examination is the preferable method to demonstrate the infection.
  • This technique is also useful for extracting the larvae by means of the clamps associated with the endoscope, which leads to the healing of the patient.
  • the preferable method to confirm the infection is to demonstrate the presence of specific antibodies in the serum of the patient. The latter is also the preferred method of demonstrating previous Anisakis infections in asymptomatic individuals.
  • IgE antibodies are the most relevant since: 1) they are involved in the type I allergic reactions observed during infections with Anisakis, and b) this is the class of most relevant immunoglobulins in terms of specificity among those that are present in serum of infected patients.
  • the first methods for measuring serum anti-Anisakis antibodies included latex agglutination (Akao and Yoshimura, 1989); double immunodiffusion and immunoelectrophoresis (Petithory et al., 1986; Tsuji, 1990), indirect hemagglutination (Asaishi et al., 1989; Tsuji, 1989); and complement fixation assay (Oshima, 1972; Tsuji, 1989). All these methods have two main drawbacks: a) they lack sufficient sensitivity and specificity and b) with these techniques it is not possible to determine IgE (reaginic) antibodies.
  • anti-Anisakis IgE determinations could be performed in sera of patients infected with the introduction of other immunoassays, for example, radio allergy tests (Desowitz et al., 1985; Yamamoto et al., 1990), linked immunosorbent assays to enzymes (ELISA) (Rodero et al. 2002), fluorescent enzyme immunoassays (UniCap FEIA, Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB, Uppsala, Sweden) and immunoblotting (Del Pozo et al., 1996; Garc ⁇ a et al., 1997), but also There were problems of sensitivity and / or specificity with these methods.
  • radio allergy tests (Desowitz et al., 1985; Yamamoto et al., 1990), linked immunosorbent assays to enzymes (ELISA) (Rodero et al. 2002), fluorescent enzyme immunoassays (UniCap FEIA, Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB, Uppsal
  • the main difficulty in developing useful serological methods for the diagnosis of human Anisakiosis lies in obtaining parasite antigens (in our case allergens) that on the one hand (i) are recognized by IgE antibodies present in the sera of all those infected patients, and (ii) that the entire molecule (that is, all epitopes present in the selected allergen) be specific to the Anisakis genus. Otherwise, low sensitivity and / or cross reactions that lead to false positives would be obtained.
  • Anisakis spp. cultured in vitro (Poggensee et al., 1989; Baeza et al., 2004), or using monoclonal antibodies to capture specific target antigens from crude L3 larval extracts of Anisakis (Yagihashi et al., 1990;
  • the present invention provides sequences of peptides, polypeptides and proteins that maintain the antigenicity of the native Anisakis molecules from which they are derived, as well as the nucleic acids encoding said sequences and antibodies or fragments thereof specific for said peptides, polypeptides. or proteins
  • the peptides, polypeptides and proteins described, as well as the antibodies or fragments thereof specific fronts to said peptides, polypeptides and proteins are useful for developing immunoassays for the serodiagnosis of human and animal anisakiosis, lacking the drawbacks of the methods previously presented .
  • a first aspect of the present invention provides an isolated nucleic acid sequence (hereinafter referred to as the nucleic acid sequence of the invention) selected from the following group:
  • a nucleic acid comprising SEQ ID N 0 1 b.
  • a nucleic acid fragment of SEQ ID N 0 1 comprising SEQ ID N 0 15 or 17 d.
  • N 0 1 encoding a contiguous stretch of 10 or more amino acids of SEQ ID N 0 2 capable of being recognized by anti-Anisakis antibodies.
  • F. A nucleic acid comprising a fragment of SEQ ID N 0 1 that encodes a contiguous stretch of 12 or more amino acids of SEQ ID N 0 2 capable of being recognized by anti-anisakis antibodies.
  • g. A nucleotide sequence having an identity of at least 70% with any of the nucleic acid sequences described in sections (a) to (f).
  • the nucleotide sequence has an identity of at least 80% with any of the nucleic acid sequences previously mentioned in sections (a) to (f) and, in an even more preferred embodiment, said nucleotide sequence has an identity of at least 90% with any of the nucleic acid sequences previously mentioned in sections (a) to (f).
  • a second aspect of the present invention provides an isolated polypeptide, peptide or protein (hereinafter referred to as the amino acid sequence of the invention) selected from the following group:
  • a fragment of the SEQ ID N 0 2 comprising a contiguous span of 8 or more amino acids capable of being recognized by anti-Anisakis antibodies.
  • d A fragment of the SEQ ID N 0 2 comprising a contiguous stretch of 10 or more amino acids capable of being recognized by anti-Anisakis antibodies.
  • a fragment of the SEQ ID N 0 2 comprising a contiguous stretch of 12 or more amino acids capable of being recognized by anti-Anisakis antibodies.
  • F An amino acid sequence having an identity of at least 70% with any of the amino acid sequences described in sections (a) to (e) at this point.
  • the amino acid sequence has an identity of at least 80% with any of the amino acid sequences previously described in sections (a) to (e) at this point and, in an even more embodiment preferred, said amino acid sequence has an identity of at least 90% with any of the amino acid sequences previously described in sections (a) to (e) at this point.
  • All these peptides, polypeptides or proteins can be used to overcome the main difficulty of developing useful serological methods for the diagnosis of human anisakiosis, by providing specific parasite antigens of the Anisakis genus and which are recognized by the IgE antibodies present in the sera of All patients infected by Anisakis.
  • a preferred embodiment of the invention refers to an amino acid sequence that can be recognized by anti-Anisakis antibodies and that comprises a fragment with a contiguous section of at least 8 or more amino acids and with an identity of at least 70% with Any fragment of SEQ ID N 0 2, selected from the following amino acid sequences:
  • amino acid sequence of the invention is produced, but not limited to any of the following techniques: to. Recombinant techniques b. Chemical synthesis and c. Substantial purification from nematodes of the Anisakidae family
  • a fourth aspect of the invention refers to a peptide, polypeptide or protein comprising two or more of the amino acid sequences of the invention.
  • a fifth aspect of the invention relates to a synthetic or recombinant nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding one or more of the amino acid sequences of the invention.
  • a sixth aspect of the invention refers to an isolated nucleic acid or amino acid sequence of the invention, labeled with a signaling molecule.
  • said marker molecule is selected, but not limited to any of the signaling molecules of the following group:
  • the marking molecule is selected, but not limited to any of the signaling molecules of the following group: to. Biotin or its derivatives b. Nitrophenol derivatives c. Colloidal Gold d. Latex e. Fluorescein
  • a seventh aspect of the invention relates to an antibody or fragment thereof (hereinafter referred to as the antibody of the invention) capable of interacting with any of the amino acid sequences of the invention. Also part of the present invention are nucleic acid sequences capable of encoding any of the antibodies of the invention.
  • said antibody of the invention is the antibody produced by the hybridoma cell line with the deposit number DSM ACC2793 deposited on June 15, 2006 in the "German
  • a further embodiment refers to the hybridoma cell line with deposit number DSM ACC2793 with deposit date June 15, 2006 deposited in the DSMZ institution.
  • a further embodiment of the invention relates to the antigen recognition sequences of any of the antibodies of the invention, particularly the antigen recognition sequences of the UA3 antibody.
  • Another aspect of the invention provides an isolated amino acid sequence of the invention, wherein said amino acid sequence is chemically fused or coupled to an additional peptide, polypeptide or protein.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector or expression system (hereinafter referred to as the expression system of the invention) comprising a nucleotide sequence of the invention.
  • Another aspect of the invention provides an isolated prokaryotic or eukaryotic host cell (hereinafter referred to as the host cell of the invention) transformed or transfected with a nucleic acid sequence of the invention or with an expression vector or system of the invention.
  • the host cell of the invention transformed or transfected with a nucleic acid sequence of the invention or with an expression vector or system of the invention.
  • An eighth aspect of the invention relates to a method for producing a recombinant peptide, polypeptide or protein encoded by a nucleic acid sequence of the invention, wherein said method comprises culturing a host cell of the invention under conditions such that it is expressed and expressed. produce said nucleotide sequence and then isolate said peptide, polypeptide or protein.
  • a ninth aspect of the invention relates to an in vitro method for detecting antibodies against Anisakis spp. in an isolated biological sample, preferably serum, comprising: a. contacting a biological sample with an amino acid sequence of the invention, under conditions sufficient to form an immunological complex between said polypeptide and the antibodies of the sample, and b. detect said immune complex.
  • the in vitro method is an immunoassay or an enzymatic immunoassay.
  • a tenth aspect of the invention refers to an in vitro method for detecting Anisakis spp. in a sample, preferably a biological sample, or a food extract, comprising: a. contacting the biological sample or food extract with an antibody of the invention, under conditions sufficient to form an immune complex between said antibody and the antigens of the sample and b. detect said immune complex.
  • the antibody of the invention that is used to detect antigens of Anisakis spp. In an in vitro sample it is the UA3 antibody.
  • a preferred aspect of the invention refers to an in vivo method to diagnose or predict allergy to Anisakis spp. in a subject, which comprises subjecting the subject to the peptide, polypeptide or protein of the invention and controlling the reaction of the subject.
  • kit of the invention suitable for the detection of Anisakis spp. in a biological sample or a food extract, comprising: a) at least one antibody of the invention or its fragments and b) a means of detection for the immune complex. It is also a preferred aspect of the present invention a kit suitable for the detection of antibodies anti-Anisakis spp. in a biological sample, preferably serum, comprising: a) at least one peptide, polypeptide or protein of the invention and b) a means of detection for the immune complex.
  • the detection means used in the kit of the invention consists of labeled secondary antibodies capable of recognizing the formation of the immune complex.
  • the detection means used in the kit of the invention is a labeled secondary reagent capable of recognizing the formation of the immune complex.
  • Another aspect of the invention relates to the use of an amino acid sequence of the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of any type of allergic reaction to
  • Anisakis spp. A preferred embodiment of the invention refers to the pharmaceutical composition as is.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” refers to any nucleotide polymer composed of two or more subunits that are deoxyribonucleotides or ribonucleotides, linked together by phosphodiester bridges.
  • Nucleic acids or “nucleic acid molecules” include deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), oligonucleotides and fragments generated by polymerase chain reaction (PCR) or by other methods such as ligation, cleavage, action of endonucleases and exonuclease action.
  • nucleotide means a monomeric unit of DNA or RNA that contains a sugar moiety (pentose), a phosphate and a nitrogen heterocyclic base.
  • the four DNA bases are adenine ("A”), guanine (“G”), cytosine ("C”) and thymine (“T”).
  • the four bases of RNA are A, G, C and uracil ("U”).
  • an "isolated nucleic acid molecule” is a nucleic acid molecule that is not integrated into the genomic DNA of an organism. Said nucleic acid molecule can be separated from the genomic DNA of a cell, can be produced using recombinant DNA technology (eg, PCR amplification, cloning, etc.) or can be chemically synthesized. The isolated nucleic acid molecule can be obtained from its natural source as a complete gene or a part thereof capable of forming a stable hybrid with that gene. The nucleic acid molecule can be single stranded or double stranded.
  • primer refers to a natural or synthetic oligonucleotide (preferably ranging from 15 to 40 nucleotides in length) that can hybridize with a complementary DNA or RNA template to form a duplex between the primer and the mold.
  • a primer is a single stranded oligodeoxyribonucleotide, and serves as a starting point for the synthesis of nucleic acid by a polymerase after hybridization with a DNA or RNA chain.
  • nucleotide sequence encoding refers to a nucleic acid sequence that directs the expression of a specific peptide, polypeptide or protein.
  • the nucleic acid sequences comprise the sequence of the DNA chain that is transcribed into RNA and also the sequence of RNA that is translated into a protein.
  • the nucleic acid sequences of the present invention include both full length nucleic acid sequences and truncated sequences (which do not have full length) derived from the full length protein.
  • the variants are also included of the nucleotide sequence encoding the same peptide, polypeptide or protein as the native sequence, which can be constructed to provide a codon preference in a specific host cell.
  • complement refers to the concept of an inverse correspondence between regions of two polynucleotide chains or between two nucleotides through the formation of base pairs. Consequently, a “complementary base sequence” refers to a polynucleotide chain in which all bases can form base pairs with a base sequence in another polynucleotide chain.
  • an adenine nucleotide can form base pairs with thymine (A-T) or uracil (A-U), while a cytosine nucleotide can form base pairs with guanine (C-G).
  • an "expression vector” refers to a set that is capable of directing the expression of a sequence or gene of interest.
  • the expression vector can be any DNA or RNA expression vector capable of expressing Anisakis spp. Antigens, such as a plasmid or a phage.
  • the expression vector according to the present invention is a plasmid (for example, pQE 31 and pTARGET).
  • plasmid refers to any autonomous circular DNA molecule capable of replicating in a cell independently of chromosomal DNA, and includes both types of expression and types of non-expression.
  • the term “recombinant” refers to a compound DNA molecule prepared outside living cells by artificially binding natural or synthetic DNA fragments to molecules of
  • recombinant also refers herein to a peptide, polypeptide or protein that is expressed using a recombinant DNA molecule.
  • polypeptide and "protein” are used interchangeably herein to designate a linear sequence of amino acids connected to each other by amide bonds between the alpha-amino group of an amino acid and an alpha-carboxy group of the adjacent amino acid.
  • Polypeptides with a length of twenty-five amino acids or less are considered “peptides.”
  • a polypeptide that is encoded by a cistron is considered a “protein.”
  • fragment of the amino acid sequence means a portion of contiguous amino acids of the specified peptide, polypeptide, protein or amino acid sequence.
  • an "isolated peptide, polypeptide or protein” is a peptide, polypeptide or protein that is essentially free of cellular contaminants, such as lipids, carbohydrates or other impurities associated with the polypeptide in nature.
  • An isolated peptide, polypeptide or protein can be purified from its natural environment by conventional chromatographic techniques. Isolated peptides, polypeptides and proteins can also be obtained by recombinant methods, or by chemical synthesis.
  • a "substantially purified polypeptide” is obtained when it is separated from at least 50%, more preferably at least 75% and even more preferably at least 90% from other polypeptides with which it naturally coexists in a cell, tissue or organism
  • amino acid As used herein, the terms "amino acid" and
  • amino acids refer to all naturally occurring L-alpha-amino acids or his rests.
  • Table 1 shows the three letter code and the one letter code (recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission) for the designation of natural amino acids:
  • mammal refers to any animal classified as a mammal, including humans, mice, rats, marine mammals, and domestic and farm animals.
  • the mammal in this document is the human being.
  • the term “antibody” refers to glycoproteins of the family of immunoglobulins, characterized in that they have antigen binding properties, and are produced by plasma cells.
  • the term “antibody” includes both monoclonal and polyclonal antibodies that belong to any class of antibodies, for example, IgG, IgD, IgM, IgA, IgE or derivatives thereof.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody composition that has a population of homogeneous antibodies. It is not intended to be limited to a particular source of the antibody or to the form in which it is produced, and includes antibodies and fragments thereof produced by cell fusion or by recombinant techniques.
  • the term “antigen” refers to any molecule or agent capable of inducing the production of specific antibodies when introduced into an immunocompetent host. As used herein, the term “antigen” also refers to any molecule or agent capable of being recognized by a specific antibody. Typically, peptides, polypeptides, proteins, carbohydrates, lipids, nucleic acids or combinations of these molecules can be recognized as antigens. These antigens may also contain attached organic and inorganic chemical groups.
  • epitope refers to the portion of an antigen that is recognized by an antibody (monoclonal or polyclonal) or by the receptor with antigen specificity of a cell.
  • the antigen is a peptide, polypeptide or a protein
  • its epitopes can be fragments of at least 5 amino acids of the primary amino acid sequence, but also regions exposed on the surface of the mature folded protein (three-dimensional tertiary structure) composed of 5 or more amino acids
  • epitopes can be classified as B cell epitopes and T cell epitopes based on the types of immune response they cause.
  • biological sample applies to any biological tissue or fluid sample that contains one or more of the nucleic acids, antibodies, peptides, polypeptides or proteins. of the present invention.
  • biological sample also applies to any biological tissue or fluid sample that can be used as a source for the determination of anti-antibody antibodies.
  • samples include, but are not limited to, isolated tissues, blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, ascites fluid, synovial fluid, saliva, urine or feces.
  • Biological samples may also include sections of tissues such as frozen sections taken for histological purposes.
  • a biological sample can be obtained from any eukaryotic organism, and preferably from a mammal such as a rat, mouse, rabbit, marine mammals, or a human being.
  • the term "food sample” refers to any sample obtained from the wide range of edible materials. These samples include, but are not limited to, pieces of raw, smoked and cooked fish and foods that have fish materials in their composition. The term “food sample” also includes foods for children's nutrition.
  • anti-Anisakis antibodies refers to any class or subclass of antibodies present in a sample capable of recognizing at least one epitope that is present in the antigens of any of the species of the Anisakis genus.
  • the expression includes antibodies produced during natural or experimental infections of humans and animals with the parasite, as well as monoclonal and polyclonal antibodies produced after the immunization of humans or animals with recombinant or synthetic antigens not purified or substantially purified, obtained from species of the genus Anisakis.
  • the expression also includes antibodies and antigen binding fragments produced by recombinant techniques, chemical synthesis or equivalent techniques.
  • percent identity refers to the percentage of amino acids or nucleotides that occupy the same relative position when two amino acid sequences, or two nucleic acid sequences are aligned side by side.
  • a suitable method to calculate the percentage of sequence identity between two nucleotide or amino acid sequences is to use the William Pearson lalign program that applies the Huang and Miller algorithm, published in Adv. Appl. Math (1991) 12: 337-
  • the term "immunoassay” refers to a method of detecting an analyte in a sample by means of an antigen-antibody reaction.
  • the analytes can be small molecules (haptens) or large molecules, such as many plasma proteins. Very often, the analyte is an antibody that can be detected by means of the specific binding between the antibody and a ligand.
  • enzyme immunoassay EIA refers to a broad type of immunoassay, characterized in that at least one of the reagents is labeled with an enzyme. EIA-linked enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) of which there are a number of variants are typical.
  • a "pharmaceutical composition” refers to a chemical or biological composition that is suitable for administration to a mammalian individual.
  • a pharmaceutical composition comprises an amount of a pharmacologically effective active agent and a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of carriers and suitable pharmaceutical formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 20 edition, Mack Publishing
  • a pharmaceutical composition can be formulated specifically for administration by different routes including, but not limited to, oral, parenteral, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intranasal, sublingual and the like.
  • the expression "diagnostic method” refers to a method for the identification of a pathological state in an animal or in an individual.
  • the diagnosis can often be made using an immunoassay (see above) that allows the detection of the antigens released by the pathogen, or of the antibodies induced in the host by said pathogen.
  • the diagnostic methods of the present invention include in vitro tests (such as an ELISA test, or histamine release test of basophils) and in vivo tests such as skin tests, for example, but not limited to, the prick in the skin ⁇ prick-test), intradermorreactions, or epicutaneous tests (for example, the patch test), which are frequently used for the diagnosis of allergies.
  • diagnosis methods also includes provocation tests, consisting of the controlled and gradual administration of the substance suspected of causing an allergic condition through different routes: oral, conjunctival, nasal, bronchial, etc., to check your tolerance
  • provocation tests consisting of the controlled and gradual administration of the substance suspected of causing an allergic condition through different routes: oral, conjunctival, nasal, bronchial, etc.
  • sequence repetitions refers to repetitive motifs in the sequence of a given protein or of a nucleic acid molecule. Sequence repetitions in the polypeptide sequences of the present invention were performed using the RADAR program (see EXAMPLE N 0 12).
  • EXAMPLE 1 mRNA isolation and construction of an expression library from Anisakis simplex. Larvae of Anisakis simplex were manually extracted in the larval phase L3 (L3) of the viscera and peritoneal cavity of the bacaladilla
  • mRNA Total messenger RNA
  • the Anisakis simplex poly (A) + RNA was first converted to double-stranded cDNA, then ligated to the lambda-ZAP expression vector and the vector was packaged using Gigapack III packaging extracts. E. coli strain XL1-Blue MRF 'was used as host. The resulting library was amplified, and contained approximately 1.3 x 10 10 pfu / ml and a
  • the A. simplex cDNA library was subjected to immunological screening using UA3 monoclonal antibodies. Following the recommendations provided in the ZAP-cDNA Gigapack III GoId Cloning Kit (Stratagene), XL1-Blue MRF 'host cells were grown in LB broth with supplements, centrifuged at 1000 xg, and the sediment was resuspended in magnesium sulfate 10 mM. To this suspension he was added an aliquot of Ie recombinant phages and the mixture was incubated 15 minutes at 37 0 C to allow the phage bind to the cells.
  • the cell suspension with attached phages was mixed with melted NZY agar (cooled to about 55 0 C), and the mixture was spread evenly on a plate of 150 mm diameter agar containing freshly poured NZY. After a time of incubation from approximately 3 h to 42 0 C to allow phage plaques to begin to form, the expression of recombinant proteins was induced by coating the plates with nitrocellulose filters previously impregnated with 10 mM isopropyl thio-beta-D-galactoside (IPTG) in water ( Schleicher & Schuell, Dassel, Germany).
  • IPTG isopropyl thio-beta-D-galactoside
  • the plates were then incubated at 37 0 C for 3.5 h, after which were carefully removed Io nitrocellulose filters containing phage adsorbed plates and blocked with 3% BSA in TBS (50 mM Tris-HCl , 150 mM NaCl, pH 7.5) at 37 0 C for 30 minutes and then incubated with monoclonal antibodies (mAb) IgG1 / kappa UA3 (1: 10,000 dilution in TBS) at 4 0 C overnight.
  • TBS 50 mM Tris-HCl , 150 mM NaCl, pH 7.5
  • Nitrocellulose filters were washed in TBS containing 0.05% Tween 20 (TBS-T), and incubated for 2 h at room temperature with goat anti-rabbit IgG conjugated to alkaline phosphatase at 1: 10,000 (Pierce, Rockford , IL, USA). After washing again, immune complexes were visualized using NBT (tetrazolium nitro blue) and BCIP (p-toluidine-5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate phosphate) (Sigma Chemical Corp., St Louis, MO , USES).
  • NBT tetrazolium nitro blue
  • BCIP p-toluidine-5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate phosphate
  • the cleaved pBluescript phagemid obtained packaged as phage particles filamentous, was used to infect SOLR host cells. Colonies of transfected SOLR cells containing the double-stranded pBluescript phagemid with the cloned DNA insert of interest were obtained by allowing the cells to grow on Luria-Bertani (LB) agar plates containing ampicillin (100 micrograms / ml). Individual bacterial colonies were grown in LB-ampicillin broth and pBluescript phagemid DNA was purified using a Perfectprep Plasmid Maxi kit (Eppendorf).
  • nucleotide sequence described comprises a 3288 nucleotide sequence, represented by the sequence of SEQ ID N 0 : 1, and encodes a deduced amino acid sequence of 1096 amino acids represented by SEQ ID N 0 : 2.
  • EXAMPLE 2 Subcloning of a fragment of the cDNA sequence (SEQ ID N 0 : 1) of Anisakis simplex in the vector pQE-31.
  • an internal recombinant DNA fragment (SEQ ID N 0 : 15) corresponding to nucleotide positions 1303 and 2139 of SEQ ID N 0 1, which encodes a 279 amino acid polypeptide sequence (SEQ ID N 0 : 16), in the expression vector pQE-31 using a QIAexpress Type IV kit (Qiagen, IZASA SA, Barcelona, Spain) according to the manufacturer's instructions, and using the restriction sites Sal I and Hind III at the multiple cloning site of pQE-31.
  • a QIAexpress Type IV kit Qiagen, IZASA SA, Barcelona, Spain
  • the sequence of the cDNA fragment corresponding to SEQ ID N 0 : 15 was amplified by PCR, and the ends of the sequence were modified using the recombinant pBluescript phagemid as a template and a set of direct primers (5 ' SEQ ID N 0 21 3 ') and inverse (5' SEQ ID N 0 22 3 '), which contained restriction sites Salt I and Hind III.
  • This modification by PCR provided specific nucleotide sequences for the restriction enzymes Sal I and Hind III so that the recombinant insert had cohesive ends with respect to the digested plasmid.
  • the PCR conditions for the amplification and modification of the sequence of the DNA fragment corresponding to SEQ ID N 0 : 15 comprised: a cycle of denaturation at 94 0 C for 4 minutes followed by 35 cycles of (30 s of denaturation at 94 0 C; 30 s hybridization at 55 0 C; and one minute elongation at 72 0 C), and a final elongation cycle of 72 0 C for 7 minutes.
  • the amplified Anisakis recombinant DNA was purified using a QiaQuick gel purification kit (Qiagen).
  • one microgram of the plasmid DNA and 2 micrograms of the DNA encoding the fragment to be inserted were digested with the restriction enzymes Sal I and Hind III, according to the buffer and incubation conditions recommended by the manufacturer (Invitrogen SA, Barcelona, Spain).
  • both the digested vector and the DNA insert were purified with the kit QiaQuick Gel purification kit (Qiagen) and ligated in a 1: 3 between the vector and the insert, using T4 DNA ligase at 16 0 C for one night.
  • SEQ ID N 0 16 of Anisakis (central portion) and two additional amino acid sequences (tails): SEQ ID N 0 23 and SEQ ID N 0
  • 6 x Histidine in the amino portion of the encoded polypeptide may facilitate the purification of recombinant polypeptides, but other vectors and purification methods may also be used as appropriate.
  • E. coli M 15 [pREP4] cells with the recombinant pQE-31 vector was performed according to the instructions provided in the manual (The QIAexpresionist: A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins) from the manufacturer (Qiagen). According to this protocol, an aliquot of cells were incubated 15 M competent previously prepared and an aliquot of the mixture of ligation on ice for 20 minutes and then incubated at 42 0 C for 90 minutes. After such incubations, the cells were resuspended in Psi broth and incubated for 90 minutes at 37 ° C.
  • the M15 transformed cells were thawed and grown at 37 0 C in LB broth supplemented with kanamycin and ampicillin, with orbital stirring (200 rpm) until an OD 6 oo 0 ,5. After the expression of the polypeptide by adding 1 mM IPTG she was induced, and the cells were incubated for an additional 4 h at 37 0 C with the same stirring conditions. Subsequently, the cells were centrifuged at 5000 xg and stored frozen at -3O 0 C until the purification of the expressed polypeptide, as described in Example 5. Under these culture conditions, M15 cells produce the recombinant polypeptide of SEQ ID N 0 : 4 precipitate in the form of inclusion bodies.
  • the inclusion bodies of the sedimented M15 cells were purified according to the following steps: a) the bacterial sediment was resuspended in 15 ml of B-PER reagent ( Pierce, Rockford, IL, USA) and stirred gently for 10 minutes; b) the sample was centrifuged at 15,000 xg and the supernatant, which contained soluble proteins, was discarded; c) the sediment containing the inclusion bodies was resuspended in another 15 ml of B-PER and lysozyme was added to the final cell suspension at a final concentration of 200 micrograms (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain) and incubated at RT for 5 minutes; d) the suspension was diluted with 100 ml of a 1: 10 dilution of B-PER and the cells were resuspended using a vortex shaker; e) the cell suspension was centrifuged at 15,000 xg for 15 minutes
  • the resin suspension was loaded on an empty column, and washed with two volumes of the loading buffer; i) the retained polypeptides were eluted with a solution containing Tris. 0.15 M Cl, pH 10.5, containing 250 mM imidazole, and stored frozen at -3O 0 C until use.
  • EXAMPLE 6 Subcloning of the fragment of the Anisakis simplex cDNA sequence of SEQ ID N 0 : 17 into the vector pTARGET and transformation of competent JM109 cells.
  • an internal fragment of 834 amino acids (SEQ ID N 0 : 17) corresponding to nucleotide positions 1306-2139 of SEQ ID NO: 1, which encodes the amino acid sequence of the polypeptide represented by SEQ ID N 0 : 18, was subcloned into the vector pTARGET (Promega).
  • SEQ ID N 0 : 17 was amplified by means of PCR using a set of direct (5 'SEQ ID N 0 25 3') and reverse primers (5 'SEQ ID N 0 26 3') and the transformed vector pQE-31 of EXAMPLE 3 as a mold.
  • the PCR conditions were: one cycle of denaturation at 94 0 C for 5 minutes, followed by 35 cycles of (45 seconds of denaturation at 94 0 C; 45 seconds of hybridization at 55 0 C; and 1.5 minutes of elongation at 72 0 C), and a final elongation cycle of 10 minutes at 72 0 C.
  • the PCR products were analyzed on a 2% agarose gel and then cloned into the pTARGET vector.
  • the ligation of pTARGET and the Anisakis insert, and the transformation of competent JM109 cells were performed as indicated in the instructions for use of the product. Positive JM109 transformants were selected by selection of white colonies using LB agar plates supplied with ampicillin / IPTG / X-Gal as described by the manufacturer.
  • the subcloning of the cDNA sequence corresponding to SEQ ID N 0 : 17 in the pTARGET vector originated a plasmid ORF of 846 nucleotides (SEQ ID N 0 : 5) that codes for the sequence of 282 amino acids of SEQ ID N 0 : 6, which includes the Anisakis polypeptide of SEQ ID N 0 : 17, and an additional sequence of 4 amino acids (SEQ ID N 0 : 24) located in the carboxyl terminal portion of SEQ ID N 0 : 17.
  • EXAMPLE 7 Isolation of recombinant plasmid DNA from J M 109 cells and vaccination of mice with plasmid DNA
  • a positive colony of JM109 cells was grown in LB-ampicillin broth, centrifuged at 15,000 x g for 15 minutes and the sediment was used for the extraction of plasmid DNA using the Plasmid Maxi kit (Qiagen).
  • a total of 50 microliters (concentration of one microgram per microliter) of plasmid DNA without endotoxins was inoculated into the quadriceps muscle of the two legs of Balb / c mice 10-20 weeks old. Inoculations were performed using an insulin syringe as described by Leiro et al. (2002).
  • An immunoassay according to the present invention can be any immunoassay capable of detecting the presence of anti-Anisakis antibodies in any biological fluid from an individual or animal species.
  • types of immunoassays include liquid phase and solid phase immunoassays, and competitive and non-competitive immunoassays in a direct or indirect format.
  • the measurement of the levels of specific anti-Anisakis antibodies in a biological fluid can be carried out by ELISA methods, such as the ELISA methods described in this example.
  • Serum samples The serum samples used in the ELISA methods of this example were obtained from uninfected individuals (healthy blood donors) and from individuals infected with the Anisakis simplex parasite. The sera were considered positive when they were obtained from individuals who had a recent history of having eaten raw fish and the presence of the parasite could be confirmed by endoscopic examination.
  • a capture ELISA method (UA3-ELISA) based on the capture of O-deglycosylated antigens of Anisakis spp. specific for immobilized UA3 monoclonal antibodies.
  • the O-deglycosylated antigen used in this immunoassay was obtained as previously described, and is based on the treatment of whole Anisakis antigens with 0.02 M NaOH at 5O 0 C for 16 h, and further neutralization of the pH with HCI.
  • FITC was carried out according to the method of Liddel and Cryer, 1991); g) aspiration and washing 3 times with 200 microliters / well of PBS-T; h) aspiration, and incubation with 100 microliters of a 1: 1,500 dilution of rabbit anti-FITC antibodies conjugated to peroxidase (Dako, Barcelona, Spain); i) aspiration, and washing with 200 microliters per well of PBS-T; j) aspiration, and incubation with peroxidase substrate (Sigma Fast OPD, Sigma); k) reading of optical densities (OD) at 492 nm in multi-well reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
  • the recombinant polypeptide of SEQ ID N 0 : 4 was used to perform an indirect ELISA to measure anti-Anisakis antibodies in sera of individuals infected with Anisakis.
  • an ELISA method for the determination of IgE antibodies in human serum samples is described, but other classes (IgA, IgG, IgM) and subclasses (IgAI, lgA2, IgGI, lgG2, lgG3 and lgG4) of antibodies can also be measured changing the specificity of secondary anti-human antibodies.
  • the immunoassay can also be adapted for antibody determinations in biological fluids of other animal species (eg, other mammals, birds or fish) by choosing the appropriate secondary anti-species antibodies.
  • the method for indirect ELISA (rUA3-ELISA) of this example was performed according to the following steps: a) coupling of the ELISA plates with the recombinant antigen of Anisakis of Ia SEQ ID N 0: 4 in 0.1 M Tris.CI, pH 10.5; b) aspiration, and then washing the ELISA plate with PBS three times; c) aspiration and , after blocking ELISA wells for 1 h at 37 0 C with a solution of Tris buffered saline (TBS) containing skim milk powder and 3% Tween-20 0.2% (TBS -TM); d) aspiration and , after incubation of the plates for 1, 5 37 0 C with 100 microliters undiluted human serum; e) washed three times with 200 microliters per well of TBS containing 0.2% Tween-20 (TBS-T); f) incubation with 100 microliters of a 1: 2500 dilution of
  • Table I shows the comparison of the IgE values obtained for 22 positive serum samples from patients infected with the Anisakis simplex nematode, tested by the capture ELISA (UA3-ELISA) and indirect ELISA (rUA3-ELISA) methods described in Example 8 of the present invention.
  • the table shows the average absorbance values, measured at 492 nm, for each serum.
  • EXAMPLE 9 Production of antibodies in mice transfected with the recombinant pT ARGET vector encoding the polypeptide of SEQ ID N 0 : 6
  • blood was extracted from mice transfected with recombinant pTARGET encoding the polypeptide of SEQ ID N 0 : 6 (see EXAMPLE 7) with anesthesia, and the serum obtained was tested in indirect ELISA to determine the presence of IgGI antibodies reactive with the polypeptide of SEQ ID N 0 : 4 immobilized in the ELISA plate.
  • the ELISA method was the same as described in EXAMPLE 8b, with the exception that peroxidase-labeled mouse goat anti-lgG antibodies (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA; 1: 3000 dilution) were used instead of anti-reagent reagents -Human side.
  • mouse sera were tested at a 1: 100 dilution.
  • Table II shows the response of IgGI antibodies obtained in BALB / c mice after vaccination (parenterally) with 100 micrograms / mouse of the recombinant p-TARGET plasmid containing the Anisakis simplex DNA insert encoding the polypeptide of SEQ ID N 0 : 6. Blood extraction from mice was done one month after immunization.
  • the table shows the mean absorbance values ⁇ SD for each serum, measured at 492 nm (three independent determinations).
  • mapping of the peptides and polypeptides of the present invention with a biomolecule or detectable chemical molecule is useful for purposes such as in vivo and in vitro diagnosis and laboratory research.
  • markers and methods for marking known to those skilled in the art (for example, Kessler (Ed). Nonradiactive labeling and detection of biomolecules. Springer-Verlag, Berlin 1992); Walker (Ed). The protein protocols handbook. Humana Press, Totowa, New Jersey (1996)).
  • markers include enzymes, radioisotopes, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds, bioluminescent compounds and chromogenic substances including colored particles such as colloidal gold and latex particles.
  • the peptides and polypeptides of the present invention are radiolabeled with, but not limited to, 32 P, 14 C, 3H, 35 S, 125 I or 131 I.
  • the labeled peptides can be detected by methods such as scintillation counting , gamma ray spectrometry or autoradiography.
  • the peptides and polypeptides of the present invention can be labeled with the firefly luciferin.
  • the bioluminescent compound can be covalently bound to the peptide or polypeptide selected by conventional methods, and the labeled peptide or polypeptide can be detected when an enzyme, for example, luciferase, catalyzes a reaction with ATP that causes the bioluminescent molecule to emit photons of light.
  • an enzyme for example, luciferase
  • Fluorogens are also widely used as markers. Examples of fluorogens include fluorescein and derivatives, rhodamine, Texas Red, phycoerythrin, phycocyanin and others. Generally, the fluorogen molecules are detected by a fluorescence detector.
  • the peptides and polypeptides of the present invention can be labeled with biotin and captured on a solid support by a specific biotin ligand such as avidin or streptavidin.
  • a specific biotin ligand such as avidin or streptavidin.
  • the peptides and polypeptides of the present invention can be labeled with enzymes (for example, peroxidase, alkaline phosphatase and other enzymes that provide a chromogenic or fluorogenic reaction after the addition of the appropriate substrate).
  • enzymes for example, peroxidase, alkaline phosphatase and other enzymes that provide a chromogenic or fluorogenic reaction after the addition of the appropriate substrate.
  • Peptides and polypeptides labeled with selected enzymes can be used, for example, to detect specific antibodies that recognize said peptides or polypeptides in a capture ELISA method, where the antibody to be detected is first captured by another antibody immobilized on a solid support and the peptide or labeled polypeptide, plus the appropriate substrate, are used to reveal that the antibody-polypeptide binding took place.
  • the peptides and polypeptides of the present invention can be labeled with colloidal gold for use in lateral flow immunochromatography assays, in accordance with methods well known to those skilled in the art.
  • methods for producing gold particles of various sizes and for the conjugation of gold with proteins are described in: Dykstra (Ed). A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum Press New York
  • the marking molecule can be magnetic microparticles and the system immobilized a magnet.
  • EXAMPLE 11 Marking and applications of Anisakis simplex nucleic acid molecules of the present invention.
  • Labeled nucleic acid molecules can be used as probes to detect complementary target sequences in a complex nucleic acid mixture by specific hybridization methods such as Southern, Northern blot, slot blot and dot blot transfer, in situ hybridization
  • ISH ISH
  • microarrays microarrays
  • marking agents including, but not limited to: radioactive agents, fluorescent dyes, chemiluminescent agents; microparticles; enzymes; colorimetric markers (such as, for example, colorants, colloidal gold and the like); magnetic markers and haptens (such as, for example, biotin, dioxigenin (DIG) and others for which antisera or monoclonal antibodies are available).
  • marking agents including, but not limited to: radioactive agents, fluorescent dyes, chemiluminescent agents; microparticles; enzymes; colorimetric markers (such as, for example, colorants, colloidal gold and the like); magnetic markers and haptens (such as, for example, biotin, dioxigenin (DIG) and others for which antisera or monoclonal antibodies are available).
  • DIG dioxigenin
  • the labeled probes of the present invention can be used as diagnostic tools, for example, for the detection of Anisakis spp. in infected human and / or animal tissues, and for research.
  • the selected nucleic acid sequences of the present invention can be labeled with DIG by PCR amplification using DIG-labeled nucleotides (Boehringer-Mannheim, Germany).
  • a nucleotide probe labeled with selected DIG can be obtained, corresponding to the positions of nucleotides 1490 and 1971 of SEQ ID N 0 : 1, using the transformed vector pQE-31 of the EXAMPLE 3 as a mold, and a set of direct priming (5 'SEQ ID N 0 : 27 3') and inverse (5 'SEQ ID N 0 : 28 3').
  • the tissue samples to be analyzed obtained from human biopsies or from infected animals, can be fixed in 4% paraformaldehyde, and then analyzed to detect the presence of Anisakis spp. using ISH methods and the probe labeled with previous DIG.
  • a detailed description of a method for performing the ISH of the present example has been described by Leiro et al. (2001), which was incorporated in this document as a reference.
  • EXAMPLE 12 Analysis of synthetic peptide sequences that inhibit the binding of US3 monoclonal antibody with Anisakis simplex peptides and polypeptides of the present invention.
  • peptide sequences are described that are recognized by the UA3 monoclonal antibody.
  • Said peptide sequences were recognized as "repetitions" of amino acids by analyzing the amino acid sequence of SEQ ID N 0 : 2 using the RADAR program http://www.ebi.ac.uk/Radar/ in the EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute).
  • Selected sequences of 12 amino acids were chemically synthesized from these "repeats” and tested in competitive ELISA with respect to the inhibition of binding of monoclonal antibodies UA3 with the recombinant polypeptide of SEQ ID N 0 : 4, immobilized in the wells of an ELISA plate.
  • the inhibitory activity of peptides corresponding to the N 0 : 7-11 amino acid sequences were tested in a capture ELISA, following the following typical steps: a) binding of the polypeptide of
  • Table III shows the inhibition values obtained for the synthetic peptides of SEQ ID N 0 : 7-11 (tested at three concentrations) on the binding of the monoclonal antibody UA3 to the polypeptide of SEQ ID N 0 : 4 immobilized in a ELISA plate. The results were expressed as the percentage of inhibition for each dilution of peptide with respect to the control (without inhibition). ND: Not done. As was deduced from the results observed, the monoclonal antibody UA3 has a preference for peptides of SEQ ID N 0 : 7 and 8, which differs only in one amino acid.
  • EXAMPLE 13 Importance of the synthetic amino acid sequences of SEQ ID N 0 : 7-11 as a target for anf / ' -Anisakis IgE antibodies present in sera of infected patients
  • the inhibitory activity of the amino acid sequences (SEQ ID N 0 : 7-11) on the binding of human IgE anti-Anisakis antibodies to the polypeptide of SEQ ID N 0 : 4 in an indirect ELISA was tested.
  • Table IV shows the inhibitory activity of a mixture of the synthetic peptides corresponding to SEQ ID N 0 : 7-11 on the binding of IgE antibodies present in sera of five infected patients to the immobilized SEQ ID N 0 4 polypeptide in ELISA plates.
  • the peptide mixture was tested at a final concentration of 1.5 x 10 ⁇ 3 M for each peptide.
  • the results were expressed as a percentage of inhibition of the peptide mixture with respect to the control (inhibited with a mixture of irrelevant peptides at the same final concentration).
  • the sequences tested were targets for a range of 25-74 percent of all anti-Anisakis IgE antibodies present in the sera of infected patients.
  • EXAMPLE 14 Characterization of Anisakis larval antigens in biological tissues
  • the peptides or polypeptides of the present invention can be used to immunize a mammal (such as, for example, rabbits, sheep, goats, mice or rats) and the specific polyclonal antibodies obtained can be used to reveal the presence of larvae of Anisakis in infected tissues of humans or animals.
  • the procedure for revealing Anisakis antigens in tissues with parasites can be performed following a conventional immunohistochemical method according to the following general steps: a) preparation of slides containing the sections of tissues included in paraffin; b) tissue blocking with TBS-TM or any other blocking reagent; c) washing stage; d) incubation with anti-polyclonal antibodies
  • the immunization (in this example, the preferred tidal molecule is the enzyme peroxidase, but any other marker such as, for example, those indicated in EXAMPLE 10 of the present invention, for the mapping of secondary antibodies) can be used; g) washing step; h) incubation with the appropriate enzyme substrate (such as, for example H2O2 + DAB); i) observation under the microscope. In another preferred embodiment, the presence of Anisakis spp. Proteins can be revealed. which comprise the amino acid sequences of the present invention in infected tissues of humans or animals using the monoclonal antibody UA3 as the primary antibody, using conventional immunohistochemical methods.
  • EXAMPLE 15 Detection of the presence of Anisakis antigens in food extracts using monoclonal antibodies and polyclonal antibodies of the present invention
  • the AcMs eg, the Ac3 UA3
  • the polyclonal antibodies obtained against the peptides, polypeptides or Proteins of the present invention can be used to design a capture ELISA method intended to detect the presence of Anisakis antigens in food extracts containing fish in its composition.
  • the ELISA method captures for the determination of Anisakis antigens in a food extract can be carried out in accordance with the following steps: a) coupling of polyclonal anti-Annisakis antibodies (100 microliters / well; antibody concentration of 10 micrograms / ml) overnight; b) aspiration, and then washing the ELISA plate with PBS three times; c) aspiration and , after blocking ELISA wells for 1 h at 37 0 C with a PBS solution containing skim milk powder and 3% Tween-20 0.2% (PBS-TM); d) aspiration, and then overnight incubation at 4 0 C and orbital agitation, with 100 microliters of the corresponding food extract (supernatant obtained by homogenization of the sample in PBS and subsequent centrifugation at 3,000 g for 30 minutes); e) washed three times with 200 microliters per well of PBS containing 0.2% Tween-20 (PBS-T);
  • Gastroallergic anisakiasis borderline between food allergy and parasitic disease-clinical and allergologic evaluation of 20 patients with confirmed acute parasitism by Anisakis simplex. Journal of Allergy and Clinical Immunology 105: 176-81.
  • Garc ⁇ a M., Moneo, I., Aud ⁇ cana, M. T., Del Pozo, M. D., Mu ⁇ oz, D., Fernández, E., Diez, J., Etxenagusia, M.A., Ansotegui, IJ. ,

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Abstract

Esta invención se refiere al campo del diagnóstico, prevención y terapia de infecciones humanas y animales por especies del género Anisakis. Esta invención también se refiere a la detección de antígenos de Anisakis en alimentos.

Description

Secuencias peptídicas y nucleotídicas de Anisakis spp., anticuerpos que reconocen dichas secuencias, y usos de los mismos
Esta invención se refiere al campo del diagnóstico, prevención y terapia de infecciones humanas y animales por especies del género Anisakis. Esta invención también se refiere a Ia detección de antígenos de Anisakis en alimentos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El género Anisakis (familia Anisakidae) incluye parásitos nematodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente se reconocen 8 especies de Anisakis entre las que se incluyen: a) las especies gemelas Anisakis simplex "en sentido estricto" (Rudolphi, 1809), A. pegreffi (Campana-Rouget y Biocca, 1955) y A. simplex C (Nascetti et al., 1986, Mattiucci et al., 2002), antiguamente incluidas en el complejo A. simplex; b) A. typica (Diesing, 1860); c) A physeterís (Baylis, 1923); d) A brevispiculata (Dollfus, 1966); e) A ziphidarum (Paggi et al., 1998); y f) A paggiae (Mattiucci et al. 2005).
Las especies de Anisakis alcanzan Ia madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente, en pinípedos. Estos mamíferos pueden infectarse por ingestión de a) hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan Ia tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por ejemplo, ballenas).
Al igual que los mamíferos marinos, los seres humanos también pueden infectarse por larvas L3 de Anisakis mediante Ia ingestión de peces y calamares crudos portadores del parásito, Io cual produce una enfermedad clínica denominada anisakiosis o anisakiasis. Con mucha frecuencia, varios platos de pescado se consideran de alto riesgo para Ia infección con especies de Anisakis. Éstos incluyen el sushi y el sashimi japonés, el arenque salteado o ahumado alemán, el gravlax escandinavo, el lomi-lomi hawaiano, el cebiche sudamericano y los boquerones en vinagre españoles ("pickled anchovies").
Cuando las larvas L3 de Anisakis infectan a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta gravedad. Dependiendo de Ia localización de las larvas y los síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal, extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En Ia forma gástrica (aguda) de anisakiosis, Ia larva penetra Ia pared gástrica y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de Ia ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3 vivas. Los estudios endoscópicos frecuentemente revelan lesiones consistentes en hemorragias puntiformes, petequias y erosión en el sitio de penetración. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos (es decir, urticaria/angioedema y algunas veces anafilaxis) en aproximadamente el 10% de los casos. La combinación de infección gástrica y síntomas alérgicos se denominó "anisakiosis gastroalérgica" (Daschner et al., 2000). Algunos pacientes pueden desarrollar una forma subaguda o crónica cuyas manifestaciones clínicas incluyen dolor epigástrico, dispepsia, vómitos y anorexia, que puede persistir durante varios meses o incluso años.
En Ia forma intestinal de Ia anisakiosis, Ia larva penetra en Ia pared intestinal, frecuentemente a nivel del íleon terminal. En los casos agudos, a menudo se observan Ia presencia de dolor abdominal (habitualmente 24-48 horas después de Ia ingestión del pescado contaminado), acompañado de náuseas, vómitos, hinchazón abdominal, induración y desviación del ritmo intestinal establecido con estreñimiento o diarrea. La observación macroscópica de los tejidos infectados en caso de anisakiosis intestinal revela lesiones flemonosas caracterizadas por edema local intenso, petequias, hiperemia e inflamación difusa de Ia serosa y el mesenterio. Estas lesiones pueden ocasionar obstrucción y dilatación proximal del intestino. En una cantidad importante de pacientes, se puede encontrar líquido ascítico abdominal con un alto contenido de eosinófilos. En Ia anisakiosis intestinal subaguda o crónica, los cambios granulomatosos inducidos por las larvas conducen a un engrosamiento de Ia pared, estenosis luminal y síntomas abdominales crónicos.
En Ia forma extragastrointestinal o ectópica, Ia larva infectante de
Anisakis araviesa Ia pared gastrointestinal, alcanzando Ia cavidad abdominal y migrando a órganos y tejidos tales como pulmones, páncreas, hígado, etc.
En estos casos, los síntomas clínicos dependen de Ia localización topográfica de Ia larva.
La forma de anisakiosis alérgica se reserva a pacientes que tienen reacciones alérgicas después de Ia infección con larvas de Anisakis, pero sin síntomas gástricos ni intestinales. Frecuentemente, los primeros síntomas aparecen muy pronto, en las primeras horas después de Ia ingestión del pescado contaminado y el transcurso clínico sigue el patrón general para las reacciones alérgicas de tipo I. Su gravedad varía desde una simple urticaria o angioedema a shock anafiláctico.
Cuando las larvas de Anisakis están presentes en el estómago, duodeno o colon, el examen endoscópico es el método preferible para demostrar Ia infección. Esta técnica también es útil para extraer las larvas por medio de las pinzas asociadas al endoscopio, Io cual conduce a Ia curación del paciente. No obstante, cuando: a) las larvas no están accesibles para el examen endoscópico; b) las larvas están parcialmente destruidas o no son visibles para el endoscopista; o c) los síntomas predominantes son alérgicos, el método preferible para confirmar Ia infección es demostrar Ia presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente. Éste último también es el método preferido para demostrar infecciones previas por Anisakis en individuos asintomáticos.
Entre las diferentes clases de anticuerpos que se producen contra antígenos de Anisakis durante Ia infección, los anticuerpos IgE son los más relevantes ya que: 1 ) están implicados en las reacciones alérgicas de tipo I observadas durante infecciones con Anisakis, y b) ésta es Ia clase de inmunoglobulinas más relevante en términos de especificidad entre las que están presentes en suero de pacientes infectados.
Desde Ia descripción del primer caso de infección humana por una larva de Anisakis (Van Thiel, 1960), se han hecho numerosos intentos de desarrollar un ensayo serológico sensible y específico para detectar anticuerpos ant\-Anisakis de diferentes clases.
Los primeros métodos para medir anticuerpos anti- Anisakis en suero incluyeron aglutinación del látex (Akao y Yoshimura, 1989); inmunodifusión doble e inmunoelectroforesis (Petithory et al., 1986; Tsuji, 1990), hemaglutinación indirecta (Asaishi et al., 1989; Tsuji, 1989); y ensayo de fijación del complemento (Oshima, 1972; Tsuji, 1989). Todos estos métodos tienen dos inconvenientes principales: a) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad y b) con estas técnicas no es posible Ia determinación de anticuerpos IgE (reagínicos).
Más recientemente, se pudieron realizar determinaciones de IgE anti- Anisakis en sueros de pacientes infectados con Ia introducción de otros inmunoensayos, por ejemplo, pruebas de radioalergosorbencia (Desowitz et al., 1985; Yamamoto et al., 1990), ensayos de inmunoabsorción vinculada a enzimas (ELISA) (Rodero et al. 2002), enzimoinmunoensayos fluorescentes (UniCap FEIA, Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB, Uppsala, Sweden) e inmunotransferencia (Del Pozo et al., 1996; García et al., 1997), pero también se presentaron problemas de sensibilidad y/o especificidad con estos métodos. La dificultad principal para desarrollar métodos serológicos útiles para el diagnóstico de Anisakiosis humana radica en Ia obtención de antígenos del parásito (en nuestro caso alérgenos) que por una parte (i) sean reconocidos por anticuerpos IgE presentes en los sueros de todos aquellos pacientes infectados, y (ii) que Ia molécula completa (es decir, todos los epítopos presentes en el alérgeno seleccionado) sean específicos del género Anisakis. De otro modo, se obtendría una baja sensibilidad y/o reacciones cruzadas que condujesen a falsos positivos.
Se intentó mejorar el serodiagnóstico de anisakiosis humana usando antígenos de excreción/secreción nativos completos (ESA) de larvas de
Anisakis spp. cultivadas in vitro (Poggensee et al., 1989; Baeza et al., 2004), o usando anticuerpos monoclonales para capturar antígenos específicos diana de extractos brutos de larvas L3 de Anisakis (Yagihashi et al., 1990;
Ubeira e Iglesias, 2000). Sin embargo, los métodos ELISA basados en estas estrategias también carecían de suficiente especificidad debido a Ia presencia de epítopos de reacción cruzada (principalmente O- y Λ/-glicanos) presentes en las glicoproteínas de Anisakis, incluyendo ESA.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se proporcionan secuencias de péptidos, polipéptidos y proteínas que mantienen Ia antigenicidad de las moléculas nativas de Anisakis de las que derivan, así como los ácidos nucleicos que codifican dichas secuencias y anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para dichos péptidos, polipéptidos o proteínas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos, así como los anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frentes a dichos péptidos, polipéptidos y proteínas son útiles para desarrollar inmunoensayos para el serodiagnóstico de Ia anisakiosis humana y animal, careciendo de los inconvenientes de los métodos presentados previamente. De esta manera, un primer aspecto de Ia presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada (denominada en Io sucesivo secuencia de ácido nucleico de Ia invención) seleccionada entre el siguiente grupo:
a. Un ácido nucleico que comprende Ia SEC ID N0 1 b. Un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico complementario de Ia SEC ID N0 1 c. Un fragmento del ácido nucleico de Ia SEC ID N0 1 que comprende Ia SEC ID N0 15 ó 17 d. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID N0 1 que codifica un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-Anisakis. e. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID
N0 1 que codifica un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-Anisakis. f. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID N0 1 que codifica un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-anisakis. g. Una secuencia nucleótidica que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en los apartados (a) a (f). En una realización preferida de Ia invención, Ia secuencia nucleótidica tiene una identidad de al menos el 80% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas previamente en los apartados (a) a (f) y, en una realización aún más preferida, dicha secuencia nucleótidica tiene una identidad de al menos el 90% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas previamente en los apartados (a) a (f) .
Un segundo aspecto de Ia presente invención proporciona un polipéptido, péptido o proteína aislada (denominada en Io sucesivo secuencia de aminoácidos de Ia invención) seleccionada entre el siguiente grupo:
a. Un polipéptido que comprende Ia SEC ID N0 2 b. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende Ia SEC ID N0
16 Ó 18 c. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis. d. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis. e. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-anisakis. f. Una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en los apartados (a) a (e) en este punto. En una realización preferida de Ia invención, Ia secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 80% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas previamente en los apartados (a) a (e) en este punto y, en una realización aún más preferida, dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas previamente en los apartados (a) a (e) en este punto. Todos estos péptidos, polipéptidos o proteínas pueden ser empledos para superar Ia dificultad principal de desarrollar métodos serológicos útiles para el diagnóstico de Ia anisakiosis humana, al proporcionar antígenos del parásito específicos del género Anisakis y que son reconocidos por los anticuerpos IgE presentes en los sueros de todos los pacientes infectados por Anisakis.
Una realización preferida de Ia invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que pueda ser reconocido por anticuerpos ant\-Anisakis y que comprenda un fragmento con un tramo contiguo de al menos 8 o más aminoácidos y con una identidad de al menos el 70% con cualquier fragmento de Ia SEC ID N0 2, seleccionado de entre las siguientes secuencias de aminoácidos:
a. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 7 b. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 8 c. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 9 d. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 10 e. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 11 f. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 12 g. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0
13 h. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 14
En un tercer aspecto, Ia secuencia de aminoácidos de Ia invención se produce, pero sin limitarnos a cualquiera de las siguientes técnicas: a. Técnicas recombinantes b. Síntesis química y c. Purificación sustancial a partir de nematodos de Ia familia Anisakidae
Un cuarto aspecto de Ia invención se refiere a un péptido, polipéptido o proteína que comprende dos o más de las secuencias de aminoácidos de Ia invención.
Un quinto aspecto de Ia invención se refiere a una molécula de ácido nucleico sintética o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de Ia invención.
Un sexto aspecto de Ia invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos aislada de Ia invención, marcada con una molécula de señalización. En una realización preferida de Ia invención, dicha molécula marcadora se selecciona, pero sin limitarnos a cualquiera de las moléculas de señalización del siguiente grupo:
a. Radiactivas b. Enzimáticas
C. Fluorescentes d. Luminiscentes e. Quimioluminiscentes f. Coloreadas
En una realización preferida de Ia invención, Ia molécula de mareaje se selecciona, pero sin limitarnos a cualquiera de las moléculas de señalización del siguiente grupo: a. Biotina o sus derivados b. Derivados de nitrofenol c. Oro coloidal d. Látex e. Fluoresceína
Un séptimo aspecto de Ia invención se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo (denominado en Io sucesivo anticuerpo de Ia invención) capaz de interaccionar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de Ia invención. También forman parte de Ia presente invención las secuencias de ácido nucleico capaces de codificar cualquiera de los anticuerpos de Ia invención.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de Ia invención es el anticuerpo producido por Ia línea celular de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2793 depositado el 15 de junio de 2006 en el "Germán
Collection of Microorganisms and CeII Cultures (DSMZ)" (de aquí en adelante anticuerpo UA3)
Una realización adicional se refiere a Ia línea celular de hibridoma con número de depósito DSM ACC2793 con fecha de depósito 15 de junio de 2006 depositada en Ia institución DSMZ.
Una realización adicional de Ia invención se refiere a las secuencias de reconocimiento de antígenos de cualquiera de los anticuerpos de Ia invención, particularmente las secuencias de reconocimiento de antígenos del anticuerpo UA3. Otro aspecto de Ia invención proporciona una secuencia de aminoácidos aislada de Ia invención, donde dicha secuencia de aminoácidos está fusionada o acoplada químicamente a un péptido, polipéptido o proteína adicional.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un vector de expresión o sistema de expresión (denominado en Io sucesivo sistema de expresión de Ia invención) que comprende una secuencia de nucleótidos de Ia invención.
Otro aspecto de Ia invención proporciona una célula hospedadora procariota o eucariota aislada (denominada en Io sucesivo célula hospedadora de Ia invención) transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico de Ia invención o con un vector o sistema de expresión de Ia invención.
Un octavo aspecto de Ia invención se refiere a un método para producir un péptido, polipéptido o proteína recombinante codificada por una secuencia de ácido nucleico de Ia invención, donde dicho método comprende cultivar una célula hospedadora de Ia invención en condiciones tales que se exprese y se produzca dicha secuencia de nucleótidos y después aislar dicho péptido, polipéptido o proteína.
Un noveno aspecto de Ia invención se refiere a un método in vitro para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. en una muestra biológica aislada, preferiblemente suero, que comprende: a. poner en contacto una muestra biológica con una secuencia de aminoácidos de Ia invención, en condiciones suficientes como para formar un complejo inmunológico entre dicho polipéptido y los anticuerpos de Ia muestra, y b. detectar dicho complejo inmunológico. En una realización preferida de Ia invención, el método in vitro es un inmunoensayo o un inmunoensayo enzimático.
Un décimo aspecto de Ia invención se refiere a un método in vitro para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra, preferiblemente una muestra biológica, o un extracto alimentario, que comprende: a. poner en contacto Ia muestra biológica o extracto alimentario con un anticuerpo de Ia invención, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho anticuerpo y los antígenos de Ia muestra y b. detectar dicho complejo inmunológico.
En una realización preferida, el anticuerpo de Ia invención que se usa para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra in vitro es el anticuerpo UA3.
Un aspecto preferido de Ia invención se refiere a un método in vivo para diagnosticar o pronosticar alergia a Anisakis spp. en un sujeto, que comprende someter al sujeto al péptido, polipéptido o proteína de Ia invención y controlar Ia reacción del sujeto.
Un aspecto aún más preferido del método in vivo de Ia invención para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. es por medio del uso del ensayo Prick.
Otro aspecto preferido de Ia presente invención es un kit (en Io sucesivo kit de Ia invención) adecuado para Ia detección de antígenos de Anisakis spp. en una muestra biológica o un extracto alimentario, que comprende: a) al menos un anticuerpo de Ia invención o sus fragmentos y b) un medio de detección para el complejo inmunológico. También es un aspecto preferido de Ia presente invención un kit adecuado para Ia detección de anticuerpos ant\-Anisakis spp. en una muestra biológica, preferiblemente suero, que comprende: a) al menos un péptido, polipéptido o proteína de Ia invención y b) un medio de detección para el complejo inmunológico.
En una realización preferida, el medio de detección usado en el kit de Ia invención consta de anticuerpos secundarios marcados capaces de reconocer Ia formación del complejo inmunológico.
En una realización más preferida, el medio de detección usado en el kit de Ia invención es un reactivo secundario marcado capaz de reconocer Ia formación del complejo inmunológico.
Otro aspecto más de Ia invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de Ia invención para Ia fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cualquier tipo de reacción alérgica a
Anisakis spp. Una realización preferida de Ia invención se refiere a Ia composición farmacéutica tal cual.
Como se usa en este documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier polímero de nucleótidos compuesto por dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, unidas entre sí por puentes fosfodiéster. "Ácidos nucleicos" o "moléculas de ácido nucleico" incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos y fragmentos generados por reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) o por otros métodos tales como ligamiento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Como se usa en este documento, el término "nucleótido" significa una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C") y timina ("T"). Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U").
Como se usa en este documento, una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación, etc.) o puede sintetizarse químicamente. La molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.
Como se usa en este documento, "cebador" se refiere a un oligonucleótido natural o sintético (que varía preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos de longitud) que puede hibridar con un molde de ADN o ARN complementario para formar un dúplex entre el cebador y el molde. Típicamente, un cebador es un oligodesoxirribonucleótido monocatenario, y sirve como punto de inicio de Ia síntesis de ácido nucleico por una polimerasa después de Ia hibridación con una cadena de ADN o ARN.
Como se usa en este documento, Ia expresión "secuencia de nucleótidos que codifica" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que dirige Ia expresión de un péptido, polipéptido o proteína específica. Las secuencias de ácido nucleico comprenden Ia secuencia de Ia cadena de ADN que se transcribe en ARN y también Ia secuencia de ARN que se traduce en una proteína. Las secuencias de ácido nucleico de Ia presente invención incluyen tanto secuencias de ácido nucleico de longitud completa como secuencias truncadas (que no tienen Ia longitud completa) derivadas de Ia proteína de longitud completa. También están comprendidas las variantes de la secuencia de nucleótidos que codifican el mismo péptido, polipéptido o proteína que Ia secuencia nativa, que puede construirse para proporcionar una preferencia de codones en una célula hospedadora específica.
Como se usa en este documento, "el complemento de" se refiere al concepto de una correspondencia inversa entre regiones de dos cadenas polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de Ia formación de pares de bases. En consecuencia, una "secuencia de bases complementarias" se refiere a una cadena polinucleotídica en Ia que todas las bases pueden formar pares de bases con una secuencia de bases en otra cadena polinucleotídica. Como se sabe, un nucleótido de adenina puede formar pares de bases con timina (A-T) o uracilo (A-U), mientras que un nucleótido de citosina puede formar pares de bases con guanina (C-G).
Como se usa en este documento, un "vector de expresión" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir Ia expresión de una secuencia o gen de interés. De acuerdo con Ia presente invención, el vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión de ADN o ARN capaz de expresar antígenos de Anisakis spp., tal como un plásmido o un fago. Preferiblemente, el vector de expresión de acuerdo con Ia presente invención es un plásmido (por ejemplo, pQE 31 y pTARGET).
Como se usa en este documento, el término "plásmido" se refiere a cualquier molécula de ADN circular autónoma capaz de replicarse en una célula independientemente del ADN cromosómico, e incluye tanto los tipos de expresión como los tipos de no expresión.
Como se usa en este documento, el término "recombinante" se refiere a una molécula de ADN compuesta preparada fuera de células vivas uniendo artificialmente fragmentos de ADN naturales o sintéticos a moléculas de
ADN que pueden replicarse en una célula viva, o moléculas que son el resultado de su replicación. El término "recombinante" también se refiere en este documento a un péptido, polipéptido o una proteína que se expresa usando una molécula de ADN recombinante.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de forma indistinta en este documento para designar una secuencia lineal de aminoácidos conectados entre sí por enlaces amida entre el grupo alfa-amino de un aminoácido y un grupo alfa-carboxi del aminoácido adyacente. Los polipéptidos con una longitud de veinticinco aminoácidos o menos se consideran "péptidos". Preferiblemente, un polipéptido que está codificado por un cistrón se considera una "proteína".
Como se usa en este documento, Ia expresión "fragmento de Ia secuencia de aminoácidos" significa una porción de aminoácidos contiguos del péptido, polipéptido, proteína o secuencia de aminoácidos especificada.
Como se usa en este documento, un "péptido, polipéptido o proteína aislada" es un péptido, polipéptido o proteína que está esencialmente exenta de contaminantes celulares, tales como lípidos, carbohidratos u otras impurezas asociadas con el polipéptido en Ia naturaleza. Un péptido, polipéptido o proteína aislada puede purificarse de su medio natural por técnicas cromatográficas convencionales. Los péptidos, polipéptidos y proteínas aisladas también pueden obtenerse por métodos recombinantes, o por síntesis química. Típicamente, se obtiene un "polipéptido sustancialmente purificado" cuando se separa de al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75% y aún más preferiblemente al menos el 90% de otros polipéptidos con los que coexiste de forma natural en una célula, tejido u organismo.
Como se usan en este documento, los términos "aminoácido" y
"aminoácidos" se refieren a todos los L-alfa-aminoácidos de origen natural o sus restos. La siguiente Tabla (Tabla 1 ) muestra el código de tres letras y el código de una letra (recomendado por Ia Comisión de Nomenclatura Bioquímica de Ia IUPAC-IUB) para Ia denominación de los aminoácidos naturales:
Asp D ácido aspártico Ne I isoleucina
Thr T treonina Leu L leucina Ser S serina Tyr Y tirosina
GIu E ácido glutámico Phe F fenilalanina
Pro P prolina His H histidina
GIy G glicina Lys K lisina
Ala A alanina Arg R arginina Cys C cisteína Trp W triptófano
Val V valina GIn Q glutamina
Met M metionina Asn N asparagina
Como se usa en este documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, mamíferos marinos y animales domésticos y de granja. Preferiblemente, el mamífero en este documento es el ser humano.
Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a glicoproteínas de Ia familia de las inmunoglobulinas, caracterizadas porque tienen propiedades de unión a antígenos, y se producen por células plasmáticas. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales que pertenecen a cualquier clase de anticuerpos, por ejemplo, IgG, IgD, IgM, IgA, IgE o derivados de los mismos. Como se usa en este documento, Ia expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. No pretende limitarse a una fuente particular del anticuerpo o a Ia forma en Ia que se produce, e incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos producidos por fusión celular o por técnicas recombinantes.
Como se usa en este documento, el término "antígeno" se refiere a cualquier molécula o agente capaz de inducir Ia producción de anticuerpos específicos cuando se introduce en un hospedador inmunocompetente. Como se usa en este documento, el término "antígeno" también se refiere a cualquier molécula o agente susceptible de reconocerse por un anticuerpo específico. Típicamente, pueden reconocerse como antígenos péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de estas moléculas. Estos antígenos también pueden contener grupos químicos orgánicos e inorgánicos unidos.
Como se usa en ese documento, el término "epítopo" se refiere a Ia porción de un antígeno que se reconoce por un anticuerpo (monoclonal o policlonal) o por el receptor con especificidad de antígeno de una célula. Cuando el antígeno es un péptido, polipéptido o una proteína, sus epítopos pueden ser fragmentos de al menos 5 aminoácidos de Ia secuencia de aminoácidos primaria, pero también regiones expuestas en Ia superficie de Ia proteína plegada madura (estructura terciaria tridimensional) compuestas por 5 o más aminoácidos. Típicamente, los epítopos pueden clasificarse como epítopos de células B y epítopos de células T basándose en los tipos de respuesta inmune que provocan.
Como se usa en este documento, el término "muestra biológica" se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que contiene uno o más de los ácidos nucleicos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos o proteínas de la presente invención. En Ia presente invención, el término "muestra biológica" también se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que pueda usarse como fuente para Ia determinación de anticuerpos anti-
Anisakis. Dichas muestras incluyen, pero sin limitación, tejidos aislados, sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial, saliva, orina o heces. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. Una muestra biológica puede obtenerse a partir de cualquier organismo eucariota, y preferiblemente de un mamífero tal como una rata, ratón, conejo, mamíferos marinos, o un ser humano.
Como se usa en este documento, el término "muestra alimentaria" se refiere a cualquier muestra obtenida de Ia amplia gama de materiales comestibles. Estas muestras incluyen, pero sin limitación, trozos de pescado crudo, ahumado y cocinado y alimentos que tienen materiales de pescado en su composición. El término "muestra alimentaria" también incluye alimentos para Ia nutrición de niños.
Como se usa en este documento, Ia expresión "anticuerpos anti- Anisakis" se refiere a cualquier clase o subclase de anticuerpos presentes en una muestra capaz de reconocer al menos un epítopo que esté presente en los antígenos de cualquiera de las especies del género Anisakis. La expresión incluye anticuerpos producidos durante infecciones naturales o experimentales de seres humanos y animales con el parásito, así como anticuerpos monoclonales y policlonales producidos después de Ia inmunización de seres humanos o animales con antígenos recombinantes o sintéticos no purificados o sustancialmente purificados, obtenidos a partir de especies del género Anisakis. La expresión también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos producidos por técnicas recombinantes, síntesis química o técnicas equivalentes. Como se usa en este documento, Ia expresión "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que ocupan Ia misma posición relativa cuando dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico se alinean una al lado de Ia otra. Para los fines de Ia presente invención, un método adecuado para calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos es usar el programa lalign de William Pearson que aplica el algoritmo de Huang y Miller, publicado en Adv. Appl. Math. (1991 ) 12: 337-
357, e incorporado en este documento como referencia. Este programa puede procesarse on Une en Ia dirección:
[http://www.ch. embnet.org/software/LALIGN_form. html].
Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo" se refiere a un método para detectar un analito en una muestra por medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Los analitos pueden ser moléculas pequeñas (haptenos) o moléculas grandes, tales como muchas proteínas plasmáticas. Con mucha frecuencia, el analito es un anticuerpo que puede detectarse por medio de Ia unión específica entre el anticuerpo y un ligando. Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo enzimático" (EIA) se refiere a un tipo amplio de inmunoensayos, caracterizados porque al menos uno de los reactivos está marcado con una enzima. Son EIA típicos los ensayos de inmunoabsorción vinculados a enzimas (ELISAs) de los cuales hay una serie de variantes. Si se desea una clasificación, o una descripción detallada de formatos de inmunoensayo, véase: Price y Newman (1997) Principies and Practice of Immunoassay, Macmillan Reference LTD, New York; Tijssen (1985) Practice and theory of enzyme immunoassays, En: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (R. H. Burdon and PH van Knippenberg, eds), Elsevier, Amsterdam; Deshpande (1996) Enzyme immunoassays, from concept to product development, Chapman & Hall, New York. Como se usa en este documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica que es adecuada para administrarse a un individuo mamífero. Típicamente, una composición farmacéutica comprende una cantidad de un agente activo farmacológicamente eficaz y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describen ejemplos de vehículos y formulaciones farmacéuticas adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, Mack Publishing
Company, Easton, 2000. Una composición farmacéutica puede formularse específicamente para Ia administración por diferentes vías incluyendo, pero sin limitación, Ia vía oral, parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intranasal, sublingual y similares.
Como se usa en este documento, Ia expresión "método de diagnóstico" se refiere a un método para Ia identificación de un estado patológico en un animal o en un individuo. Cuando dicho estado patológico se produce por un agente infeccioso, frecuentemente el diagnóstico puede realizarse usando un inmunoensayo (véase anteriormente) que permite Ia detección de los antígenos liberados por el patógeno, o de los anticuerpos inducidos en el hospedador por dicho patógeno. Los métodos de diagnóstico de Ia presente invención incluyen ensayos in vitro (tales como un ensayo ELISA, o el test de liberación de histamina de los basófilos) y ensayos in vivo tales como las pruebas cutáneas, por ejemplo, pero sin limitación, el ensayo de pinchazo en Ia piel {prick-test), intradermorreacciones, o las pruebas epicutáneas (por ejemplo, el ensayo de parche), que se usan frecuentemente para el diagnóstico de alergias. La expresión "métodos de diagnóstico" también incluye a las pruebas de provocación, consistentes en Ia administración controlada y gradual de Ia sustancia sospechosa de provocar un cuadro alérgico a través de diferentes vías: oral, conjuntival, nasal, bronquial, etc., para comprobar su tolerancia. Una descripción más detallada de estos últimos métodos, puede verse en: Comité de Reacciones Adversas a Alimentos: Metodología diagnóstica en Ia alergia a alimentos. Alergología e Inmunología Clínica, 14: 50-52 (1999), así como en diversos manuales de Ia especialidad de Alergología e Inmunología Clínica.
Como se usa en este documento, Ia expresión "repeticiones de secuencia" se refiere a motivos repetitivos en Ia secuencia de una proteína dada o de una molécula de ácido nucleico. Las repeticiones de secuencia en las secuencias polipeptídicas de Ia presente invención se realizaron usando el programa RADAR (véase el EJEMPLO N0 12).
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista habitual en Ia técnica a Ia que pertenece esta invención. En Ia práctica de Ia presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento. A Io largo de toda Ia descripción y las reivindicaciones, Ia palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Otros objetos, ventajas y características de Ia invención serán evidentes para los especialistas en Ia técnica tras el examen de Ia descripción o pueden aprenderse por Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar Ia presente invención.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. Aislamiento de ARNm y construcción de una biblioteca de expresión a partir de Anisakis simplex. Se extrajeron manualmente larvas de Anisakis simplex en Ia fase larvaria L3 (L3) de las visceras y cavidad peritoneal de Ia bacaladilla
(Micromesistius poutassou) y se almacenaron en nitrógeno líquido antes de comenzar Ia construcción de Ia biblioteca de ADNc. Se obtuvo el ARN mensajero (ARNm) total a partir de 1 g de larvas L3 de Anisakis simplex congeladas usando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track 2.0 (Invitrogen
S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se usaron cinco microgramos del ARN poli (A)+ obtenido para construir Ia biblioteca de ADNc de Anisakis usando el kit ZAP-cDNA Gigapack III GoId Cloning Kit (Stratagene, La JoIIa, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. De acuerdo con las instrucciones proporcionadas, el ARN poli (A)+ de Anisakis simplex se convirtió primero en ADNc bicatenario, después se ligó al vector de expresión lambda-ZAP y el vector se empaquetó usando extractos de empaquetamiento Gigapack III. Se usó como hospedador Ia cepa XL1-Blue MRF' de E. coli. La biblioteca resultante se amplificó, y contenía aproximadamente 1 ,3 x 1010 pfu/ml y un
1 % de fagos no recombinantes.
Exploración de Ia biblioteca de ADNc de Anisakis simplex Una vez amplificada, Ia biblioteca de ADNc de A. simplex se sometió a un cribado inmunológico usando anticuerpos monoclonales UA3. Siguiendo las recomendaciones proporcionadas en el ZAP-cDNA Gigapack III GoId Cloning Kit (Stratagene), se dejaron crecer células hospedadoras XL1-Blue MRF' en caldo LB con suplementos, se centrifugaron a 1000 x g, y el sedimento se resuspendió en sulfato de magnesio 10 mM. A esta suspensión se Ie añadió una alícuota de los fagos recombinantes y Ia mezcla se incubó 15 minutos a 370C para permitir que los fagos se unieran a las células. Después, Ia suspensión celular con los fagos adheridos se mezcló con agar NZY fundido (enfriado a aproximadamente 550C), y Ia mezcla se extendió uniformemente sobre una placa de 150 mm de diámetro, que contenía agar NZY recién vertido. Después de un tiempo de incubación de aproximadamente 3 h a 420C para permitir que comenzaran a formarse placas de fagos, se indujo Ia expresión de proteínas recombinantes recubriendo las placas con filtros de nitrocelulosa previamente impregnados en isopropil tio-beta-D-galactósido (IPTG) 10 mM en agua (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Después, las placas se incubaron a 370C durante 3,5 h, después de Io cual se retiraron cuidadosamente los filtros de nitrocelulosa que contenían las placas de fago adsorbido y se bloquearon con BSA al 3% en TBS (Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5) a 370C durante 30 minutos y después se incubaron con anticuerpos monoclonales (AcM) lgG1/kappa UA3 (dilución 1 :10.000 en TBS) a 40C durante una noche. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron en TBS que contenía Tween 20 al 0,05% (TBS-T), y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con IgG de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina a 1 :10.000 (Pierce, Rockford, IL, USA). Después de lavar otra vez, se visualizaron los complejos inmunes usando NBT (nitroazul de tetrazolio) y BCIP (fosfato de p-toluidina-5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) (Sigma Chemical Corp., St Louis, MO, USA).
Escisión in vivo de un único clon y secuenciación de ADNc Después de identificar un ADNc que codificaba una proteína reconocida por el AcM UA3 mediante el cribado inmunológico sobre el vector lambda-ZAP intacto, se purificó Ia placa de fago correspondiente
(clon UAR-H5). De acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el ZAP- cDNA Gigapack III GoId Cloning Kit (Stratagene), se transfirió Ia porción central de las placas positivas para el fago seleccionadas a un tubo de microcentrífuga y se liberaron las partículas de fago recombinante en tampón SM. Después, se realizó Ia escisión in vivo del fagémido pBluescript del vector lambda-ZAP mediante coinfección de células hospedadoras XL1-
Blue MRF' con el fago recombinante y el fago auxiliar ExAssist proporcionado con el kit. Al final de este procedimiento, el fagémido pBluescript escindido, obtenido empaquetado como partículas de fago filamentosas, se usó para infectar células hospedadoras SOLR. Se obtuvieron colonias de células SOLR transfectadas que contenían el fagémido pBluescript bicatenario con el inserto de ADN clonado de interés dejando crecer las células en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían ampicilina (100 microgramos/ml). Se dejaron crecer colonias bacterianas individuales en caldo LB-ampicilina y se purificó el ADN del fagémido pBluescript usando un kit Perfectprep Plasmid Maxi (Eppendorf).
Se usaron los cebadores M13 directo (5' SEC ID N0 19 3') e inverso (5' SEC
ID N0 20 3') de Ia secuencia de pBluescript SK, así como varios cebadores internos, para Ia secuenciación automática del ADN del fagémido usando el Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 377 (PE Biosystems). Se realizaron comparaciones de Ia secuencia de ADN y de Ia secuencia deducida de aminoácidos con los bancos de datos EMBL y SWISS-PROT usando el paquete de software ExPASy (el Expert Protein Analysis System), servidor World Wide Web (http://www.expasy.org/), del Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., 2003). La secuencia de nucleótidos descrita comprende una secuencia de 3288 nucleótidos, representada por Ia secuencia de Ia SEC ID N0: 1 , y codifica una secuencia de aminoácidos deducida de 1096 aminoácidos representada por Ia SEC ID N0: 2.
EJEMPLO 2. Subclonación de un fragmento de Ia secuencia de ADNc (SEC ID N0: 1 ) de Anisakis simplex en el vector pQE-31.
En una realización preferida, se subclonó un fragmento de ADN recombinante interno (SEC ID N0: 15) que corresponde a las posiciones de nucleótidos 1303 y 2139 de Ia SEC ID N0 1 , que codifica una secuencia polipeptídica de 279 aminoácidos (SEC ID N0: 16), en el vector de expresión pQE-31 usando un kit QIAexpress Type IV (Qiagen, IZASA S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y usando los sitios de restricción Sal I y Hind III en el sitio de clonación múltiple de pQE-31.
Está disponible otra metodología similar en manuales tales como:
Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Sambrook et al., 2001 ) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1998).
Antes de Ia clonación, se amplificó Ia secuencia del fragmento de ADNc que corresponde a Ia SEC ID N0: 15 mediante PCR, y los extremos de Ia secuencia se modificaron usando el fagémido pBluescript recombinante como molde y un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID N0 21 3') e inverso (5' SEC ID N0 22 3'), que contenían sitios de restricción Sal I y Hind III. Esta modificación mediante PCR proporcionó secuencias de nucleótidos específicas para las enzimas de restricción Sal I y Hind III para que el inserto recombinante tuviera extremos cohesivos con respecto al plásmido digerido. Las condiciones de PCR para Ia amplificación y modificación de Ia secuencia del fragmento de ADN correspondiente a Ia SEC ID N0: 15 comprendió: un ciclo de desnaturalización a 940C durante 4 minutos seguido por 35 ciclos de (30 s de desnaturalización a 940C; 30 s de hibridación a 550C; y un minuto de elongación a 720C), y un ciclo de elongación final de 720C durante 7 minutos. Después de que acabara Ia PCR, se purificó el ADN recombinante de Anisakis amplificado usando un kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen). A continuación, un microgramo del ADN plasmídico y 2 microgramos del ADN que codificaba el fragmento a insertar se digirieron con las enzimas de restricción Sal I y Hind III, de acuerdo con el tampón y las condiciones de incubación recomendadas por el fabricante (Invitrogen S.A., Barcelona, España). Finalmente, tanto el vector digerido como el inserto de ADN se purificaron con el kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen) y se ligaron en una proporción 1 :3 entre el vector y el inserto, usando ADN ligasa de T4 a 160C durante una noche. La inserción del ADN recombinante de Anisakis simplex de Ia SEC ID N0: 15 entre los sitios Sal I y Hind III del sitio de clonaje múltiple de pQE- 31 originó un marco abierto de lectura (ORF) plasmídico de 915 nucleótidos (SEC ID N0: 3), que codificó Ia secuencia de aminoácidos de Ia SEC ID N0:
4, Ia cual incluye Ia SEC ID N0: 16 de Anisakis (porción central) y dos secuencias de aminoácidos adicionales (colas): SEC ID N0 23 y SEC ID N0
24, localizadas, respectivamente, en las porciones amino y carboxilo terminales de Ia secuencia de Anisakis clonada. La presencia de Ia señal de
6 x Histidina en Ia porción amino del polipéptido codificado puede facilitar Ia purificación de polipéptidos recombinantes, pero también pueden usarse otros vectores y métodos de purificación según convenga.
EJEMPLO 3. Transformación de células M15 (pREP4) con pQE-31 recombinante
La transformación de células M 15 [pREP4] de E. coli con el vector pQE-31 recombinante se realizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual (The QIAexpresionist: A handbook for high- level expression and purification of 6xHis-tagged proteins) del fabricante (Qiagen). De acuerdo con este protocolo, se incubaron una alícuota de células M 15 competentes preparadas previamente y una alícuota de Ia mezcla de ligamiento en hielo durante 20 minutos y después se incubaron a 420C durante 90 minutos. Después de dichas incubaciones, las células se resuspendieron en caldo Psi y se incubaron durante 90 minutos a 370C. Después, las células M15 se sembraron en placas de agar LB que contenían 25 microgramos por mililitro de kanamicina y 100 microgramos de ampicilina y se incubaron durante una noche a 370C. Una colonia positiva se dejó crecer en caldo LB suplementado con kanamicina y penicilina, se centrifugó y las células sedimentadas se almacenaron en medio SOB que contenía glicerol a -8O0C. EJEMPLO 4. Expresión del polipéptido recombinante de Anisakis simplex
Para producir el polipéptido recombinante de Anisakis recombinante del Ejemplo 2, las células M15 transformadas se descongelaron y dejaron crecer a 370C en caldo LB, complementado con kanamicina y ampicilina, con agitación orbital (200 r.p.m.) hasta alcanzar una DO6oo de 0,5. Después se indujo Ia expresión del polipéptido añadiendo IPTG 1 mM, y las células se incubaron durante 4 h adicionales a 370C con las mismas condiciones de agitación. Posteriormente, las células se centrifugaron a 5000 x g y se almacenaron congeladas a -3O0C hasta Ia purificación del polipéptido expresado, según se describe en el Ejemplo 5. En estas condiciones de cultivo, las células M15 producen el polipéptido recombinante de Ia SEC ID N0: 4 precipitado en forma de cuerpos de inclusión.
EJEMPLO 5. Purificación de polipéptido recombinante de Anisakis simplex
En una realización preferida, los cuerpos de inclusión de las células M15 sedimentadas, obtenidas a partir de un cultivo de 250 mi, se purificaron de acuerdo con las siguientes etapas: a) el sedimento bacteriano se resuspendió en 15 mi de reactivo B-PER (Pierce, Rockford, IL, USA) y se agitó suavemente durante 10 minutos; b) Ia muestra se centrifugó a 15.000 x g y el sobrenadante, que contenía proteínas solubles, se desechó; c) el sedimento que contenía los cuerpos de inclusión se resuspendió en otros 15 mi de B-PER y a Ia suspensión celular se Ie añadió lisozima a una concentración final de 200 microgramos (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y se incubó a TA durante 5 minutos; d) Ia suspensión se diluyó con 100 mi de una dilución 1 :10 de B-PER y las células se resuspendieron empleando un agitador vortex; e) Ia suspensión celular se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se resuspendió en otros 100 mi de B-PER y se agitó en el vortex; f) Ia suspensión que contenía B-PER diluido se centrifugó a 15.000 x g y el sedimento se resuspendió en 50 mi de un tampón de desnaturalización que constaba de NaHbPO4 100 mM, Tris. Cl 10 mM y Urea
6 M, pH 8,0, y después se agitó en el vortex; g) Ia suspensión se centrifugó a 15.000 x g durante 20 minutos y se disolvió en 10 mi de un tampón de desnaturalización que constaba de NaH2PO4 100 mM, Tris. Cl 10 mM y Urea 8 M, pH 8,0 (tampón de carga); h) a Ia solución que contenía el péptido, se
Ie añadieron 2,5 mi de una suspensión de resina Ni-NTA al 50% (Qiagen) y
Ia mezcla se agitó en un agitador orbital durante 30 minutos a TA. Después
Ia suspensión de resina se cargó en una columna vacía, y se lavó con dos volúmenes del tampón de carga; i) los polipéptidos retenidos se eluyeron con una solución que contenía Tris. Cl 0,15 M, pH 10,5, que contenía imidazol 250 mM, y se almacenó congelada a -3O0C hasta su uso.
EJEMPLO 6. Subclonación del fragmento de Ia secuencia de ADNc de Anisakis simplex de Ia SEC ID N0: 17 en el vector pTARGET y transformación de células JM109 competentes.
En otra realización preferida, un fragmento interno de 834 aminoácidos (SEC ID N0: 17) correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1306-2139 de Ia SEC ID N°:1 , que codifica Ia secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por Ia SEC ID N0: 18, se subclonó en el vector pTARGET (Promega). Para ello, Ia SEC ID N0: 17 seamplificó mendiante PCR empleando un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID N0 25 3') y reverso (5' SEC ID N0 26 3') y el vector pQE-31 transformado del EJEMPLO 3 como molde. Las condiciones de PCR fueron: un ciclo de desnaturalización a 940C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de (45 segundos de desnaturalización a 940C; 45 segundos de hibridación a 550C; y 1 ,5 minutos de elongación a 720C), y un ciclo de elongación final de 10 minutos a 720C. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 2% y después se clonaron en el vector pTARGET. El ligamiento de pTARGET y el inserto de Anisakis, y Ia transformación de células JM109 competentes se realizaron como se indica en las instrucciones del uso del producto. Se seleccionaron transformantes JM109 positivos por selección de colonias blancas usando placas de agar LB suministradas con ampicilina/ IPTG/X-Gal como se describe por el fabricante.
En las condiciones experimentales descritas, Ia subclonación de Ia secuencia de ADNc correspondiente a Ia SEC ID N0: 17 en el vector pTARGET originó un ORF plasmídico de 846 nucleótidos (SEC ID N0: 5) que codifica para Ia secuencia de 282 aminoácidos de Ia SEC ID N0: 6, que incluye el polipéptido de Anisakis de Ia SEC ID N0: 17, y una secuencia adicional de 4 aminoácidos (SEQ ID N0: 24) situada en Ia porción carboxilo terminal de Ia SEC ID N0: 17.
EJEMPLO 7. Aislamiento del ADN del plásmido recombinante de células J M 109 y vacunación de ratones con ADN plasmídico
Se dejó crecer una colonia positiva de células JM109 en caldo LB- ampicilina, se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se usó para Ia extracción del ADN plasmídico usando el kit Plasmid Maxi (Qiagen). Se inoculó un total de 50 microlitros (concentración de un microgramo por microlitro) de ADN plasmídico sin endotoxinas en el músculo cuadríceps de las dos patas de ratones Balb/c de 10-20 semanas de edad. Las inoculaciones se realizaron usando una jeringa de insulina como se describe por Leiro et al. (2002).
EJEMPLO 8. Inmunoensayos para Ia determinación de anticuerpos anti- Anisakis en sueros de pacientes infectados
Un inmunoensayo de acuerdo con Ia presente invención puede ser cualquier inmunoensayo capaz de detectar Ia presencia de anticuerpos anti- Anisakis en cualquier fluido biológico procedente de un individuo o especie animal. Los ejemplos de tipos de inmunoensayos incluyen inmunoensayos en fase líquida y fase sólida, e inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto.
Típicamente, Ia medición de los niveles de anticuerpos ant\-Anisakis específicos en un fluido biológico, como por ejemplo en suero o plasma, puede realizarse por métodos ELISA, como son los métodos ELISA descritos en este ejemplo.
a) Muestras de suero Las muestras de suero usadas en los métodos ELISA de este ejemplo se obtuvieron a partir de individuos no infectados (donantes de sangre sanos) y de individuos infectados con el parásito Anisakis simplex. Los sueros se consideraron positivos cuando se obtuvieron a partir de individuos que tenían una historia reciente de haber comido pescado crudo y Ia presencia del parásito pudo confirmarse por examen endoscópico.
b) ELISA de captura con antígenos O-desglicosilados y anticuerpos monoclonales UA3.
Se describe un método ELISA de captura (UA3-ELISA) basado en Ia captura de antígenos O-desglicosilados de Anisakis spp. específicos por anticuerpos monoclonales UA3 inmovilizados.
El antígeno O-desglicosilado usado en este inmunoensayo se obtuvo como se ha descrito previamente, y se basa en el tratamiento de antígenos de Anisakis enteros con NaOH 0,02 M a 5O0C durante 16 h, y neutralización adicional del pH con HCI.
Para realizar el ELISA de captura, se realizaron las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos monoclonales UA3 purificados (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de Ia placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocilios de ELISA durante 1 h a 370C con una solución de PBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (PBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 1 ,5 h a 370C con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocilio de PBS que contenía Tween-20 al 0,2% (PBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :2500 de anticuerpos monoclonales anti-lgE humana marcados con FITC (Ingenasa, Madrid, España; el mareaje con
FITC se llevó a cabo de acuerdo con el método de Liddel y Cryer, 1991 ); g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :1.500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako, Barcelona, España); i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocilio de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
c) ELISA indirecto con el polipéptido recombinante de Anisakis expresado en células M15 transformadas.
En una realización preferida, el polipéptido recombinante de Ia SEC ID N0: 4 se usó para realizar un ELISA indirecto para medir anticuerpos anti- Anisakis en sueros de individuos infectados con Anisakis.
En este ejemplo se describe un método ELISA para Ia determinación de anticuerpos IgE en muestras de suero humano, pero también pueden medirse otras clases (IgA, IgG, IgM) y subclases (IgAI , lgA2, IgGI , lgG2, lgG3 e lgG4) de anticuerpos cambiando Ia especificidad de los anticuerpos anti-humano secundarios. Del mismo modo, el inmunoensayo también puede adaptarse para determinaciones de anticuerpos en fluidos biológicos de otras especies animales (por ejemplo, otros mamíferos, aves o peces) eligiendo los anticuerpos secundarios anti-especie apropiados. En una realización preferida, el método para realizar el ELISA indirecto (rUA3-ELISA) del presente ejemplo se realizó de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de las placas de ELISA con el antígeno recombinante de Anisakis de Ia SEC ID N0: 4 en Tris.CI 0,1 M, pH 10,5; b) aspiración, y después lavado de Ia placa de ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocilios de ELISA durante 1 h a 370C con una solución de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación de las placas durante 1 ,5 h a 370C con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocilio de TBS que contenía Tween-20 al 0,2% (TBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :2500 de anticuerpos monoclonales anti-lgE humana marcados con FITC (Ingenasa; marcado con FITC de acuerdo con el método de Liddel y Cryer, 1991 ); g) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; h) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :1500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako); i) aspiración, y después lavado con 200 microlitros por pocilio de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices).
La siguiente Tabla I muestra Ia comparación de los valores de IgE obtenidos para 22 muestras de suero positivas de pacientes infectados con el nematodo Anisakis simplex, ensayadas por los métodos de ELISA de captura (UA3-ELISA) y ELISA indirecto (rUA3-ELISA) descritos en el Ejemplo 8 de Ia presente invención. La tabla muestra los valores medios de absorbancia, medidos a 492 nm, para cada suero. Los valores de corte {cut- off) para las determinaciones de IgE fueron DO = 0,105 para el método UA3-ELISA y DO = 0,049 para el método rUA3-ELISA. Nótese que Ia muestra 2 fue sólo positiva por el método rUA3-ELISA. Estos resultados demuestran que tanto el método UA3-ELISA (sensibilidad del 95,45%) como el método rUA3-ELISA (sensibilidad del 100%) son métodos válidos para serodiagnóstico de infecciones humanas por Anisakis spp.
Tabla I
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EJEMPLO 9. Producción de anticuerpos en ratones transfectados con el vector pT ARGET recombinante que codifica el polipéptido de Ia SEC ID N0: 6 En este ejemplo, se extrajo sangre de ratones transfectados con pTARGET recombinante que codificaba el polipéptido de Ia SEC ID N0: 6 (véase el EJEMPLO 7) con anestesia, y el suero obtenido se ensayó en ELISA indirecto para determinar Ia presencia de anticuerpos IgGI reactivos con el polipéptido de Ia SEC ID N0: 4 inmovilizado en Ia placa de ELISA. El método ELISA fue el mismo descrito en el EJEMPLO 8b, con Ia excepción de que se usaron anticuerpos de cabra anti-lgG de ratón marcados con peroxidasa (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA; dilución 1 :3000) en lugar de reactivos anti-humano secundarios. En este ejemplo, se ensayaron sueros de ratón a una dilución 1 :100. La siguiente Tabla Il muestra Ia respuesta de anticuerpos IgGI obtenida en ratones BALB/c después de Ia vacunación (por vía parenteral) con 100 microgramos/ratón del plásmido p-TARGET recombinante que contenía el inserto de ADN de Anisakis simplex que codifica el polipéptido de Ia SEC ID N0: 6. La extracción de sangre de los ratones se hizo un mes después de Ia inmunización. La tabla muestra los valores medios de absorbancia ± SD para cada suero, medidos a 492 nm (tres determinaciones independientes).
Estos resultados demuestran que una vacuna de ADN recombinante que contiene una secuencia de ADN de Anisakis (mostrado en este experimento por Ia SEC ID N0: 6 de Ia presente invención) puede ser útil para Ia inducción de anticuerpos ant\-Anisakis in vivo. La inducción in vivo de anticuerpos por vacunas es de interés para: a) Ia inducción de protección inmunológica contra agentes infecciosos, y b) para Ia prevención de reacciones alérgicas. Tabla II
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EJEMPLO 10. Mareaje y aplicaciones de péptidos y polipéptidos recombinantes de Anisakis simplex de Ia presente invención
El mareaje de los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención con una biomolécula o molécula química detectable es útil para fines tales como diagnóstico in vivo e in vitro e investigación de laboratorio. Hay muchos marcadores y métodos diferentes para el mareaje conocidos por los especialistas en Ia técnica (por ejemplo, Kessler (Ed). Nonradiactive labeling and detection of biomolecules. Springer-Verlag, Berlín 1992); Walker (Ed). The protein protocols handbook. Humana Press, Totowa, New Jersey (1996)). Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en Ia presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y sustancias cromogénicas incluyendo partículas coloreadas tales como oro coloidal y partículas de látex. En una realización preferida, los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención están radiomarcados con, pero sin limitación, 32P, 14C, 3H, 35S, 125I o 131 I. Los péptidos marcados pueden detectarse por métodos tales como recuento de centelleo, espectrometría de rayos gamma o autorradiografía. En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención pueden marcarse con Ia luciferina de luciérnaga. El compuesto bioluminiscente puede estar unido covalentemente al péptido o polipéptido seleccionado por métodos convencionales, y el péptido o polipéptido marcado se puede detectar cuando una enzima, por ejemplo, luciferasa, cataliza una reacción con ATP que hace que Ia molécula bioluminiscente emita fotones de luz.
Los fluorógenos también son de amplio uso como marcadores. Los ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, ficocianina y otros. Generalmente, las moléculas de fluorógeno se detectan por un detector de fluorescencia.
En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención (por ejemplo, el polipéptido de Ia SEC ID N0: 4) pueden marcarse con biotina y capturarse en un soporte sólido por un ligando de biotina específico como avidina o estreptavidina. Una vez que se ha inmovilizado el polipéptido marcado en el soporte sólido (por ejemplo, el pocilio de una placa de ELISA), puede usarse para detectar anticuerpos contra el polipéptido seleccionado realizando las incubaciones típicas y etapas de lavado como las descritas en el Ejemplo 8b de Ia presente invención.
Como alternativa, los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención pueden marcarse con enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina y otras enzimas que proporcionan una reacción cromogénica o fluorogénica después de Ia adición del sustrato apropiado). Pueden usarse péptidos y polipéptidos marcados con enzimas seleccionadas, por ejemplo, para detectar anticuerpos específicos que reconocen dichos péptidos o polipéptidos en un método ELISA de captura, donde el anticuerpo a detectar se captura primero por otro anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido y el péptido o polipéptido marcado, más el sustrato apropiado, se usan para revelar que tuvo lugar Ia unión anticuerpo-polipéptido. En otra realización preferida más, los péptidos y polipéptidos de Ia presente invención pueden marcarse con oro coloidal para su uso en ensayos de inmunocromatografía de flujo lateral, de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en Ia técnica. Por ejemplo, se describen métodos para producir partículas de oro de diversos tamaños y para Ia conjugación de oro con proteínas en: Dykstra (Ed). A manual of applied techniques for biological electrón microscopy. Plenum Press. New York
(1993).
Además, en otra realización preferida, Ia molécula de mareaje puede ser micropartículas magnéticas y el sistema inmovilizado un imán.
EJEMPLO 11. Mareaje y aplicaciones de moléculas de ácido nucleico de Anisakis simplex de Ia presente invención.
Pueden usarse moléculas de ácido nucleico marcadas como sondas para detectar secuencias diana complementarias en una mezcla de ácido nucleico compleja por métodos de hibridación específicos tales como transferencia de Southern, de Northern, slot blot y dot blot, hibridación in situ
(ISH) y micromatrices (microarrays). Los métodos para marcar moléculas de ácido nucleico son bien conocidos en Ia técnica y pueden realizarse usando diferentes agentes de mareaje incluyendo, pero sin limitación: agentes radiactivos, colorantes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes; micropartículas; enzimas; marcadores colorimétricos (tales como, por ejemplo, colorantes, oro coloidal y similares); marcadores magnéticos y haptenos (tales como, por ejemplo, biotina, dioxigenina (DIG) y otros para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales).
Las sondas marcadas de Ia presente invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico, por ejemplo, para Ia detección de ADN de Anisakis spp. en tejidos humanos y/o animales infectados, y para investigación. En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico seleccionadas de Ia presente invención pueden marcarse con DIG por amplificación por PCR usando nucleótidos marcados con DIG (Boehringer- Mannheim, Alemania).
Como ejemplo, puede obtenerse una sonda de secuencia de nucleótidos marcada con DIG seleccionada (482 pares de bases), que corresponde a las posiciones de los nucleótidos 1490 y 1971 de Ia SEC ID N0: 1 , usando el vector pQE-31 transformado del EJEMPLO 3 como molde, y un conjunto de cebadoeas directo (5' SEC ID N0: 27 3') e inverso (5' SEC ID N0: 28 3'). Las muestras tisulares a analizar, obtenidas a partir de biopsias humanas o de animales infectados, pueden fijarse en paraformaldehído al 4%, y después analizarse para detectar Ia presencia de ADN de Anisakis spp. usando métodos ISH y Ia sonda marcada con DIG anterior. Una descripción detallada de un método para realizar el ISH del presente ejemplo ha sido descrita por Leiro et al. (2001 ), que se incorporó en este documento como referencia.
EJEMPLO 12. Análisis de secuencias peptídicas sintéticas que inhiben Ia unión de anticuerpo monoclonal US3 con péptidos y polipéptidos de Anisakis simplex de Ia presente invención.
En un aspecto de Ia presente invención, se describen secuencias peptídicas que se reconocen por el anticuerpo monoclonal UA3. Dichas secuencias peptídicas se reconocieron como "repeticiones" de aminoácidos analizando Ia secuencia de aminoácidos de Ia SEC ID N0: 2 usando el programa RADAR http://www.ebi.ac.uk/Radar/ en el EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute). Se sintetizaron químicamente secuencias seleccionadas de 12 aminoácidos a partir de estas "repeticiones" y se ensayaron en ELISA competitivo con respecto a Ia inhibición de Ia unión de anticuerpos monoclonales UA3 con el polipéptido recombinante de Ia SEC ID N0: 4, inmovilizado en los pocilios de una placa de ELISA. La actividad inhibidora de péptidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos N0: 7-11 se ensayaron en un ELISA de captura, siguiendo las siguientes etapas típicas: a) unión del polipéptido de
Ia SEC ID N0: 4 a los pocilios de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocilios de ELISA durante 1 h a 370C con tampón TBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-
20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 2 h a
370C con 100 microlitros de Ia dilución apropiada de mAb UA3 preincubado con el péptido inhibidor a ensayar; d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contenía Tween-20 al 0,2% (TBS-T); e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :3000 en PBS-TM de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Nordic Immunological
Laboratory, Tilburg, The Netherlands); f) aspiración, y lavado 3 veces con
200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); i) lectura de las densidades ópticas
(DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices).
La siguiente Tabla III muestra los valores de inhibición obtenidos para los péptidos sintéticos de las SEC ID N0: 7-11 (ensayados a tres concentraciones) sobre Ia unión del anticuerpo monoclonal UA3 al polipéptido de Ia SEC ID N0: 4 inmovilizado en una placa de ELISA. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición para cada dilución de péptido con respecto al control (sin inhibición). ND: No hecho. Como se dedujo de los resultados observados, el anticuerpo monoclonal UA3 tiene preferencia por péptidos de las SEC ID N0: 7 y 8, que difiere solamente en un aminoácido.
Tabla
Concentración de péptidos 2x10"3M 7.4x10"5M 8.23x10"6M
Figure imgf000042_0001
EJEMPLO 13. Importancia de las secuencias de aminoácidos sintéticas de las SEC ID N0: 7-11 como diana para anticuerpos IgE anf/'-Anisakis presentes en sueros de pacientes infectados
En otra realización preferida, se ensayó Ia actividad inhibidora de Ia secuencias de aminoácidos (SEC ID N0: 7-11 ) sobre Ia unión de anticuerpos IgE humanos ant\-Anisakis al polipéptido de Ia SEC ID N0: 4 en un ELISA indirecto competitivo del siguiente modo: a) unión del polipéptido de Ia SEC ID N0: 4 a los pocilios de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocilios de ELISA durante 1 h a 370C con tampón TBS que contiene leche descremada en polvo al 3% y Tween- 20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 2 h a 370C con 100 microlitros de una dilución 1 :1 del suero del paciente correspondiente y Ia solución peptídica en TBS (1 ,5 X 10~3 M, concentración final para cada uno de los péptidos anteriores); d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contiene Tween-20 al 0,2% (TBS-T); e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :2500 de anticuerpos monoclonales anti-lgE humana marcados con FITC; f) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :1500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako); h) aspiración, y después lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; i) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); j) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en un lector multipocillo (Molecular Devices).
La siguiente Tabla IV muestra Ia actividad inhibidora de una mezcla de los péptidos sintéticos que corresponden a las SEC ID N0: 7-11 sobre Ia unión de anticuerpos IgE presentes en sueros de cinco pacientes infectados al polipéptido de Ia SEC ID N0 4 inmovilizado en placas de ELISA. La mezcla peptídica se ensayó a una concentración final de 1 ,5 x 10~3 M para cada péptido. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de Ia mezcla peptídica con respecto al control (inhibido con una mezcla de péptidos irrelevantes a Ia misma concentración final). Como se observó en Ia Tabla, las secuencias ensayadas fueron dianas para un intervalo del 25- 74 por ciento de todos los anticuerpos IgE anti-Anisakis presentes en los sueros de pacientes infectados. Sin embargo, se entiende que probablemente otros péptidos y polipéptidos recombinantes o sintéticos que comprenden un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0: 2, o repeticiones de dichas secuencias, también pueden reconocerse por anticuerpos ant\-Anisakis de varios isotipos que están presentes en sueros de pacientes infectados.
Tabla IV
Figure imgf000043_0001
EJEMPLO 14. Caracterización de antígenos de larvas de Anisakis en tejidos biológicos En una realización preferida, los péptidos o polipéptidos de Ia presente invención pueden usarse para inmunizar un mamífero (tal como, por ejemplo, conejos, ovejas, cabras, ratones o ratas) y los anticuerpos policlonales específicos obtenidos pueden usarse para revelar Ia presencia de larvas de Anisakis en tejidos infectados de seres humanos o animales.
Típicamente, el procedimiento para revelar antígenos de Anisakis en tejidos con parásitos puede realizarse siguiendo un método de inmunohistoquímica convencional de acuerdo con las siguiente etapas generales: a) preparación de los portaobjetos que contienen las secciones de tejidos incluidos en parafina; b) bloqueo de los tejidos con TBS-TM o cualquier otro reactivo de bloqueo; c) etapa de lavado; d) incubación con anticuerpos policlonales anti-
Anisakis; e) etapa de lavado; f) incubación con anticuerpos secundarios marcados que reconocen anticuerpos IgG de Ia especie animal usada para
Ia inmunización (en este ejemplo, Ia molécula de mareaje preferida es Ia enzima peroxidasa, pero puede usarse cualquier otro marcador tal como, por ejemplo, los indicados en el EJEMPLO 10 de Ia presente invención, para el mareaje de anticuerpos secundarios); g) etapa de lavado; h) incubación con el sustrato enzimático apropiado (tal como, por ejemplo H2O2 + DAB); i) observación al microscopio. En otra realización preferida, puede revelarse Ia presencia de proteínas de Anisakis spp. que comprenden las secuencias de aminoácidos de Ia presente invención en tejidos infectados de seres humanos o animales usando el anticuerpo monoclonal UA3 como anticuerpo primario, usando métodos de inmunohistoquímica convencionales.
EJEMPLO 15. Detección de Ia presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios empleando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales de Ia presente invención
En otra realización preferida, los AcMs (ejemplo el AcM UA3) y los anticuerpos policlonales obtenidos frente a los péptidos, polipéptidos o proteínas de Ia presente invención pueden ser utilizados para diseñar un método ELISA captura destinado a detectar Ia presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios que contengan pescado en su composición. En una realización todavía más preferida, el método ELISA captura para Ia determinación de antígenos de Anisakis en un extracto alimentario se puede llevar a cabo de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos policlonales ant\-Anisakis (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de Ia placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocilios de ELISA durante 1 h a 370C con una solución de PBS que contenga leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (PBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante una noche a 40C y agitación orbital, con 100 microlitros del correspondiente extracto alimentario (sobrenadante obtenido por homogenización de Ia muestra en PBS y posterior centrifugación a 3.000 g durante 30 minustos); e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocilio de PBS que contenga Tween-20 al 0,2% (PBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :2500 de anticuerpos monoclonales UA3 marcados con biotina (mareaje realizado según se describe en Ia referencia Walker (1996)); g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1 :1.500 avidina-peroxidasa (Pierce, Rockford, IL, USA); i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocilio de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). BIBLIOGRAFÍA
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Una secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada entre el siguiente grupo: a. Un ácido nucleico que comprende Ia SEC ID N0 1 b. Un ácido nucleico que comprende el complemento de Ia SEC ID N0 I c. Un fragmento del ácido nucleico de Ia SEC ID N0 1 que comprende Ia SEC ID N0 15 o Ia SEC ID N0 17. d. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID
N0 1 que codifica un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocido por anticuerpos ant\-Anisakis. e. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID N0 1 que codifica un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis. f. Un ácido nucleico que comprende un fragmento de Ia SEC ID N0 1 que codifica un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos de Ia SEC ID N0 2 capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis. g. Un ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas previamente.
2. Un polipéptido, péptido o proteína aislada codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas de Ia reivindicación 1 , seleccionado entre el siguiente grupo: a. Un polipéptido, proteína o péptido que comprende Ia SEC ID N0 2 b. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende Ia SEC ID N0
16 o Ia SEC ID N0 18. c. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos ant\-Anisakis. d. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis. e. Un fragmento de Ia SEC ID N0 2 que comprende un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos ant\-Anisakis. f. Un polipéptido, péptido o proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de polipéptidos, proteínas o péptidos descritas previamente.
3. El péptido, polipéptido o proteína aislada de acuerdo con Ia reivindicación 2(a)-2(e) o Ia secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con Ia reivindicación 1(a)-1 (f), que presente una identidad de al menos el 80% con cualquiera de estas secuencias.
4. El polipéptido, péptido o proteína aislada de acuerdo con Ia reivindicación 2(a)-2(e) o en Ia secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con Ia reivindicación 1 (a)-1 (f), que presente una identidad de al menos el 90% con cualquiera de estas secuencias.
5. Un péptido, polipéptido o proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2(c)-2(f), 3 ó 4, seleccionada entre el siguiente grupo: a. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 7 b. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 8 c. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 9 d. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 10 e. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 11 f. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 12 g. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0 13 h. Una secuencia de aminoácidos que comprende Ia SEC ID N0
14
6. Una secuencia de ácido nucleico aislada capaz de codificar cualquiera de los péptidos de Ia reivindicación anterior.
7. Un péptido, polipéptido o proteína que comprende dos o más de las secuencias de aminoácidos de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5.
8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína de Ia reivindicación 7.
9. Un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de reconocer cualquier péptido, polipéptido o proteína de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.
10. El anticuerpo de Ia reivindicación anterior, donde dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal producido por Ia línea celular de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2793.
11. La línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo de Ia reivindicación anterior, con el número de depósito DSM ACC2793.
12. Un epítopo reconocido específicamente por cualquiera de los anticuerpos de las reivindicaciones 9-10.
13. Un péptido, polipéptido o proteína sintética, recombinante o sustancialmente purificada obtenida a partir de nematodos del género
Anisakis, que contiene uno o más epítopos reconocidos por el anticuerpo monoclonal producido por Ia línea celular de hibridoma con el número de deposito DSM ACC2793.
14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína de Ia reivindicación 13.
15. Una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, donde dicha secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos está marcada con una molécula de señalización.
16. La secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con Ia reivindicación 13, donde dicha molécula se mareaje se selecciona entre el siguiente grupo:
a. Radiactiva b. Enzimática c. Fluorescente d. Luminiscente e. Quimioluminiscente f. Haptenos g. Coloreada
17. La secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con Ia reivindicación previa, donde dicha molécula de mareaje se selecciona entre el siguiente grupo:
a. Biotina o sus derivados b. Derivado de nitrofenol c. Oro coloidal y d. Látex
18. Un péptido, polipéptido o proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, fusionada o unida químicamente a un péptido, polipéptido o proteína adicional.
19. Un vector de expresión o sistema de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3-4, 6-8 o 13-15.
20. Una célula hospedadora procariota o eucariota aislada transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3-4, 6, 8 ó 13-15 o con el vector o sistema de expresión de Ia reivindicación 17.
21. Un método para elaborar un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, por cualquiera de las siguientes técnicas:
a. Técnicas recombinantes b. Síntesis química c. Purificación sustancial de nematodos de Ia familia Anisakidae
22. Un método que comprende cultivar Ia célula hospedadora de Ia reivindicación 18 en condiciones tales que se exprese dicha secuencia de nucleótidos, y producir y después aislar dicho péptido, polipéptido o proteína.
23. Un método in vitro para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. en una muestra biológica que comprende: a. poner en contacto Ia muestra biológica, preferiblemente suero, con un péptido, polipéptido o proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 ó 13, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho polipéptido y los anticuerpos de Ia muestra, y b. detectar dicho complejo inmunológico.
24. El método de Ia reivindicación 23, en el que dicho método es un inmunoensayo o un inmunoensayo enzimático.
25. Un método in vitro para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra biológica o en un extracto alimentario que comprende: a. poner en contacto Ia muestra biológica, o el extracto alimentario con un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho anticuerpo y los antígenos de Ia muestra, y b. detectar dicho complejo inmunológico
26. El método in vitro de acuerdo con Ia reivindicación 23, en el que el anticuerpo usado para formar un complejo inmunológico es UA3.
27. Una composición inmunológica que comprende un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3-4, 6, 8 ó 10.
28. Uso de un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5 o 7, para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de alergia a Anisakis spp.
29. Un kit adecuado para Ia detección de anticuerpos anti-Anisakis spp. en una muestra biológica que comprende un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 ó
13.
30. Un kit adecuado para Ia detección de antígenos de Anisakis spp en una muestra biológica, o en un extracto alimentario que comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-10.
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