ES2294935B1 - Secuencias peptidicas y nucleotidicas de anisakis spp., anticuerpos que reconocen dichas secuencias, y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Secuencias peptídicas y nucleotídicas de Anisakis spp., anticuerpos que reconocen dichas secuencias, y usos de los mismos. En la presente invención se proporcionan secuencias de péptidos, polipéptidos y proteínas que mantienen la antigenicidad de las moléculas nativas de Anisakis de las que derivan, así como los ácidos nucleicos que codifican dichas secuencias y anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para dichos péptidos, polipéptidos o proteínas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos, así como los anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frentes a dichos péptidos, polipéptidos y proteínas son útiles para desarrollar inmunoensayos para el serodiagnóstico de la anisakiosis humana y animal.

Description

Secuencias peptídicas y nucleotídicas de Anisakis spp., anticuerpos que reconocen dichas secuencias, y usos de los mismos.

Esta invención se refiere al campo del diagnóstico, prevención y terapia de infecciones humanas y animales por especies del género Anisakis. Esta invención también se refiere a la detección de antígenos de Anisakis en alimen-
tos.

Antecedentes de la invención

El género Anisakis (familia Anisakidae) incluye parásitos nematodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente se reconocen 8 especies de Anisakis entre las que se incluyen: a) las especies gemelas Anisakis simplex "en sentido estricto" (Rudolphi, 1809), A. pegreffi (Campana-Rouget y Biocca, 1955) y A. simplex C (Nascetti et al., 1986, Mattiucci et al., 2002), antiguamente incluidas en el complejo A. simplex; b) A. typica (Diesing, 1860); c) A. physeteris (Baylis, 1923); d) A. brevispiculata (Dollfus, 1966); e) A. ziphidarum (Paggi et al., 1998); y f) A. paggiae (Mattiucci et al. 2005).

Las especies de Anisakis alcanzan la madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente, en pinípedos. Estos mamíferos pueden infectarse por ingestión de a) hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan la tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por ejemplo, ballenas).

Al igual que los mamíferos marinos, los seres humanos también pueden infectarse por larvas L3 de Anisakis mediante la ingestión de peces y calamares crudos portadores del parásito, lo cual produce una enfermedad clínica denominada anisakiosis o anisakiasis. Con mucha frecuencia, varios platos de pescado se consideran de alto riesgo para la infección con especies de Anisakis. Estos incluyen el sushi y el sashimi japonés, el arenque salteado o ahumado alemán, el gravlax escandinavo, el lomi-lomi hawaiano, el cebiche sudamericano y los boquerones en vinagre españoles ("pickled anchovies").

Cuando las larvas L3 de Anisakis infectan a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta gravedad. Dependiendo de la localización de las larvas y los síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal, extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En la forma gástrica (aguda) de anisakiosis, la larva penetra la pared gástrica y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de la ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3 vivas. Los estudios endoscópicos frecuentemente revelan lesiones consistentes en hemorragias puntiformes, petequias y erosión en el sitio de penetración. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos (es decir, urticaria/angioedema y algunas veces anafilaxis) en aproximadamente el 10% de los casos. La combinación de infección gástrica y síntomas alérgicos se denominó "anisakiosis gastroalérgica" (Daschner et al., 2000). Algunos pacientes pueden desarrollar una forma subaguda o crónica cuyas manifestaciones clínicas incluyen dolor epigástrico, dispepsia, vómitos y anorexia, que puede persistir durante varios meses o incluso años.

En la forma intestinal de la anisakiosis, la larva penetra en la pared intestinal, frecuentemente a nivel del íleon terminal. En los casos agudos, a menudo se observan la presencia de dolor abdominal (habitualmente 24-48 horas después de la ingestión del pescado contaminado), acompañado de náuseas, vómitos, hinchazón abdominal, induración y desviación del ritmo intestinal establecido con estreñimiento o diarrea. La observación macroscópica de los tejidos infectados en caso de anisakiosis intestinal revela lesiones flemonosas caracterizadas por edema local intenso, petequias, hiperemia e inflamación difusa de la serosa y el mesenterio. Estas lesiones pueden ocasionar obstrucción y dilatación proximal del intestino. En una cantidad importante de pacientes, se puede encontrar líquido ascítico abdominal con un alto contenido de eosinófilos. En la anisakiosis intestinal subaguda o crónica, los cambios granulomatosos inducidos por las larvas conducen a un engrosamiento de la pared, estenosis luminal y síntomas abdominales
crónicos.

En la forma extragastrointestinal o ectópica, la larva infectante de Anisakis atraviesa la pared gastrointestinal, alcanzando la cavidad abdominal y migrando a órganos y tejidos tales como pulmones, páncreas, hígado, etc. En estos casos, los síntomas clínicos dependen de la localización topográfica de la larva.

La forma de anisakiosis alérgica se reserva a pacientes que tienen reacciones alérgicas después de la infección con larvas de Anisakis, pero sin síntomas gástricos ni intestinales. Frecuentemente, los primeros síntomas aparecen muy pronto, en las primeras horas después de la ingestión del pescado contaminado y el transcurso clínico sigue el patrón general para las reacciones alérgicas de tipo I. Su gravedad varía desde una simple urticaria o angioedema a shock anafiláctico.

Cuando las larvas de Anisakis están presentes en el estómago, duodeno o colon, el examen endoscópico es el método preferible para demostrar la infección. Esta técnica también es útil para extraer las larvas por medio de las pinzas asociadas al endoscopio, lo cual conduce a la curación del paciente. No obstante, cuando: a) las larvas no están accesibles para el examen endoscópico; b) las larvas están parcialmente destruidas o no son visibles para el endoscopista; o c) los síntomas predominantes son alérgicos, el método preferible para confirmar la infección es demostrar la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente. Este último también es el método preferido para demostrar infecciones previas por Anisakis en individuos asintomáticos.

Entre las diferentes clases de anticuerpos que se producen contra antígenos de Anisakis durante la infección, los anticuerpos IgE son los más relevantes ya que: 1) están implicados en las reacciones alérgicas de tipo I observadas durante infecciones con Anisakis, y b) ésta es la clase de inmunoglobulinas más relevante en términos de especificidad entre las que están presentes en suero de pacientes infectados.

Desde la descripción del primer caso de infección humana por una larva de Anisakis (Van Thiel, 1960), se han hecho numerosos intentos de desarrollar un ensayo serológico sensible y específico para detectar anticuerpos anti-Anisakis de diferentes clases.

Los primeros métodos para medir anticuerpos anti-Anisakis en suero incluyeron aglutinación del látex (Akao y Yoshimura, 1989); inmunodifusión doble e inmunoelectroforesis (Petithory et al., 1986; Tsuji, 1990), hemaglutinación indirecta (Asaishi et al., 1989; Tsuji, 1989); y ensayo de fijación del complemento (Oshima, 1972; Tsuji, 1989). Todos estos métodos tienen dos inconvenientes principales: a) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad y b) con estas técnicas no es posible la determinación de anticuerpos IgE (reagínicos).

Más recientemente, se pudieron realizar determinaciones de IgE anti-Anisakis en sueros de pacientes infectados con la introducción de otros inmunoensayos, por ejemplo, pruebas de radioalergosorbencia (Desowitz et al., 1985; Yamamoto et al., 1990), ensayos de inmunoabsorción vinculada a enzimas (ELISA) (Rodero et al. 2002), enzimoinmunoensayos fluorescentes (UniCap FEIA, Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB, Uppsala, Sweden) e inmunotransferencia (Del Pozo et al., 1996; García et al., 1997), pero también se presentaron problemas de sensibilidad y/o especificidad con estos métodos.

La dificultad principal para desarrollar métodos serológicos útiles para el diagnóstico de Anisakiosis humana radica en la obtención de antígenos del parásito (en nuestro caso alergenos) que por una parte (i) sean reconocidos por anticuerpos IgE presentes en los sueros de todos aquellos pacientes infectados, y (ii) que la molécula completa (es decir, todos los epítopos presentes en el alergeno seleccionado) sean específicos del género Anisakis. De otro modo, se obtendría una baja sensibilidad y/o reacciones cruzadas que condujesen a falsos positivos.

Se intentó mejorar el serodiagnóstico de anisakiosis humana usando antígenos de excreción/secreción nativos completos (ESA) de larvas de Anisakis spp. cultivadas in vitro (Poggensee et al., 1989; Baeza et al., 2004), o usando anticuerpos monoclonales para capturar antígenos específicos diana de extractos brutos de larvas L3 de Anisakis (Yagihashi et al., 1990; Ubeira e Iglesias, 2000). Sin embargo, los métodos ELISA basados en estas estrategias también carecían de suficiente especificidad debido a la presencia de epítopos de reacción cruzada (principalmente O- y N-glicanos) presentes en las glicoproteínas de Anisakis, incluyendo ESA.

Descripción de la invención

En la presente invención se proporcionan secuencias de péptidos, polipéptidos y proteínas que mantienen la antigenicidad de las moléculas nativas de Anisakis de las que derivan, así como los ácidos nucleicos que codifican dichas secuencias y anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para dichos péptidos, polipéptidos o proteínas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos, así como los anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frentes a dichos péptidos, polipéptidos y proteínas son útiles para desarrollar inmunoensayos para el serodiagnóstico de la anisakiosis humana y animal, careciendo de los inconvenientes de los métodos presentados
previamente.

De esta manera, un primer aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada (denominada en lo sucesivo secuencia de ácido nucleico de la invención) seleccionada entre el siguiente grupo:

a.

Un ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº 1

b.

Un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico complementario de la SEC ID Nº 1

c.

Un fragmento del ácido nucleico de la SEC ID Nº 1 que comprende la SEC ID Nº 15 ó 17

d.

Un ácido nucleico que comprende un fragmento de la SEC ID Nº 1 que codifica un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de la SEC ID Nº 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-Anisakis.

e.

Un ácido nucleico que comprende un fragmento de la SEC ID Nº 1 que codifica un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos de la SEC ID Nº 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-Anisakis.

f.

Un ácido nucleico que comprende un fragmento de la SEC ID Nº 1 que codifica un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos de la SEC ID Nº 2 capaz de ser reconocida por anticuerpos anti-anisakis.

\newpage

g.

Una secuencia nucleótidica que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en los apartados (a) a (f). En una realización preferida de la invención, la secuencia nucleótidica tiene una identidad de al menos el 80% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas previamente en los apartados (a) a (f) y, en una realización aún más preferida, dicha secuencia nucleótidica tiene una identidad de al menos el 90% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas previamente en los apartados (a) a (f).

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido, péptido o proteína aislada (denominada en lo sucesivo secuencia de aminoácidos de la invención) seleccionada entre el siguiente grupo:

a.

Un polipéptido que comprende la SEC ID Nº 2

b.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende la SEC ID Nº 16 ó 18

c.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis.

d.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende un tramo contiguo de 10 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis.

e.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende un tramo contiguo de 12 o más aminoácidos capaz de ser reconocido por anticuerpos anti-anisakis.

f.

Una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en los apartados (a) a (e) en este punto. En una realización preferida de la invención, la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 80% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas previamente en los apartados (a) a (e) en este punto y, en una realización aún más preferida, dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas previamente en los apartados (a) a (e) en este punto.

Todos estos péptidos, polipéptidos o proteínas pueden ser empleados para superar la dificultad principal de desarrollar métodos serológicos útiles para el diagnóstico de la anisakiosis humana, al proporcionar antígenos del parásito específicos del género Anisakis y que son reconocidos por los anticuerpos IgE presentes en los sueros de todos los pacientes infectados por Anisakis.

Una realización preferida de la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que pueda ser reconocido por anticuerpos anti-Anisakis y que comprenda un fragmento con un tramo contiguo de al menos 8 o más aminoácidos y con una identidad de al menos el 70% con cualquier fragmento de la SEC ID Nº 2, seleccionado de entre las siguientes secuencias de aminoácidos:

a.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 7

b.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 8

c.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 9

d.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 10

e.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 11

f.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 12

g.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 13

h.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 14

En un tercer aspecto, la secuencia de aminoácidos de la invención se produce, pero sin limitamos a cualquiera de las siguientes técnicas:

a.

Técnicas recombinantes

b.

Síntesis química y

c.

Purificación sustancial a partir de nematodos de la familia Anisakidae

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un péptido, polipéptido o proteína que comprende dos o más de las secuencias de aminoácidos de la invención.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico sintética o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de la inven-
ción.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos aislada de la invención, marcada con una molécula de señalización. En una realización preferida de la invención, dicha molécula marcadora se selecciona, pero sin limitamos a cualquiera de las moléculas de señalización del siguiente grupo:

a.

Radiactivas

b.

Enzimáticas

c.

Fluorescentes

d.

Luminiscentes

e.

Quimioluminiscentes

f.

Coloreadas

En una realización preferida de la invención, la molécula de marcaje se selecciona, pero sin limitamos a cualquiera de las moléculas de señalización del siguiente grupo:

a.

Biotina o sus derivados

b.

Derivados de nitrofenol

c.

Oro coloidal

d.

Látex

e.

Fluoresceína

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo (denominado en lo sucesivo anticuerpo de la invención) capaz de interaccionar con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la invención. También forman parte de la presente invención las secuencias de ácido nucleico capaces de codificar cualquiera de los anticuerpos de la invención.

En una realización preferida, dicho anticuerpo de la invención es el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2793 depositado el 15 de junio de 2006 en el "German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)" (de aquí en adelante anticuerpo UA3).

Una realización adicional se refiere a la línea celular de hibridoma con número de depósito DSM ACC2793 con fecha de depósito 15 de junio de 2006 depositada en la institución DSMZ.

Una realización adicional de la invención se refiere a las secuencias de reconocimiento de antígenos de cualquiera de los anticuerpos de la invención, particularmente las secuencias de reconocimiento de antígenos del anticuerpo
UA3.

Otro aspecto de la invención proporciona una secuencia de aminoácidos aislada de la invención, donde dicha secuencia de aminoácidos está fusionada o acoplada químicamente a un péptido, polipéptido o proteína adicional.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión o sistema de expresión (denominado en lo sucesivo sistema de expresión de la invención) que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula hospedadora procariota o eucariota aislada (denominada en lo sucesivo célula hospedadora de la invención) transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico de la invención o con un vector o sistema de expresión de la invención.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método para producir un péptido, polipéptido o proteína recombinante codificada por una secuencia de ácido nucleico de la invención, donde dicho método comprende cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones tales que se exprese y se produzca dicha secuencia de nucleótidos y después aislar dicho péptido, polipéptido o proteína.

Un noveno aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. en una muestra biológica aislada, preferiblemente suero, que comprende:

\newpage

a.

poner en contacto una muestra biológica con una secuencia de aminoácidos de la invención, en condiciones suficientes como para formar un complejo inmunológico entre dicho polipéptido y los anticuerpos de la muestra, y

b.

detectar dicho complejo inmunológico.

En una realización preferida de la invención, el método in vitro es un inmunoensayo o un inmunoensayo enzimático.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra, preferiblemente una muestra biológica, o un extracto alimentario, que comprende:

a.

poner en contacto la muestra biológica o extracto alimentario con un anticuerpo de la invención, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho anticuerpo y los antígenos de la muestra y

b.

detectar dicho complejo inmunológico.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención que se usa para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra in vitro es el anticuerpo UA3.

Un aspecto preferido de la invención se refiere a un método in vivo para diagnosticar o pronosticar alergia a Anisakis spp. en un sujeto, que comprende someter al sujeto al péptido, polipéptido o proteína de la invención y controlar la reacción del sujeto.

Un aspecto aún más preferido del método in vivo de la invención para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. es por medio del uso del ensayo Prick.

Otro aspecto preferido de la presente invención es un kit (en lo sucesivo kit de la invención) adecuado para la detección de antígenos de Anisakis spp. en una muestra biológica o un extracto alimentario, que comprende:

a)

al menos un anticuerpo de la invención o sus fragmentos y

b)

un medio de detección para el complejo inmunológico.

También es un aspecto preferido de la presente invención un kit adecuado para la detección de anticuerpos anti-Anisakis spp. en una muestra biológica, preferiblemente suero, que comprende:

a)

al menos un péptido, polipéptido o proteína de la invención y

b)

un medio de detección para el complejo inmunológico.

En una realización preferida, el medio de detección usado en el kit de la invención consta de anticuerpos secundarios marcados capaces de reconocer la formación del complejo inmunológico.

En una realización más preferida, el medio de detección usado en el kit de la invención es un reactivo secundario marcado capaz de reconocer la formación del complejo inmunológico.

Otro aspecto más de la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cualquier tipo de reacción alérgica a Anisakis spp. Una realización preferida de la invención se refiere a la composición farmacéutica tal cual.

Como se usa en este documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier polímero de nucleótidos compuesto por dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, unidas entre sí por puentes fosfodiéster. "Acidos nucleicos" o "moléculas de ácido nucleico" incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos y fragmentos generados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por otros métodos tales como ligamiento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Como se usa en este documento, el término "nucleótido" significa una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C") y timina ("T"). Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U").

Como se usa en este documento, una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación, etc.) o puede sintetizarse químicamente. La molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.

Como se usa en este documento, "cebador" se refiere a un oligonucleótido natural o sintético (que varia preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos de longitud) que puede hibridar con un molde de ADN o ARN complementario para formar un dúplex entre el cebador y el molde. Típicamente, un cebador es un oligodesoxirribonucleótido monocatenario, y sirve como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico por una polimerasa después de la hibridación con una cadena de ADN o ARN.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de nucleótidos que codifica" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión de un péptido, polipéptido o proteína específica. Las secuencias de ácido nucleico comprenden la secuencia de la cadena de ADN que se transcribe en ARN y también la secuencia de ARN que se traduce en una proteína. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención incluyen tanto secuencias de ácido nucleico de longitud completa como secuencias truncadas (que no tienen la longitud completa) derivadas de la proteína de longitud completa. También están comprendidas las variantes de la secuencia de nucleótidos que codifican el mismo péptido, polipéptido o proteína que la secuencia nativa, que puede construirse para proporcionar una preferencia de codones en una célula hospedadora específica.

Como se usa en este documento, "el complemento de" se refiere al concepto de una correspondencia inversa entre regiones de dos cadenas polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de la formación de pares de bases. En consecuencia, una "secuencia de bases complementarias" se refiere a una cadena polinucleotídica en la que todas las bases pueden formar pares de bases con una secuencia de bases en otra cadena polinucleotídica. Como se sabe, un nucleótido de adenina puede formar pares de bases con timina (A-T) o uracilo (A-U), mientras que un nucleótido de citosina puede formar pares de bases con guanina (C-G).

Como se usa en este documento, un "vector de expresión" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. De acuerdo con la presente invención, el vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión de ADN o ARN capaz de expresar antígenos de Anisakis spp., tal como un plásmido o un fago. Preferiblemente, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención es un plásmido (por ejemplo, pQE 31 y pTARGET).

Como se usa en este documento, el término "plásmido" se refiere a cualquier molécula de ADN circular autónoma capaz de replicarse en una célula independientemente del ADN cromosómico, e incluye tanto los tipos de expresión como los tipos de no expresión.

Como se usa en este documento, el término "recombinante" se refiere a una molécula de ADN compuesta preparada fuera de células vivas uniendo artificialmente fragmentos de ADN naturales o sintéticos a moléculas de ADN que pueden replicarse en una célula viva, o moléculas que son el resultado de su replicación. El término "recombinante" también se refiere en este documento a un péptido, polipéptido o una proteína que se expresa usando una molécula de ADN recombinante.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de forma indistinta en este documento para designar una secuencia lineal de aminoácidos conectados entre sí por enlaces amida entre el grupo alfa-amino de un aminoácido y un grupo alfa-carboxi del aminoácido adyacente. Los polipéptidos con una longitud de veinticinco aminoácidos o menos se consideran "péptidos". Preferiblemente, un polipéptido que está codificado por un cistrón se considera una
"proteína".

Como se usa en este documento, la expresión "fragmento de la secuencia de aminoácidos" significa una porción de aminoácidos contiguos del péptido, polipéptido, proteína o secuencia de aminoácidos especificada.

Como se usa en este documento, un "péptido, polipéptido o proteína aislada" es un péptido, polipéptido o proteína que está esencialmente exenta de contaminantes celulares, tales como lípidos, carbohidratos u otras impurezas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Un péptido, polipéptido o proteína aislada puede purificarse de su medio natural por técnicas cromatográficas convencionales. Los péptidos, polipéptidos y proteínas aisladas también pueden obtenerse por métodos recombinantes, o por síntesis química. Típicamente, se obtiene un "polipéptido sustancialmente purificado" cuando se separa de al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75% y aún más preferiblemente al menos el 90% de otros polipéptidos con los que coexiste de forma natural en una célula, tejido u
organismo.

Como se usan en este documento, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-alfa-aminoácidos de origen natural o sus restos. La siguiente Tabla (Tabla 1) muestra el código de tres letras y el código de una letra (recomendado por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB) para la denominación de los aminoácidos naturales:

100

Como se usa en este documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, mamíferos marinos y animales domésticos y de granja. Preferiblemente, el mamífero en este documento es el ser humano.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a glicoproteínas de la familia de las inmunoglobulinas, caracterizadas porque tienen propiedades de unión a antígenos, y se producen por células plasmáticas. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales que pertenecen a cualquier clase de anticuerpos, por ejemplo, IgG, IgD, IgM, IgA, IgE o derivados de los mismos.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. No pretende limitarse a una fuente particular del anticuerpo o a la forma en la que se produce, e incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos producidos por fusión celular o por técnicas recombinantes.

Como se usa en este documento, el término "antígeno" se refiere a cualquier molécula o agente capaz de inducir la producción de anticuerpos específicos cuando se introduce en un hospedador inmunocompetente. Como se usa en este documento, el término "antígeno" también se refiere a cualquier molécula o agente susceptible de reconocerse por un anticuerpo específico. Típicamente, pueden reconocerse como antígenos péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de estas moléculas. Estos antígenos también pueden contener grupos químicos orgánicos e inorgánicos unidos.

Como se usa en ese documento, el término "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno que se reconoce por un anticuerpo (monoclonal o policlonal) o por el receptor con especificidad de antígeno de una célula. Cuando el antígeno es un péptido, polipéptido o una proteína, sus epítopos pueden ser fragmentos de al menos 5 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos primaria, pero también regiones expuestas en la superficie de la proteína plegada madura (estructura terciaria tridimensional) compuestas por 5 o más aminoácidos. Típicamente, los epítopos pueden clasificarse como epítopos de células B y epítopos de células T basándose en los tipos de respuesta inmune que provocan.

Como se usa en este documento, el término "muestra biológica" se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que contiene uno o más de los ácidos nucleicos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos o proteínas de la presente invención. En la presente invención, el término "muestra biológica" también se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que pueda usarse como fuente para la determinación de anticuerpos anti-Anisakis. Dichas muestras incluyen, pero sin limitación, tejidos aislados, sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial, saliva, orina o heces. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. Una muestra biológica puede obtenerse a partir de cualquier organismo eucariota, y preferiblemente de un mamífero tal como una rata, ratón, conejo, mamíferos marinos, o un ser humano.

Como se usa en este documento, el término "muestra alimentaria" se refiere a cualquier muestra obtenida de la amplia gama de materiales comestibles. Estas muestras incluyen, pero sin limitación, trozos de pescado crudo, ahumado y cocinado y alimentos que tienen materiales de pescado en su composición. El término "muestra alimentaria" también incluye alimentos para la nutrición de niños.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpos anti-Anisakis" se refiere a cualquier clase o subclase de anticuerpos presentes en una muestra capaz de reconocer al menos un epítopo que esté presente en los antígenos de cualquiera de las especies del género Anisakis. La expresión incluye anticuerpos producidos durante infecciones naturales o experimentales de seres humanos y animales con el parásito, así como anticuerpos monoclonales y policlonales producidos después de la inmunización de seres humanos o animales con antígenos recombinantes o sintéticos no purificados o sustancialmente purificados, obtenidos a partir de especies del género Anisakis. La expresión también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos producidos por técnicas recombinantes, síntesis química o técnicas equivalentes.

Como se usa en este documento, la expresión "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que ocupan la misma posición relativa cuando dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico se alinean una al lado de la otra. Para los fines de la presente invención, un método adecuado para calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos es usar el programa lalign de William Pearson que aplica el algoritmo de Huang y Miller, publicado en Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357, e incorporado en este documento como referencia. Este programa puede procesarse on line en la dirección: [http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html].

Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo" se refiere a un método para detectar un analito en una muestra por medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Los analitos pueden ser moléculas pequeñas (haptenos) o moléculas grandes, tales como muchas proteínas plasmáticas. Con mucha frecuencia, el analito es un anticuerpo que puede detectarse por medio de la unión específica entre el anticuerpo y un ligando. Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo enzimático" (EIA) se refiere a un tipo amplio de inmunoensayos, caracterizados porque al menos uno de los reactivos está marcado con una enzima. Son EIA típicos los ensayos de inmunoabsorción vinculados a enzimas (ELISAs) de los cuales hay una serie de variantes. Si se desea una clasificación, o una descripción detallada de formatos de inmunoensayo, véase: Price y Newman (1997) Principles and Practice of Immunoassay, Macmillan Reference LTD, New York; Tijssen (1985) Practice and theory of enzyme immunoassays, En: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (R.H. Burdon and PH van Knippenberg, eds), Elsevier, Amsterdam; Deshpande (1996) Enzyme immunoassays, from concept to product development, Chapman & Hall, New York.

Como se usa en este documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica que es adecuada para administrarse a un individuo mamífero. Típicamente, una composición farmacéutica comprende una cantidad de un agente activo farmacológicamente eficaz y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describen ejemplos de vehículos y formulaciones farmacéuticas adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª edición, Mack Publishing Company, Easton, 2000. Una composición farmacéutica puede formularse específicamente para la administración por diferentes vías incluyendo, pero sin limitación, la vía oral, parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intranasal, sublingual y similares.

Como se usa en este documento, la expresión "método de diagnóstico" se refiere a un método para la identificación de un estado patológico en un animal o en un individuo. Cuando dicho estado patológico se produce por un agente infeccioso, frecuentemente el diagnóstico puede realizarse usando un inmunoensayo (véase anteriormente) que permite la detección de los antígenos liberados por el patógeno, o de los anticuerpos inducidos en el hospedador por dicho patógeno. Los métodos de diagnóstico de la presente invención incluyen ensayos in vitro (tales como un ensayo ELISA, o el test de liberación de histamina de los basófilos) y ensayos in vivo tales como las pruebas cutáneas, por ejemplo, pero sin limitación, el ensayo de pinchazo en la piel (prick-test), intradermorreacciones, o las pruebas epicutáneas (por ejemplo, el ensayo de parche), que se usan frecuentemente para el diagnóstico de alergias. La expresión "métodos de diagnóstico" también incluye a las pruebas de provocación, consistentes en la administración controlada y gradual de la sustancia sospechosa de provocar un cuadro alérgico a través de diferentes vías: oral, conjuntival, nasal, bronquial, etc., para comprobar su tolerancia. Una descripción más detallada de estos últimos métodos, puede verse en: Comité de Reacciones Adversas a Alimentos: Metodología diagnóstica en la alergia a alimentos. Alergología e Inmunología Clínica, 14: 50-52 (1999), así como en diversos manuales de la especialidad de Alergología e Inmunología
Clínica.

Como se usa en este documento, la expresión "repeticiones de secuencia" se refiere a motivos repetitivos en la secuencia de una proteína dada o de una molécula de ácido nucleico. Las repeticiones de secuencia en las secuencias polipeptídicas de la presente invención se realizaron usando el programa RADAR (véase el Ejemplo Nº 12).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento. A lo largo de toda la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Otros objetos, ventajas y características de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica tras el examen de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de ARNm y construcción de una biblioteca de expresión a partir de Anisakis simplex

Se extrajeron manualmente larvas de Anisakis simplex en la fase larvaria L3 (L3) de las vísceras y cavidad peritoneal de la bacaladilla (Micromesistius poutassou) y se almacenaron en nitrógeno líquido antes de comenzar la construcción de la biblioteca de ADNc. Se obtuvo el ARN mensajero (ARNm) total a partir de 1 g de larvas L3 de Anisakis simplex congeladas usando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track 2.0 (Invitrogen S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se usaron cinco microgramos del ARN poli (A)+ obtenido para construir la biblioteca de ADNc de Anisakis usando el kit ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. De acuerdo con las instrucciones proporcionadas, el ARN poli (A)+ de Anisakis simplex se convirtió primero en ADNc bicatenario, después se ligó al vector de expresión lambda-ZAP y el vector se empaquetó usando extractos de empaquetamiento Gigapack III. Se usó como hospedador la cepa XL1-Blue MRF' de E. coli. La biblioteca resultante se amplificó, y contenía aproximadamente 1,3 x 10^{10} pfu/ml y un 1% de fagos no recombinantes.

Exploración de la biblioteca de ADNc de Anisakis simplex

Una vez amplificada, la biblioteca de ADNc de A. simplex se sometió a un cribado inmunológico usando anticuerpos monoclonales UA3. Siguiendo las recomendaciones proporcionadas en el ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene), se dejaron crecer células hospedadoras XL1-Blue MRF' en caldo LB con suplementos, se centrifugaron a 1000 x g, y el sedimento se resuspendió en sulfato de magnesio 10 mM. A esta suspensión se le añadió una alícuota de los fagos recombinantes y la mezcla se incubó 15 minutos a 37ºC para permitir que los fagos se unieran a las células. Después, la suspensión celular con los fagos adheridos se mezcló con agar NZY fundido (enfriado a aproximadamente 55ºC), y la mezcla se extendió uniformemente sobre una placa de 150 mm de diámetro, que contenía agar NZY recién vertido. Después de un tiempo de incubación de aproximadamente 3 h a 42ºC para permitir que comenzaran a formarse placas de fagos, se indujo la expresión de proteínas recombinantes recubriendo las placas con filtros de nitrocelulosa previamente impregnados en isopropil tio-beta-D-galactósido (IPTG) 10 mM en agua (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Después, las placas se incubaron a 37ºC durante 3,5 h, después de lo cual se retiraron cuidadosamente los filtros de nitrocelulosa que contenían las placas de fago adsorbido y se bloquearon con BSA al 3% en TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) a 37ºC durante 30 minutos y después se incubaron con anticuerpos monoclonales (AcM) IgGilkappa UA3 (dilución 1:10.000 en TBS) a 4ºC durante una noche. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron en TBS que contenía Tween 20 al 0,05% (TBS-T), y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con IgG de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina a 1:10.000 (Pierce, Rockford, IL, USA). Después de lavar otra vez, se visualizaron los complejos inmunes usando NBT (nitroazul de tetrazolio) y BCIP (fosfato de p-toluidina-5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) (Sigma Chemical Corp., St Louis, MO,
USA).

Escisión in vivo de un único clon y secuenciación de ADNc

Después de identificar un ADNc que codificaba una proteína reconocida por el AcM UA3 mediante el cribado inmunológico sobre el vector lambda-ZAP intacto, se purificó la placa de fago correspondiente (clon UAR-H5). De acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene), se transfirió la porción central de las placas positivas para el fago seleccionadas a un tubo de microcentrifuga y se liberaron las partículas de fago recombinante en tampón SM. Después, se realizó la escisión in vivo del fagémido pBluescript del vector lambda-ZAP mediante coinfección de células hospedadoras XL1-Blue MRF' con el fago recombinante y el fago auxiliar ExAssist proporcionado con el kit. Al final de este procedimiento, el fagémido pBluescript escindido, obtenido empaquetado como partículas de fago filamentosas, se usó para infectar células hospedadoras SOLR. Se obtuvieron colonias de células SOLR transfectadas que contenían el fagémido pBluescript bicatenario con el inserto de ADN donado de interés dejando crecer las células en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían ampicilina (100 microgramos/ml). Se dejaron crecer colonias bacterianas individuales en caldo LB-ampicilina y se purificó el ADN del fagémido pBluescript usando un kit Perfectprep Plasmid Maxi (Eppendorf). Se usaron los cebadores M13 directo (5' SEC ID Nº 19 3') e inverso (5' SEC ID Nº 20 3') de la secuencia de pBluescript SK, así como varios cebadores internos, para la secuenciación automática del ADN del fagémido usando el Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 377 (PE Biosystems). Se realizaron comparaciones de la secuencia de ADN y de la secuencia deducida de aminoácidos con los bancos de datos EMBL y SWISS-PROT usando el paquete de software ExPASy (el Expert Protein Analysis System), servidor World Wide Web (http://www.expasy.org/), del Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., 2003). La secuencia de nucleótidos descrita comprende una secuencia de 3288 nucleótidos, representada por la secuencia de la SEC ID Nº: 1, y codifica una secuencia de aminoácidos deducida de 1096 aminoácidos representada por la SEC ID
Nº: 2.

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Ejemplo 2

Subclonación de un fragmento de la secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 1) de Anisakis simplex en el vector pQE-31

En una realización preferida, se subclonó un fragmento de ADN recombinante interno (SEC ID Nº: 15) que corresponde a las posiciones de nucleótidos 1303 y 2139 de la SEC ID Nº 1, que codifica una secuencia polipeptídica de 279 aminoácidos (SEC ID Nº: 16), en el vector de expresión pQE-31 usando un kit QlAexpress Type IV (Qiagen, IZASA S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y usando los sitios de restricción Sal I y Hind III en el sitio de clonación múltiple de pQE-31. Está disponible otra metodología similar en manuales tales como: Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Sambrook et al., 2001) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1998).

Antes de la clonación, se amplificó la secuencia del fragmento de ADNc que corresponde a la SEC ID Nº: 15 mediante PCR, y los extremos de la secuencia se modificaron usando el fagémido pBluescript recombinante como molde y un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº 21 3') e inverso (5' SEC ID Nº 22 3'), que contenían sitios de restricción Sal I y Hind III. Esta modificación mediante PCR proporcionó secuencias de nucleótidos específicas para las enzimas de restricción Sal I y Hind III para que el inserto recombinante tuviera extremos cohesivos con respecto al plásmido digerido. Las condiciones de PCR para la amplificación y modificación de la secuencia del fragmento de ADN correspondiente a la SEC ID Nº: 15 comprendió: un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 4 minutos seguido por 35 ciclos de (30 s de desnaturalización a 94ºC; 30 s de hibridación a 55ºC; y un minuto de elongación a 72ºC), y un ciclo de elongación final de 72ºC durante 7 minutos. Después de que acabara la PCR, se purificó el ADN recombinante de Anisakis amplificado usando un kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen). A continuación, un microgramo del ADN plasmídico y 2 microgramos del ADN que codificaba el fragmento a insertar se digirieron con las enzimas de restricción Sal I y Hind III, de acuerdo con el tampón y las condiciones de incubación recomendadas por el fabricante (Invitrogen S.A., Barcelona, España). Finalmente, tanto el vector digerido como el inserto de ADN se purificaron con el kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen) y se ligaron en una proporción 1:3 entre el vector y el inserto, usando ADN ligasa de T4 a 16ºC durante una noche. La inserción del ADN recombinante de Anisakis simplex de la SEC ID Nº: 15 entre los sitios Sal I y Hind III del sitio de clonaje múltiple de pQE-31 originó un marco abierto de lectura (ORF) plasmídico de 915 nucleótidos (SEC ID Nº: 3), que codificó la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, la cual incluye la SEC ID Nº: 16 de Anisakis (porción central) y dos secuencias de aminoácidos adicionales (colas): SEC ID Nº 23 y SEC ID Nº 24, localizadas, respectivamente, en las porciones amino y carboxilo terminales de la secuencia de Anisakis clonada. La presencia de la señal de 6 x Histidina en la porción amino del polipéptido codificado puede facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes, pero también pueden usarse otros vectores y métodos de purificación según convenga.

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Ejemplo 3

Transformación de células M15 (pREP4) con pQE-31 recombinante

La transformación de células M15 [pREP4] de E. coli con el vector pQE-31 recombinante se realizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual (The QIAexpresionist: A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins) del fabricante (Qiagen). De acuerdo con este protocolo, se incubaron una alícuota de células M15 competentes preparadas previamente y una alícuota de la mezcla de ligamiento en hielo durante 20 minutos y después se incubaron a 42ºC durante 90 minutos. Después de dichas incubaciones, las células se resuspendieron en caldo Psi y se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Después, las células M15 se sembraron en placas de agar LB que contenían 25 microgramos por mililitro de kanamicina y 100 microgramos de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37ºC. Una colonia positiva se dejó crecer en caldo LB suplementado con kanamicina y penicilina, se centrifugó y las células sedimentadas se almacenaron en medio SOB que contenía glicerol a
-80ºC.

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Ejemplo 4

Expresión del polipéptido recombinante de Anisakis simplex

Para producir el polipéptido recombinante de Anisakis recombinante del Ejemplo 2, las células M15 transformadas se descongelaron y dejaron crecer a 37ºC en caldo LB, complementado con kanamicina y ampicilina, con agitación orbital (200 r.p.m.) hasta alcanzar una DO_{600} de 0,5. Después se indujo la expresión del polipéptido añadiendo IPTG 1 mM, y las células se incubaron durante 4 h adicionales a 37ºC con las mismas condiciones de agitación. Posteriormente, las células se centrifugaron a 5000 x g y se almacenaron congeladas a -30ºC hasta la purificación del polipéptido expresado, según se describe en el Ejemplo 5. En estas condiciones de cultivo, las células M15 producen el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4 precipitado en forma de cuerpos de inclusión.

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Ejemplo 5

Purificación de polipéptido recombinante de Anisakis simplex

En una realización preferida, los cuerpos de inclusión de las células M15 sedimentadas, obtenidas a partir de un cultivo de 250 ml, se purificaron de acuerdo con las siguientes etapas: a) el sedimento bacteriano se resuspendió en 15 ml de reactivo B-PER (Pierce, Rockford, IL, USA) y se agitó suavemente durante 10 minutos; b) la muestra se centrifugó a 15.000 x g y el sobrenadante, que contenía proteínas solubles, se desechó; c) el sedimento que contenía los cuerpos de inclusión se resuspendió en otros 15 ml de B-PER y a la suspensión celular se le añadió lisozima a una concentración final de 200 microgramos (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y se incubó a TA durante 5 minutos; d) la suspensión se diluyó con 100 ml de una dilución 1:10 de B-PER y las células se resuspendieron empleando un agitador vortex; e) la suspensión celular se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se resuspendió en otros 100 ml de B-PER y se agitó en el vortex; f) la suspensión que contenía B-PER diluido se centrifugó a 15.000 x g y el sedimento se resuspendió en 50 ml de un tampón de desnaturalización que constaba de NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris.Cl 10 mM y Urea 6 M, pH 8,0, y después se agitó en el vortex; g) la suspensión se centrifugó a 15.000 x g durante 20 minutos y se disolvió en 10 ml de un tampón de desnaturalización que constaba de NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris.Cl 10 mM y Urea 8 M, pH 8,0 (tampón de carga); h) a la solución que contenía el péptido, se le añadieron 2,5 ml de una suspensión de resina Ni- NTA al 50% (Qiagen) y la mezcla se agitó en un agitador orbital durante 30 minutos a TA. Después la suspensión de resina se cargó en una columna vacía, y se lavó con dos volúmenes del tampón de carga; i) los polipéptidos retenidos se eluyeron con una solución que contenía Tris.Cl 0,15 M, pH 10,5, que contenía imidazol 250 mM, y se almacenó congelada a -30ºC hasta su
uso.

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Ejemplo 6

Subclonación del fragmento de la secuencia de ADNc de Anisakis simplex de la SEC ID Nº: 17 en el vector pTARGET y transformación de células JM109 competentes

En otra realización preferida, un fragmento interno de 834 aminoácidos (SEC ID Nº: 17) correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1306-2139 de la SEC ID Nº:1, que codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por la SEC ID Nº: 18, se subclonó en el vector pTARGET (Promega). Para ello, la SEC ID Nº: 17 seamplificó mendiante PCR empleando un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº 25 3') y reverso (5' SEC ID Nº 26 3') y el vector pQE-31 transformado del Ejemplo 3 como molde. Las condiciones de PCR fueron: un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de (45 segundos de desnaturalización a 94ºC; 45 segundos de hibridación a 55ºC; y 1,5 minutos de elongación a 72ºC), y un ciclo de elongación final de 10 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 2% y después se donaron en el vector pTARGET. El ligamiento de pTARGET y el inserto de Anisakis, y la transformación de células JM109 competentes se realizaron como se indica en las instrucciones del uso del producto. Se seleccionaron transformantes JM 109 positivos por selección de colonias blancas usando placas de agar LB suministradas con ampicilina/IPTG/X-Gal como se describe por el fabricante.

En las condiciones experimentales descritas, la Subclonación de la secuencia de ADNc correspondiente a la SEC ID Nº: 17 en el vector pTARGET originó un ORF plasmídico de 846 nucleótidos (SEC ID Nº: 5) que codifica para la secuencia de 282 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6, que incluye el polipéptido de Anisakis de la SEC ID Nº: 17, y una secuencia adicional de 4 aminoácidos (SEQ ID Nº: 24) situada en la porción carboxilo terminal de la SEC ID
Nº: 17.

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Ejemplo 7

Aislamiento del ADN del plásmido recombinante de células JM109 y vacunación de ratones con ADNplasmídico

Se dejó crecer una colonia positiva de células JM109 en caldo LB-ampicilina, se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se usó para la extracción del ADN plasmídico usando el kit Plasmid Maxi (Qiagen). Se inoculó un total de 50 microlitros (concentración de un microgramo por microlitro) de ADN plasmídico sin endotoxinas en el músculo cuádriceps de las dos patas de ratones Balb/c de 10-20 semanas de edad. Las inoculaciones se realizaron usando una jeringa de insulina como se describe por Leiro et al. (2002).

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Ejemplo 8

Inmunoensayos para la determinación de anticuerpos anti-Anisakis en sueros de pacientes infectados

Un inmunoensayo de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier inmunoensayo capaz de detectar la presencia de anticuerpos anti-Anisakis en cualquier fluido biológico procedente de un individuo o especie ani-
mal.

Los ejemplos de tipos de inmunoensayos incluyen inmunoensayos en fase líquida y fase sólida, e inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto.

Típicamente, la medición de los niveles de anticuerpos anti-Anisakis específicos en un fluido biológico, como por ejemplo en suero o plasma, puede realizarse por métodos ELISA, como son los métodos ELISA descritos en este ejemplo.

a) Muestras de suero

Las muestras de suero usadas en los métodos ELISA de este ejemplo se obtuvieron a partir de individuos no infectados (donantes de sangre sanos) y de individuos infectados con el parásito Anisakis simplex. Los sueros se consideraron positivos cuando se obtuvieron a partir de individuos que tenían una historia reciente de haber comido pescado crudo y la presencia del parásito pudo confirmarse por examen endoscópico.

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b) ELISA de captura con antígenos O-desglicosilados y anticuerpos monoclonales UA3

Se describe un método ELISA de captura (UA3-ELISA) basado en la captura de antígenos O-desglicosilados de Anisakis spp. específicos por anticuerpos monoclonales UA3 inmovilizados.

El antígeno O-desglicosilado usado en este inmunoensayo se obtuvo como se ha descrito previamente, y se basa en el tratamiento de antígenos de Anisakis enteros con NaOH 0,02 M a 50ºC durante 16 h, y neutralización adicional del pH con HCl.

Para realizar el ELISA de captura, se realizaron las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos monoclonales UA3 purificados (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de la placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de PBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (PBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 1,5 h a 37ºC con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS que contenía Tween-20 al 0,2% (PBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC (Ingenasa, Madrid, España; el marcaje con FITC se llevó a cabo de acuerdo con el método de Liddel y Cryer, 1991); g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1.500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako, Barcelona, España); i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

c) ELISA indirecto con el polipéptido recombinante de Anisakis expresado en células M15 transformadas

En una realización preferida, el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4 se usó para realizar un ELISA indirecto para medir anticuerpos anti-Anisakis en sueros de individuos infectados con Anisakis.

En este ejemplo se describe un método ELISA para la determinación de anticuerpos IgE en muestras de suero humano, pero también pueden medirse otras clases (IgA, IgG, IgM) y subclases (IgAl, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos cambiando la especificidad de los anticuerpos anti-humano secundarios. Del mismo modo, el inmunoensayo también puede adaptarse para determinaciones de anticuerpos en fluidos biológicos de otras especies animales (por ejemplo, otros mamíferos, aves o peces) eligiendo los anticuerpos secundarios anti-especie
apropiados.

En una realización preferida, el método para realizar el ELISA indirecto (rUA3-ELISA) del presente ejemplo se realizó de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de las placas de ELISA con el antígeno recombinante de Anisakis de la SEC ID Nº: 4 en Tris.Cl 0,1 M, pH 10,5; b) aspiración, y después lavado de la placa de ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación de las placas durante 1,5 h a 37ºC con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de TBS que contenía Tween-20 al 0,2% (TBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC (Ingenasa; marcado con FITC de acuerdo con el método de Liddel y Cryer, 1991); g) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; h) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako); i) aspiración, y después lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular
Devices).

La siguiente Tabla I muestra la comparación de los valores de IgE obtenidos para 22 muestras de suero positivas de pacientes infectados con el nematodo Anisakis simplex, ensayadas por los métodos de ELISA de captura (UA3-ELISA) y ELISA indirecto (rUA3-ELISA) descritos en el Ejemplo 8 de la presente invención. La tabla muestra los valores medios de absorbancia, medidos a 492 nm, para cada suero. Los valores de corte (cut-off) para las determinaciones de IgE fueron DO = 0,105 para el método UA3-ELISA y DO = 0,049 para el método rUA3-ELISA. Nótese que la muestra 2 fue sólo positiva por el método rUA3-ELISA. Estos resultados demuestran que tanto el método UA3-ELISA (sensibilidad del 95,45%) como el método rUA3-ELISA (sensibilidad del 100%) son métodos válidos para serodiagnóstico de infecciones humanas por Anisakis spp.

TABLA I

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Ejemplo 9

Producción de anticuerpos en ratones transfectados con el vector pTARGET recombinante que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6

En este ejemplo, se extrajo sangre de ratones transfectados con pTARGET recombinante que codificaba el polipéptido de la SEC ID Nº: 6 (véase el Ejemplo 7) con anestesia, y el suero obtenido se ensayó en ELISA indirecto para determinar la presencia de anticuerpos IgG1 reactivos con el polipéptido de la SEC ID Nº: 4 inmovilizado en la placa de ELISA. El método ELISA fue el mismo descrito en el Ejemplo 8b, con la excepción de que se usaron anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón marcados con peroxidasa (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA; dilución 1:3000) en lugar de reactivos anti-humano secundarios. En este ejemplo, se ensayaron sueros de ratón a una dilución
1:100.

La siguiente Tabla II muestra la respuesta de anticuerpos IgG1 obtenida en ratones BALB/c después de la vacunación (por vía parenteral) con 100 microgramos/ratón del plásmido p-TARGET recombinante que contenía el inserto de ADN de Anisakis simplex que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6. La extracción de sangre de los ratones se hizo un mes después de la inmunización. La tabla muestra los valores medios de absorbancia \pm SD para cada suero, medidos a 492 nm (tres determinaciones independientes).

Estos resultados demuestran que una vacuna de ADN recombinante que contiene una secuencia de ADN de Anisakis (mostrado en este experimento por la SEC ID Nº: 6 de la presente invención) puede ser útil para la inducción de anticuerpos anti-Anisakis in vivo. La inducción in vivo de anticuerpos por vacunas es de interés para: a) la inducción de protección inmunológica contra agentes infecciosos, y b) para la prevención de reacciones
alérgicas.

TABLA II

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Ejemplo 10

Marcaje y aplicaciones de péptidos y polipéptidos recombinantes de Anisakis simplex de la presente invención

El marcaje de los péptidos y polipéptidos de la presente invención con una biomolécula o molécula química detectable es útil para fines tales como diagnóstico in vivo e in vitro e investigación de laboratorio. Hay muchos marcadores y métodos diferentes para el marcaje conocidos por los especialistas en la técnica (por ejemplo, Kessler (Ed). Nonradiactive labeling and detection of biomolecules. Springer-Verlag, Berlin 1992); Walker (Ed). The protein protocols handbook. Humana Press, Totowa, New Jersey (1996)).

Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y sustancias cromogénicas incluyendo partículas coloreadas tales como oro coloidal y partículas de látex.

En una realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención están radiomarcados con, pero sin limitación, ^{32}P, ^{14}C, ^{3}H, ^{35}S, ^{125}I o ^{131}I. Los péptidos marcados pueden detectarse por métodos tales como recuento de centelleo, espectrometría de rayos gamma o autorradiografía.

En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con la luciferina de luciérnaga. El compuesto bioluminiscente puede estar unido covalentemente al péptido o polipéptido seleccionado por métodos convencionales, y el péptido o polipéptido marcado se puede detectar cuando una enzima, por ejemplo, luciferasa, cataliza una reacción con ATP que hace que la molécula bioluminiscente emita fotones de
luz.

Los fluorógenos también son de amplio uso como marcadores. Los ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, ficocianina y otros. Generalmente, las moléculas de fluorógeno se detectan por un detector de fluorescencia.

En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, el polipéptido de la SEC ID Nº: 4) pueden marcarse con biotina y capturarse en un soporte sólido por un ligando de biotina específico como avidina o estreptavidina. Una vez que se ha inmovilizado el polipéptido marcado en el soporte sólido (por ejemplo, el pocillo de una placa de ELISA), puede usarse para detectar anticuerpos contra el polipéptido seleccionado realizando las incubaciones típicas y etapas de lavado como las descritas en el Ejemplo 8b de la presente
invención.

Como alternativa, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina y otras enzimas que proporcionan una reacción cromogénica o fluorogénica después de la adición del sustrato apropiado). Pueden usarse péptidos y polipéptidos marcados con enzimas seleccionadas, por ejemplo, para detectar anticuerpos específicos que reconocen dichos péptidos o polipéptidos en un método ELISA de captura, donde el anticuerpo a detectar se captura primero por otro anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido y el péptido o polipéptido marcado, más el sustrato apropiado, se usan para revelar que tuvo lugar la unión anticuerpo-polipéptido.

En otra realización preferida más, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con oro coloidal para su uso en ensayos de inmunocromatografia de flujo lateral, de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos para producir partículas de oro de diversos tamaños y para la conjugación de oro con proteínas en: Dykstra (Ed). A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum Press. New York (1993).

Además, en otra realización preferida, la molécula de marcaje puede ser micropartículas magnéticas y el sistema inmovilizado un imán.

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Ejemplo 11

Marcaje y aplicaciones de moléculas de ácido nucleico de Anisakis simplex de la presente invención

Pueden usarse moléculas de ácido nucleico marcadas como sondas para detectar secuencias diana complementarias en una mezcla de ácido nucleico compleja por métodos de hibridación específicos tales como transferencia de Southern, de Northern, slot blot y dot blot, hibridación in situ (ISH) y micromatrices (microarrays). Los métodos para marcar moléculas de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y pueden realizarse usando diferentes agentes de marcaje incluyendo, pero sin limitación: agentes radiactivos, colorantes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes; micropartículas; enzimas; marcadores colorimétricos (tales como, por ejemplo, colorantes, oro coloidal y similares); marcadores magnéticos y haptenos (tales como, por ejemplo, biotina, dioxigenina (DIG) y otros para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales).

Las sondas marcadas de la presente invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico, por ejemplo, para la detección de ADN de Anisakis spp. en tejidos humanos y/o animales infectados, y para investigación.

En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico seleccionadas de la presente invención pueden marcarse con DIG por amplificación por PCR usando nucleótidos marcados con DIG (Boehringer-Mannheim, Alemania).

Como ejemplo, puede obtenerse una sonda de secuencia de nucleótidos marcada con DIG seleccionada (482 pares de bases), que corresponde a las posiciones de los nucleótidos 1490 y 1971 de la SEC ID Nº: 1, usando el vector pQE-31 transformado del Ejemplo 3 como molde, y un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº: 27 3') e inverso (5' SEC ID Nº: 28 3'). Las muestras tisulares a analizar, obtenidas a partir de biopsias humanas o de animales infectados, pueden fijarse en paraformaldehído al 4%, y después analizarse para detectar la presencia de ADN de Anisakis spp. usando métodos ISH y la sonda marcada con DIG anterior. Una descripción detallada de un método para realizar el ISH del presente ejemplo ha sido descrita por Leiro et al. (2001), que se incorporó en este documento como
referencia.

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Ejemplo 12

Análisis de secuencias peptídicas sintéticas que inhiben la unión de anticuerpo monoclonal UA3 con péptidos y polipéptidos de Anisakis simplex de la presente invención

En un aspecto de la presente invención, se describen secuencias peptídicas que se reconocen por el anticuerpo monoclonal UA3. Dichas secuencias peptídicas se reconocieron como "repeticiones" de aminoácidos analizando la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 usando el programa RADAR http://www.ebi.ac.uk/Radar/ en el EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute). Se sintetizaron químicamente secuencias seleccionadas de 12 aminoácidos a partir de estas "repeticiones" y se ensayaron en ELISA competitivo con respecto a la inhibición de la unión de anticuerpos monoclonales UA3 con el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4, inmovilizado en los pocillos de una placa de ELISA.

La actividad inhibidora de péptidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos Nº: 7-11 se ensayaron en un ELISA de captura, siguiendo las siguientes etapas típicas: a) unión del polipéptido de la SEC ID Nº: 4 a los pocillos de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con tampón TBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 2 h a 37ºC con 100 microlitros de la dilución apropiada de mAb UA3 preincubado con el péptido inhibidor a ensayar; d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contenía Tween-20 al 0,2% (TBS-T); e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:3000 en PBS-TM de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Nordic Immunological Laboratory, Tilburg, The Netherlands); f) aspiración, y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); i) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices).

La siguiente Tabla III muestra los valores de inhibición obtenidos para los péptidos sintéticos de las SEC ID Nº: 7-11 (ensayados a tres concentraciones) sobre la unión del anticuerpo monoclonal UA3 al polipéptido de la SEC ID Nº: 4 inmovilizado en una placa de ELISA. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición para cada dilución de péptido con respecto al control (sin inhibición). ND: No hecho. Como se dedujo de los resultados observados, el anticuerpo monoclonal UA3 tiene preferencia por péptidos de las SEC ID Nº: 7 y 8, que difiere solamente en un aminoácido.

TABLA III

3

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Ejemplo 13

Importancia de las secuencias de aminoácidos sintéticas de las SEC ID Nº: 7-11 como diana para anticuerpos IgE anti-Anisakis presentes en sueros de pacientes infectados

En otra realización preferida, se ensayó la actividad inhibidora de la secuencias de aminoácidos (SEC ID Nº: 7-11) sobre la unión de anticuerpos IgE humanos anti-Anisakis al polipéptido de la SEC ID Nº: 4 en un ELISA indirecto competitivo del siguiente modo: a) unión del polipéptido de la SEC ID Nº: 4 a los pocillos de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con tampón TBS que contiene leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (TBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante 2 h a 37ºC con 100 microlitros de una dilución 1:1 del suero del paciente correspondiente y la solución peptídica en TBS (1,5 X 10^{-3} M, concentración final para cada uno de los péptidos anteriores); d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contiene Tween-20 al 0,2% (TBS-T); e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC; f) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1500 de anticuerpos de conejo anti- FITC conjugados con peroxidasa (Dako); h) aspiración, y después lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; i) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); j) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en un lector multipocillo (Molecular
Devices).

La siguiente Tabla IV muestra la actividad inhibidora de una mezcla de los péptidos sintéticos que corresponden a las SEC ID Nº: 7-11 sobre la unión de anticuerpos IgE presentes en sueros de cinco pacientes infectados al polipéptido de la SEC ID Nº 4 inmovilizado en placas de ELISA. La mezcla peptídica se ensayó a una concentración final de 1,5 x 10^{-3} M para cada péptido. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de la mezcla peptídica con respecto al control (inhibido con una mezcla de péptidos irrelevantes a la misma concentración final). Como se observó en la Tabla, las secuencias ensayadas fueron dianas para un intervalo del 25-74 por ciento de todos los anticuerpos IgE anti-Anisakis presentes en los sueros de pacientes infectados. Sin embargo, se entiende que probablemente otros péptidos y polipéptidos recombinantes o sintéticos que comprenden un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o repeticiones de dichas secuencias, también pueden reconocerse por anticuerpos anti-Anisakis de varios isotipos que están presentes en sueros de pacientes infectados.

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TABLA IV

4

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Ejemplo 14

Caracterización de antígenos de larvas de Anisakis en tejidos biológicos

En una realización preferida, los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden usarse para inmunizar un mamífero (tal como, por ejemplo, conejos, ovejas, cabras, ratones o ratas) y los anticuerpos policlonales específicos obtenidos pueden usarse para revelar la presencia de larvas de Anisakis en tejidos infectados de seres humanos o animales. Típicamente, el procedimiento para revelar antígenos de Anisakis en tejidos con parásitos puede realizarse siguiendo un método de inmunohistoquímica convencional de acuerdo con las siguiente etapas generales: a) preparación de los portaobjetos que contienen las secciones de tejidos incluidos en parafina; b) bloqueo de los tejidos con TBS-TM o cualquier otro reactivo de bloqueo; c) etapa de lavado; d) incubación con anticuerpos policlonales anti-Anisakis; e) etapa de lavado; f) incubación con anticuerpos secundarios marcados que reconocen anticuerpos IgG de la especie animal usada para la inmunización (en este ejemplo, la molécula de marcaje preferida es la enzima peroxidasa, pero puede usarse cualquier otro marcador tal como, por ejemplo, los indicados en el Ejemplo 10 de la presente invención, para el marcaje de anticuerpos secundarios); g) etapa de lavado; h) incubación con el sustrato enzimático apropiado (tal como, por ejemplo H_{2}O_{2} + DAB); i) observación al microscopio.

En otra realización preferida, puede revelarse la presencia de proteínas de Anisakis spp. que comprenden las secuencias de aminoácidos de la presente invención en tejidos infectados de seres humanos o animales usando el anticuerpo monoclonal UA3 como anticuerpo primario, usando métodos de inmunohistoquímica convencionales.

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Ejemplo 15

Detección de la presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios empleando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales de la presente invención

En otra realización preferida, los AcMs (ejemplo el AcM UA3) y los anticuerpos policlonales obtenidos frente a los péptidos, polipéptidos o proteínas de la presente invención pueden ser utilizados para diseñar un método ELISA captura destinado a detectar la presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios que contengan pescado en su composición.

En una realización todavía más preferida, el método ELISA captura para la determinación de antígenos de Anisakis en un extracto alimentario se puede llevar a cabo de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos policlonales anti-Anisakis (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de la placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de PBS que contenga leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0,2% (PBS-TM); d) aspiración, y después incubación durante una noche a 4ºC y agitación orbital, con 100 microlitros del correspondiente extracto alimentario (sobrenadante obtenido por homogenización de la muestra en PBS y posterior centrifugación a 3.000 g durante 30 minutos); e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS que contenga Tween-20 al 0,2% (PBS-T); f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales UA3 marcados con biotina (marcaje realizado según se describe en la referencia Walker (1996)); g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1.500 avidina-peroxidasa (Pierce, Rockford, IL, USA); i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma); k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA).

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<110> Universidade de Santiago de Compostela

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<120> Secuencias peptídicas y nucleotidicas de Anisakis spp., anticuerpos que reconocen dichas secuencias, y usos de los mismos.

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<130> ES1596.2

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<160> 28

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 3288

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<212> DNA

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<213> Anisakis spp.

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(3288)

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<223> Región codificante de la secuencia antigénica de la SEQ ID nº 2 de Anisakis

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<400> 1

5

6

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<210> 2

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<211> 1096

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<212> PRT

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<213> Anisakis spp.

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<220>

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<221> Peptide

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<222> (1)..(1096)

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<223> Secuencia aminoácidica deducida de la SEQ ID Nº 1

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<400> 2

7

8

9

10

11

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<210> 3

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<211> 915

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<212> DNA

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<213> Anisakis spp.

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(915)

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<223> OERF PQE31 (marco de lectura abierto del plásmido PQE31)

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<400> 3

12

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<210> 4

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<211> 305

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<212> PRT

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<213> Anisakis spp.

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<220>

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<221> PEPTIDE

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<222> (1)..(305)

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<223> Secuencia aminoácidica deducida de la SEQ ID Nº 3

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<400> 4

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13

14

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<210> 5

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<211> 846

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<212> DNA

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<213> Anisakis spp

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(846)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> OERF Ptarget (marco de lectura abierto del plásmido Ptarget)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(282)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia aminoácidica deducida de la SEQ ID Nº 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Gln Lys Tyr Gly Thr Glu Phe Cys Asn Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Gln Lys Tyr Gly Gln Glu Phe Cys Asn Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Gln Arg Tyr Gly Thr Gln Phe Cys Lys Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Arg Lys Tyr Gly Val Thr Tyr Cys Asn Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Ala Arg Tyr Gly Ala Glu Phe Cys Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Gln Lys Tyr Gly Ala Glu Phe Cys Asn Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Tyr Gly Glu Gln Phe Cys Ser Ser Met Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido antigénico de Anisakis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asn Arg Leu Gly Ala Ala Cys Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 838

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(838)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento nucleotídico de la SEQ ID Nº 1 que codifica la secuencia antigenica SEQ ID Nº 16 de Anisakis spp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).(279)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia antigénica aminoácidica deducida de la SEQ ID Nº 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 834

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(834)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento nucleotídico de la SEQ ID Nº 1 que codifica la secuencia antígenica SEQ ID Nº 18 de Anisakis spp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PEPTIDE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(278)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia antigénica aminoácidica deducida de la SEQ ID Nº 17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgtaaaacg acggccagtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctttgtcga tactggtact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagagagt cgacatgatg cacaaatgct taaagtc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(36)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagagaaa gctttcgcca aggatcctgt tgcgga

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PEPTIDE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(22)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Ser}

\sac{Ser Val Pro Arg Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anisakis spp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PEPTIDE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(4)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Ile Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcacaaatg cttaaagtcg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagctaatta agcttcgcca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaatggtgg tgaccacaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggatcaaaa gtctctcctg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (27)

1. Secuencia de ácido nucleico aislada seleccionada de cualquiera de las siguientes:

a.

Un ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº 1

b.

Un ácido nucleico que comprende el complemento de la SEC ID Nº 1

c.

Un fragmento del ácido nucleico de la SEC ID Nº 1 que comprende la SEC ID Nº 15 o la SEC ID Nº 17.

d.

Un ácido nucleico que comprende un fragmento de la SEC ID Nº 1 que codifica para cualquiera de las SEC ID Nº 4 o 7-14.

e.

Un ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas previamente.

2. Polipéptido, péptido o proteína aislada codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 1, seleccionado entre el siguiente grupo:

a.

Un polipéptido, proteína o péptido que comprende la SEC ID Nº 2

b.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende la SEC ID Nº 16 o la SEC ID Nº 18.

c.

Un fragmento de la SEC ID Nº 2 que comprende cualquiera de las SEC ID Nº 4 o 7-14.

d.

Un polipéptido, péptido o proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con cualquiera de las secuencias de polipéptidos, proteínas o péptidos descritas previamente.

3. El péptido, polipéptido o proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 2(a)-2(d) o la secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1(a)-1(e), que presente una identidad de al menos el 80% con cualquiera de estas secuencias.

4. El polipéptido, péptido o proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 2(a)-2(d) o en la secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1(a)-1(e), que presente una identidad de al menos el 90% con cualquiera de estas secuencias.

5. Péptido, polipéptido o proteína aislada que consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2(c)-2(d), 3 ó 4, seleccionada entre el siguiente grupo:

a.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 7

b.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 8

c.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 9

d.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 10

e.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 11

f.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 12

g.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 13

h.

Una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 14.

6. Una secuencia de ácido nucleico aislada capaz de codificar cualquiera de los péptidos de la reivindicación anterior.

7. Un péptido, polipéptido o proteína que comprende dos o más de las secuencias de aminoácidos de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína de la reivindicación 7.

9. Un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de reconocer cualquier péptido, polipéptido o proteína de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

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10. Un anticuerpo según la reivindicación anterior, donde dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal UA3 producido por la línea celular de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2793.

11. Línea celular de hibridoma con número de depósito DSM ACC2793 caracterizado porque produce el anticuerpo monoclonal UA3 específico frente a la SEC ID Nº 2.

12. Una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde dicha secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos está marcada con una molécula de señalización.

13. La secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha molécula de marcaje se selecciona entre el siguiente grupo:

a.

Radiactiva

b.

Enzimática

c.

Fluorescente

d.

Luminiscente

e.

Quimioluminiscente

f.

Haptenos

g.

Coloreada.

14. La secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación anterior, donde dicha molécula de marcaje se selecciona entre el siguiente grupo:

a.

Biotina o sus derivados

b.

Derivado de nitrofenol

c.

Oro coloidal y

d.

Látex.

15. Un péptido, polipéptido o proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, fusionada o unida químicamente a un péptido, polipéptido o proteína adicional.

16. Un vector de expresión o sistema de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-4, 6 o 8.

17. Una célula hospedadora procariota o eucariota aislada transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-4, 6, o 8 ó con el vector o sistema de expresión de la reivindicación 16.

18. Un método para elaborar un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, por cualquiera de las siguientes técnicas:

a.

Técnicas recombinantes

b.

Síntesis química

c.

Purificación sustancial de nematodos de la familia Anisakidae.

19. Un método para elaborar un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 17 en condiciones tales que se exprese dicha secuencia de nucleótidos, y producir y después aislar dicho péptido, polipéptido o proteína.

20. Un método in vitro para detectar anticuerpos contra Anisakis spp. en una muestra biológica que comprende:

a.

poner en contacto la muestra biológica, preferiblemente suero, con un péptido, polipéptido o proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 ó 13, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho polipéptido y los anticuerpos de la muestra, y

b.

detectar dicho complejo inmunológico.

21. El método de la reivindicación 20, en el que dicho método es un inmunoensayo o un inmunoensayo enzimático.

22. Un método in vitro para detectar antígenos de Anisakis spp. en una muestra biológica o en un extracto alimentario que comprende:

a.

poner en contacto la muestra biológica, o el extracto alimentario con un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunológico entre dicho anticuerpo y los antígenos de la muestra, y

b.

detectar dicho complejo inmunológico.

23. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el anticuerpo usado para formar un complejo inmunológico es UA3.

24. Una composición inmunológica que comprende un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-4, 6, 8 ó 10.

25. Uso de un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5 o 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de alergia a Anisakis spp.

26. Un kit adecuado para la detección de anticuerpos anti-Anisakis spp. en una muestra biológica que comprende un péptido, polipéptido o proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, 7 ó 13.

27. Un kit adecuado para la detección de antígenos de Anisakis spp en una muestra biológica, o en un extracto alimentario que comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-10.