KR20160121673A

KR20160121673A - 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트

Info

Publication number: KR20160121673A
Application number: KR1020150050442A
Authority: KR
Inventors: 허문; 정점규; 김지연; 하양화; 이진주; 김연희; 정석찬
Original assignee: 주식회사 젠바디; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2016-10-20
Also published as: KR101779443B1

Abstract

본 발명은 브루셀라 균주에서 유래된 스무스 LPS(smooth lipopolysaccharide) 항원이 결합된 기판 및 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트 및 상기 키트를 이용하여 브루셀라병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트는 브루셀라 균주로부터 유래된 스무스 LPS 항원이 고정된 기판 및 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하여, 미량의 시료를 사용하더라도 목적하는 항체를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 브루셀라병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

브루셀라병 진단용 형광면역진단키트{Kit for fluorescence-linked immunochromatographic assay to diagnose brucellosis}

본 발명은 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 브루셀라 균주에서 유래된 스무스 LPS(smooth lipopolysaccharide) 항원이 결합된 기판 및 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트 및 상기 키트를 이용하여 브루셀라병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

브루셀라병은 대표적인 인수공통 전염병(인체;4군법정전염병, 가축;2종법정전염병)의 하나이며 국내는 물론 전 세계적으로 공중보건학적, 경제학적 심각한 문제를 야기한다고 알려져 있다. 최근 국내에서 본 감염증이 인체와 가축에서도 폭발적인 증가를 보이고 있어 국민적 관심사는 물론 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.

브루셀라병을 유발하는 브루셀라균은 Brucella abortus(소), B. melitensis(양, 염소), B. canis(개), B. ovis(양), B. suis(돼지) 등이 알려져 있는데, 이들은 모두 모두 인체에 감염하여 심각한 질병을 초래할 수 있고, 국내에서는 Brucella abortus가 높은 비율을 차지하는 것으로 알려져 있다. 상기 브루셀라병이 발병되면, 인체에 감염될 경우 10% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염, 관절염등 중증 질병으로 진행하게 되며, 감염된 동물에서 보이는 증상은 특별한 외부 증상이 없이 암컷에서의 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 수컷에서 고환염, 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다고 알려져 있다. 상기 브루셀라균은 세포내에서 증식하며 발병을 일으키기 때문에 인체감염의 경우 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 등으로 인하여 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다. 그러나, 소에 브루셀라병이 발병된 경우, 특별한 증상없이 장기간 동안 보균자로 유지하면서, 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하므로, 조기진단에 어려움이 있을 뿐만 아니라 브루셀라균의 세포내 탐식기전 및 세포내 증식기전에 대한 연구결과가 많지 않아 상기 질환의 근절이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 브루셀라균이 체내에 감염된 경우에도 면역원성이 낮아서 면역세포가 형성되기 어렵기 때문에 백신개발에 대한 연구도 성과가 미미한 실정이다.

특히, 소에서 브루셀라병이 발병된 경우, 소의 신체 각 부위(특히 간, 비장, 임파절, 혈액 등)에서 균이 높은 농도로 존재하게 되며, 우리나라의 식문화 특성상 육회, 간, 비장, 위 등을 날것으로 섭취하는 경향이 높아 브루셀라 균에 대하여 심각하게 노출되어 있고, 이에 대한 국가적 대책 마련이 시급한 실정이다. 이를 위하여, 브루셀라균을 검출하여 브루셀라병의 발병여부를 확인하고 있으나, 지금까지 알려진 방법으로는 민감도가 낮아서 검출효율이 매우 낮기 때문에, 새로운 진단법의 개발이 요구되고 있으며, 이를 위한 연구도 활발히 진행되고 있다.

예를 들어, 한국등록특허 제0260381호에는 브루셀라 아보투스 균주를 항원으로 하여 이를 감작시킨 라텍스비드를 이용한 브루셀라병 진단방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1270662호에는 브루셀라 아보투스의 26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS를 이용한 브루셀라 진단방법이 개시되어 있으며, 미국등록특허 제8,691,237호에는 소 브루셀라 단백질이 포함된 조성물을 이용한 브루셀라 진단방법이 개시되어 있으나, 이들 방법을 사용하여도 만족할만한 수준의 진단효율을 얻지 못하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 브루셀라병을 보다 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 브루셀라병을 유발시키는 B. abortus 1119-3균으로부터 유래된 항원인 smooth LPS(lipopolysaccharide)이 결합된 기판과 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G(protein A/G)가 결합된 형태의 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 개발하였으며, 상기 형광면역진단키트를 사용할 경우, 소의 혈액에 포함된 미량의 항체를 검출하여 브루셀라병을 보다 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 소의 브?伶? 감염증을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 브루셀라병을 보다 효과적으로 검출하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 코마린 덴드리머에 주목하게 되었다. 통상적으로, 시료에 포함된 항체를 검출하기 위한 샌드위치 ELISA 키트는 항원에 형광물질과 같은 표지물질을 결합시키는데, 상기 항원에 결합된 형광물질에서 방출되는 형광세기가 한계가 있어, 시료에 포함된 항체의 농도가 낮은 경우에는 기저값과 비교하여 형광세기의 변화를 측정하기가 어렵다는 단점이 있다. 이에, 상기 형광세기를 증폭시킬 수 있는 수단을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, LED 광원에 의하여 여기되는 녹색형광 물질의 하나인 코마린(Coumarin) 염료의 변형체인 코마린 덴드리머(coumarin 3-dendrimer)에 프로틴 A/G(protein A/G)가 결합된 축합체를 사용할 경우, 상기 형광의 세기를 효과적으로 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.

실제로, 본 발명자들은 브루셀라 균의 항원인 smooth LPS(lipopolysaccharide)이 결합된 기판과 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제작하고, 상기 키트에 브루셀라병이 발병된 소의 혈액시료를 가한 결과, 상기 혈액시료에 포함된 다양한 항체의 불변영역(constant region)에 상기 축합체에 포함된 프로틴 A/G가 결합하여 코마린 덴드리머-프로틴 A/G-항체의 형태로 구성된 복합체를 형성하고, 상기 복합체 중에서 항-LPS 항체를 포함하는 복합체만이 상기 기판에 고정된 LPS 항원과 결합하며, 상기 기판에 결합된 복합체에 포함된 코마린 덴드리머에 의하여 증폭된 형광을 검출함으로써, 상기 혈액시료에 항-LPS 항체가 미량으로 존재할 경우라도, 효과적으로 상기 항체를 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다른 형태의 브루셀라병 진다키트와 검출능을 비교한 결과, 민감도와 특이도가 우수함을 확인하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G(protein A/G)가 결합된 형태의 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제공한다.

상기 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트는 브루셀라 균주가 감염되어 상기 균주로부터 유래된 smooth LPS 항원에 의하여 동물의 체내에서 생성된 항체를 검출하는 방식으로, 브루셀라병의 발병여부를 진단하게 되는데, 이때, 상기 항체를 검출하기 위하여, 상기 키트에 포함된 축합체를 사용하게 된다.

본 발명의 용어 "코마린 덴드리머(coumarin dendrimer)"란, 나뭇가지 형태의 덴드리머 구조를 포함하는 460nm 내지 645nm의 파장영역을 갖는 형광물질을 의미한다. 상기 코마린 덴드리머는 LED 광원에서 발색되는 낮은 세기의 빛으로도 형광신호를 유발시킬 수 있다는 장점이 있어, 다중형광제, 바이오센서, 형광면역진단용 키트 등에 응용되고 있다.

본 발명의 용어 "프로틴 A/G(protein A/G)"란, 프로틴 A(protein A)와 프로틴 G(protein G)의 IgG 결합 도메인이 조합된 형태의 약 50kDa의 분자량을 갖는 재조합 융합단백질을 의미한다. 상기 프로틴 A/G는 프로틴 A에서 유래된 4개의 IgG의 Fc 영역 결합도메인과 프로틴 G에서 유래된 2개의 IgG의 Fc 영역 결합도메인을 포함한다. 상기 프로틴 A/G 단백질의 구체적인 아미노산은 당업계에 공지되어 있다(Sikkema, J.W.D. (1989) Amer. Biotech. Lab, 7, 42 등).

본 발명의 용어 프로틴 A(protein A)"란, 스타필로코커스 균주(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 유래되고, spa 유전자로부터 발현되는 42 kDa의 표면단백질을 의미하는데, 인간, 마우스, 랫트, 염소, 소, 기니아피그, 토끼, 닭 등에서 유래된 항체의 불변영역(Fc, constant region)과 특이적으로 결합할 수 있다고 알려져 있다. 상기 프로틴 A 단백질의 구체적인 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 유전자 서열 정보는 당업계에 공지되어 있다(Graille M, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97 (10): 5399-5404. 등).

본 발명의 용어 프로틴 G(protein G)"란, C 및 G 그룹의 스타필로코커스 균주로부터 유래되고, 65kDa 또는 58kDa의 크기를 갖는 면역글로불린 결합 단백질로서, 면역글로불린의 가변영역(Fab 도메인)과 불변영역(Fc 영역)에 모두 결합할 수 있다고 알려져 있다. 상기 프로틴 A 단백질의 구체적인 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 유전자 서열 정보는 당업계에 공지되어 있다(Sjobring U, et al., (1991), J Biol Chem 266 (1): 399-405 등).

본 발명의 용어 "브루셀라 균주(Brucella sp.)"란, 브루셀라감염증을 일으키는 호기성 그람음성 세균의 1속(屬)에 속하는 세균을 의미하는데, 호기성 또는 미호기성으로 발육하여 사람 및 각종 동물에 감염하여 브루셀라증(brucellosis)의 발병원인이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "브루셀라병(brucellosis)"이란, 다양한 브루셀라균의 감염에 의하여 발병되는 전염병을 의미하는데, 인체에 감염될 경우 10% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염, 관절염등 중증 질병으로 진행하게 되며, 감염된 동물에서 보이는 증상은 특별한 외부 증상이 없이 암컷에서의 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 수컷에서 고환염, 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 브루셀라병은 소의 브루셀라균(Brucella abortus)에 의하여 소에서 발병되는 법정전염병인 소 브루셀라병(bovine brucellosis)을 의미하는 것으로 해석될 수 있으며, 이는 브루셀라 균주에서 특이적으로 생성되는 smooth LPS 항원에 대한 항체를 소의 시료에서 검출하여 그의 감염여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 용어"smooth LPS(lipopolysaccharide)"란, LPS의 일종으로서 코어 올리고다당체인 O-antigen과 lipid A로 구성된 지질다당체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 smooth LPS는 브루셀라 균주가 감염된 소에서 분비되어, 소의 면역시스템에 의하여 이에 대한 항체를 형성하게 되는 항원으로 작용하므로, 브루셀라병이 발병이 의심되는 소의 시료로부터 상기 항체를 검출하여, 소의 브루셀라병의 발병여부를 진단하기 위한 수단으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 상기 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하여 목적하는 항체를 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 축합체를 포함하는 ELISA 키트가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 ELISA 키트가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트가 될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 혈액시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료주입부로부터 일정 간격에 위치한 축합체 혼합물(코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체와 코마린 덴드리머에 NUS 단백질이 결합된 축합체의 혼합물), 상기 smooth LPS가 고정된 검사선 및 상기 코마린 덴드리머에 NUS 단백질이 결합된 축합체에 결합할 수 있는 항-NUS 항체가 고정된 대조선이 구비된 면역스트립 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)가 될 수 있다.

본 발명의 용어, "NUS 단백질"이란, "NusA 단백질"이라고도 하고, 대장균에서 발현되는 54.8 kDa의 분자량과, 495개의 아미노산으로 구성된 단백질을 의미한다. 상기 NUS 단백질은 RNA 중합효소에 결합하여 전사종결(transcription termination)의 유도 또는 조절하는 활성을 나타내고, 약 95%의 용해도를 나타내며, 대량으로 발현되는 특성을 나타내며, 포유동물의 단백질과의 반응성을 나타내지 않는다는 특징이 있다. 상기 NUS 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 또는 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: EGT68887.1 등).

본 발명에 있어서, 상기 NUS 단백질은 포유동물의 단백질과의 반응성을 나타내지 않는다는 특징으로 인하여, 본 발명에서 제공하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트용 축합체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 서열번호 1의 NUS 단백질을 포함하는 축합체를 사용하였다.

본 발명의 키트는 브루셀라병의 발병이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 상기 브루셀라 균주에서 분비되는 smooth LPS에 의해 생성된 항체를 검출하는데 사용될 수 있는데, 상기 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체 외에도, 검출 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 브루셀라 균주의 smooth LPS가 결합된 기판과, 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제작하였다.

상기 키트에 브루셀라병이 발병된 개체에서 분리된 시료를 가하면, 브루셀라병의 발병으로 인하여 생성되어 상기 시료에 포함된 항체의 불변영역에 상기 축합체의 프로틴 A/G가 결합하여 항체-축합체 형태의 1차 복합체를 형성하고, 상기 1차 복합체는 기판에 고정된 항원과 다시 결합하여 항원-항체-축합체 형태의 2차 복합체를 형성하며, 상기 2차 복합체는 기판에 고정되고, 상기 축합체에 포함된 덴드리머로 인하여 형광을 발색시키므로, 상기 제작된 키트를 이용하여 브루셀라병의 발병으로 인하여 생성된 항체를 명확히 검출할 수 있음을 확인하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에, 목적하는 항체의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 브루셀라병 진단방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 인간을 제외한 동물의 브루셀라병 진단방법은 (a) 브루셀라병의 발병이 의심되는 인간을 제외한 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 시료를 상기 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 가하여 브루셀라 균주로부터 유래된 스무스 LPS 항원에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 이때, 사용되는 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 비강액, 타액, 콧물, 객담, 혈액, 뇨 등의 가검물을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "동물"이란, 브루셀라균(Brucella sp.)의 감염에 의하여 브루셀라병이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 사람을 제외한 소, 개, 양, 염소, 돼지 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체와 코마린 덴드리머에 NUS 단백질이 결합된 축합체를 포함하는 축합체 혼합물, 검사선에 고정되고 항체를 검출할 수 있는 smooth LPS, 대조선에 고정되고 NUS 단백질을 검출할 수 있는 항체가 기판에 고정된 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제작하고, 상기 키트를 이용하여 브루셀라 균주의 smooth LPS에 대한 항체를 검출하는 방법을 설명한다.

즉, 브루셀라병의 발병이 의심되는 소의 혈액으로 수득한 혈장을 상기 키트에 가하면, 이에 포함된 항체는 측면유동방식으로 상기 축합체 혼합물에 도달하여 상기 혼합물에 포함된 프로틴 A/G와 결합하여, 축합체-항체의 형태를 갖는 결합체를 형성한다. 상기 결합체가 검사선으로 이동하면, 상기 축합체-항체의 형태를 갖는 결합체 중에서 항-smooth LPS 항체를 포함하는 결합체만이 검사선에 결합된 항원과 결합하여 고정된다. 또한, 상기 축합체 혼합물에 포함된 코마린 덴드리머에 NUS 단백질이 결합된 축합체는 상기 혈장의 투입에 의하여 측면유동방식으로 대조선으로 이동하고, 상기 대조선에 결합된 항-NUS 항체와 결합하여 대조선에 고정된다. 이어, 상기 반응이 종료된 키트에 LED를 조사하면, 코마린 덴드리머에 의하여 검사선과 대조선에서 형광이 발색되어, 이를 검출기를 이용하여 측정함으로써, 시료에 브루셀라 균주의 smooth LPS에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 확인할 수 있게 된다.

본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트는 브루셀라 균주로부터 유래된 스무스 LPS 항원이 고정된 기판 및 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체를 포함하여, 미량의 시료를 사용하더라도 목적하는 항체를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 브루셀라병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 2-hydroxy-4- nitrobenzoic acid로부터 코마린 골격의 합성 전구체 화합물를 합성하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 2는 3개의 아지도기(azido groups)을 갖는 링커를 합성하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 코마린 골격의 합성 전구체 화합물와 링커를 결합시켜서, 목적하는 코마린 덴드리머를 제작하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 4a 내지 4c는 6개의 브루셀라병 양성 혈청 희석물을 이용하여, 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 정량분석능을 검증한 결과를 나타내는 그래프 및 도표로서, 도 4a 및 4b는 6개 혈청 중에서 1개 혈청(serum ID 8888)의 희석물을 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 적용하여 얻어진 결과를 나타내는 도표이고, 도 4b는 상기 도 4a의 도표를 분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4c는 상기 6개 혈청 중에서 나머지 5개의 희석물을 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 적용하여 정량분석한 결과를 나타내는 도표이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 브루셀라병 진단용 항원의 제조

브루셀라병을 유발시킬 수 있는 브루셀라 균주(B. abortus 1119-3)를 브루셀라 배양용 고체배지(potato infusion agar)에서 배양하고, 0.5% phenol-saline으로 배양된 균주를 회수하였으며, 회수된 균주를 세척하고, 80℃에서 1시간 동안 불활성화시켰으며, 가열 추출법(hot water/hot phenol method)을 사용하여 상기 균주로부터 smooth-LPS를 추출하였다. 구체적으로, 상기 균제 50g에 66℃의 D.W 170㎖와 90% 페놀 190㎖를 가하고, 20분 동안 반응시켜서 LPS를 추출한 다음, 상기 추출물을 원심분리하여 페놀 분획을 수득하였다. 상기 수득한 페놀 분획에 아세트산나트륨으로 포화된 메탄올 1%가 포함된 메탄올 500㎖을 가하여 반응시킨 다음, 침전물을 수득하였다. 상기 침전물에 증류수를 가하여 현탁시킨 다음 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 TCA(trichloroacetic acid)를 가하여 단백질을 침전시킨 다음, 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 트립신(0.05%, w/v)을 처리하여 반응산물을 수득하고, 상기 수득한 반응산물을 증류수에 투석한 다음, 이를 동결건조하여, smooth LPS를 제조하였으며, 상기 제조된 smooth LPS를 브루셀라병 진단용 항원으로 사용하였다.

실시예 2: 코마린 덴드리머의 제작

라이신 기의 말단에 있는 아미노기와 효과적으로 결합할 수 있는 티오이소시아네이트(thioisocyanate, -NCS) 기를 합성하고자, LED에 효과적으로 검출 가능한 여러 골격 중 다양한 치환기의 도입이 가능하여 흡수파장의 조절이 용이한 코마린(coumarin) 골격을 선택하여 이 골격에 티오이소시아네이트가 도입된 형태의 코마린 덴드리머를 제작하였다.

먼저, 2-hydroxy-4- nitrobenzoic acid로부터 몇 단계를 거쳐 코마린 골격의 합성 전구체 화합물을 합성하였다(도 1).

도 1은 2-hydroxy-4- nitrobenzoic acid로부터 코마린 골격의 합성 전구체 화합물를 합성하는 과정을 나타내는 개략도이다.

다음으로, 코마린 골격의 합성에 필요한 또 다른 전구체의 확보를 위해 아미노티오페놀(2-aminothiophenol)을 에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 120℃에서 용매 없이 축합하여 3개의 아지도기(azido groups)을 갖는 링커를 합성하였다(도 2). 상기 합성된 링커는 3개의 벤조티아졸릴(Benzothiazolyl) 기를 결합시킬 수 있어, 형광물질의 핵심성분으로 사용된다.

도 2는 3개의 아지도기(azido groups)을 갖는 링커를 합성하는 과정을 나타내는 개략도이다.

끝으로, 상기 각각 합성된 코마린 골격의 합성 전구체 화합물와 링커를 결합시켜서, 목적하는 코마린 덴드리머(coumarin 3-dendrimer)를 제작하였다(도 3).

도 3은 코마린 골격의 합성 전구체 화합물와 링커를 결합시켜서, 목적하는 코마린 덴드리머를 제작하는 과정을 나타내는 개략도이다.

상기 제작된 코마린 덴드리머는 상호결합에 의한 침전을 방지하기 위하여 DMSO에 용해시켜서 사용하였다.

실시예 3: 브루셀라병 진단용 축합체의 제조

상기 실시예 2에서 제작한 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G를 결합시켜서 브루셀라 진단용 축합체(시험군 축합체)를 제조하였다.

구체적으로, 0.1M 인산염 완충액에 용해된 프로틴 A/G 용액(1mg/㎖)에 코마린 덴드리머 6% 당량을 가하고, 차광조건 및 상온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이어, 상기 반응물에 1%(w/v)가 되도록 BSA를 가하고, 동일조건에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 반응물을 하룻밤 동안 투석하여, 브루셀라병 진단용 축합체를 제조하였다.

아울러, 내부 대조군으로 사용하기 위하여 프로틴 A/G 대신에 NUS 단백질을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 방법과 동일한 방법을 수행하여, NUS 단백질에 코마린 덴드리머가 결합된 형태의 축합체(대조군 축합체)를 제조하였다.

실시예 4: 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 제작

상기 실시예 3에서 제작한 축합체를 포함하는, 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 제작하였다.

구체적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부를 구비시켰다. 상기 시료주입부와 일정간격을 두고, 상기 실시예 3에서 제작한 시험군 축합체와 대조군 축합체의 혼합물을 가하고, 상기 혼합물과 일정 간격을 두고 검사선을 설정한 다음, 상기 검사선에 상기 실시예 1에서 제조한 smooth LPS를 0.8 mg/㎖의 농도로 가하여 고정시켰다.

상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선을 설정한 다음, 상기 대조선에 상기 대조군 축합체에 포함된 NUS 단백질에 대한 항체(anti-Nus 5C4 MAb)를 1mg/㎖의 농도로 가하여 고정시켰다.

그 결과로서, 시료에 포함된 브루셀라 균주 유래 smooth LPS에 대한 항체를 검출할 수 있도록, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 축합체 혼합물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광면역진단키트(fluorescent immunochromatographic test, FICT)를 제작하였다.

한편, 상기 형광면역진단키트에 시료를 가한 후, 원활한 검출을 수행하기 위하여 사용되는 전개액(0.1M Tris, pH 8.5, 1% Tween 20, 500 mM NaCl 및 0.1% NaN₃)을 제조하였다.

실시예 5: 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능평가

실시예 5-1: 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 정량분석능 검증

상기 실시예 4에서 제작된 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 정량분석능을 검증하기 위하여, 소에서 유래된 6개의 브루셀라병 양성 혈청 희석물을 적용하여, 정량분석을 수행하였다(도 4a 내지 4c).

도 4a 내지 4c는 6개의 브루셀라병 양성 혈청 희석물을 이용하여, 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 정량분석능을 검증한 결과를 나타내는 그래프 및 도표로서, 도 4a 및 4b는 6개 혈청 중에서 1개 혈청(serum ID 8888)의 희석물을 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 적용하여 얻어진 결과를 나타내는 도표이고, 도 4b는 상기 도 4a의 도표를 분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4c는 상기 6개 혈청 중에서 나머지 5개의 희석물을 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 적용하여 정량분석한 결과를 나타내는 도표이다.

도 4a 내지 4c에서 보듯이, R²값이 0.93 이상의 직선성을 나타내었으므로, 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 이용한 정량적 검사가 가능함을 알 수 있었다.

실시예 5-2: 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트와 ELISA 키트의 분석능 비교

상기 실시예 5-1에서 사용된 시료 중에서 하나의 시료(serum ID 8888)의 희석액을 사용하여, 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트 및 종래의 브루셀라병 진단용 I-ELISA 키트에 적용하여 각각 분석한 다음, 이를 비교하였다(표 1). 이때, SD는 표준편차를 나타내고, I-ELISA 키트에서 측정된 값은 40이상을 나타낼 경우, 양성으로 판정하였다.

브루셀라병 진단효능 비교

희석배수	본 발명의 키트				I-ELISA 키트	결과
	1st	2nd	평균	SD	PP(>40)
8배 16배 32배 64배	1330 1275 1175 1140	1245 1188 1138 1100	1287.5 1231.5 1156.5 1120.0	42.5 43.5 18.5 20.0	75.62 66.05 46.61 31.84	양성 양성 양성 음성

상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트는 I-ELISA 키트와 비교시 동등하거나 또는 더욱 우수한 검출능을 나타냄을 확인하였다.

실시예 5-3: 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 민감도 및 특이도 평가

소에서 얻어진 브루셀라 감염 양성 혈청 102개 및 음성 혈청 59개를 사용하여 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 민감도와 특이도를 평가하였다. 이때, 양성 혈청 및 음성 혈청은 RBT, Tube test, FPA 및 C-ELISA에 의해 사전확인된 시료를 사용하였다.

브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 민감도 및 특이도

판정결과	양성 혈청(n=102)	음성 혈청(n=59)	일치수준(Kappa Value)
양성 음성	101 1	0 59	0.99
진단적 정확도	99%	100%

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트는 높은 민감도와 특이도를 나타냄을 확인하였다.

실시예 5-4: 의양성 또는 약양성 시료에 대한 브루셀라병 진단용 형광 면역진단키트의 성능평가

의양성 또는 약양성 혈청에 대하여도 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 소에서 유래된 3개의 의양성 또는 약양성 혈청을 사용하여 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능을 평가하였다(표 3). 이때, 비교군으로는 튜브응집반응법(TUBE), I-ELISA 키트 및 C-ELISA 키트에 의한 결과를 사용하였다.

의양성 또는 약양성 시료에 대한 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능

혈청	TUBE(>50)	I-ELISA 키트(>80)	C-ELISA 키트(>40)	본 발명의 키트
cattle4 cattle5 cattle6	<50 100± 100±	105 115 120	40 54 41	+ + -

상기 표 3에서 보듯이, 현재 국내외에서 사용되고 있는, 튜브응집반응법, I-ELISA 키트 및 C-ELISA 키트를 사용하여 의양성 또는 약양성을 나타내는 혈청을 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에 적용할 경우, 이들을 정상적인 양성 혈청구 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-5: 비특이 교차반응 시료에 대한 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능평가

비특이 교차반응 혈청에 대하여도 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 소에서 Y. enterocolitica O9, E. coli O157:H7 또는 Salmonella typhi 균을 인공감염시켜 주차별로 채혈한 혈청을 사용하여 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능을 평가하였다(표 4).

비특이 교차반응 시료에 대한 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능

감염 균주	개체 번호	Tube 응집항체가(경과일, 주)					본 발명의 키트
감염 균주	개체 번호	1	2	3	4	5	본 발명의 키트
Y. enterocolitica O9	3413 3709 9810 7785	+200 +100 +200 +200	±200 ±50 ±200 ±200	±100 +25 ±100 +25	+50 +50 +25 +25	+50 +25 +50 +50	- - - -
E. coli O157:H7	6164	+100	±100	+25	+25	+50	-
Salmonella typhi	6342	+100	±25	-	-	-	-

상기 표 4에서 보듯이, Tube 응집항체가가 25배에서 200배인 혈청에 대하여도 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트에서는 비특이 반응에 의한 양성이 전혀 관찰되지 않아 그 특이성을 확인하였다.

실시예 5-6: 다른 동물에 대한 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능평가

소가 아닌 다른 동물에서 발병된 브루셀라병에 대하여도 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 염소에서 유래된 양성 혈청 6개를 사용하여 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능을 평가하였다(표 5).

염소의 혈청에 대한 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트의 성능

혈청	TUBE(>50)	I-ELISA 키트(>80)	C-ELISA 키트(>40)	본 발명의 키트
goat 1 goat 2 goat 4 goat 5 goat 6 goat 7	<50 200 50 200 <50 <50	104 104 104 100 98 91	74 95 87 95 62 61	+ + + + + -

상기 표 5에서 보듯이, 소가 아닌 염소와 같은 다른 동물에서 발병된 브루셀라병의 진단에도 본 발명의 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트를 사용하여 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> GenBody Inc. REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Kit for fluorescence-linked immunochromatographic assay to diagnose brucellosis <130> KPA141241-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant NUS <400> 1 Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys 1 5 10 15 Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala 20 25 30 Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln 35 40 45 Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val 50 55 60 Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln 85 90 95 Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln 100 105 110 Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp 115 120 125 Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys 130 135 140 Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala 145 150 155 160 Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly 165 170 175 Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly 180 185 190 Val Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu 195 200 205 Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys 210 215 220 Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr 225 230 235 240 Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly 245 250 255 Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp 260 265 270 Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met 275 280 285 Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr 290 295 300 Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg 305 310 315 320 Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu 325 330 335 Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala 340 345 350 His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp 355 360 365 Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu 370 375 380 Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu 385 390 395 400 Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr 405 410 415 Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Cys Asp 420 425 430 Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu 435 440 445 Ala Ala Arg Gly Val Cys Ser Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile 450 455 460 Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala 465 470 475 480 Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala 485 490 495

Claims

브루셀라 균주에서 유래된 스무스 LPS(smooth lipopolysaccharide) 항원이 고정된 기판 및 코마린 덴드리머-프로틴 A/G 형태의 축합체를 포함하는 브루셀라병 진단용 형광면역진단키트.
제1항에 있어서,
브루셀라병이 발병된 동물에서 스무스 LPS 항원에 대한 항체를 검출하여 브루셀라병의 발병여부를 진단하는 것인 키트.
제1항에 있어서,
상기 키트는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트인 것인 키트.
제3항에 있어서,
상기 FICT 키트는 시료주입부, 축합체 혼합물, 검사선 및 대조선이 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 구비된 형태인 것인 키트.
제4항에 있어서,
상기 시료주입부는 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드로 구성되는 것인 키트.
제4항에 있어서,
상기 축합체 혼합물은 코마린 덴드리머에 프로틴 A/G가 결합된 축합체와 코마린 덴드리머에 NUS 단백질이 결합된 축합체를 포함하는 것인 키트.
제6항에 있어서,
상기 NUS 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 키트.
제4항에 있어서,
상기 검사선은 상기 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 스무스 LPS가 고정된 형태인 것인 키트.
제4항에 있어서,
상기 대조선은 상기 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 항-NUS 항체가 고정된 형태인 것인 키트.
(a) 브루셀라병의 발병이 의심되는 인간을 제외한 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 시료를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키트에 가하여 브루셀라 균주로부터 유래된 스무스 LPS 항원에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 브루셀라병 진단방법.
제10항에 있어서,
상기 동물은 브루셀라균(Brucella sp.)의 감염에 의해 브루셀라병이 발병될 수 있는 소, 개, 양, 염소 또는 돼지인 것인 방법.
제10항에 있어서,
상기 시료는 비강액, 타액, 콧물, 객담, 혈액, 뇨 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 가검물인 것인 방법.