WO2010066936A1 - Método de extracción y detección de antígenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal - Google Patents

Método de extracción y detección de antígenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal Download PDF

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WO2010066936A1
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fish
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food
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PCT/ES2009/070573
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Margarita TEJADA YÁBAR
Ignacio Moneo Goiri
Ana Isabel RODRÍGUEZ MAHILLO
Miguel GONZÁLEZ MUÑOZ
Mª Teresa SOLAS ALADOS
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Carlos Iii
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    • G01N2333/4353—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes

Definitions

  • the present invention relates to a method of extracting and detecting allergens of fish parasites in food samples for human or animal consumption.
  • the extraction is based on applying solutions with low ionic strength, homogenization, sonication and different pHs to various types of fish, whether fresh or treated.
  • the detection is based on immunochemical methods through the use of polyclonal antibodies that allow detecting antigenic proteins of the parasite as well as polyclonal antibodies that allow the detection of the Ani s 4 allergen, which due to its physicochemical characteristics resists the thermal treatment of the food.
  • the method is sensitive, since Ani s 4 can be detected in amounts less than 1 ppm with recovery rates greater than 65%.
  • the described method is specific since it does not show cross reactivity with components of the different matrices tested.
  • the Anisakis genus includes nematode parasites that belong to several related species. Through the use of morphological and genetic / molecular markers, the following Anisakis species are now recognized: Anisakis pegreffii, Anisakis physeter ⁇ s, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispisulaggia or Anisakis paisakis.
  • Anisakis species reach sexual maturity in the stomach of cetaceans and, less frequently, in pinnipeds. These mammals can be infested by ingestion of a) paratenic hosts, that is, fish (mainly teleost) and cephalopods (mainly squid), which house the third larval phase of the parasite (L3), and b) by ingestion of krill, as an intermediate, which also houses L3 larvae (for example, whales).
  • Anisakis L3 larvae When Anisakis L3 larvae infest humans, they often cause gastrointestinal symptoms that may be associated with allergic reactions of varying severity. Depending on the location of the larvae and the dominant symptoms, four main clinical forms of anisakiosis (gastric / gastroallergic, intestinal, extragastrointestinal and allergic) have been presented in humans. In the gastric (acute) form of anisakiosis, the larva penetrates the gastric wall and a clinical course characterized by acute epigastric pain, nausea and vomiting is observed a few hours after ingestion of fish containing live Anisakis L3 larvae. In addition, allergic symptoms can also be observed in sensitized individuals (approximately 10% of cases).
  • Anisakis larvae in fish produces in the consumer the infestation by live larvae when raw or consumed fish is consumed.
  • the Anisakis L3 larva is able to secrete proteins that can cause serious allergic reactions in sensitized individuals. These reactions can be produced by ingestion of live or dead larvae.
  • Several of the Anisakis allergens described to date are stable to freezing, high temperatures or high pressures and resistant to variations in pH and the action of digestive enzymes. In their structure they have, among others, sulfydryl (SH) groups that allow the formation of covalent bonds with matrix proteins in which they are found, which can complicate their extraction and modify their antigenic capacity.
  • SH sulfydryl
  • the technical problem posed by the detection of allergens antigens of Anisakis larvae is the difficulty in the extraction of antigens of the parasite that are valid in a later step to induce the production of antibodies against said antigens and / or to be detected by antibodies already generated previously.
  • Antigen extraction methods have been described that use the incubation of live larvae at pH ranges similar to that of the stomach of humans
  • the present invention relates to a method of extracting and detecting allergens of fish parasites in food samples for human or animal consumption.
  • the method allows simple and efficient extraction without capture and isolation steps of the allergen.
  • the presence of allergens of interest in human health is identified.
  • Anisakis allergens are extracted in concentrations below 1 ppm and with recovery rates greater than 65%.
  • the method is applicable to different fish, samples from different parts of the fish or other samples that contain any fish processing.
  • the detection of Anisakis antigens is carried out by means of immunochemical techniques based on polyclonal antibodies.
  • the extraction and subsequent detection of some food allergens can be complicated since they are usually in trace concentrations and in complex matrices. Also when it comes to processed foods, preserved or cooked, the extraction and detection of allergens can be altered by food processing.
  • the detection by immunochemical methods based on antibodies ELISA, Western blot, dot blot or immunochromatographic strips) allows the specific identification of the allergen in the extract.
  • the alteration of the allergen by food processing can alter its extraction and / or detection.
  • this is solved using a simple and efficient extraction method and a detection by means of polyclonal antibodies generated against a crude extract of the parasite and / or detecting allergens that are stable and therefore can be detected even after that the food is frozen, heated or subjected to other treatments.
  • the method of the present invention leads to an unexpected result, since the steps of extraction of Anisakis antigens are simplified, while at the same time achieving a surprising effect in the subsequent detection of specific Anisakis antigens, as demonstrated in the examples , obtaining a recovery rate of Ani s 4 antigen, injected into fish muscle, of 65% and a detection sensitivity of less than 1 ppm.
  • the main aspect of the present invention is a method of extraction and detection of antigens of the Anisakis genus in a food intended for human and / or animal consumption comprising: Obtaining the food sample. Add a hypotonic solution to the food sample to fracture cell membranes and homogenize to continue fracturing intact membranes. Sonicate the homogenate to more effectively release the antigens. Separate the supernatant. Reduce the pH of the supernatant to a value equal to or less than 3. Incubate the supernatant. Neutralize the pH. Separate the supernatant from the product obtained, in this case the supernatant is called crude extract and, analyze the crude extract by means of immunochemical techniques.
  • the specimens of the Anisakis genus are parasitic nematodes, whose life cycle affects marine fish and mammals. They are infectious to humans and cause anisakiasis, a severe allergic reaction.
  • the species of the genus Anisakis referred to in the present invention are selected from the list comprising, without limitation, Anisakis pegreffii, Anisakis physeter ⁇ s, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis breispisulagiagisgis pagisulagisgis paisakisgisgis .
  • the species Anisakis simplex is selected.
  • hypotonic solution refers to a solution with a solute concentration lower than the solute concentration inside the cell (cytoplasm).
  • homogenize refers to the process that allows the cells to be broken with the help of a rotary piston that fits the walls of a tube.
  • the device that allows homogenization is called homogenizer.
  • homogenizer There are homogenizers in which the separation between the piston and the wall is calibrated to produce homogenized with a determined particle size.
  • Sonicar as used in the present invention refers to the application of ultrasound to a cell suspension. The intense agitation produced destroys cell membranes. Depending on the frequency, intensity and energy applied, subcellular structures can also be destroyed and even protein complexes solubilized. It is usually applied cold to prevent overheating of the samples that could cause protein denaturation.
  • separating the supernatant refers to the fractionation and selection of the liquid fraction also called supernatant.
  • techniques are used that allow the separation of solid or suspended fractions that are insoluble from the liquid fractions containing soluble proteins.
  • the separation is carried out by centrifugation.
  • the homogenate is sonicated, it is fractionated by centrifugation and only the supernatant is selected.
  • the pH reduction is carried out by the addition of an acid in order to achieve a pH below 3. It must be kept in incubation at that pH.
  • the incubation is preferably carried out at room temperature between 16 0 C and 27 0 C.
  • Pl isoelectric point
  • the pH is neutralized reaching a value between 6 and 8.
  • the reduction of the pH is carried out by means of hydrochloric acid (HCI).
  • pH neutralization is preferably carried out by means of NaOH.
  • the analysis of the crude extract is carried out by means of immunochemical techniques. Immunochemical techniques allow the detection of antigens of the genus Anisakis. Part of the antigens that can be detected by the described method are allergens.
  • An antigen is a substance that triggers the formation of antibodies and can cause an immune response.
  • An allergen is a substance that can induce a hypersensitivity reaction in susceptible individuals in an individual. In these people the allergen is recognized as a "foreign" substance and foreign to the organism at the first contact. In subsequent exposures, the immune system reacts to the exposure in an exaggerated way, with the release of substances that alter the homeostasis of the organism, which gives rise to the symptoms of the allergy.
  • the immunochemistry is based on the use of a specific antibody (polyclonal or monoclonal), previously marked by a chemical bond with an enzyme (preferably by conjugation) that can transform a substrate into visible, without affecting the ability of the antibody to form a complex with the antigen, applied to a sample.
  • the antigen-antibody complex thus formed, through the use of any of the specific enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), allows to be located and identified within the samples obtained.
  • the analysis of the crude extract by means of immunochemical techniques can allow the detection (presence) or not (absence) of Anisakis antigens in any of its developmental phases recognized by specific antibodies.
  • a preferred embodiment is the method described where the concentration of the crude extract obtained is also carried out.
  • the concentration is preferably carried out by precipitation by an alcohol.
  • the alcohol is 100% ethanol (or absolute ethanol) and is added to the crude extract in a ratio of 1: 5 to 1: 9 (crude extract: ethanol).
  • the analysis is carried out by means of the use of polyclonal anti-Anisakis antigen antibodies and of polyclonal anti-Ani s 4 antibodies.
  • polyclonal antibodies against a crude Anisakis extract different proteins of the parasite are detected allowing the identification thereof even in cases where the veterinary inspection does not detect it.
  • the use of polyclonal antibodies directed against the Ani s 4 allergen allows to detect the presence of the allergen and due to its physicochemical properties (low molecular weight, thermostability, resistance to pepsin and high pressures, etc.), can be identified in samples Industrially processed or in different culinary processes.
  • Another preferred embodiment is the method where the analysis is carried out by either western blot or dot blot.
  • the western blot allows the separation of denatured proteins through the implementation of electrophoresis.
  • the proteins are transferred from the gel to the membrane (preferably nitrocellulose), where they are examined using antibodies specific for the protein.
  • the dot blot allows the detection of the antigenic proteins of interest by means of the application of the mixture of proteins or crude extract to a membrane as a dot ⁇ dot) and then specific antibodies are applied.
  • the dot blot saves time by not having to use chromatography or electrophoresis, however, it does not offer information about the detected antigens, so that only the presence or absence of said antigens can be confirmed.
  • the analysis can also be carried out, without limitation, either by means of the ELISA technique or by means of immunochromatographic strips.
  • the food sample is obtained either from fish or from any food containing any fish derivative.
  • the food sample can be fresh, processed, preserved or cooked fish, without being limited to these types of fish.
  • the food sample can also be obtained from any food product that contains any fish derivative, fish derivative being understood as any processed product that comprises any part of the fish including fish proteins or extracts.
  • fish refers to fish (vertebrate fish) or invertebrate aquatic species (invertebrate fish) such as, without limitation, cephalopods, which have been extracted from a natural environment or artificial in which these species pass some of the stages of their life cycle.
  • the food sample is obtained from a fish of the genus Merluccius or Engraulis.
  • the food sample is selected either fish of the species Mehuccius merluccius, or fish of the species Engraulis encrasicholus.
  • Hake (Merluccius merluccius) and anchovy (Engraulis encrasicholus) are the main related foods in cases of Anisakis allergy, according to the Spanish Society of Clinical Allergology and Immunology (SEAIC).
  • the food sample is obtained from a fish or from a food product containing any fish derivative, which has been frozen.
  • the preservation of fish or a food product that contains any fish derivative by freezing does not affect the proteins of the parasite, which retain their antigenicity and allergenicity during freezing periods and temperatures commonly used in the sector.
  • the food sample is obtained from a feed.
  • the feed may contain any fish derivative and / or may be intended for the feeding of aquaculture species or other species intended for human consumption.
  • antigens of the Anisakis simplex species are extracted and detected.
  • the method is used to evaluate the efficacy of food treatments to kill or eliminate parasites of the Anisakis genus or inactivate or suppress their allergens.
  • Food treatments include heat treatment (freezing or high temperature), high hydrostatic pressure, vacuum suction or electrocution, without being limited to these treatments.
  • the obligatory nature is established, for the establishments that serve food, to submit all the fish that are going to be served in raw or almost raw at a temperature equal to or less than -20 0 C for 24 hours once the Product has reached this temperature.
  • the efficacy of said treatments in the preparation and / or preparation of the fishery products can be evaluated, as well as determining the presence or absence of allergens such as Anis 4.
  • kits comprising hypotonic solution, solutions for changing the pH of the products obtained, polyclonal anti-Anisakis antigen antibodies and polyclonal anti-Ani s 4 antibodies.
  • the solutions to change the pH of the products obtained as described throughout this explanation of the invention comprise a solution that reduces the pH below 3 and a solution that neutralizes the acidic pH achieved after adding the previous solution.
  • the kit also includes instructions for carrying out the extraction and detection of antigens of the Anisakis genus.
  • the volume to be added to the products obtained and the order of addition are indicated, as well as the intermediate steps to be carried out in accordance with the main aspect of the present invention. That is, the instructions will describe the protocol that must be followed to carry out both the extraction of Anisakis antigens and their detection.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the kit described in the previous paragraphs for the extraction and detection of antigens of the Anisakis genus.
  • FIG. 1 Shows the process of extracting proteins from the parasite in fish samples.
  • M Sample.
  • H Homogenization.
  • S Sonication.
  • SOL . hypotonic solution, neutral pH.
  • B Lower the pH of the supernatant.
  • N Neutralize.
  • E Crude extract to analyze.
  • FIG. 2. It shows the detection of Anisakis antigens and the Ani s 4 allergen in different fish for human consumption.
  • M Merluccius merluccius (Hake).
  • E Engraulis encrasicolus (Boquerón).
  • S Sardine pilchardus (Sardine).
  • Mu Mullus spp. (Red mullet).
  • Anti-E Antibodies anti raw extract.
  • Anti-Ani s 4 Anti-Ani s antibodies 4.
  • FIG. 3 It shows the presence of antigens and the Anis s 4 allergen of Anisakis by western blotting in different parts of the same fish.
  • V Ventresca.
  • C Cola.
  • Anti-E Antibodies anti raw extract.
  • Anti-Ani s 4 Anti-Ani s antibodies 4.
  • FIG. 4 Shows the presence of Anisakis antigens and Ani s 4 allergen by dot blot in different fish.
  • M Merluccius merluccius (Hake).
  • E Engraulis encrasicolus (Boquerón).
  • M1 to M10 and B1 to B10 samples corresponding to different specimens of hake (M) and anchovy (E).
  • Anti-E Antibodies anti raw extract.
  • Anti-Ani s 4 Anti-Ani s antibodies 4.
  • FIG. 5 It shows the sensitivity of detection of Ani s 4 and recovery in addition tests.
  • A Recovery and detection of recombinant Ani s 4 injected into bacaladilla muscle (Micromesistius poutassou).
  • B Recovery and detection of Ani s 4 to determine the recovery of the allergen.
  • FIG. 6 Shows the effect of pH on the extraction of Ani s 4.
  • A extraction of Ani s 4 in Miicromessistius poutassou (bacaladilla) at pH ⁇ 3.
  • B extraction of Ani s 4 in Miicromessistius poutassou (bacaladilla) at pH 7.
  • C extraction of Ani s 4 in Engraulis encrasicolus (anchovy) at pH ⁇ 3.
  • FIG. 7 Shows the presence of Anisakis antigens and Ani s 4 allergen by western blot in hake frozen in freezing at -2O 0 C for 12 months. It is observed that after a period of 1 year of freezing of the fish, the parasite proteins retain their antigenicity (as observed when developing with the anti-crude antiserum) as well as their allergenicity (as observed when revealing with the anti antiserum -Ani s 4), demonstrating that parasitized fish is a source of allergens at temperatures and in freezing periods that are commonly used in the sector.
  • EXAMPLE 1 Extraction of Anisakis antigens. Obtaining the crude extract.
  • An alternative step is the concentration of the extract. For this, a 1 ml aliquot of the crude extract was taken and mixed with 9 ml of absolute ethanol at rest and room temperature for 15 minutes. It was then centrifuged for 15 minutes at 3000 g and 2O 0 C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 100 ⁇ l of electrophoresis sample buffer.
  • EXAMPLE 2 Detection of Anisakis or Ani s 4 proteins by western blot.
  • the detection of parasite or Ani s 4 allergen proteins by western blot was carried out by the following steps:
  • a 16% acrylamide gel was made. 2. Samples were prepared by diluting them in an adequate volume of loading buffer.
  • the sample loading buffer for SDS-PAGE gels was composed of: 12.5 ml 1 M Tris pH 6.8 (final concentration 125 mM), 40 ml SDS 10% (final concentration 4%), 20 ml Glycerol (final concentration 20% ), 2 ml Bromophenol Blue 0.2% (final concentration 0.042%), was brought to a final volume of 100 ml with distilled H 2 O. If reducing conditions were required, 5% fresh 2-Mercaptoethanol was added.
  • the electrophoresis was performed at 40 V / gel (1.2 V / cm 2 ). 5.
  • the gel and nitrocellulose (NC) were equilibrated in transfer buffer by subjecting it to orbital agitation for 15 minutes (Composition of transfer buffer: 5OmM NaCI, 2mM Tris-HCI, pH 7.4). 6.
  • the transfer was carried out by diffusion overnight, room temperature and stirring. 7.
  • the NC was incubated in the non-ionic Nonidet P-40 detergent (NP-40) 3% in phosphate buffered saline (0.15 M CINa, Phosphate buffer pH 7.0) (PBS) at room temperature under stirring for 30 minutes 8.
  • the NC was washed in PBS at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to a total of 3 times. 9. It was incubated with rabbit antiserum anti-crude extract of the parasite or with rabbit antiserum anti-Ani s 4 diluted 1/8000 in diluent solution for 2 hours at room temperature and stirring (Composition of the diluent solution: 1OmM Tris-saline , 5% Fetal Calf Serum (STF), 1% Tween 20, pH 7.4). 10. It was washed in a wash solution at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to a total of 3 times (Composition of the wash solution: 0.5M NaCI, 2mM Tris-CI pH 7.4, 0.1% Tween 20). 11. It was incubated with rabbit anti-IgG antiserum conjugated with alkaline phosphatase diluted 1/5000 in Diluent Solution for 1 hour at room temperature and stirring.
  • FIG. 2 An example of the results when different fish were analyzed is shown in FIG. 2.
  • FIG. 3 the results are shown when different samples taken from the same fish were analyzed.
  • EXAMPLE 3 Detection of Anisakis proteins by dot blot.
  • NC was allowed to dry for 30 minutes at 25 0 C.
  • the NC was washed in PBS at room temperature under stirring for 5 minutes and repeated up to 3 times. 4. It was incubated with rabbit antiserum anti-crude extract or with rabbit antiserum anti-Ani s 4 diluted 1/8000 in diluent solution for 1 hour at room temperature under stirring. Composition of the diluent solution: 1OmM Tris-saline, 5% STF, 1% Tween 20, pH 7.4.
  • EXAMPLE 4 Determination of extraction effectiveness and sensitivity in the detection of Anisakis antigens in Micromesistius poutassou

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico- químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1 ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.

Description

MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ANTÍGENOS DE ANISAKIS EN ALIMENTOS DESTINADOS AL CONSUMO HUMANO O ANIMAL
La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica, homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4, que por sus características físico- químicas resiste el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1 ppm con tasas de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El género Anisakis incluye parásitos nemátodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente se reconocen las siguientes especies de Anisakis: Anisakis pegreffii, Anisakis physeterís, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispiculata o Anisakis paggiae.
Las especies de Anisakis alcanzan Ia madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente, en pinnipedos. Estos mamíferos pueden infestarse por ingestión de a) hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan Ia tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por ejemplo, ballenas).
Al igual que los mamíferos marinos, los seres humanos también pueden infestarse por larvas L3 de Anisakis mediante Ia ingestión de peces y calamares crudos o poco cocinados portadores del parásito, Io cual produce una enfermedad clínica denominada anisakiosis o anisakiasis.
Cuando las larvas L3 de Anisakis infestan a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta gravedad. Dependiendo de Ia localización de las larvas y los síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal, extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En Ia forma gástrica (aguda) de anisakiosis, Ia larva penetra Ia pared gástrica y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de Ia ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3 vivas. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos en individuos sensibilizados (aproximadamente el 10% de los casos).
La presencia de larvas de Anisakis en pescado produce en el consumidor Ia infestación por las larvas vivas cuando se consume el pescado crudo o sometido a tratamientos. La larva L3 de Anisakis es capaz de segregar proteínas que pueden producir reacciones alérgicas graves en individuos sensibilizados. Estas reacciones pueden ser producidas por Ia ingestión de las larvas vivas o muertas. Varios de los alérgenos de Anisakis descritos hasta Ia fecha son estables a congelación, altas temperaturas o altas presiones y resistentes a variaciones de pH y a Ia acción de enzimas digestivas. En su estructura poseen entre otros, grupos sulfidrilo (SH) que posibilitan Ia formación enlaces covalentes con proteínas de Ia matriz en Ia que se encuentran, Io que puede complicar su extracción y modificar su capacidad antigénica.
Existen diferentes técnicas de complejidad y eficacia variables para detectar Ia presencia de Ia larva de Anisakis en el músculo y visceras de pescado. Se pueden enumerar las siguientes: Examen visual simple, transiluminación con luz ultravioleta, digestión, espectroscopia de imagen por absorción/reflexión, diferencia de conductividad (WO93/14400). Todas ellas tienen como objetivo Ia detección del parásito vivo o muerto pero no detectan Ia presencia de antígenos del parásito en el músculo del pescado.
Por otra parte han sido descritas técnicas de detección basadas en secuencias nucleotídicas y peptídicas pertenecientes a las larvas de Anisakis pero que no están basadas en Ia extracción, concentración o captura de los antígenos de Anisakis a partir de muestras alimentarias (WO2008006927 A1 ).
El problema técnico que plantea Ia detección de antígenos alergénicos de larvas de Anisakis es Ia dificultad en Ia extracción de antígenos propios del parásito que sean válidos en un paso posterior para inducir Ia producción de anticuerpos contra dichos antígenos y/o para que sean detectados por anticuerpos ya generados con anterioridad.
Se han descrito métodos de extracción de antígenos que utilizan Ia incubación de larvas vivas a rangos de pH similares al del estómago de humanos
(ES2209592 y Moneo et al. (2005) Parasitol. Res. 96(5):285-9). Para una detección precisa se requiere un proceso de extracción de antígenos que sea robusto, rápido, eficaz y sencillo que permita Ia detección de antígenos presentes en una muestra que contenga o haya contenido larvas de Anisakis vivas o muertas.
En el caso de parásitos de peces que suponen un riesgo para Ia salud, como las especies pertenecientes al género Anisakis, hay que añadir que las matrices varían de un pescado a otro, incluso tratándose de pescados frescos, y se pueden modificar al aplicar procesos de conservación y tratamiento tecnológico debido a Ia labilidad de las proteínas del pescado y a Ia rápida oxidación de sus lípidos. Por ello, es necesario disponer de un método de extracción sencillo, sin pasos complejos de captura y aislamiento de un alérgeno de interés en salud humana, que sea aplicable a diferentes pescados, ya sean frescos, congelados o cocinados y que permita Ia detección de antígenos alérgenos en concentraciones traza.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en muestras alimentarias para el consumo humano o animal. El método permite Ia extracción sencilla y eficaz sin pasos de captura y aislamiento del alérgeno. Además se identifica Ia presencia de alérgenos de interés en salud humana. Mediante Ia aplicación de este método se extraen alérgenos de Anisakis en concentraciones inferiores a 1 ppm y con tasas de recuperación superiores a un 65%. El método es aplicable a diferentes pescados, a muestras procedentes de diferentes partes del pescado o a otras muestras que contienen cualquier procesado de pescado. La detección de los antígenos de Anisakis se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas basadas en anticuerpos policlonales. Utilizando anticuerpos policlonales frente a un extracto crudo del Anisakis, se detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo Ia identificación de antígenos incluso en los casos en que Ia inspección veterinaria no detecta al parásito. Asimismo al utilizar anticuerpos policlonales dirigidos al alérgeno Ani s 4, se puede detectar Ia presencia del alérgeno que, debido a sus propiedades fisico-químicas de bajo peso molecular, termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones resiste los procesados, tratamientos o los diferentes procesos culinarios. El método descrito es específico ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.
La extracción y posterior detección de algunos alérgenos en alimentos puede ser complicada ya que suelen estar en concentraciones traza y en matrices complejas. Además cuando se trata de alimentos ya elaborados, conservados o cocinados, la extracción y detección de los alérgenos puede verse alterada por el procesamiento del alimento. La detección por métodos inmunoquímicos basados en anticuerpos (ELISA, Western blot, dot blot o tiras inmunocromatográficas) permite Ia identificación específica del alérgeno en el extracto. Sin embargo, Ia alteración del alérgeno por el procesamiento del alimento puede alterar su extracción y/o detección. En Ia presente invención, esto se soluciona utilizando un método de extracción sencillo y eficaz y una detección por medio de anticuerpos policlonales generados contra un extracto crudo del parásito y/o detectando alérgenos que sean estables y por Io tanto que puedan ser detectados incluso después de que el alimento sea congelado, calentado o sometido a otros tratamientos.
El método de Ia presente invención conduce a un resultado inesperado, ya que se simplifican los pasos de extracción de antígenos de Anisakis, consiguiéndose de al mismo tiempo un efecto sorprendente en Ia detección posterior de antígenos específicos de Anisakis, tal como se demuestra en los ejemplos, obteniéndose una tasa de recuperación del antígeno Ani s 4, inyectado en músculo de pescado, de un 65 % y una sensibilidad de detección de menos de 1 ppm.
En este sentido, el principal aspecto de Ia presente invención es un método de extracción y detección de antígenos del género Anisakis en un alimento destinado al consumo humano y/o animal que comprende: Obtener Ia muestra de alimento. Añadir una solución hipotónica a Ia muestra de alimento para fracturar las membranas celulares y homogeneizar para seguir fracturando las membranas intactas. Sonicar el homogenado para liberar con mayor eficacia los antígenos. Separar el sobrenadante. Reducir el pH del sobrenadante hasta un valor igual o menor de 3. Incubar el sobrenadante. Neutralizar el pH. Separar el sobrenadante del producto obtenido, en este caso el sobrenadante se denomina extracto crudo y, analizar el extracto crudo por medio de técnicas inmunoquímicas. Los ejemplares del género Anisakis son nematodos parásitos, cuyo ciclo vital afecta a los peces y mamíferos marinos. Son infecciosos para los seres humanos y causan anisakiasis, una reacción alégica severa. Las especies del género Anisakis a las que se refiere Ia presente invención se seleccionan de Ia lista que comprende, sin limitarse, Anisakis pegreffii, Anisakis physeterís, Anisakis schupakovi, Anisakis simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica, Anisakis brevispiculata o Anisakis paggiae. Preferiblemente se selecciona Ia especie Anisakis simplex.
El término "solución hipotónica" hace referencia a una solución con una concentración de soluto menor que Ia concentración de soluto del interior de Ia célula (citoplasma). De este modo, en una célula sumergida en una solución hipotónica, el agua difunde al interior de Ia célula sin límite y como consecuencia tiende a romper las membranas celulares, es decir, Ia célula muere y se libera el contenido del citoplasma.
El término "homogeneizar" tal como se usa en Ia presente invención hace referencia al proceso que permite romper las células con Ia ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta a las paredes de un tubo. El dispositivo que permite Ia homogeneización se denomina homogeneizador. Existen homogeneizadores en los que está calibrada Ia separación entre el émbolo y Ia pared para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado. El término "sonicar" tal como se usa en Ia presente invención se refiere a Ia aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de Ia frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar Ia desnaturalización de las proteínas.
Por tanto, todas las técnicas descritas anteriormente se emplean para destruir las células y liberar sus proteínas. Cada una de las técnicas produce un efecto en la destrucción de las membranas celulares y todos ellos constituyen una forma efectiva de extraer las citadas proteínas.
El término "separar el sobrenadante" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere al fraccionamiento y selección de Ia fracción líquida también denominada sobrenadante. Para ello se emplean técnicas que permiten Ia separación de las fracciones sólidas o en suspensión que son insolubles de las fracciones líquidas que contienen las proteínas solubles. Preferiblemente Ia separación se lleva a cabo mediante centrifugación.
Concretamente, una vez que el homogenado es sonicado, se procede a su fraccionamiento mediante centrifugación y se selecciona solamente el sobrenadante.
La reducción del pH se lleva a cabo mediante Ia adición de un ácido con el objeto de conseguir un pH por debajo de 3. Se debe mantener en incubación a ese pH. La incubación se realiza preferiblemente a temperatura ambiente de entre 160C y 270C. El objeto de reducir el pH por debajo de 3 es recuperar de forma específica aquellos antígenos que permanecen solubles a un pH menor de 3, ya que este pH se aleja del punto isoeléctrico (Pl) de las proteínas antigénicas (Pl de Ani s 4 = 5,6) que se pretenden detectar pero no es necesario que las larvas estén vivas. En el pH que coincide con el Pl de una proteína, ésta se encuentra en las condiciones de menor solubilidad y por tanto, para poder recuperar las proteínas en su forma soluble es necesario alejarse Io suficiente del Pl de los antígenos de interés. A continuación se neutraliza el pH alcanzando un valor de entre 6 y 8. Preferiblemente Ia reducción del pH se lleva a cabo por medio de ácido clorhídrico (HCI). Asimismo, Ia neutralización del pH se lleva a cabo preferiblemente por medio de NaOH. El análisis del extracto crudo se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas. Las técnicas inmunoquímicas permiten Ia detección de antígenos del género Anisakis. Parte de los antígenos que se pueden detectar mediante el método descrito son alérgenos.
Un antígeno es una sustancia que desencadena Ia formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmune.
Un alérgeno es una sustancia que puede inducir en un individuo una reacción de hipersensibilidad en personas susceptibles. En estas personas se reconoce el alérgeno como sustancia "extraña" y ajena al organismo en el primer contacto. En exposiciones posteriores, el sistema inmunológico reacciona a Ia exposición de forma exagerada, con liberación de sustancias que alteran Ia homeostasis del organismo, Io que da lugar a los síntomas propios de Ia alergia.
La inmunoquímica se basa en Ia utilización de un anticuerpo específico (policlonal o monoclonal), previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima (preferiblemente por conjugación) que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar Ia capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra. El complejo antígeno- anticuerpo así formado, mediante Ia utilización de alguna de las enzimas específicas (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc), permite ser localizado e identificado dentro de las muestras obtenidas. El análisis del extracto crudo mediante técnicas inmunoquímicas puede permitir Ia detección (presencia) o no (ausencia) de antígenos de Anisakis en cualquiera de sus fases de desarrollo reconocidos por anticuerpos específicos.
Una realización preferida es el método descrito donde además se lleva a cabo Ia concentración del extracto crudo obtenido. La concentración se lleva a cabo preferiblemente mediante precipitación por un alcohol. Preferiblemente el alcohol es etanol 100% (o etanol absoluto) y se añade al extracto crudo en una relación de 1:5 a 1:9 (extracto crudo:etanol). En otra realización preferida del método, el análisis se lleva a cabo mediante Ia utilización de anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y de anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.
Utilizando anticuerpos policlonales frente a un extracto crudo de Anisakis, se detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo Ia identificación del mismo incluso en los casos en que Ia inspección veterinaria no Io detecte. La utilización de anticuerpos policlonales dirigidos frente al alérgeno Ani s 4, permite detectar Ia presencia del alérgeno y debido a sus propiedades físico- químicas (bajo peso molecular, termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones, etc.), se puede identificar en muestras procesadas industrialmente o en diferentes procesos culinarios.
Otra realización preferida es el método donde el análisis se lleva a cabo por medio o bien de western blot o bien de dot blot. El western blot permite Ia separación de proteínas desnaturalizadas mediante Ia implementación de Ia electroforesis. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia Ia membrana (preferiblemente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando los anticuerpos específicos para Ia proteína. El dot blot permite Ia detección de las proteínas antigénicas de interés mediante Ia aplicación de Ia mezcla de proteínas o extracto crudo a una membrana como un punto {dot) y seguidamente se aplican anticuerpos específicos. El dot blot permite ahorrar tiempo al no tener que emplear cromatografía o electroforesis, sin embargo, no ofrece información acerca de los antígenos detectados, de modo que solamente se puede confirmar Ia presencia o ausencia de dichos antígenos. El análisis puede ser llevado a cabo además, sin limitarse, o bien por medio de Ia técnica ELISA o bien por medio de tiras inmunocromatográficas.
Según otra realización preferida más, Ia muestra de alimento se obtiene o bien de pescado o bien de cualquier alimento que contenga cualquier derivado de pescado. Teniendo en cuenta que los parásitos del género Anisakis tienen un ciclo vital que afecta a los peces y mamíferos marinos, Ia muestra de alimento puede ser pescado fresco, elaborado, conservado o cocinado, sin limitarse a estos tipos de pescado. Además, Ia muestra de alimento también puede obtenerse de cualquier producto alimentario que contenga cualquier derivado de pescado, entendiéndose como derivado de pescado cualquier producto procesado que comprenda cualquier parte del pescado incluyendo proteínas o extractos de pescado.
El término "pescado" tal como usa en Ia presente invención hace referencia a los peces (pescado vertebrado) o a las especies acuáticas invertebradas (pescado invertebrado) como por ejemplo, sin limitar, a los cefalópodos, que han sido extraídos de un medio natural o artificial en el que se estas especies pasan alguna de las etapas de su ciclo de vida.
En una realización más preferida, Ia muestra de alimento se obtiene de un pescado del género Merluccius o Engraulis. Preferiblemente Ia muestra de alimento se selecciona o bien pescado de Ia especie Mehuccius merluccius, o bien pescado de Ia especie Engraulis encrasicholus. La merluza (Merluccius merluccius) y el boquerón (Engraulis encrasicholus) son los principales alimentos relacionados en los casos de alergia por Anisakis, según Ia Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica (SEAIC).
En una realización aún más preferida, Ia muestra de alimento se obtiene de un pescado o de un producto alimentario que contenga cualquier derivado de pescado, que ha estado congelada. Tal y como demuestran los autores de Ia presente invención (FIG. 7), Ia conservación del pescado o de un producto alimentario que contenga cualquier derivado de pescado mediante congelación, no afecta a las proteínas del parásito, que conservan su antigenicidad y su alergenicidad durante periodos y temperaturas de congelación habitualmente utilizados en el sector. Según otra realización preferida Ia muestra de alimento se obtiene de un pienso. El pienso puede contener cualquier derivado de pescado y/o puede estar destinado a Ia alimentación de especies de acuicultura u otras especies destinadas a consumo humano.
En otra realización preferida de cualquiera de los métodos anteriores se extraen y detectan antígenos de Ia especie Anisakis simplex.
Según otra realización preferida, el método se emplea para evaluar Ia eficacia de los tratamientos de los alimentos para matar o eliminar parásitos del género Anisakis o inactivar o suprimir sus alérgenos. Los tratamientos de los alimentos comprenden el tratamiento térmico (congelación o alta temperatura), alta presión hidrostática, succión por vacío o electrocución, sin limitarse a estos tratamientos.
Según Ia legislación nacional, se fija Ia obligatoriedad, para los establecimientos que sirven comida, de someter todos los pescados que se vayan a servir en crudo o casi crudos a una temperatura igual o inferior a -200C durante 24 horas una vez que el producto ha alcanzado esta temperatura. Esto incluye productos de Ia pesca que han sido sometidos a un proceso de ahumado en frío en el que Ia temperatura central del producto no ha sobrepasado los 600C. Igualmente estarán obligados a garantizar Ia congelación en las mismas condiciones si se trata de productos de Ia pesca en escabeche o salados, cuando este proceso no baste para destruir las larvas. Mediante el método de Ia presente invención se puede evaluar Ia eficacia de dichos tratamientos en Ia elaboración y/o preparación de los productos de Ia pesca así como determinar Ia presencia o ausencia de alérgenos tales como Ani s 4.
Otro aspecto de Ia presente invención es un kit que comprende solución hipotónica, soluciones para cambiar el pH de los productos obtenidos, anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y anticuerpos policlonales anti-Ani s 4. Las soluciones para cambiar el pH de los productos obtenidos tal como se describe a Io largo de esta explicación de Ia invención, comprenden una solución que reduzca el pH por debajo de 3 y una solución que neutralice el pH ácido conseguido tras adicionar Ia solución anterior.
Según una realización preferida, el kit comprende, además, instrucciones para llevar a cabo Ia extracción y detección de antígenos del género Anisakis. En las citadas instrucciones se indica el volumen que ha de añadirse a los productos obtenidos y el orden de adición, así como los pasos intermedios que han de llevarse a cabo de acuerdo con el principal aspecto de Ia presente invención. Es decir, en las instrucciones se describirá el protocolo que ha de seguirse para llevar a cabo tanto Ia extracción de antígenos de Anisakis como Ia detección de los mismos.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del kit descrito en los párrafos anteriores para Ia extracción y detección de antígenos del género Anisakis.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Muestra el proceso de extracción de proteínas del parásito en muestras de peces. M: Muestra. H: Homogeneización. S: Sonicación.
SOL.: solución hipotónica, pH neutro. B: Bajar el pH del sobrenadante. N: Neutralizar. E: Extracto crudo para analizar.
FIG. 2. Muestra Ia detección de antígenos de Anisakis y del alérgeno Ani s 4 en diferentes pescados de consumo humano.
M: Merluccius merluccius (Merluza). E: Engraulis encrasicolus (Boquerón). S: Sardina pilchardus (Sardina). Mu: Mullus spp. (Salmonete).
Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo. Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.
FIG. 3. Muestra Ia presencia de antígenos y del alérgeno de Ani s 4 de Anisakis por western blot en diferentes partes de un mismo pescado.
V: Ventresca. C: Cola.
Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo. Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.
FIG. 4. Muestra Ia presencia de antígenos de Anisakis y del alérgeno Ani s 4 por dot blot en diferentes pescados.
M: Merluccius merluccius (Merluza). E: Engraulis encrasicolus (Boquerón). M1 a M10 y B1 a B10: muestras correspondientes a distintos ejemplares de merluza (M) y boquerón (E).
Anti-E: Anticuerpos anti extracto crudo. Anti-Ani s 4: Anticuerpos anti-Ani s 4.
FIG. 5. Muestra Ia sensibilidad de detección de Ani s 4 y recuperación en ensayos de adición.
A: Recuperación y detección de Ani s 4 recombinante inyectado en músculo de bacaladillas (Micromesistius poutassou). B: Recuperación y detección de Ani s 4 para determinar Ia recuperación del alérgeno.
FIG. 6. Muestra el efecto del pH en Ia extracción de Ani s 4.
A: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius poutassou (bacaladilla) a pH <3. B: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius poutassou (bacaladilla) a pH 7. C: extracción de Ani s 4 en Engraulis encrasicolus (boquerón) a pH <3. D: extracción de Ani s 4 en Engraulis encrasicolus (boquerón) a pH =7.
FIG. 7. Muestra Ia presencia de antígenos de Anisakis y del alérgeno Ani s 4 por western blot en merluzas conservadas en congelación a -2O0C durante 12 meses. Se observa que tras un periodo de 1 año de conservación en congelación del pescado, las proteínas del parásito conservan su antigenicidad (como se observa al revelar con el antisuero anti-crudo) así como su alergenicidad (como se observa al revelar con el antisuero anti-Ani s 4), demostrando que el pescado parasitado es una fuente de alérgenos a temperaturas y en periodos de conservación en congelación que se utilizan habitualmente en el sector. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el método de extracción y detección de antígenos de Anisakis.
EJEMPLO 1. Extracción de antígenos de Anisakis. Obtención del extracto crudo.
Se mezclaron 10 g de músculo de bacaladilla con 30 ml_ de 30 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 6,8. Se homogeneizó hasta obtener una mezcla homogénea y sin grumos. La mezcla se sometió a sonicación durante 30 segundos a 18 watts y se incubó en agitación orbital vertical durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugó durante 30 minutos a 4000 g y 2O0C, el sedimento se descartó y 5 ml_ de sobrenadante se pasaron a un tubo limpio. Se añadió HCI 5N hasta obtener un pH de 2. Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente y el pH se neutralizó con NaOH 5N. Seguidamente se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se centrifugó durante 15 minutos a 3000 g y 2O0C. El sobrenadante fue el extracto en el que se encontraban los antígenos de Anisakis (extracto crudo). Este proceso puede verse resumido en Ia FIG. 1.
Un paso alternativo es Ia concentración del extracto. Para ello se tomó una alícuota de 1 mi del extracto crudo y se mezcló con 9 mi de etanol absoluto en reposo y temperatura ambiente, durante 15 minutos. A continuación se centrifugó durante 15 minutos a 3000 g y 2O0C. Se Descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 100 μl de tampón de muestra de electroforesis.
EJEMPLO 2. Detección de proteínas de Anisakis o de Ani s 4 por western blot. La detección de proteínas del parásito o del alérgeno Ani s 4 por western blot se llevó a cabo mediante los siguientes pasos:
1. Se hizo un gel de acrilamida al 16%. 2. Se prepararon las muestras diluyéndolas en un volumen adecuado de tampón de carga. El tampón de carga de muestras para geles de SDS- PAGE estaba compuesto por: 12.5 mi Tris 1 M pH 6.8 (concentración final 125 mM), 40 mi SDS 10% (concentración final 4%), 20 mi Glicerol (concentración final 20%), 2 mi Azul de Bromofenol 0.2% (concentración final 0.042%), se llevó hasta un volumen final de 100 mi con H2O destilada. En caso de requerirse condiciones reductoras, se añadió 5% de 2-Mercaptoetanol fresco.
3. Se cargaron las muestras en los pocilios del gel de acrilamida.
4. Se realizó Ia electroforesis a 40 V/gel (1.2 V/cm2). 5. Se equilibró el gel y Ia nitrocelulosa (NC) en tampón de transferencia sometiéndolo a agitación orbital durante 15 minutos (Composición del tampón de transferencia: 5OmM NaCI, 2mM Tris-HCI, pH 7.4). 6. Se llevó a cabo Ia transferencia por difusión durante toda Ia noche, temperatura ambiente y agitación. 7. Se Incubó Ia NC en el detergente no iónico Nonidet P-40 (NP-40) 3% en solución salina tamponada con fosfato (CINa 0,15 M, Tampón fosfato pH 7.0) (PBS) a temperatura ambiente en agitación durante 30 minutos. 8. Se lavó Ia NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces. 9. Se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo del parásito o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 2 horas a temperatura ambiente y agitación (Composición de Ia solución diluyente: 1OmM Tris-salino, 5% de Suero de Ternera Fetal (STF), 1 % Tween 20, pH 7.4). 10. Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces (Composición de Ia solución de lavado: 0.5M NaCI, 2mM Tris-CI pH 7.4, 0.1 % Tween 20). 11.Se incubó con Antisuero Anti-lgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en Solución Diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación.
12. Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 4 veces.
13. Se lavó en solución salina a temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de Ia solución salina: 0.15mM NaCI.
14.Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-lndolyl Phosphate-Nitro
Blue Tetrazolium) a temperatura ambiente durante 30 minutos. 15. Finalmente se paró Ia reacción con H2O o PBS y se analizó.
Un ejemplo de los resultados cuando se analizaron diferentes peces se muestra en Ia FIG. 2. En Ia FIG. 3 se muestra los resultados cuando se analizaron diferentes muestras extraídas del mismo pez.
EJEMPLO 3. Detección de proteínas de Anisakis por dot blot.
La detección de proteínas del parásito o del alérgeno Ani s 4 por dot blot se llevó a cabo mediante los siguientes pasos:
1. Se aplicaron 10 μl del extracto crudo en una membrana de NC
2. Se dejó secar Ia NC durante 30 minutos a 250C.
3. Se lavó Ia NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces. 4. se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Composición de Ia solución diluyente: 1OmM Tris-salino, 5% STF, 1 % Tween 20, pH 7.4.
5. Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces. Composición de Ia solución de lavado: 0.5M NaCI, 2mM Tris-CI pH 7.4, 0.1 % Tween 20. 6. Se incubó con Antisuero Anti-lgG conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación.
7. Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces.
8. Se lavó en solución salina temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de Ia solución salina: 0.15mM NaCI.
9. Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-lndolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium)a temperatura ambiente durate 10 minutos. 10. Finalmente se paró Ia reacción con H2O o PBS y se analizó.
Un ejemplo de los resultados se muestra en Ia FIG. 4.
EJEMPLO 4. Determinación de Ia efectividad de extracción y de Ia sensibilidad en Ia detección de antígenos de Anisakis en Micromesistius poutassou
Se prepararon diferentes muestras de 10 gr de bacaladilla. A cada una se Ie inyectó una cantidad determinada de Ani s 4 recombinante (4 μg, 2 μg, 1 μg y 0 μg), para obtener las siguientes concentraciones del alérgeno: 0,4 ppm, 0,2 ppm y 0,1 ppm. El recombinante se inyectó en diferentes zonas de cada muestra de músculo de pescado. El extracto se preparó y concentró como se ha detallado previamente. La detección de Ani s 4 recombinante se realizó como el ejemplo 2. Como control, se prepararon diferentes concentraciones (0,4 ppm, 0,2 ppm y 0,1 ppm) de Ani s 4 en PBS con BSA al 0,5% y se introdujo en los pocilios correspondientes del gel. La recuperación de Ani s 4 recombinante superó el 65% y Ia sensibilidad de detección fue < 1 ppm como se puede observar en Ia FIG. 5.
EJEMPLO 5. Efecto del pH en Ia extracción de antígenos. Para valorar el efecto del pH en Ia extracción de antígenos, se inyectó Ia misma concentración de Ani s 4 recombinante en muestras de bacaladillas y boquerones (4 μg de recombinante en 10 gr de pescado; volumen de solución inyectada = 250 μl repartidos en 4 puntos de inyección por muestra de pescado). Se siguió el proceso de extracción descrito en el ejemplo 1. Una vez que las muestras fueron homogeneizadas, sonicadas y centrifugadas, el sobrenadante obtenido se dividió en dos alícuotas de 15 mi. Una de ellas se mantuvo a pH neutro, mientras que Ia otra se acidificó a pH <3. Los siguientes pasos se realizaron como se ha descrito previamente. La detección se realizó por inmunoblot con antisuero específico anti-Ani s 4 como se describe en el ejemplo 2. En Ia FIG. 6 se observa una gran diferencia en el rendimiento de Ia extracción entre los dos pHs, siendo claramente superior Ia extracción a pH ácido.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de extracción y detección de antígenos del género Anisakis en un alimento destinado al consumo humano y/o animal que comprende: a. Obtener Ia muestra de alimento, b. añadir una solución hipotónica a Ia muestra del apartado (a) y homogeneizar, c. sonicar el homogenado del apartado (b), d. separar el sobrenadante del producto del apartado (c), e. reducir el pH del sobrenadante del apartado (d) hasta un valor igual o menor de 3, f. incubar el sobrenadante del apartado (e) y neutralizar el pH, g. separar el sobrenadante del producto del apartado (f) (extracto crudo) y h. analizar el extracto crudo del apartado (g) por medio de técnicas inmunoquímicas.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde además se lleva a cabo Ia concentración del extracto crudo obtenido en el apartado (f) antes del apartado de análisis (h).
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el análisis se lleva a cabo mediante Ia utilización de anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y de anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el análisis se lleva a cabo por medio o bien de western blot o bien de dot blot.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Ia muestra de alimento se obtiene o bien de cualquier parte procedente de pescado o bien de cualquier alimento que contenga cualquier derivado de pescado.
6. Método de según Ia reivindicación 5, donde Ia muestra de alimento se obtiene de un pescado del género Merluccius, Micromesistius o Engraulis.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, donde Ia muestra de alimento ha estado congelada.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Ia muestra de alimento se obtiene de un pienso.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los antígenos extraídos y detectados son de Anisakis simplex.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para evaluar Ia eficacia de los tratamientos de los alimentos contra parásitos del género Anisakis.
11. Kit que comprende solución hipotónica, solución para cambiar el pH de los productos obtenidos, anticuerpos policlonales anti-antígeno de Anisakis y anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.
12. Kit según Ia reivindicación 11 que además comprende instrucciones para llevar a cabo Ia extracción y detección de antígenos del género Anisakis.
13. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 para Ia extracción y detección de antígenos del género Anisakis.
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