ES2325277T3 - Uso de cyfra 21-1 y osteopontina, como marcadores para el cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para valorar el cáncer colorrectal, in vitro, que comprende las etapas de a) medir, en una muestra, de la concentración del marcador de fragmento de citoqueratina 21-1 (CYFRA 21-1), b) medir, en una muestra, de la concentración de osteopontina (OPN), c) medir, en la muestra, la concentración de otro u otros marcadores adicionales opcionales, de cáncer colorrectal, d) correlacionar la concentración determinada en la etapa (a) y (b) y, opcionalmente, la(s) concentración(es) determinada(s) en la etapa (c), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

Description

Uso de CYFRA 21-1 y osteopontina, como marcadores para el cáncer colorrectal.

La presente invención, se refiere a un procedimiento que ayuda en la valoración del cáncer colorrectal (= CRC). Esta revela el uso de un marcador de fragmento de citoqueratina 21-1 (CYFRA 21-1) y osteopontina (OPN), como marcadores del cáncer colorrectal. Adicionalmente, además, ésta se refiere, de una forma especial, a un procedimiento para valorar el cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida, derivada de un individuo, mediante la medición de CYFRA 21-1 y OPN, en la citada muestra. La medición de CYFRA 21-1 y OPN, puede utilizarse, por ejemplo, en la detección temprana el cáncer colorrectal, o en la vigilancia de pacientes que experimentan una terapia, por ejemplo, cirugía.

El cáncer, permanece como un desafío mayor de la salud pública, a pesar del progreso en la detección y la terapia. Entre los varios tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (= CRC), es uno de la cánceres más frecuentes en el mundo occidental.

El cáncer colorrectal, progresa, de la forma más frecuente, desde adenomas (pólipos) a carcinomas malignos. Las diferentes etapas de CRC, se clasifican, usualmente, según las etapas de Duke A a D.

La clasificación del cáncer en etapas, es la clasificación de la enfermedad, en términos de extensión, progresión, y gravedad. Esta agrupa a los pacientes de cáncer, de tal forma que se puedan hacer generalizaciones en cuanto a lo referente a la prognosis, y la elección de la terapia.

Hoy en día, el sistema TNM, es el sistema de clasificación más extensamente utilizado de la extensión anatómica del cáncer. Este representa un sistema de clasificación mediante etapas, uniforme, internacionalmente aceptado. Existen tres variedades básicas: T (la extensión del tumor primario), N (el estatus de los ganglios linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de metástasis distante). Los criterios TNM, están publicados por parte de la UICC (Internacional Union Agains Cancer - [Unión Internacional contra el cáncer] - ), edición 1997 (Sobin, L.H., y Fleming, I.D. TNM 80 (1997), 1803 - 4).

Lo que esencialmente importante, es que, la diagnosis temprana del CRC, se traduce en una prognosis mucho mejor. Los tumores malignos del cáncer colorrectal, aparecen a partir de tumores benignos, por ejemplo, a partir de adenomas. Así, por lo tanto, la mejor prognosis, la tienen aquéllos pacientes diagnosticados en la etapa de adenoma. Los pacientes diagnosticados en una etapa tan temprana como la correspondiente a la etapa T_{is,} N0, ó T1-3; N0, M0, si se tratan adecuadamente, tienen una esperanza de supervivencia del 90%, 5 años después de la diagnosis, si se compara a la tasa de supervivencia de únicamente un 10%, para pacientes diagnosticados cuando la metástasis distante se encuentra presente.

En el sentido de la presente invención, la diagnosis temprana del CRC, se refiere a la diagnosis en un estado pre-maligno (adenoma) o en una etapa tumoral en donde no existe metástasis en absoluto (ni próxima ni distal), es decir, adenoma, T_{is}, N0, M0 ó T1-4; N0; M0. T_{is}, significa carcinoma in situ.

Se prefiere adicionalmente el hecho de que, el CRC, se diagnostique cuando éste no haya todavía crecido completamente a través de la pared del intestino y, así de este modo, que no se haya perforado ni el peritoneo visceral ni tampoco se encuentren invadidos otros órganos o estructuras, es decir, que la diagnosis, se realice en la etapa T_{is}, N0, M0 ó T1-3; N0; M0(= T_{is}-3; N0; M0).

Cuanto antes pueda detectarse/diagnosticarse el cáncer, mejor es la tasa de supervivencia total. Esto es especialmente cierto, para el CRC. La prognosis, en etapas avanzadas del tumor, es pobre. Más de un tercio de los pacientes, morirán progresivamente dentro de los cinco años después de la diagnosis, correspondiendo, la tasa de supervivencia, a aproximadamente un 40%, para los cinco años. El tratamiento corriente, cura únicamente a una fracción de los pacientes, y tiene claramente el mejor efecto sobre aquéllos pacientes diagnosticados en una etapa temprana de la enfermedad.

Con respecto al CRC, como un problema de salud pública, es esencial el hecho de que se desarrollen rastreos efectivos y medidas preventivas para el cáncer colorrectal.

Los procedimientos de detección más temprana disponibles en el momento presente, para el cáncer colorrectal, involucran tests de ensayo para la sangre fecal ó procedimientos endoscópicos. No obstante, debe existir un tamaño significativo del tumor, antes de que se detecte sangre fecal. La sensibilidad de los tests de ensayo de sangre oculta, basados en guaiac, es de -26%, lo cual significa el hecho de que, un 74% de los pacientes con lesiones malignas, permanecerán indetectados (Ahlquist, D.A. Gastroenterol, Clin. North Am. 26 (1997) 41 - 55). La visualización de lesiones precancerosas y cancerosas, representan el mejor procedimiento para la detección temprana, pero, la colonoscopia, es invasiva, con unos significativos costes, riesgos y complicaciones (Silvis, S.E., et al., JAMA 235 (1976) 928-930; Greenen, J.E., et al., Am. J. Dis. 20 (1975) 231 - 235; Anderson, W.F., et al., J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126 - 1133).

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Con objeto de ser de utilidad clínica, un nuevo marcador de diagnósticos, como marcador individual, debería ser por lo menos tan bueno como el mejor marcador individual conocido en el arte especializado de la técnica. Ahora bien, un nuevo marcador, debería conducir a un progreso en la sensibilidad y/o especificidad del diagnóstico, tanto si se utiliza individualmente, como si se utiliza en combinación con uno o más marcadores distintitos, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad de diagnóstico de un test de ensayo, se valora, de la mejor forma, mediante sus características operativas de receptor, las cuales se describirán en mayor detalle, abajo, a continuación.

La utilidad clínica de marcadores bioquímicos en el cáncer colorrectal, se ha revisado, recientemente, por parte de European Group on Tumor Markers (EGTM - [Grupo Europeo de marcadores tumorales ] - ) (Duffy, M.J. et al., Eur. J. Cancer 39 (2003 718 - 727).

En el momento presente, se encuentran disponibles tests de ensayo primarios de diagnóstico en la sangre, basados en la detección del antígeno carcinoembrionario, (CEA), una glicoproteína asociada a los tumores, para ayudar en la diagnosis, en el sector del CRC. El CEA, se encuentra incrementado, en un 95% de las muestras de tejido obtenidas de pacientes con cánceres colorrectales, gástricos, o pancreáticos y en la mayoría de carcinomas de pecho, de pulmón y de la cabeza y el cuello (Goldenberg, D.M. et al., J. Natl. Cancer Inst. Bethesda) 57 (1976) 11 - 22). Se han reportado también niveles elevados del CEA en el suero, en pacientes con una enfermedad no maligna, y muchos pacientes con cáncer colorrectal nuevamente detectado, tienen niveles normales del CEA en el suero, especialmente, durante la etapa temprana de la enfermedad (Carriquiry, LA., y Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921 - 929; Herrera, M.A., et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5 - 9; Wanebo, H.J., et al., N. Eng., J. Med. 299 (1978) 448 - 451; Wanebo, H.J. et al., mencionado anteriormente, arriba). La utilidad del CEA, medido en el suero o en el plasma, en la detección de recidivas o repeticiones, se reporta como siendo controversial y debe no obstante aplicarse extensamente (Martell, R.E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145 - 149; Moertel, C.G., et al., JAMA 270 (1993) 943 - 947).

A la luz de los datos disponibles, la determinación del CEA en el suero, no posee ni la sensibilidad ni la especificidad para capacitar su uso, como un ensayo de rastreo para el cáncer colorrectal, en la población asintomática (Reynoso, G. et al., JAMA 220 (1972) 361 - 365; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 49 (2002) 1151 - 1159).

La sangre entera, el suero o el plasma, son las fuentes de muestras más ampliamente utilizadas, en la rutina clínica. La identificación de un marcador temprano del CRC que ayudaría en la detección fidedigna del cáncer, o que proporcionaría una información temprana del pronóstico, podría conducir a un ensayo de diagnóstico que ayudaría en gran manera en la diagnosis y el manejo del cáncer. Así, por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente, en cuanto al hecho de poder mejorar el enjuiciamiento o valoración in vitro del CRC. Es especialmente importante el mejorar la diagnosis temprana del CRC, debido al hecho de que, para los pacientes diagnosticados tempranamente, las posibilidades de supervivencia, son mucho mayores, si se comparan con las de aquéllos diagnosticados en una etapa progresada o avanzada de la enfermedad.

Era una tarea de la presente invención, el investigar el hecho de si, puede identificarse un marcador bioquímico, el cual pueda utilizarse para enjuiciar el CRC.

De una forma sorprendente, se ha encontrado el hecho de que, el uso del marcador CYFRA 21-1, puede superar, por lo menos parcialmente, los problemas conocidos en el estado actual del arte de la técnica especializada.

La presenta invención, se refiere, correspondientemente en concordancia, a un procedimiento para valorar el cáncer colorrectal, in vitro, el cual comprende, a) la medición, en una muestra, de las concentraciones CYFRA 21-1 y OPN, y b) el uso de las concentraciones determinadas en la etapa (a), en la valoración del cáncer colorrectal.

La presente invención, proporciona, también, un equipo, a modo de "kit", para realizar el procedimiento en concordancia con la presente invención, que comprende por lo menos los reactivos requeridos, para medir, de una forma específica, CYFRA 21-1 y OPN, respectivamente, y auxiliarmente, reactivos opcionales para realizar las mediciones.

En una forma de presentación preferida, adicional, la presente invención, se refiere a un procedimiento para valorar el cáncer colorrectal, in vitro, que comprende las etapas de, a) la medición, en una muestra, de las concentraciones de CYFRA 21-1 y OPN, y b) opcionalmente, medir, en la muestra, la concentración de otro u otros marcadores adicionales de cáncer colorrectal, y c), utilizar las concentraciones determinadas en la etapa (a) y opcionalmente la etapa (b), en la valoración del cáncer colorrectal.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, cada uno de los términos que se facilitan a continuación, tiene el significado asociado con éste, en esta sección.

Los artículos "uno" y "una", se utilizan aquí, en este documento, para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A título de ejemplo, "un marcador", significa un marcador o más de un marcador.

El término "marcador" o "marcador bioquímico", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a moléculas a ser utilizadas como diana, para analizar muestras de ensayo de pacientes. Los ejemplos de tales tipos de dianas moleculares, son proteínas o polipéptidos en sí mismos, así como también anticuerpos presentes en una muestra. Las proteínas y polipéptidos usados como marcadores, en la presente invención, se contemplan como incluyendo cualesquiera variantes de la citada proteína así como fragmentos de la citada proteína o de la citada variante, de una forma particular, fragmentos inmunológicamente detectables. Una persona experta en el arte especializado de la técnica, reconocería el hecho de que, las proteínas que se liberan por parte de la células, o que se encuentran presentes en la matriz extracelular que se convierte en dañada, por ejemplo, durante la inflamación, podría convertirse en degradada o segregada en dos fragmentos. Ciertos marcadores, se analizan en una forma inactiva, la cual puede activarse subsiguientemente, mediante proteólisis. Tal y como apreciará un persona experta en el arte especializado de la técnica, las proteínas o fragmentos de éstas, pueden encontrarse presentes como parte de un complejo. Tal tipo de complejo, puede también utilizarse como marcador, en el sentido de la presente invención. Variantes de un polipéptido marcador, se codifican mediante el mismo gen, pero difieren en su PI ó MW, ó ambos (por ejemplo, como resultado de un procesado de mRNA ó pre-procesado de mRNA, alternativos, como por ejemplo, corte y empalme alternativo o proteólisis limitada) y, adicionalmente, o de una forma alternativa, puede producirse a raíz de modificación diferencial de post-traducción (por ejemplo, glicosación, acilación, y/o fosforilación).

El término "valoración del cáncer colorrectal", se utiliza para indicar el hecho de que, el procedimiento en concordancia con la presente invención ayudará (sólo, o conjuntamente con otros marcadores o variables, como por ejemplo, el criterio expuesto por la UICC (véase anteriormente, arriba), ayuda al médico a establecer o confirmar la ausencia o presencia de CRC, o ayudará al médico en la prognosis, el control de la eficacia de la terapia (por ejemplo, después de cirugía, quimioterapia o radiografía ), y la detección de recurrencia (repetición) o recidiva (seguimiento de pacientes después de la cirugía).

El término "ejemplo", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a una muestra biológica obtenida para el propósito de evaluación in vitro. En los procedimientos de la presente invención, la muestra o la muestra de un paciente, puede comprender, de una forma preferible, cualquier fluido corporal. Los muestras de ensayo preferidas, incluyen a la sangre, suero, plasma orina, saliva, y fluido sinovial. Las muestras preferidas, son la sangre entera, suero, plasma o fluido sinovial, siendo el plasma o el suero, los mayormente preferidos.

Tal y como apreciará el experto en el arte especializado de la técnica, cualquier valoración de este tipo, se realiza in vitro. La muestra del paciente, a continuación, se desecha. La muestra del paciente, se utiliza solamente para el procedimiento in vitro de la invención y, el material de la muestra del paciente, no se transfiere de vuelta al cuerpo de paciente. De una forma típica, la muestra, es una muestra líquida, como por ejemplo, sangre entera, suero o
plasma.

En una forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere a un procedimiento para valorar el CRC in vitro, mediante marcadores bioquímicos que comprende la medición, en una muestra, de la concentraciones de CYFRA 21-1 y OPN, y la utilización de la concentración determinada, en la valoración del CRC.

En un ensayo para "CYFRA 21-1", éste mide específicamente un fragmento soluble de citoqueratina 19, como presente en la circulación. La medición de CYFRA 21-1, se basa, de una forma típica, en dos anticuerpos monoclonales (Bodenmueller, H., et al., Int. J. Biol. Markers 9 (1944) 75-81). En el ensayo de CYFRA 21-1 de Roche Diagnostics, Alemania, se utilizan los dos anticuerpos monoclonales específicos (KS 19.1 y BM 19.21), y se mide un fragmento soluble de citoqueratina 19, que tiene un peso molecular de aproximadamente 30.000 Dalton.

Las citoqueratinas, son proteínas estructurales que forman las subunidades de filamentos intermediarios epiteliales. Hasta ahora, se han identificado veinte polipéptidos de citoqueratina diferentes. Debido a sus modelos patrón de distribución específica, éstos son eminentemente apropiados para su uso como marcadores de diferenciación, en la patología tumoral. Los polipéptidos de citoqueratina intacta, son escasamente solubles, pero pueden detectarse fragmentos solubles en el suero (Bodenmueller, H., et al., anteriormente citado, arriba).

CYFRA 21-1, es un marcador bien establecido para el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCL - [del inglés, Non-Small-Cell Lung Carcinoma] - ). La principal indicación para CYFRA 21-1, es el control del curso del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL)(Sturgeon, C. Clinical Chemistry 48 (2002) 1151 - 1159).

En la diagnosis primaria, unos altos niveles de CYFRA 21-1, indican un estado tumoral avanzado, y una prognosis reducida, en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (van der Gaast, A., et al., Br. J. Cancer 69 (1994) 525 - 528). Un valor normal o únicamente ligeramente elevado, no excluye la presencia de un tumor.

Se ha documentado una terapia satisfactoria, mediante una rápida caída del nivel de CYFRA 21-1 en suero, a los márgenes normales. Un valor constante del valor de CYFRA 21-1, ó un descenso ligeramente suave, o lento en valor de CYFRA 21-1, indica una eliminación incompleta de un tumor o la presencia de múltiples tumores, con las correspondientes consecuencias terapéuticas y del pronóstico. La progresión de la enfermedad, se muestra a menudo de una forma más temprana, mediante valores incrementantes de CYFRA 21-1, que mediante la sintomatología clínica y procedimientos de obtención y procesado de imágenes.

Se acepta el hecho de que, la diagnosis primaria de un carcinoma pulmonar, debería realizarse en base a una sintomatología clínica, procedimientos de obtención y procesado de imágenes o colonoscopia y descubrimientos intraoperativos. Un foco circular no claro en el pulmón, conjuntamente con valores de CYFRA 21-1 > 30 ng/ml, indican, con una alta probabilidad, la existencia de un carcinoma bronquial primario.

CYFRA 21-1, es también adecuado para el control, durante el curso, del cáncer mioinvasivo de la vesícula. Por parte de la CYFRA 21-1, se muestra una buena especificidad, con relación a enfermedades benignas del pulmón (neumonía, sarcoidosis, tuberculosis, bronquitis crónica, asma bronquial, enfisema).

Se encuentran raramente unos valores ligeramente elevados (de hasta 10 ng/ml), en enfermedades benignas del hígado, y en el fallo renal (insuficiencia renal). No existe correlación con el sexo, la edad, o si se es fumador. Los valores de CYFRA 21-1, se encuentran también inafectados, en el caso de embarazo.

Recientemente, se ha encontrado el hecho de que, CYFRA, se utiliza, también, en la detección de la recaída o relapso de la enfermedad, y en la valoración de la eficacia del tratamiento, en el sector del cáncer de colon (Nakata, B., et al., British J. of Cancer (2004) 1-6).

Se ha evaluado una combinación de marcadores de suero CEA, CYFRA 21-1, IAP y CA 19-9, en cáncer colorrectal, y ésta indicó una utilidad provechosa en el establecimiento de la etapa del cáncer y en la estimación de la prognosis (Miyashita, T., et al., Database Biosis (Febrero 2000), Nº de acceso PREV200000195119).

Se ha procedido a someter a teste de ensayo, el valor de pronóstico del CEA, en comparación a los marcadores CA242, CA 19-9, CA 72-4, CYFRA 21-1, y S100, en el cáncer colorrectal, en un análisis univariante (Hofmann, D. et al., Tumor Biol. 24 (Supl. 1)(2003) 49, Resumen P-14 CEA).

Matsumoto, H., et al., han analizado el significado clínico del nivel mesentérico en la sangre de la CYFRA 21-1, en pacientes con cáncer colorrectal, con respecto al riesgo de los pacientes, para la metástasis hematogénea postoperatoria (Matsumoto, H., et al., Database Biosis (Marzo 2002), nº de acceso PREV200200296087).

El ensayo con el equipo, a modo de "Kit" BALL ELSA CYFRA 21-1, para la detección de citoqueratina 19, en el suero de pacientes con cáncer que sufren de cáncer del esófago, gástrico, colorrectal y pancreático, ha sido evaluado, por parte de Sakahara, H., et al., Kukuigaku 30 (1993) 1475 - 1479).

CYFRA 21-1, ha sido medido en un analizador del tipo Elecsys® analyzer, utilizando el producto de Roche nº 11820966, en concordancia con las instrucciones de los fabricantes.

Tal y como se ha mencionado muy anteriormente, arriba, CYFRA 21-1, es un marcador establecido, en el sector del NSCLC. Cuando se desarrolla y establece la CYFRA 21-1, para el NSCLC, se han utilizado controles de enfermedad no maligna, derivados de pacientes con ciertas enfermedades no malignas del pulmón. Esto se ha considerado como importante para diferenciar enfermedades del pulmón no malignas, con respecto a las malignas (H. Bodenmüller, et al., citado anteriormente, arriba).

Los inventores de la presente invención, ha sido capaces, de una forma sorprendente, de detectar el marcador CYFRA 21-1, en un porcentaje significativo de ejemplos, derivados de pacientes con CRC. De una forma todavía más sorprendente, éstos han sido capaces de demostrar el hecho de que, la presencia de CYFRA 21-1, en tal muestra de líquido obtenida de un individuo, puede utilizarse en la valoración del cáncer colorrectal.

Se ha encontrado, también, el hecho de que, el valor de corte para CYFRA 21-1, en el sector del cáncer colorrectal, debería ser considerablemente inferior al establecido para el NSCLC. En esta investigación, se han utilizado ambos controles, los controles sanos, así como los controles obtenidos de pacientes con enfermedades del colon, no malignas, y confirmaron estos descubrimientos. El descubrimiento consistente en el hecho de que, se aplica un corte inferior, para CYFRA 21-1, en el sector del CRC, es más verosímil, y también por lo menos parte de la explicación, para el sorprendente descubrimiento de que CYFRA 21-1, sola, pero también en combinación con otros marcadores, debería considerarse como un marcador de gran potencial en sector del CRC. Tal y como se muestra en la sección de los ejemplos, CYFRA 21-1, sola, es de una utilidad significativa en el CRC, debido al hecho de que, a una especificidad de aproximadamente el 90%, la sensibilidad es de aproximadamente el 60%.

El escenario ideal para la diagnosis, sería una situación en donde, un acontecimiento o proceso, provocara la enfermedad respectiva, tal como, por ejemplo, en enfermedades infecciosas. En todos los otros casos, la diagnosis correcta, puede ser muy difícil, especialmente, cuando la etología de la enfermedad, no se entiende de una forma completa, tal y como es el caso del CRC. Tal y como apreciará la persona experta en el arte especializado de la técnica, ningún marcador bioquímico, por ejemplo, en el sector del CRC, es un diagnóstico con un 100% de especificidad, y al mismo tiempo, con un 100% de sensibilidad, para una enfermedad dada. Más bien, los marcadores bioquímicos, se utilizan para valorar, con una cierta probabilidad o valor predictivo, la presencia o ausencia de una enfermedad. Así, por lo tanto, en la diagnosis clínica de rutina, se consideran generalmente varios síntomas clínicos y marcadores biológicos, conjuntamente, en la diagnosis, tratamiento, y control de la enfermedad subyacente.

Los marcadores bioquímicos, pueden determinarse, o bien individualmente, o bien, en una forma preferida de presentación de la invención, éstos pueden medirse simultáneamente utilizando una tecnología de un conjunto u orden de disposición basado en astillas o en perlas. Las concentraciones de los biomarcadores, se interpretan entonces de una forma independiente, utilizando un corte individual de cada marcador, o éstos se combinan para la
interpretación.

En una forma de presentación adicionalmente preferida de la invención, la valoración de cáncer colorrectal, en concordancia con la presente invención, se realiza en un procedimiento que comprende las etapas de a) medir, en una muestra, la concentración de CYFRA 21-1, b) opcionalmente, uno o más marcadores distintos adicionales de cáncer colorrectal, y c) utilizar las concentraciones determinadas en la etapa a) y opcionalmente, en la etapa (b), en la medición del cáncer colorrectal.

La presente invención, se dirige, también, a un procedimiento para valorar la CRC in vitro, mediante marcadores bioquímicos, que comprende la medición, en una muestra, de la concentración de CIFRA 21-1 y OPN, y opcionalmente, de uno o más marcadores de CRC, y utilizar las concentraciones determinadas a la valoración del CRC.

En concordancia con los datos que se muestran en la sección de los ejemplos, el marcador CUFRA 21-1, en ambos, en el análisis univariante, así como en el análisis multivariante utilizados, tiene (a una especificidad de aproximadamente un 90%), una sensibilidad remarcable, para el CRC, de casi un 60% y en este respecto, se encontró como superior, al compararse con otros marcadores investigados. En la valoración de CRC, el marcador CIFRA 21-1, será ventajoso, en uno o más de los siguientes aspectos: barrido de exploración; ayuda de diagnóstico; control de la quimioterapia, y seguimiento.

Barrido de exploración

La CRC, es la segunda malignidad más común de ambos, hombres y mujeres, en los países desarrollados. Debido a su alta frecuencia, su larga fase asintomática y la presencia de lesiones premalignas, el CRC, reúne muchos de los criterios para un barrido de exploración. Claramente, un marcador tumoral en suero que tiene una sensibilidad y especificidad aceptables, sería más apropiado para el barrido de exploración, que ambos, el ensayo de FOB o la endoscopia.

Tal y como demuestran los datos proporcionados en la sección de los ejemplos, la CIFRA 21-1, sola, no es suficiente como para permitir un barrido general de exploración, por ejemplo, de la población en riesgo para CRC. De una forma más verosímil, ningún marcador bioquímico individual en la circulación, cumplirá jamás los criterios de sensibilidad y especificidad requeridos para los propósitos de un barrido de exploración. Más bien, debe esperarse el hecho de que, deberá usarse un panel de marcadores en el barrido de exploración del CRC. Los datos establecidos en la presente invención, indican el hecho de que, el marcador CIFRA 21-1, formará una parte integral de un panel de marcadores apropiado para los propósitos de un barrido de exploración. CIFRA 21-1, puede utilizarse, por lo tanto, como un marcador de un panel de marcadores de CRC, para propósitos de barrido de exploración para el CRC. Los presentes datos, indican, adicionalmente, el hecho de que, ciertas combinaciones de marcadores, serán ventajosas, en el barrido de exploración para el CRC. Así, por lo tanto, puede utilizarse un panel de marcadores que comprenda CYFRA 21-1 y NSE, ó un panel de marcadores que comprenda ASC y ASC, o un panel de marcadores que comprenda CYFRA-21-1 y NSE, ASC, para los propósitos de barrido de exploración del CRC.

Ayuda de diagnóstico

Los valores preparativos de CRC, son de un valor de diagnóstico limitado. No obstante, el European Committee on Tumor Markers [(ECTM) - Comité Europeo para los marcadores de tumours - ], recomienda que, debería medirse el CFA, antes de la cirugía, con objeto de establecer un valor de línea de base y para valorar la prognosis. Puesto que, la CYFRA 21-1, como un marcador individual en concordancia con los datos de la presente especificación, puede ser por lo menos tan bueno como un marcador individual como el CEA, o incluso superior, debe esperarse el hecho de que, CYFRA 21-1, pueda utilizarse como una ayuda de diagnóstico, especialmente, para establecer un valor de línea de base, antes de la cirugía.

CYFRA 21-1, puede por lo tanto también utilizarse, para establecer un valor de línea de base, antes de la cirugía, para el CRC.

Prognosis

Los patrones standard de oro, para determinar la prognosis, en pacientes con CRC, es la extensión de la enfermedades, según se define mediante los sistemas de Duke, TNM, u otros sistemas de clasificación por etapas. Si un marcador, tal como el CEA, debe utilizarse para predecir resultados, éste debe: proporcionar una información del pronóstico más fuerte que la que se ofrece mediante los sistemas de clasificación por etapas, existentes, proporcionar una información independiente de los sistemas existentes, o proporcionar datos de prognosis dentro de subgrupos específicos, definidos mediante criterios existentes, como por ejemplo, en pacientes del la etapa B de Duke, ó nódulo-negativos.

Recientemente, una conferencia de consenso de la American Joint Commitee on Cancer [(AJCC) - Comité solidario americano del cáncer - ], sugirió el hecho de que, el CEA, debería añadirse al sistema de clasificación TNM, para el cáncer colorrectal. El nivel de CEA, debería designarse del siguiente modo: CX, CEA no puede valorarse; CO, CEA no elevado (<5\mug/l), ó CEA1, CEA elevado (>5\mug/l)(Compton, C., et al, Cancer 88 (2000) 1739 - 1757).

Puesto que la CYFRA 21-1, sola, contribuye de una forma significativa a la diferenciación de pacientes de CRC, de los controles sanos o de los controles sanos más enfermedades de colon no malignas, debe esperarse el hecho de que, ésta, ayudará en la valoración de la prognosis de los pacientes que sufren de CRC. El nivel de CYFRA 21-1,
preoperativa, se combinará, de una forma más probable, con uno o más marcadores distintos para el CRC y/o el sistema de clasificación por etapas TNM, según se recomienda para el CEA, por parte del AJCC. CYFRA 21-1, puede por lo tanto también utilizarse en la prognosis de pacientes con CRC.

Control de la quimioterapia

Un gran número de informes, han descrito el uso del CEA, en el control del tratamiento de pacientes con CRC avanzado (para una revisión, véase Refs. Duffy, M.J., Clin. Chem. 47 (2001) 625 - 630; Fletcher, R.H., Ann. Int. Med. 104 (1986) 66 - 73; Anonymous, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 2843 - 2877). La mayoría de éstos, eran retrospectivos, no aleatorios, y contenían reducidos números de pacientes. Estos estudios, sugerían: a) que los pacientes con un decrecimiento en los niveles de CEA, mientras recibían quimioterapia, tenían un mejor resultado que aquéllos cuyos niveles de CEA, no decrecían y b) para casi todos los pacientes, los incrementos en los niveles de CEA, se asociaron con una progresión de la enfermedad.

Debido a los datos mostrados en la sección de los ejemplos, debe esperarse el hecho de que, CYFRA 21-1, será por lo menos tan buena, como marcador para el control de la quimioterapia, que el CEA. CYFRA 21-1, puede por lo tanto utilizarse, también, en el control de pacientes de CRC, que están experimentando quimioterapia.

Seguimiento

Aproximadamente un 50% de los pacientes que experimentan una resección quirúrgica encaminada a la cura, posteriormente, desarrollan una recurrencia de la enfermedad metastásica (Berman, J.M., et al, Lancet 355 (2000) 395 - 399). La mayoría de estas recidivas, acontecen dentro de los primeros 2 - 3 años de la diagnosis, y se confinan usualmente en el hígado, los pulmones o en las áreas locorregionales. Puesto que, la enfermedad recurrente / metastásica, es invariablemente fatal, una investigación considerable, se ha centralizado en su identificación, en un estado temprano y así, de este modo, potencialmente tratable. Por consiguiente, muchos de estos pacientes, experimentan un programa de vigilancia post-operativa, el cual, de una forma frecuente, incluye el control regular con CEA.

Los controles en serie con CEA, han mostrado detectar enfermedad recurrente/metastásica, con una sensibilidad de aproximadamente un 80%, una especificidad de aproximadamente un 70% y proporciona un tiempo de indicación medio de 5 meses (para una revisión, véase Duffy, M. J. et al., mencionado anteriormente, arriba y Fletcher, R.H., mencionado anteriormente, arriba). Adicionalmente, además, el CEA, era el indicador más frecuente de recurrencia en pacientes asintomáticos (Pietra, N., et al., Dis. Colon Rectum 41 (1998) 1127 - 1133 y Gram., R. A., et al., Ann. Surg. 228 (1998) 59 - 63) y era más efectivo, en cuanto a costes, que la radiología, para la detección de enfermedades recurrentes potencialmente curables. En cuanto a lo concerniente a la metástasis de recurrencia/metástasis, el CEA, era mayormente sensible (aproximadamente un 100%), para la detección de metástasis en el hígado. Por otro lado, el CEA, era menos fiable para diagnosticar recurrencias colorregionales, siendo la sensibilidad de únicamente aproximadamente un 60% (Moertel, C.G., et al., Jama 270 (1993) 943-7).

Como compromiso entre la conveniencia del paciente, los costes y la eficiencia de la detección de la enfermedad, el Panel EGTM, como el Panel ASCO (Anonymous, J., Clin. Oncol. 14 (1996) 2843 - 2877), sugiere el hecho de que, el ensayo de la CEA, se lleve a cabo cada 2 - 3 meses, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 3 años, después de la diagnosis inicial. Después de un transcurso de tiempo de 3 años, el ensayo, podría realizarse de una forma menos frecuente, como por ejemplo, cada 6 meses. No existe no obstante ninguna evidencia, en cuanto al hecho de mantener esta frecuencia del ensayo.

Tal y como muestra la discusión anterior de arriba, con respecto al estado actual del arte de la técnica especializada, el seguimiento de los pacientes con CRC, después de la cirugía, es uno de los sectores más importantes, en cuanto al uso de un marcador bioquímico apropiado. Debido a la alta sensibilidad de la CYFRA 21-1, en pacientes investigados con CRC, se espera el hecho de que, la CYFRA 21-1, sola o en combinación con uno o más marcadores distintos, será de una gran ayuda en el seguimiento de pacientes con CRC, especialmente, en pacientes con CRC, después de la cirugía. Puede por lo tanto utilizarse un panel de marcadores que comprenda CYFRA 21-1, y uno o más marcadores distintos del CRC, en el seguimiento de pacientes con CRC.

La presente invención, da a conocer y, por lo tanto, en una forma preferida de presentación, se refiere, al uso de CYFRA 21-1 y OPN, en el sector de diagnóstico de CRC, o en la valoración del CRC, respectivamente.

En todavía otra forma de presentación, la presente invención, se refiere al uso de CYFRA 21-1,y OPN, como moléculas marcadoras, para el cáncer colorrectal, opcionalmente, en combinación con una o más moléculas marcadoras, para el cáncer colorrectal, en la valoración de cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo. En este sentido, la expresión "uno o más", se refiere de 1 a 20, de una forma preferible, de 1 a 10, de una forma más preferible, de 1 a 5 y, de una forma mayormente preferible, de 3 ó 4. CYFRA 21-1, OPN y el uno o más marcadores, forman un panel de marcadores de CRC.

Así, de este modo, una forma preferida de presentación de la presente invención, es el uso de CYFRA 21-1 y OPN como moléculas marcadoras para el cáncer colorrectal, opcionalmente, en combinación con una o más moléculas marcadoras para el cáncer colorrectal, en la valoración del cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo. Los otros marcadores seleccionados, preferidos para CRC, con los cuales puede combinarse la valoración de CYFRA 21-1, son los NSE, CYFRA 21-1, NMMT, CA 19-9, CA 72-4 y/ó CEA. Todavía de una forma preferida, el panel de marcadores utilizado en la valoración de CRC, comprende CYFRA 21-1, OPN y por lo menos una de las moléculas marcadoras seleccionadas de entre el grupo consistente en NSE, CYFRA 21-1 y NMMT.

Los marcadores que de una forma preferible se combinan con CYFRA 21-1 y OPN, o que forman parte del panel de marcadores de CRC que comprenden CYFRA 21-1 y OPN, respectivamente, se discuten, en mayor detalle, abajo, a continuación.

OPN

La OPN (osteopontina), es una glico-proteína, la cual se expresa y se secreta por parte de numerosos cánceres humanos. La OPN, se encentra en el plasma normal, la orina, la leche y la bilis (U.S. 6.141.219; U.S. 5.695.761); Denhard D.T. & Guo, X., FASEB J. (1993) 1475 - 1482; Oldberg, A., et al., PNAS 83 (1986) 8819 - 8823; Oldberg, A., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 19433 - 19436; Giachelli, C.M., et al., Trenes Cardiovasc. Med. 5 (1995) 88 - 95). La proteína OPN humana y el cDNA, se han aislado y secuenciado (Kiefer M.C., et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989) 3306.

La OPN, funciona en la adhesión celular, quimiotaxis, supresión de interleucina 10 dirigida a macrófagos (IL 10), angiogénesis dependiente del estrés, prevención de la apoptosis, crecimiento de células tumorales independiente del anclaje, mediante la regulación de interacciones de la matriz celular y señalización celular mediante enlace con integrina y receptores DC44. Mientras que existe una expresión constitutiva de la OPN, en diversos tipos de células, se ha detectado la expresión inducida, en linfocitos T, células eopidérmicas, células óseas, macrófagos y células tumorales, en procesos remodelantes tales como la inflamación, la isquemia-reperfusión, la resorción ósea, y la progresión tumoral (revisado por Wai, P.Y & Kuo P.C. J. Surg. Res. 121 (2004) 228 - 241).

Es conocido el hecho de que, la OPN, interactúa con un gran número de receptores de integrina. La expresión incrementada de OPN, se ha reportado en un gran número de cánceres humanos, y sus receptores cognados (integrinas av-b3, av-b5, y av-b1 y CD 44), han sido identificados. En estudios in vitro realizados por parte de Irby, R.B., et al., Clinical & Experimental Metastasis 21 (2004) 515 - 523), se indica que ambas, la expresión de la OPN endógena (vía transfección estable), así como también la OPN exógena (añadida a un medio de cultivo), mejoraban la motilidad y la capacidad invasiva de las células cancerosas del colon, in vitro. La OPN, parecía regular la motilidad a través de la interacción con CD44. La expresión de la OPN, reducía, también, la adhesión intercelular (homotípica), lo cual se considera como una característica de las células cancerosas metastásicas. La transfección estable de cuatro líneas celulares de cáncer de colon escasamente tumorígenas, con OPN, dieron también, como resultado, una tumorigenicidad mejorada, in vivo, concordante con el grado de expresión de la OPN.

La expresión de TIMP-1, ha sido sugerida como un marcador, en un panel de marcadores, para la detección y el control del cáncer colorrectal, en muestras de pacientes (EP 1 439 393 A2).

Se han identificado mRNAs, en el tejido de cáncer de colon, al comparare con el tejido sano, mediante la utilización de datos de expresión de una micro-serie de disposiciones. Entre otras mRNAs, la osteopontina, se ha encontrado como estando sobreexpresada, en cánceres de colon (US 2004/038225).

Mor. G., et al., PNAS 102 (2005) 7677 - 7682, reportan un test de ensayo en sangre (suero), para la diagnosis temprana del cáncer de ovarios hepiterial, basado en la cuantificación simultánea de la OPN y tres distintos analitos más.

NSE

La NSE (enolasa neuronal-específica), también conocida como enzima glicolítica enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa), EC 4.2.1.11, peso molecular aprox. 80 kD), acontece en una variedad de isoformas diméricas, comprendiendo tres subunidades inmunológicamente diferentes, denominadas \alpha,\beta, y \gamma. La subunidad \alpha de la enolasa, acontece en numerosos tipos de tejidos de mamíferos, mientras que, las subunidades \beta, se encuentran principalmente en el corazón y en la musculatura estriada. Las isoformas de enolasa \alpha\gamma, y \gamma\gamma, a las cuales se les hace referencia como enolasa neuronal- específica (NSE) ó \gamma-enolasa, son principalmente detectables en altas concentraciones, en neuronas y células neuro-endocrinas, así como en tumores que se originan a partir de éstas. (Lamerz R., NSE (Neuronen-spezifische Enolasa - Enolasa neuronal-específica), \gamma-Enolase. In: Thomas L (ed) Clinical Laboratory Diagnosis,
- Diagnosis Clínica de Laboratorio, TH-Books, Frankfurt, 1st English Edition (1ª edición Inglesa) 1998: 979 - 981, 5. deutsche Auflage (5ª edición alemana) 1998: 1000 - 1003).

La NSE, se describe como el marcador de primera elección en el control del carcinoma bronquial de células pequeñas, (Lamerz R., mencionado anteriormente, arriba), mientras que, la CYFRA-21, es superior a la NSE, para el carcinoma bronquial de células no pequeñas.(Ebert W., et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem 32 (1994) 189 - 199).

Las concentraciones elevadas de NSE, se encuentran, en un 60 - 81% de los casos del carcinoma bronquial de células pequeñas.

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Para la NSE, no existe una correlación al sitio de metástasis o la metástasis cerebral, pero existe una correlación al estado clínico, es decir, la extensión de la enfermedad.

Como respuesta a la quimioterapia, hay un incremento temporal en el nivel de NSE, 24 - 72 horas después del primer ciclo de terapia, como resultado de la citólisis de las células tumorales. Esto viene seguido, dentro del transcurso de una semana, o hacia el final del primer ciclo de terapia, por una rápida caída de los valores en suero (los cuales se encuentran elevados, previamente a la terapia). Como contraste de ello, los no respondientes a la terapia, exhiben unos elevados niveles, los cuales se encuentran constantemente elevados o fallan en encontrarse en el rango de referencia. Durante la remisión, un porcentaje del 80 - 96% de los pacientes, tienen unos valores normales. En el caso de recidiva, se encuentran valores incrementantes de NSE. El incremento, acontece, en algunos casos, con un período latente de
1 - 4 meses, éste es a menudo exponencial (con un tiempo de duplicación de 10 - 94 día) y se correlaciona con el período de supervivencia. La NSA, es de utilidad como un factor de pronóstico individual, y marcador de la actividad, durante el control de la terapia y el transcurso de la enfermedad, en el carcinoma bronquial de células pequeñas: sensibilidad de diagnóstico, 93%, valor predictivo positivo 92% (Lamerz, R., mencionado anteriormente, arriba).

En el neuroblastoma, se encuentran valores de NSE en suero por encima de 30 ng/ml, en un porcentaje del 62% de los niños afectados. Las medias, crecen en concordancia con la etapa de la enfermedad. Existe una correlación significativa, entre la magnitud o frecuencia de los valores patológicos de NSE, y la etapa de la enfermedad; existe una correlación inversa con la supervivencia exenta de enfermedad.

El 68 - 73% de los pacientes con seminoma, tienen una elevación clínica significativa de la NSE. (Lamers R., mencionado anteriormente, arriba). Existe una correlación utilizable con el curso clínico de la enfermedad.

La NSE, se ha medido en otros tumores: Las enfermedades no pulmonares malignas, muestran valores por encima de 25 ng/ml, en el 22% de los casos (carcinomas, en todos los estados). Los tumores del cerebro, tales como el glioma, miningioma, neurofibroma, y neurinoma, se encuentran únicamente ocasionalmente acompañados por elevados valores de NSA en suero. En tumores primarios del cerebro o metástasis cerebral y en el melanoma y feocromocitoma malignos, pueden acontecer valores elevados de NSE, en el CSF (fluido cerebroespinal). Se han reportado concentraciones incrementadas de NSE, para el 14% de carcinomas renales con órgano restringido y el 46% de carcinomas renales metastisizantes, con una correlación con respecto al grado como un factor independiente de prognosis.

En enfermedades malignas, se han encontrado concentraciones elevadas de NSE en suero (> 12 ng/ml), en pacientes con enfermedades pulmonares malignas, y enfermedades cerebrales. Se han encontrado valores elevados, principalmente en el licor, en meningitis cerebrovascular, encefalitis diseminada, degeneración espinocerebelar, isquemia cerebelar, infarto cerebral, hematoma intracerebral, hemorragia subaracnoidea, heridas en la cabeza, enfermedades inflamatorias del cerebro, epilepsia orgánica, esquizofrenia, y la enfermedad de Jakob-Creutzfeld. (Lamerz R., mencionado anteriormente, arriba).

La NSE, se midió en un analizador del tipo Elecsys®, utilizando el producto Roche número 12133113, en concordancia con las instrucciones de los fabricantes.

CA 19-9

Los valores medidos de CA 19-9 (antígeno carbohidrato 19-9), se definen mediante el uso del anticuerpo monoclonal 1116-NS-19-9. Se procede a expresar el 1116-NS-19-9-reactivo determinante, principalmente, en una proteína semejante a la mucina, la cual contiene un alto número de epítopes CA-19-9 (Magnani J.L., Arch Biochem Biophys 426 (2004) 122 - 131).

Un porcentaje del 3 - 7% de la población, tiene la configuración del grupo de sangre de Lewis a-negativo/b-negativo, y son incapaces de expresar la mucina con el determinante reactivo CA 19-9. Este hecho, debe tomarse en consideración, cuando se interpreten los descubrimientos.

Las mucinas que contienen la CA 19-9, se expresan en el epitelio fetal gástrico, intestinal y pancreático. Pueden encontrarse también pequeñas concentraciones en el tejido de los adultos, en el hígado, los pulmones, y el páncreas (Stieber, P. y Fateh-Mogahdam, A., Boeringer Mannheim, Cat nº 1536869 (inglés) 1320947 (alemán). ISBN 3-926725-07-9 alemán/inglés, Juergen Hartmann Verlag, Marloffstein-Rathsberg (1993); Herlyn. M., et al., J. Clin. Immunol 2 (1982) 135 - 140).

Los valores de ensayo del CA 19-9, pueden asistir en la diagnosis diferencial y control de pacientes con carcinoma pancreático (sensibilidad del 70 - 87%) (Ritts, R.E., Jr., et al., Int. J. Cancer 33 (1984) 339 - 345). No existe correlación entre la masa tumoral y los valores de ensayo del CA 19-9. No obstante, los pacientes con niveles de suero de CA 19-9 por encima de 10.000 U/ml, tienen casi siempre metástasis distal.

La determinación del CA 19-9, no puede utilizarse para la detección temprana de carcinoma pancreático (Steinberg, W. M., et al., Gastroenterology 90 (1986) 343 - 349).

En el carcinoma hepatobiliar, los valores del CA 19-9, proporcionan una sensibilidad del 50 - 75%. Se recomienda la determinación concomitante del CA 72-4 y del CEA, en el caso del carcinoma gástrico. En el carcinoma colorrectal, la determinación del CEA solo, es adecuada: sólo en raros casos CEA-negativos, puede ser de utilidad la determinación del CA 19-9.

Puesto que la mucina se excreta exclusivamente vía el hígado, incluso una ligera colestasis, puede conducir, en algunos casos, a unos niveles de CA 19-9 en suero claramente elevados. Se encuentran, también unos elevados valores del CA 19-9, con un gran número de enfermedades inflamatorias benignas del tracto gastrointestinal y el hígado, así como también en fibrosis cística.

El CA 19-9, se midió con un analizador del tipo Elecsys®, utilizando el producto número 11776193, en concordancia con las instrucciones de los fabricantes.

CEA

El CEA (antígeno carcinoembriónico), es una glicoproteína monomérica (peso molecular de aproximadamente 180.000 dalton), con un componente variable de hidratos de carbono de aproximadamente un 45 - 60% (Gold. P. and Freedmann, S.O., J. Exp Med 121 (1965) 439 - 462).

El CEA, como el AFP, pertenece al grupo de antígenos carcinofetales que se producen durante el período embriónico y fetal. La familia de genes CEA, consiste en aproximadamente 17 genes activos, en dos subgrupos. El primer grupo, contiene CEA y antígenos no específicos de reacción cruzada (NCA - del inglés, Non specific Cross-reacting Antigens - ); el segundo grupo, contiene las glicoproteínas específicas del embarazo (PSG - del inglés, Pregnacy-Specific Glycoproteins - ).

El CEA, se encuentra, principalmente, en el tracto gastrointestinal fetal y el suero fetal. Éste se origina, también, en ligeras cantidades, en el tejido intestinal, pancreático, y hepático de adultos sanos. La formación de CEA, se reprime, después del nacimiento y, correspondientemente en concordancia, los valores del CEA en suero, son difícilmente mesurables en pacientes adultos sanos.

Se encuentran frecuentemente altas concentraciones de CEA, en casos de adenocarcinoma colorrectal (Stieber, P. y Fathe-Moghadam, A., mencionado anteriormente, arriba). Unas ligeras a moderadas elevaciones del CEA (raramente > 10 ng(ml), acontecen, en un porcentaje del 20 - 50% de enfermedades benignas del intestino, del páncreas, del hígado y de los pulmones (por ejemplo, cirrosis hepática, hepatitis crónica, pancreatitis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfisema)(Stieber, P. y Fathe-Moghadam, A., mencionado anteriormente, arriba). Los fumadores, tienen también valores elevados del CEA.

La indicación principal para las determinaciones del CEA, es el control de seguimiento y de la terapia del cáncer colorrectal.

Las determinaciones del CEA, no se recomiendan, para el barrido de exploración del cáncer, en la población general. Las concentraciones de CEA, dentro del rango normal, no excluyen la posible presencia de una enfermedad maligna.

Los anticuerpos, en ensayos fabricados por parte de la firma Roche Diagnostics, reaccionan con el CEA y (como en casi la totalidad de procedimientos de detección del CEA), con el antígeno de meconio (NCA2). La reactividad cruzada con el NCA1, es del 0,7% (Hammarstrom, S., et al., Cancer Res. 49 (1989) 4852 - 4858; y Bormer, O.P., Tumor Biol. 12 (1991) 9 - 15).

El CEA, se midió con un analizador del tipo Elecsys®, utilizando el producto número 117731629, en concordancia con las instrucciones de los fabricantes.

ASC

La proteína semejante al moteado asociado a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento asociado a la caspasa (ASC), se conoce, también, como "diana de silenciamiento inducido mediante metilación 1 (TMS1) (Swiss-PROT: Q9ULZ3)". La ASC, tiene un peso molecular teórico de 21.627 Da, y a un punto isoeléctrico teórico de pH 6,29.

Los dominios de reclutamiento asociados a la caspasa (CARDs), mediatizan la interacción entre adaptadores de proteínas, tales como el APAF-1 (factor de activación 1 de la proteasa apoptótica) y la pro-forma de caspasas (por ejemplo, CASP 9) que participan en la apoptosis. ASC es un miembro de la familia de adaptadores de proteínas que contienen CARD.

Mediante inmunobarrido de exploración de una línea celular promielocítica, Masumoto et al., aislaron un cDNA que codificaba para la ASC. La proteína deducida de 195 aminoácidos, contiene un dominio N-terminal, semejante a la pirina (PYD) y un CARD C-terminal de 87 residuos. Un análisis de transferencia de Western, mostró la expresión de una proteína de 22 kDa, e indicaba el hecho de que, la ASC, puede tener actividad proapoptótica mediante el incremento de la susceptibilidad de las líneas celulares de leucemia a estímulos apoptóticos mediante fármacos anti-cáncer. Masumoto, J., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835 - 22838).

Los análisis de PCR de restricción sensible a la metilación, y de PCR específica de metilación (MSP), de Conway et al, indicaron el hecho de que la ASC, se correlaciona con la hipermetilación del exón 1, circundante de la isla de CpG y que, la sobre-expresión de la DNMT1 (DNA-citosin-5-metiltranferasa-1), fomenta la hipermetilación de la ASC, y el silenciamiento de la ASC. Las líneas celulares de cáncer de pecho, pero no el tejido de pecho normal, exhibían una metilación completa de la ASC, y no expresaban ningún mensaje de ASC. La expresión de la ASC, en las líneas celulares del cáncer de pecho, inhibía el crecimiento, y reducían el número de colonias supervivientes. Conway et al., concluyeron que, las funciones de la ASC, en la fomentación de la apoptosis caspasa-dependiente, y que la sobreexpresión de la ASC, inhibe el crecimiento de la células de cáncer de pecho (Conway, K. E., et al., Cancer Research 60 (2000) 6236 - 6242).

McConnell y Vertino, mostraron que, la expresión inducible de la ASC, inhibe la proliferación celular e induce la fragmentación del DNA que puede bloquearse mediante inhibidor de caspasa. La microscopia de inmunofluorescencia, demostró el hecho de que, la inducción de apotosis, provoca un traslado CARD-dependiente desde la expresión citoplásmica difusa, a agregados esféricos perinucleares (McConnell, B. B., y Vertino, P.M. Cancer Research 60 (2000) 6243 - 6247). Moriani et al., observaron la metilación del gen de la ASC, no únicamente en la células de cáncer de pecho, sino también en cáncer gástrico. Éstos sugirieron un rol interpretativo directo para la metilación aberrante del gen de la ASC, en la progresión del cáncer de pecho y gástrico, que involucra una regulación hacia abajo del gen de la ASC proapoptótica (Moriani, R., et al., Anticancer Research 22 (2002) 4163 - 4168).

Conway et al., examinaron los tejidos principales del pecho, para la metilación de TMS1 y compararon los resultados a la metilación en tejidos sanos (Conway K.E., et al., Cancer Research 60 (2000) 6236 - 6242). Levine et al., encontraron que, el silenciamiento de la ASC, no se correlacionaba con la metilación de sitios de GpG específicos, sino que, más bien, se encontraba asociado con la metilación densa la isla CgP de la ASC. Las líneas celulares del tumor de pecho que contienen exclusivamente copias metiladas de ASC, no expresan ASC, mientras que, en líneas de células parcialmente metiladas, los niveles de expresión de ASC, se encuentran directamente relacionadas al porcentaje de alelos de ASC metilada, presentes en la población de células (Levine, J. J. et al., Oncogene 22 (2003) 3475 - 3488).

Virmani et al., examinaron el estatus de metilación de ASC, en tejido de cáncer de pulmón y cáncer de pecho. Estos encontraron la metilación aberrante de ASC presente en un 46% de las líneas celulares de cáncer de pulmón, y en un 32% del tejido de cáncer de pecho. La metilación, era rara, en tejido de pecho no maligno (7%) (Virmani, A., et al., Int. J. Cancer 106 (2003) 198 - 204).

Shiohara et al., descubrieron que la regulación mediante aumento de la ASC, se encuentra íntimamente asociada con la inflamación y apoptosis en neutrofilos humanos (Shioara, M., et al., Blood 98 (2001), 229a).

Mesumoto et al., observaron de que se encuentran expresados altos niveles de ASC, en células y leucocitos epiteliales (Masumoto, J. et al., Journal Histochem. Citochem. 49 (2001) 1269 - 1275).

Para la medición de la ASC, se desarrolló un inmunoensayo de tipo sándwich, diseño en nuestra casa. Este ensayo, se realizó en una placa de microtitulación. Se utilizaron, para ello, placas de microtitulación revestidas con estreptavidina. En este ensayo del tipo sándwich, se utilizó un anticuerpo policlonal biotinilizado, a la ASC, como segundo compañero de enlace específico. El complejo sándwich formado, se visualiza, finalmente, mediante un conjugado de peroxidasa del rábano salvaje anti-digoxigenina, y un substrato de peroxidasa apropiado.

MASP

La proteína MAP (precursor de maspina; Swiss-PROT: P36952), es una proteína de 42 kDa, la cual homología con la superfamilia de serpinas de los inhibidores de proteasa. Estudios de inmunotinción, demostraron el hecho de que, la maspina, se encuentra en la matriz extracelular y en la membrana del plasma (Zou, Z., et al., Science 263 (1994)
526 - 529).

El gen humano MAPS (SERPINB5 de PI5), se aisló, originalmente, a partir del epitelio mamario normal, mediante hibridación substractiva, en base a su expresión al nivel de la mRNA (Zou et al., mencionado anteriormente, arriba). La maspina, se expresó en células epiteliales mamarias normales, pero no en muchas de las líneas celulares del carcinoma mamario. Zou et al., (mencionado anteriormente, arriba), mostraron que, su expresión, reduce la capacidad de células transformadas, para inducir la formación de tumores y metástasis, sugiriendo el hecho de que, el gen de la maspina, codifica a un supresor tumoral.

Bass, R., et al., (J. Biol. Chem. 227 (2002) 46845-46848), caracterizaron a la maspina eucariótica, y encontraron que ésta no tenía un efecto inhibitorio de proteasa contra cualesquiera de los sistemas proteolíticos sometidos a test de ensayo. No obstante, ésta inhibía la migración de ambas células, células tumorales y células vasculares del músculo liso.

Song, S.Y. et al., (Digestive Diseases and Sciences 47 (2002) 1831 - 1835), estudiaron la expresión de la maspina en los cánceres de colon, mediante la tinción inmunohistomática de secciones de tejido procedentes de adenomas, adenocarcinomas y adenocarcinomas metastáticos. La inmunorreactividad de la maspina, descubierta por parte de Song et al. (mencionado anteriormente, arriba), era citoplásmica, con alguna tinción nuclear. Más de un 90% de las secciones de tejido de adenoma, más de un 75% de las de adenocarcinoma y más de un 47% de las de carcinoma metastático, tenían tinción positiva para la maspina. Este estudio, tenía la limitación en cuanto al hecho de que no se utilizó ningún sistema de ensayo cuantitativo, tal como el análisis de transferencia Western. El nivel de expresión, en comparación con el tejido del colon normal adyacente, no se valoró.

FERR

La ferratina (FERR), es una proteína que contiene aproximadamente un 20% de hierro, y se encuentra en los intestinos, el hígado y el bazo. Ésta es una de las formas, en las cuales, se almacena el hierro en el cuerpo. Los almacenajes del hierro en el cuerpo, se han reportado como incrementando el riesgo de neoplasma colorrectal. En un estudio realizado por parte Scholefield, J.H. et al. (Dis. Colon Rectum 41 (1998), se procedió a estudiar la ferratina en suero, utilizando muestras de 148 pacientes (50 pacientes con cáncer colorrectal probado, 49 pacientes sin enfermedad en el colon, y pacientes con adenomas del colon). No existían diferencias significativas en los niveles de ferratina en suero, entre cualquiera de los tres grupos.

NNMT

La proteína nicotinamida-N-metiltransferasa (NNMT; Swiss-PROT: P40261), tiene un peso molecular aparente de 29,6 kDa y un punto isoeléctrico de 5,56.

La NNMT, cataliza la N-metilación de la nicotinamida y otras piridinas. Esta actividad, es importante para la biotransformación de muchos fármacos y compuestos xenobióticos. La proteína, se ha reportado como expresándose predominantemente en el hígado, y se encuentra localizada en el citoplasma. La NNMT, se clonó a partir de cDNA procedente de un hígado humano, y contenía un marco de lectura abierto de 792 nucleótidos, que codificaba a una proteína de 264 aminoácidos, con una masa molecular calculada de 29,6 kDa. (Aksoy, S., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835 - 14840. Se conoce muy poco, en la literatura, acerca del rol interpretativo potencial de la enzima, en el cáncer humano. En un documento, se reportó una actividad enzimática hepática de NNMT, como un marcador para la caquexia por cáncer, en ratones (Okamura, A., et al., Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649 - 656). En un informe reciente, se demostró la regulación hacia abajo del gen de NNMT, como respuesta a la radiación, en líneas celulares sensibles a la radiación (Kassem, H., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 454 - 460).

Recientemente, se ha encontrado el hecho (documento de patente internacional WO 2004/057 336) de que, la NNMT, será de interés, en la valoración del CRC. El inmunoensayo descrito en el documento de patente internacional WO 2004/057 336, se ha utilizado para medir las muestras (CRC, controles sanos y enfermedades no malignas del colon) del presente estudio.

Tal y como podrá apreciar el artesano experto en el arte especializado de la técnica, existen muchas formas de utilizar las mediciones de dos o más marcadores, con objeto de mejorar el diagnóstico en cuestión que se encuentre bajo investigación. En un procedimiento bastante simple, pero no obstante a menudo efectivo, se asume un resultado positivo, si una muestra es positiva, para por lo menos uno de los marcadores investigados. Este puede ser por ejemplo el caso, cuando se diagnostica una enfermedad infecciosa, como el SIDA.

Frecuentemente, no obstante, se evalúa la combinación de marcadores. De una forma preferible, los valores medidos para los marcadores de un panel de marcadores, por ejemplo, para CYFRA 21-1 y NSE, o para CYFRA 21-1 y OPN, se combinan matemáticamente y, el valor combinado, se correlaciona al diagnóstico subyacente en cuestión. Los valores de los marcadores, pueden combinarse mediante cualquier estado actual apropiado del procedimiento matemático correspondiente al arte especializado de la técnica. Los procedimientos matemáticos bien conocidos para correlacionar una combinación de marcadores a una enfermedad, emplean métodos como el análisis discriminatorio (DA), (es decir, DA lineal, cuadrático, regularizado), métodos de Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores k del vecino más cercano), PLS (Mínimos cuadrados parciales - PLS, del inglés Partial Least Squares), Métodos basados en árboles (es decir, Regresión logística), CART, Métodos forestales aleatorios, Métodos de estimulación/embolsado (Boosting/Bagging Methods)), Modelos lineales generalizados (a saber, Regresión Logística), Métodos basados en componentes principales (a saber, SIMCA), Modelos aditivos generalizados, Métodos basados en lógica difusa, Métodos basados en redes naturales y algoritmos genéricos. El artesano experto en el arte especializado de la técnica, no tendrá problema alguno en seleccionar un método apropiado para evaluar una combinación de marcadores de la invención. De una forma preferible, el método utilizado en la correlación de la combinación de marcadores de la invención, a por ejemplo la ausencia o la presencia de CRC, se selecciona de entre el DA (es decir, análisis discriminatorio lineal, cuadrático, regularizado), métodos de Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores k del vecino más cercano), PLS (Mínimos cuadrados parciales - PLS, del inglés Partial Least Squares), Métodos basados en árboles (es decir, Regresión logística, CART, Métodos forestales aleatorios, Métodos de estimulación/embolsado (Boosting/Bagging Methods)) o Modelos lineales generalizados (a saber, Regresión Logística). Los detalles correspondientes a estos métodos estadísticos, se encuentran en las siguientes referencias: Ruczinski, I., et al., J. of Computacional and Graphical Statistics, 12, - Diario de estadísticas computarizadas y gráficas, 12, - (2003) 475 - 511; Friedmann, J. H., J. of the American Statistical Assotiation 84, - Diario de la Asociación de estadísticas 84, (1989) 165 - 175; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedmann, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics, - Los elementos del aprendizaje estadístico, Series Springer de estadística -, 2001; Breiman, L., Friedmann, J. H., Olshen, R.A., Stone, C.J. (1984) Classification and regresion trees, - Árboles de clasificación y regresión, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning 45 -, Bosques aleatorios, aprendizaje mecánico 45 (2001) 5 - 32; Pepe, M.S. The Stadistical Evaluation of Medicals Tests for Classification and Prediction, - La evaluación estadística de tests de ensayo médicos para la clasificación y la predicción -, Oxford Statistical Science Series 28, Serie de ciencia estadística de Oxford, 28 (2003); y Duda, R.O., Hart, P.E., Stork, D.G., Partern Clasification, - Clasificación de modelos patrón, Wiley Interscience, 2ª Edición (2001).

Es una forma preferida de presentación de la invención, se prefiere utilizar un corte multivariante optimizado de la combinación subyacente de marcadores biológicos y discriminar el estado A del estado B, por ejemplo, enfermo de sano. En este tipo de análisis, los marcadores, no son ya independientes, sino que forman un panel de marcadores. Podría establecerse el hecho de que, el combinar la mediciones de CYFRA 21-1 y NSE ó ASC, respectivamente, no mejora de una forma particular la precisión del diagnóstico para el CRC, al compararse con ya sea los controles sanos ó, tal y como también se valora, al compararse con controles sanos más controles de enfermedad no maligna. De una forma alternativa, la combinación de CYFRA 21-1 con OPN ó con OPN y FERR, mejora la precisión del diagnóstico en un escenario del mismo tipo. Especialmente, éste último descubrimiento, es de gran importancia, debido al hecho de que, un paciente con una enfermedad no maligna, puede requerir un tratamiento bastante diferente que un paciente con CRC.

La precisión de un test de ensayo, se describe, de la mejor forma, mediante sus características operativas del receptor (ROC, del inglés, receiver-operating charac-teristics) (véase, especialmente, Zweig, M. H., y Campbell, G. Clin. Chem. 39 (1993) 561 - 577). El gráfico ROC, es un trazado gráfico de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes de la variación continua del umbral de decisión sobre la totalidad del rango de datos observados.

Las prestaciones técnicas clínicas de un test de ensayo de laboratorio, dependen de su precisión o exactitud de diagnóstico, o de la capacidad de clasificar correctamente sujetos, en subgrupos clínicamente relevantes. La precisión o exactitud del diagnóstico, mide la capacidad del test de ensayo, para distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Tales tipos de condiciones son, por ejemplo, salud y enfermedad ó enfermedad benigna versus maligna.

En cada caso, el gráfico ROC, representa el solapado entre las dos distribuciones, procediendo a trazar un gráfico de la sensibilidad versus especificidad 1, para el rango completo de los umbrales de decisión. En el eje y, se encuentra la sensibilidad, o la fracción positiva verdadera [definida como (número de resultados de tests de ensayo positivos verdaderos)/(número de resultados de tests de ensayo positivos verdaderos + numero de resultados de test de ensayo negativos falsos)]. A ésta, se le ha hecho también referencia como positividad en presencia de una enfermedad o condición. Esto se calcula únicamente a partir de subgrupo afectado. En el eje x, se encuentra la fracción positiva falsa, ó especificidad 1 [definida como (número de resultados de tests de ensayo positivos falsos)/(número de resultados de tests de ensayo negativos verdaderos + numero de resultados de test de ensayo positivos falsos)]. Ésta, es un índice de especificidad, y se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado. Debido al hecho de que, las fracciones positivas falsas y verdaderas, se calculan enteramente por separado, mediante la utilización de los resultados de los tests de ensayo procedentes de los dos diferentes subgrupos, el trazado gráfico ROC, es independiente del predominio de la enfermedad en la muestra. Cada punto, en el gráfico ROC, representa un par sensibilidad/especificidad 1, correspondiente a un umbral de decisión individual. Un test de ensayo con una discriminación perfecta (sin solapado en las dos distribuciones de resultados), tiene un trazado gráfico ROC, que pasa a través de la esquina izquierda superior, en donde, la fracción positiva verdadera, es de 1,0 ó 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción positiva falsa, es 0 (especificidad perfecta). El trazado gráfico teórico para un test de ensayo sin discriminación (distribuciones de resultados idénticas para los dos grupos), es un línea en diagonal de 45º, desde la esquina inferior izquierda a la esquina superior derecha. La mayoría de los trazados gráficos, caen entre estos dos extremos. (Si el trazado gráfico ROC cae completamente por debajo de la diagonal de 45º, esto se remedia fácilmente invirtiendo el criterio para "positividad" desde "mayor de" a "menos de" ó viceversa). Cualitativamente, cuanto más cercano se encuentra el trazado gráfico, con respecto a la esquina superior izquierda, mayor es la precisión o exactitud del test de
ensayo.

Un objetivo conveniente para cuantificar la precisión o exactitud de diagnóstico de un test de ensayo de laboratorio, es el expresar sus prestaciones técnicas, mediante un número individual. Tal tipo de parámetro global, es por ejemplo el deonominado "error total" o, de una forma alternativa, el área bajo la curva = AUC''. La medición global más común, es el área bajo el trazado gráfico ROC. Por convención, esta área, es siempre \geq 0,5 (si no lo es, puede invertirse la norma de decisión para que sí lo sea). Los valores se encuentran dentro de un rango comprendido dentro de unos márgenes situados entre 1,0 (separación perfecta de los valores de test de ensayo de los dos grupos ) y 0,5 (sin diferencial distribucional aparente entre los dos grupos de valores de test de ensayo). El área, no depende únicamente de una porción particular del trazado gráfico, tal como el punto más cercano a la diagonal o la sensibilidad a un 90% de especificidad, sino del trazado gráfico en su totalidad. Esto es una expresión cuantitativa, descriptiva, de cuan cercano se encuentra el trazado gráfico ROC, con respecto a uno perfecto (área = 1,0).

La combinación de las mediciones de CYFRA 21-1 y OPN, con otros marcadores recientemente descubiertos, como la ASC y la NMMT, o con marcadores conocidos como el CEA y el NSE, o con otros marcadores de CRC, a ser todavía descubiertos, conduce y conducirá, respectivamente, a mejoras adicionales, en la valoración del CRC.

La combinación de los dos marcadores CYFRA 21-1, y NSE, mejora de una forma significativa la exactitud o precisión de diagnóstico para el CRC. La combinación de dos marcadores CYFRA 21-1 y ASC, mejora también, de una forma significativa, la precisión de diagnóstico para el CRC. Adicionalmente, además, la combinación de dos marcadores CYFRA 21-1 y OPN, mejora de una forma significativa, la precisión de diagnóstico para el CRC.

En una forma de presentación de la presente invención, ésta se refiere a un procedimiento para mejorar la previsión del diagnóstico para el CRC, versus controles sanos y/o pacientes que sufren de enfermedades no malignas del colon, mediante la medición, en una muestra, de la concentración de por lo menos CYFRA 21-1 y OPN, y correlacionando las concentraciones determinadas, a la presencia o ausencia de CRC, resultando, la mejora, en clasificar más pacientes, de una forma correcta, como sufriendo de CRC versus controles sanos y / o pacientes que sufren de enfermedad no maligna del colon, al compararse a una clasificación basada en cualquier marcador individual investigado solo.

En un procedimiento preferido en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1 y OPN, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

En todavía un procedimiento preferido adicional, en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1, OPN y ASC, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

En todavía un procedimiento preferido adicional, en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1, NSE y OPN, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

En todavía un procedimiento preferido adicional, en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1, NNMT y OPN, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

En todavía un procedimiento preferido adicional, en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1, MASP y OPN, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

En todavía un procedimiento preferido adicional, en concordancia con la presente invención, se determina por lo menos la concentración de los biomarcadores CYFRA 21-1, FERR y OPN, respectivamente y, la combinación de marcadores, se utiliza en la valoración del CRC.

Los ejemplos, referencias y figuras que se facilitan a continuación, se proporcionan para ayudar en el entendimiento de la presente invención, cuyo ámbito cierto, se presenta en las reivindicaciones adjuntas.

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Definición de las figuras

Figura 1

Análisis ROC de pacientes diagnosticados con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad, utilizando log CYFRA 21-1 solo.

Figura 2

Análisis ROC de pacientes diagnosticados con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad, utilizando la combinación de log CYFRA 21-1 y log NSE.

Figura 3

Análisis ROC de pacientes diagnosticados con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad, utilizando la combinación de log CYFRA 21-1 y log ASC.

Figura 4

Análisis ROC de pacientes diagnosticados con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad, utilizando la combinación de log CYFRA 21-1, log NSE y log ASC.

Figura 5

Análisis ROC de pacientes diagnosticados con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad, utilizando la combinación de log CYFRA 21-1, log ASC y log NNMT.

Ejemplo 1 1^{er} estudio de población

Se utilizaron muestras derivadas de 109 pacientes de CRC bien caracterizados, median la clasificación UCC proporcionada en la tabla 1.

TABLA 1 Cáncer colorrectal - etapas de la enfermedad

1

Las muestras de CRC de la tabla 1, se evaluaron en comparación a muestras de control obtenidas de individuos sanos, pacientes con enfermedades del colon no malignas, o en comparación con los datos obtenidos extraídos con las muestras sanas y no malignas de control. La tabla 2, proporciona una supervisión de los controles utilizados.

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TABLA 2 1^{er} estudio de población: controles sanos y no malignos

2

En los ejemplos que se facilitan a continuación, se presentan datos, utilizando los datos obtenidos a partir de todas las muestras listadas en la tabla 2 (es decir, datas que cubren a ambos, los controles sanos así como los controles de enfermedades no malignas).

Ejemplo 2

Se procedió a calcular la sensibilidad para cada marcador, a un nivel de especificidad común de un 90%, para cada marcador individual sometido a test de ensayo. La tabla 3, proporciona la sensibilidad para todas las etapas, en porcentaje, para cada uno de los marcadores de CRC más prometedores.

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TABLA 3 Sensibilidad de marcadores individuales en el 1^{er} estudio de población

3

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Tal y como resulta obvio a raíz de la tabla 3, el marcador CYFRA 21 - 1 (= CYFRA) se ha encontrando que tiene la mayor sensibilidad para el CRC, en comparación con la totalidad de los otros marcadores investigados. Los marcadores NMMT y ASC, parecen tener una sensibilidad comparable, pero ligeramente inferior, y vienen seguidos por el CEA.

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Ejemplo 3

Panel de marcadores

Los algoritmos de clasificación, se generaron con el análisis discriminante regularizado (RDA - [del inglés, Regularizad Discriminant Analysis] - ), el cual es una generalización de análisis discriminatorio común, es decir, Análisis Discriminatorio Cuadrático y Lineal (McLachlan, G. J., Discriminant Analysis and Statistical Pattern Recognition, Wiley Series in probability and mathematical stadistics, 1992, - Análisis discriminatorio y reconocimiento estadístico de modelos patrón -, Series Wiley en probabilidades y estadísticas matemáticas, 1992) -. En el RDA, se utilizan alternativas a las estimaciones de probabilidades máximas usuales (complemento o "plug-in"), para las matrices de covarianza. Estas alternativas, se caracterizan por dos parámetros (\lambda,\gamma), cuyos valores, se particularizan a situaciones individuales, procediendo a minimizar conjuntamente una estimación basada en una muestra del riesgo futuro de clasificación fallida (Friedman, J. H., Regularizad Discriminat Analysis, - Análisis discriminatorio regularizado -, J. of the American Statistical Assotiation 84 (1989) 165 - 175). Como un procedimiento alternativo, puede adoptarse el Support Vector Machines algoritms, - Algoritmos mecánicos de vectores de soporte (Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elementes of Statistical Lerning, Springer Series in Statistics, 2001 -, Los elementos del aprendizaje estadístico, Series Springer sobre estadística, 2001), con unos resultados de clasificación comparables. El análisis mediante RDA, se basa en 106 muestras de CRC, porque para 3 de las 109 muestras originales, se omitió un valor de marcador.

Los paneles de marcadores, se construyeron por etapas, partiendo del mejor marcador individual para el problema de de clasificación, y finalizando cuando el incremento en sensibilidad, a un nivel de especificidad del 90%, no cambia ya más, de una forma remarcable. Con objeto de ganar distribuciones centralizadas, cada marcador individual, se transformó con la función logarítmica (log) natural. Se utilizó una validación cruzada de un valor quintuplicado (es decir, por cinco veces).

La Tabla 4, presenta los datos de RDA, de pacientes diagnosticados con CRC versus controles que incluyen enfermedades del colon no malignas. El primer marcador seleccionado mediante RDA, era CYFRA 21-1, el segundo, el NSE.

TABLA 4 Resultados de clasificación en el conjunto de preparación de pacientes con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad

4

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El panel de marcadores CYFRA 21-1, NSE y ASC, en este análisis, produjo la mayor sensibilidad a una especificidad de aproximadamente un 90%.

Se procedió a evaluar varios otros marcadores, en combinación con CYFRA 21-1. Tal y como se muestra en la tabla 5, la ASC, en combinación con CYFRA 21-1, condujo, también, a una significativa mejora de la sensibilidad, mientras que, la combinación de CYFRA 21-1, con otros marcadores del CRC candidatos, parece ser menos favorable.

TABLA 5 Resultados de clasificación en el conjunto de preparación de pacientes con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad

5

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Las curvas ROC más interesantes, para los marcadores y combinaciones de marcadores, respectivamente, de las tablas 4 y 5, respectivamente, se muestran en las figuras 1 a 5.

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Ejemplo 4

Análisis de un segundo estudio de población

De una forma similar a la que se ha descrito en el ejemplo 3, se procedió a realizar la RDA, utilizando un panel de marcadores que comprendía CYFRA 21-1, OPN, FERR, NNMT, NSE y MASP.

6

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La segunda población de estudio, comprendía muestras de suero procedentes de 254 pacientes diagnosticados con CRC (véase la tabla 6) y 391 muestras de control. Éstos se dividieron en un conjunto o grupo de preparación y un conjunto o grupo de test de ensayo. Los análisis, se basaron en un conjunto o grupo de preparación de 128 muestras de CRC y 195 controles. De los controles, 16 de ellos, procedían de individuos sin ninguna enfermedad gastro-intestinal, 50 de ellos, procedían de individuos con hemorroides, 5 de ellos, procedían de pacientes con otras enfermedades del intestino; 63 controles, procedían de individuos con diverticulosis, 61, de donantes de sangre sanos. El conjunto de test de ensayo, consistía en 126 muestras de CRC y 196 controles. De los controles, 20 de ellos, procedían de individuos sin ninguna enfermedad gastrointestinal, 43 de ellos, procedían de individuos con hemorroides, 8 de ellos, procedían de pacientes con otras enfermedades del intestino; 65 controles, procedían de individuos con diverticulosis, 60 de ellos, procedían de donantes de sangre sanos.

Los datos presentados en las tablas 7 y 8, indican el hecho de que, con una especificidad subyacente de un 90%, los marcadores CYFRA 21-1, OPN y NNMT, proporcionan, cada uno de ellos, una sensibilidad correspondiente a un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 30% y un 40%. Una combinación de CYFRA 21-1 y OPN, incrementa substancialmente la sensibilidad. Con objeto de enjuiciar el hecho de si, la adición de un tercer marcador, incrementa las prestaciones técnicas o rendimiento de la detección, se procedió a incluir un tercer marcador. Entre varias combinaciones sometidas a test de ensayo, CYFRA 21-1, OPN y FERR, proporcionan una ventaja particular consistente en el hecho de que, la sensibilidad, se incrementa otra vez, substancialmente, con respecto a las combinaciones de CYFRA 21-1 y únicamente OPN.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Resultados de clasificación en el conjunto de preparación de pacientes con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad

8

TABLA 8 Resultados de clasificación en el conjunto de preparación de pacientes con CRC versus controles sanos y controles de enfermedad

9

TABLA 8 (continuación)

10

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Claims (8)

1. Un procedimiento para valorar el cáncer colorrectal, in vitro, que comprende las etapas de

a) medir, en una muestra, de la concentración del marcador de fragmento de citoqueratina 21-1 (CYFRA 21-1),

b) medir, en una muestra, de la concentración de osteopontina (OPN),

c) medir, en la muestra, la concentración de otro u otros marcadores adicionales opcionales, de cáncer colorrectal, y

d) correlacionar la concentración determinada en la etapa (a) y (b) y, opcionalmente, la(s) concentración(es) determinada(s) en la etapa (c), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

2. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde los citados uno o más marcadores adicionales, se selecciona(n), de entre el grupo consistente en enolasa neuronal-específica (NSE), proteína semejante al moteado asociado a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento asociado a la caspasa (ASC), nicotinamida-N-metiltransferasa (NNMT), antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), antígeno carbohidrato 72-4 (CA 72-4), antígeno carcionembriónico (CEA), precursor de maspina (MASP) y ferritina (FERR).

3. El procedimiento, según la reivindicación 2, en donde, el citado uno o más marcadores, es NSE.

4. El procedimiento, según la reivindicación 2, en donde, el citado uno o más marcadores, es ASC.

5. El procedimiento, según la reivindicación 2, en donde, el citado uno o más marcadores, es NNMT.

6. El procedimiento, según la reivindicación 2, en donde, el citado uno o más marcadores, es FERR.

7. Uso de panel de marcadores, que comprende CYFRA 21-1 y OPN, en la valoración de cáncer colorrectal.

8. Uso de un equipo, a modo de "kit", para realizar el procedimiento en concordancia con la reivindicación 1, que comprende los reactivos requeridos para medir específicamente CYFRA 21-1 y OPN.