CN101088011A

CN101088011A - Cyfra 21－1作为结肠直肠癌的标记的用途

Info

Publication number: CN101088011A
Application number: CNA200580044411XA
Authority: CN
Inventors: J·卡尔; H·安德里斯; V·格鲁纳特; W·罗林杰; W·佐尔格
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: CN101088011B; JP4606469B2; JP2008522172A; US20080020414A1; ES2325277T3; CA2585788A1; HK1115636A1; EP1831695B1; US7731938B2; WO2006066915A1; EP1831695A1; ATE430936T1; CN101088012A; DE602005014386D1; CA2585788C

Abstract

本发明涉及结肠直肠癌的评价。它公开了CYFRA 21－1测定在结肠直肠癌的评价中的用途。它还涉及通过测量样品中的CYFRA 21－1，使用源自个体的液体样品体外评价结肠直肠癌的方法。CYFRA 21－1的测量可以例如用于结肠直肠癌患者的早期检测或随访。

Description

CYFRA 21-1作为结肠直肠癌的标记的用途

技术领域

本发明涉及辅助评价结肠直肠癌(＝CRC)的方法。它公开了细胞角蛋白片段标记21-1(＝CYFRA 21-1)作为结肠直肠癌的标记的用途。而且，它尤其涉及通过测量源自个体的液体样品中的CYFRA 21-1，从所述样品评价结肠直肠癌的方法。CYFRA 21-1的测量可以例如用于结肠直肠癌的早期检测或经历治疗(例如外科手术)的患者的监护。

背景技术

尽管检测和治疗的进展，但癌症仍然是主要的公共健康挑战。在各种类型的癌症中，结肠直肠癌(＝CRC)是西方世界最常见的癌症之一。

结肠直肠癌最经常从腺瘤(息肉)发展成恶性癌。通常根据Dukes氏病期A至D来分类CRC的不同病期。

癌症的分期是疾病关于程度、进展和严重性的分类。其将癌症患者分组，从而可以对预后和选择治疗作出概括。

TNM系统是当前最广泛使用的癌症解剖学程度的分类。该系统代表国际接受的统一分期系统。它有三个基本变量：T(原发肿瘤的程度)，N(局部淋巴结状态)以及M(存在或不存在远处转移)。TNM标准由UICC(International Union Against Cancer)公布，1997版本(Sobin，L.H.和Fleming，I.D.，TNM 80(1997)1803-4)。

特别重要的是，CRC的早期诊断转变为好很多的预后。结肠直肠的大多数恶性肿瘤似乎起于良性肿瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期诊断的那些患者具有最好的预后。在已经存在远处转移时诊断的患者仅有10％的五年生存率，与此相比，如果处理得当，在早至T_is、N0、M0或T1-3；N0；M0病期诊断的患者，在诊断后具有90％以上的五年生存机会。

就本发明来说，CRC的早期诊断指在恶化前状态(腺瘤)或在完全没有转移(既非邻近的也非远处的)的肿瘤病期，即存在腺瘤、T_is、N0、M0或T1-4；N0；M0的病期，进行的诊断。T_is表示原位癌。

更优选地，在CRC尚未完全生长穿过肠壁时进行CRC诊断，且这样既没有脏层腹膜穿孔也没有其它器官或结构受侵，即，在病期T_is、N0、M0或T1-3；N0；M0(＝T_is-3；N0；M0)中作出诊断。

癌症能够越早得到检测/诊断，总生存率就越高。对于CRC，这一点尤其正确。晚期肿瘤的预后差。超过三分之一的患者将在诊断后五年内死于进行性疾病，对应于约40％的五年生存率。目前的治疗仅仅治愈一部分患者，而且对在疾病早期诊断的那些患者显然具有最佳作用。

关于作为公共健康问题的CRC，有必要开发对结肠直肠癌更有效的筛选和预防措施。

目前，关于结肠直肠癌可用的最早检测程序包括使用粪便潜血检验或内窥镜检查程序。然而，在检测粪便血液之前一般必须存在显著的肿瘤大小。以愈创木脂为基础的粪便潜血试验的灵敏性约为26％，意味着74％具有恶性病变的患者将仍然未检测到(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。癌变前和癌性病变的显像代表早期检测的最佳方法，但是结肠镜检查是昂贵、具有风险和并发症的侵入性方法(Silvis，S.E.等，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.等，J.Natl.CancerInstitute 94(2002)1126-1133)。

为了具有临床效用，作为单独标记的新的诊断标记应当至少与本领域已知的最佳单独标记一样好。或者，如果单独或分别与一个或多个其它标记联合使用，一个新的诊断标记应当引起诊断灵敏性和/或特异性的改进。通过检验的接收器工作特性(receiver-operating characterisitics)对其诊断灵敏性和/或特异性进行最佳评价，所述接收器工作特性将在下面详细介绍。

最近，欧洲肿瘤标记研究组(European Group on Tumor Markers)(EGTM)已经综述了生物化学标记在结肠直肠癌中的临床应用(Duffy，M.J.，等，Eur.J.Cancer 39(2003)718-727)。

目前，主要可利用基于检测肿瘤相关糖蛋白癌胚抗原(CEA)的诊断性血液检验来辅助CRC领域的诊断。在从结肠直肠癌、胃癌和胰癌和大部分乳腺癌、肺癌以及头部和颈部癌患者得到的组织样品中，95％样品中CEA升高(Goldenberg，D.M.等，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。在非恶性疾病患者中也有过CEA水平升高的报导，而且许多新检测的结肠直肠癌患者具有正常的血清CEA水平，特别是在疾病的早期阶段(Carriquiry，L.A.，和Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum42(1999)921-929；Herrera，M.A.等，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，等，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451；Wanebo，H.J.，等，同上)。据报导，从血清或血浆测量的CEA在检测复发中的效用是有争议的，且也未得到广泛应用(Martell，R.E.，等，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.等，JAMA 270(1993)943-947)。

根据现有数据，血清CEA测定既不具有灵敏性也不具有特异性来使其用于无症状群体中结肠直肠癌的筛选检验(Reynoso，G.等，JAMA220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。

全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期CRC肿瘤标记的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和控制的诊断性测定。因此，存在改进CRC的体外评价的急迫的临床需求。由于早期诊断的患者的存活机会大大高于在疾病进展后期得到诊断的患者，所以改进CRC的早期诊断尤其重要。

发明内容

本发明的任务是，研究是否可以鉴定用于评价CRC的生物化学标记。

令人惊讶的是，已发现标记CYFRA 21-1的使用至少可以部分地克服从本领域技术水平已知的问题。

本发明涉及体外评价结肠直肠癌的方法，其包含：a)测量样品中CYFRA 21-1的浓度，和b)使用步骤(a)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。

本发明还涉及通过生物化学标记体外评价CRC的方法，其包含：测量样品中CYFRA 21-1和CRC的一种或多种其它标记的浓度，并使用测定的浓度，评价CRC。

本发明还涉及包含至少CYFRA 21-1和NSE的标记组在评价CRC中的用途。

本发明还涉及包含至少CYFRA 21-1和ASC的标记组在评价CRC中的用途。

本发明还涉及包含至少CYFRA 21-1和OPN的标记组在评价CRC中的用途。

本发明还涉及包含至少CYFRA 21-1和FERR的标记组在评价CRC中的用途。

本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量CYFRA 21-1和NSE所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。

本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量CYFRA 21-1和ASC所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。

本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量CYFRA 21-1和OPN所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。

本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量CYFRA 21-1和FERR所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及体外评价结肠直肠癌的方法，其包含下述步骤：a)测量样品中CYFRA 21-1的浓度，b)任选地测量样品中结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，和c)使用在步骤(a)和任选的步骤(b)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。

如本文所使用的，下面术语的每一个在本部分中具有与它相关的含义。

冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种))冠词的语法上的对象。作为实例，“一种标记”指一种标记或超过一种标记。

术语“标记”或“生物化学标记”在本文中用于指要用作分析患者实验样品的靶的分子。这样的分子靶的实例是存在于样品中的蛋白或多肽本身以及抗体。在本发明中用作标记的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的任意变体以及所述蛋白或所述变体的片段，具体是免疫学上可检测的片段。本领域的技术人员可认识到，受到损害(例如，在炎症过程中)的由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白，可被降解或切割成这样的片段。以无活性形式合成某些标记，其可以随后通过蛋白水解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标记。标记多肽的变体由相同基因编码，但是它们的PI或分子量(MW)或二者不同(例如，作为可变mRNA或前mRNA加工的结果，例如可变剪接或限制性蛋白水解)，且另外或可选择地，可以源自有差别的翻译后修饰(例如，糖基化、酰化和/或磷酸化)。

术语“评价结肠直肠癌”用于指，本发明的方法将(单独地或与其它标记或变体一起，例如，UICC(见上面)所述的标准)，例如，辅助医师确定或证实是否存在CRC，或辅助医师进行预后、监控治疗功效(例如外科手术、化疗或放疗后)和检测复发(治疗后患者的随访)。

术语“样品”在本文中用于指为体外评价目的而得到的生物学样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包含任意的体液。优选的试验样品包括血、血清、血浆、尿、唾液和滑液。优选的样品是全血、血清、血浆或滑液，其中血浆或血清是最优选的。

如熟练的技术人员将明白的，体外进行任意的这种评价。此后抛弃患者样品。患者样品单独地用于本发明的体外诊断方法，且患者样品材料不再输回到患者体内。一般地，样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。

在优选的实施方案中，本发明涉及通过生物化学标记体外评价CRC的方法，其包含测量样品中的CYFRA 21-1浓度，和使用测定的浓度评价CRC。

“CYFRA 21-1”的测定特异性地测量存在于循环中的细胞角蛋白19的可溶片段。CYFRA 21-1的测量一般基于两种单克隆抗体(Bodenmueller，H.，等，Int.J.Biol.Markers 9(1994)75-81)。在来自德国Roche Diagnostics的CYFRA 21-1测定中，使用了两种特异性的单克隆抗体(KS 19.1和BM 19.21)，并测量了具有约30,000道尔顿分子量的细胞角蛋白19的可溶片段。

细胞角蛋白是形成上皮中间丝的亚基的结构蛋白。迄今已经鉴别出20种不同的细胞角蛋白多肽。由于它们的特异性分布模式，它们非常适用作肿瘤病理学的区分标记。完整的细胞角蛋白多肽溶解度低，但是在血清中可以检测到可溶片段(Bodenmueller，H.，等，同上)。

CYFRA 21-1是非小细胞肺癌(NSCLC)的非常确定的标记。CYFRA21-1的主要指示是监控非小细胞肺癌(NSCLC)的进程(Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。

在初步诊断中，高CYFRA 21-1血清水平指示着非小细胞肺癌患者的晚期肿瘤病期和较差预后(van der Gaast，A.，等，Br.J.Cancer 69(1994)525-528)。正常的或仅仅轻微升高的值不能排除肿瘤的存在。

CYFRA 21-1血清水平快速下降至正常范围，证明成功的治疗。恒定的CYFRA 21-1值或CYFRA 21-1值的轻微的或仅仅缓慢的降低，指示着肿瘤的不完全去除、或具有对应的治疗和预后结果的多种肿瘤的存在。通过升高的CYFRA 21-1值，经常可以比临床症状学和成像方法更早地显示疾病的进展。

已经接受，肺癌的初步诊断应当基于临床症状学、成像或内窥镜方法和手术中的发现。肺中不清楚的圆形病灶以及＞30ng/mL的CYFRA21-1值，以高可能性指示着原发性支气管癌的存在。

CYFRA 21-1也适用于肌侵入性(myoinvasive)膀胱癌的进程监控。相对于良性肺病(肺炎、结节病、结核病、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿)，CYFRA 21-1表现出良好的特异性。

轻微升高的值(最高达10ng/mL)罕见于明显的良性肝病和肾衰竭中。与性别、年龄或吸烟无关。CYFRA 21-1的值也不受妊娠的影响。

最近已经发现，CYFRA也可以在乳腺癌领域中用于检测疾病复发和评价治疗功效(Nakata，B.，等，British J.of Cancer(2004)1-6)。

根据生产商的说明书，使用Roche产品号11820966，已经在Elecsys^分析仪上测量了CYFRA 21-1。

如上面进一步提及的，CYFRA 21-1是NSCLC领域的确定的标记。当开发和确立NSCLC的CYFRA 21-1时，已经使用了源自某些非恶性肺病患者的非恶性疾病对照。已经认为，这对于区分良性和恶性肺病是重要的(H.Bodenmüller，等，同上)。

本发明的发明人已经令人惊奇地能够检测源自CRC患者的样品中的相当大百分比的标记CYFRA 21-1。甚至更令人惊奇地，他们已经能够证实，CYFRA 21-1在从个体得到的这种液体样品中的存在，可以用于评价结肠直肠癌。

还已经发现，结肠直肠癌领域中的CYFRA 21-1的截止值应当大大低于对于NSCLC确立的截止值。健康对照以及从非恶性结肠疾病患者得到的对照已经用于该研究，并证实了这些发现。更低的截止值应用于CRC领域中的CYFRA 21-1的发现，最可能也至少是下述令人惊奇的发现的解释的部分，即单独的CYFRA 21-1，但是也可以与其它标记相组合，应当被认为是CRC领域中具有巨大潜力的标记。如实施例部分所显示的，单独的CYFRA 21-1在CRC中具有重要的效用，因为在约90％的特异性，灵敏性是几乎60％。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在传染病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在CRC的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的疾病，例如在CRC领域中，没有生物化学标记的诊断是100％特异性且同时100％灵敏性的。相反地，使用生物化学标记来例如以某种可能性或预测值评价疾病的存在与否。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标记来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

可以单独地测定生物化学标记，或者，在本发明的优选的实施方案中，可以使用基于芯片或珠的阵列技术，同时测量它们。然后，使用每种标记的单独截止值，独立地解释生物标记的浓度，或者可以组合它们进行解释。

在另一个优选的实施方案中，在包含下述步骤的方法中，进行根据本发明的CRC评价：测量样品中a)CYFRA 21-1，b)任选地结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，和c)使用在步骤(a)中和任选地在步骤(b)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。

优选地，通过测量CYFRA 21-1浓度和一种或多种其它标记的浓度，并使用CYFRA 21-1浓度和一种或多种其它标记的浓度评价CRC，来进行评价CRC的方法。

本发明也涉及通过生物化学标记体外评价CRC的方法，其包含，测量样品中CYFRA 21-1的浓度和CRC的一种或多种其它标记的浓度，并使用测定的浓度评价CRC。

根据实施例部分显示的数据，标记CYFRA 21-1在进行的单变量分析以及多变量分析中，(在约90％的特异性时)对CRC具有几乎60％的显著灵敏性，且在这方面，发现它优于研究的其它标记。在CRC的评价中，标记CYFRA 21-1在一个或多个下述方面是有益的：筛选；诊断辅助；预后；治疗的监控，和随访。

筛选：

CRC是发达国家男性和女性的第二最常见的恶性肿瘤。因为它的高患病率、它的长期无症状阶段和存在恶化前病变，CRC满足许多筛选标准。显然，与FOB测试或内窥镜检查相比，具有可接受的灵敏性和特异性的血清肿瘤标记更适用于筛选。

实施例部分给出的数据证实，单独的CYFRA 21-1不足以允许进行普通筛选，例如，有危险患CRC的群体。最可能地，循环中的单个生物化学标记不能满足筛选目的所要求的灵敏性和特异性标准。相反，必须预见到在CRC筛选中必须使用标记组。在本发明中确立的数据表明，标记CYFRA 21-1将形成适用于筛选目的的标记组的主要部分。本发明因此涉及CYFRA 21-1作为用于CRC筛选目的的CRC标记组的一种标记的用途。本发明的数据还表明，标记的某些组合在CRC的筛选中是有利的。因此，本发明还涉及包含CYFRA 21-1和NSE的标记组、或包含CYFRA 21-1和ASC的标记组、或包含CYFRA 21-1和NSE和ASC的标记组在筛选CRC目的中的用途。

诊断辅助：

手术前的CEA值具有有限的诊断价值。尽管如此，欧洲肿瘤标记委员会(European Committee on Tumor Markers)(ECTM)建议，应当在外科手术前测量CFA，以确立基线值和评价预后。因为根据本发明的数据，CYFRA 21-1作为单一标记可能至少是与CEA一样好的单一标记或甚至更优越，所以必须预见到，CYFRA 21-1可以用作诊断辅助，尤其是通过在外科手术前确立基线值。

本发明因而也涉及CYFRA 21-1在CRC外科手术前确立基线值中的用途。

预后：

确定CRC患者的预后的黄金标准是，Dukes氏定义的疾病的扩展、TNM或其它分期系统，如果要将标记(例如CEA)用于预测结果，它必须：提供比现有的分期系统所提供的更强的预后信息，提供独立于现有系统的信息，或提供在由现有标准定义的特定亚群内的预后数据，例如在Dukes氏B或结节阴性的患者中。

最近，美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)(AJCC)一致会议提出，CEA应当加入结肠直肠癌的TNM分期系统中。应当如下指定CEA水平：CX，不能评价CEA；CO，CEA未升高(＜5μg/l)，或CEA1，CEA升高(＞5μg/l)(Compton，C.，等，Cancer88(2000)1739-1757)。

由于单独的CYFRA 21-1明显有助于区分CRC患者和健康对照或健康对照+非恶性的结肠疾病，所以必须预见到，它将辅助评价患有CRC的患者的预后。手术前的CYFRA 21-1水平最可能与CRC的一种或多种其它标记和/或TNM分期系统相组合，如AJCC为CEA所提议的。在优选的实施方案中，CYFRA 21-1用于CRC患者的预后。

化疗的监控：

许多报告已经描述了CEA在监控晚期CRC患者的治疗中的用途(综述见，Refs.Duffy，M.J.，Clin.Chem.47(2001)625-630；Fletcher，R.H.，Ann.Int.Med.104(1986)66-73；Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)。其中的大多数是回顾性的、非随机化的，且包含少数患者。这些研究表明：a)CEA水平降低同时接受化疗的患者通常具有比CEA水平不降低的那些患者更好的结果，和(b)对于几乎所有的患者，CEA水平的升高与疾病进展有关。

由于实施例部分显示的数据，所以必须预见到，在化疗的监控方面，CYFRA 21-1将至少是与CEA一样好的标记。本发明因此也涉及CYFRA21-1用于监控处于化疗中的CRC患者的用途。

随访：

大约50％经历外科手术切除的患者的目的是治愈、复发或转移性疾病的更迟发展(Berman，J.M.，等，Lancet 355(2000)395-399)。这些复发的大多数在诊断的前2-3年内发生，且通常局限在肝、肺或局部区域(locoregional area)。由于复发性/转移性疾病总是致命的，所以大量的研究已经集中在它的早期鉴别上，以及因而潜在地可治疗的阶段。结果，许多这样的患者经历手术后的监护计划，这经常包括使用CEA的常规监控。

已经显示，使用CEA的系列监控以约80％的灵敏性和约70％的特异性检测复发性/转移性疾病，并提供5个月的平均超前时间(lead-time)(综述见，Duffy，M.J.，等，同上，和Fletcher，R.H.，同上)。而且，CEA是无症状患者的复发的最常见的指示剂(Pietra，N.，等，Dis.ColonRectum 41(1998)1127-1133和Graham，R.A.，等，Ann.Surg.228(1998)59-63)，且在检测潜在地可治愈的复发性疾病方面，比放射学更节省成本。关于复发/转移的位点，CEA对于肝转移的检测最灵敏(几乎100％)。另一方面，CEA对于诊断局部区域的复发不太可靠，灵敏性仅仅是约60％(Moertel，C.G.，等，Jama 270(1993)943-947)。

作为患者便利、疾病检测的成本和效率之间的折衷，EGTM组和ASCO组一样(Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)提出，在原始诊断后，可以每2-3个月进行一次CEA测试，持续至少3年。3年后，以更低的频率进行测试，例如每6个月。但是没有证据支持该测试频率。

如上面关于现有技术水平的讨论所表明的，外科手术后CRC患者的随访是适当生物化学标记的最重要的应用领域之一。由于CYFRA 21-1在研究的CRC患者中的高灵敏性，所以预见到单独的或与一种或多种其它标记相联合的CYFRA 21-1将极大地有助于CRC患者的随访，尤其是外科手术后CRC患者的随访。包含CYFRA 21-1和CRC的一种或多种其它标记的标记组在CRC患者的随访中的用途，代表本发明的另一个优选的实施方案。

本发明公开了，且因此在优选的实施方案中涉及，CYFRA 21-1分别在CRC的诊断领域或在CRC的评价中的用途。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及与结肠直肠癌的一种或多种标记分子相联合的作为结肠直肠癌的标记分子的CYFRA 21-1在从个体得到的液体样品评价结肠直肠癌中的用途。在这点上，表述“一种或多种”代表1-20，优选1-10，优选1-5，更优选3或4。CYFRA 21-1和一种或多种其它标记形成CRC标记组。

因而，本发明的优选的实施方案是，与结肠直肠癌的一种或多种标记分子相联合的作为结肠直肠癌的标记分子的CYFRA 21-1在从个体得到的液体样品评价结肠直肠癌中的用途。可以与CYFRA 21-1的测量相组合的优选的选择的其它CRC标记是NSE、ASC、NMMT、CA 19-9、CA 72-4和/或CEA。进一步优选地，在CRC的评价中使用的标记组包含CYFRA 21-1和选自NSE、ASC和NMMT的至少一种其它标记分子。

在下面更详细地讨论了优选地与CYFRA 21-1相组合或形成包含CYFRA 21-1的CRC标记组的部分的标记。

OPN

OPN(骨桥蛋白)是由许多人癌症表达和分泌的糖-磷蛋白。OPN见于正常的血浆、尿、乳和胆汁中(U.S. 6,414,219；U.S. 5,695,761；Denhardt，D.T & Guo，X.，FASEB J.7(1993)1475-1482；Oldberg，A.，等，PNAS 83(1986)8819-8823；Oldberg，A.，等，J.Biol.Chem.263(1988)19433-19436；Giachelli，C.M.，等，Trends Cardiovasc.Med.5(1995)88-95)。已经分离并测序了人OPN蛋白和cDNA(Kiefer M.C.，等，Nucl.Acids Res.17(1989)3306)。

OPN通过结合整联蛋白和CD44受体，调节细胞-基质相互作用和细胞信号传导，在细胞粘附、趋化性、巨噬细胞指导的白细胞介素-10(IL-10)抑制、应激-依赖性的血管发生、细胞凋亡的预防、和无贴壁依赖的肿瘤细胞生长中起作用。尽管OPN的组成型表达存在于几种细胞类型中，但已经在处于重构过程(例如炎症、局部缺血-再灌注、骨吸收和肿瘤进展)中的T-淋巴细胞、表皮细胞、骨细胞、巨噬细胞、和肿瘤细胞中检测到了诱导的表达(综述见Wai，P.Y.& Kuo P.C.J.Surg.Res.121(2004)228-241)。

已知OPN与许多整联蛋白受体相互作用。已经报道了许多人癌症中的增高的OPN表达，且已经鉴别出了它的同族受体(av-b3、av-b5和av-b1整联蛋白和CD44)。Irby，R.B.，等，Clinical & ExperimentalMetastasis 21(2004)515-523的体外研究显示，内源OPN表达(通过稳定的转染)以及外源OPN(加入培养基中)增加人结肠癌细胞的体外游动性和侵入能力。OPN似乎通过与CD44相互作用来调节游动性。OPN表达也减少细胞间的(同型的)粘附，后者被视作转移癌细胞的特征。用OPN稳定地转染4种较难致瘤的人结肠癌细胞系，也导致增强的体内致瘤性，其具有增加的增殖和升高的CD31阳性微血管计数，与OPN表达程度相一致。

Mor，G.，等，PNAS 102(2005)7677-7682报道了基于OPN和3种其它分析物的同时定量，早期诊断上皮卵巢癌的血(血清)实验。

NSE

NSE(神经元特异性烯醇化酶)也称作糖酵解酶烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油酸水解酶，EC 4.2.1.11，分子量约80kD)，以多种二聚体同工型存在，其包含3种免疫学上不同的亚基，称作α、β和γ。烯醇化酶的α-亚基存在于哺乳动物的许多类型的组织中，而β-亚基主要见于心脏和横纹肌肉系统中。烯醇化酶同工型αγ和γγ称作神经元特异性烯醇化酶(NSE)或γ-烯醇化酶，主要在神经元和神经内分泌细胞以及源自它们的肿瘤中可以高浓度地检测到(Lamerz R.，NSE(Neuronen-spezifischeEnolase)，γ-Enolase.In：Thomas L(ed)Clinical Laboratory Diagnosis，TH-Books，Frankfurt，1^st English Edition 1998：979-981，5.deutscheAuflage 1998：1000-1003)。

NSE被描述为监控小细胞支气管癌的首选标记(Lamerz R.，同上)，而对于非小细胞支气管癌，CYFRA 21-1优于NSE(Ebert W.，等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem 32(1994)189-199)。

升高的NSE浓度见于60-81％小细胞支气管癌病例中。

NSE与转移的位点或脑转移没有关联，但是与临床病期(即疾病的程度)有好的关联。

作为对化疗的响应，首个治疗周期后24-72小时，NSE水平暂时升高，其原因是肿瘤细胞的溶解。在此后一周内或在首个治疗周期结束时，血清值快速降低(其在治疗前升高)。相反地，治疗的非应答者表现出恒定升高的水平，或不能落入参考范围内。在缓解过程中，80-96％患者具有正常值。在复发的情况下，发现升高的NSE值。在有些情况下，该升高的发生具有1-4个月的潜伏期，且经常是指数的(倍增时间为10-94天)，且与存活时间段相关联。在监控小细胞支气管癌的治疗和疾病进程的过程中，NSE可以用作单一预后因子和活性标记：诊断灵敏性93％，阳性预测值92％(Lamerz R.，同上)。

在成神经细胞瘤中，在62％患病儿童中发现超过30ng/ml的NSE血清值。中值随疾病的病期而升高。病理性NSE值的量级或频率和疾病病期之前存在显著的关联；与无病的存活存在负关联。

68-73％精原细胞瘤患者具有临床上显著的NSE升高(Lamerz R.，同上)。与该疾病的临床进程存在有用的关联。

NSE也已经在其它肿瘤中测量到：在22％病例(在所有病期的癌)中，非肺的恶性疾病表现出大于25ng/ml的值。脑肿瘤(例如神经胶质瘤、脑膜瘤(miningioma)、神经纤维瘤和神经鞘瘤)仅仅有时伴有升高的血清NSE值。在原发性脑肿瘤或脑转移和恶性黑素瘤和嗜铬细胞瘤中，升高的NSE-值可以发生在CSF(脑脊液)中。对于14％限于器官的和46％转移性肾癌，已经报道了升高的NSE浓度，其与作为独立的预后因子的等级相关联。

在良性疾病中，已经在良性肺病和脑病患者中发现了升高的血清NSE浓度(＞12ng/ml)。已经在脑血管脑膜炎、弥散性脑炎、脊髓小脑变性、脑缺血、脑梗死、脑内血肿、蛛网膜下腔出血、颅脑损伤、炎性脑病、器质性癫痫、精神分裂症和Jakob-Creutzfeld病中发现了升高的值，主要在液体中(Lamerz R.，同上)。

根据生产商的说明书，使用Roche产品号12133113，已经在Elecsys^分析仪上测量了NSE。

CA 19-9

使用单克隆抗体1116-NS-19-9，定义了测量的CA 19-9(糖抗原19-9)值。血清中的1116-NS-19-9-反应性决定簇主要表达在粘蛋白-样蛋白上，后者含有大量的CA19-9表位(Magnani J.L.，Arch.Biochem.Biophys.426(2004)122-131)。

3-7％群体具有Lewis a-阴性的/b-阴性的血型构型，且不能表达具有反应性决定簇CA 19-9的粘蛋白。当解释该发现时，必须予以考虑。

含有CA19-9的粘蛋白在胎儿胃、肠和胰上皮中表达。低浓度也可见于肝、肺和胰的成年组织中(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，Boeringer Mannheim，目录号1536869(engl)，1320947(dtsch).ISBN3-926725-07-9 dtsch/engl.，Juergen Hartmann Verlag，Marloffstein-Rathsberg(1993)；Herlyn，M.，等，J.Clin.Immunol 2(1982)135-140)。

CA 19-9测定值可以辅助有差别地诊断和监控胰癌患者(灵敏性70-87％)(Ritts，R.E.，Jr.，等，Int.J.Cancer 33(1984)339-345)。肿瘤块和CA 19-9测定值之间没有关联。但是，具有大于10,000U/mL的CA19-9血清水平的患者几乎总是具有远端转移。

CA 19-9的测定不能用于胰癌的早期检测(Steinberg，W.M.，等，Gastroenterology 90(1986)343-349)。

在肝胆癌中，CA 19-9值提供50-75％的灵敏性。在胃癌的情况下，推荐同时测定CA 72-4和CEA。在结肠直肠癌中，单独测定CEA是足够的；仅仅在有限数目的CEA-阴性的情况下，CA 19-9的测定是有用的。

由于粘蛋白排它地通过肝排泄，所以在有些情况下，甚至轻微的胆汁郁积也导致明显升高的CA 19-9血清水平。升高的CA 19-9值也见于许多良性和炎性的胃肠道和肝疾病中，以及囊性纤维化中。

根据生产商的说明书，使用Roche产品号11776193，已经在Elecsys^分析仪上测量了CA 19-9。

CEA

CEA(癌胚抗原)是一种单体糖蛋白(分子量约180.000道尔顿)，其含有约45-60％的可变糖组分(Gold，P.和Freedman，S.O.，J.Exp Med121(1965)439-462)。

CEA，如AFP，属于在胚胎和胎儿时间段生成的癌胎(carcinofetal)抗原组。CEA基因家族由2个亚组中的约17个活性基因组成。第一组合有CEA和非特异性的交叉反应抗原(NCA)；第二组含有妊娠特异性的糖蛋白(PSG)。

CEA主要见于胎儿胃肠道和胎儿血清。它也以微量存在于健康成年人的肠、胰和肝组织中。出生后，CEA的形成受到抑制，因此在健康成年人中几乎难以测量到血清CEA值。

在结肠直肠腺癌的情况下，经常发现高CEA浓度(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。轻微至中等CEA升高(很少＞10ng/mL)发生在20-50％肠、胰、肝和肺的良性疾病中(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、Crohn氏病、肺气肿)(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。吸烟者也具有升高的CEA值。

CEA测定的主要指示是结肠直肠癌患者的治疗控制和随访。

不推荐CEA测定用于一般群体的癌症筛选。正常范围内的CEA浓度不能排除恶性疾病的可能存在。

在Roche Diagnostics生产的测定中的抗体与CEA反应，且与胎粪抗原(NCA2)反应(如同几乎所有的CEA检测方法一样)。与NCA1的交叉反应性是0.7％(Hammarstrom，S.，等，Cancer Res.49(1989)4852-4858；和Bormer，O.P.，Tumor Biol.12(1991)9-15)。

根据生产商的说明书，使用Roche产品号11731629，已经在Elecsys^分析仪上测量了CEA。

ASC

“含有胱天蛋白酶相关募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白”(ASC)也称作“甲基化诱导的沉默的靶1”(TMS1)(Swiss-PROT：Q9ULZ3)。ASC具有理论分子量21,627Da和理论等电点pH 6.29。

胱天蛋白酶相关募集结构域(CARD)介导衔接蛋白如APAF1(细胞凋亡蛋白酶激活因子1)和参与细胞凋亡的胱天蛋白酶前体形式(例如，CASP 9)之间的相互作用。ASC是含有CARD的衔接蛋白家族的成员。

通过免疫筛选前髓细胞(promyelocytic)细胞系，Masumoto等分离了编码ASC的cDNA。推论的195-氨基酸蛋白含有N-末端热蛋白-样结构域(PYD)和87-残基C-末端CARD。蛋白印迹分析显示了22-kDa蛋白的表达，并显示ASC可以通过增加白血病细胞系对抗癌药物的细胞凋亡刺激的易感性，具有促细胞凋亡(proapoptotic)活性(Masumoto，J.，等，J.Biol.Chem.274(1999)33835-33838)。

Conway等的甲基化-敏感的限制PCR和甲基化-特异性的PCR(MSP)分析表明，ASC的沉默与外显子1周围的CpG岛的过度甲基化有关，且DNMT1(DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶-1)的超表达促进过度甲基化和ASC的沉默。乳腺癌细胞系(而不是正常的乳房组织)表现出ASC的完全甲基化，且不表达ASC信号。ASC在乳腺癌细胞系中的表达抑制生长，并减少存活集落的数目。Conway等的结论是，ASC在促进胱天蛋白酶-依赖性的细胞凋亡中起作用，且ASC的超表达抑制乳腺癌细胞的生长(Conway，K.E.，等，Cancer Research 60(2000)6236-6242)。

McConnell和Vertino显示，ASC的诱导型表达抑制细胞增殖，并诱导可以被胱天蛋白酶抑制剂阻断的DNA断裂。免疫荧光显微镜术证实，细胞凋亡的诱导造成CARD-依赖性的从弥散性细胞质表达向球形核周聚集体的变化(McConnell，B.B.，和Vertino，P.M.，Cancer Research60(2000)6243-6247)。Moriani等不仅在乳腺癌细胞中、还在胃癌中观察到了ASC基因的甲基化。他们提出了ASC基因的异常甲基化在涉及促细胞凋亡的ASC基因的下调的乳腺癌和胃癌的发展中的直接作用(Moriani，R.，等，Anticancer Research 22(2002)4163-4168)。

Conway等检查了用于TMS1甲基化的初生乳房组织，并将结果与健康组织中的甲基化相对比(Conway K.E.，等，Cancer Research 60(2000)6236-6242)。Levine等发现，ASC沉默与特定CpG位点的甲基化无关，但是与ASC CpG岛的密集甲基化有关。排它地含有甲基化的ASC拷贝的乳腺肿瘤细胞系不表达ASC，而在部分甲基化的细胞系中，ASC的表达水平与存在于细胞群体中的甲基化ASC等位基因的百分比直接相关(Levine，J.J.，等，Oncogene 22(2003)3475-3488)。

Virmani等检查了肺癌和乳腺癌组织中的ASC的甲基化状态。他们发现，ASC的异常甲基化存在于46％乳腺癌细胞系和32％乳腺肿瘤组织中。甲基化罕见于非恶性乳腺组织中(7％)(Virmani，A.，等，Int.J.Cancer 106(2003)198-204)。

Shiohara等发现，ASC的上调与人嗜中性粒细胞中的炎症和细胞凋亡密切相关(Shiohara，M.，等，Blood 98(2001)229a)。

Masumoto等观察到了在上皮细胞和白细胞中大量表达的ASC的高水平(Masumoto，J.，等，Journal Histochem.Cytochem.49(2001)1269-1275)。

已经开发了自制(in-house)夹心免疫测定，以用于ASC的测量。该测定以微量滴定板的形式进行。使用链霉抗生物素蛋白-包被的微量滴定板。在该夹心测定中，使用生物素化的ASC多克隆抗体作为捕获抗体，且使用洋地黄毒苷化的ASC多克隆抗体作为第二种特异性的结合配偶体。最后，通过抗-洋地黄毒苷辣根过氧化物酶缀合物和适当的过氧化物酶底物，显现形成的夹心复合物。

MASP

蛋白MASP(乳腺丝抑蛋白前体；Swiss-PROT：P36952)是一种42-kDa蛋白，其与蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族共有同源性。免疫染色研究证实，乳腺丝抑蛋白见于细胞外基质和质膜(Zou，Z.，等，Science 263(1994)526-529)。

人MASP基因(PI5的SERPINB5)最初分离自正常的乳房上皮，这通过基于它在mRNA水平上的表达的扣除杂交来实现(Zou等，同上)。乳腺丝抑蛋白在正常的乳房上皮细胞中表达，但是在大多数乳房癌细胞系中不表达。Zou等(同上)显示，它的表达减少转化的细胞诱导肿瘤形成和转移的能力，从而表明乳腺丝抑蛋白基因编码肿瘤抑制剂。

Bass，R.，等(J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848)表征了真核生物的乳腺丝抑蛋白，并发现，它对测试的任何蛋白水解系统都没有蛋白酶抑制作用。但是，它确实抑制肿瘤和血管平滑肌细胞的迁移。

Song，S.Y.，等(Digestive Diseases and Sciences 47(2002)1831-1835)通过腺瘤、腺癌和转移性腺癌的组织切片的免疫组织化学染色，研究了乳腺丝抑蛋白在结肠癌中的表达。Song等(同上)发现的乳腺丝抑蛋白的免疫反应性是细胞质的，同时有一些核染色。超过90％腺瘤、75％腺癌和47％转移性癌组织切片是乳腺丝抑蛋白染色阳性的。该研究具有下述局限，即没有使用定量测定系统，例如蛋白印迹分析。没有评价与邻近的正常结肠组织相比的表达水平。

FERR

铁蛋白(FERR)是一种含有约20％铁的蛋白，且见于肠、肝和脾中。它是铁在体内贮藏的主要形式之一。已经报道，身体铁贮藏增加结肠直肠肿瘤的危险。在Scholefield，J.H.，等(Dis.Colon Rectum 41(1998)1029-1032)的一项研究中，使用来自148位患者(50位被证实患有结肠直肠癌的患者，49位没有结肠疾病的患者，和患有结肠腺瘤的患者)的样品，测定了血清铁蛋白。在三个组的任一组中，血清铁蛋白水平没有显著差异。

NNMT

蛋白烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT；Swiss-PROT：P40261)具有29.6kDa的表观分子量和5.56的等电点。

NNMT催化烟酰胺和其它吡啶的N-甲基化。该活性对于许多药物和异生素化合物的生物转化是重要的。据报道，该蛋白主要在肝中表达，并位于细胞质中。已经从来自人肝的cDNA克隆了NNMT，且其含有792-核苷酸可读框，其编码具有29.6kDa的计算分子量的264-氨基酸蛋白(Aksoy，S.，等，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。关于该酶在人癌症中的潜在作用，文献中知之甚少。在一篇论文中，将升高的肝NNMT酶活性报道为小鼠癌性恶病质的标记(Okamura，A.，等，Jpn.J.Cancer Res.89(1998)649-656)。在一篇近期的报告中，证实了在辐射敏感的细胞系中，辐射引起的NNMT基因的下调(Kassem，H.，等，Int.J.Cancer 101(2002)454-460)。

最近已经发现(WO 2004/057336)，NNMT可以用于评价CRC。在WO 2004/057336中描述的免疫测定，已经用于测量本研究的样品(CRC、健康对照和非恶性结肠病)。

如熟练的技术人员会明白的，存在许多使用两种或更多种标记的测量的方式，以改善在研究中的诊断问题。在一个非常简单的、但是仍然经常有效的方案中，如果样品对至少一种研究的标记是阳性的，则假定是阳性结果。这可以是例如当诊断传染病(如AIDS)时的情况。

但是，经常地，评价标记的组合。优选地，数学地组合为标记组的标记(例如CYFRA 21-1和NSE，或CYFRA 21-1和OPN)测得的值，并将组合的值与潜在的诊断问题相关联。通过任何适当的现有技术水平数学方法，可以组合标记值。众所周知的将标记组合与疾病相关联的数学方法使用下述方法，如判别式分析(DA)(即线性的-、二次的-、规则化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类符)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林(Random Forest)方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主组分的方法(即SIMCA)、广义累加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练的技术人员会无问题地选择适当的方法来评价本发明的标记组合。优选地，用于将本发明的标记组合与例如是否存在CRC相关联的方法选自DA(即线性的-、二次的-、规则化的判别式分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类符)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于这些统计学方法的细节，参见下面的文献：Ruczinski，I.，等，J.of Computational and Graphical Statistics，12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie，T.，Tibshirani，R.，Friedman，J.，The Elements ofStatistical Learning，Springer Series in Statistics，2001；Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.(1984)Classification andregression trees，California：Wadsworth；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluationof Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford StatisticalScience Series，28(2003)；和Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，2nd Edition(2001)。

本发明的一个优选的实施方案是，使用生物学标记的潜在组合的最优化的多变量截止值，并辨别状态A和状态B，例如病态和健康。在这类分析中，标记不再是独立的，而是形成标记组。可以确定，组合CYFRA21-1和NSE或ASC各自的测量，确实与健康对照相比，或者，如也评价的，与健康对照加非恶性疾病对照相比，CRC诊断准确度显著提高。或者，将CYFRA 21-1与OPN或OPN和FERR相组合，提高类似环境中的诊断准确度。特别地，后一发现非常重要，因为非恶性疾病患者可能要求与CRC患者完全不同的治疗。

诊断方法的精确性最好由其接收器工作特性(ROC)说明(特别见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲线图是在整个观察数据范围内连续变化决定阈值(decision thresh-hold)产生的所有灵敏性/特异性对的图。

实验室检验的临床性能依赖于其诊断精确性、或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性测量了检验将研究的受试者的两种不同状况正确区分的能力。这类状况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。

在每个病例中，ROC图通过在决定阈值的全部范围将灵敏性对1-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏性或真阳性率[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性数+假阴性试验结果数)]。它也指疾病或状况存在的确定性。它从受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性率或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性数+假阳性结果数)]。它是特异性的指标，并完全从未受影响的亚群计算。因为使用来自两个不同亚群的检验结果，完全独立地计算真和假阳性率，所以ROC图不依赖于样品中疾病的患病率。ROC图上的每点代表对应于特定决定阈值的灵敏性/1-特异性对。具有最佳辨别力的检验(在结果的两个分布中没有重叠)具有经过左上角的ROC图，在左上角，真阳性率为1.0，或者100％(理想的灵敏性)，且假阳性率为0(理想的特异性)。没有辨别力的检验的理论图(两组结果的同样分布)为从左下角至右上角的45°对角线。大多图介于这两个极端之间。(如果ROC图完全落在45°对角线之下，则容易通过将“确定性”标准从“高于”反转为“低于”来矫正这种情况，反之亦然。)从定性上，图越接近左上角，检验的总精确度就越高。

定量实验室检验诊断精确度的一个方便的目标是通过单独的数字表达其性能。这样的总参数是例如所谓的“总误差”或可选的“曲线下面积＝AUC”。最普通的全面测量是ROC图下的面积。按照惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，则可以反转决定规则使其≥0.5)。值在1.0(两组检验值的理想分离)和0.5(在两组检验值之间没有明显的分布差异)之间变化。该面积不仅依赖于该图的特定部分，例如最接近对角线的点或在90％特异性的灵敏性，也依赖于全图。这是对ROC图有多么接近理想ROC图(面积＝1.0)的定量的说明性表达。

组合测量CYFRA 21-1和其它新近发现的标记(如OPN、ASC或NMMT)或已知的标记(如CEA和NSE)或其它待发现的CRC标记，分别导致且将导致CRC评价的其它提高。

两种标记CYFRA 21-1和NSE的组合，显著提高CRC的诊断准确度。两种标记CYFRA 21-1和ASC的组合，也显著提高CRC的诊断准确度。另外，两种标记CYFRA 21-1和OPN的组合，显著提高CRC的诊断准确度。

在优选的实施方案中，本发明涉及提高CRC对健康对照和/或非恶性结肠疾病患者的诊断准确度的方法，其通过分别测量样品中至少CYFRA 21-1和NSE、OPN或ASC的浓度，并将测定的浓度与是否存在CRC相关联实现，与基于单独研究的任何单一标记的分类相比，所述提高导致更多患者被正确地归入CRC对健康对照和/或非恶性结肠疾病患者。

在根据本发明的优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA21-1和NSE的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1和ASC的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1和OPN的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、NSE和ASC的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、OPN和ASC的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、NSE和OPN的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、NNMT和OPN的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、MASP和OPN的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标记CYFRA 21-1、FERR和OPN的浓度，并将该标记组合用于评价CRC。

提供下列实施例、参考文献和附图以帮助对本发明的理解，其真实范围于附加的权利要求中提出。应当理解，可以在不偏离本发明精神的情况下，在提出的方法中进行修饰。

附图说明

图1使用单独的log CYFRA 21-1，诊断出CRC的患者对健康对照和疾病对照的ROC-分析。

图2使用log CYFRA 21-1和log NSE的组合，诊断出CRC的患者对健康对照和疾病对照的ROC-分析。

图3使用log CYFRA 21-1和log ASC的组合，诊断出CRC的患者对健康对照和疾病对照的ROC-分析。

图4使用log CYFRA 21-1、log NSE和log ASC的组合，诊断出CRC的患者对健康对照和疾病对照的ROC-分析。

图5使用log CYFRA 21-1、log NSE、log ASC和log NNMT的组合，诊断出CRC的患者对健康对照和疾病对照的ROC-分析。

具体实施方式

实施例1

第一个研究群体

已经使用了源自109位充分表征的CRC患者的样品，其具有表1给出的UICC分类。

表1：

第一个研究群体：CRC样品和对应的UICC分类

根据UICC的病期	样品数
根据UICC的病期	样品数	UICC 0	3
UICC I	33	UICC 0	3
UICC I	33	UICC II	23
UICC III	21	UICC II	23
UICC III	21	UICC IV	23
没有分期	6	UICC IV	23
没有分期	6	CRC样品总数	109

与从健康个体、患有非恶性结肠疾病的患者得到的对照样品相比，或与用健康和非恶性对照样品得到的合并数据相比，已评价了表1的CRC样品。表2给出了使用的对照的概况。

表2：

第一个研究群体：健康和非恶性对照

对照样品的类型	样品数
对照样品的类型	样品数	健康对照	317
憩室病	50	健康对照	317
憩室病	50	憩室炎	7
结肠炎	12	憩室炎	7
结肠炎	12	CED	10
溃疡	3	CED	10
溃疡	3	其它	5
所有疾病对照	87	其它	5

在下面的实施例中，使用从表2列出的所有样品得到的数据(即覆盖健康和非恶性疾病对照的数据)，表示数据。

实施例2：

对于每种测试的单个标记，已计算了在90％的共同特异性水平时，每种标记的灵敏性。表3给出了每种最有前途的CRC标记在所有UICC病期以百分比表示的灵敏性。

表3：

在第一个研究群体中单个标记的灵敏性

标记	NSE	ASC	NNMT	CA 19-9	CEA	CYFRA
标记	NSE	ASC	NNMT	CA 19-9	CEA	CYFRA	在90％特异性时的灵敏性	18.9％	54.1％	55.0％	32.1％	46.8％	57.8％

如从表3可以容易地看出的，已经发现与研究的所有其它标记相比，标记CYFRA 21-1(＝CYFRA)对CRC具有最高灵敏性。标记NMMT和ASC似乎具有相当的、但是略低的灵敏性，然后是CEA。

实施例3：

标记组

使用规则化的判别式分析(RDA)，它是普通判别式分析的一般化，即二次的-和线性的判别式分析(McLachlan，G.J.，Discriminant Analysisand Statistical Pattern Recognition，Wiley Series in probability andmathematical statistics，1992)，生成分类算法。在RDA中，使用协方差矩阵的平常最大可能性(插入(plug-in))估计的替代方案。这些替代方案的特征在于2个参数(λ，γ)，它们的值根据单独的情况定制，其通过共同地使基于样品的将来错分类危险估计最小化来实现(Friedman，J.H.，Regularized Discriminant Analysis，J.of the American StatisticalAssociation 84(1989)165-175)。作为一种替代方法，Support VectorMachines算法(Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics，2001)可以被拟合以得到可比较的分类结果。RDA分析是基于106份CRC样品的，因为原始的109份样品中的3份缺少标记值。

从分类问题的最佳单一标记开始，并在约90％特异性水平时的灵敏性增加不再有显著改变时结束，逐步构建标记组。为了得到集中的分布，用自然对数(log)函数转化每一种单一标记。使用5-倍交叉验证。

表4提供了诊断出CRC的患者对对照(包括非恶性结肠疾病)的分类结果。通过RDA选择的第一种标记是CYFRA 21-1，第二种是NSE。

表4：

CRC患者对健康对照和疾病对照的训练集合(training set)的分类结果

标记数	标记或标记组	方法(RDA)	截止值	交叉验证(5倍)
				交叉验证(5倍)			总误差	真阳性灵敏性	真阴性特异性
				1	log CYFRA	λ＝0.25，γ＝0	总误差	真阳性灵敏性	真阴性特异性	2.8	0.16	59.7％	90.3％
2	log CYFRA，log NSE	λ＝0，γ＝0.75	3.7	1	log CYFRA	λ＝0.25，γ＝0	0.14	69.6％	90.5％	2.8	0.16	59.7％	90.3％
2	log CYFRA，log NSE	λ＝0，γ＝0.75	3.7	3	log CYFRA，log NSE，log ASC	λ＝0.5，γ＝0	0.14	69.6％	90.5％	2.7	0.12	78.7％	90.2％
4	log CYFRA，log NSE，log ASC，log NNMT	λ＝0.5，γ＝0	2.0	3	log CYFRA，log NSE，log ASC	λ＝0.5，γ＝0	0.13	76.4％	90％	2.7	0.12	78.7％	90.2％

在该分析中的标记组CYFRA 21-1、NSE和ASC确实在约90％的特异性水平产生了最高灵敏性。

已经评价了与CYFRA 21-1相组合的各种其它标记。如表5所示，与CYFRA 21-1相组合的ASC也导致灵敏性的显著提高，而CYFRA 21-1与其它候选CRC标记的组合似乎是不太有利的。

表5：

CRC患者对健康对照和疾病对照的训练集合的分类结果

标记数	标记或标记组	方法(RDA)	截止值	交叉验证(5倍)
				交叉验证(5倍)			总误差	真阳性灵敏性	真阴性特异性
				2	log CYFRA，log ASC	λ＝0.75，γ＝1	总误差	真阳性灵敏性	真阴性特异性	2.7	0.15	67.6％	90.2％
2	log CYFRA，log NNMT	λ＝1，γ＝0.25	2.2	2	log CYFRA，log ASC	λ＝0.75，γ＝1	0.16	62.8％	90.1％	2.7	0.15	67.6％	90.2％
2	log CYFRA，log NNMT	λ＝1，γ＝0.25	2.2	2	log CYFRA，log CA19_9	λ＝0.75，γ＝1	0.16	62.8％	90.1％	2.5	0.17	55.8％	90.1％
2	log CYFRA，log CA	λ＝1，γ＝0.75	2.5	2	log CYFRA，log CA19_9	λ＝0.75，γ＝1	0.17	54.6％	90.5％	2.5	0.17	55.8％	90.1％

在图1-5中，分别显示了表4和5的标记和标记组合的最令人感兴趣的ROC-曲线。

实施例4：

第二个研究群体的分析

以与实施例3所述类似的方式，使用包含CYFRA 21-1、oPN、FERR、NNMT、NSE和MASP的标记组，进行RDA。

表6：

第二个研究群体：CRC样品和对应的UICC分类

根据UICC的病期	样品数
根据UICC的病期	样品数	UICC 0	8
UICC I	41	UICC 0	8
UICC I	41	UICC II	53
UICC III	67	UICC II	53
UICC III	67	UICC I-III(未分类，非-IV病期)	13
UICC IV	61	UICC I-III(未分类，非-IV病期)	13
UICC IV	61	没有分期	11
CRC样品总数	254	没有分期	11

第二个研究群体包含来自254位诊断为CRC患者的血清样品(见表6)和391份对照样品。将它们分成训练集合和实验集合。分析基于128份CRC样品和195份对照的训练集合。在对照中，16份来自没有任何胃肠疾病的个体，50份来自痔个体，5份来自其它肠病患者；63份对照来自憩室病个体，61份来自健康血液供体。实验集合由126份CRC样品和196份对照组成。在对照中，20份来自没有任何胃肠疾病的个体，43份来自痔个体，8份来自其它肠病患者；65份对照来自憩室病个体，60份来自健康血液供体。

表7和8所示的数据表明，在90％的基础特异性，标记CYFRA 21-1、OPN和NNMT各自提供30％至40％的灵敏性。CYFRA 21-1和OPN的组合显著提高灵敏性。为了评价加入第三种标记是否增强检测性能，包含了第三种标记。在几种测试的组合中，CYFRA 21-1、OPN和FERR提供特别的优点，即灵敏性又显著升高到超过仅仅CYFRA 21-1和OPN的组合。

表7：

诊断为CRC的患者对健康对照和疾病对照的训练集合的分类结果

标记数	标记或标记组	方法(RDA)	截止值	交叉验证(5倍)		实验集合的分类
				交叉验证(5倍)		实验集合的分类		灵敏性	特异性	真阳性(灵敏性)	真阴性(特异性)
				1	log CYFRA	λ＝0.75，γ＝0	0.6	灵敏性	特异性	真阳性(灵敏性)	真阴性(特异性)	39.1％	90.1％	37.3％	92.3％
1	log OPN	λ＝0.5，γ＝0	-0.4	1	log CYFRA	λ＝0.75，γ＝0	0.6	34.1％	90.9％	30.2％	92.3％	39.1％	90.1％	37.3％	92.3％
1	log OPN	λ＝0.5，γ＝0	-0.4	1	log FERR	λ＝0.75，γ＝0	0.1	34.1％	90.9％	30.2％	92.3％	12.5％	91.7％	19％	92.9％
1	log ASC	λ＝0，γ＝0	-0.2	1	log FERR	λ＝0.75，γ＝0	0.1	24.4％	90.1％	30.2％	85.7％	12.5％	91.7％	19％	92.9％
1	log ASC	λ＝0，γ＝0	-0.2	1	log NNMT	γ＝0.5，γ＝0	-0.4	24.4％	90.1％	30.2％	85.7％	36.2％	90.4％	31％	90.3％
1	log NSE	λ＝0.5，γ＝0	0.6	1	log NNMT	γ＝0.5，γ＝0	-0.4	15.8％	90.8％	18.2％	93.9％	36.2％	90.4％	31％	90.3％
1	log NSE	λ＝0.5，γ＝0	0.6	1	log MASP	λ＝0.75，γ＝0	0.1	15.8％	90.8％	18.2％	93.9％	23.6％	90.9％	19％	91.3％
2	log CYFRA，log OPN	λ＝1，γ＝0	0.2	1	log MASP	λ＝0.75，γ＝0	0.1	45.3％	90.6％	45.2％	92.3％	23.6％	90.9％	19％	91.3％

表8：

标记数	标记或标记组	方法(RDA)	截止值	交叉验证(5倍)		实验集合的分类
				交叉验证(5倍)		实验集合的分类		灵敏性	特异性	真阳性(灵敏性)	真阴性(特异性)
				1	log CYFRA	λ＝0.75，γ＝0	0.6	灵敏性	特异性	真阳性(灵敏性)	真阴性(特异性)	39.1％	90.1％	37.3％[28.8，46.4]	92.3％[87.9，95.7]
2	log CYFRA，log OPN	λ＝1，γ＝0	0.2	1	log CYFRA	λ＝0.75，γ＝0	0.6	45.3％	90.6％	45.2％[36.4，54.4]	92.3％[87.9，95.7]	39.1％	90.1％	37.3％[28.8，46.4]	92.3％[87.9，95.7]
2	log CYFRA，log OPN	λ＝1，γ＝0	0.2	3	log CYFRA，log OPNlog FERR	λ＝1，γ＝0	0	45.3％	90.6％	45.2％[36.4，54.4]	92.3％[87.9，95.7]	52.7％	90.1％	53.2％[44.1，62.1]	88.3％[83.3，92.6]
3	log CYFRA，log ASClog OPN	λ＝0.75，γ＝0	0.3	3	log CYFRA，log OPNlog FERR	λ＝1，γ＝0	0	40.8％	90.6％	42.9％[34.1，52]	90.8％[86.2，94.6]	52.7％	90.1％	53.2％[44.1，62.1]	88.3％[83.3，92.6]
3	log CYFRA，log ASClog OPN	λ＝0.75，γ＝0	0.3	3	log CYFRA，log NNMTlog OPN	λ＝1，γ＝0	0	40.8％	90.6％	42.9％[34.1，52]	90.8％[86.2，94.6]	45.9％	91.4％	42.1％[33.3，51.2]	91.3％[86.7，95]
3	log CYFRA，log NSElog OPN	λ＝1，γ＝0	-0.4	3	log CYFRA，log NNMTlog OPN	λ＝1，γ＝0	0	42.8％	90.7％	41.3％[32.6，50.4]	93.9％[ 89.8，96.9]	45.9％	91.4％	42.1％[33.3，51.2]	91.3％[86.7，95]
3	log CYFRA，log NSElog OPN	λ＝1，γ＝0	-0.4	3	log CYFRA，log MASPlog OPN	λ＝1，γ＝0	0.1	42.8％	90.7％	41.3％[32.6，50.4]	93.9％[ 89.8，96.9]	43.6％	90.6％	41.3％[32.6，50.4]	93.9％[89.8，96.9]

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Claims

1.体外评价结肠直肠癌的方法，其包含下述步骤：

a)测量样品中CYFRA 21-1的浓度，

b)任选地测量样品中结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，和

c)将在步骤(a)测定的浓度和任选地在步骤(b)中测定的浓度与结肠直肠癌的诊断相关联。

2.根据权利要求1的方法，其中所述一种或多种其它标记选自NSE、ASC、NNMT、CA 19-9、CA 72-4、CEA、MASP、OPN和FERR。

3.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其它标记是NSE。

4.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其它标记是ASC。

5.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其它标记是NNMT。

6.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其它标记是OPN。

7.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其它标记是FERR。

8.CYFRA 21-1在评价结肠直肠癌中的用途。

9.包含CYFEA 21-1和结肠直肠癌的一种或多种其它标记的标记组在价结肠直肠癌中用途。

10.根据权利要求9的标记组的用途，其中所述一种或多种其它标记选自NSE、ASC、NNMT、CA 19-9、CA 72-4、CEA、MASP、OPN和FERR。

11.根据权利要求10的标记组的用途，所述标记组包含至少CYFRA21-1和NSE。

12.根据权利要求10的标记组的用途，所述标记组包含至少CYFRA21-1和OPN。

13.用于执行根据权利要求2的方法的试剂盒，其包含特异性地测量CYFRA 21-1和结肠直肠癌的一种或多种其它标记所需的试剂。

14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述结肠直肠癌的一种或多种其它标记是NSE。

15.根据权利要求13的试剂盒，其中所述结肠直肠癌的一种或多种其它标记是OPN。