ES2321627T3 - Kit-reactivo para preparar una disolucion muestra para la reaccion de amplificacion de acido nucleico y metodo de deteccion de acido nucleico usando la disolucion de tratamiento. - Google Patents
Kit-reactivo para preparar una disolucion muestra para la reaccion de amplificacion de acido nucleico y metodo de deteccion de acido nucleico usando la disolucion de tratamiento. Download PDFInfo
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Abstract
Método para detectar un ácido nucleico diana, que comprende las etapas de: homogeneizar un tejido derivado de un organismo vivo en una disolución de tratamiento que comprende dimetilsulfóxido, disolvente acuoso y un tensioactivo, de manera que se transfiere un ácido nucleico del tejido a la disolución de tratamiento; mezclar el homogeneizado obtenido y un reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico, sin extraer ni purificar un ácido nucleico en el homogeneizado; amplificar el ácido nucleico diana contenido en la mezcla; y detectar el ácido nucleico diana amplificado.
Description
Kit-reactivo para preparar una
disolución muestra para la reacción de amplificación de ácido
nucleico y método de detección de ácido nucleico usando la
disolución de tratamiento.
La presente invención se refiere a un método
para detectar un ácido nucleico diana, que comprende usar la
disolución de tratamiento. Además, la presente invención se refiere
a un kit para amplificar un ácido nucleico diana, que comprende la
disolución de tratamiento.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
un método de amplificación de un ácido nucleico en el que puede
amplificarse exponencialmente un fragmento de ADN diana llevando a
cabo repetidamente la disociación de una cadena de ADN para dar una
cadena sencilla, posteriormente la unión, a la cadena de ADN, de un
cebador correspondiente a una región específica en la cadena, y
reacción de síntesis de ADN con una ADN polimerasa. Además del
método de PCR, hay métodos de amplificación de ácido nucleico tales
como RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa
con transcriptasa inversa), NASBA (amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico), LAMP (amplificación de ADN isotérmica
mediada por bucle), TMA (método de amplificación mediada por
transcripción) y 3SR (replicación de secuencias autosostenida).
La reacción de amplificación de un ácido
nucleico en los métodos de amplificación de ácido nucleico
mencionados anteriormente es sensible a la influencia de una
sustancia que inhibe la reacción de amplificación de ácido
nucleico, tal como una proteína (denominado a continuación en el
presente documento, inhibidor) contenida en una muestra biológica,
y la reacción de amplificación de ácido nucleico se inhibe por el
inhibidor. En consecuencia, es necesaria la operación de extracción
o purificación de un componente de ácido nucleico tal como ADN o
ARN a partir de una muestra biológica antes de la detección de un
ácido nucleico mediante el método de amplificación de ácido
nucleico. Sin embargo, la operación de extracción o purificación de
un componente de ácido nucleico es problemática y requiere mucho
tiempo. Como métodos que pueden amplificar un ácido nucleico diana
sin realizar la operación de extracción o purificación de un
componente de ácido nucleico, se conocen métodos descritos en la
solicitud de patente estadounidense abierta a consulta al público
número 2005/0089857 (WO0070073) o el documento internacional
abierto a consulta por el público número 00/08136 (WO0008136).
La solicitud de patente estadounidense abierta a
consulta al público número 2005/0089857 citada anteriormente
describe un método de amplificación de un ácido nucleico diana, que
comprende tratar una muestra biológica con una disolución que
contiene una sal que interacciona con un inhibidor con el fin de
reducir la influencia del inhibidor.
El documento internacional abierto a consulta
por el público número 00/08136 citado anteriormente describe un
método de amplificación de un ácido nucleico a partir de un
microorganismo presente en una muestra tal como heces, que
comprende lavar la muestra con un disolvente orgánico para eliminar
un inhibidor. Específicamente, cuando la muestra es heces, se
suspenden las heces en una disolución tampón adecuada, y se
centrifuga la suspensión resultante para eliminar sólidos grandes,
y se recoge su sobrenadante. Se centrifuga el sobrenadante obtenido,
y se descarta el sobrenadante resultante, y se lavan los
precipitados residuales añadiendo un disolvente orgánico y
centrifugando los precipitados, y se recuperan microorganismos como
precipitados y se usan como una muestra para amplificación de ácido
nucleico. El documento internacional abierto a consulta por el
público número 00/08136 citado anteriormente describe que pueden
usarse como disolvente orgánico disolventes orgánicos hidrófilos
tales como etanol, metanol, 2-propanol, propanona
(acetona), etanonitrilo (acetonitrilo) y dimetilsulfóxido (DMSO) o
disolventes orgánicos anfipáticos tales como butanol,
2-butanol y acetato de etilo. El documento
internacional abierto a consulta al público número 00/08136 también
describe que la muestra puede ser tejidos recogidos quirúrgicamente
del organismo vivo, una muestra sólida tal como un tejido se
homogeneiza de manera deseable para facilitar el lavado, y un ácido
nucleico como objeto de amplificación no se limita particularmente
a un gen de un microorganismo patógeno o un gen derivado del
organismo vivo.
Sin embargo, en el método en el documento
internacional abierto a consulta al público número 00/08136, se usa
como muestra un tejido derivado de un organismo vivo, y cuando ha de
amplificarse un ácido nucleico derivado del tejido pero no un ácido
nucleico en un microorganismo presente en el tejido, surge ahí un
problema que cuando el tejido homogeneizado se lava con el
disolvente orgánico mencionado anteriormente, se elimina el ácido
nucleico objetivo junto con un inhibidor, reduciendo así la cantidad
de ácido nucleico que puede recuperarse.
El documento WO2004072270 da a conocer un método
para detectar ácido nucleico usando una disolución de enjuague, que
contiene un disolvente miscible en agua y DMSO, y una disolución de
homogeneización, que contiene un tensioactivo. En este documento,
las muestras de ARN se aíslan de los tejidos tras los tratamientos
mediante la disolución de enjuague y mediante la disolución de
homogeneización sin emplear una amplificación directa ni una etapa
de detección.
El alcance de la presente invención se define
únicamente por las reivindicaciones adjuntas, y no se ve afectada
en grado alguno por las declaraciones dentro de este sumario.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un método para detectar un ácido nucleico diana, que
comprende las etapas de: preparar una disolución de muestra para la
reacción de amplificación de ácido nucleico tratando una muestra
biológica con una disolución de tratamiento que contiene
dimetilsulfóxido, conteniendo la disolución de muestra ácido
nucleico que se transfiere desde la muestra biológica; amplificar el
ácido nucleico diana contenido en la disolución de muestra; y
detectar el ácido nucleico diana amplificado.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un kit de reactivos para amplificar un ácido nucleico
diana, que comprende: un primer reactivo para tratar una muestra
biológica, que comprende una disolución de tratamiento que contiene
dimetilsulfóxido; y un segundo reactivo para la reacción de
amplificación de ácido nucleico, que comprende
desoxirribonucleótidos trifosfato, una ADN polimerasa y un cebador
que es complementario al ácido nucleico diana.
La figura 1 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 1.
La figura 2 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el ganglio linfático
como muestra biológica.
La figura 3 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el ovario como muestra
biológica.
La figura 4 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el riñón como muestra
biológica.
La figura 5 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el pulmón como muestra
biológica.
La figura 6 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el hígado como muestra
biológica.
La figura 7 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el corazón como muestra
biológica.
La figura 8 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el bazo como muestra
biológica.
La figura 9 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el estómago como
muestra biológica.
La figura 10 es una gráfica que muestra los
resultados en el ejemplo 2, en el que se usó el colon como muestra
biológica.
La disolución de tratamiento para preparar una
disolución de muestra para la reacción de amplificación de ácido
nucleico contiene dimetilsulfóxido (DMSO) con el fin de reducir la
influencia de un inhibidor. Una disolución de muestra preparada
tratando una muestra biológica con la disolución de tratamiento para
transferir un ácido nucleico contenido en la muestra biológica a la
disolución de tratamiento se usa en la reacción de amplificación de
un ácido nucleico, mediante la cual puede recuperarse eficazmente el
ácido nucleico incluso si se deriva de un tejido, y puede reducirse
eficazmente la influencia de un inhibidor durante la amplificación
de ácido nucleico.
La disolución de tratamiento es una disolución
obtenida disolviendo dimetilsulfóxido (DMSO) en disolvente acuoso.
La concentración de DMSO en la disolución de tratamiento es
preferiblemente del 1 al 50% (v/v), más preferiblemente del 5 al
30% (v/v), todavía más preferiblemente del 10 al 25% (v/v). La
disolución de tratamiento que contiene DMSO a la concentración se
usa para tratar una muestra biológica preparando así una disolución
de muestra para la amplificación de ácido nucleico, y la disolución
de muestra se usa en la reacción de amplificación de un ácido
nucleico, mediante la cual puede reducirse una posible disminución
de la actividad enzimática en la reacción de amplificación de ácido
nucleico, y puede reducirse eficazmente la influencia de un
inhibidor durante la amplificación de ácido nucleico.
Para evitar la degradación de un ácido nucleico
contenido en la disolución de muestra, se usa de manera deseada una
disolución de tratamiento ácida que es inferior a pH 7,0. El pH de
la disolución de tratamiento es preferiblemente de 2,5 a 5,0, más
preferiblemente de 3,0 a 4,0.
El disolvente acuoso incluye agua y una
disolución tampón. Por ejemplo, la disolución tampón que permite que
el pH de la disolución se mantenga ácido puede usarse como
disolvente acuoso para preparar la disolución de tratamiento
ácida.
La disolución de tratamiento contiene además un
tensioactivo con el fin de aumentar la cantidad de un ácido
nucleico contenido en la disolución de muestra para la reacción de
amplificación de ácido nucleico. El tensioactivo contenido en la
disolución de tratamiento es preferiblemente un tensioactivo no
iónico. Entre diversos tensioactivos no iónicos se prefiere un
tensioactivo no iónico a base de polioxietileno. El tensioactivo no
iónico a base de polioxietileno es de manera particularmente
preferible un tensioactivo representado por la siguiente fórmula
general:
R1-R2-(CH_{2}CH_{2}O)n-H
en la que R1 representa un grupo
alquinilo, un grupo alquenilo, un grupo alquilo C10 a C22 o un grupo
isooctilo; R2 representa -O- ó
-(C_{6}H_{4})-O-; y n es un número entero de 8 a
120.
Ejemplos preferidos del tensioactivo no iónico a
base de polioxietileno incluyen éter laurílico de polioxietileno,
éter cetílico de polioxietileno, éter oleílico de polioxietileno,
éter miristílico de polioxietileno, éter estearílico de
polioxietileno, éter nonilfenílico de polioxietileno y éter
isooctilfenílico de polioxietileno. La concentración del
tensioactivo en la disolución de tratamiento se selecciona de modo
que se sea una concentración preferible dependiendo del tipo del
tensioactivo usado. Por ejemplo, la concentración del tensioactivo
no iónico, en la disolución de tratamiento es preferiblemente del
0,1 al 6% (v/v), más preferiblemente del 1 al 5% (v/v). La
disolución de tratamiento puede contener también una agente
desespumante junto con el tensioactivo.
La muestra biológica no está particularmente
limitada. Por ejemplo, la muestra biológica incluye tejidos tales
como ganglios linfáticos o sangre completa, plasma, suero, orina,
saliva, secreciones y fluido corporales recogidos de organismos
vivos tales como seres humanos o animales. La muestra biológica
también incluye tejidos cultivados y células cultivadas obtenidas
mediante el cultivo de tejidos o células recogidos de seres humanos
o animales. Además, la muestra biológica incluye muestras derivadas
de no animales tales como plantas y microorganismos.
La disolución de muestra para la reacción de
amplificación de ácido nucleico es una disolución obtenida mezclando
una muestra biológica con la disolución de tratamiento, y contiene
un ácido nucleico que sirve como molde en la reacción de
amplificación de ácido nucleico. Para su uso en la reacción de
amplificación del ácido nucleico, la disolución de muestra se
mezcla con reactivos para la reacción de amplificación de ácido
nucleico. Los reactivos para la reacción de amplificación de ácido
nucleico incluyen desoxirribonucleótidos trifosfato, enzimas tales
como una ADN polimerasa y ARN transcriptasa inversa, al menos una
clase de cebador que es complementario al ácido nucleico diana, y
una disolución tampón dando condiciones preferibles a la reacción
enzimática. Además, los reactivos para la reacción de amplificación
de ácido nucleico pueden combinarse con la disolución de tratamiento
para constituir un kit de reactivos para amplificar un ácido
nucleico diana. Por ejemplo, cuando el kit de reactivos comprende
un primer reactivo para tratar una muestra biológica y un segundo
reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico, el
primer reactivo comprende una disolución de tratamiento que contiene
dimetilsulfóxido y el segundo reactivo comprende
desoxirribonucleótidos trifosfato, enzimas tales como una ADN
polimerasa y ARN transcriptasa inversa y un cebador que es
complementario al ácido nucleico diana. Para constituir el segundo
reactivo, puede combinarse un reactivo de un primer grupo que
contiene desoxirribonucleótidos trifosfato y enzimas tales como una
ADN polimerasa y ARN transcriptasa inversa con un reactivo de un
segundo grupo que contiene un cebador que es complementario al
ácido nucleico diana. Además, puede combinarse un reactivo de un
primer grupo que contiene desoxirribonucleótidos trifosfato y un
cebador que es complementario al ácido nucleico diana con un
reactivo de un segundo grupo que contiene enzimas tales como una ADN
polimerasa y ARN transcriptasa inversa. Además, puede combinarse un
reactivo de un primer grupo que contiene desoxirribonucleótidos
trifosfato con un reactivo de un segundo grupo que contiene enzimas
tales como una ADN polimerasa, y ARN transcriptasa inversa y un
reactivo de un tercer grupo que contiene un cebador que es
complementario al ácido nucleico diana.
Cuando la disolución de muestra se prepara
mezclando una muestra biológica con la disolución de tratamiento,
las células que contienen un ácido nucleico diana se rompen o se
lisan para transferir el ácido nucleico en las células a la
disolución de tratamiento. Particularmente, cuando se usa una
muestra sólida tal como un tejido como muestra biológica, la
disolución de muestra se hace homogénea de manera deseable con un
homogeneizador, una mezcladora o similar para preparar la
disolución de muestra mezclando la muestra biológica con la
disolución de tratamiento. Para eliminar los materiales sólidos
relativamente grandes tales como residuos celulares, la disolución
de muestra que se hace homogénea puede someterse si es necesario a
tratamiento tal como filtración y centrifugación para preparar la
disolución de muestra.
El ácido nucleico diana incluye, pero no se
limita a, ADN y ARN derivado del organismo vivo, ADN y ARN
microbiano, y ADN y ARN derivado de plantas.
El inhibidor se refiere a una sustancia que
inhibe la reacción de amplificación de un ácido nucleico, y ejemplos
del inhibidor incluyen proteínas, lípidos y azúcares contenidos en
la muestra biológica. Cuando el inhibidor está contenido en la
disolución de muestra preparada a partir de la muestra biológica, la
reacción de amplificación de un ácido nucleico se inhibe debido a
la influencia del inhibidor.
La influencia del inhibidor puede reducirse
disminuyendo la concentración del inhibidor en la disolución de
muestra. El método de disminución de la concentración del inhibidor
incluye la dilución de la disolución de muestra. Sin embargo, la
concentración del ácido nucleico diana en la disolución de muestra
también disminuye mediante la dilución de la disolución de muestra.
Particularmente, cuando la cantidad de un ácido nucleico diana en
la muestra biológica es baja, la concentración del ácido nucleico
diana en la disolución de muestra se hace muy baja tras la dilución
a alto grado, dando como resultado problemas tales como la necesidad
de un largo tiempo en la amplificación de ácido nucleico, un nivel
inferior del ácido nucleico amplificado que limite de detección, y
no lograr amplificar el ácido nucleico. Por consiguiente, la
disolución de tratamiento que contiene DMSO puede usarse para
reducir la influencia de un inhibidor contenido en la disolución de
muestra, sin diluir la disolución de muestra a alto grado. El grado
de dilución óptimo para amplificar un ácido nucleico reduciendo
eficazmente la influencia de un inhibidor varía dependiendo de la
cantidad y el tipo de la muestra biológica usada. Por consiguiente,
cuando la disolución de muestra se prepara a partir de una muestra
biológica usando la disolución de tratamiento, se selecciona un
grado de dilución adecuado de manera deseable dependiendo de la
cantidad y el tipo de la muestra biológica usada. Para la dilución
puede usarse la disolución de tratamiento.
La disolución de muestra preparada a partir de
una muestra biológica usando la disolución de tratamiento puede
usarse en métodos conocidos para amplificar ácidos nucleicos. Pueden
mencionarse métodos para amplificar ácidos nucleicos, tales como
PCR (reacción en cadena de la polimerasa), RT-PCR
(reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa),
LAMP (amplificación de ADN isotérmica mediada por bucle),
RT-LAMP (amplificación de ADN isotérmica mediada
por bucle con transcriptasa inversa), TMA (método de amplificación
mediado por transcripción), NASBA (amplificación basada en
secuencias de ácido nucleico), 3SR (replicación de secuencia
autosostenida), SDA (amplificación por desplazamiento de cadena) e
ICAN (amplificación de ácidos nucleicos iniciada por cebadores
quimérica e isotérmica). Como una clase de métodos de amplificación
de ácido nucleico, pueden mencionarse también métodos de
amplificación de señal tales como RCA (amplificación por circulo
rodante), INVADER, CPT (tecnología de la sonda cíclica) y PALSAR
(reacción de autoensamblaje de ligador con alternancia de sonda).
En el método de amplificación de señal, no se amplifica el ácido
nucleico diana por sí mismo sino una secuencia de nucleótidos
específica complementaria al ácido nucleico diana. El método de
amplificación de ácido nucleico es preferiblemente PCR,
RT-PCR, LAMP o RT-LAMP, de manera
particularmente preferible LAMP o RT-LAMP desde el
punto de vista de la amplificación rápida del ácido nucleico.
El método de detección del ácido nucleico diana
amplificado no está particularmente limitado, y el ácido nucleico
diana puede detectarse mediante métodos conocidos en la técnica. Es
posible emplear, por ejemplo, electroforesis sobre gel de agarosa,
un método de detección de detección en tiempo de real con sondas
usando un marcador fluorescente, y un método de detección mediante
la turbidez de un subproducto generado tras la síntesis de ADN. Si
es necesario también puede usarse un método de detección de un ácido
nucleico diana confirmando un patrón de escisión de ácido nucleico
obtenido mediante tratamiento enzimático, un método de detección de
un ácido nucleico determinando su secuencia de nucleótidos mediante
análisis de secuencia y otros muchos métodos. Cuando una banda del
ácido nucleico diana casi no puede distinguirse debido a muchas
bandas no específicas, la banda del ácido nucleico diana puede
confirmarse mediante transferencia de tipo Southern con sondas para
el ácido nucleico específico. Desde el punto de vista de la
detección rápida del ácido nucleico diana, el método de detección
del ácido nucleico diana particularmente preferible es el método de
detección en tiempo de real con una sonda usando un marcador
fluorescente y el método de detección mediante la turbidez de un
subproducto generado tras la síntesis de ADN.
La disolución de tratamiento puede usarse
ampliamente en examen clínico para la valoración de la presencia o
ausencia de enfermedades mediante el método de amplificación de
ácido nucleico. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo,
infecciones, enfermedades relacionadas con genes y cánceres.
Las células cancerosas salen de un foco primario
y se propagan por medio de la circulación sanguínea o del sistema
linfático hacia todo el organismo. En la operación del cáncer, el
foco debe eliminarse de la manera más precisa posible de modo que
se requiere que su metástasis se detecte de manera precisa, y se
realiza un tratamiento adecuado dependiendo de la metástasis. Por
consiguiente el diagnóstico de la metástasis de cáncer en el
ganglio linfático durante la operación tiene un significado muy
importante. En el cáncer de mama, por ejemplo, la zona del ganglio
linfático que ha de escindirse en la operación es de manera más
deseable lo más pequeña posible para mejorar la CDV (calidad de
vida). En el cáncer de esófago debe seleccionarse operación
abdominal, apertura del pecho o incisión cervical dependiendo del
sitio de propagación del cáncer en el ganglio linfático. En el
cáncer de próstata, debe determinarse si la operación ha de
continuarse o suspenderse, si la escisión ha de continuarse y si ha
de llevarse a cabo tratamiento hormonal cuando existe metástasis en
ganglio linfático. En el cáncer de estómago, la zona del ganglio
linfático que va a extirparse y el tipo de operación se cambian
dependiendo de la presencia o ausencia de la metástasis del cáncer
en el ganglio linfático. En el cáncer de estómago, la presencia o
ausencia de la metástasis del cáncer en el ganglio linfático se
convierte en una pauta para el plan de tratamiento tras la
operación, por ejemplo una pauta para seleccionar si por ejemplo ha
de administrarse un fármaco anticancerígeno y si ha de realizarse
radioterapia. En este caso, si puede diagnosticarse rápidamente la
metástasis del cáncer usando una muestra biológica recogida durante
la operación, la zona del ganglio linfático que va extirparse, el
tipo de operación que va a realizarse y el tratamiento
complementario que va a realizarse pueden determinarse en la
operación incluso durante un corto tiempo, permitiendo así al
paciente recibir el mejor tratamiento. Además, puede reducirse la
carga sobre el paciente durante la operación.
Cuando se usa la disolución de tratamiento
descrita anteriormente, puede prepararse rápidamente una disolución
de muestra para la reacción de amplificación de ácido nucleico a
partir de una muestra biológica sin extraer o purificar un ácido
nucleico. Por consiguiente, la disolución de tratamiento puede
usarse de manera eficaz particularmente en el diagnóstico de
metástasis del cáncer que debería completarse rápidamente usando el
método de amplificación de ácido nucleico durante la operación.
El ácido nucleico que sirve como indicador del
cáncer incluye ácidos nucleicos de citoqueratinas tales como
citoqueratina 18, citoqueratina 19 y citoqueratina 20 y marcadores
tumorales tales como CEA (antígeno carcinoembrionario), PSA
(antígeno específico de la próstata) y
CA-15-3 (antígeno de hidratos de
carbono 15-3).
En este ejemplo se examinó el efecto de DMSO
contenido en la disolución de tratamiento para preparar la
disolución de muestra. En este ejemplo, se usó la disolución de
tratamiento que contenía DMSO para preparar una disolución de
muestra para la reacción de amplificación de ácido nucleico a partir
de una muestra biológica, y se usaron la disolución de muestra
preparada y un reactivo para la reacción de amplificación de ácido
nucleico para llevar a cabo RT-LAMP.
Como muestra biológica, se usaron células
Molt-4 cultivadas comerciales. Las células
Molt-4 son células tumorales subcultivadas
derivadas de ser humano de leucemia linfocítica aguda.
Como disolución de tratamiento, se usaron 4
disoluciones de tratamiento que tenían diferentes concentraciones
de DMSO del 0% (v/v), 5% (v/v), 10% (v/v) y el 20% (v/v),
respectivamente. La composición de las disoluciones de tratamiento
se muestra a continuación. La disolución de tratamiento contiene un
tensioactivo Brij35 (fabricado por Sigma Aldrich Japón) que es
lauril éter de polioxietileno (23). Como agente de deformación está
contenido KS-538 fabricado por
Shin-Etsu Chemical Co., Ltd en la disolución de
tratamiento.
Se llevó a cabo la amplificación de ácido
nucleico mediante RT-LAMP en la que se usó ARN de
\beta-actina como ácido nucleico diana. La
\beta-actina se expresa a un nivel definido en
cada célula.
Como reactivo para la reacción de amplificación
de ácido nucleico, se usaron una disolución de reacción, una
disolución enzimática y un reactivo de cebador que contenía seis
cebadores expuestos en las SEQ ID NOS: 1 a 6. La composición de
cada reactivo se muestra a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 4 ml de la disolución de
tratamiento a 300 mg de células Molt-4, y se
rompieron las células y se homogeneizaron a 25.000 rpm durante 90
segundos con un homogeneizador fabricado por Microtec Nition.
Entonces, se centrifugó la disolución homogeneizada (10.000 xg, 1
minuto) dando un sobrenadante. Se usó el sobrenadante resultante
como una disolución de muestra de dilución de una vez.
Adicionalmente, se diluyó la disolución de muestra de dilución de
una vez 2, 4, 8, 10 y 16 veces con la disolución de tratamiento,
para preparar disoluciones de muestra diferentes en el grado de
dilución.
Se realizó la amplificación de ácido nucleico
mediante RT-LAMP en la que el ácido nucleico diana
era ARN de \beta-actina. En primer lugar, se
mezclaron entre sí 13,97 \mul de la disolución de reacción, 3,04
\mul del reactivo enzimático y 6,00 \mul del reactivo de
cebador para preparar una mezcla de reactivos. Se mezclaron 23
\mul de la mezcla de reactivos con 2 \mul de cada disolución de
muestra preparada en (1), y entonces se hicieron reaccionar a 65ºC
durante 30 minutos. En la detección del ácido nucleico amplificado
se usó un instrumento de medición de la turbidez en tiempo real
Loopamp (LA-200) fabricado por Teramecs. La reacción
de amplificación de ácido nucleico puede monitorizarse en tiempo
real con este instrumento realizando una reacción de amplificación
de ácido nucleico a una temperatura predeterminada y detectando
simultáneamente la turbidez del pirofosfato de magnesio formado
como subproducto de la amplificación. En este ejemplo, se midió la
absorbancia a una temperatura fijada a 65ºC durante 30 minutos tras
haberse mezclado la disolución de muestra con el reactivo para la
reacción de amplificación de ácido nucleico.
En la figura 1 se muestra en una gráfica de
barras el tiempo que había transcurrido hasta que la absorbancia de
cada disolución de muestra alcanzó 0,1. El tiempo (min.) que había
transcurrido hasta que la absorbancia (Abs a 650 nm) alcanzó 0,1 se
muestra en la ordenada. El triángulo en blanco sobre la gráfica de
barras indica que la absorbancia no alcanzó 0,1 dentro del tiempo
de reacción (30 minutos). El grado de dilución se muestra en la
abscisa. En la gráfica de barras se usan las siguientes disoluciones
de tratamiento de izquierda a derecha: la disolución de tratamiento
a una concentración de DMSO del 0%, la disolución de tratamiento a
una concentración de DMSO del 5%, la disolución de tratamiento a
una concentración del DMSO de 10% y la disolución de tratamiento a
una concentración de DMSO del 20%.
En las muestras diluidas a grados relativamente
bajos de dilución (diluidas 1, 2 y 4 veces respectivamente) en la
figura 1, las muestras usando la disolución de tratamiento que no
contenía DMSO (es decir, a la concentración de DMSO del 0%)
mostraron que había transcurrido más tiempo hasta que la absorbancia
alcanzó 0,1 que las muestras usando las disoluciones de tratamiento
que contenían DMSO (es decir, a las concentraciones de DMSO del 5%,
10% y el 20%, respectivamente). En este caso, el contenido de un
inhibidor en la disolución de muestra es mayor a medida que el
grado de dilución es menor. A partir de lo anterior, se encontró que
la influencia de un inhibidor contenido en la disolución de muestra
se reduce añadiendo DMSO a la disolución de tratamiento.
Cuando se comparan los tiempos que habían
transcurrido hasta que la absorbancia alcanzaba 0,1 en las muestras
que contenían DMSO a las concentraciones del 5%, 10% y el 20%
respectivamente, las muestras que contenían DMSO a la concentración
del 20% y diluidas a un grado de dilución menor muestran la
disminución más significativa en el tiempo. Incluso en la muestra
diluida una vez, el tiempo que ha transcurrido hasta que la
absorbancia alcanza 0,1 es tan corto como de aproximadamente 22
minutos. A partir de este resultado, se encontró que cuando la
concentración de DMSO es del 20%, puede reducirse más eficazmente la
influencia de un inhibidor en la disolución de muestra.
Entre las disoluciones de muestra diluidas a
grados de dilución relativamente altos (diluidas 8, 10 y 16 veces
respectivamente) en la figura 1, las disoluciones de muestra incluso
usando la disolución de tratamiento que no contiene DMSO permiten
reducir el tiempo que había transcurrido hasta que la absorbancia
alcanzó 0,1 hasta el mismo grado que se había conseguido mediante
las disoluciones de muestra que contenían DMSO. Esto es,
presumiblemente, debido a que mediante la dilución de la disolución
de muestra a un alto grado de dilución, la concentración de un
inhibidor contenido en la disolución de muestra se reduce también,
reduciendo así la influencia del inhibidor.
Se llevó a cabo RT-LAMP en este
ejemplo en el que se usaron varias clases de tejidos como muestra
biológica, y se usó la disolución de tratamiento que contenía DMSO
para preparar la disolución de muestra.
Se usaron nueve clases de tejidos (ganglio
linfático, ovario, riñón, pulmón, hígado, corazón, bazo, estómago y
colon) extirpados de un ratón como muestra biológica.
Como disolución de tratamiento, se usó una
disolución tampón que tenía la siguiente composición que contenía
el 20% (v/v) de DMSO.
Se llevó a cabo la amplificación de ácido
nucleico mediante RT-LAMP en la que el ácido
nucleico diana era ARN de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). La GAPDH es expresa a una cantidad definida
en cada célula.
Como reactivo para la reacción de amplificación
de ácido nucleico, se usaron la disolución de reacción usada en el
ejemplo 1, la disolución enzimática usada en el ejemplo 1 y un
reactivo de cebador que contenía seis cebadores expuestos en las
SEQ ID NOS: 7 a 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 4 ml de la disolución de
tratamiento a 300 mg de cada clase de tejido, y se rompieron las
células y se homogeneizaron a 25.000 rpm durante 90 segundos con un
homogeneizador fabricado por Microtec Nition. Entonces, se
centrifugó la disolución homogeneizada (10.000xg, 1 minuto), y se
diluyeron los sobrenadantes resultantes respectivamente 10 veces
con la disolución de tratamiento, y se usaron éstos como
disoluciones de muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la amplificación de ácido nucleico
mediante RT-LAMP en la que el ácido nucleico diana
era ARN de gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). En primer lugar, se mezclaron entre sí 13,97
\mul de la disolución de reacción, 3,04 \mul del reactivo
enzimático y 6,00 \mul del reactivo de cebador para preparar una
mezcla de reactivos. Se mezclaron 23 \mul de la mezcla de
reactivos con 2 \mul de cada disolución de muestra preparada en
(1), y entonces se hicieron reaccionar a 65ºC durante 30 minutos. En
la detección del ácido nucleico amplificado, se usó un instrumento
de medición de la turbidez en tiempo real Loopamp
(LA-200) fabricado por Teramecs. En este ejemplo,
se midió la absorbancia a una temperatura fijada a 65ºC durante 30
minutos tras mezclarse la disolución de muestra con el reactivo para
la reacción de amplificación de ácido nucleico. Se usó una muestra
usando ARN total de roedor (fabricado por Applied Biosystems) en
lugar de la disolución de muestra como control positivo, y se usó
una muestra usando la disolución de tratamiento en lugar de la
disolución de muestra como control negativo.
Cada una de las figuras 2 a 10 es una gráfica
que muestra la amplificación del ADNc de GAPDH en cada clase de
tejido. En cualquier gráfica, se muestra la absorbancia (Abs a 650
nm) en la ordenada y el tiempo (min.) en la abscisa. Los resultados
se muestran en las gráficas en las que se usaron los siguientes
tejidos como muestra biológica: el ganglio linfático en la figura
2, el ovario en la figura 3, el riñón en la figura 4, el pulmón en
la figura 5, el hígado en la figura 6, el corazón en la figura 7, el
bazo en la figura 8, el estómago en la figura 9 y el colon en la
figura 10. En cada gráfica, el símbolo de círculos negros es un
símbolo de cada clase de tejido, el símbolo de círculos blancos es
un símbolo del control positivo y el símbolo de triángulos negros
es un símbolo del control negativo.
En las figuras 2 a 10, el tiempo de arranque de
la amplificación del ADNc y la cantidad del ADNc amplificado cuando
se habían usado los tejidos como muestra biológica eran similares a
los del control positivo. El control positivo no contiene ningún
inhibidor. A partir de este resultado, se encontró que puede usarse
la disolución de tratamiento para cualquier tejido para reducir la
influencia de un inhibidor y amplificar el ácido nucleico
diana.
\newpage
En este ejemplo, se preparó una disolución de
muestra para la reacción de amplificación de ácido nucleico a
partir de una muestra biológica usando la disolución de tratamiento
(que contenía DMSO al 20% (v/v)) para preparar una disolución de
muestra, y se usaron la disolución de muestra preparada y un
reactivo comercial para llevar a cabo la
RT-PCR.
Como muestra biológica, se usaron ganglios
linfáticos humanos (A), (B), (C), (D) y (E) en los que se reconoció
clínicamente la metástasis del cáncer como muestra biológica. Como
control negativo, se usaron ganglios linfáticos humanos normales
(F), (G) y (H).
Como disolución de tratamiento, se usó la misma
disolución de tratamiento que en el ejemplo 2.
Se realizó la amplificación de ácido nucleico
mediante RT-PCR en la que el ácido nucleico diana
era ARN de citoqueratina 19 (CK19). Se sabe que CK19 se expresa en
células epiteliales y también se expresa en tejidos tales como el
ganglio linfático en el que se reconoce la metástasis del cáncer, y
también existe una diferencia en el nivel de expresión de la misma
entre tejidos normales y tejidos cancerosos. En este ejemplo, se
usaron 3 cebadores expuestos en las SEQ ID NOS: 13 a 15.
Se llevó a cabo la RT-PCR usando
reactivos de mezcla madre para RT-PCR en una sola
etapa de TaqMan fabricados por Applied Biosystems y unidad de PCR
de cuantificación en tiempo real (ABI PRISMR 7700) fabricada por
Applied Biosystems. Los reactivos de mezcla madre para
RT-PCR en una sola etapa de TaqMan son un kit de
reactivos para RT-PCR, que consistía en 2 x mezcla
madre y 40 x mezcla de inhibidor de ARNasa. El ácido nucleico
amplificado puede cuantificarse con ABI PRISMR 7700 realizando la
reacción de amplificación de ácido nucleico a una temperatura
predeterminada durante un tiempo predeterminado y entonces
detectando la densidad de fluorescencia aumentada dependiendo de la
amplificación del ácido nucleico.
Se añadieron 4 ml de la disolución de
tratamiento a 300 mg de cada una de las muestras biológicas (A) a
(H), y se rompieron las células y se homogeneizaron a 25.000 rpm
durante 90 segundos con un homogeneizador fabricado por Microtec
Nition. Entonces, se centrifugaron las disoluciones homogeneizadas
(10.000 xg, 1 minuto), y se diluyeron los sobrenadantes resultantes
10 veces con la disolución de tratamiento y se usaron como
disoluciones de muestra de ARNm bruto (A) a (H), respectivamente.
Usando el kit RNeasy Mini fabricado por QIAGEN, se purificaron ARNm
a partir de los sobrenadantes anteriores y se usaron como
purificados dando disoluciones de muestra de ARNm (A) a (H),
respectivamente. El tiempo necesario desde la purificación del ARNm
del sobrenadante hasta la preparación de la disolución de muestra
de ARNm purificado es aproximadamente de 60 minutos.
En este ejemplo, se realizó la
RT-PCR en la que se usaron las disoluciones de
muestra de ARNm bruto (A) a (H) y las disoluciones de muestra de
ARNm purificado (A) a (H) preparadas en (1) respectivamente como
disolución de muestra para la reacción de amplificación de ácido
nucleico. En primer lugar, se preparó una disolución de reacción
que contenía la mezcla madre, mezcla de inhibidor de ARNasa y los 3
cebadores, y se mezcló la disolución de reacción así preparada con
la disolución de muestra con el fin de llevar a cabo la
RT-PCR. La RT-PCR consistió en 40
ciclos que implicaban cada uno una reacción de transcripción inversa
48ºC durante 30 minutos y mantener la mezcla a 95ºC durante 10
minutos, entonces a 95ºC durante 15 segundos y a 60ºC durante 1
minuto. Se mezcló la disolución de reacción que contenía la mezcla
madre, mezcla de inhibidor de ARNasa y los 3 cebadores con la
disolución de muestra y se reguló de modo que la composición final
se convirtió en 1 x mezcla madre, 1 x mezcla de inhibidor de
ARNasa, cebador directo 300 nM (SEQ ID NO: 13), cebador inverso 300
nM (SEQ ID NO: 14) y sonda de TaqMan 200 nM (SEQ ID NO: 15).
La tabla 1 muestra la cantidad de ADNc
(copias/reacción) de CK19 amplificado mediante la reacción de
amplificación en cada muestra. La cantidad de ADNc
(copias/reacción) en la tabla indica el número de copias de ADNc de
CK19 contenidas en la muestra tras finalizar la reacción de
amplificación. En la tabla, ND se refiere a una muestra en la que
la cantidad de ADNc es inferior a 10^{2} (copias/reacción), y
cuando la cantidad de ADNc está en este intervalo, no se considera
que se haya amplificado el ácido nucleico diana.
Cuando se comparaba la cantidad de ADNc de CK19
amplificado mediante RT-PCR usando la disolución de
muestra de ARNm bruto (A) con aquélla usando la disolución de
muestra de ARNm purificado (A), las dos son muy similares entre sí.
Esto se aplica también a los casos de (B) a (E), de manera similar
al caso de (A), en los que cuando se compara la cantidad de ADNc de
CK19 amplificado usando la disolución de muestra de ARNm bruto con
aquélla usando la disolución de muestra de ARNm purificada, las dos
son muy similares entre sí. A partir de estos resultados, se
encontró que incluso si se usa la disolución de muestra de ARNm
bruto como disolución de muestra, el producto de amplificación
puede obtenerse en una cantidad similar a aquélla usando la
disolución de muestra de ARNm purificado. En cualquier disolución
de muestra (F) a (H) usada como control negativo, no se confirmó
amplificación de ADNc de CK19.
Usando una disolución de tratamiento que
contiene tensioactivo, se preparó una disolución de muestra para la
reacción de amplificación de ácido nucleico en este ejemplo a partir
de una muestra biológica, y se midió la cantidad de ARN contenido
en la disolución de muestra preparada.
Se usaron ganglios linfáticos recogidos de 4
ratones (ratones MRL) de la misma raza respectivamente como muestra
biológica. Como disolución de tratamiento, se usaron disoluciones de
tratamiento (I) a (IV) que contenían DMSO y un tensioactivo. La
composición para las disoluciones de tratamiento se muestra a
continuación. Las disoluciones de tratamiento respectivas son
diferentes en el tipo o la concentración del tensioactivo contenido:
es decir, la disolución de tratamiento (I) contiene el 1% (v/v) de
Nonidet P-40 que es isooctil fenil éter de
polioxietileno (9); la disolución de tratamiento (II) contiene el
1,5% (v/v) de Brij35 que es lauril éter de polioxietileno (23); la
disolución de tratamiento (III) contiene el 3% (v/v) de Brij35; la
disolución de tratamiento (IV) contiene el 5% (v/v) de Brij35.
Se añadió la disolución de tratamiento (I),
(II), (III) o (IV) a cada ganglio linfático de ratón, y se rompieron
las células y se homogeneizaron a 25.000 rpm durante 90 segundos
con un homogeneizador fabricado por Microtec Nition. Entonces, se
centrifugó cada una de las disoluciones homogeneizadas (10.000 xg, 1
minuto), y se usó el sobrenadante resultante como disolución de
muestra para la reacción de amplificación de ácido nucleico. En
este ejemplo, se preparo cada disolución de muestra de manera que
contuviese aproximadamente 1 \mul de la disolución de tratamiento
por 0,075 mg de la muestra biológica.
Se extrajo el ARN contenido en la disolución de
muestra para la reacción de amplificación de ácido nucleico
obtenida en (1) usando el kit RNeasy Mini fabricado por QIAGEN.
Se diluyó el extracto de ARN obtenido en el
método descrito anteriormente 10 veces con la disolución de
tratamiento, y se cuantificó el ARN midiendo la absorbancia (Abs
280 nm) de la muestra diluida. Los resultados se muestran en la
tabla 2.
La tabla 2 muestra la cantidad de ARN
(\mug/ml) en cada una de las disoluciones de muestra obtenidas
finalmente en las que cada ganglio linfático (mg) se mezcló con
cada disolución de tratamiento (\mul). (I), (II), (III) y (IV) en
la tabla se refieren a los casos en los que se usaron las
disoluciones de tratamiento (I), (II), (III) y (IV) como disolución
de tratamiento, respectivamente.
La tabla 1 reveló que cuando se usaron las
disoluciones de tratamiento (I), (II), (III) y (IV), estaban
contenidos 71 (\mug/ml), 122 (\mug/ml), 97 (\mug/ml) y 115
(\mug/ml) de ARN respectivamente, lo que indica que estaba
contenida una cantidad suficiente de ARN para la reacción de
amplificación de ácido nucleico.
<110> Sysmex Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Disolución de tratamiento para
preparar disolución de muestra para la reacción de amplificación de
ácido nucleico y método para detectar ácido nucleico usando la
disolución de tratamiento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2004-075JP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2004-353849
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
7-12-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
la beta-actina
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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<210> 12
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
GAPDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
CK19
\newpage
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ADN diseñado basándose en el gen de
CK19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN diseñado basándose en el gen de
CK19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
Claims (16)
1. Método para detectar un ácido nucleico diana,
que comprende las etapas de:
- \quad
- homogeneizar un tejido derivado de un organismo vivo en una disolución de tratamiento que comprende dimetilsulfóxido, disolvente acuoso y un tensioactivo, de manera que se transfiere un ácido nucleico del tejido a la disolución de tratamiento;
- \quad
- mezclar el homogeneizado obtenido y un reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico, sin extraer ni purificar un ácido nucleico en el homogeneizado;
- \quad
- amplificar el ácido nucleico diana contenido en la mezcla; y
- \quad
- detectar el ácido nucleico diana amplificado.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dimetilsulfóxido es del 1 al 50% (v/v).
3. Método según la reivindicación 1, en el que
el tensioactivo es un tensioactivo no iónico a base de
polioxietileno.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
el disolvente acuoso es una disolución tampón.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
el pH de la disolución de tratamiento es de 2,5 a 5,0.
6. Método según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de eliminar materiales sólidos del
homogeneizado.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
los materiales sólidos se eliminan mediante filtración o
centrifugación.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
el reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico
comprende desoxirribonucleótidos trifosfato, una ADN polimerasa y un
cebador que es complementario al ácido nucleico diana.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
el reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico
comprende desoxirribonucleótidos trifosfato, una ARN transcriptasa
inversa, una ADN polimerasa y un cebador que es complementario al
ácido nucleico diana.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
la etapa de amplificación se lleva a cabo mediante PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), RT-PCR (reacción en cadena
de la polimerasa con transcriptasa inversa), LAMP (amplificación de
ADN isotérmica mediada por bucle) o RT-LAMP
(amplificación de ADN isotérmica mediada por bucle con
transcriptasa inversa).
11. Kit reactivo para amplificar un ácido
nucleico diana, contenido en una muestra preparada sin extraer ni
purificar un ácido nucleico,
que comprende:
- \quad
- un primer reactivo, que comprende una disolución de tratamiento para transferir ácido nucleico desde un tejido derivado de un organismo vivo a la disolución de tratamiento, en el que la disolución de tratamiento comprende dimetilsulfóxido, disolvente acuoso y un tensioactivo; y
- \quad
- un segundo reactivo para la reacción de amplificación de ácido nucleico, que comprende desoxirribonucleótidos trifosfato, una ADN polimerasa y un cebador que es complementario al ácido nucleico diana.
12. Kit reactivo según la reivindicación 11, en
el que el segundo reactivo comprende además una ARN transcriptasa
inversa.
13. Kit reactivo según la reivindicación 11, en
el que la concentración de dimetilsulfóxido es 1 a 50% (v/v).
14. Kit reactivo según la reivindicación 11, en
el que el tensioactivo es un tensioactivo no iónico basado en
polioxietileno.
15. Kit reactivo según la reivindicación 11, en
el que el disolvente acuoso es una disolución tampón.
16. Kit reactivo según la reivindicación 11, en
el que el pH de la disolución de tratamiento es 2,5 a 5,0.
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