ES2321479T3 - Uso de un soporte poroso. - Google Patents

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ES2321479T3 ES01958246T ES01958246T ES2321479T3 ES 2321479 T3 ES2321479 T3 ES 2321479T3 ES 01958246 T ES01958246 T ES 01958246T ES 01958246 T ES01958246 T ES 01958246T ES 2321479 T3 ES2321479 T3 ES 2321479T3
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Abstract

Soporte cerámico poroso preformado que comprende un esqueleto interconectado hecho de andamiajes y riostras y que tiene poros, la mayoría de los cuales está en el intervalo de 20 a 1.000 micrómetros, comprendiendo los poros una red de esferas coalescidas, teniendo el soporte una densidad menor que aproximadamente 40% de la teórica, conteniendo los poros un fármaco en ellos, controlándose la velocidad de liberación del fármaco desde el soporte mediante la colocación del fármaco en los poros dentro de un soporte degradable.

Description

Uso de un soporte poroso.
La presente invención se refiere a los usos de un soporte poroso.
En la patente EP0598783B (referencia del Agente: P00914PCT(EP)) se describió y reivindicó:
``un método para obtener un artículo refractario poroso compuesto de partículas refractarias, comprendiendo el método las etapas de:
a)
formar una dispersión que comprende partículas en un soporte líquido;
b)
introducir gas en la dispersión;
c)
eliminar el vehículo líquido para proporcionar un artículo sólido que tiene poros derivados de las burbujas;
d)
secar; y
e)
cocer
caracterizado porque la dispersión contiene un material monomérico polimerizable''.
En la Solicitud de patente WO98/15505 (referencia del Agente: P01885PCT) se ha descrito y reivindicado:
``un método para obtener un artículo poroso compuesto de partículas unidas (tales como hidroxiapatita o similar), comprendiendo el método las etapas de:
a)
formar una dispersión que comprende un soporte líquido y las partículas y un material monomérico polimerizable;
b)
formar una espuma de la dispersión;
c)
polimerizar la estructura espumada;
d)
secar la estructura para eliminar el soporte líquido y proporcionar un artículo sólido que tiene poros derivados de las burbujas, y
e)
cocer el artículo para eliminar el aglutinante orgánico y proporcionar una unión cerámica
caracterizado porque se introducen pequeñas burbujas de gas en la dispersión con agitación para formar la espuma, y se deja que coalezcan antes de la polimerarización del material polimérico''.
Más específicamente, en el documento WO98/15505 se ha descrito y reivindicado:
``un método para obtener un artículo poroso, compuesto de partículas unidas, comprendiendo el método las etapas de:
a)
formar una dispersión que comprende un soporte líquido y las partículas y un material monomérico polimerizable;
b)
formar una espuma de la dispersión;
c)
polimerizar la estructura espumada;
d)
secar la estructura para eliminar el soporte líquido y proporcionar un artículo sólido que tiene poros derivados de las burbujas, y
e)
cocer el artículo para eliminar el aglutinante orgánico y proporcionar una unión cerámica
caracterizado porque se introducen pequeñas burbujas de gas en la dispersión con agitación para formar la espuma, y se deja que coalezcan antes de la polimerización, y porque la cocción se lleva a cabo a una temperatura apropiada para el crecimiento de células óseas''.
En la Solicitud de patente GB 0009731.1 (referencia: P02810GB) se ha descrito y reivindicado un método para obtener una espuma cerámica mediante extrusión a baja presión. Los materiales cerámicos de espuma obtenidos mediante ese método son útiles en la presente invención.
Los documentos US 4.293.540 y JP59131346 describen materiales cerámicos porosos implantables, usados para la liberación in situ de fármacos. El documento WO99/16478 describe materiales cerámicos sustitutivos de huesos, que pueden contener un fármaco.
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la estructura de un soporte poroso obtenido mediante los métodos según las Solicitudes anteriores hace al soporte particularmente adecuado para portar un amplio intervalo de materiales, y proporciona control sobre cómo se pueden liberar los materiales portados. El soporte poroso según la invención es como se define en las reivindicaciones.
Según esta invención, en un aspecto se proporciona un soporte cerámico poroso preformado que comprende un esqueleto interconectado que tiene poros, la mayoría de los cuales está en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 1.000 micrómetros, teniendo el soporte una densidad menor que 40% de la teórica, conteniendo los poros un segundo material en ellos, controlándose la velocidad de liberación del segundo material desde el sopor-
te.
Según esta invención, el soporte comprende una red cerámica porosa preformada que comprende un esqueleto interconectado que tiene poros, la mayoría de los cuales está en el intervalo de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 1.000 micrómetros, y una densidad menor que 40% de la teórica. El esqueleto está formado por andamiaje y riostras. La distribución de tamaños de poros es controlable, con tamaños medios de poros en el intervalo de 50 a 800, preferiblemente 60 a 650 micrómetros. El tamaño de poros se optimiza para satisfacer las aplicaciones específicas. Por ejemplo, para la infiltración y vascularización celular general, es adecuado un soporte que tiene poros en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000 micrómetros, mientras que, para el crecimiento interior de células óseas, se prefieren poros en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 micrómetros. El tamaño de poros requerido para la deposición de materiales degradables dentro de los poros requerirá un tamaño más grande de poros, para adecuar el grosor o deposición de una capa. Tal soporte se puede obtener mediante un método según las patentes y solicitudes de patentes citadas anteriormente.
El vehículo tiene una porosidad sustancial y totalmente interconectada a densidades menores que 30% de la densidad teórica. La densidad puede oscilar desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 40%, preferiblemente aproximadamente 30%. Si la densidad teórica es menor que 10% de la teórica, entonces se observa una falta de resistencia, y el soporte se hace friable. Si la densidad teórica supera 40%, la interconectividad puede no ser total, y no pueden lograrse los tamaños de poros. La densidad se determina mediante medida física de masa y volumen. El valor teórico se toma de la bibliografía.
El soporte cerámico puede estar hecho de partículas tales como óxidos y no óxidos. Estos materiales son inherentemente estables al agua, o tienen un revestimiento en la superficie que es estable a las condiciones del proceso. Los materiales que se han usado incluyen alúmina, circón, espinela, carburo de silicio, óxido de estaño, NZP, hidroxiapatita y otros derivados de fosfato de calcio, circonia, kyantie, cordierita y similares. El material cerámico puede ser total o parcialmente reabsorbible cuando el soporte se use con fines médicos. El proceso de reabsorción implica la eliminación de los materiales del implante originales a través de la acción de fluidos corporales, enzimas o células. El fosfato de calcio reabsorbido se puede redepositar, por ejemplo, como mineral óseo, o reutilizar de otro modo en el organismo, o se puede excretar.
Preferiblemente, el soporte cerámico poroso preformado tiene un grado controlado de reticulación. La reticulación debería ser elevada para reducir el gradiente de presión generado en la infiltración, y para minimizar el nivel de defectos asociados con la contracción térmica diferencial al enfriarlo.
La densidad del material cerámico espumado está preferiblemente por debajo de 30%, para asegurar una porosidad sustancial y totalmente interconectada. Mayores densidades pueden ser útiles en circunstancias en las que se requiera un material más denso por razones de resistencia o permeabilidad.
Estos materiales más densos, es decir, de densidad mayor que 30% de la densidad teórica, pero, en el caso de la técnica de espumación basada en la agitación, limitados hasta un máximo de 60%, se pueden aplicar a los materiales menos densos en el estado verde o cocido, para crear gradientes de porosidad a lo largo del artículo poroso. Antes del uso, será necesario cocer el artículo. El grosor de estas capas puede variar para adecuarse a la aplicación.
Se pueden aplicar capas de mayor densidad, hasta completamente densas, al material cerámico espumado en el estado verde mediante técnicas de procesamiento tales como moldeo en gel, moldeo por coagulación. Será necesario cocer el artículo formado antes del uso.
Las proporciones de las dos fases se pueden ajustar fácilmente de forma que el material cerámico espumado constituya el componente principal en volumen del cuerpo formado, o que lo sea la segunda fase, por ejemplo una fase metálica.
La estructura de poros totalmente interconectados permite la penetración profunda de los poros del soporte. El material penetrante puede formar una matriz continua separada, o se puede depositar simplemente sobre las paredes interiores.
El material a introducir en los poros se puede seleccionar de una amplia variedad de materiales. Estos incluyen factores de crecimiento, tales como hormona de crecimiento humana o proteínas morfogenéticas; macrófagos; antibióticos tales como penicilina, tetraciclina, mistatina; vitaminas tales como vitamina D, proteínas tales como polipéptidos, proteínas; hormonas, y similares. Los materiales específicos incluyen:
-
un material de crecimiento óseo
-
FGF (factor de crecimiento fibroplástico)
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IGF-1
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IGF-II
-
PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas)
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TGF-B (factor de crecimiento transformante)
-
BMP-Z (proteína morfogenética ósea)
-
HGH (hormona de crecimiento humana)
-
Concentraciones de factores de crecimiento derivados de seres humanos
Otros ejemplos incluyen por lo menos una célula que es una célula formadora de hueso o que degrada el hueso. Los tipos celulares particularmente útiles incluyen condrocitos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, células madre mesenquimales, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, células parenquimales, células de origen intestinal, células nerviosas, y células de la piel, y se pueden proporcionar como explantes tisulares primarios, preparaciones de explantes tisulares primarios, células aisladas, estirpes celulares, estirpes celulares transformadas, y células hospedantes. El material puede ser también un agente quimioterapéutico o un agente que proteja contra la radiación. Se ha desarrollado un número de sistemas de suministro de fármacos contra el cáncer, de liberación sostenida, que emplean soportes de tipo biomaterial tales como partículas de carbono, éster etílico de ácidos grasos de aceite de semilla de amapola yodados, y coágulo de fibrina, para suministrar agentes quimioterapéuticos a concentraciones elevadas durante períodos prolongados de tiempo y reducir los efectos secundarios sistémicos, y aquellos se pueden incorporar también.
La invención puede proporcionar así un medio para la introducción de un material cerámico biocompatible en el cuerpo humano o animal para proporcionar una fuente localizada de fármacos a una velocidad controlada de liberación para proporcionar un tratamiento más eficaz de diversas enfermedades. En particular, la invención permite un tratamiento más eficaz de cánceres y tumores, y minimiza los efectos secundarios localizando el tratamiento a sitios específicos en el cuerpo para el tratamiento mediante agentes de quimioterapia tales como cisplatino, o el tratamiento mediante radiografía por agentes radioactivos tales como estroncio-67 o samario-153. En algunos casos, se prefiere fijar estos agentes en los poros.
El osteosarcoma es un tumor óseo maligno en el que el tejido óseo normal es destruido, y se produce un osteoide neoplásico mediante estroma fusiforme que prolifera anormalmente. Es un tumor maligno primario habitual del hueso. La quimioterapia coadyuvante, es decir, cirugía seguida de quimioterapia, tal como con antimetabolitos, ayuda a evitar los tumores micrometastásicos y la reaparición local, mientras que permite el crecimiento óseo continuado como resultado de su selectividad por células neoplásicas. Los antimetabolitos son agentes que interfieren con el metabolismo normal debido a su similitud estructural con intermedios normales en la síntesis de precursores de ARN y ADN. Sirven como sustratos para enzimas, para inhibir enzimas, o para ambos. Debido a las diferencias en el metabolismo entre las células normales y las células cancerígenas, varios antimetabolitos tienen el potencial para actuar con cierto grado de especificidad sobre células cancerígenas.
El metotrexato (MTX), el análogo 4-amino-10-metílico del ácido fólico, sigue siendo el antifolato más ampliamente usado en quimioterapia contra el cáncer, con actividad documentada frente a leucemia, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, linfoma, cáncer urotelial, coriocarcinoma y osteosarcoma. Esta clase de agentes representa el mejor caracterizado y el más versátil de todos los fármacos quimioterapéuticos en uso clínico. El MTX es un inhibidor de unión fuerte de dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima crítica manteniendo el conjunto de folato intracelular en su forma completamente reducida como tetrahidrofolatos.
El MTX es más activo frente a células que proliferan rápidamente, debido a que los efectos citotóxicos se producen principalmente durante la fase S del ciclo celular. Durante exposiciones más prolongadas al fármaco, se permite que más células entren en la fase sintética de ADN del ciclo celular, dando como resultado un mayor exterminio celular. Además, con períodos más prolongados de exposición al fármaco se potencia sustancialmente la formación de poliglutamato de MTX, incrementando de ese modo la citotoxicidad. Los efectos citotóxicos de MTX también son mayores con concentraciones crecientes de fármaco. Por lo tanto, la citotoxicidad de MTX depende enormemente de la concentración absoluta de fármaco y la duración de la exposición. De este modo, la administración para osteosarcoma se ha usado a dosis elevadas (1-33 g/m^{2}) desde el comienzo de los años 70.
El soporte es aquel que tiene biocompatibilidad, es decir, "la capacidad de un material para comportarse con una actividad biológica específica, o provocar una respuesta apropiada a fin de lograr una función completamente sofisticada y eficaz para una aplicación específica".
El biomaterial debe lograr aceptación, reconocimiento biológico, y una incorporación adecuada, y debe ser bioactivo en lugar de ser absolutamente inerte. Esto ha conducido al desarrollo de la "segunda generación" de biomateriales que están siendo diseñados específicamente con el objetivo de que el biomaterial provoque una respuesta específica positiva a partir de células y tejidos específicos en el sitio de implante en el cuerpo. De este modo, pueden potenciar la estimulación de osteoblastos a fin de depositar rápidamente matriz ósea mineralizada sobre la superficie o en proximidad cercana a prótesis recientemente implantadas y lograr una mejor osteointegración. Uno de tales biomateriales que posee estas propiedades es el material cerámico de fosfato de calcio hidroxilado o hidroxiapatita (HA).
La HA es un material biocompatible, bioactivo, que provoca una baja respuesta inmunógena. La HA también posee propiedades oseoconductoras, es decir, la capacidad para fomentar el crecimiento óseo directamente a lo largo o aproximadamente su superficie cuando se coloca en la vecindad de hueso viable o células formadoras de hueso diferenciadas. Además, puede permitir el crecimiento de un borde de avance de callo de cicatrización proporcionando una red de soporte mecánico sobre la que puede crecer nuevo hueso. Desde hace tiempo se ha demostrado que las estructuras cristalinas de HA sintética y el componente inorgánico del hueso, el mineral óseo, son sorprendentemente similares, y se ha demostrado que se forma una unión no mecánica de resistencia significativa entre HA y el hueso. Esta característica ha conducido a un gran interés en su uso potencial como un biomaterial para la reparación de defectos óseos, ya que permite la unión química directa del hueso, es decir, promueve la deposición ósea sobre la superficie.
A pesar de estas propiedades interesantes y útiles, todavía existe diferencia biomecánica y mal comportamiento mecánico de estos materiales, debido a la mala capacidad de la HA para soportar cargas. De este modo, la utilización clínica se ha limitado a aplicaciones en las que los materiales cerámicos de fosfato de calcio confieren bioactividad sobre implantes casi inertes (por ejemplo, revestimientos sobre prótesis metálicas), o en defectos que se producen en áreas que soportan menos peso, por ejemplo aplicación maxilofacial.
Además de estas propiedades promotoras del hueso, la HA es capaz de adsorber fácilmente factores biológicos, y posiblemente compuestos químicos, sobre su superficie. Dependiendo de la estructura de la molécula y la química de superficie de la HA particular, esta adsorción se puede producir mediante adsorción física y adsorción química. La cantidad del compuesto químico adsorbido puede corresponder a varias monocapas sobre la superficie.
La HA puede lograr propiedades bioactivas superiores con su presencia sola o en combinación con agentes que influyen sobre los tejidos, adsorbidos sobre su superficie, para ser liberados en el organismo a concentraciones terapéuticas, por ejemplo antibióticos y agentes anticancerígenos. Sus aplicaciones diana serían fomentar la restauración y reparación de la función tisular (por ejemplo del tejido óseo), y desarrollar una interacción bioactiva en un estado de equilibrio estable (por ejemplo oseointegración potenciada), manteniendo la actividad natural de células y tejidos circundantes en su entorno (por ejemplo de células óseas), destruyendo al mismo tiempo tejidos indeseados tales como células neoplásicas o bacterianas.
Es una característica de esta invención de que, cuando HA está presente como un soporte definido anteriormente, se obtienen las ventajas requeridas.
El objeto de un sistema de suministro de fármacos es lograr una dosis local óptima en un sitio deseado específico. Convencionalmente, la administración del fármaco (ya sea oral o intravenosamente) se realiza en zonas alejadas de su tejido diana, y de este modo la cantidad de fármaco y la duración de la biodisponibilidad no se pueden controlar independientemente y el fármaco es libre para difundirse por todo el cuerpo, lo que puede dar lugar a problemas y complicaciones sistémicos. Estos sistemas están dirigidos a incrementar la biodisponibilidad de fármacos y factores, y por tanto a permitir una acción más eficaz y controlada a lo largo del tiempo en sitios específicos. A menudo, la liberación controlada se ha comparado con un patrón de liberación bifásico en el que se logra una liberación rápida durante una fase temprana, seguido de una liberación sostenida más lenta durante la fase tardía.
Experimentos realizados hasta la fecha como parte de esta invención han demostrado la eficacia de la HA para suministrar antibióticos y tratar el hueso tras el legrado del hueso infectado. Igualmente, los bloques de HA cargados con agentes quimioterapéuticos podrían ser útiles para rellenar injertos tras el legrado de tumores óseos. Este sistema logrará los efectos óptimos de la quimioterapia exponiendo el tumor a una concentración elevada de un agente anticancerígeno durante periodos de tiempo prolongados para reducir la proliferación de y exterminar todas las células tumorales locales. Según esta invención, se postula que la liberación localizada y sostenida se puede lograr más fácilmente mediante el uso de una estructura de HA porosa entrelazada que tenga la capacidad para adsorber sustancias sobre su superficie. La estructura porosa permite una mayor área superficial para que el fármaco se adsorba sobre ella y de este modo se libere en el cuerpo mediante desorción. Los fármacos pueden ser cualesquiera de los enumerados anteriormente, y otros, por ejemplo polímeros de poli(ácido láctico/glicólico), PEMfTHFMA, gelatina y cola de fibrina.
La administración local vía HA es factible y eficaz para el control local de tumores óseos y de tejidos blandos, por razones de una administración más segura del fármaco, una evaluación más fácil del efecto quimioterapéutico, una prevención de la reaparición local y una baja frecuencia de efectos secundarios sistémicos.
Además, un soporte de HA según la invención muestra una excelente biocompatibilidad y propiedades mecánicas y químicas similares al hueso, permitiendo la incorporación y vascularización tisular. Confiere propiedades oseoconductoras y oseoinductoras actuando como un injerto óseo, o como un revestimiento de implante que evita la necesidad de sitios donantes, lo que frecuentemente provoca morbilidad de los pacientes. Estas propiedades permiten que los osteoblastos migren y crezcan sobre el revestimiento poroso del implante, creando una unión de interbloqueo que limita el movimiento entre el implante y el hueso, y que por lo tanto potencia la estabilidad protésica, a la vez que el fármaco liberado realiza su acción quimioterapéutica.
Por tanto, según la invención, la HA impregnada con agentes quimioterapéuticos se puede usar tras cirugía tumoral para rellenar defectos en áreas que no soportan peso, tales como en los lóbulos frontal, occipital del cráneo, el maxilar superior y la mandíbula de la cara, o en áreas que soportan peso cuando se incorpora sobre una prótesis en tratamiento de rescate de un miembro.
El MTX se puede usar como un agente anticancerígeno en bloques de HA debido a su eficacia demostrada frente a osteosarcoma, a la facilidad de detección en comparación con otros agentes anticancerígenos, y a su relativa selectividad por células neoplásicas. Además de examinar la cinética de elución de un complejo de HA-MTX, también se han evaluado los efectos citotóxicos de una concentración y tiempo de exposición aumentados (por encima de la duración sistémicamente administrada de 24 a 42 horas) sobre células de osteoblastos y dos células de osteosarcoma, a fin de evaluar si un tiempo de exposición y una concentración incrementados de MTX sería más eficaz tratando osteosarcoma pero no afectaría a la proliferación de osteoblastos. Esto se estudió debido a que el MTX es uno de los pocos agentes quimioterapéuticos en los que los estudios han indicado selectividad por células neoplásicas, una relación de efecto con la concentración y de efecto con el tiempo. La idea de este sistema de MTX-HA es proporcionar una concentración y un tiempo de exposición incrementados, con un efecto mínimo sobre otro tejido; de este modo, estas propiedades de MTX se deben de demostrar a fin de validar el sistema de HA-MTX para uso potencial en la práctica clínica.
El soporte puede contener en sus poros otros materiales distintos de los fármacos enumerados anteriormente. Tales otros materiales incluyen complejos de coordinación de tipo Wemer (por ejemplo sales de hexaamincobalto (III), sales de tris(fenantrolina)hierro (II), cisplatino, carboplatino y oxaliplateno, complejos de edta), complejos macrocíclicos (por ejemplo metaloporfirinas), metalocenos y complejos de tipo sándwich (por ejemplo ferroceno y titanoceno), y complejos organometálicos (por ejemplo metilcobalamina).
Preferiblemente, el control se ajusta para ralentizar la velocidad de liberación.
El control se logra colocando el segundo material en un soporte degradable, por ejemplo un soporte biodegradable tal como colágeno o un polímero o similar. Los polímeros biodegradables específicos en el contexto incluyen PCPP.SA (poli(carboxifenoxi)propano-ácido sebácico, PCC, CPP.SA, FAD-SAPTMC, PAA, y similares. En términos generales, son adecuados los polianhídridos, poliortoésteres, polilactidas y poliglicolidas, y sus copolímeros.
El uso de un soporte intermedio degradable es atractivo debido a que es tan versátil de forma que el depósito se puede estratificar de diferentes maneras, por ejemplo:
\bullet
alternando capas de resina o polímero libre de agente, y capas que contienen agente;
\bullet
variando la concentración de agente a lo largo de las diferentes capas de resina o polímero.
\vskip1.000000\baselineskip
Un soporte se puede rellenar de diferentes maneras, usando vacío, o presión, o ambos. Estas capas se pueden formar mediante impregnación secuencial simple, humectación incipiente u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica, si se requiere una distribución homogénea por todo el cuerpo. Se pueden usar otras técnicas si se requiere una distribución heterogénea. Por ejemplo, usando una técnica de impregnación centrífuga, se puede concentrar una capa específica en las secciones más externas del material cerámico espumado. Las capas se pueden formar de manera mecánica insertando piezas de espuma con un agente o fármaco específico en una espuma que contiene otro agente o fármaco. También se prefiere la liofilización.
Los fármacos se pueden liberar a dosis precisas en el cuerpo. Para impregnar el artículo poroso, se usará bien un monómero biodegradable que incorpora concentraciones conocidas de fármaco, y después se polimerizará, o bien se usará un polímero que incorpora los fármacos.
La superficie geométrica externa y/o la superficie de los poros interiores se puede revestir con polímeros biodegradables que incorporan fármacos, o más específicamente, agentes anticancerígenos. Estos polímeros pueden rellenar los espacios vacíos dentro del artículo poroso, y pueden actuar como un depósito para los agentes de liberación lenta. Como se ha indicado, las capas se pueden formar de forma que capas individuales tengan funciones diferentes. Por ejemplo, la primera capa puede contener factores de crecimiento, la segunda capa es polímero puro, la tercera capa puede incorporar factores antitumorales tales como cisplatino. Cada capa puede tener velocidades diferentes de biodegradabilidad, cambiando la naturaleza del polímero, de forma que se controlen y sean predecibles las velocidades de liberación de los diversos agentes.
Aunque el artículo de esta invención se puede conformar para cualquier uso, se prefiere que se conforme para la sustitución, por ejemplo
ortopédica
maxilo-facial, o
craneofacial
o similar.
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Tales injertos se pueden usar, por ejemplo, para:
\bullet
sustituir segmentos óseos tras la cirugía
\bullet
rellenar grandes pérdidas de hueso, tras trauma o infección
\bullet
reparar o reconstruir articulaciones dañadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, un artículo de la invención se puede situar en el cuerpo en otras localizaciones, por ejemplo sitios intramusculares, sitios interperitoneales, sitios subcutáneos, sitios del sistema nervioso central, y sitios oculares.
El material cerámico poroso se puede conformar de forma que se puedan colocar insertos de material cerámico denso, tal como alúmina o quizás metales, en lugares donde quizás se requiera una mayor resistencia mecánica del implante en situaciones que eventualmente soportan carga. El inserto cerámico o de metal se puede exponer en una o más de las superficies externas del material cerámico espumado, o se puede encerrar dentro de una cubierta de material cerámico espumado. El grosor de esta cubierta puede ser típicamente de 1 mm a 10 mm, pero no está limitado a este intervalo. Como alternativa, el material cerámico espumado puede ser el inserto contenido en un material cerámico denso o un metal.
A fin de que la invención se entienda bien, ahora se describirá a título ilustrativo con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo I
Materiales de HA porosos fabricados mediante un método según la invención que produjo un material cerámico poroso interconectado con una maximización de la resistencia mecánica introduciendo macroporos en una matriz densificada según las patentes de Dytech anteriores. Estos están disponibles bajo el nombre comercial HI-POR®. No se introdujeron impurezas durante el proceso de formación. Aunque la composición química del producto acabado es la misma que la de los productos de HA ya en el mercado, se produce mediante una técnica que permite una estructura física única. Las muestras de HA porosas se fabricaron como cilindros (aproximadamente 13 mm de diámetro por 6 mm). En el estudio se usó un tipo de HA que consiste en una densidad de poros de 18% y un tamaño medio de poros de 300 \mum.
Las muestras de HA porosas solas se denominan como discos, y una vez están cargadas con fármacos, tales como MTX para el suministro, se denominan como "sistemas".
El MTX (David Bull Laboratories, Onco-Tain a 25 mg/ml) fue una preparación clínica que contiene metotrexato B.P. 25 mg, cloruro de sodio B.P. 0,49% p/v de hidróxido sódico. El MTX se almacenó a 4ºC.
Después se mezclaron 4 ml de MTX a 25 mg/ml con 46 ml de disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Sigma-D8537), y se mezcló a conciencia para obtener una mezcla homogénea. Se tuvo cuidado de no exponer el MTX a la luz directa, puesto que ésta puede alterar su composición química.
Se colocaron cada una de 48 unidades de HA de 300 \mum de tamaño de poros y 18% de densidad en recipientes Bijou de 7 ml (Sterilin, número de catálogo 1298), y se añadió a cada unidad 1 ml de la mezcla de MTX/PBS, y el Bijou se cerró con tapones. Las muestras completamente sumergidas se cargaron entonces de cuatro formas diferentes.
Absorción simple
El primer método implicó cargar mediante absorción simple una disolución de MTX, permitiendo la distribución pasiva a intervalos a través de los poros que se interconectan. Esto se realizó colocando 18 discos en una disolución de MTX en una incubadora ajustada a 37ºC. Después se retiraron 6 unidades tras 1 hora en MTX, las siguientes 6 se retiraron tras 3 horas, y las 6 finales se retiraron después de 6 horas.
Impregnación por vacío
La carga mediante vacío se realizó colocando 18 unidades en una cámara de vacío (Angil Scientific, Cambridge, Inglaterra, no -1506), con las tapas de los recipientes Bijou sueltas. Entonces se puso en marcha el vacío a una presión de 150 mbares, creando así una presión negativa en el recipiente y permitiendo la extrusión del MTX a través de los macro y microporos de las unidades. 6 muestras se retiraron del MTX tras 1 hora en el vacío, 6 unidades se retiraron después de 2 horas, y 6 unidades después de 4 horas.
Centrifugación
Esto implicó colocar 6 unidades en sus recipientes Bijou, con las tapas fuertemente cerradas. Cada recipiente Bijou se colocó en un tubo cónico de polipropileno de 50 ml Blue Max (Becton Dickinson 30 x 115 mm). Cada tubo cónico se cerró fuertemente y se colocó en una centrifugadora (Centra-3, Damon/IEC, Bedfordshire, Inglaterra, no-23670102) a 1.000 rpm durante 1 hora. Cada tubo cónico se contrapesó mediante otra muestra contenida en un tubo cónico.
Liofilización
Esta implicó la eliminación de las tapas de los recipientes Bijou de 6 unidades, y la colocación en un liofilizador (Modulyo, Edwards, modelo no -165005) a -60ºC y 8 mbares de presión. Todas las muestras se colocaron durante aproximadamente 24 horas y se retiraron. Todos los sistemas se retiraron de los recipientes Bijou, y se les dejó secar al aire toda la noche en condiciones asépticas.
Una vez que las muestras estuvieron secas, se pudo realizar el estudio de elución. Este proceso implicó la adición del eluato, 5 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y 5 ml de disolución salina tamponada con un fosfato (PBS) de Dulbecco. Cada sistema se colocó entonces suavemente en un tubo universal usando pinzas para mantener las muestras estériles y evitar cualquier movimiento brusco que pueda haber eliminado cualquier MTX cargado. La mitad de los sistemas de cada técnica de carga se añadieron cada uno a 5 ml de medio y los otros 14 y los otros 24 a PBS.
Entonces los 48 sistemas se colocaron todos sobre rodillos, que se inclinaron a fin de sumergir completamente todos los sistemas en el eluyente. Los sistemas se retiraron entonces bajo una campana estéril y mediante el uso de pinzas estériles, y se colocaron en un tubo universal nuevo que contiene 5 ml de eluyente reciente a 5 puntos de tiempo diferentes -2 h, 4 h, 24 h, 48 h y 168 h. Las 240 muestras que contienen el MTX liberado se analizaron entonces usando técnicas de espectrometría de UV.
Cuantificación de MTX en muestras de elución mediante espectrometría de UV
Los análisis de UV de MTX en las eluciones de las muestras se realizaron a 303 mm usando un espectrómetro Unicam UV4 (Cambridge, Reino Unido). En primer lugar, se realizó una dilución en serie de MTX a partir de 1.000 \mum/ml en PBS y DMEM, a fin de obtener un conjunto de concentraciones conocidas de MTX en las muestras de liberación de fármaco (Apéndice III). Los valores tomados se obtuvieron hasta las concentraciones más bajas que parecieron detectables mediante el espectrómetro de UV, y los valores representados estuvieron dentro del intervalo lineal de los datos de calibración.
Las ecuaciones de las calibraciones obtenidas fueron:
1)
PBS_{1y} = 0,0664_{x} + 0,0044
2)
Medio_{y} = 0,0663_{x} + 0,0074
en las que
_{y} = lectura de absorbancia (nm) y
_{x} = concentración de MTX (\mug/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocó 1 ml de disolución que contiene medio o PBS sin MTX en una cubeta de cuarzo y en el espectómetro de UV como un valor basal. Entonces se colocó 1 ml de los eluyentes en otra cubeta de cuarzo, y se midió la lectura de la absorbancia frente a este valor basal. Las lecturas de la absorbancia se introdujeron entonces en las ecuaciones 1 ó 2 para obtener las concentraciones de MTX.
Algunas lecturas de absorbancia fueron mayores que las porciones lineales de las curvas de calibración, es decir, mayores que 2,079 nm para PBS, y mayores que 1,040 nm para el medio. De este modo, en estas muestras se realizó una dilución 1 en 5 para obtener lecturas en la curva de calibración. Estas muestras fueron principalmente aquellas que se tomaron después de 2 horas. Los resultados de las concentraciones de liberación de los sistemas usando las 4 técnicas diferentes se tabularon entonces y se usó la prueba de Tukey Kramer de Diferencia Honradamente Significativa (TKHSDT) para determinar cualesquiera diferencias significativas entre las cantidades que existieron.
Cultivo celular in vitro
Se usaron dos estirpes celulares de osteosarcoma y osteoblastos humanos primarios en los estudios de cultivo celular del efecto de la concentración de MTX y tiempo de duración incrementados. Las células MG63 se obtuvieron de un varón caucásico de 14 años (ATCC- CRL-1427). Las células de tipo osteosarcoma humano (HOS) se obtuvieron de una hembra caucásica de 13 años (ATCC- CRL-1543). Las células de tipo osteoblasto humano (HOB) se aislaron de pacientes que sufren artroplastia total de rodilla. Las estirpes celulares se cultivaron cada una en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) completo (Gibco, Reino Unido), suplementado con suero fetal de ternera al 10% (FCS) (Gibco, Reino Unido), aminoácidos no esenciales (1%), ácido ascórbico (150 \sim g/ml), L-glutamina (0,02 M), HEPES (0,01 M), penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 \sim g/ml), a 37ºC y 5% de CO_{2} en una atmósfera estéril humidificada al 99%. El medio se cambió por lo menos dos veces a la semana para evitar el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de productos de deshecho.
Una vez que las células fueron confluentes, se eliminaron vaciando el medio, lavando con 10 ml de PBS y añadiendo 5 ml de Tripcina al 0,25%, e incubando a 37ºC. Después de 5 minutos, la capa celular se retiró del matraz de cultivo tisular golpeando el matraz sobre una superficie sólida. Los contenidos se recogieron entonces en un tubo universal, y el matraz se lavó con 10 ml de medio, que también se colocó en el tubo universal. El recipiente se centrifugó entonces a 2.000 rpm durante 5 minutos a 18ºC, después de lo cual se eliminó el sobrenadante que contiene tripsina, teniendo cuidado de no descargar el pelete de células en el fondo del recipiente. Después, las células se contaron en un microscopio de luz, y se obtuvieron concentraciones de 13,2 x 10^{4} células/ml. Estas se sembraron entonces en placas de 96 pocillos. En total se sembraron 6 placas, conteniendo 2 placas una de las tres estirpes celulares, con el fin de medir la proliferación celular.
Cada placa se dejó incubar durante 2 días, y después se añadieron a cada placa 12 concentraciones variables de MTX. Aunque las dosis de MTX se dan en mg/m2 BSA, no fue posible usar tal índice para calcular la dosificación apropiada en este estudio. Por lo tanto, fue necesario averiguar la concentración de las dosis tendrían en el plasma de una persona media. Esto implicó encontrar la proporción del peso corporal que es fluido. El volumen intravascular representó aproximadamente el 60% del peso corporal. Por lo tanto, puesto que 1 kg es aproximadamente igual a 1 litro, un paciente de 70 kg tiene un volumen intravascular de 42 litros. Por lo tanto, el volumen de 1 m^{2} de fluido de BSA es:
42 litrosII.73 m^{2} = 24,3 litros
La dosis recomendada de BNF para una terapia con un único agente de MTX (mg/ml) es 600.
De este modo, en esta terapia se obtiene la siguiente concentración plasmática:
600 mg/24300 ml
= 0,0247 mg/ml
= 24,7 \mug/ml
Esta concentración inicial cae a medida que es eliminada en el cuerpo; sin embargo, algunos estudios realizados han usado dosis de hasta 2,3 veces este valor. De este modo, las concentraciones usadas oscilaron por encima y por debajo de 24,7 g/ml, oscilando desde 0,1 \mug/ml hasta 1.000 \mug/ml. Se les suministró a tres placas, una placa con cada estirpe celular, MTX durante una exposición de 24 horas (1 día), y se les suministró a las otras dos placas durante una exposición de 72 horas (3 días) para observar las diferencias en la proliferación celular con concentraciones variables y tiempos de exposición incrementados.
Ensayo de MTT
Los efectos de MTX sobre la proliferación de células de osteosarcoma se midieron mediante el ensayo de MTT. Los reactivos requeridos para este ensayo fueron polvo de MTT (sigma M2128 o M5655), dimetilsulfóxido DMSO (sigma D2650), y disolución salina tamponada con fosfato (PBS). El medio se eliminó de los pocillos. La disolución de MTT se obtuvo añadiendo 50 mg de MTT a 10 ml de PBS en un tubo universal, el cual se calentó a 37ºC durante 15 minutos. La disolución se filtró entonces, y se añadieron a cada pocillo 10 \mu de MTT y se devolvieron al incubador durante aproximadamente 3 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} y 99% de humedad (los detalles sobre la función y acción de MTT se pueden encontrar en el Apéndice II). El MTT se eliminó mediante inversión y coagulación sobre papel de tejido. Seguidamente, se añadieron 100 \mul de DMSO a cada pocillo, y se agitó durante 1 minuto. Entonces se leyó la absorbancia de cada pocillo mediante un lector de microplacas Dynatech (BioRad modelo 3550), a una longitud de onda de 595 nm y un tiempo de mezclamiento de 5 segundos. Estas muestras no se pudieron reutilizar y por lo tanto se desecharon al terminar el ensayo. Una vez se obtuvieron las lecturas, se tabularon y normalizaron como un porcentaje del valor del control. Las lecturas de la absorbancia se analizaron frente a los valores del control mediante una prueba de Dunnetts de significancia al nivel de 5%, a fin de determinar si hubo una diferencia estadísticamente significativa en la proliferación celular a medida que se elevó la concentración de MTX.
Resultados Evaluación de HA como un sistema de suministro de fármacos para MTX
Los resultados mostraron que los diferentes sistemas de HA porosa cargaron MTX con éxito, y liberaron el fármaco anticancerígeno. Las diferencias en los métodos de carga tuvieron efectos significativos sobre las cinéticas de liberación para MTX. Sin embargo, los resultados de las muestras colocadas en el medio proporcionaron lecturas de la absorbancia erráticas y no fiables por el espectómetro de UV, y de este modo no se presentaron gráficamente.
Globalmente, en los sistemas 7 y 8 se observa un patrón de liberación bifásico para el suministro controlado de fármaco; véase la Tabla 1 más abajo. Esto implicó una liberación rápida en la fase temprana, con una liberación sostenida y lenta pero gradual de fármaco en la fase tardía. Los sistemas 1 a 6 de la Tabla 1 no presentaron este patrón, y mostraron un agotamiento inicial rápido de MTX en las primeras 24 horas, con una liberación indetectable en la fase tardía. Los resultados para cada sistema representan un valor medio de 3 réplicas, y los métodos de carga para cada uno de los sistemas se pueden observar más abajo en la Tabla 1.
TABLA 1 Técnicas diferentes de cargar MTX sobre discos de HA
1
Los resultados se muestran en la gráfica de la Figura 1 que se acompaña, que muestra la liberación inicial, y en la Figura 2, que muestra la liberación después de 24 horas.
Este estudio es significativo en relación con un sistema de liberación de fármacos, ya que el tratamiento con MTX sistémicamente es normalmente sólo para 24 a 42 horas, y estudios de intensidad cercana no han mostrado diferencia en la eficacia a medida que se incrementa la concentración. Este estudio está dirigido a observar si la duración de tiempo durante el cual se libera MTX del sistema de suministro de fármacos es de suficiente duración y concentración para proporcionar un mayor beneficio terapéutico incrementando la muerte de las células de osteosarcoma. Además, la estirpe de células HOB se ensayó para observar si la elección del fármaco (MTX) podría ser suficientemente selectiva para células neoplásicas, y no inhibir el crecimiento óseo por células de osteoblastos.
En conjunto, los resultados permitieron la definición de sistemas de materiales óptimamente porosos basándose en perfiles cinéticos de liberación positiva. La elucidación de los métodos óptimos de carga se realizó mediante centrifugación y liofilización, que presentaron la liberación sostenida más prolongada de todos los sistemas. Además, el tiempo de exposición parece que proporciona una disminución significativa en la proliferación celular de por lo menos una de las estirpes celulares de osteosarcoma.
En general, los perfiles óptimos se aproximan a un "modelo bifásico" de liberación controlada (Figura 3). Esto implica una liberación rápida durante la fase temprana, y una liberación gradual, sostenida, durante la fase tardía. Estos perfiles óptimos fueron los discos de HA cargados con MTX mediante centrifugación (sistema 7) y liofilización (sistema 8). Estos se vieron como los sistemas óptimos, puesto que fueron los únicos que mostraron una liberación detectable de MTX dentro del intervalo terapéutico durante un tiempo de hasta 168 horas. Los sistemas 1 a 6 (cargados mediante absorción y vacío) mostraron una liberación inicial elevada, pero ninguna liberación detectable después de 48 horas.
La liberación de un fármaco incorporado en los poros de hidroxiapatita porosa se ha atribuido al grado de macroporosidad y microporosidad, reflejando la densidad aparente (AD) los perfiles de liberación en las etapas tempranas como una función de macroporosidad, y reflejando la densidad real la liberación controlada en las etapas más tardías como una función del nivel de microporosidad abierta. En otras palabras, el porcentaje y tamaño de macroporosidad y el nivel de fármaco cargado portado (MTX) son los factores dominantes en las etapas tempranas, y el fármaco contenido en los microporos es el factor dominante en la liberación del fármaco en la fase II tardía.
El objetivo de este estudio fue determinar el grado en el que las diferentes técnicas de carga podrían cargar el fármaco en los micro y macroporos, y por tanto obtener una liberación sostenida. Puesto que la centrifugación y la liofilización proporcionaron una liberación tardía sostenida, así como una liberación temprana, se deben cargar los micro y macroporos. Una elevada liberación temprana es importante en la terapia contra el cáncer, puesto que esta puede captar y exterminar células cancerígenas que vuelven a aparecer localmente de forma temprana, y una liberación sostenida de fase tardía es importante para mantener el efecto terapéutico. De este modo, la biodisponibilidad del MTX, particularmente con una liberación temprana rápida y una liberación tardía sostenida, puede ser esencial en la terapia contra el cáncer.
Los 8 sistemas ensayados mostraron una liberación inicial elevada. Esta liberación inicial elevada se puede atribuir a un efecto de "eliminación por lavado", en el que el fármaco solidificado incrustado en la superficie se disuelve cuando el sistema se coloca inicialmente en el primer eluyente. El sistema 8 (liofilización) mostró la liberación inicial más elevada después de 2 horas, y muy probablemente es atribuible a la naturaleza del proceso de liofilización. Al final del procedimiento, las muestras se concentraron, con MTX solidificado incrustado sobre la superficie, el cual se puede separar parcialmente mediante golpes, pero aún queda gran exceso de MTX y de este modo éste se disolverá en el primer eluyente.
La velocidad más elevada de liberación después de las primeras 4 horas también fue presentada por el proceso de liofilización (sistema 8). A este le siguió de cerca el proceso de centrifugación (sistema 7), y después el vacío y la absorción (sistemas 1 a 6). Esto se puede haber atribuido a las siguientes razones: el proceso de liofilización puede proporcionar una extrusión inmediata de la disolución de MTX en los poros de la unidad de HA, permitiendo que la disolución de MTX entre en los macroporos, pero el MTX no está en disolución cuando se retira la unidad de HA. De este modo, al retirar el disco de HA, algo del MTX líquido puede salir de los macroporos en los otros sistemas, reduciendo así la carga de fármaco disponible para la liberación inicial. Sin embargo, el sistema 8 no tiene pérdida del MTX desde los macroporos al retirarlo, puesto que ya está solidificado en los poros.
Las diferencias entre las velocidades de liberación inicial de los sistemas 1 a 8 pueden ser atribuibles a la capacidad de cada método para permitir la extrusión a la fuerza eficaz de MTX a través de los macroporos. La centrifugación fue posiblemente la más poderosa, seguido de la liofilización y el vacío, siendo obviamente los menos poderosos los métodos de absorción simple. Las diferencias en tiempos de vacío y tiempos de absorción incrementados son pequeñas, no presentándose grandes diferencias estadísticas mediante el TKHSDT, indicando que la maximización de la carga del fármaco se obtiene tras los primeros puntos de tiempo, es decir, después de 1 hora de absorción y 1 hora de vacío. Las diferencias sutiles se pueden producir como resultado de la variación en el tamaño de los poros, densidad e interconectividad de los poros en los discos de HA, como resultado de ligeras inconsistencias en la fabricación.
Los sistemas de liberación sostenida fueron los sistemas 7 y 8, proporcionando el sistema 7 una mayor velocidad de liberación de la fase tardía. Como se ha mencionado, la liberación de la fase tardía es función de la microporosidad. El hecho de que no hubo liberación de MTX detectada para los sistemas 1 a 6 después de 24 horas indica que el espectómetro de UV fue insensible a las pequeñas cantidades de MTX, o que no entró disolución de MTX en los microporos de los discos de HA. Sin embargo, es probable que algo de la disolución de MTX entró en los microporos, y se pueda haber liberado una pequeña cantidad pero que fuese menor que el umbral de detección y posiblemente menor que el umbral terapéutico de 0,01 \mum.
La velocidad de liberación de la fase tardía sostenida es mayor para la centrifugación, probablemente debido a que la disolución de MTX se hizo girar a 1.000 rpm durante 1 hora, permitiendo que los microporos se llenasen con el fármaco de forma más eficaz que con la técnica de liofilización. Además, la capacidad para extruir un líquido en los microporos de HA puede haber sido adecuada bajo la presión negativa del liofilizador, pero la disolución puede haber solidificado antes o en mitad del proceso de la entrada en los microporos.
Las fuerzas químicas de adsorción directa del fármaco sobre la superficie también pueden desempeñar un papel en la liberación de la fase temprana y tardía. Todos estos métodos no usaron un soporte de suministro de fármacos, tal como gelatina o alginato, y las únicas formas en las que el fármaco puede permanecer unido sobre la superficie de HA es mediante uniones físicas y químicas. La adsorción física de MTX se logra mediante fuerzas de Van Der Waals. Esto permite que varias capas de la molécula de MTX se unan a la superficie de la HA. Los enlaces químicos son más cortos en longitud y mucho más fuertes, y consisten en tipos de enlaces electrostáticos (iónico) y/o covalentes. Este tipo de unión solo permite la formación de una monocapa de la molécula sobre la superficie.
Es probable que el fármaco físicamente adsorbido sobre la superficie de HA contribuya a la liberación temprana a medida que la temperatura se eleva en la habitación caliente (37ºC) en la que se colocan los sistemas, por cuanto los enlaces físicos se rompen liberando cualquier fármaco en los primeros eluyentes. Sin embargo, puesto que los enlaces químicos son mucho más fuertes, es probable que contribuyan en mayor grado a la liberación en la fase tardía. Puesto que la centrifugación parece que ha proporcionado la mayor cobertura de microporos, y por tanto de área superficial, entonces parece razonable sugerir que aquella dio como resultado una mayor cantidad de cobertura de la HA mediante enlaces físicos y químicos. Por lo tanto, la ruptura de estos enlaces dio como resultado la velocidad y cantidad de liberación en la fase tardía del estudio más elevadas que en cualquier otro sistema. Estos enlaces químicos consisten en uniones covalentes e iónicas, pero es improbable que las interacciones covalentes desempeñen un papel en la liberación del fármaco, puesto que la fortaleza de tales enlaces puede no permitir que se desorba el MTX. Los enlaces iónicos pueden ser favorables para la liberación del fármaco, se pueden producir entre iones de calcio y grupos carboxilo, o entre agrupamientos de fosfato y el grupo N-metilo de MTX. También se pueden producir otros enlaces químicos tales como entre grupos hidroxilo de HA y nitrógenos aromáticos, grupos carboxilo, enlaces amida/péptido. También diversas interacciones de tipo quelación entre los iones de calcio y la molécula de MTX mediadas vía combinaciones de varios o más de los siguientes agrupamientos presentes en el fármaco: grupos amida/péptido, grupos hidroxilo, nitrógenos aromáticos, grupos amino libres.
La importancia de que el MTX se adsorba directamente sobre HA es que los revestimientos de HA sobre una endoprótesis en el tratamiento de rescate de un miembro se pueden cargar con MTX, reduciendo así la probabilidad de reaparición local de osteosarcoma.
La liberación acumulativa total más elevada fue presentada por el sistema 8, y parece que se correlaciona con la liberación inicial más elevada después de 2 horas. La cantidad de MTX liberada tras 24 horas y posterior, en proporción a la dosis inicial liberada, es muy pequeña. De este modo, la liberación acumulativa total más grande en los sistemas estaría gobernada principalmente por la cantidad inicial liberada debido al efecto de "eliminación por lavado".
Se encontró que el método óptimo de carga de discos de HA con MTX es mediante centrifugación, seguido de liofilización. Otras propiedades físicas de la HA pueden determinar su capacidad para actuar como un sistema de suministro de fármacos, tales como los tiempos de sintetización alterados (que alteran la interconectividad de los microporos), el tamaño de los poros y la densidad de los poros. Además de estos estudios, se debería de investigar también el efecto terapéutico de MTX tras la adsorción a HA, puesto que la desorción puede dar como resultado una estructura química alterada.
El efecto de la concentración de fármaco y del tiempo de exposición sobre las tres estirpes celulares HOS, MG63 y HOB mostró los siguientes resultados. Todas las estirpes celulares, después de un día de exposición, mostraron una disminución en la proliferación a medida que se elevó la concentración de MTX. Las estirpes celulares menos sensibles fueron las células HOS, que mostraron sólo una pequeña disminución en la proliferación tras la adición de MTX, y solo 4 diferencias estadísticamente significativas de las doce concentraciones de MTX. Después de 3 días de exposición a las mismas concentraciones, las células HOB y HOS mostraron un nivel reducido de proliferación celular, en comparación con las muestras de la exposición de un día. Por el contrario, las células MG63 mostraron un comportamiento errático a medida que se elevó la concentración de MTX. De este modo, estos resultados muestran que ROS y ROB son sensibles a un aumento del efecto citotóxico del tiempo de exposición incrementado de MTX. Esto se puede explicar por el hecho de que se potencia sustancialmente la formación de poliglutamato con periodos más prolongados de exposición al fármaco, incrementando de ese modo la citotoxicidad. Además, parece que a medida que se prolonga el tiempo de exposición el efecto citotóxico fue mínimamente mayor a medida que se elevó la concentración, sugiriendo que el tiempo de exposición es un factor importante y quizás se pueda haber alcanzado un umbral de concentración para la eficacia citotóxica.
MG63 se vio afectada sólo ligeramente a medida que la concentración y el tiempo de exposición de MTX aumentó, lo que puede ser debido a resistencia. Aunque frecuentemente se usa una dosis elevada de MTX en el tratamiento de osteosarcoma, algunas veces la terapia con la dosis convencional puede ser ineficaz. Varios estudios retrospectivos han sugerido que se necesita alcanzar un nivel de MTX pico umbral para obtener una buena respuesta a la quimioterapia/O-53. Esta relación sugiere que el osteosarcoma es intrínsecamente resistente a dosis convencionales de MTX, que se puede superar mediante el uso de dosis extremadamente elevadas. Un mecanismo potencial para la resistencia intrínseca es la disminución del transporte en las células vía el soporte de folato reducido (RFC), lo que podría explicar por qué el tiempo de exposición no tuvo ningún efecto, puesto que quizás se requiere un mayor tiempo para permitir el transporte por medios alternativos, tal como difusión pasiva. Además, las dosis pueden no haber sido suficientemente elevadas para permitir el transporte en las células. Un segundo potencial para la resistencia intrínseca es un resultado de la poliglutamilación alterada, lo que conduce a una falta de retención de fármaco en la célula, inhibiendo su acción.
El MTX es aparentemente muy selectivo para células neoplásicas, pero las HOE se vieron afectadas en grado similar a las células HOS. La razón de esto es que MTX es más activo frente a células que proliferan rápidamente, debido a que su efecto citotóxico se produce principalmente en la fase S del ciclo celular. Durante exposiciones más prolongadas, se permite que más células entren en la fase sintética de ADN del ciclo celular, dando como resultado un mayor exterminio celular. Puesto que las células HOE cultivadas in vitro se dividen rápidamente como las células de osteosarcoma, aquellas se pueden ver afectadas de la misma manera. Esto estimularía el escenario clínico en el que algunas células de osteoblastos no se dividen rápidamente. Por otro lado, estudios in vitro han mostrado sólo una disminución del 30% en la proliferación de células de osteosblastos, en comparación con una disminución de 90% en la proliferación de células de osteosarcoma, a 5 mM de MTX.
Esta investigación demostró que la HA porosa fue capaz de liberar con éxito MTX durante un periodo de 7 días usando dos de los métodos de carga de fármacos. Además, los niveles de fármaco liberado estaban dentro del intervalo terapéutico para el tratamiento de osteosarcoma. Estudios de proliferación celular apoyaron la eficacia terapéutica de un tiempo de exposición al fármaco incrementado en la prevención de la proliferación celular de células HOS. El tiempo de exposición ensayado fue más prolongado que los tiempos permitidos para administrar sistémicamente el fármaco, y dentro del periodo de tiempo que el fármaco se libera a partir de los sistemas de HA estudiados.
De este modo, la aplicación de HA cargada con MTX, como sistema de suministro de fármacos para el tratamiento de osteosarcoma, muestra un gran potencial, y se puede usar en el escenario clínico en áreas que no soportan peso, para rellenar pequeños defectos post-operatorios, por ejemplo, cirugía maxilofacial, y se puede incorporar sobre una prótesis en el tratamiento de recuperación de un miembro, para tratar áreas que soportan carga.
Ejemplo II Absorbancia de perclorato de trisfenantrolinahierro [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} sobre HA
Se exploraron cuatro métodos para la absorbancia de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} sobre HA, usando cada uno bloques de porosidad 83,35 (0006) y dimensiones aproximadas de 20 x 15 x 20 mm, peso 303,5 g. Las disoluciones se prepararon disolviendo [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} (0,031 mmoles) en metanol (30 cm^{3}). Todos los bloques se pesaron en húmedo, y se secaron en un horno a aproximadamente 100ºC durante la noche.
1.
Absorbancia mediante inmersión de HA en una disolución de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} durante 35 minutos.
2.
Absorbancia mediante inmersión de HA en una disolución de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} durante 24 horas.
3.
Absorbancia colocando HA a vacío durante 10 minutos antes de la inyección directa de una disolución de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} sobre el bloque, y manteniendo el vacío durante otros 30 minutos.
4.
Absorbancia mediante inmersión de HA en una disolución de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} y la aplicación de un vacío durante 35 minutos.
La cantidad de disolución absorbida por los bloques osciló entre 2,7-3,5 g, y las mayores cantidades se observaron para los métodos que usan vacío. (La exactitud de la pesada está limitada debido a la evaporación del disolvente).
La penetración observada en los bloques fue pequeña en todos los casos, con un gran grado de absorción superficial. La mejor penetración se observó para los bloques cargados según el método 2, es decir, inmersión prolongada.
Lixiviación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} a partir de bloques de HA preparados según el método 3
Lixiviación con agitación de las disoluciones para evitar inexactitudes debido a gradientes de concentración. (Según los presentes montajes, sin embargo, se pueden producir anomalías por el choque ocasional del bloque con el seguidor magnético).
La mitad del bloque preparado en el método 3 se sumergió en agua destilada (30 cm^{3}), y la absorbancia se registró mediante espectrometría de UV-Vis a una longitud de onda de 512 nm. En todos los cálculos se usó un coeficiente de extinción de 10.620 mol^{-1} dm^{3} cm^{-1}.
La gráfica a continuación muestra la cantidad de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} liberada desde el boque, a lo largo del tiempo.
2
La gráfica muestra dos fases que probablemente corresponden a la liberación inicial de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} absorbido sobre la superficie, seguido de la liberación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} desde el interior del bloque. Casi todo el [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} se libera a partir del bloque después de 170 minutos. Tras 330 minutos, la disolución se sustituye por agua destilada, y se mide la absorbancia después de otras 20 horas. La lectura reveló la liberación de otros 0,14 mg desde el bloque; esto puede ser debido a la liberación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} que estaba en el interior del bloque cuando el sistema alcanzó el equilibrio durante los primeros 330 minutos.
Ejemplo III Uso de poli(DL-lactida-co-glicolida) para ralentizar la liberación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2}
Puesto que el polímero biodegradable poli(DL-lactida-co-glicolida) (pLG) no es soluble en metanol, se usó acetonitrilo para los siguientes experimentos.
Carga
Para cargar los compuestos sobre HA, se usó el método 3 de vacío; nuevamente se usaron bloques de porosidad 83,35% (0006) con dimensiones aproximadas, 20 x 20 x 15 mm, de 3,6-3,8 g de peso. Para el bloque de control con sólo [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} (0,01 g, 0,013 mmoles en 6 cm^{3} de acetonitrilo), se observó buena penetración en el bloque. Para el bloque cargado con [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} (0,01 g, 0,013 mmoles) y PLG (50:50) (200 mg en 6 cm^{3} de acetonitrilo), se observó menos penetración, pero la distribución fue más uniforme. Nuevamente, los bloques se secaron en el horno. (A fin de disolver completamente el polímero en acetonitrilo, antes de la carga se requiere una agitación durante un tiempo de hasta 1 horas).
Lixiviación
Todos los experimentos de lixiviación se llevaron a cabo usando las mitades de corte de los bloques cargados con agua destilada (30 cm^{3}) y agitación constante. Los experimentos de lixiviación iniciales mostraron que los bloques impregnados con el polímero flotaban, necesitando lastre usando varillas de vidrio. Esta flotabilidad es debida probablemente al polímero que bloquea los poros en la HA, atrapando aire en el interior del bloque. Además, estos experimentos revelaron que las lecturas se deben de tomar a lo largo de un número de días, puesto que se requiere un sistema cerrado para evitar la evaporación del agua, que conduce a inexactitudes. Nuevamente, la absorbancia se registró a \lambda 512 nm a intervalos apropiados.
3
Lixiviación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2}
Aproximadamente todo el [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} se liberó después de 300 minutos. Se tomaron lecturas adicionales después de 24 horas, y la absorbancia observada disminuyó. Después de otras 48 horas, se observó la desaparición casi completa de color. Esto puede ser debido a la hidrólisis de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} por el bloque de HA.
Lixiviación a partir del bloque impregnado con [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} PLG (50:50)
4
Cuando el bloque se sumergió primero en el agua, se observaron burbujas en la superficie del bloque, además de la flotabilidad observada: esto indica atrapamiento de aire en el bloque. Después de 24 horas, el bloque ya no flotaba, lo que puede indicar penetración del agua en el bloque. Los resultados muestran que la impregnación de PLG en el bloque ralentiza significativamente la liberación de TrisFenHierro. La liberación de cantidades adicionales de complejo se observó incluso después de 5 días.
La cantidad de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} absorbido sobre HA aumentó mediante la aplicación de vacío durante la carga. La penetración incrementada se observa cuando se usa acetonitrilo como el disolvente, en lugar de metanol.
La liberación de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} a partir de HA transcurre mediante un estallido inicial (debido a la liberación del complejo desde la superficie del bloque), seguido de una fase más lenta (liberación del complejo desde el interior del bloque). La liberación en conjunto es rápida, liberándose la mayoría del complejo después de 300 minutos. La impregnación de HA con una mezcla de [Fe(phen)_{3}][ClO_{4}]_{2} y PLG ralentiza drásticamente la liberación de [Fe(phen)_{3}]
[ClO_{4}]_{2}, observándose una liberación continuada del complejo incluso después de 5 días.
Ejemplo IV Impregnación de HA con el fármaco anticancerígeno cisplatino
Usando el método 3 de vacío, se inyectó cisplatino (0,025 g, 0,08 mmoles), en una disolución acuosa de cloruro de sodio (50 cm^{3} de una disolución al 0,9% en peso), sobre un bloque de HA de porosidad 84,04% (0003), dimensiones 21 x 23 x 15 mm, peso 4,2 g. Después de secar, sobre la superficie del bloque se observaron parches de color amarillo, que se supone que son de cisplatino. No se observó ningún color amarillo dentro del bloque.
Lixiviación
Los experimentos de lixiviación se llevaron a cabo en agua destilada (35 cm^{3}) con agitación, en ausencia de luz, y de forma cerrada para evitar la evaporación. La absorbancia se registró a \lambda 206 nm a intervalos apropiados, y todos los cálculos requirieron el coeficiente de extinción 3.057 mol^{-1} dm^{3} cm^{-1}.
5 
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La liberación de cis-platino es rápida -casi todo el fármaco se liberó después de 45 minutos. La liberación rápida del fármaco puede indicar que no se produce penetración en el bloque, y que el fármaco está siendo liberado simplemente desde la superficie del bloque.
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Ejemplo V Uso de poli(DL-lactida-co-glicolida) para ralentizar la liberación de cis-platino
Puesto que PLG no es soluble en agua, y el cis-platino no es soluble en acetonitrilo, se llevó a cabo un programa de carga en dos fases. Usando el método 3 de vacío, inicialmente se cargó cis-platino (0,025 g, 0,08 mmoles) en el bloque en una disolución acuosa de cloruro de sodio (50 cm^{3} de una disolución al 0,9% en peso). Después de secar el boque en un horno toda la noche, se usó nuevamente el método de vacío para inyectar una disolución de PLG (85:15) (0,105 g) en acetonitrilo (50 cm^{3}). Nuevamente, el bloque se secó en el horno toda la noche.
Conclusión
La liberación de cis-platino a partir de HA es también rápida, liberándose la mayoría del fármaco tras sólo 45 minutos.
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Ejemplo VI Liberación del agente anti-inflamatorio prednisolona a partir de HA
Se realizaron experimentos de dilución en serie para obtener la siguiente gráfica y ecuación de calibración para la prednisolona.
6
Durante la preparación de disoluciones para cargarlas en los discos de HA (esto implica agitar las disoluciones/suspensiones de fármaco/polímero durante una hora y ocasionalmente sumergirlas en un tanque sónico durante 30 segundos), se descubrió que la prednisolona se disuelve en acetonitrilo. Por lo tanto, se debería de tener claro que la siguiente técnica no fue una cargada en suspensión.
Para estos experimentos se usaron cuatro discos de HA procedentes del segundo lote. En cada una de las disoluciones en acetonitrilo se usaron aproximadamente 0,01 g de prednisolona. Los experimentos se etiquetaron 1AA, 1BB, 1CC y 1DD. 1AA y 1BB se cargaron mediante centrifugación, y 1BB contenía 0,1 g de PLG (50:50). 1CC y 1DD se cargaron usando la técnica de vacío, y 1DD contenía 0,1 g de PLG (50:50). Se llevaron a cabo experimentos de lixiviación estándar, y los resultados se presentan a continuación.
7
Los resultados muestran que, en presencia de polímero, se ralentizó la liberación de prednisolona a partir de HA. Las dos gráficas siguientes muestran la liberación acumulada del fármaco a partir de HA.
8 
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Ejemplo VII
Estratificación de los agentes terapéuticos en discos de HA
Inicialmente, la liberación de MTX a partir de HA usando el polímero PLG (75:25) se llevó a cabo para establecer si este polímero {que se espera que se degrade a una velocidad más lenta que PLG (50:50)} indujo una velocidad ralentizada de la liberación de MTX. Para el experimento se usaron discos de HA procedentes del segundo lote, y se usaron aproximadamente las mismas cantidades de MTX, PLG y acetonitrilo. El experimento se etiquetó según lo siguiente; IA y IB se cargaron mediante centrifugación, y IB contiene polímero; IC y ID se cargaron mediante la técnica de vacío, y ID contiene polímero. Se obtuvieron los siguientes resultados.
10 
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Los resultados confirman que la presencia de PLG (75:25) ralentiza la liberación de MTX a partir de HA. Sin embargo, este efecto no parece que sea mayor para PLG (75:25) que para PLG (50:50).
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A pesar de estos resultados que indican que este polímero no fue eficaz disminuyendo adicionalmente la velocidad de liberación de MTX a partir de HA, la observación de los discos al terminar el experimento indicó que todavía había cantidades adicionales de MTX atrapadas en el disco que se habían cargado en presencia de polímero. Esto indica que se puede liberar más MTX después de la degradación posterior del polímero.
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Ejemplo VIII
Carga de HA con dos fármacos diferentes incorporados en los polímeros
Cuatro discos de HA procedentes del segundo lote se cargaron primero con suspensiones de MTX cargadas en acetonitrilo, conteniendo dos el polímero PLG (75:25). Se usaron ambas técnicas, de centrifugación y de vacío, como se describió previamente. Los discos se dejaron secar entonces en aire, y se cargaron subsiguientemente con disoluciones que contienen prednisolona en disolución, nuevamente conteniendo dos de las disoluciones un polímero, en este caso PLG (50:50). En este punto se identificó un problema potencial: para los dos discos cargados en presencia de polímero, tras cargar la prednisolona, las disoluciones que quedan tras la carga tuvieron un color amarillo pálido, indicando la liberación de algo de MTX durante el proceso de carga. Esto es consistente con que las segundas disoluciones (acetonitrilo) disuelvan algo del polímero original (PLG (75:25)) en los discos y den como resultado la liberación de algo de MTX. Se anticipa que la lixiviación a partir de estos discos da como resultado la liberación simultánea de ambo fármacos. Para logar el estratificado eficaz de los fármacos sobre HA, se propusieron dos vías de investigación. La identificación de una variedad de polímeros biodegradables solubles en diferentes disolventes puede permitir la estratificación de los fármacos, o, como alternativa, puede ser exitosa la inyección de disoluciones de polímero en diferentes áreas de los bloques de HA.
Conclusión
Las múltiples repeticiones de liberación de MTX en presencia o ausencia de PLG (50:50) no fueron concluyentes, probablemente debido a la degradación de MTX y/o del polímero.
La lixiviación de MTX (con PLG (50:50) en algunos discos) a partir de HA, con el pesado de los discos, mostró una tendencia similar según se observa para el experimento original con la presencia de PLG (50:50) que muestra una velocidad de liberación más lenta de MTX en comparación con la ausencia de polímero. A periodos de tiempo más tardíos, la liberación de MTX en presencia de polímero es mayor cuando se compara con los discos cargados en ausencia de polímero.
La liberación de los fármacos cis-platino y prednisolona a partir de HA también se ralentiza por la presencia de PLG (50:50).
La lixiviación de MTX (con PLG (75:25) en algunos discos) a partir de HA no parece que muestre una velocidad de liberación más lenta que para PLG (50:50); sin embargo, la observación de los discos al terminar los experimentos de lixiviación indica la presencia de cantidades adicionales de MTX. Cuando se aplica una segunda disolución de polímero/fármaco, se observa cierta liberación del fármaco original debido a que se disuelve algo del polímero original. Los polímeros biodegradables, con diferentes solubilidades para facilitar el estratificado, o la inyección de disoluciones en HA resolverán este problema.

Claims (30)

1. Soporte cerámico poroso preformado que comprende un esqueleto interconectado hecho de andamiajes y riostras y que tiene poros, la mayoría de los cuales está en el intervalo de 20 a 1.000 micrómetros, comprendiendo los poros una red de esferas coalescidas, teniendo el soporte una densidad menor que aproximadamente 40% de la teórica, conteniendo los poros un fármaco en ellos, controlándose la velocidad de liberación del fármaco desde el soporte mediante la colocación del fármaco en los poros dentro de un soporte degradable.
2. Soporte según la reivindicación 1, en el que el esqueleto tiene tamaños medios de poros en el intervalo de 20 a 800 micrómetros.
3. Soporte según la reivindicación 2, en el que el tamaño medio de poros está en el intervalo de 60 a 800 micrómetros.
4. Soporte según la reivindicación 3, en el que existen microporos, formándose los microporos mediante sinterización del precursor del soporte en condiciones que estaban por debajo de las requeridas para la sinterización total.
5. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que el esqueleto es un material biocompatible.
6. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que la densidad oscila desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 30% de la densidad teórica.
7. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que el fármaco en los poros comprende uno o más de: factores de crecimiento; antibióticos; vitaminas; proteínas; hormonas; un agente de quimioterapia; o un agente radioopacificante.
8. Soporte según la reivindicación 7, en el que los poros contienen uno o más de los siguientes factores de crecimiento:
-
un material de crecimiento óseo
-
FGF (factor de crecimiento de fibroblastos)
-
IGF-1
-
IGF-II
-
PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas)
-
TGF-B (factor de crecimiento transformante)
-
una célula formadora de hueso o que degrada el hueso
-
BMP-Z
-
HGH
-
Concentraciones de factores de crecimiento procedentes de seres humanos.
9. Soporte según la reivindicación 7, en el que el agente de quimioterapia es cis-platino.
10. Soporte según la reivindicación 7, en el que el agente radioopacificante es estroncio-67 o samario-153.
11. Soporte según la reivindicación 7, en el que el agente es metotrexato.
12. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que los poros contienen uno o más de los complejos de coordinación de tipo Werner; complejos macrocíclicos; metalocenos y complejos de tipo sándwich y organometálicos.
13. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que la superficie de los poros se ha modificado para controlar la liberación del fármaco.
14. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la superficie de los poros se ha modificado mediante tratamiento con un ácido o álcali, o mediante deposición de vapor por plasma o química.
15. Vehículo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el soporte degradable comprende un soporte biodegradable.
16. Soporte según la reivindicación 15, en el que el soporte degradable es un colágeno o polímero.
17. Soporte según la reivindicación 15 ó 16, en el que el soporte es uno de poli(carboxifenoxi)propano-ácido sebácico (PCPP.SA), carbonato de calcio precipitado (PCC), (carboxifenoxi)propano-ácido sebácico (CPP.SA), carbonato de politrimetilen (ácido sebácico de dímero de ácido graso) (FAD-SAPTMC), poli(ácido aspártico) (PAA).
18. Soporte según la reivindicación 15, 16 ó 17, en el que los poros contienen capas de fármaco o soporte biodegradable, siendo cada capa diferente de su vecina o vecinas.
19. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que los poros contienen material en capas, dispuestas como capas alternas de capa libre de fármaco y capas que contienen fármaco, o mediante la concentración de fármaco a lo largo de diferentes capas de colágeno o polímero.
20. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que el fármaco se introduce en los poros mediante una o más de una técnica de centrifugación, inmersión, impregnación a vacío o liofilización.
21. Soporte según cualquier reivindicación anterior, en el que la superficie exterior se ha revestido con un polímero biodegradable que contiene un fármaco.
22. Soporte según la reivindicación 1, en el que el esqueleto es parcial o totalmente reabsorbible.
23. Soporte según la reivindicación 22, en el que el esqueleto está formado por carbonato de calcio o hidroxiapatita (HA).
24. Soporte según la reivindicación 1, en el que el fármaco es perclorato de trisfenantrolinahierro (II).
25. Soporte según la reivindicación 24, en el que el perclorato de trisfenantrolinahierro (II) se ha cargado en los poros mediante impregnación a vacío.
26. Soporte según la reivindicación 24, en el que los poros contienen además glicolida, controlándose la velocidad de liberación de perclorato de trisfenantrolinahierro (II).
27. Soporte según la reivindicación 1, en el que el fármaco comprende cis-platino y una glicolida, controlándose la velocidad de liberación del cis-platino y una glicolida.
28. Soporte según la reivindicación 1, en el que el fármaco comprende prednisolona, controlándose la velocidad de liberación de la prednisolona.
29. Soporte según cualquier reivindicación anterior, conformado para la sustitución ortopédica, maxilo-facial, o cráneo-facial, o similar.
30. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, conformado para la colocación en un sitio intramuscular, un sitio interperitoneal, un sitio subcutáneo, sitios del sistema nervioso central o sitios oculares.
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