ES2314996T3

ES2314996T3 - Biosensor de glucosa.

Info

Publication number: ES2314996T3
Application number: ES98966130T
Authority: ES
Inventors: Homme W. Hellinga
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1998-12-31
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2018-12-31
Also published as: DE69840107D1; AU2210199A; JP4472169B2; JP2002500361A; CA2316199C; CA2316199A1; AU760743B2; US6277627B1; EP1044374A1; EP1044374A4; EP1044374B1; ATE410683T1; DK1044374T3; US6521446B2; US20020004217A1; WO1999034212A1

Abstract

Biosensor de glucosa que comprende una proteína enlazante de glucosa (GBP) y un grupo indicador que efectúan la transducción de una señal detectable, en el que dicho grupo indicador se acopla a dicha GBP para que una señal transducida mediante dicho grupo indicador cuando dicha GBP se encuentra enlazada a la glucosa se diferencia de una señal transducida por dicho grupo indicador cuando dicha GBP no se encuentra enlazada a la glucosa; en el que dicho grupo indicador es un fluoróforo y en el que dicha GBP se manipula mediante ingeniería genética para incluir residuos de aminoácido que permitan la introducción específica del sitio de dicho grupo indicador.

Description

Biosensor de glucosa.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a biosensores y, en particular, a un biosensor de glucosa que comprende una Proteína Enlazante de Glucosa modificada por ingeniería genética.

Antecedentes

Los biosensores asocian los eventos de unión de ligandos biomoleculares muy específicos para los cambios en las señales físicas, proporcionando de este modo herramientas analíticas que pueden medir la presencia de especies moleculares simples en mezclas complejas (Hall, Biosensors, Prentice-Hall: Englewood Cliffs (1991)). La mayor parte de los biosensores son macromoléculas que se producen de manera natural, tal y como encimas o anticuerpos, que proporcionan la especificidad del analito deseada, pero a menudo no son muy apropiados para los mecanismos simples de transducción de señal (Griffiths et al, Tr. Biotech. 11: 122-130 (1993)). Una solución a este problema es la utilización de técnicas de ingeniería proteínica para integrar las funciones de transducción de señal directamente en las proteínas, adaptándolas a tecnologías de detección sencillas, antes que desarrollar instrumentación específica para las propiedades de una proteína en particular (Adams et al, Nature 39: 694-697 (1991); Braha et al, Chem. Biol. 4: 497-505 (1997); Brennan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 5783-5787 (1995); Brune et al, Biochemistry 33: 8262-8271 (1994); Cornell et al, Nature 387: 580-583 (1997); Gilardi et al, Anal. Chem. 66: 3840-3847 (1994); Godwin et al, J. Am. Chem. Soc. 118: 6514-6515 (1996); Marvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1997); Post et al, J. Biol. Chem. 269: 12880-12887 (1994); Romoser, J. Biol. Chem. 272: 13270-13274 (1997); Stewart et al, J. Am. Chem. Soc. 116: 415-416 (1994); Thompson et al, J. Biomed. Op. 1: 131-137 (1996); Walkup et al, J. Am. Chem. Soc. 119: 5445-5450 (1997)). Un enfoque simple para construir dichos transductores de señal integrada es aprovecharse de las estrategias de detección óptica basadas en los cambios en los grupos indicadores fluorescentes que responden a la unión del ligando (Guiliano et al, Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 24: 405-434 (1995); Czamik, Chem. Biol. 2: 432-438 (1995)). Los fluoróforos se pueden introducir concretamente en un sitio de una proteína mediante la utilización de la síntesis total, la semisíntesis, o las fusiones génicas. De esta manera, los pares de fluoróforos se pueden disponer para la detección de la unión por transferencia de energía de fluorescencia, o uno simple, un fluoróforo respetuoso con el medio se puede posicionar para responder a los cambios conformacionales que acompañan a los eventos de unión (véanse las referencias citadas anteriormente).

Lo ideal sería que la relación estructural entre el sitio de unión del ligando y el grupo indicador sea tal que cada uno se pueda manipular de forma independiente, permitiendo un enfoque modular a la optimización de las propiedades del sitio de unión o del fluoróforo (Marvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1997); Walkup et al, J. Am. Chem. Soc. 119: 3443-3450 (1997); Cheng et al, J. Am. Chem. Soc. 118: 11349-11356 (1996); Ippolito et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 5017-5021 (1995); Elbaum et al, J. Am. Chem. Soc. 118: 8381-8387 (1996)). Una forma de conseguir dicha modularidad es separar espacialmente los dos sitios para minimizar la interferencia estérica entre ellos. La separación espacial del grupo indicador y el sitio de unión requiere que el comportamiento del fluoróforo permanezca acoplado al grado de ocupación del sitio de unión del ligando por medio de un mecanismo de acoplamiento alostérico. Recientemente, se ha mostrado que es posible modificar por ingeniería genética dichas funciones del transductor de señal alostérica fluorescente integrado (FAST) en la Proteína Enlazante de Maltosa (MBP) de la cepa de E. coli por su ventaja en los grandes cambios conformacionales que tienen lugar sobre la unión del ligando en esta proteína, utilizando un enfoque de diseño racional basado en la estructura (Marvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1997)).

La presente invención se refiere, en una realización, a la Proteína Enlazante de Glucosa/Galactosa con funciones FAST modificadas por ingeniería genética y a una nueva clase de sensores fluorescentes de la glucosa con aplicaciones en la industria alimentaria (Suleiman et al, In: Biosensor Design and Application, Matthewson and Finley, Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., Vol. 511 (1992)), y en la química clinica (Wilkins et al, Med. Eng. Phys. 18: 273-278 (1996); Pickup, Tr. Biotech. 11: 285-291 (1993); Meyerhoff et al, Endricon 6: 51-58 (1996)).

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a un biosensor de glucosa que comprende una Proteína Enlazante de Glucosa (GBP) modificada por ingeniería genética que incluye mutaciones que permiten la introducción específica del sitio de los grupos indicadores respetuosos con el medio. La señal de estos grupos prostéticos cambia linealmente con el grado de unión de la glucosa. De este modo, el sensor de glucosa de la presente invención se puede utilizar, por ejemplo, para la detección de glucosa en sangre o en los procesos de fermentación industrial.

Un aspecto de la presente invención proporciona un biosensor tal y como se expone en la Reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Comparación de las formas cerradas de la MBP (Spurlino et al, J. Biol. Chem. 266: 5202-5219 (1991)) (cabecera; Protein Data Bank ref2MBP) y la GBP (Vyas et al, Nature, 327: 635-638 (1987); Vyas et al, Science 242: 1290-1295 (1988); Vyas et al, Biochemistry 33: 4762-4768 (1994)) (final: PDB ref IGLG) acomplejadas con sus respectivos sustratos, mostrando la posición. Los sitios de acoplamiento de los fluoróforos conjugados se encuentran indicados mediante esferas. La esfera ubicada en la región de la "estructura ramificada" de la MBP indica la posición del fluoróforo que se observó que daba la mejor respuesta alostérica (Marvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1977)) (acoplado al Asp95Cys). Sobre la base de este resultado, cuatro sitios en la región análoga de la GBP (255, 257, 294, 296) se pronosticaron para ser potencialmente relacionados desde un punto de vista alostérico con el bolsillo de unión de la glucosa. Los sitios 15 y 152, ubicados en el bolsillo de unión de la glucosa, son posiciones para los grupos indicadores en potencia no alostéricos. Los diagramas de cintas se efectuaron con el generador de imágenes Molscript (Krollis, J. Appl. Crystal. 24: 946-950 (1991)).

Figuras 2A y 2B: Unión de la glucosa a los conjugados L255C-acrilodan (Figura 2A) y H152C-IANBD (Figura 2B). La curva de unión es el promedio de tres valoraciones diferentes (las barras de error son más pequeñas que los círculos mostrados). La inserción muestra los cambios en el espectro de emisión sobre la adición de glucosa saturada: sin glucosa (línea discontinua), 10 mM de glucosa (línea continua).

Figura 3: Atenuación en solución mediante yoduro del conjugado L255C-acrilodan. F_{0}/F es el cambio fraccionario en la emisión de fluorescencia a 498 nm sobre la adición de yoduro. La atenuación se determinó para la apoproteína (círculos) y en presencia de 10 mM de glucosa (diamantes), y se trazó tanto para máxima emisión a 498 nm (símbolos cerrados) como a 520 nm (símbolos abiertos).

Figura 4. Bolsillo de unión de la glucosa en la CBP (Protein Databank Ref 2GBP).

Figura 5. Fluorímetro basado en LEDs azules de excitación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una novedosa proteína sensora de la glucosa modificada por ingeniería genética a partir de la GBP para incluir residuos de aminoácido que permiten la introducción específica en el sitio de los grupos indicadores de fluoróforos respetuosos con el medio. La presente invención da lugar, al menos en parte, desde la identificación de las regiones en la GBP que se colocan directamente dentro o que se acoplan alostéricamente al sitio de unión de la glucosa.

Antes de la producción de los sensores de glucosa de la presente invención, los sitios alostéricos se han identificado en la Proteína Enlazante de Maltosa (MBP) (Marvin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1997)). La identificación directa de los sitios alostéricos fue posible cuando se conocieron las estructuras con rayos X de alta resolución de la MBP tanto en el estado ligado a la maltosa ("cerrado") como en el estado libre de maltosa ("cerrado"). En comparación, la GBP se había cristalizado solamente en la conformación "cerrada" (es decir, ligada a la glucosa) y de este modo se descartó el cálculo directo de la ubicación de los sitios potencialmente alostéricos (PAS). Aunque la MBP y la GBP comparten una pequeña homología, tienen diferentes pesos moleculares e incluso en cierto modo una tipología de estructura secundaria diferente, resultó posible aprovecharse de la similitud estructural rugosa aproximada entre las dos proteínas para predecir la ubicación de los sitios alostéricos en la GBP (Vyas et al, Nature 327: 635-638 (1987); Vyas et al, Science 242: 1290-1295 (1988); Vyas et al, Biochemistry 33: 4762-4768 (1994)).

Aunque los sensores de glucosa de la presente invención se describen con algún detalle en los Ejemplos que se acompañan, se apreciará que las GBP en particular modificadas por ingeniería genética descritas representan sólo realizaciones individuales. Además, se apreciará que cuando la GBP es un elemento de una superfamilia de proteínas receptoras, la presente invención incluye las GBP modificadas por ingeniería genética diferentes de las GBP de la cepa de E. coli modificadas por ingeniería genética, tal y como la GBP de las bacterias termófilas modificadas por ingeniería genética (véase Tam et al, Microbiol. Rev. 57: 320 (1993)).

Las proteínas modificadas por ingeniería genética de la presente invención se pueden producir mediante la introducción del sitio de grupo(s) indicador(es) por síntesis total, semisíntesis, o fusiones génicas (véanse Godwin et al (1996), Walkup et al (1997), Adams et al (1991), Bruné et al (1994), Gilardi et al (1994), Marvin et al (1997), Post et al (1994), Thompson et al (1996), Romoser et al (1997), citados todos anteriormente)).

Se pueden utilizar varios grupos indicadores de fluoróforo. Los fluoróforos que actúan en grandes longitudes de onda de excitación y emisión (por ejemplo, superiores a 600 nm) se prefieren cuando el sensor molecular se incorpora en un biosensor transdérmico (la piel se vuelve opaca por debajo de los 600 nm). En este momento, existen pocas sondas respetuosas con el medio disponibles en esta región del espectro y ninguna con grupos funcionales tiol reactivos (Thompson, R.B., Red and Near-Infrared Fluorometry, in Topics in Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lackowicz. Editor 1994, Plenum Press: New York, p. 151-181). Sin embargo, se pueden preparar los derivados tiol reactivos de los complejos bisbipiridilo del osmio (II) y del colorante Azul de Nil (Geren et al, Biochem. 30: 9450 (1991)). Los conjugados que contienen estos fluoróforos, por ejemplo, acoplados a diversos mutantes de la cisteína elaborados en la región bisagra de la GBP, se pueden examinar para identificar que da lugar al cambio más grande en la fluorescencia sobre la unión de la glucosa. Los complejos bisbipiridilo del osmio (II) disponen de absorbancias en longitudes de onda superiores a los 600 nm con máxima emisión en la región de 700 nm a 800 nm (Demas et al, Anal. Chem. 63: 829A (1991)) y los tiempos de vida son largos (en el rango de 100 ns), simplificando la duración de la instrumentación basada en la técnica de imágenes por tiempos de vida fluorescentes. Las propiedades de absorbancia y luminiscencia de estos complejos se pueden afinar fácilmente mediante la sustitución de los ligandos. En estos complejos, la toxicidad del osmio se reduce ya que el estado del osmio (II) es inerte al cambio (en gran medida reduciendo cualquier pérdida potencia de metal del complejo), y el potencial redox-IV para que sea poco probable que se oxide a osmio (III) bajo condiciones fisiológicas (Demas et al, Anal. Chem. 63: 829A (1991)).

El (los) grupo(s) indicador(es) se puede(n) colocar en el bolsillo de unión de la GBP (Vyas et al, Nature 327: 635-638 (1987); Vyas et al, Science 242: 1290-1295 (1988); Vyas et al, Biochemistry 33: 4762-4768 (1994)), para que los cambios en la señal del indicador sean una consecuencia de las interacciones directas con la glucosa ligada. Este enfoque puede ser desfavorable por el hecho de que se puede acompañar por interacciones estéricas desfavorables entre el grupo indicador y la glucosa que baja la afinidad de la glucosa o la selectividad del sustrato. Alternativamente, el (los) grupo(s) indicador(es) se puede(n) colocar en ubicaciones distantes del sitio de unión donde el (los) grupo(s) indicador(es) detecta(n) la unión de la glucosa indirectamente por medio de un mecanismo de acoplamiento alostérico basado en la detección de los movimientos de dominio. Los sitios alostéricos apropiados se ubican en zonas de la GBP que sufren un cambio conformacional localizado conjuntamente con el movimiento de flexión del interdominio. En el caso de la MBP, las posiciones de dichos sitios se dedujeron por comparación de las estructuras determinadas experimentalmente de ambas conformaciones de la proteína (es decir, la "abierta" y la "cerrada"). Tal y como se indicó anteriormente, ello demostró que es posible extender este análisis a la GBP partiendo de la base de que la homología estructural rugosa entre las dos proteínas. El mecanismo de detección alostérica tiene la ventaja de que no existe interacción directa entre el grupo indicador y la glucosa, para que las propiedades originales del sitio de unión no se vean esencialmente afectadas. La estrategia de diseño alostérico es modular por naturaleza, es decir, el sitio de unión del ligando se puede alterar sin destruir las propiedades indicadoras del indicador acoplado, y viceversa.

Las mutaciones se pueden introducir tanto en un sitio alostérico (para los propósitos del enlace del grupo indicador) como en el sitio de unión para modificar la afinidad de la proteína con la glucosa sin destruir, o impactar excesivamente, el enlace alostérico con el grupo indicador. Ello puede encontrar aplicación, por ejemplo, cuando se utiliza el biosensor para determinar las concentraciones de glucosa en sangre. La glucosa en sangre se encuentra normalmente en aproximadamente 7 mM y fluctúa entre los 5 y los 15 mM en condiciones diabéticas (Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2ª edición, (1986) Burtis y Ashwood (eds.) Saunders, Londres). Para determinar con precisión la concentración de glucosa sin la necesidad de la dilución de la muestra, la constante de unión del biosensor modificado por ingeniería genética se ajusta para igualarse al rango de funcionamiento fisiológico (y patológico). La GBP en estado natural tiene un K_{d} (glucosa) = 0,8 \muM. De forma ventajosa, un biosensor de la presente invención dispone de una constante de unión más débil (aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más débil) pero todavía es específica para la glucosa. Por ejemplo, se pueden utilizar los biosensores que tienen una constante de unión en el rango de
0,8 \muM a 20 mM. De forma ventajosa, la constante de unión se encuentra en el rango de 1 mM a 20 mM cuando el biosensor se va a utilizar para propósitos clínicos. Las constantes de unión se pueden determinar, por ejemplo, mediante la medición del cambio de fluorescencia de una proteína modificada por ingeniería genética en respuesta a cantidades conocidas de glucosa (véanse los Ejemplos que se acompañan). De forma similar, las constantes de unión se pueden "afinar" para igualar las condiciones de funcionamiento en los procesos industriales.

Las mutaciones que cambian la constante de unión de la GBP sin alterar la especificidad del azúcar se pueden identificar mediante el examen de la estructura tridimensional del bolsillo de unión de la glucosa en la GBP (Figura 4). Las tres categorías de interacciones entre la proteína y el azúcar ligado se pueden modificar: (A) las interacciones directas del puente de hidrógeno, (B) las interacciones directas de Van der Waals, (C) los contactos indirectos de Van der Waals o de puente de hidrógeno. Los contactos de clase (A) tienen más posibilidades de contribuir a la especificidad y por lo tanto se pueden dejar sin alterar. Los contactos de clase (B) y (C) se pueden alterar mediante mutagénesis dirigida con residuos específicos siendo mutada, en primer lugar, en la alanina. Los mutantes simples W183A e Y10A, así como del mutante doble W183AY10A, se han elaborado en una construcción de señalización alostéricamente designada 255C. Estas mutaciones cambian la constante de unión para la glucosa desde los 0,2 \muM hasta los 20 \muM, los 50 \muM y los 650 \muM, respectivamente, demostrando que la constante de unión se puede "afinar" sin destruir el mecanismo de señalización alostérica. El mutante doble D154AW183A descrito en el Ejemplo 5 (también en un marco de referencia 255C) tiene una constante de unión de 7,2. Se pueden realizar otras mutaciones en las que participan, por ejemplo, Phe16, Lys92, Glu147, Lys9, Asp 184, Asn14, Asn91, His 152, Asp 154, Arg158, Asn211, Asp236, Asn256, Tyr10, Met17, Asn66, Ser112, Ser115, Trp183, Asn210, Met214, Gln261 y/o Tyr295. Además del cambio de las posiciones específicas en la alanina, también se puede determinar el efecto de otros aminoácidos. De forma ventajosa, todas las mutaciones se examinarán en el marco de referencia 255C no alostérico.

El biosensor de la presente invención se puede utilizar esencialmente en cualquier posición donde se requiera la detección de la glucosa. Por ejemplo, el presente biosensor se puede utilizar en la industria alimentaria (Suleiman et al, In: Biosensor Design and Application: Mathewson and Finley Eds; American Chemical Socieity, Washington, DC 1992, vol. 511) y en la química clinica (Wilkins et al, Med. Eng. Phys. 18: 273-288 (1996); Pickup, Tr. Biotech. 11: 285-291 (1993); Meyerhoff et al, Endricon 6: 51-58 (1966); Riklin et al, Nature 376: 672-675 (1995); Willner et al, J. Am. Chem. Soc. 118: 10321-10322 (1996)). El biosensor de la presente invención se puede utilizar, por ejemplo, como base para la elaboración de una célula de flujo fluorescente que contenga conjugados GBP-FAST inmovilizados (véanse Wilkins et al, Med. Eng. Phys. 18: 273-288 (1966), Pickup, Tr. Biotech. 11: 285-291 (1993); Meyerhoff et al, Endricon. 6: 51 (1966); Group, New Engl. J. Med. 329: 977-986 (1993); Gough et al, Diabetes 44: 1005-1009 (1995)). El presente biosensor se puede utilizar en un dispositivo implantable adecuado para utilizar como un páncreas artificial.

Ciertos aspectos de la presente invención se encuentran descritos con más detalle en los Ejemplos no limitativos que se acompañan (véase también Marvin et al, J. Am. Chem. Soc. 120: 7 (1998)).

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Ejemplos

Los siguientes detalles experimentales se refieren a los Ejemplos específicos que se acompañan.

Mutagénesis. El gen para la forma citoplásmica de la GBP (Scholle et al, Mol. Gen. Genet. 208: 247-253 (1987)) (es decir, que falta el péptido de secuencia leader) se amplificó a partir del ADN genómico de la cepa de E. coli utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con los iniciadores complementarios deseados para introducir un sitio 5' de restricción EcoRI en el amino terminal del codón de inicio (5' CCG GAA TTC GGA GAT ACC ATG GCT GAT ACT CGC ATT GGT GTA ACA ATC TAT 3'; el sitio de restricción y el codón de inicio se encuentran subrayados), y un sitio BamHI justo antes del codón de terminación (5' AAG CTT TCA TTA GGA TCC TTT CTT GCT GAA CTC AGC CAG GTT GCT TTT 3'). El fragmento resultante se clonó en el vector de expresión pKK223-3 (Pharmacia). Una codificación de la secuencia del oligonucleótido para un oligopéptido His_{5} se clonó posteriormente en el sitio BamHI para permitir la purificación por etapas simples mediante la técnica de la Cromatografía de Afinidad para Metal Inmovilizado (IMAC) (Hochuli et al, Bio/Technol. 6: 1321-1325 (1988)). Los mutantes individuales de la cisteína se llevaron a cabo mediante mutagénesis por fragmentos de la PCR por solapamiento.

Expresión y Purificación de la Proteína. Una colonia de células de la cepa de E. coli XL1-blue (Stratagene) recién transformadas con un plásmido expresando una proteína mutante de la GBP se dejaron crecer a 37ºC durante toda una noche en 20 ml de medio 2XYT conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina. El medio 2XYT (1 litro) complementado con un 0,2% (peso/volumen) de glucosa se inoculó con 10 ml del cultivo durante toda una noche y se dejó crecer con agitación enérgica a 37ºC hasta un OD_{600} = 0,5. La expresión de la proteína se indujo con 1 mM de 1PTG y se dejó crecer durante unas 4 horas adicionales. Las células se cultivaron mediante centrifugación a 3000\cdotg, resuspendidas en 40 ml de solución tampón de alta concentración de sal (1 M de NaCl, 50 mM de fosfato, pH 7,0; HSB), y se almacenaron congeladas a -80ºC. Las células se descongelaron y se lisaron en un French Press refrigerado a 1200 psi. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 6000\cdotg durante 10 minutos. El ADN se precipitó por la adición de polianimina (pH 8) al 5% (peso/volumen) y se eliminó mediante centrifugación a 6000\cdotg durante 30 minutos. La GBP se purificó con un IMAC de purificación por etapas simples (Hochuli et al, Bio/Technol. 6: 1321-1325 (1988)). El lisado depurado se diluyó hasta los 100 ml con HSB en una columna de iminodiacetato/cinc de 30 ml (Pharmacia) y se lavó exhaustivamente con HSB para eliminar las proteínas libres (y la glucosa ligada), seguido por la elución de la GBP mutante con la utilización de unos 200 ml, 0-100 mM de gradiente de imidazola en HSB. La GBP se localizó en un único pico tardío que reveló sólo una banda de proteína en un gel de SDS/poliacrilamida adicionado teñido con Azul Coomassie. El rendimiento era normalmente de unos 5 mg/l de crecimiento.

Acoplamiento de los fluoróforos. Los fluoróforos se conjugaron con las proteínas mutantes de la GBP por medio de la única cisteína libre. El acrilodan (Prendergast et al, J. Biol. Chem. 259: 7541-7544 (1983)) y el (((2-(yodoacetoxi)etil)metil)amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (IANBD) (Ghosh et al, Biochem. J. 108: 155 (1968)) se adquirieron a partir de Molecular Probes y se utilizaron con purificación adicional. Los fluoróforos se disolvieron en acetonitrilo y se hicieron reaccionar con mutantes de la cisteína recién purificados (5:1 de ratio molar) de la GBP (\sim 1 mg) en 1 M de NaCl, 50 mM de solución tampón de fosfato (pH 7,0), durante 3-5 h, a temperatura ambiente. El fluoróforo que no hubiera reaccionado se separó de la proteína mediante filtración de gel. La extensión del acoplamiento se midió tanto para determinar la concentración de tiol libre restante utilizando el reactivo de Ellman (Ellman, Arch. Biochem. Biophy. 82: 70-77 (1959)) como para utilizar el ratio de las absorbancias de la proteína principal y de los cromóforos del fluoróforo (\varepsilon_{280} (GBP) = 37 mM^{-1} cm^{-1} (en el presente estudio); \varepsilon_{469} (IANBD) = 23 mM^{-1} cm^{-1}; \varepsilon_{392} (acrilodan) = 20 mM^{-1} cm^{-1}). El acoplamiento se encontró siempre superior al 95%. Los conjugados eran estables a 4ºC durante un periodo de meses, tal y como se determinó mediante los ensayos de unión de la glucosa.

Medición de la Unión de la Glucosa y la Galactosa. La unión del azúcar se determinó mediante los cambios de la medición en la fluorescencia de los fluoróforos conjugados en un fluorímetro SLM-Aminco-Bowman, de la serie 2, a 25ºC \pm 1ºC. La glucosa o la galactosa (Sigma) se valoraron en una solución de proteína conjugada 50 nM en 0,1 M de NaCl, 50 mM fosfato (pH 7,0), que se mezcló sin interrupción con un agitador magnético. Para las valoraciones, los anchos de ranura de excitación y emisión se fijaron en 4 y 16 nm, respectivamente (IANBD: \lambda_{ex} = 469 nm, \lambda_{cm} = 540 nm; acrilodan: \lambda_{ex} = 392 nm, \lambda_{cm} = 520 nm). Bajo estas condiciones el ruido del instrumento fue inferior al 1% de la señal de la fluorescencia observada en la saturación de soluciones de la glucosa. Las curvas de unión observadas experimentalmente se ajustaron a una isoterma de unión:

(1)\Delta F = \Delta F_{max} \ (1+K_{d}/S)^{-1}

donde \DeltaF es el cambio en la fluorescencia, \DeltaF_{max} es el cambio el fluorescencia en la saturación de concentraciones de ligando, K_{d} es la constante de unión, y S es la concentración del ligando.

Ejemplo 1 Identificación de los Sitios de los Indicadores Enlazados Alostéricamente

Se analizaron las diferencias conformacionales de las estructuras en rayos X de alta resolución de las formas abiertas (Spurlino et al, J. Biol. Chem. 266: 5202-5219 (1991) y cerradas (Sharff et al, Biochemistry 31: 10657-10663 (1992)) de la MBP, y se analizaron las regiones que se pronosticaron que iban a ser enlazadas alostéricamente a los sitios de unión (Marvin et al, Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A., 94: 4366-4371 (1977)). El acoplamiento específico del sitio de los fluoróforos respetuosos con el medio demostró que estas regiones se encuentran acopladas alostéricamente a la unión de la maltosa. La GBP se ha cristalizado solamente en la conformación cerrada, imposibilitando el cálculo directo de las posiciones de los sitios potencialmente alostéricos (PAS). En su lugar, se utilizaron los resultados obtenidos en la MBP, y la semejanza estructural aproximada entre la MBP y la GBP se utilizó para predecir la localización de los PAS análogos en éste último, a pesar de que las dos proteínas comparten poca homología en la secuencia y tienen peso molecular diferente y topología de la estructura secundaria un tanto diferente (Hsiao et al, J. Mol. Biol. 262: 225-242 (1996)).

El sitio que dio la señalización alostérica más pronunciada de la MBP está ubicado en una región que forma una "estructura ramificada" móvil que recubre la bisagra actual. Esta estructura ramificada se encuentra formada por dos mitades no conectadas, cada una de ellas confinada en uno de los dominios. Su movimiento relativo cambia el medio de un fluoróforo acoplado que se encuentra completamente separado del bolsillo de unión por la lámina \beta bisagra. La región equivalente de la estructura ramificada en la GBP es mucho más pequeña, con realmente sólo una mitad retenida, que limita por sí mismo las posiciones acopladas en el GBP a la bisagra (Figura 1).

Enfrentado con la cantidad limitada de información estructural disponible para la GBP, la búsqueda para las ubicaciones de los PAS fue restringida a esta región. Debido a que es imposible predecir que residuos en la región de la estructura ramificada es probable que den la respuesta alostérica más pronunciada a la unión del ligando, se exploró la parte lámina \beta de la estructura ramificada y se identificaron cuatro sitios para el acoplamiento del grupo indicador (L255, D257, P294, V296). Estas posiciones se ubicaron todas en un lado de la lámina \beta bisagra, formando una superficie sobre la que se empaqueta la estructura ramificada de la hélice \alpha. Su micromedio se predice, por lo tanto, para el cambio si la región de la estructura ramificada cambia en la unión del ligando.

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Ejemplo 2 Sitios del Indicador (Peristérico) No Alostéricos

Además de las mutaciones en los PAS, se identificaron por sí mismo dos sitios para el acoplamiento de los grupos indicadores en el sitio de unión (N15, H152). Los fluoróforos ubicados en estas posiciones se predijeron para responder a los cambios en su micromedio por la interacción directa con el ligando, por los cambios conformacionales de la proteína como las "mandíbulas" del final del sitio de unión alrededor del ligando, o por los cambios en la disolución. Esta estrategia se ha utilizado con éxito para introducir la señal no alostérica que efectúan la transducción de grupos indicadores fluorescentes en la MBP (Gilardi et al, Anal. Chem. 66: 3840-3847 (1994)) y en la Proteína Enlazante de Fosfato (PBP) (Brune et al, Biochemistry 33: 8262-8271 (1994)), otro elemento de la familia de las proteínas enlazantes periplásmicas, que se une al fosfato inorgánico. En ambos casos, la constante de unión del ligando de la proteína conjugada se incrementa significativamente en relación con la que se encuentra en estado natural, indicando un grado significativo de interferencia estérica entre el ligando y el fluoróforo, que pueden también explicar el cambio en el micromedio del fluoróforo (Gilardi et al, Prot. Engin. 5: 479-486 (1997)). Esta estrategia pierde por lo tanto la independencia estérica entre el grupo indicador y el punto de unión inherentes en el enfoque alostérico.

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Ejemplo 3 Propiedades de la Transducción de Señal de los Mutantes

Las seis variantes de la GBP con las únicas cisteínas introducidas para el acoplamiento covalente específico en el sitio de los fluoróforos se construyeron mediante una estrategia de mutagénesis de la PCR. La Tabla 1 representa los resultados del acrilodan (Prendergast et al, J. Biol. Chem. 259: 7541-7544 (1983)) o del (((2-(iodoacetoxi)etil)metil)amino)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (IANBD) (Ghosh et al, Biochem. J. 108: 155 (1968)) conjugados de estas proteínas mutantes. Estos dos fluoróforos se han seleccionado debido a su conocida sensibilidad a la polaridad de sus micromedios.

TABLA 1 Propiedades de Unión de los Conjugados Fluorescentes de las Proteínas Mutantes

2

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Los cuatro mutantes en la región bisagra mostraron un cambio en la fluorescencia de sus conjugados acrilodan o ANBD sobre la unión del ligando. El conjugado acrilodan en la posición 255 proporciona el cambio más grande (2 veces menor; Figura 2A). En todos los casos, se podría construir una curva hiperbólica de unión en un solo sitio midiendo el cambio en la fluorescencia como una función de la concentración de la glucosa o la galactosa, de la que se concluye que los fluoróforos acoplados a la región bisagra se encuentran enlazados alostéricamente al bolsillo de unión del azúcar, tal y como se predijo. Además, las constantes de unión del azúcar se ven afectadas por no más que por un factor de 4, indicando que el FAST y los sitios de la unión del ligando se encuentran estéricamente separados, tal y como se preveía.

También se construyeron dos mutaciones de la cisteína por sí mismo en el bolsillo de unión (Figura 1). La posición H 152C interactúa directamente con el azúcar, debido a que substituye su posición 152 que forma un puente de hidrógeno con el oxígeno 06 tanto de la galactosa como de la glucosa. (Vyas et al, Biochemistry 33: 4762-4768 (1994)). El cambio más grande en la fluorescencia de todas las variantes exploradas en este estudio (4 veces mayor) se observó con el IANBD acoplado en esta posición. Sin embargo, este conjugado muestra un gran aumento en las constantes de unión para la glucosa (\sim 100 veces) y la galactosa (\sim 500 veces) tal y como se esperaría tanto de la pérdida del puente de hidrógeno en el oxígeno 06 como de la interferencia estérica directa con el azúcar
ligado.

Los fluoróforos acoplados en la posición N15C se desea que respondan a los cambios en la distancia de interdominio, antes que por la interacción directa con el azúcar, desde los puntos Asn15 alejados del bolsillo de unión del azúcar. Tanto los conjugados acrilodan como los conjugados IANBD muestran un cambio en la unión del azúcar, aunque no tan grande como el IANBD en la posición 152. Sin embargo, los conjugados en la posición 15 no perturban mucho las constantes de unión del azúcar, indicando que no existe interacción directa con el azúcar.

Ejemplo 4 Micromedio de los Conjugados Fluoróforos

Tanto el acrilodan como el IANBD son sensibles a los cambios en la polaridad de su micromedio (Ghosh et al, Biochem. J. 108: 155 (1968); MacGregor et al, Nature 319: 70-73 (1986); Weber et al, J. Biochemistry 18: 3075-3078 (1979)), que puede ser resultado de los cambios en la accesibilidad al disolvente, la movilidad de la sonda, y los cambios en las interacciones estéricas con la proteína circundante (o el ligando, en el caso del conjugado H152C-NBD). Dichos cambios en el micromedio se pueden manifestar como diferencias en la intensidad de la emisión así como por cambios en las longitudes de onda de sus máximos. Los máximos de emisión del acrilodan se sabe que son particularmente dependientes en la polaridad del medio, mostrando un significativo cambio azul en la molécula apolar en relación con los medios acuosos (MacGregor et al, Nature 319: 70-73 (1986); Weber et al, Biochemistry 18: 3075-3078 (1979)).

Las respuestas de los diversos sitios varían extensamente. En varios casos solamente uno de los dos conjugados acoplado en un sitio en particular responde al enlace del azúcar (véase la Tabla 1). Además, ninguno de los conjugados demuestra un cambio apreciable en los máximos de emisión sobre la unión del ligando. Se examinó con más detalle el comportamiento del mejor transductor de señal alostérico en la región bisagra, el L255C-acrilodan (Figura 3). El espectro de emisión de este conjugado tiene dos máximos (a 498 y a 520 nm; Figura 2A), sugiriendo que el acrilodan acoplado se encuentra presente en dos medios distintos que se diferencian en sus polaridades que son intermedios entre el agua y el etanol basados en sus cambios de azul en relación con el agua (Prendergast et al, J. Biol. Chem. 259: 7541-7544 (1983)). Ambos picos se encuentran presentes en las formas ligadas del apo y el azúcar, aunque su intensidad relativa cambie algo sobre la unión del ligando, sugiriendo una leve redistribución entre los dos estados. Para examinar la contribución potencial de las diferencias en la accesibilidad al disolvente del sitio de acoplamiento a los cambios en la relajación dipolar del fluoróforo que tiene lugar sobre la unión del ligando, se determinará el efecto del yoduro sobre la fluorescencia en presencia y en ausencia de glucosa. El yoduro atenúa selectivamente a los fluoróforos expuestos al disolvente. El grado de atenuación sigue la ecuación de Stem-Volmer que describe la atenuación colisional estacionaria (Lehrer et al, Methods Enzymol. 49: 222-236 (1978)):

(2)F_{0}/F = 1 + K[I^{-}]

donde F_{0}/F es la disminución fraccionaria de la fluorescencia, y K es la constante de atenuación de Stem-Volmer (K > 1,0 para un fluoróforo expuesto al disolvente) que está relacionada con el grado de accesibilidad al disolvente. Se encontró que las constantes de atenuación medidas para ambos máximos de emisión del acrilodan son aproximadamente las mismas, sin cambiar en la adición de glucosa y siendo mayores de 1 (Figura 3), indicando que ambas conformaciones de acrilodan se encuentran parcialmente expuestas al disolvente, y el cambio en el micromedio es poco probable que implique un cambio en la accesibilidad al disolvente. Se llevaron a cabo observaciones similares con otros conjugados.

Estos resultados sugieren que el mecanismo por el que los cambios conformacionales afectan la relajación dipolar del fluoróforo acoplado no implica el cambio en la accesibilidad local al disolvente de la posición del acoplamiento, pero es dependiente en la interacción detallada del fluoróforo con su micromedio, tal y como se observó también para el IANBD acoplado en el punto de unión de la MBP (Gilardi et al, Prot. Engin. 5: 479-486 (1997)).

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Ejemplo 5 Alteración de la Constante de Unión de la Glucosa

El examen de la estructura tridimensional determinada experimental de la GBP (véase la Figura 4) indica que existen dos tipos de residuos que forman el sitio de unión de la glucosa, los que hacen contacto directo con la glucosa a través de los puentes de hidrógeno o las interacciones de Van der Waals (superficie de unión primaria) y los que sirven para orientar los residuos en la superficie de unión primaria (superficie de unión secundaria). (Superficie de unión primaria en la GBP de la cepa de E. coli: Asn14, Asn91, His152, Asp154, Arg158, Asn211, Asp236, Asn256; superficie de unión secundaria en la GBP de la cepa de E. coli: Tyr10, Phe16, Met17, Asn66, Ser112, Ser115, Trp183, Asn210, Met214, Gln261, Tyr295). Para cambiar la constante de unión de la glucosa, los residuos en ambas superficies se han mutado de forma sistemática, individualmente o en pares. Los datos obtenidos se representan en la Tabla 2. El doble mutante Asp154Ala, Trp183Ala (D154A + W183A) tiene una constante de unión de 7,2 mM. El rango dinámico se iguala de este modo para funcionar en rangos de concentración de glucosa fisiológicamente relevantes.

3

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Ejemplo 6 Instrumentación Óptica

Debido a que las longitudes de onda de emisión del LED azul (máximo a 470 nm, potencia mitad a \pm 30 nm) se igualan perfectamente en la longitud de onda de excitación del fluoróforo del colorante Azul de Nil (NBD) (máximo a 469 nm), se construyó un primer prototipo de fluorímetro especializado basado en componentes electrónicos económicos, sencillos y fácilmente disponibles (véase la Figura 5). Una cubeta de 1 ml se encuentra iluminada con un LED azul de nitruro de galio mezclado con silicio de Nichia Chemical (3 cd a 20 mA). Una lente convexa doble se utiliza para enfocar la luz en la muestra. Un filtro de paso-alto de cristal (515 nm de corte) se utiliza para separar la luz de excitación de la luz de emisión. Un fotodiodo PIN planar difuso de silicio (Detectores Fotónicos) grande (100 mm^{2}) se utiliza para detectar la luz emitida. El fotodiodo se encuentra funcionando en modo no polarizado (fotovoltaico), optimizado para un funcionamiento de ruido bajo y baja frecuencia. La señal se encuentra filtrada por un filtro de paso-bajo (5 Hz de corte), y pasada posteriormente a través de un sumador variable y un amplificador de ganancia variable para conseguir la calibración deseada de baja y alta gama. Se utilizan los amplificadores operacionales LT1028 (ruido ultra bajo) para todo el tratamiento de la señal analógica. Se utiliza un convertidor analógico/digital de integración de doble pendiente de 12 bits con un tiempo de conversión total de \sim 150 ms para promediar el ruido total desde la entrada análoga. La salida digital se alimenta a través de una EPROM del tipo 27C64. La lectura aparece en un visualizador de LEDs verdes de siete segmentos. Este instrumento puede detectar cambios en la fluorescencia del NBD en la unión del ligando con la suficiente exactitud como para construir una curva de unión hiperbólica.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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Claims

1. Biosensor de glucosa que comprende una proteína enlazante de glucosa (GBP) y un grupo indicador que efectúan la transducción de una señal detectable, en el que dicho grupo indicador se acopla a dicha GBP para que una señal transducida mediante dicho grupo indicador cuando dicha GBP se encuentra enlazada a la glucosa se diferencia de una señal transducida por dicho grupo indicador cuando dicha GBP no se encuentra enlazada a la glucosa; en el que dicho grupo indicador es un fluoróforo y en el que dicha GBP se manipula mediante ingeniería genética para incluir residuos de aminoácido que permitan la introducción específica del sitio de dicho grupo indicador.

2. Biosensor según la Reivindicación 1, en el que dicho grupo indicador se acopla a dicha GBP en un sitio distante de un sitio de unión de la glucosa de dicha GBP.

3. Biosensor según la Reivindicación 1, en el que dicho grupo indicador se acopla a un sitio de unión de la glucosa de dicha GBP.

4. Biosensor según la Reivindicación 1, en el que dicha GBP es una proteína de la cepa de E. coli mutante.

5. Biosensor según la Reivindicación 1, en el que dicho grupo indicador se acopla a dicha GBP en un sitio distante de un sitio de unión de la glucosa de dicha GBP y para que dicho grupo indicador detecte la unión de la glucosa a dicha GBP indirectamente por medio de un mecanismo de acoplamiento alostérico basado en la detección de movimientos de dominio de la GBP.