CN109762050A - 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用 - Google Patents

可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109762050A
CN109762050A CN201910057635.8A CN201910057635A CN109762050A CN 109762050 A CN109762050 A CN 109762050A CN 201910057635 A CN201910057635 A CN 201910057635A CN 109762050 A CN109762050 A CN 109762050A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
fluorescent protein
albumen
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910057635.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109762050B (zh
Inventor
储军
迈克尔·林
郭育奇
张楚秋
王慧娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN201910057635.8A priority Critical patent/CN109762050B/zh
Publication of CN109762050A publication Critical patent/CN109762050A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109762050B publication Critical patent/CN109762050B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。具体而言，本发明提供了一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,M160I,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N。本发明还提供了一种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N149Y,G160S或G160C,A206K。本发明的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白具有良好的光稳定性，可用于高灵敏FRET成像。

Description

可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用
本发明是申请日为2015年12月31日、申请号为201511025610.8、发明名称为“可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用”的分案申请，通过引用将其全部内容结合到本发明。
技术领域
本发明是关于可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。
背景技术
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。荧光共振能量转移技术能够实时监控活细胞内生物分子的活性和分子之间的相互反应，为研究复杂细胞信号通路提供了高时间和空间分辨率的有效方法。随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
在生物光学与分子影像技术领域，科学家们一直在努力寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器。这些基因编码的生物传感器利用荧光共振能量转移技术实时的监控生物分子的活性和分子之间的相互反应。现在普遍使用的基因编码生物传感器是将青色和黄色荧光蛋白相融合，以青和黄两种颜色的荧光团相搭配，通过荧光共振能量转移实时监控生物分子的活性和分子之间的相互作用。但是这种生物传感器有诸多缺陷，主要表现在以下方面：(1)普通生物传感器中使用的青色和黄色两种荧光蛋白的动态感光范围较低，所以导致成像灵敏度低，很难对细胞内的一些瞬时和微弱生化反应进行监测。(2)光毒性大，在检测活的细胞或样品时，对细胞正常的代谢反应和分子相互作用产生较大的负面影响，导致实验结果出现较大的误差，细胞在长时间成像过程中可能死亡。(3)生物传感器自发荧光干扰。在细胞中成像时，由于传感器本身不可避免的激发青色荧光蛋白的同时可激发细胞内一些内源性分子，比如flavin，会出现自发荧光，所以对实验结果也会造成不同程度的干扰和影响。(4)在激发黄色荧光蛋白时青色荧光蛋白出现光活化。(5)传感器所使用的荧光蛋白对pH敏感，pH发生少许变化时，荧光蛋白可能会失活，荧光会明显减弱。
2012年Lam,A.J.等人开发出来一个GFP-RFP对，两种荧光蛋白分别为Clover和mRuby2。该荧光蛋白FRET对与普通的CFP-YFP FRET对相比提高了反应的敏感性，降低了成像时光毒性，与其它的GFP-RFP对相比性质优越，且该方案也已经成功用于活细胞中Zn2+聚集和CaMKIIα活性的成像。但是不足之处为Clover的光稳定弱，在光连续照射下容易光漂白。而mRuby2的光强度也并不高，所以限制了该荧光蛋白FRET对的使用(Lam,A.J.etal.Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescentproteins.Nat Methods9,1005-1012(2012))。在此将该文献的全部内容并入于本发明中作为参考文献。
发明内容
本发明主要是为了寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器的荧光蛋白。
本发明通过定点突变技术，在现有技术荧光蛋白mRuby2和mClover的基础上进行氨基酸位点突变，而得到突变的新红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，实现了蛋白光物理学性质的提高。
具体而言，一方面，本发明采用定点突变技术在mRuby2基础上进行定点诱变获得了本发明的新红色荧光蛋白。本发明的该新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列(mRuby 2的氨基酸序列可参见图1a)相比，具有以下突变位点：M160I。M160I可以让突变蛋白相比mRuby2更亮，在mRuby2基础上具有M160I突变的蛋白具有比未突变的mRuby2较高的光强度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合。这些突变位点会让蛋白成熟或折叠变好。根据本发明的具体实施方案，本发明的红色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。其中，所述的“相同功能”是指相比于mRuby 2蛋白光物理学性质提高(例如亮度提高)的功能。
根据本发明的一优选具体实施方案，本发明的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列参见SEQ ID No.2所示(其中，所述的M160I突变位点对应SEQ ID No.2氨基酸序列的第164位，所述的N33R突变位点对应SEQ ID No.2氨基酸序列的第37位，……，依次类推)，本发明中命名该蛋白为mRuby 3。本发明设计的优选的编码该蛋白mRuby 3的基因序列参见SEQ IDNo.1所示。
mRuby3的激发光谱和发射光谱的峰值分别在约558nm和592nm处，与mRuby2相比出现了蓝移。在峰值处的消光系数为128mM-1cm-1，量子产率为0.45，所以mRuby3的光强度比mRuby2高出35％，所以它是目前为止最亮的单体红色荧光蛋白。除此之外，mRuby3的光稳定性很好，在弧光灯的照射下，mRuby3的半衰期为349秒，长于mRuby2的123秒和TagRFP-T的337秒。在光漂白动力学方面，mRuby3表现出单指数关系，它的解离常数值为4.8，与mRuby2相比耐酸性相似。mRuby3是目前为止亮度最亮和光稳定最好的红色荧光蛋白
另一方面，本发明还提供了mRuby3的融合蛋白，例如，所述mRuby3与mClover、mClover3、mNeonGreen或EGFP的融合蛋白。本发明通过实验证明了mRuby3的融合蛋白能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。mRuby3在哺乳动物细胞系中所表达的信号强度，比红色荧光蛋白mRuby2、FusionRed和mCherry高出至少100％。mRuby3是一种比mRuby2更高效的荧光共振能量转移受体。
另一方面，本发明中同样还对绿色荧光蛋白Clover进行了改造，得到光亮度和光稳定性有所提升且可以作为mRuby3荧光共振能量转移高效供体的新的绿色荧光蛋白。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N149Y。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：G160S或G160C；
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的新的绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：A206K。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供的新的绿色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。其中，所述的“相同功能”是指相比于Clover蛋白光物理学性质提高(例如光稳定性提高)的功能。
在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下突变位点：N149Y。本发明命名该新的绿色荧光蛋白为Clover1.5，具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID No.5所示(其中，所述的N149Y突变位点对应SEQ ID No.5氨基酸序列的第150位)。
在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下两个突变位点：N149Y和G160S。本发明命名该新的绿色荧光蛋白为dClover2，具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID No.6所示(其中，所述的N149Y突变位点对应SEQ ID No.6氨基酸序列的第150位，所述的G160S突变位点对应SEQ ID No.6氨基酸序列的第161位)。
在本发明的一具体实施方案中，本发明的新的绿色荧光蛋白，其氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，仅具有以下三个突变位点：N149Y、G160C和A206K。本发明命名该新的绿色荧光蛋白为mClover3，具体地，其氨基酸序列参见SEQ ID No.4所示(其中，所述的N149Y突变位点对应SEQ ID No.4氨基酸序列的第150位，所述的G160C突变位点对应SEQ IDNo.4氨基酸序列的第161位，所述的A206K突变位点对应SEQ ID No.4氨基酸序列的第207位)，本发明设计的优选的编码该蛋白mClover3的基因序列参见SEQ ID No.3所示。
本发明的新的绿色荧光蛋白，在体内，dClover2在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为98秒，mClover3在体内时在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为80秒，而Clover只有50秒。
另一方面，本发明还提供了所述绿色荧光蛋白的融合蛋白，例如，mClover3与mRuby3的融合蛋白。通过在哺乳动物细胞系中对mClover3系统性地进行测试，证明了mClover3的融合蛋白能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合，mClover3和mNeonGreen相比与mEGFP拥有更高的荧光共振能量转移效率，mClover3-mRuby3和mNeonGreen-mRuby3的效率也比Clover-mRuby3要高，mClover3和mNeonGreen是mRuby3的最有效的供体。
另一方面，本发明还提供了所述的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体中的应用。具体地，其中，所述荧光共振能量转移的供体可选自以下蛋白：mEGFP、Envy、mNeonGreen、Clover或本发明所述的新的绿色荧光蛋白。
本发明还提供了所述的绿色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移供体中的应用。具体地，其中，所述荧光共振能量转移的受体选自以下蛋白：mCherry、mKate2、FusionRed、mRuby2或mRuby3。
本发明还提供了一种能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其包括：
本发明所述的新的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体；和/或
本发明所述的新的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
本发明还提供了一种可用于光学成像的基因编码生物传感器，该生物传感器包括：
本发明所述的新的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体；和/或
本发明所述的新的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
与普遍使用的基因编码的生物传感器相比，本发明的传感器在荧光成像过程中可以有效降低成像背景干扰信号，显著提高了荧光成像的灵敏度，使得成像更加清晰。由于该传感器的光稳定性有了极大地提高，有效的延长了可成像时间，使得长时间观察某种反应或现象更加容易。由于该传感器光毒性的减小，减轻了实验过程中对细胞的正常反应和功能的影响，使得实验结误差减小，实验结果更贴近真实。
具体地，在本发明的一具体实施方案中，分别构建了以Clover和mRuby3为FRET对的Camuiα传感器Camuiα-CR3，mClover3和mRuby3为FRET对的Camuiα传感器Camuiα-C3R3，mNeonGreen和mRuby3为FRET对的Camuiα传感器Camuiα-NR3，测试在Camuiα指示器中新的红色和绿色荧光蛋白在提高FRET基线的能力，结果显示mClover3-mRuby3和mNeonGreen3-mRuby3在Camuiα中改善了反应效果。
另一方面，本发明还开发出了一套评估荧光蛋白在哺乳动物细胞系中作为独立标记和基因编码生物传感器的标准评估方法，通过该评估方法检验荧光蛋白衍生物在哺乳动物细胞系中的表达所产生的荧光信号强度。
本发明与普遍使用的基因编码的生物传感器相比有5大优点：(1)选取绿色和红色荧光蛋白相融合，代替原有青色和黄色荧光蛋白相融合，以绿和红两种颜色的荧光团相搭配，使得光谱分隔的距离变大，减轻了干扰，提高了灵敏度。(2)荧光蛋白的光稳定性出现了极大的提高，荧光蛋白mClover3相比于前一代Clover提高了60％。而mRuby3相比于前一代mRuby2提高了200％，使得mRuby3蛋白成为目前为止光稳定性最强的单体红色荧光蛋白。(3)荧光蛋白的光亮度也有较大的提高，例如mRuby3比前一代mRuby2要亮35％，使得mRuby3成为目前为止光亮度最亮的红色荧光蛋白。(4)高表达，经过转染哺乳动物细胞系后，对细胞成像灵敏度高于现在普遍使用的生物传感器。(5)mRuby3是延时拍摄成像和光量子受限制情况下检测蛋白的良好探针，包括快速延时拍摄成像和单分子成像。
附图说明
图1a显示mRuby3与mRuby2蛋白质一级结构的序列及对比结果。
图1b为mRuby3与mRuby2的突变对比晶体结构图。
图1c为红色荧光蛋白mCherry、mKate2、FusionRed、mRuby2和mRuby3的吸收图(左)与发射图(右)。
图1d显示了mRuby3、mRuby2和mRuby2-M160I突变体在细菌培养箱中培养后的荧光图。
图2a为在HeLa细胞中表达mRuby3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像图。从左到右：mRuby3-7aa-actin(肌动蛋白细胞骨架)，mRuby3-6aa-tubulin(微管)，connexin43(细胞粘附接点)-7aa-mRuby3，mRuby3-10aa-H2B(核小体)。中间aa代表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。
图2b显示在HEK293A和HeLa细胞中四种单体红色荧光蛋白mCherry，FusionRed，mRuby2和mRuby3的亮度比较。
图3a显示mClover3、dClover2和Clover的蛋白质一级结构的序列及对比结果。
图3b为mClover3与Clover相比突变位点的晶体结构图。
图3c为绿色荧光蛋白mEGFP、Envy、mNeonGreen、Clover和Clover3的吸收(左)和发射(右)光谱图。
图4a为在HeLa细胞中表达mClover3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像图。从左到右：mClover3-7aa-actin(肌动蛋白细胞骨架)，mClover3-6aa-tubulin(微管)，connexin43(细胞粘附接点)-7aa-mClover3，mClover3-10aa-H2B(核小体)。中间aa代表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。
图4b显示在HEK293A和HeLa细胞中通过表达GFP-P2A-mCherry，对六种单体绿色荧光蛋白的亮度比较。
图4c为在HEK293A和HeLa细胞中三种GFP-mRuby3蛋白的荧光共振能量转移的效率对比图。
图5a显示与Camuiα连接的绿色/红色FRET对的结构。
图5b显示绿色/红色表达Camuiα的HeLa细胞在没有钙离子载体刺激的情况下供体/受体的发射比率(RDA)。数据以均值±标准差形式表现。
图5c中，左图片为平均供体/受体的发射比率(RDA)随时间的变化图，右图片为HeLa细胞在钙离子载体刺激下反应所得到的强度比率图。每个细胞的发射比率的变化在图中用灰色线表示，平均值用黑色线表示。数据以均值±标准差形式表现。将Camuiα-CR分别与Camuiα-C3R3和Camuiα-NR3在激发峰值处的比率有统计学差异。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。以下各实验中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法包括定点突变技术、融合蛋白技术、人工脂质体细胞转染技术等为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
本发明各实验中所用主要技术和实验方案包括：
(1)荧光共振能量转移的距离模型。
建立的模型的公式为 ftotal表示在某一波长处的荧光强度。εD(λex)表示在激发波长下供体的消光系数。E表示荧光共振能量转移效率。是表示供体的量子产率。fD(λ)表示在波长λ处供体的已标准化的发射光。εA(λex)是表示在激发波长下受体的消光系数。而内部荧光基团距离(interfluorophore distance,r)通过福斯特公式E＝1/(1+(r6/r0 6)算出，r0为福斯特半径。
(2)重组质粒构建
质粒构建包括：聚合酶链式反应(PCR)，重叠延伸聚合酶链式反应(overlap PCR)，限制性酶切反应和In-Fusion连接，转化DH5α细菌。所有重组载体通过测序鉴定。
(3)HeLa和HEK293A细胞培养和转染
利用脂质体转染法将重组质粒转入HeLa和HEK293A细胞中，3-5小时后更换培养液，培养24小时后将细胞消化后，分装到8孔板中，再培养24小时。
(4)荧光显微镜观察融合蛋白
对于mClover3-mRuby3融合蛋白，在转染到HeLa细胞中24-72小时后，利用FV1000激光共聚焦显微镜成像。对于mClover3，在488nm激发光下激发，收集500-600nm的光。对于mRuby3，在559nm处激发，收集570-670nm处的光。所得到的图像用软件ImageJ处理。
(5)荧光蛋白的体外特征
由于荧光蛋白的N-末端连接有六个组氨酸，所以使用钴树脂纯化(HisPur CobaltResin)。而吸光度，激发光谱和发射光谱通过多功能酶标仪SafireII测量出来。消光系数通过变性方法(对于每个蛋白样品，准备完全一样两份溶液，蛋白溶解在PBS中。其中一份测量吸收峰，另外一份在1N NaOH作用下测量吸收峰，通过公式‘变性前/变性后*44000’计算出消光系数)测出，而量子产率则以Clover和mRuby2为参考(分别测量待测样品和参考蛋白的发射谱和吸收谱，然后分别计算发射谱面积和获得发射谱的吸收值，然后将发射谱面积除以吸收值，然后将待测样品的上述比值除以参考蛋白的比值，然后乘以参考蛋白的量子产率，即可得知待测蛋白的量子产率)。
在体外的光漂白实验中，以纯化的蛋白质在为样品，使用倒置荧光显微镜油镜，使用40×0.90-NA UPlan S-Apo物镜，使用X-Cite 120-瓦金属卤化物灯在100％中性密度分别透过一个545/30nm的激发滤波器(对mRuby突变体而言)和一个485/30nm激发滤波器(对Clover突变体而言)。在金属氯化物光源连续照射下，每1秒采集一次图像(相机为ORCA-ERCCD)，倍数也调整为产生光子输出率为1000光子每秒。
凝胶过滤层析实验中使用复合凝胶柱(Superdex 200 30/100GL column)。上样量为100μL，浓度为10μM。洗脱流度为0.5毫升/分钟。通过280nm处的吸收监测蛋白洗脱。
(6)基础荧光共振能量转移的测量
GFP-RFP融合蛋白由C-端截断的av GFP衍生体或mNeonGreen通过连接序列融合了mRuby2或mRuby3的aa 3-233。将融合蛋白转染到HEK293A和HeLa细胞中。转染后2天，将细胞转移到96孔板中检测荧光光谱。发射光谱范围为490-750nm，用470nm激发。
(7)在哺乳动物细胞系中比较突变体的光亮度
对哺乳动物细胞系中绿色荧光蛋白和mRuby的突变体进行比较时，以mCherry和mTurquoise2为表达内参，使用脂质体法转染重组质粒到HEK293A和HeLa细胞中，转染后2天，将细胞转移到底部透明的96孔板中检测荧光光谱。不同的荧光蛋白的设置参数如下：mTurquoise2-434/5nm-474/5nm,mCherry-587/20nm-610/5nm,GFP-430/20nm-480～650nm,RFP-550/10nm-570～670nm。相对亮度是以整合的绿色荧光蛋白或mRuby突变体发射光强除以mCherry或mTurquoise2的发射光强得到的。
(8)Camuiα传感器改进和特征
为了构建Camuiα-CR突变体，一个N-末端为NheI酶切位点和一个C-末端扩展编码的连接器(GFP和CaMKIIα之间的)被用来扩增C-末端截短的avGFP(不含‘GITHGMDELYK’序列)或mNeonGreen(不含‘GMDELYK’序列)。在任意一端的CaMKIIα区域通过PCR扩增成功后，对mRuby2或mRuby3也通过PCR方法扩增目的片段，反应同时在CaMKIIα区域引入一个N-末端扩展的连接器，在C-末端引入ApaI酶切位点，通过重叠延伸聚合酶链式反应将插入片段克隆到载体pcDNA3.1上。
在细胞被重组质粒转染后2天，用显微镜观察细胞。使用倒置荧光显微镜200M的冷ORCA-ER CCD摄像机和40×1.2-NA C-高度消色镜水浸模块观察，使用软件Micro-manager1.4，具体参数为：17-inch 2.5-GHz Core 2Duo MacBook Pro running Mac OS10.6.8。连续不断的FRET和供体发射光谱成像通过以下滤光片获得：绿色荧光蛋白为激发HQ470/30nm和发射505AELP nm，FRET使用激发HQ470/30nm和发射BA575IF nm。
(9)比率型图像分析
FRET的测量通过软件ImageJ量化。原始文件为16-位TIFF文件，以随机的方法来选择视野，转染发出荧光细胞为阳性，以未转染的细胞为背景检测。背景去掉供体的发射强度除以背景去掉FRET的强度得到的值为发射比率。使用一个全光谱查阅表(最小值为蓝色，最大值为红色)，通过受体通道产生强度调节显示。
(10)统计方法
采用方差分析和邓尼特法后验检测确定细胞中亮度测量的差异。采用T检验确定Camuiα突变体的峰值发射比率改变有没有统计学差异。作图软件为Excel和Prism。
实施例1：可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对
1新红色荧光蛋白mRuby 3的性质和成像效果
1.1mRuby3的结构和光物理性质
采用定点突变技术在mRuby2基础上进行定点诱变获得本发明的新红色荧光蛋白mRuby 3。mRuby 3的氨基酸序列参见SEQ ID No.2所示，本发明设计的优选的编码该蛋白mRuby 3的基因序列参见SEQ ID No.1所示(可通过基于PCR聚合的基因合成方法获得mRuby3的DNA序列，即设计很多PCR引物，每两个引物存在18～25bp的重叠，然后通过overlap PCR的方法将所有引物聚合，从而行程一个完整的基因)。
mRuby 3与上一代的mRuby2相比氨基酸序列有21个替换，具体为：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,M160I,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N，可参见图1a，而mRuby的晶体结构(PDB数据库ID为3U0M)可参见图1b。图1a中，形成生色团的氨基酸已经用黑色方框标出；位于蛋白外壁的突变用蓝色标出，包括N33R,T38V,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,L202I,F210Y,H216V；位于内壁的突变用绿色标出，包括：M160I；位于环处的突变用橙色标出，包括：M36E,K74A,G75D,I192V,M209T,F221Y,A222S,G223N。
红色荧光蛋白mCherry、mKate2、FusionRed、mRuby2、和mRuby3的吸收图可参见图1c中左图，各蛋白发射图可参见图1c中右图。图中可见，mRuby3的激发光谱和发射光谱的峰值分别在558nm和592nm处，与mRuby2相比出现了蓝移。在峰值处的消光系数为128mM-1cm-1，量子产率为0.45(见表1)，所以mRuby3的光强度比mRuby2高出35％，所以它是目前为止最亮的单体红色荧光蛋白。除此之外，mRuby3的光稳定性很好，在弧光灯的照射下，mRuby3的半衰期为349秒，长于mRuby2的123秒和TagRFP-T的337秒。在光漂白动力学方面，mRuby3表现出单指数关系，它的解离常数值为4.8，与mRuby2相比耐酸性相似。所以mRuby3是目前为止亮度最亮和光稳定最好的红色荧光蛋白。
表1：单体绿色和红色荧光蛋白的光物理性质
表注：b为激发光峰值时所在的波长。c为发射光峰值时所在的波长。d为最大消光系数。e为荧光量子产率。f为蛋白光亮度的相对值。g为解离常数。h为蛋白的光稳定性，表示在弧光灯照射下每个分子每秒从1000个光子光漂白为500个光子所用的时间，时间单位为秒。
mRuby 3与mRuby2相比的各突变位点中，M160I让蛋白更亮，但蛋白成熟或折叠变差；而其它位点则让蛋白成熟或折叠变好。在本发明中，还在mRuby2的基础上定点突变得到了与mRuby2相比仅具有M160I突变位点的突变体，本发明中命名为mRuby2-M160I。图1d中的图片(1)显示了mRuby2(右边)和mRuby2-M160I(左边)突变体在细菌培养箱中过夜培养24h的荧光图，图1d中的图片(2)显示了mRuby2(右边)和mRuby2-M160I(左边)突变体在细菌培养箱中培养48h的荧光图。从图中可知，mRuby2-M160I由于成熟或折叠比较慢，因此24h培养后比mRuby2要暗一些，但随着培养时间的延长，最终要比mRuby2要亮。图1d中的图片(3)为mRuby3和mRuby2在细菌培养箱中过夜培养24h后的荧光图(图中左边为mRuby3，右边为mRuby2)。
1.2mRuby3在哺乳动物细胞系中成像
在哺乳动物细胞系中比较突变体的光亮度。图2a为在HeLa细胞中表达mRuby3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像图。从左到右：mRuby3-7aa-actin(肌动蛋白细胞骨架)，mRuby3-6aa-tubulin(微管)，connexin43(细胞粘附接点)-7aa-mRuby3，mRuby3-10aa-H2B(核小体)。中间aa代表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。证明了mRuby3的融合蛋白(PCR扩增获得mRuby3序列，然后将此连接入EcoRI和BglII双酶切的pEGFP-C1载体中构建pmRuby3-C1，然后分别扩增上诉亚细胞定位序列，然后通过in-fusion技术连入BamHI和EcoRI双酶切的pmRuby3-C1载体中构建融合蛋白)能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。
然后将mRuby3在哺乳细胞内所产生的荧光信号与其它的单体的红色荧光蛋白进行比较。图2b显示了在HEK293A和HeLa细胞中四种单体红色荧光蛋白mCherry、FusionRed、mRuby2和mRuby3的亮度比较，结果显示mRuby3在HEK293A和HeLa细胞中所表达的信号强度最强，比红色荧光蛋白mRuby2、FusionRed和mCherry高出至少100％(图2b)。本发明的这种检测方法得到的结果与单独每个分子光亮度检测方法相比灵敏度更高。
由此可见，mRuby3理论上是一个FRET的优秀受体。由于mRuby2已经证明是一个高效的荧光共振能量转移受体。所以将mRuby3与mRuby2进行比较，以相同的绿色荧光蛋白Clover为供体，发现mRuby3比mRuby2更高效。
2新绿色荧光蛋白mClover3的性质和成像效果
2.1mClover3的结构和光物理性质
本发明中同样还对绿色荧光蛋白Clover进行了改造，意图得到一个光亮度和光稳定性有所提升且可以作为mRuby3荧光共振能量转移高效供体的蛋白。通过随机突变技术(采用Clontech公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒进行，保证1～3bp突变/1000bp)得到Clover的突变体，然后通过蓝色发光二极管的照射筛选光稳定性强的突变体。经过筛选得到Clover1.5(第149位由天冬酰胺变成酪氨酸)，dClover2(第149位由天冬氨酸变成酪氨酸，第160位由甘氨酸变成丝氨酸)。在体内，dClover2在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为98秒，而Clover只有50秒。消光系数为123mM–1cm–1，也比Clover的111mM–1cm–1有所提高。相对量子产率为0.8比Clover的0.76稍高。在dClover2的基础上进一步经过将第206位点处丙氨酸变为赖氨酸和将160位点处丝氨酸变半胱氨酸后，得到了单体的荧光蛋白mClover3。mClover3的氨基酸序列参见SEQ ID No.4所示，本发明设计的优选的编码该蛋白mClover3的基因序列参见SEQ ID No.3所示(可通过基因合成的方法获得mClover3的DNA序列)。
图3a显示了mClover3、dClover2和Clover的蛋白质一级结构的序列及对比结果。形成生色团的氨基酸已经用黑色方框标出。位于蛋白壁上的三处突变(N149,G160,A206)用橙色标出。图3b显示了mClover3与Clover相比突变位点的晶体结构。图3c显示了绿色荧光蛋白mEGFP、Envy、mNeonGreen、Clover和Clover3的吸收光谱(左图)和发射光谱(右图)，可以看出mClover3与Clover相比拥有相似的光谱，并且在亮度上也差不多。另mClover3在体内时在亮度归一化情况下光稳定性的半衰期为80秒。
2.2mClover3在哺乳动物细胞系中成像
在哺乳动物细胞系中对mClover3系统性地进行了测试。
图4a显示了在HeLa细胞中表达mClover3融合蛋白后对特定的亚细胞结构的荧光成像图。从左到右：mClover3-7aa-actin(肌动蛋白细胞骨架)，mClover3-6aa-tubulin(微管)，connexin43(细胞粘附接点)-7aa-mClover3，mClover3-10aa-H2B(核小体)。中间aa代表连接两个蛋白之间的距离的单位，以单个氨基酸距离为1个aa。证明了mRuby3的融合蛋白能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。然后将mRuby和mRuby3在哺乳细胞内所产生的荧光信号与其它的单体的绿色荧光蛋白进行比较，如mEGFP、sfGFP和Envy。mEGFP是现在用途最广泛的荧光蛋白。sfGFP是mEGFP的具有高折叠效率的衍生体。而Envy在出芽酵母中被认为是亮度最大的。但是，这三种蛋白在体外提取物中都没有Clover和mClover3亮度大(表1)。但是在哺乳动物细胞系中表现出相似的亮度。而最近报道的单体mNeonGreen在体外相比mClover3要亮10％(表1)，二者有着相似的激发和发射光谱，与绿色荧光蛋白(GFP)相比出现了少许的红移，可能是荧光生色团出现了阳离子-π相互作用。
在HEK293A和HeLa细胞中通过表达GFP-P2A-mCherry，比较了六种单体绿色荧光蛋白的亮度，结果参见图4b。发现在HEK293A细胞中，转染了mNeonGreen的细胞平均荧光强度是最亮的，其次是Clover或mClover3，再次是Envy，最弱的是sfGFP。mNeonGreen和mClover3、mClover3和EGFP或sfGFP之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。在HeLa细胞中，mNeonGreen、Clover或mClover3表达后都出现很强的荧光，相互之间亮度差别不大，而Envy的亮度次之，然后是EGFP，最后是sfGFP。mClover3、Envy、EGFP和sfGFP之间的亮度差异有统计学意义。
为了寻找最适合的可以做mRuby3的荧光共振能量转移最佳供体的单体绿色荧光蛋白，将要检测的单体的绿色荧光蛋白mClover、mClover3、mNeonGreen和EGFP与mRuby3做成融合蛋白，然后在哺乳动物细胞中检测各种融合蛋白的荧光共振能量转移的效率，结果见图4c，显示实验所得的发射光光谱(红色线)与线性拟合的发射光光谱(黑色线)十分的吻合，mClover3和mNeonGreen相比与mEGFP拥有更高的荧光共振能量转移效率。mClover3-mRuby3和mNeonGreen-mRuby3的效率也比Clover-mRuby3要高(图4c)。由此可见，mClover3和mNeonGreen是mRuby3的最有效的供体。
3Camuiα传感器
首先分别构建以Clover和mRuby3为FRET对的Camuiα-CR3，mClover3和mRuby3为FRET对的Camuiα-C3R3，mNeonGreen和mRuby3为FRET对的Camuiα-NR3。
图5a显示与Camuiα连接的绿色/红色FRET对的结构。实验证明在检测CaMKIIα的活性时，Clover3-mRuby3提高了荧光共振能量转移的灵敏度。在Camuiα实验中，荧光蛋白与CaMKIIα多肽的终端相融合形成FRET对。与结构分析相一致，Camuiα在不活跃状态下FRET能力高，在活化状态下FRET能力低(图5a)。
然后测试在Camuiα指示器中新的红色和绿色荧光蛋白在提高FRET基线的能力。图5b显示了绿色/红色表达Camuiα的HeLa细胞在没有钙离子载体刺激的情况下供体/受体的发射比率(RDA)，显示含有mRuby3的Camuiα-CR3的FRET基线比含有mRuby2的Camuiα-CR高(图5b)。仅仅将Clover替换为mClover3或mNeonGreen不能明显的改变基本的FRET水平(图5b)。数据以均值±标准差形式表现。
最后检测Camuiα本身效果是否会因为新的FRET对的出现有所提升。在钙离子载体的刺激下，在HeLa细胞中比较Camuiα-CR、-CR3、-C3R3和-NR3的反应。图5c的左图为平均供体/受体的发射比率(RDA)随时间的变化图，右图为HeLa细胞在钙离子载体刺激下反应所得到的强度比率图。每个细胞的发射比率的变化在图中用灰色线表示，平均值用黑色线表示。数据以均值±标准差形式表现。将Camuiα-CR分别与Camuiα-C3R3和Camuiα-NR3在激发峰值处的比率有统计学差异。Camuiα-CR3的平均反应与Camuiα-CR相似，大约在45％(图5c)。如果将mClover3和mNeonGreen取代Clover将会显著地提高Camuiα动态范围，钙诱导的增强提高了绿色/红色发射比率。在Camuiα-CR3中提高了45％，在Camuiα-C3R3中提高了70％，在Camuiα-NR3中提高了56％(图5c)。虽然Camuiα-CR3、-C3R3和-NR3拥有相似的r0值和FRET基线，但是Camuiα的敏感性出现了显著的提升。如果mNeonGreen或mClover3出现了149位由N变成Y和第206位由A变成K两个位置突变，会促进Camuiα-C3R3和Camuiα-NR3向活化状态转变。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用
<130> GAI15CN4344-1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRuby3的编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(711)
<400> 1
atg gtg tct aag ggc gaa gag ctg atc aag gaa aat atg cgt atg aag 48
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Arg Met Lys
1 5 10 15
gtg gtc atg gaa ggt tcg gtc aac ggc cac caa ttc aaa tgc aca ggt 96
Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe Lys Cys Thr Gly
20 25 30
gaa gga gaa ggc aga ccg tac gag gga gtg caa acc atg agg atc aaa 144
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Val Gln Thr Met Arg Ile Lys
35 40 45
gtc atc gag gga gga ccc ctg cca ttt gcc ttt gac att ctt gcc acg 192
Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr
50 55 60
tcg ttc atg tat ggc agc cgt acc ttt atc aag tac ccg gcc gac atc 240
Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Ala Asp Ile
65 70 75 80
cct gat ttc ttt aaa cag tcc ttt cct gag ggt ttt act tgg gaa aga 288
Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
85 90 95
gtt acg aga tac gaa gat ggt gga gtc gtc acc gtc acg cag gac acc 336
Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
100 105 110
agc ctt gag gat ggc gag ctc gtc tac aac gtc aag gtc aga ggg gta 384
Ser Leu Glu Asp Gly Glu Leu Val Tyr Asn Val Lys Val Arg Gly Val
115 120 125
aac ttt ccc tcc aat ggt ccc gtg atg cag aag aag acc aag ggt tgg 432
Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp
130 135 140
gag cct aat aca gag atg atg tat cca gca gat ggt ggt ctg aga gga 480
Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly
145 150 155 160
tac act gac atc gca ctg aaa gtt gat ggt ggt ggc cat ctg cac tgc 528
Tyr Thr Asp Ile Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu His Cys
165 170 175
aac ttc gtg aca act tac agg tca aaa aag acc gtc ggg aac atc aag 576
Asn Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys
180 185 190
atg ccc ggt gtc cat gcc gtt gat cac cgc ctg gaa agg atc gag gag 624
Met Pro Gly Val His Ala Val Asp His Arg Leu Glu Arg Ile Glu Glu
195 200 205
agt gac aat gaa acc tac gta gtg caa aga gaa gtg gca gtt gcc aaa 672
Ser Asp Asn Glu Thr Tyr Val Val Gln Arg Glu Val Ala Val Ala Lys
210 215 220
tac agc aac ctt ggt ggt ggc atg gac gag ctg tac aag 711
Tyr Ser Asn Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Arg Met Lys
1 5 10 15
Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe Lys Cys Thr Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Val Gln Thr Met Arg Ile Lys
35 40 45
Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr
50 55 60
Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Ala Asp Ile
65 70 75 80
Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
85 90 95
Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Thr
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Gly Glu Leu Val Tyr Asn Val Lys Val Arg Gly Val
115 120 125
Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp
130 135 140
Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Asp Ile Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu His Cys
165 170 175
Asn Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys
180 185 190
Met Pro Gly Val His Ala Val Asp His Arg Leu Glu Arg Ile Glu Glu
195 200 205
Ser Asp Asn Glu Thr Tyr Val Val Gln Arg Glu Val Ala Val Ala Lys
210 215 220
Tyr Ser Asn Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mClover3的编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(717)
<400> 3
atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtc cgc ggc 96
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
gag ggc gag ggc gat gcc acc aac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
ttc ggc tac ggc gtg gcc tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240
Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
cgc acc atc tct ttc aag gac gac ggt acc tac aag acc cgc gcc gag 336
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
aac ttc aac agc cac tac gtc tat atc acg gcc gac aag cag aag aac 480
Asn Phe Asn Ser His Tyr Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
tgc atc aag gct aac ttc aag atc cgc cac aac gtt gag gac ggc agc 528
Cys Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc cat cag tcc aaa ctg 624
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Lys Leu
195 200 205
agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
gtg acc gcc gcc ggg att aca cat ggc atg gac gag ctg tac aag 717
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 4
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Tyr Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Cys Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 5
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Clover1.5
<400> 5
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Tyr Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 6
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dClover2
<400> 6
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Tyr Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Ser Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235

Claims (10)

1.一种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N149Y；
优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：G160S或G160C；
更优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：A206K。
2.根据权利要求1所述的绿色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。
3.编码权利要求1或2所述的绿色荧光蛋白的多核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸序列具有如SEQ ID No.3所示序列。
4.一种融合蛋白，其包含权利要求1或2所述的绿色荧光蛋白。
5.权利要求1或2所述的绿色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移供体中的应用；
优选地，其中，所述荧光共振能量转移的受体选自以下蛋白：mCherry、mKate2、FusionRed、mRuby2或mRuby3。
6.一种能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其包括：
权利要求1或2所述的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
7.根据权利要求6所述的能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其还包括以下红色荧光蛋在作为荧光共振能量转移受体：
所述红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：M160I；
优选地，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合。
8.根据权利要求7所述的能用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，其中，所述红色荧光蛋白为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。
9.一种可用于光学成像的基因编码生物传感器，该生物传感器包括：
权利要求1或2所述的绿色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体。
10.根据权利要求9所述的可用于光学成像的基因编码生物传感器，该生物传感器还包括以下红色荧光蛋在作为荧光共振能量转移受体：
所述红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：M160I；
优选地，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合；
更优选地，所述红色荧光蛋白为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。
CN201910057635.8A 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用 Active CN109762050B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910057635.8A CN109762050B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511025610.8A CN105504027B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用
CN201910057635.8A CN109762050B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511025610.8A Division CN105504027B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109762050A true CN109762050A (zh) 2019-05-17
CN109762050B CN109762050B (zh) 2020-08-28

Family

ID=55712380

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511025610.8A Active CN105504027B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用
CN201910057635.8A Active CN109762050B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511025610.8A Active CN105504027B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN105504027B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961225A (zh) * 2019-12-14 2021-06-15 深圳先进技术研究院 近红外荧光蛋白、重组载体、重组细胞及其应用
CN113201058A (zh) * 2021-05-06 2021-08-03 深圳先进技术研究院 一种绿色荧光蛋白Clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和应用
CN115028743A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 山东大学 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108503701B (zh) * 2017-02-24 2020-07-24 中国科学院深圳先进技术研究院 一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
CN106632640B (zh) * 2017-02-24 2020-04-14 中国科学院深圳先进技术研究院 一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
CN106831971B (zh) * 2017-02-24 2020-10-27 中国科学院深圳先进技术研究院 一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
CN108659110B (zh) * 2017-04-01 2020-11-06 北京义翘神州科技股份有限公司 一种改进的红色荧光蛋白及其应用
WO2022232983A1 (zh) * 2021-05-06 2022-11-10 深圳先进技术研究院 一种绿色荧光蛋白Clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和应用
CN114813706B (zh) * 2022-06-29 2022-12-13 国科大杭州高等研究院 一种血细胞高光谱光镊捕获能量共振转移分析仪

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103201383A (zh) * 2010-11-12 2013-07-10 独立行政法人科学技术振兴机构 改性荧光蛋白

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151511A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 Agency For Science, Technology And Research Modified Dual-Colour Protein
WO2015039211A1 (en) * 2013-09-17 2015-03-26 Mcmaster University Method for assaying a protease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103201383A (zh) * 2010-11-12 2013-07-10 独立行政法人科学技术振兴机构 改性荧光蛋白

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMY J LAM等: "Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins", 《NAT METHODS》 *
BENJAMIN CC等: "Crystal structure of Green fluorescent protein clover and design of clover-based Redox sensors", 《STRUCTURE》 *
BRYCE TB等: "Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961225A (zh) * 2019-12-14 2021-06-15 深圳先进技术研究院 近红外荧光蛋白、重组载体、重组细胞及其应用
CN113201058A (zh) * 2021-05-06 2021-08-03 深圳先进技术研究院 一种绿色荧光蛋白Clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和应用
CN113201058B (zh) * 2021-05-06 2022-08-05 深圳先进技术研究院 一种绿色荧光蛋白Clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和应用
CN115028743A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 山东大学 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用
CN115028743B (zh) * 2022-06-28 2024-05-14 山东大学 一种检测d-2-羟基戊二酸的荧光传感器及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109762050B (zh) 2020-08-28
CN105504027B (zh) 2020-08-07
CN105504027A (zh) 2016-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109762050A (zh) 可用于高灵敏fret成像的荧光蛋白对及其应用
Rizzo et al. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins
Hink et al. Imaging protein-protein interactions in living cells
US7157566B2 (en) Monomeric and dimeric fluorescent protein variants and methods for making same
US7015310B2 (en) Oxidation reduction sensitive green fluorescent protein variants
Yang et al. mBeRFP, an improved large stokes shift red fluorescent protein
Klima et al. Incorporation of sensing modalities into de novo designed fluorescence-activating proteins
JPH10509881A (ja) 改変緑色蛍光タンパク質
US7005511B2 (en) Fluorescent protein variants and methods for making same
Xu et al. [12] Bioluminescence resonance energy transfer: Monitoring protein-protein interactions in living cells
JP5570803B2 (ja) 蛍光タンパク質およびｐＨ測定方法
JP5019771B2 (ja) 蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法
US20090203035A1 (en) Fluorescent proteins with increased photostability
Petazzi et al. Fluorescence microscopy methods for the study of protein oligomerization
EP1645881A1 (en) Screening process for the detection and characterization of protein-protein-interactions in vivo by fluorescence cross correlation spectroscopy
JP4557685B2 (ja) 蛍光蛋白質
US9023998B2 (en) Near infrared fluorogen and fluorescent activating proteins for in vivo imaging and live-cell biosensing
Williams et al. [25] Confocal Ca2+ imaging of organelles, cells, tissues and organs
US20090017516A1 (en) Target physiological function inactivator using photosensitizer-labeled fluorescent protein
WO2021066157A1 (ja) 新規蛍光タンパク質、及びその利用
CN109651495A (zh) 橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用
CN106632640A (zh) 一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
Miyawaki et al. Comparison of monomeric variants of StayGold
KR100468221B1 (ko) 세포내 칼슘변화의 측정을 위한 칼슘 바이오센서
Mauser Characterizing a Redox Sensitive Green Fluorescent Protein for Dynamic Monitoring of Endoplasmic Reticulum Redox State

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant