JP2002500361A

JP2002500361A - バイオセンサー

Info

Publication number: JP2002500361A
Application number: JP2000526812A
Authority: JP
Inventors: ヘリンガ、ホム・ダブリュ
Original assignee: デューク・ユニバーシティー
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1998-12-31
Publication date: 2002-01-08
Anticipated expiration: 2018-12-31
Also published as: DE69840107D1; AU760743B2; AU2210199A; ATE410683T1; DK1044374T3; CA2316199C; ES2314996T3; EP1044374A1; CA2316199A1; EP1044374A4; JP4472169B2; WO1999034212A1; US6277627B1; US20020004217A1; US6521446B2; EP1044374B1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝子的に加工されたグルコース結合性タンパク質（GBP）を具備したグルコースバイオセンサーに関する。特定の実施例において、本発明は環境感受性レポーター基の部位特異的な導入を可能にする突然変異を含むように加工されたGBPに関する。これら補欠分子基の信号は、グルコース結合の程度に伴って線形に変化する。従って、本発明のグルコースセンサーは、例えば、血液中または工業的発酵プロセスにおけるグルコースの検出のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この出願は、1997年12月31日に出願された暫定出願60/070,293号の優先権を主
張する。当該暫定出願の全体の内容を、本明細書の一部をなす参照として援用す
る。

【０００２】

【発明の技術分野】

本発明は一般的にバイオセンサーに関し、特に、遺伝子工学的に加工されたグ
ルコース結合性タンパク質を含むグルコースバイオセンサーに関する。

【０００３】

【発明の背景】

バイオセンサーは、高度に特異的な生体分子リガンド結合事象とカップリング
して生理的信号を変化させることにより、複雑な混合物中の一つの分子種の存在
を測定できる分析ツールを提供する（Hall, Biosensors, Prentice-Hall: Engle
wood Cliffs (1991)）。殆どのバイオセンサーは、酵素または抗体のような天然
に存在する巨大分子であり、これらは所望の分析特異性を提供するが、簡易な信
号変換機構には十分に適さないことが多い。この問題に対する一つの解決策は、
特定のタンパク質特性に対して特異的な装置を開発するのではなく、タンパク質
工学技術を使用して信号変換機能を直接タンパク質に組込み、これをそのまま検
出技術に適合させることである（Adams et al., Nature 39:694-697(1991)；Bra
ha et al., Chem. Biol. 4:497-505(1997)；Brennan et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 92:5783-5787 (1995)；Brune et al., Biochemistry 33:8262-827
1(1994)；Cornell et al, Nature 387:580-583(1997)；Godwin et al., J. Am.
Chem. Soc. 118:6514-6515(1996)；Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 94:4366-4371(1997)；Post et al., J. Bio. Chem. 269:12880-12887(1994
)；Romoser, J. Biol. Chem. 272:13270-13274(1997)；Stewart et al., J. Am.
Chem. Soc. 116:415-416(1994)；Thompson et al., J. Biomed. Op. 1:131-137
(1996)；Walkut et al., J. Am. Chem. Soc. 119:5445-5450(1997)）。このよう
な一体化した信号伝達体を構築するための単純なアプローチは、リガンドの結合
に応答する蛍光レポータ基の変化に基づいて光学的検出ストラテジーを開発する
ことである（Guiliano et al., Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 24:40
5-434 (1995)；Czarnik, Chem. Biol. 2:432-438(1995)）。全合成、半合成、ま
たは遺伝子融合を使用することにより、蛍光体をタンパク質の中に部位特異的に
導入することができる。この方法では、蛍光エネルギー移動による結合の検出の
ために蛍光体の対を配置することができ、または付随する結合事象を伴うコンホ
メーション変化に応答するように、環境的に感受性の一つの蛍光体を配置するこ
とができる（上記の引用文献を参照のこと）。

【０００４】理想的には、リガンド結合部位とレポーター基との間の構造的関係は、夫々が
独立に操作できて、結合部位または蛍光体の特性の最適化へのモジュール的アプ
ローチを可能にするものである（Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 94:4366-4371(1997)；Walkup et al., J. Am. Chem. Soc. 119:3443-3450(19
97)；Cheng et al., Am. Chem. Soc. 118:11349-11356(1996)；Ippolito et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:5017-5021(1995)；Elbaum et al., J. Am
. Chem. Soc. 118:8381-8387(1996)）。このようなモジュール性を達成する一つ
の方法は、二つの部位を、それらの間の立体的干渉を最小限にするように空間的
に離間させることである。レポーター基および結合部位の空間的分離には、蛍光
体の挙動が、アロステリック結合機構を介してリガンド結合部位の占有度に密接
に関連したまま残ることを必要とする。最近、構造に基づく合理的な設計アプロ
ーチを使用して、該タンパク質におけるリガンド結合の際に生じる大きなコンホ
メーション変化を利用することにより、E. coliのマルトース結合性タンパク質（MBP）におけるこのような一体化された蛍光アロステリック信号変換体（FAST ）を加工することが可能であることが示された（Marvin et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371 (1997)）。

【０００５】本発明は、一つの態様において、加工されたFAST機能をもったグルコース／ガ
ラクトース結合性タンパク質に関し、また食品工業（Suleiman et al., In:Bios
ensor Desighn and Application, Matthewson and Finley, Eds. American Chem
ical Society, Washington, D.C., Vol.511 (1992)）および臨床化学（Wilkins
et al., Med. Eng. Phys. 18:273-278；Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1993
)；Meyerhoff et al., Endricon 6:51-58(1996)）における応用性をもった新規クラスの蛍光グルコースセンサーに関する。

【０００６】

【発明の概要】

本発明は、遺伝子工学的に加工されたグルコース結合性タンパク質（GBP）を含むグルコースバイオセンサーに関する。特定の態様において、本発明は環境感
受性レポーター基の部位特異的な導入を可能にする突然変異を含むように加工さ
れたGBPに関する。これら補欠分子基の信号は、グルコース結合の程度に伴って線形に変化する。従って、本発明のグルコースセンサーは、例えば、血液中また
は工業的発酵プロセスにおけるグルコースの検出のために使用することができる
。

【０００７】

【発明の詳細な記述】

本発明は、蛍光体のような環境感受性リポーター基の導入を可能にするアミノ
酸残基を含むように、GBPから加工された新規なグルコース検知タンパク質に関する。本発明は、少なくとも部分的には、直接的にグルコース結合部位内に配置
され、またはグルコース結合部位に対してアロステリックに密接に関連したGBP 領域の同定に由来する。

【０００８】本発明のグルコースセンサーの製造に先立って、マルトース結合性タンパク質
（MBP）におけるアロステリック部位が同定された（Marvin et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371）。マルトース結合形（「閉鎖形」）および
マルトース遊離形（「開放形」）の両方の状態においてMBAの高解像度のＸ線構造が公知であったので、アロステリック部位の直接的な同定が可能であった。対
照的に、GBPは「閉鎖形」（即ち、グルコースが結合した）のコンホメーションでしか結晶化せず、従って、可能なアロステリック部位（PAS）の位置を直接計算することは排除された。MBPおよびGBPには僅かの相同性しかなく、異なった分
子量を有し、しかも二次構造トポロジーも幾分異なっているが、二つのタンパク
質の間の粗い構造的類似性を利用して、GBPにおけるアロステリック部位の位置を予測することが可能であることが立証された（Vyas et al. Nature 327:635-6
38(1987)；Vyas et al., Science 242:1290 -1295(1988)；Vyas et al., Bioche
mistry 33:4762-4768(1994)）。

【０００９】以下の例には本発明のグルコースセンサーが幾らか詳細に説明されているが、
記載された特定の加工されたGBPは個別の具体例のみを表していることが理解されるであろう。更に、GBPは受容体タンパク質の副科のメンバーであるから、本発明は加工されたE.coli GBP以外の加工されたGBP、例えば加工された好熱性バクテリアGBP（Tam et al., Microbiol. Rev. 57:320(1993)参照）をも含むものであることが理解されるであろう。

【００１０】本発明の加工されたタンパク質は、全合成、半合成、または遺伝子融合により
、レポーター基を部位特異的に導入することによって製造することができる（全
て上記に挙げたGodwin et al.(1996), Walkup et al.(1997), Adams et al.(199
1), Brune et al.(1994), Gilardi et al.(1994), Marvin et al.(1997), Post
et al.(1994), Thompson et al.(1996), Romoser et al.(1997)参照）。

【００１１】信号伝達の物理的性質（例えば、蛍光、電気化学的、核磁気共鳴（NMR）および電子常磁性共鳴（EPR））およびレポーター基の化学的性質において異なる種々のレポーター基を使用することができる。例えば、異なった種々の蛍光体を使
用することができる。分子センサーが経皮的バイオセンサーの中に組込まれると
き（皮膚は600nm未満では不透明である）は、長い励起および放出波長（例えば＞600nm）で動作する蛍光体が好ましい。現在のところ、スペクトルのこの領域で利用可能な環境的に感受性のプローブは僅かしか存在せず、またチオール反応
性官能基をもったものは存在しない（Thompson, R.B., Red and near-infrared
fluorometty, in Topics in Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Edi
tor, 1994, Plenum Press: New York, p. 151-181）。しかし、オスミウム(II) ビスビピリジル錯体およびナイルブルー色素のチオール反応性誘導体は調製する
ことができる（Green et al., Biochem. 30:9450(1991)）。例えば、GBPのヒンジ領域に構築された種々のシステイン変異体に結合したこれら蛍光体を含有する
複合体を、グルコース結合の際に何れが大きな蛍光の変化を生じるかを決定する
ためにスクリーニングすることができる。Os(II)ビスビピリジル錯体は600 nmよ
りも長い波長に吸収を有し、700〜800 nmの領域に最大放出を有し（Demas et al
., Anal. Chem. 63:829A(1991)）、寿命は長く（100nsの範囲）、蛍光の寿命測定機器の組み立てを簡単にする。これらの錯体の吸収および発光特性は、リガン
ド置換によって容易に変えることができる。これらの錯体において、Os(II)の状
態は不活性に変化し（該錯体から金属が喪失する可能性を大きく低減する）、ま
た酸化還元電位は〜1Vであるため生理学的条件下ではOs（III）に酸化され難いので、Osの毒性は低下する。酸化還元の共同因子は、レポーター基としても使用
できる（例えばフェロセンおよびそのチオール反応性誘導体）。2,2,6,6-テトラ
メチル-1-ピペリンオキシジル（TEMPO）および 2,2,5,5-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ（PROXYL）のような有機遊離基のチオール反応性誘導もまた使用することができ、モニターされるリガンド結合に
応答して、これらプローブのEPRスペクトルが変化する。

【００１２】レポーター基はGBPの結合性ポケットに配置することができ（Vyas et al., Na
ture 327:635-638(1987), Vyas et al., Science 242:1290-1295(1988), Vyas e
t al., Biochemistry 33:4762-4768(1994)）、その結果、レポーター信号におけ
る変化は結合したグルコースとの直接的な相互作用の結果である。このアプロー
チは、レポーター基とグルコースとの間の望ましくない立体的な相互作用を伴う
可能性があり、これがグルコース親和性または基質選択性を低下させる点におい
て不利であるかもしれない。或いは、レポーター基は結合部位から遠くの位置に
配置されることができ、そこでは、ドメイン移動の検出に基づくアロステリック
カップリング機構を介して、レポーター基がグルコース結合を間接的に検知する
。適切なアロステリック部位は、ドメイン間の曲げ移動と協働して局部的コンホ
メーション変化を受けるGBP領域に位置している。MBPの場合、このような部位の
位置は、両タンパク質コンホメーション（即ち、「開放形」および「閉鎖形」）
の実験的に決定された構造の比較によって推定される。上記に述べたように、MB
PとGBPの二つのタンパク質間の粗い構造的ホモロジーに基づいて、この解析をGB
Pにまで拡大可能であることが証明された。アロステリック検知機構は、レポーター基とグルコースとの間の直接的な相互作用がなく、結合部位の元の性質が本
質的に影響されないという利点を有する。このアロステリック設計ストラテジー
は、自然界ではモジュール式(modular)である。即ち、リガンド結合部位は、結合したレポーターのレポート特性を破壊することなく変化され得る。

【００１３】本発明の更なる側面においては、レポーター基とのアロステリック結合を破壊
したり、過度に悪影響を及ぼすことなくグルコースに対するタンパク質の親和性
を変更するために、アロステリック部位（レポーター基の連結のための）および
結合部位の両方に突然変異が導入される。本発明のこの側面は、例えば、バイオ
センサーが血中グルコース濃度測定のために使用されるときに応用できる。血中
グルコースは典型的には約7 mMであり、糖尿病の症状では5〜15mMの間で変動する（Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed., (1986) Burtis and Ash
wood (eds.) Saunders, London）。サンプルを希釈することを必要とせずにグル
コースを正確に測定するために、生理学的（および病理学的）操作レンジに適合
するように当該加工バイオセンサーの結合定数を調節する。野生型GBPは、K_d（グルコース）＝0.8μmを有している。有利なことに、本発明のバイオセンサーは
弱い結合定数（約4乗小さい）を有するが、グルコースに対して特異的である。例えば、グルコースに対して0.8μM〜20 mMの結合定数を有するバイオセンサーを使用することができる。有利なことに、バイオセンサーが臨床目的で使用され
るとき、結合定数は1mM〜20mMの範囲にある。結合定数は、例えば、既知量のグルコースに応答した、加工タンパク質の蛍光変化を測定することによって測定す
ることができる（後述の例を参照のこと）。同様に、結合定数は、工業的プロセ
スにおける操作条件に適合するように「変更」することができる。

【００１４】糖の特異性を変えることなくGBPの結合定数を変化させる突然変異は、GBPにお
けるグルコース結合ポケットの三次元構造（図４）を調べることによって同定す
ることができる。タンパク質と結合した糖との間の三つのカテゴリーの相互作用
が変化され得る：（Ａ）直接の水素結合相互作用、（Ｂ）直接のフンデルワール
ス相互作用、（Ｃ）間接的なフンデルワールス接触または水素結合接触。クラス
（Ａ）の接触は、特異性に最も寄与し易く、従って変更されずに残る。クラス（
Ｂ）およびクラス（Ｃ）の接触は部位特異的突然変異によって変更することがで
き、第一の例では、特異的残基がアラニンに変異される。W183AおよびY10Aの単一変異体ならびにW183A Y10Aの二重変異体が、255Cと称するアロステリック信号
伝達構築物中に構築された。これらの突然変異は、グルコースについての結合定
数を0.2μMから夫々20μM、50μMおよび650μMに変化させ、アロステリック信号
伝達機構を破壊することなく結合定数が「変化」され得ることを示す。実施例５
に記載したD154A W183A二重突然変異（これも255Cバックグラウンドの中）は、7
.2の結合定数を有する。例えば、Phe16、Lys92、Glu147、Lys9、Asp184、Asn14 、Asn91、His152、Asp154、Arg158、Asn211、Asp236、Asn256；Tyr10、Met17、A
sn66、Ser112、Ser115、Trp183、Asn210、Met214、Glu261および／またはTyr295
を含む他の突然変異体を作製することができる。アラニンに特異的な位置を変え
ることに加えて、他のアミノ酸の効果を決定することができる。有利なことに、
全ての突然変異体は非アロステリックな152Cバックグラウンドにおいても試験さ
れるであろう。

【００１５】本発明のバイオセンサーは、本質的には、グルコース検出が必要とされる如何
なる環境においても使用することができる。例えば、本発明のバイオセンサーは
、食品工業（Suleiman et al., In: Biosensor Desighn and Application, Math
ewson and Finley, Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., Vol.
511 (1992)）および臨床化学（Wilkins et al., Med. Eng. Phys. 18:273-278；
Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1993)；Meyerhoff et al., Endricon 6:51-5
8(1996)；Riklin et al, Nature 376:672-675(1995)；Willner et al., J. Sm.
Chem. Soc. 118:10321-10322(1996)）において使用することができる。本発明の
バイオセンサーは、例えば、固定化されたGBP-FAST複合体を含む蛍光フローセル
を構築するための基礎として使用することができる。（Wilkins et al, Med. En
g. Phys. 18:273-288(1966)；Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1933)；Meyerh
off et al., Endricon. 6:51(1966)；Group, New Engl. J. Med. 329:977-986(1
993)；Gough et al., Diabetes 44:1005-1009(1995)）。本発明のバイオセンサーは、人工膵臓としての使用に適した移植装置に用いることができる。

【００１６】本発明の一定の側面を、以下の非制限的実施例において更に詳細に説明する（
Marvin et al., J. Am. Chem. Soc. 120:7(1998)も参照されたい）。

【００１７】

【実施例】

以下の実験の詳細は、下記の特定の例に関する。

【００１８】＜突然変異誘発＞細胞質形態のGBPの遺伝子（Scholle et al., Mol. Gen. Genet. 208:247-253(
1987)）（即ち、リーダー配列ペプチドを欠いているもの）を、開始コドンのN- 末端にE.coliの制限部位5’を導入するように設計されたフランキングプライマー（5’ CCG GAA TTC GGA GAT ACC ATG GCT GAT ACT CGC ATT GGT GTA ACA ATC
TAT 3’；制限部位および開始コドンに下線を付した）および停止コドンの直前にBamHI部位を導入するように設計されたフランキングプライマー（5’ AAG CTT
TCA TTA GGA TCC TTT CTT GCT GAA CTC AGC CAG GTT GCT TTT 3’）を用いたポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、大腸菌ゲノムDNAから増幅した。得られ
たフラグメントをpKK223-3発現ベクター（ファルマシア社）の中にクローニング
した。続いて、His₅をコードするオリゴヌクレオチドカセットをBamHI部位にクローニングして、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーによる一
段階精製を可能にした（Hochuli et al., Bio/Technol. 6:1321-1325(1988)）（
IMAC）。PCR断片突然変異誘発を重ね合わせることにより、個別的なシステイン突然変異体を作製した。

【００１９】＜タンパク質の発現および精製＞突然変異体GBPタンパク質を発現するプラスミドで新たに形質転換されたE. co
li XL1-blue cells（ストラタジーン社）のコロニーを、100μg／mLのアンピシリンを含有する20 mLの2XYT培地中において37℃で一晩増殖させた。0.2％（w/v ）のグルコースを懸濁させた2XYT培地（1L）に上記一晩培養物 10 mLを接種し、
激しく震盪しながら、37℃においてOD₆₀₀−0.5まで増殖させた。1 mM 1PTGでタンパク質の発現を誘導し、更に４時間増殖させた。3000gでの遠心分離により細胞を回収し、40 mLの高塩バッファー（1 mM NaCl, 50 mM燐酸, pH 7.0; HSB）の
中に懸濁させ、-80℃で凍結保存した。細胞を融解し、1200 psiにおいて冷凍フレンチプレス中で溶解した。細胞の破片を6000 gで10分間の遠心分離により除去
した。ポリエンイミン（pH8）を5％（w/v）まで添加することによりDNAを沈殿さ
せ、6000gで30分の遠心分離により除去した。GBPを一段階IMAC（Hochuli et al.
, Biol/Technol. 6:1321-1325(1988)）で精製した。透明にした溶解液をHBSで10
0 mLにまで希釈して30 mLのイミノジアセテート／亜鉛カラム（ファルマシア社）に掛け、HSBで広範に洗浄して未結合のタンパク質（および結合したグルコース）を除去し、続いて200 mLのHBS中の0〜100 mMイミダゾール勾配溶液を使用し
て変異体GBPを溶出した。単一の遅延ピークの中にGBPが見つかり、これはオーバ
ーロードしたSDS／ポリアクリルアミド上のクーマシー青で染色された唯一のタンパク質バンドであることが明らかになった。収率は、典型的には5 mg/Lであっ
た。

【００２０】＜蛍光体カップリング＞蛍光体を、単一の遊離システインを介してGBPタンパク質に結合させた。アクリロダン(acrylodan)（Prendergast et al., J. Biol. Chem. 259:7541-7544(19
83)）および（((2-(ヨードアセトキシ)エチル)メチル)アミノ）-7-ニトロベンズ
-2-オキサ-1,3-ジアゾール（Ghosh et al., Biochem. J. 108:155(1968)）（IAN
BD）をモレキュラープローブ社から購入し、更に精製せずに使用した。この蛍光
体をアセトニトリル中に溶解し、1 M NaCl, 50 mMリン酸バッファー中において室温で3〜5時間、新たに精製したGBPnoシステイン変異体（〜1mg）と反応させた
。未反応の蛍光体をゲル濾過によりタンパク質から分離した。エルマン試薬（El
lman, Arch. Biophy. 82:70-77(1959)）を使用して残留する遊離チオール濃度を
測定することにより、また主タンパク質および蛍光体発色団の吸収率（ε₂₈₀(GB
P)＝37 mM^-1cm^-1（本研究）；ε₄₆₉(IANBD)＝23 mM^-1cm^-1；ε₃₉₂(アクリロダン
)＝20 mM^-1cm^-1）を使用することにより、結合の程度を測定した。結合は常に95
％より大きいことが分かった。グルコース結合試験により測定したところ、この
複合体は4℃で数ヶ月に亘って安定であった。

【００２１】＜グルコースおよびガラクトース結合の測定＞ SLM-Aminco-Bowmanシリーズ２蛍光計上で、25±1℃において、複合化された蛍
光体の蛍光変化を測定することにより糖結合を決定した。グルコースまたはガラ
クトース（シグマ社）を、0.1MnaCl, 50 mMリン酸（pH7.0）中の50nM複合体タン
パク質溶液の中に滴定し、これを磁気スターラーで連続的に混合した。滴定のた
めに、励起および放出スリット幅を夫々4nmおよび16nmに設定した（IANBD：λ_ex ＝469 nm、λ_em＝540 nm；アクリロダン：λ_ex＝392 nm、λ_em＝520 nm）。これ
らの条件の下で、装置ノイズはグルコースの飽和溶液中で観察された蛍光信号の
＜1％であった。実験的に観察された結合曲線は、下記の結合等温曲線に適合した。

【００２２】 ΔＦ＝ΔＦ_max（１＋Ｋ_d／Ｓ）^-1 （１）ここで、ΔＦは蛍光における変化であり、ΔＦ_maxはリガンドの飽和濃度における蛍光変化であり、Ｋ_dは結合定数であり、Ｓはリガンドの濃度である。

【００２３】

【実施例】

実施例１：アロステリック的に連結されるレポーター部位の同定開放型ＭＢＰ（Spurlino et al,J.Biol.Chem.266:5202-5219(1991)）および閉
鎖型ＭＢＰ（Sharff et al,Biochemistry 31:10657-10663(1992)）の高分解Ｘ線
構造の立体配座上の相違点が分析され、アロステリック的に結合部位に連結され
ると予想される領域が分析された（Marvin et al,Proc.Natl.Acd.Sci.USA 94:43
66-4371(1977)）。これらの領域はアロステリック的にマルト−ス結合部位に連結されるということが、環境に敏感な蛍光体の部位特異的な結合により明らかと
なった。ＧＢＰは閉鎖型立体配座においてのみ結晶化し、潜在的アロステリック
部位（ＰＡＳ）の位置の直接的な予測（計算）を妨げてきた。その代わりに、Ｍ
ＢＰで得られた結果が用いられ、２つのタンパク質が配列相同性をほとんど共有
せず、相違した分子量および多少相違した２次構造トポロジーであるにもかかわ
らず、ＭＢＰおよびＧＢＰとの大まかな構造的類似点を頼りに、後者における類
似したＰＡＳの位置が予測された（Hsiao et al,J.Mol.Biol.262:225-242(1996)
）。

【００２４】ＭＢＰにおいて最も顕著なアロステリック信号を与えた部位は、現存するヒン
ジを覆っている可動性「フラップ」を形成する領域に位置する。このフラップは
、それぞれがドメインの１つに閉じ込められる２つの結合されていない半片によ
って形成される。それらの相対的な移動は、ヒンジβシートにより結合ポケット
から完全に分離して結合した蛍光体の環境を変化させる。ＧＢＰにおける相当す
るフラップ領域ははるかに小さく、１つの半片のみが適切に保持され、対するＧ
ＢＰにおける結合位置をヒンジ自体に制限する（図１）。

【００２５】ＧＢＰに役立つ限られた量の構造的情報を直視し、ＰＡＳの位置に関する研究
がこの領域に限定された。フラップ領域における残基のどれが、リガンド結合に
対して最も顕著なアロステリック応答を与えるかを予測することは不可能である
ので、フラップのβシートの１部をこまかく調べ、レポーター基結合のための４
つの部位（L255、D257、P294、V296）を同定した。これらの位置は全てヒンジβ
シートの片側に位置し、フラップαヘリックスが詰め込まれる表面を形成する。
それゆえ、もしリガンド結合によってフラップ領域が再配列するならば、それら
の微視的環境は変化すると予想される。

【００２６】実施例２：非アロステリック（ペリステリック）レポーター部位ＰＡＳ突然変異に加え、結合部位自体におけるレポーター基結合のための２つ
の部位（N15、H152）が同定された。これらの部位に配置される蛍光体は、リガンドの直接的な相互作用、リガンド周囲に接近した結合部位の「入り口」として
のタンパク質立体配座変化、または溶媒和における変化による微視的環境におけ
る変化に対し応答すると予測される。この戦略は、ＭＢＰ（Gilardi et al,Anal
.Chem.66:3840-3847(1994)）および無機リン酸塩に結合するペリプラズム結合性
タンパク質類の他のメンバーであるリン酸塩結合性タンパク質（Brune et al,Bi
ochemistry 33:8262-8271(1994)）（ＰＢＰ）に蛍光性レポーター基を形質導入して、非アロステリック信号を首尾良く導入するために用いられてきた。どちら
の場合においても、複合タンパク質のリガンド結合定数は、野生型に比較してか
なり増加し、それはリガンドおよび蛍光体間の立体干渉の度合いが相当であり、
そのことが発蛍光団の微視的環境における変化の原因であることを示す（Gilard
i et al,Prot.Engin.5:479-486(1997)）。したがって、この戦略は、本来のアロ
ステリックアプローチにおけるレポーター基および結合部位間の立体的独立を失
っている。

【００２７】実施例３：突然変異体の信号変換特性蛍光体が部位特異的共有結合のために導入された１つのシステインを持つ６つ
のＧＢＰ変異体が、ＰＣＲ変異変異誘発戦略により構築された。表１はこれら突
然変異タンパク質のアクリロダン（Prendergast et al,J.Biol.Chem.259:7541-7
544(1983)）または(((2-(アイオドアセトキシ)エチル)メチル)アミノ)-7-ニトロ
ベンズ-2-オキサ-1,3,ジアゾール（Ghosh et al,Biochem.J.108:155(1968)）（ＩＡＮＢＤ）複合体の結果を示す。これら２つの蛍光体は、知られているように
、微視的環境の極性に対して敏感であるとの理由から選択された。

【００２８】

【表１】Ｒ：アポタンパク質に対する完全に飽和したＧＢＰ（10ｍＭグルコース）の蛍
光比（Ｒ＝1.0は、変化がないことを示す；Ｒ＜1.0は、グルコース結合の減少を
示す；Ｒ＞1.0は、増加を示す）。Ｋ_d(Glc)、Ｋ_d(Gal)：それぞれグルコースおよびガラクトースにおける結合定数（μＭ）（nd：未実施；結合定数は、Ｒ≠1.
0の全ての場合で決定した）。野生型は、Ｋ_d(Glc)=0.2μＭ、およびＫ_d(Gal)=0.
4μＭを有する(Millerら、J.Biol.Chem.258:13665-13672(1983年))。Ｎ15Ｃおよ
びＨ152Ｃは、非アロステリックレポーター基のための位置で、他の４つの突然変異体は、アロステリックフラップのヒンジ部に位置している。

【００２９】ヒンジ部にある４つの全ての突然変異体は、リガンド結合におけるそれらのア
クリロダンまたはＩＡＮＢＤ複合体の蛍光において変化を示した。位置255におけるアクリロダン複合体は、最も大きな変化を与える（２倍減少；図２Ａ）。全
ての場合において、グルコースまたはガラクトース濃度の関数として蛍光の変化
を測定することで、１つの部位の双曲線型結合曲線が構成され、そこから我々は
予想通り、ヒンジ部に結合された蛍光体が、アロステリックに糖結合ポケットへ
連結されると結論する。さらに、糖結合定数は、４つの因子だけによって影響さ
れ、ＦＡＳＴおよびリガンド結合部位は、意図通り、立体的に離されていること
を示している。

【００３０】また、２つのシステイン突然変異が、結合ポケット自体に組み立てられた（図
１）。H152は、ガラクトースおよびグルコースの両方のＯ6酸素と水素結合を形成するhis152と置換されるため（Vyas et al,Biochemistry 33:4762-4768(1994)
）、直接糖と相互作用する。本研究で研究される全ての変異体の蛍光における最
も大きな変化（４倍増加）が、この位置に結合されたＩＡＮＢＤで観察された。
しかしながら、Ｏ6酸素への水素結合の減少および結合した糖への直接的な立体干渉から予想されたように、この複合体はグルコース（〜100倍）およびガラクトース（〜500倍）の結合定数において大きな増加を示す。

【００３１】糖結合ポケットからAsn15は離れて位置するので、Ｎ15Ｃに結合された蛍光体は、糖との直接的な相互作用によってというよりはむしろ、ドメイン間距離の変
化に応答するはずである。アクリロダンおよびＩＡＮＢＤ複合体は、位置152におけるＩＡＮＢＤほど大きくはないが、糖結合における変化を示す。しかしなが
ら、位置15における複合体は、糖結合定数を大きく乱さず、糖との直接的な相互
作用が存在しないことを示す。

【００３２】実施例４：蛍光体複合体の微視的環境アクロリダンおよびＩＡＮＢＤのどちらも、それらの微視的環境における極性
の変化に敏感であり（Ghosh et al,Biochem.J.108:155(1968)；Macgregor et al
,Nature 319:70-73(1986)；Weber et al,Biochemistry 18:3075-3078(1979年)）
、それは、溶媒アクセシビリティー、プローブの可動性における変化および周囲
のタンパク質（または、H152C−NBD複合体の場合には、リガンド）との立体相互
作用における変化に起因する。そのような微視的環境変化は、それらの極大波長
のシフトだけでなく、放出強度の相違として明らかである。アクリロダンの放出
極大は特に環境の極性に依存すると知られており、水成環境に関連した非極性に
おける青シフトを示す（Macgregor et a,Nature 319:70-73(1986)；Weber et al
,Biochemistry 18:3075-3078(1979)）。

【００３３】相違する部位の応答は、広範囲にわたって様々である。幾つかの場合において
、特定の部位に結合した２つの複合体のうち１つのみが、糖の結合に対して応答
する（表１参照）。さらに、複合体のどれもリガンド結合における放出極大の感
知しうるシフトを示さない。ヒンジ部における最もすぐれたアロステリック信号
変換体の様子、Ｌ255Ｃ−アクリロダン（図３）、をより詳しく調査した。この複合体の放出スペクトルは、２つの極大（498および520ｎｍ；図２Ａ）を有し、
結合されたアクリロダンが、水に関連したそれらの青シフトに基づき、水および
エタノールとの中間である極性が異なる２つの別の環境に存在することを示唆し
ている（Prendergast et al,J.Biol.Chem.259:7541-7544(1983)）。両ピークは、それらの相対強度はリガンド結合において多少変化はするものの、アポおよび
糖結合型で存在し、２つの状態間で再配置はわずかであること示唆する。リガン
ド結合によって起こる蛍光体の極性緩和の変化に対する結合部位における溶媒ア
クセビリティの相違の潜在的な寄与を調べるために、我々はグルコース存在下お
よび非存在下において、蛍光における沃化物の効果を測定した。沃化物は溶媒に
さらされた蛍光体を選択的に抑制する。抑制の度合いは、定常状態衝突抑制を表
すシュテルン−フォルマーの式に従う：Ｆ₀／Ｆ＝１＋Ｋ[Ｉ^-]（２）そこで、Ｆ₀／Ｆは蛍光の減少割合およびＫは溶媒アクセシビリティの度合いに関連するシュテルン−フォルマー抑制定数（溶媒にさらされた蛍光体において、
Ｋ＞1.0）。アクリロダンの両放出極大において測定される抑制定数はほぼ同じであり、グルコース添加において変化せず、＞１である（図３）ことを見出し、
両アクリロダン立体配座は部分的に溶媒にさらされ、微視的環境における変化は
、溶媒アクセシビリティにおける変化を含みそうにないことを示す。同様に他の
複合体でも観察された。

【００３４】これらの結果は、立体配座変化が結合された蛍光体の双極子緩和に影響するメ
カニズムは、結合位置の局部的な溶媒アクセシビリティにおける変化を含まない
が、ＭＢＰの結合部位に結合されたＩＡＮＢＤにおいても観察されたように（Gi
lardi et al,Prot.Engin.5:479-486(1997)）、その微視的環境との蛍光体の詳細
な相互作用に依存することを示唆する。

【００３５】実施例５：グルコース結合定数の改変実験的に測定されるＧＢＰ３次元構造の試験（図４参照）は、グルコース結合
部位（水素結合またはファンデルワールス相互作用を通してグルコースと直接接
触する残基（第一結合表面）および第一結合表面における残基を配向させるため
に働く残基（第二結合表面））を形成する２つの型の残基が存在することを示す
。（大腸菌ＧＢＰにおける第一結合表面：Asn14、Asn91、His152、Asp154、Arg1
58、Asn211、Asp236、Asn256；大腸菌ＧＢＰにおける第二結合表面：Tyr10、Phe
16、Met17、Asn66、Ser112、Ser115、Trp183、Asn210、Met214、Gln261、Tyr295
）。グルコースの結合定数を変化させるために、両表面の残基を、１つまたは１
対のどちらかで体系的に突然変異させた。得られたデータを表２に示した。Asp1
54Ala、Trp183Ala(D154A＋W183A)の二重突然変異体は、7.2ｍＭの結合定数を有する。従って、変動範囲は生理的に関連したグルコース濃度範囲において作用す
るために調和している。

【００３６】

【表２】実施例６：光学装置青ＬＥＤの放出波長（470ｎｍで極大、半パワー±30ｎｍ）は、ナイルブルー色素（ＮＢＤ）蛍光体の励起波長（469ｎｍで極大）に完全に匹敵するので、単純な原器の特別な目的のための蛍光器が、安価に、簡単に、素早く利用できる電
子部分を基に構成された（図５参照）。１ｍｌキュベットを、ニチア化学(Nichi
a Chemical)ケイ素−混合窒化ガリウム青ＬＥＤ（20ｍＡで３ｃｄ）で照射する。サンプルの中に光を集めるため、二重の凸レンズが用いられる。放出光からの
励起光を分離するために、ハイパスガラスフィルター（515ｎｍ遮断）が用いられる。放出された光を検出するために、広い（100ｍｍ²）平面拡散ＳｉＰＩＮフ
ォトダイオード（光子検出器）が用いられる。フォトダイオードは、非バイアス
（光起電力）モードで作動し、低ノイズおよび低周波数運転において最適化され
る。信号はローパスフィルターされ（5Ｈｚ遮断）、続いて所望の低−および高 −末端キャリブレーションを達成するために可変サマーおよび可変ゲイン増幅器
を通過する。すべてのアナログ信号処理のために、ＬＴ1028（超低ノイズ）演算
増幅器が用いられる。アナログ入力からノイズを平均化するために、総変換時間
〜150ｍｓの12ビットデュアルスロープ積分型アナログ・ディジタルコンバーターが用いられる。デジタル出力は、27Ｃ64ＥＰＲＯＭを通して供給される。表示
は４つの７−セグメントグリーンＬＥＤディスプレー上に現れる。この計器は、
双曲線型結合曲線を構成するのに十分精密にリガンド結合におけるＮＢＤ蛍光変
化を検出できる。

【００３７】全ての上記引用文書は、本文で参照文献欄に完全に記載している。

【００３８】本技術分野の当業者は、形態および細部の様々な変化が本発明の真の領域から
はずれることなく行われ得るということを、この開示を読むことで十分理解する
であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】夫々の基質と複合体を形成した閉鎖形態のMBP（Spurlino et al., J. Biol. C
hem. 266:5202-5219(1991)）（top; Protein Data Bank ref 2MBP）およびGBP（
Vyas et al, Nature, 327:635-638(1987)；Vyas et al., Science 242:1290-129
5(1988)）（Vyas et al., Biochemistry 33:4762-4768(1944)）（bottom:PDB re
f IGLG）の比較であり、位置を示している。結合した蛍光体の結合部位は球によ
り示されている。MBPの「フラップ」領域に位置する球は、最良のアロステリック応答を与えることが分かった蛍光体の位置を示している（Marvin et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371 (1977)）（Asp95Cysに結合される）。この結果に基づいて、GBPの類似領域における四つの部位（255，258，294，296 ）が、潜在的にグルコース結合性ポケットにアロステリックに結合することが予
測される。グルコース結合性ポケット内に位置する部位15および152は、潜在的な非アロステリックレポーター基のための位置である。リボン図形はモルスクリ
プト(Molscript)で作製された（Krollis, J. Appl. Crystal. 24:946-950(1991)
）。

【図２】 L255C-アクリロダン複合体（図２Ａ）およびH152C-IANBD複合体（図２Ｂ）へのグルコースの結合。結合曲線は３回の別々の滴定の平均である（誤差バーは示
された円よりも小さい）。挿入図は、飽和グルコースの添加に際しての放出光ス
ペクトルの変化を示している：グルコースなし（破線）、10mMグルコース（実線
）。

【図３】 L255-アクリロダン複合体の沃化物による溶質クエンチング。沃化物を添加したときの498nmでの蛍光放出におけるＦ_０／Ｆ画分変化。アポタンパク質（塩）について、および10mMグルコースの存在下（菱形）でクエンチングを測定し、49
8nm（塗り潰し）および520nm（白抜き）での最大放出についてプロットした。

【図４】 GBPにおけるグルコース結合性ポケット（タンパク質データバンクRef 2GBP）

【図５】青LEDに基づく蛍光計

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコース結合性タンパク質（GBP）および検出可能な信号を変換するレポーター基を具備するグルコースバイオセンサーであって、前記レ
ポーター基は、前記GBPがグルコースに結合しているときに前記レポーター基によって変換された信号が、前記GBPがグルコースに結合していないときに前記レポーター基により変換された信号とは異なるように、前記GBPに結合されるバイオセンサー。
【請求項２】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター
基は、前記GBPのグルコース結合部位から離れた部位において前記GBPに結合され
るバイオセンサー。
【請求項３】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター
基は、前記GBPのグルコース部位に結合されるバイオセンサー。
【請求項４】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター
基が蛍光体であるバイオセンサー。
【請求項５】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター
基が酸化還元共同因子であるバイオセンサー。
【請求項６】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて0.8μM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項７】請求項６に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて1mM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項８】請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは突然変異体バクテリアタンパク質であるバイオセンサー。
【請求項９】請求項８に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて0.8μM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項１０】請求項９に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて1mM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項１１】請求項９に記載のバイオセンサーであって、前記突然変異
体タンパク質が突然変異体E. coliタンパク質であるバイオセンサー。
【請求項１２】請求項１１に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、154および183の位置において野生型E. coliのGBPとは異なるバイオセンサー。
【請求項１３】請求項１２に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、154および183の位置にアラニンが存在するバイオセンサー。
【請求項１４】請求項１３に記載のバイオセンサーであって、前記レポー
ター基が蛍光体であるバイオセンサー。
【請求項１５】請求項１３に記載のバイオセンサーであって、前記レポー
ター基は255位置のシステイン残基に結合されるバイオセンサー
【請求項１６】被検サンプル中におけるグルコースの存在を検出する方法
であって：請求項１に記載のバイオセンサーを、前記バイオセンサーが前記被検サンプル
中に存在するグルコースと結合できる条件下で前記被検サンプルに接触させるこ
とと；前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター
基により変換された信号を、前記バイオセンサーがグルコースを含まない対照サ
ンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号と比較する
こととを具備し、前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター
基により変換された信号の、前記バイオセンサーが前記対照サンプルと接触して
いるときと比較した差によって、被検サンプルがグルコースを含有することが示
される方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記被検サンプルが生
理学的液体である方法。。
【請求項１８】請求項１７に記載の方法であって、前記生理学的液体が血
液、尿、唾液の間質液である方法。
【請求項１９】被検サンプル中のグルコース濃度を決定する方法であって
：請求項１に記載のバイオセンサーを、前記バイオセンサーが前記被検サンプル
中に存在するグルコースと結合できる条件下で前記被検サンプルに接触させるこ
とと；前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター
基により変換された信号を、前記バイオセンサーが公知の量のグルコースを含有
する対照サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号
を測定することにより作成された標準の双曲線的グルコース結合曲線と比較し、
これにより前記決定を行うこととを具備した方法。
【請求項２０】請求項２０に記載の方法であって、前記被検サンプルが生
理学的液体である方法。
【請求項２１】請求項２０に記載の方法であって、前記生理学的液体が血
液、尿、唾液の間質液である方法。