ES2314102T3 - Nuevos peptidos derivados de la proteina g del vrs y su uso en una vacuna. - Google Patents
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Abstract
Péptido inmunógeno derivado de la proteína G del VRS (virus sincitial respiratorio) del sub-grupo A o B que comprende por lo menos: - un primer péptido derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o B que comprende por lo menos en posición 173, 176, 182 y 186 una cisteína, y en posición C-terminal como máximo el aminoácido en posición 192; y - un segundo péptido derivado de una proteína del VRS del sub-grupo A o B, estando dicho segundo péptido situado corriente abajo de dicho primer péptido, de manera que el péptido inmunógeno producido presenta un puente disulfuro que une los residuos 173 y 186 y un segundo puente disulfuro que une los residuos 176 y 182, caracterizado porque dicho péptido inmunógeno derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o B presenta la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3.
Description
Nuevos péptidos derivados de la proteína G del
VRS y su uso en una vacuna.
La presente invención se refiere al virus
respiratorio sincitial, y más particularmente a la identificación
de nuevos antígenos, útiles en particular para el tratamiento
terapéutico y profiláctico de las afecciones provocadas por
este
virus.
virus.
El Virus Respiratorio Sincitial (VRS) está
clasificado en la familia de los Paramyxoviridae, tipo
pneumovirus que comprende un genoma ARN no segmentado, de polaridad
negativa, que codifica para 11 proteínas específi-
cas.
cas.
El VRS es uno de los agentes etiológicos
encontrados más frecuentemente en el niño y en las personas mayores.
Las bronquiolitis son frecuentemente graves en el niño y necesitan
hospitalización. Actualmente, no existe ningún medio de prevención
contra la enfermedad causada por el VRS. La primera infección
causada por el VRS no previene contra la siguiente. El tratamiento
de los casos graves mediante antibioterapia (Ribavirina) y/o
asociado con la inmunoterapia (inmunoglobulinas humanas) no puede
atenuar la agravación de la enfermedad. Se ha desarrollado asimismo
un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína F
del VRS denominado palivizumab (Synagis TM). Sin embargo, este tipo
de tratamiento sigue siendo muy costoso. En los años 60, las
tentativas de inmunizar unos niños con una vacuna VRS inactivada por
formalina (FI-VRS) habían tenido por consecuencia
la agravación de la enfermedad en lugar de conferir una protección
contra la infección natural por VRS. Esta agravación de la
enfermedad se ha caracterizado por un aumento de los neutrófilos
polimorfonucleares, de los linfocitos y de los eosinófilos en la
sangre y en los pulmones (Kim et al., Pediatric Res.,
10:75-78, 1976). Se ha demostrado asimismo en el
ratón que FI-VRS inducía una respuesta inmune de
tipo Th2 (T-helper-2), que se
traduce en particular por una producción importante de
IL-4, de IL-5, de
IL-10 y de IL-13, de las citoquinas
Th2. Unos estudios recientes han permitido correlacionar esta
inmunopatología observada tras la administración de
FI-VRS con una región precisamente determinada, un
epítopo CD4+ de secuencia 185-193 de la proteína G
(ICK.RIPNKK, SEC ID nº 10), que demuestra ser primordial para
obtener una respuesta en citoquinas Th2 en los ratones (Varga et
al., J. Immunol., 165:6487-6495,
2000).
2000).
La solicitud WO 87/04185 ha propuesto usar unas
proteínas estructurales del VRS con vistas a una vacuna, tal como
las proteínas de envoltura denominadas proteínas F (proteína de
fusión) o proteína G (proteína de enlace), una glucoproteína de 22
Kd, una proteína de 9,5 Kd, o la proteína principal de cápside
(proteína N).
La solicitud WO 89/02935 describe las
propiedades de protección de la proteína F completa del VRS,
eventualmente modificada en forma monomérica o desglucosilada.
En la solicitud WO 95/27787, se ha demostrado
que la proteína G del VRS puede ser útil en la preparación de
productos destinados al tratamiento y/o a la prevención de
afecciones provocadas por el VRS, sub-grupo A o
B.
En la solicitud WO 97/46581 se han descrito unos
péptidos estructuralmente homólogos a la secuencia
149-197 de la proteína G, y en la que ningún
oligosacárido está enlazado a una serina, treonina o asparagina.
En cuanto a la solicitud WO 99/03987, ésta
describe unos fragmentos de la proteína G del VRS que contienen
unos epítopos específicos, usados en una vacuna contra la infección
por el VRS.
Sin embargo, ninguna de esta solicitudes ha
resuelto el problema de la puesta a punto de antígenos del VRS que
permiten obtener al mismo tiempo una respuesta inmune suficiente y
protectora, una protección cruzada VRS A y B y que presentan el
menor riesgo posible de inmunopatologías asociadas con la producción
de citoquinas de tipo
Th2.
Th2.
Además, para unas vacunas destinadas a los
recién nacidos, también es deseable que el antígeno usado presente
una hipersensibilidad inmediata (o HSI) negativa. La
hipersensibilidad inmediata o anafiláctica a IgE, de tipo I según
la clasificación de Gell y Coombs, agrupa las manifestaciones
clínicas observadas durante ciertas afecciones respiratorias,
oculares, cutáneas, digestivas... Se puede correlacionar una
respuesta HSI positiva o una respuesta de tipo Th2 con producción
de IL-5 y de IgE; así, a fin de reducir el riesgo de
patologías asociadas con una vacunación contra el VRS, es deseable
no inducir a través de la molécula vacunal una respuesta de tipo
Th2.
Se ha observado asimismo por los inventores que
la producción de péptidos derivados de la proteína G planteaban
múltiples problemas, en particular a nivel de la formación de
puentes disulfuros, que deben encontrarse en la misma configuración
que la de la proteína G nativa. En efecto, el emparejamiento nativo
entre los puentes disulfuros debe ser respetado conservando al
mismo tiempo un buen rendimiento.
Así, el objetivo de la presente invención es
obtener nuevos péptidos derivados de la proteína G que responden a
los problemas mencionados anteriormente, fáciles de producir
industrialmente y que permiten obtener una respuesta inmune tanto
como una protección suficiente, una protección cruzada VRS A y B, y
el menor riesgo posible de inmunopatologías, y que presentan en
particular una HSI negativa.
De manera sorprendente, se ha puesto en
evidencia que un péptido inmunógeno derivado de la proteína G del
VRS del sub-grupo A o B que comprende por lo
menos:
- -
- un primer péptido derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o B, que comprende por lo menos en posición 173, 176, 182 y 186 una cisteína, y cuyo extremo C-terminal comprende como máximo el aminoácido en posición 192; y
- -
- un segundo péptido derivado de una proteína del VRS del sub-grupo A o B, estando dicho segundo péptido situado corriente abajo de dicho primer péptido,
de manera que el péptido inmunógeno producido
presenta un puente disulfuro que une los residuos 173 y 186 y un
segundo puente disulfuro que une los residuos 176 y 182, responde a
los problemas mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, la presente invención tiene por objeto un
péptido inmunógeno derivado de la proteína G del VRS del
sub-grupo A o B que comprende por lo menos:
- -
- un primer péptido derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o B que comprende por lo menos en posición 173, 176, 182 y 186 una cisteína, y cuyo extremo C-terminal comprende como máximo el aminoácido en posición 192; y
- -
- un segundo péptido derivado de una proteína del VRS del sub-grupo A o B, estando dicho segundo péptido situado corriente abajo de dicho primer péptido,
de manera que el péptido inmunógeno producido
presente un puente disulfuro que une los residuos 173 y 186, y un
segundo puente disulfuro que une los residuos 176 y 182,
caracterizado porque dicho péptido inmunógeno presenta la secuencia
SEC ID nº 1, SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3.
Mediante la expresión "péptido inmunógeno"
se entiende cualquier péptido que, cuando se asocia a un vehículo o
a un adyuvante, es capaz de generar o aumentar una respuesta
inmunitaria dirigida contra el VRS. Preferentemente, este péptido
inmunógeno permite asimismo obtener una protección cruzada VRS A y
B.
Se debe entender que, cuando dicho segundo
péptido se selecciona de entre los péptidos derivados de la proteína
G del VRS, dicho segundo péptido no es un péptido naturalmente
contiguo corriente abajo de dicho primer péptido en la secuencia de
dicha proteína G, esto para evitar volver a caer sobre un péptido
inmunógeno cuya secuencia estaría naturalmente incluida en la
secuencia salvaje de dicha proteína G, o en la de una de sus
variantes naturales. En efecto, estas secuencias, ya descritas en
los documentos de la técnica anterior citados anteriormente, no
permiten obtener al mismo tiempo la formación y la configuración de
los puentes disulfuros esperados (véase a continuación) y una HSI
negativa.
En la presente invención, se entenderá asimismo
mediante el término "péptido" los polipéptidos.
Mediante la expresión "situado corriente abajo
de dicho primer péptido" se debe entender que el segundo péptido
está situado en posición 3' con relación al primer péptido.
Mediante péptido "que comprende por lo menos
en posición 173, 176, 182 y 186 una cisteína, y cuyo extremo
C-terminal comprende como máximo el aminoácido en
posición 192", se entiende cualquier péptido que presenta por lo
menos 4 cisteínas en la misma configuración que la proteína G
nativa. Los números de posición hacen referencia a la proteína G
nativa del VRS y no significan que el primer péptido según la
invención comprenda obligatoriamente todos los 192 aminoácidos de
la proteína nativa, sino que este péptido es un péptido de secuencia
n-m, siendo n = I-172 y m =
187-192.
Mediante la expresión "proteína G del VRS del
sub-grupo A o B" se entiende la proteína de
envoltura del VRS A o B.
Se describe que el péptido según la invención se
puede sintetizar en un único bloque, es decir, es en realidad un
único péptido que se puede considerar como el ensamblaje de un
primer y de un segundo péptido tal como se ha definido
anteriormente.
Estos dos péptidos se pueden asimismo acoplar.
El acoplamiento es preferentemente un acoplamiento covalente, que
se puede realizar por vía química o mediante unas técnicas de ADN
recombinante.
Se describe que el péptido se puede obtener en
particular mediante síntesis química peptídica habitual,
preferentemente sin etapas de glucosilación, conocida por el
experto en la materia o por vía recombinante, preferentemente sin
glucosilación.
Los métodos de preparación de los péptidos
recombinantes glucosilados o preferentemente no glucosilados son
muy conocidos por el experto en la materia en la actualidad y no se
desarrollarán en la presente descripción. Entre las células que se
pueden utilizar para la producción de estas proteínas recombinantes,
se pueden citar en particular las células bacterianas (Olins P.O. y
Lee S.C., Curr. Op. Biotechnology, 4:520-525, 1993),
y más particularmente E. coli.
Se describe que el extremo
C-terminal de dicho primer péptido comprende como
máximo el aminoácido en posición 190.
Se describe asimismo que dicho primer péptido
presenta una secuencia seleccionada de entre la secuencia de la
proteína G del VRS de sub-grupo A o B
130-190, 130-192,
140-190, 140-192,
145-190, 145-192,
148-190, 148-192,
130-188, 140-188,
145-188 o 148-188 y preferentemente
la secuencia 140-190.
Se describe también que dicho segundo péptido
está constituido por una cadena de por lo menos 5 aminoácidos,
preferentemente 6, 7, 8, 9 y 10 aminoácidos.
En efecto, como ya se ha demostrado en los
ejemplos siguientes, es necesario que el fragmento del péptido
inmunógeno según la invención contiguo a la posición 186 de dicho
primer péptido comprenda por lo menos más de 4 aminoácidos para
permitir obtener la formación y la configuración de los puentes
disulfuros esperados.
Se describe asimismo que dicho segundo péptido
contiene por lo menos un epítopo B del VRS A o B. Este péptido
puede derivarse en particular de la proteína G o F del VRS.
Se describe asimismo que dicho segundo péptido
se selecciona de entre los fragmentos de la proteína G del VRS que
comprende por lo menos el fragmento 144-158 de la
proteína G del VRS, comprendiendo el extremo
C-terminal de dicho segundo péptido como máximo el
aminoácido en posición 172.
Así, dicho segundo péptido puede presentar una
secuencia seleccionada de entre la secuencia
144-158, 144-159 de la proteína G
del VRS y de entre los péptidos neutralizantes descritos de la
proteína F (descrito por Trudel et al., J. Gen. Virol.,
68:2273-2280, 1987; Trudel et al., Can. J.
Microbiol. 33:933-938, 1987; Lopez et al.,
J. Virol., 64:927-930, 1990 y Scopes et al.,
J. Gen. Virol., 71:53-59, 1990) tales como los
péptidos de secuencia 221-237,
274-287, 262-268 y
483-488 de la proteína F del VRS.
Se describe que dicho segundo péptido presenta
la secuencia 144-158 o 144-159 de la
proteína G del VRS.
Se describe que dicho péptido inmunógeno
derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o
B presenta una HSI negativa.
Como ejemplo de péptidos, se pueden citar los
péptidos inmunógenos constituidos por un primer péptido que
presenta una secuencia seleccionada de entre la secuencia de la
proteína G del VRS de sub-grupo A o B
140-190 ó 140-192, y por un segundo
péptido que presenta una secuencia seleccionada de entre la
secuencia 144-158 ó 144-159 de la
proteína G del VRS.
Así, la presente invención tiene por objeto los
péptidos de secuencias SEC ID nº 1 (denominada G20a), SEC ID nº 2
(denominada G20aP) y SEC ID nº 3 (denominada G23a).
La invención se refiere asimismo a las
secuencias de ácido nucleico que codifican para un péptido según la
invención.
La invención tiene asimismo por objeto una
composición farmacéutica caracterizada porque comprende en un medio
farmacéuticamente aceptable por lo menos un péptido según la
invención o una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho
péptido.
Estas composiciones según la invención pueden
contener además por lo menos una proteína portadora y/o un
adyuvante.
Se describe que la proteína portadora se puede
seleccionar ventajosamente de entre la proteína TT (tetanus
toxoide), la proteína DT (toxoide diftérica), la proteína de unión a
la seroalbúmina humana del estreptococo y sus fragmentos, la toxina
colérica (CT) su sub-unidad B (CTB), la enterotoxina
de E. coli (LT) o su sub-unidad B (LTB) y
los extractos de proteínas membranarias bacterianas tales como las
OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect.
Immun., 60:4977-4983, 1992), TraT de Escherichia
coli (Croft et al., J. Immunol.,
146:793-798, 1991) o PorB de Neisseria
meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis.,
175:364-372, 1997) o cualquier otra proteína que
presenta un epítopo Th.
Se describe que una de las proteínas portadoras
puede consistir en una OmpA de una bacteria del género
Klebsiella, proteína principal de la membrana externa
denominada P40, que presenta una actividad de proteína portadora,
por vía sistémica, para unos antígenos sub-unitarios
peptídicos (documentos WO 95/27787 y WO 96/14415; Haeuw et
al., Eur. J. Biochem., 255:446-454, 1998;
Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol.,
73:5637-5645, 1999).
La secuencia de aminoácido de la proteína P40 se
identifica, por ejemplo, en el listado de secuencias del documento
WO 99/49892 mediante la secuencia SEC ID nº 1.
Un portador particularmente preferido consiste
en unos derivados atóxicos de la proteína DT (toxoide diftérica),
en los se ha suprimido por lo menos un residuo cisteína. Como
ejemplo de tal portador, se pueden citar las proteínas de
secuencias SEC ID nº 4 (denominada DTa), SEC ID nº 5 (denominada
DTb) y SEC ID nº 6 (denominada DTaDTb).
Según la presente invención, el adyuvante se
puede seleccionar en particular de entre el MPL-A
("MonoPhosphoryl Lipid A"), el MF-59®, el
Quil-A® (adyuvante derivado de saponina), ISCOM
("ImmunoStimulating COMplex"), el dioctadecildimetil amonio en
forma de bromuro (DDAB) o de cloruro (DDAC), el alo (hidróxido de
aluminio), el adjuphos, los CpG (oligodesoxinucleótidos que
contienen un motivo específico centrado sobre un dinucleótido CpG),
el Leif (factor de iniciación, de elongación de Leishmania, antígeno
proteico derivado de Leishmania capaz de estimular las células PBMC
y presentadoras de antígeno, y de producir una reacción citoquina de
tipo Th-1), la CT (toxina colérica), la LT ("heat
Labil Toxin") y las versiones detoxificadas de la CT o la LT.
El péptido según la invención se puede asociar,
en particular mediante mezcla o mediante acoplamiento, a la
proteína portadora.
Se describe que el acoplamiento es
preferentemente un acoplamiento covalente, que se puede realizar por
vía química o mediante unas técnicas de ADN recombinante.
Se describe un modo de realización particular en
el que se introduce uno o varios elementos de unión en el péptido
según la invención y/o en dicho portador para facilitar el
acoplamiento químico, pudiendo ser dicho elemento de unión
introducido un aminoácido.
Así, es posible introducir uno o varios
elementos de unión, en particular unos aminoácidos para facilitar
las reacciones de acoplamiento entre el péptido según la invención y
el portador. El acoplamiento covalente entre el péptido según la
invención y dicho portador puede realizarse en el extremo N- o
C-terminal de dicho péptido. Los agentes reactivos
bifuncionales que permiten este acoplamiento se determinarán en
función del extremo de dicho péptido elegido para efectuar el
acoplamiento, y de la naturaleza de dicho portador a acoplar.
El acoplamiento entre el péptido según la
invención y dicho portador puede realizarse mediante recombinación
genética, cuando dicho portador es de naturaleza peptídica.
Los conjugados procedentes de un acoplamiento
entre el péptido según la invención y dicho portador pueden
prepararse mediante recombinación genética. La proteína quimérica o
híbrida (el conjugado) se puede producir mediante unas técnicas de
ADN recombinante mediante inserción o adición a la secuencia de ADN
que codifica para dicho péptido según la invención, de una
secuencia que codifica para dicho portador de naturaleza
proteica.
Los procedimientos de síntesis de las moléculas
híbridas abarcan los métodos usados en ingeniería genética para
construir unos polinucleótidos híbridos que codifican para las
secuencias polipeptídicas buscadas. Se podrá, por ejemplo, hacer
referencia ventajosamente a la técnica de obtención de genes que
codifican para unas proteínas de fusión descritas por D.V. Goeddel
(Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185,
3-187, 1990).
Así, la invención tiene por objeto unos péptidos
según la invención que comprenden asimismo un derivado de la
proteína DT (toxoide diftérica), en los que se ha suprimido por lo
menos un residuo cisteína, caracterizado por una de las secuencias
SEC ID nº 7 (denominada G20a-DTa), SEC ID nº 8
(denominada G20a-DTb) y SEC ID nº 9 (denominada
G20a-DTaDTb), así como los ácidos nucleicos que
codifican para los polipéptidos de secuencias SEC ID nº 7, SEC ID
nº 8 y SEC ID nº 9.
Se describe que el péptido según la invención
puede estar conjugado a la proteína portadora por una proteína de
unión; esta proteína de unión se puede seleccionar en particular de
entre un receptor de la albúmina sérica de mamífero y los
receptores presentes en la superficie de las células mucosales.
La invención tiene asimismo por objeto la
composición según la invención, caracterizada porque dicha
composición farmacéutica comprende además por lo menos un segundo
antígeno, inmunógeno o hapteno del VRS y/o un antígeno, inmunógeno
o hapteno derivado del micro-organismo responsable
de patologías de las vías aéreas seleccionado de entre los virus de
la parainfluenza (VIP 1, 2, 3 y 4), el virus de la influenza
(A y B), los hantavirus, los estreptococos, los neumococos,
haemophilus influenza de tipo b, los rinovirus, los
coronavirus y los meningococos.
Mediante "inmunógeno, antígeno o hapteno"
se entiende en particular cualquier compuesto expresado por un
agente infeccioso, o uno de sus análogos estructurales, que solo o
en asociación con un adyuvante o portador es capaz de inducir una
respuesta inmunitaria específica de dicho agente infeccioso.
Mediante "inmunógeno, antígeno o hapteno"
se entiende asimismo en la presente descripción un compuesto que
presenta una analogía estructural con dicho antígeno o hapteno capaz
de inducir una respuesta inmunológica dirigida contra dicho
antígeno o hapteno en un organismo previamente inmunizado con dicho
compuesto análogo.
Se describe que dicho segundo antígeno del VRS
puede comprender por lo menos un fragmento de la proteína G del
virus respiratorio sincitial, comprendiendo dicho fragmento un
epítopo T o estando únicamente compuesto por dicho epítopo T.
Se describe que dicho segundo antígeno del VRS
comprende por lo menos un fragmento de la proteína F del virus
respiratorio sincitial, comprendiendo dicho fragmento un epítopo T o
estando únicamente compuesto por dicho epítopo T.
En el sentido de la presente invención, el medio
farmacéuticamente aceptable es el medio en el que se administran
los compuestos de la invención, preferentemente un medio inyectable
en el ser humano. Puede estar constituido por agua, por una
disolución acuosa salina o por una disolución acuosa a base de
dextrosa y/o de glicerol.
La invención comprende asimismo una composición
según la invención, caracterizada porque dicha composición
farmacéutica está vehiculada en una forma que permite mejorar su
estabilidad y/o su inmunogenicidad; así, se puede vehicular en
forma de liposomas, virosomas, nanoesferas, microesferas o
microcápsulas.
La invención tiene asimismo por objeto unos
anticuerpos, monoclonales o policlonales, dirigidos contra los
péptidos según la invención.
Los anticuerpos monoclonales están,
preferentemente, humanizados y pueden estar producidos por la vía
recombinante. También se pueden obtener mediante el método de
librería de fagos.
Se describe que el anticuerpo monoclonal,
policlonal o uno de sus fragmentos, está caracterizado porque es
capaz de fijarse específicamente sobre un epítopo o determinante de
los péptidos no glucosilados según la invención.
Los anticuerpos monoclonales se podrán preparar
ventajosamente a partir de hibridomas según la técnica descrita por
Kohler y Milstein en 1975 (Nature, 256:495-497,
1975).
Los anticuerpos policlonales se podrán preparar,
por ejemplo, mediante inmunización de un animal, en particular un
ratón o un conejo, con el péptido según la invención asociado con un
adyuvante de la respuesta inmunitaria, y después purificación de
los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales
inmunizados sobre una columna de afinidad sobre la cual se ha
fijado previamente dicho péptido que ha servido de antígeno.
Se describe asimismo cualquier fragmento de
anticuerpo monoclonal de la invención capaz de fijarse sobre un
epítopo del péptido según la invención sobre el cual se fija el
anticuerpo monoclonal o policlonal del cual procede dicho
fragmento. Unos ejemplos de dichos fragmentos comprenden en
particular unos anticuerpos monoclonales de cadena simple o unos
fragmentos monovalentes Fab o Fab', y unos fragmentos divalentes
tales como F(ab')2, que poseen la misma especificidad de
fijación que el anticuerpo monoclonal o policlonal del cual
proceden. Dicho fragmento podrá asimismo ser un fragmento Fv de
cadena simple producido mediante unos métodos conocidos por el
experto en la materia, y tal como se han descrito, por ejemplo, por
Skerra et al. (Science, 240:1038-1041, 1988)
y King et al. (Biochemical J., 290:723-729,
1991).
Se describe que unos fragmentos de anticuerpos
monoclonales o policlonales se pueden obtener a partir de los
anticuerpos monoclonales o policlonales tal como se han descrito
anteriormente mediante unos métodos tales como la digestión
mediante unas enzimas, como la pepsina o la papaína y/o mediante la
escisión de los puentes disulfuros por reducción química. De otra
manera, los fragmentos de anticuerpos monoclonales o policlonales
se pueden sintetizar mediante unos sintetizadores automáticos de
péptidos tales como los suministrados por la compañía Applied
Biosystems, etc., o se pueden preparar manualmente usando unas
técnicas conocidas por el experto en la materia y tal como se han
descrito, por ejemplo, por Geysen et al. (J. lmmunol.
Methods, 102:259-274, 1978).
En general, para la preparación de anticuerpos
monoclonales, policlonales o sus fragmentos, se puede hacer
referencia a las técnicas que se describen en particular en el
manual "Antibodies" (Harlow et al., Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications p. 726, 1988) o a
la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por
Kohler y Milstein en 1975.
Los anticuerpos monoclonales humanizados según
la invención, o sus fragmentos, se pueden preparar mediante unas
técnicas conocidas por el experto en la materia (Carter et
al., PNAS 89:4285-4289, 1992; Mountain et
al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142,
1992).
Dichos anticuerpos monoclonales humanizados
según la invención se citan en la presente memoria para su uso en
unos métodos terapéuticos.
Los anticuerpos de la invención, o sus
fragmentos, podrán ser asimismo marcados mediante un marcado de tipo
enzimático, fluorescente o radioactivo.
Los anticuerpos monoclonales marcados según la
invención, o sus fragmentos, comprenden, por ejemplo, unos
anticuerpos denominados inmunoconjugados que se pueden conjugar, por
ejemplo, con unas enzimas tales como la peroxidasa, la fosfatasa
alcalina, la
(\beta-D-galactosidasa, la glucosa
oxidasa, la glucosa amilasa, la anhidrasa carbónica, la
acetilcolinesterasa, la lisozima, la malato deshidrogenasa o la
glucosa-6 fosfato deshidrogenasa, o con una
molécula tal como la biotina, la digoxigenina o la
5-bromo-desoxiuridina. Se pueden
conjugar asimismo unos marcadores fluorescentes con los anticuerpos
monoclonales o sus fragmentos de la invención, y comprenden en
particular la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus
derivados, la GFP (GFP por "Green Fluorescent Protein"), el
dansilo, la umbeliferona, etc. En dichos conjugados, los anticuerpos
monoclonales de la invención, o sus fragmentos, se pueden preparar
mediante unos métodos conocidos por el experto en la materia. Se
pueden acoplar con las enzimas o con los marcadores fluorescentes
directamente o por medio de un grupo espaciador o de un grupo de
uniones tal como un polialdehído, tal como el gutaraldehído, el
ácido etilendiamintetraacético (EDTA), el ácido
dietilentriaminpentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de
acoplamiento tales como el peryodato, etc. Los conjugados que
comprenden unos marcadores de tipo fluoresceína se pueden preparar
mediante la reacción con un
isotiocianato.
isotiocianato.
Otros conjugados pueden comprender asimismo unos
marcadores quimioluminiscentes tales como el luminol y los
dioxetanos o unos marcadores bioluminiscentes tales como la
luciferasa o la luciferina.
Entre los marcadores que se pueden fijar sobre
el anticuerpo monoclonal, o uno de sus fragmentos, según la
invención, se prefieren asimismo los marcadores radioactivos tales
como ^{14}C, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{51}Cr,
^{152}Eu, ^{59}Fe, ^{3}H, ^{125}l, ^{131}l, ^{32}P,
^{33}P, ^{35}S, ^{75}SE y ^{99m}Tc que pueden ser
detectados mediante unos medios conocidos tales como, por ejemplo,
el contador gamma o de centelleos o mediante autoradiografía.
Los péptidos y/o los anticuerpos según la
invención, o una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho
péptido, pueden, según un modo de realización de la invención,
entrar en la composición de un kit de diagnóstico.
Los péptidos y los anticuerpos según la
invención se pueden usar a título de medicamento, y más
particularmente para la preparación de una composición destinada al
tratamiento preventivo o curativo de las afecciones provocadas por
el VRS, sub-grupo A o B.
Así, la invención se refiere asimismo al uso de
un péptido según la invención o de una secuencia de ácido nucleico
que codifica para dicho péptido, o de un anticuerpo según la
invención para la preparación de una composición farmacéutica,
preferentemente de una vacuna, destinada al tratamiento profiláctico
o terapéutico de las afecciones provocadas por el VRS,
sub-grupo A o B, que presenta una respuesta
inmunogénica, una protección cruzada VRS A y B, una HSl negativa y
que no induce ninguna inmunopatología.
Se describe asimismo el uso de un péptido según
la invención tal como se ha definido anteriormente, o de una
secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a generar o
aumentar una respuesta inmunitaria contra el VRS, y que no induce
ninguna inmunopatología.
Las leyendas de las figuras y los ejemplos
siguientes están destinados a ilustrar la invención sin limitar de
ninguna manera su alcance.
En estos ejemplos, se hará referencia a las
siguientes figuras:
Figuras 1A y 1B: Título anti-VRS
antes y después de una inmunización en ratones sin inmunizar
(expresado en log10).
Figuras 2A y 2B: Título anti-VRS
antes y después de una inmunización en ratones seropositivos frente
a VRS-A (expresado en log10).
Figuras 3A y 3B: Título anti-VRS
antes y después de una inmunización en ratones seropositivos frente
a VRS-B (expresado en log10).
Figuras 4A y 4B: protección contra un
VRS-A provocador en ratones inmunizados por G23 o
G20.
Figuras 5A y 5B: Medición de infiltraciones de
células de tipo granuloso (seguidas por el marcador
RB6-8C5) y medición de las citoquinas de tipo Th2
(IL-10 e IL-5).
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Ejemplo
1
A título de ejemplo, se ha clonado el gen que
codifica para G20a, obtenido mediante PCR, en un vector de expresión
cuyo promotor está basado en el operón triptófano (Trp). Resulta de
ello el vector denominado pTEXG20a cuyo ADN de la inserción ha sido
verificado mediante secuenciación ADN. El vector se ha transformado
en una bacteria Escherichia coli K12 denominada ICONE®.
- A.
- Fermentación: en un fermentador de 30 l (CHEMAP CMF400) que contiene 18 l de medio de cultivo mínimo (g/l) (KH_{2}PO_{4}, 6/K_{2}HPO_{4}, 4/Na_{3} citrato 2H_{2}O, 9/Extracto de levadura 1/(NH4)_{2}SO_{4}, 5/CaCl_{2}, 0,3/MgSO_{4}, 7H_{2}O, 2/Glicerol 100) y los oligoelementos (1 ml/l) y antiespumante Struktol (0,4 ml/l) suplementado con una disolución de tetraciclina y triptófano con una concentración final respectivamente (0,008 g/l) y (0,3 g/l), se inoculan 1.400 ml del mismo medio que procede de un cultivo previo de E. coli recombinante descrito anteriormente en un fermentador de 2 litros. En cultivo de tipo batch, estos parámetros físico-químicos se mantienen constantes: temperatura a 37ºC, pH a 7 ajustado con NH_{4}OH, agitación 500-1.000 rpm. Para mantener el porcentaje de O_{2} disuelto a 30%. Cuando la densidad óptica (DO 620 nm) del medio de cultivo alcanza aproximadamente el valor de 50, se puede inducir entonces la expresión de la proteína recombinante añadiendo 2 ml/litro de cultivo de una disolución de ácido 3-indolacrílico (IAA) a 12,5 g/l. Algunas horas después, la fermentación se detiene mediante enfriamiento a 4ºC después del agotamiento de sustrato carbonado (medido mediante dosificación enzimática del glicerol en el medio de cultivo). La biomasa bacteriana se obtiene mediante centrifugación continua del medio (14.000 rpm, caudal 100 l/h). El rendimiento en biomasa es de aproximadamente 38 g de células secas/l.
- B.
- Extracción: la biomasa (aproximadamente 500 g de células secas) se recoge en 10 l de tampón TST (Tris HCl 25 mM, pH 8, MgCl_{2} 6H_{2}O 5 mM, EDTA 2 mM). La suspensión bacteriana se tritura con el Manton-Gaulin (3 ciclos a 560 bares). Siendo la proteína recombinante G20a mayoritariamente soluble, la purificación puede realizarse directamente a partir de la suspensión triturada. Se puede realizar, por ejemplo, la captura de G20a mediante cromatografía de intercambio de iones en lecho expandido (Streamline, Pharmacia). Se necesitan dos o tres etapas de cromatografía suplementaria (intercambio de iones y exclusión) a fin de eliminar los contaminantes ADN y proteicos de la célula hospedante. Se analizan las proteínas purificadas sobre gel SDS-PAGE en unas condiciones reducidas, en el aparato MINI PROTEAN II SYSTEM (BioRads). Éstas se pueden visualizar con Coomassie brilliant blue R250.
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Ejemplo
2
El péptido G7a (denominado asimismo "G7")
es un fragmento de la proteína G del VRS-A
(158-190) de 33 aminoácidos. Comprende 4 cisteínas
en posición 173, 176, 182 y 186, capaces de formar 2 puentes
disulfuros. La secuencia del péptido G7 es la siguiente (SEC ID nº
11):
- K_{158}PNNDFHFEVFNFVPC_{173}SIC_{176}SNNPTC_{182}WAIC_{186}KRIP_{190}.
El péptido se obtiene con la ayuda de un
sintetizador automático de péptido en fase sólida (SPPS) en química
Fmoc/tBu partiendo del lado C hacia el lado
N-terminal en la escala de 0,25 mmoles a partir de
los aminoácidos protegidos siguientes:
Fmoc-L-Ala,
Fmoc-L-Arg(Pmc),
Fmoc-L-Asn(Trt),
Fmoc-L-Asp(OtBu),
Fmoc-L-Cys(Trt),
Fmoc-L-Glu(OtBu),
Fmoc-L-His(Trt),
Fmoc-L-lle,
Fmoc-L-Lys(Boc),
Fmoc-L-Phe,
Fmoc-L-Pro,
Fmoc-L-Ser(tBu),
Fmoc-L-Thr(tBu),
Fmoc-L-Trp,
Fmoc-L-Val,
Fmoc-L-Pro-Resina).
Se obtienen 1,750 mg de
péptido-resina al final de la síntesis. La mitad de
la muestra (890 mg) se escinde en una disolución que contiene ácido
trifluoroacético así como un fagocito (1% de TIS) y después se
liofiliza con un rendimiento de 50% de péptido reducido no
purificado.
Se solubilizan 81 mg de péptido en bruto
reducido en 64 ml de agua mezclados con 16 ml de DMSO (disolvente
oxidante) a temperatura ambiente durante 5 días. La oxidación de la
mezcla en bruto conduce a la formación de 2 formas oxidadas
enumeradas ox1 y ox2 según el orden de elución en HPLC ("High
Pressure Liquid Chromatography") y distintas de la forma
reducida mediante HPLC. La naturaleza oxidada de las 2 formas se
confirma mediante espectrometría de masas (4 RSH => 2
RS-S-R menos 4 unidades de masa
atómica; masa del péptido reducido: 3842,43 Da; masa del péptido
oxidado: 3838,43 Da).
Los 2 picos principales observados mediante
RP-HPLC (Reverse Phase-High Pressure
Liquid Chromatography) en la mezcla compleja así obtenida se aíslan
y se analizan mediante espectrometría de masas
(ES-MS, "ElectronSpray-Mass
Spectrometry"). Las masas medidas obtenidas son compatibles con
unas masas teóricas que corresponden a unas formas oxidadas del
péptido G7a (G7ox1: 1,3 mg, es decir, 1,6% de rendimiento);
RP-HPLC (RT): 13,70 min.; ES-MS:
masa calculada = 3838,43 Da/Masa medida: 3838,27 Da \pm 0,10 y
G7ox2: 1,21 mg, es decir, 1,5% de rendimiento);
RP-HPLC (RT): 15,00 min.; ES-MS:
masa calculada = 3838,43 Da/Masa medida: 3838,27 Da \pm
0,10).
0,10).
Cuatro cisteínas (enumeradas de 1 a 4 por el
lado N- hacia el lado C-terminal) en una proteína se
pueden emparejar según 3 isómeros teóricos:
1-2/3-4
1-3/2-4 y
1-4/2-3. Se han descrito unos
métodos químicos de obtención y de caracterización de los 3
isómeros teóricos del hexadecapéptido G4a, que corresponde a la
región central 172-187 de la proteína G del
VRS-A (Beck et al., J. Pept. Res., 55:24,
2000). El emparejamiento nativo de la proteína G es la forma
1-4/2-3 para el VRS bovino
(Langedijk et al., J. Gen. Virol., 77:1249, 1996) y para el
VRS humano (Beck et al., J. Pept. Res., 55:24, 2000). Se
estudia el emparejamiento de las 4 cisteínas de las 2 formas
oxidadas del péptido G7a mediante LC-MS ("Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry") y mediante
microsecuenciación de fragmentos obtenidos tras una ruptura con la
termolisina. La interpretación de los fragmentos obtenidos se
describe en la tabla 1 siguiente.
Aparece que el péptido G7ox2 es una mezcla
inseparable mediante HPLC de los péptidos
G7(1-4/2-3) y
G7(1-3/2-4) en proporción
desconocida. El rendimiento de la reacción y de la purificación es
muy baja (1,5%).
El péptido G20a es un fragmento de la proteína G
del VRS-A
(140-190)-(144-158) de 69
aminoácidos. Comprende 4 cisteínas capaces de formar 2 puentes
disulfuros. La secuencia del péptido G20a es la siguiente/SEC ID nº
1):
- MEFQ_{140}TQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPC-_{173}SlC_{176}SNNPT C_{182}WAIC_{186}KRIP_{190}S_{144}KPTTKQRQNKPPNK_{158}.
El péptido G20a se obtiene mediante síntesis
automática en fase sólida en química Fmoc/tBu a la escala de 0,25
mmoles a partir de una resina hidroximetilfenoximetilo (HMP)
pre-cargada con una Lys(Boc) (0,70 mmoles/g)
y unos Fmoc-aminoácidos protegidos a nivel de las
cadenas laterales por los siguientes grupos: tritilo (Trt) para
Asn, Gln y His; terc-butiléter (tBu) para Ser y Thr;
terc-butiléster (OtBu) para Asp y Glu,
terc-butiloxicarbonilo (Boc) para Lys y Trp, y
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(Pmc) para Arg. Las cisteínas usadas poseían los grupos protectores
ortogonales siguientes: Trt para las Cys 176 y 182 por un lado y
acetamidometilo (Acm) para las Cys 173 y 186. Al final de la
síntesis, se han escindido 1.000 mg de los 2.500 mg de
péptido-resina mediante una mezcla
TFA/EDT/tioanisol/fenol/TIS/H_{2}O: 20 ml/0,25 ml/1 ml/1,5 g/0,22
ml/1 ml. Después de 3 horas de reacción bajo agitación a
temperatura ambiente, la mezcla se filtra para eliminar la resina, y
el péptido en bruto se precipita gracias a la adición de dietiléter
frío. El precipitado se solubiliza en una mezcla
H_{2}O/CH_{3}CN/TFA: 80/20/0,1: v/v/v y después se
liofiliza.
Antes de la oxidación, se purifica el péptido en
bruto mediante RP-HPLC con la ayuda de un gradiente
de agua/acetonitrilo, y se analiza mediante RP-HPLC
(pureza RP-HPLC > 75%; rendimiento: 38%) y
ES-MS (masa calculada: 8.186,42 Da/masa medida:
8.186,40).
Formación de los puentes disulfuros en 2
etapas. Para formar el puente entre las Cys 176 y 182, no
protegidas, el péptido liofilizado se solubiliza (1 mg/ml) en una
mezcla DMSO-H_{2}O al 20% (v/v) y se agita a
temperatura ambiente durante 4 días (Tam et al, J. Am. Chem.
Soc., 113:6657, 1991). Al final de la reacción, para eliminar el
DMSO, se purifica el péptido mediante RP-HPLC en las
mismas condiciones que el péptido reducido. Las fracciones que
corresponden al pico principal se recolectan y se liofilizan. Se
somete una alícuota a un análisis mediante ES-MS
para verificar que se ha formado el primer puente disulfuro. El
segundo puente, entre las Cys(Acm) 173 y 186 se obtiene
mediante oxidación (Buku et al., Int. J. Peptide. Res., 33,
86, 1989 y Annis et al., Meth. Enzymol., 289, 198, 1997). El
péptido se solubiliza (1 mg/ml) en una mezcla de ácido acético/agua
al 80% (v/v) y se añade 10% de HCl 1 N. La disolución se satura
mediante nitrógeno. Se añaden a continuación rápidamente 10
equivalentes de yodo solubilizado en una mezcla de ácido
acético/agua al 80% (v/v), y el medio se agita durante 5 horas a
temperatura ambiente. El exceso de yodo se reduce mediante la
adición gota a gota de una disolución acuosa de ácido ascórbico
hasta que el color característico del yodo desaparezca. El péptido
oxidado en bruto se purifica mediante RP-HPLC, se
liofiliza y se analiza mediante RP-HPLC y
ES-MS.
Formación de los puentes disulfuros en 1
etapa. Se ha realizado asimismo un protocolo de obtención en
una etapa mediante oxidación directa con yodo sobre el péptido
reducido permitiendo asimismo obtener el péptido de interés. El
rendimiento pasa entonces de 22 a 44% (pureza
RP-HPLC > 90%; masa calculada: 8.140,22 Da/masa
calculada: 8.040,30 Da).
El emparejamiento de los puentes disulfuros se
estudia mediante LC-MS y mediante microsecuenciación
de los fragmentos obtenidos a consecuencia de un corte del péptido
con termolisina. Los fragmentos obtenidos y su interpretación se
describen en la tabla 2 siguiente.
Aparece de manera sorprendente que el protocolo
descrito anteriormente permite obtener únicamente la forma nativa
G20a (1-4/2-3).
Así, el péptido G20a (69 aa) ha sido más fácil
de producir que el péptido G7a (33 aa) a pesar del hecho de
adicionar 36 aa de más etapa por etapa. El protocolo en 2 etapas
descrito para el péptido G20a aplicado al péptido G7a (2% de
rendimiento) confirma los resultados indicados en el ejemplo 1. La
explicación propuesta a posteriori, que sólo es una
hipótesis y no es limitativa, es que es necesario tener más de 4
aminoácidos por el lado C-terminal de la Cys 186
para que el emparejamiento nativo entre las Cys 173 y 186 por un
lado y las Cys 176 y 182 por otro lado pueda realizarse con un buen
rendimiento y formar un motivo estructural conocido con el nombre
de "cystine noose" presente en la proteína G nativa
(Doreleijers et al., Biochemistry, 35:14684, 1996) y que
corresponde a un epítopo inmunodominante de la proteína G del VRS
(Plotnicky et al., J. Virol., 73:5637, 1999).
Este ejemplo demuestra por lo tanto que la
adición de un fragmento peptídico de secuencia no salvaje por el
lado C-terminal de la región conservada de los 2
puentes disulfuros permite facilitar su síntesis, conservando al
mismo tiempo el motivo estructural "cystine noose" presente en
la proteína G nativa.
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Ejemplo
3
Con el fin de ensayar la inmunogenicidad de los
péptidos G23a y G20a, se han inmunizado los ratones Balb/c con 6 ó
1,5 \mug de equivalente G2Na dos veces el D0 y D14 por vía
intramuscular.
El péptido G2Na (denominado asimismo "G2A"
o "G2a") es el fragmento aa 130-230 de la
proteína G del VRS sub-grupo A tal como se ha
identificado, por ejemplo, en el listado de secuencias de la
solicitud WO 95/27787 mediante la secuencia SEC ID nº 1.
Se han sensibilizado algunos ratones mediante
VRS 20 días antes de la primera inmunización con el fin de hacerlos
seropositivos frente a VRS. Se han puncionado los ratones antes de
cada inmunización, y se han determinado los títulos anticuerpos
anti-G2Na, VRS-A y
VRS-B.
Diez días después de la última inmunización, se
han provocado los ratones con 10^{5}pfu/50 \mul de
VRS-A. Se ha medido el título vírico 5 días después
de la provocación.
Los ratones inmunizados por G20a o G23a
desarrollan unas respuestas anticuerpo
anti-VRS-A y VRS-B a
partir de la primera inmunización (véanse las figuras 1A y 1B). Se
observa un aumento después de un boost mediante las diferentes
moléculas ensayadas (resultados no mostrados).
Se ha observado que las moléculas siguen siendo
inmunogénicas incluso en presencia de anticuerpos VRS de tipo A
(véanse las figuras 2A y 2B) o B (véanse las figuras 3A y 3B).
La inmunización con G23a o G20a induce una
protección de las vías pulmonares tras una provocación con
VRS-A (véanse las figuras 4A y 4B).
Los resultados indican que G23a y G20a son
inmunogénicos y protectores en el ratón sin inmunizar. Además, la
inmunogenicidad y la protección observadas con estas dos moléculas
son comparables a las observadas con BBG2Na (el péptido BBG2Na es
el péptido que resulta de la fusión del péptido G2Na con el
fragmento "BB" de la proteína de unión a la seroalbúmina
humana de estreptococo, tal como se ha identificado en la solicitud
WO 95/27787).
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Ejemplo
4
Se inmunizan las cobayas el D0 y D8 con las
diferentes moléculas adicionadas con el adjuphos al 20% (v/v) en
i.m. El D21, se efectúa un recuerdo con las diferentes moléculas no
adicionadas en i.v. Se evalúa entonces la muerte de las
cobayas.
Se incluye un testigo positivo de experimento
constituido por ovoalbúmina a 200 \mug para cada molécula
ensayada (véase la tabla 3 siguiente).
Los resultados indican que G20 no induce HSl en
6/6 animales ensayados.
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Ejemplo
5
Los ratones se inmunizan tres veces con G23a
adicionado con alhydrogel al 20% el D0, D14 y D28. Se provocan los
ratones el D34 con 10^{5} pfu/50 \mul de VRS-A.
Siete días después de la provocación, se recuperan los pulmones, se
digieren y se analizan las células que infiltran los pulmones
mediante FACS ("Fluorescens Activated Cell Sorter"). Se
analizan asimismo las citoquinas mediante FACS después de la
incubación durante una noche con un activador no específico. Se
miden la IL-10 y la IL-5.
Los resultados (véanse las figuras 5A y 5B)
indican que G23a, sea cual sea la dosis ensayada, no induce ninguna
infiltración de células de tipo granuloso (seguidas por el marcador
RB6-8C5). En cambio, FI-VRS (VRS
inactivado con formalina), que induce una inmunopatología, induce
una infiltración de este tipo de células en los pulmones de ratones
inmunizados por Fl-VRS y provocados por VRS.
La medición de las citoquinas de tipo Th2
(IL-10 e IL-5) indica que al
contrario de Fl-VRS, no se observa ninguna
patología después de la inmunización mediante G23a.
<110> Pierre Fabre Medicament
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS PÉPTIDOS DERIVADOS DE LA
PROTEÍNA G DEL VRS Y SU USO EN UNA VACUNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D19677
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0109731
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-07-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS denominado
G20a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS denominado
G20aP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS denominado
G23a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido denominado Dta derivado del derivado atóxico CRM
197 de la toxina diftérica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido denominado Dtb derivado del derivado atóxico CRM
197 de la toxina diftérica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido fusionado denominado DtaDTb derivado del
derivado atóxico CRM 197 de la tóxina diftérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido fusionado denominado G20a-DTa
derivado de la proteína G del VRS y del derivado atóxico CRM 197 de
la toxina diftérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido fusionado denominado G20a-DTb
derivado de la proteína G del VRS y del derivado atóxico CRM 197 de
la tóxina diftérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido fusionado denominado G20a-DTaDTb
derivado de la proteína G del VRS y del derivado atóxico CRM 197 de
la toxina diftérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido derivado de la proteína G del VRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
Claims (18)
1. Péptido inmunógeno derivado de la proteína G
del VRS (virus sincitial respiratorio) del sub-grupo
A o B que comprende por lo menos:
- -
- un primer péptido derivado de la proteína G del VRS del sub-grupo A o B que comprende por lo menos en posición 173, 176, 182 y 186 una cisteína, y en posición C-terminal como máximo el aminoácido en posición 192; y
- -
- un segundo péptido derivado de una proteína del VRS del sub-grupo A o B, estando dicho segundo péptido situado corriente abajo de dicho primer péptido,
de manera que el péptido inmunógeno producido
presenta un puente disulfuro que une los residuos 173 y 186 y un
segundo puente disulfuro que une los residuos 176 y 182,
caracterizado porque dicho péptido inmunógeno derivado de la
proteína G del VRS del sub-grupo A o B presenta la
secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3.
2. Secuencia de ácido nucleico que codifica para
un péptido inmunógeno según la reivindicación 1.
3. Composición farmacéutica,
caracterizada porque contiene en un medio farmacéuticamente
aceptable, por lo menos un péptido inmunógeno según la
reivindicación 1 y/o una secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 2.
4. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada porque contiene además por lo menos una
proteína portadora y/o un adyuvante.
5. Composición según la reivindicación 4,
caracterizada porque la proteína portadora consiste en unos
derivados de la proteína DT (toxoide diftérica) en los que se ha
suprimido por lo menos un residuo cisteína.
6. Composición según la reivindicación 5,
caracterizada porque la proteína portadora consiste en una
proteína de secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6.
7. Composición según la reivindicación 4,
caracterizada porque el adyuvante se selecciona de entre el
grupo de adyuvantes que comprende el MPL-A
(monofosforilo lípido A), el MF59®, el Quil-A®, el
ISCOM ("immunostimulating complex"), el dimetilamonio
dioctadecilo en forma de bromuro (DDAB) o de cloruro (DDAC), el alo,
el adjuphos, los CpG, el Leif (factor de iniciación de elongación
de Leishmania), la CT (toxina colérica), la LT ("heat Labil
Toxin") y las versiones detoxificadas de la CT o de la LT.
8. Composición según una de las reivindicaciones
3 a 7, caracterizada porque dicho péptido inmunógeno está
asociado, mediante mezcla o mediante acoplamiento, a la proteína
portadora y/o al adyuvante.
9. Composición según una de las reivindicaciones
3 a 8, caracterizada porque dicha composición farmacéutica
contiene además un segundo antígeno, inmunógeno o hapteno del VRS
y/o un antígeno, inmunógeno o hapteno derivado del
micro-organismo responsable de patologías de las
vías aéreas seleccionado de entre los virus parainfluenza (VIP 1,
2, 3, 4), el virus influenza (A y B), los hantavirus, los
estreptococos, los neumococos, haemophilus influenza de tipo
b, los rinovirus, los coronavirus y los meningococos.
10. Composición según una de las
reivindicaciones 3 a 9, caracterizada porque dicho medio
farmacéuticamente aceptable está constituido por agua, por una
disolución acuosa salina o por una disolución acuosa a base de
dextrosa y/o de glicerol.
11. Composición según una de las
reivindicaciones 3 a 10, caracterizada porque dicha
composición farmacéutica está vehiculada en una forma que permite
mejorar su estabilidad y/o su inmunogenicidad.
12. Anticuerpos policlonales o monoclonales
dirigidos contra un péptido inmunógeno según la reivindicación
1.
13. Anticuerpos según la reivindicación 12,
caracterizados porque están humanizados.
14. Kit de diagnóstico, caracterizado
porque comprende un péptido inmunógeno según la reivindicación 1,
una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 2 o un
anticuerpo según la reivindicación 12 ó 13.
15. Uso de un péptido inmunógeno según la
reivindicación 1, de una secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 2 o de un anticuerpo según la reivindicación 12 ó
13, para la preparación de una composición farmacéutica destinada
al tratamiento profiláctico o terapéutico de las afecciones
provocadas por el VRS sub-grupo A o B, que presenta
una respuesta inmunogénica, una protección cruzada VRS A y B, una
hipersensibilidad inmediata negativa y que no induce ninguna
inmunopatología.
\newpage
16. Uso de un péptido inmunógeno según la
reivindicación 1, de una secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 2 o de un anticuerpo según la reivindicación 12 ó
13, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
generar o aumentar una respuesta inmunitaria contra el VRS.
17. Polipéptido según la reivindicación 1, que
comprende además una toxina diftérica, estando dicho polipéptido
caracterizado porque comprende una de las secuencias SEC ID
nº 7, SEC ID nº 8 y SEC ID nº 9.
18. Ácido nucleico que codifica para un
polipéptido según la reivindicación 17.
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