ES2313737T3

ES2313737T3 - Composiciones purificadas de 10-propargil-10-deazaaminopterina y sus metodos de uso en el tratamiento de tumores.

Info

Publication number: ES2313737T3
Application number: ES97934905T
Authority: ES
Inventors: Francis M. Sirotnak; James R. Piper; Joseph I. Degraw; William T. Colwell
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; SRI International Inc; Southern Research Institute; Stanford Research Institute
Current assignee: SRI International Inc; Southern Research Institute; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: EP0944389A4; JP2009091361A; EP2258702A2; JP2001505537A; EP2258702A3; CA2260266C; ATE407677T1; EP0944389B1; CA2260266A1; WO1998002163A1; JP5271677B2; DK0944389T3; US6028071A; PT944389E; EP0944389A1; DE69738981D1

Abstract

SE HA DEMOSTRADO QUE UNAS COMPOSICIONES ALTAMENTE PURIFICADAS DE 10 - PROPARGIL - 10 - DEAZAAMINOPTERINA (10 - PROPARGIL 10DAM), PROBADAS EN MODELOS DE XENOINJERTOS EN CUANTO A SU EFICACIA CONTRA LOS TUMORES HUMANOS, SON MUY SUPERIORES AL METOTREXATO (MTX), E INCLUSO SUPERIORES AL MAS RECIENTE CANDIDATO CLINICO, EL EDATREXATO (EDX). ADEMAS, LA 10 PROPARGIL - 10DAM MOSTRO UNA SORPRENDENTE HABILIDAD PARA LA CURACION DE TUMORES, HASTA EL PUNTO DE QUE NO SE ENCONTRO INDICIO ALGUNO DE CRECIMIENTO TUMORAL VARIAS SEMANAS DESPUES DE SUSPENDIDA LA TERAPIA. POR CONSIGUIENTE, UNAS COMPOSICIONES ALTAMENTE PURIFICADAS QUE CONTENGAN 10 - PROPARGIL - 10DAM PUEDEN UTILIZARSE PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES HUMANOS, PARTICULARMENTE LOS TUMORES MAMARIOS Y EL CANCER HUMANO DE PULMON.

Description

Composiciones purificadas de 10-propargil-10-desazaaminopterina y sus métodos de uso en el tratamiento de tumores.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud se refiere a una composición purificada del compuesto 10-propargil-10-desazaaminopterina y a los métodos de para usar este compuesto en el tratamiento de tumores.

La 10-propargil-10-desazaaminopterina ("10-propargil-10-dAM") es un miembro de una extensa clase de compuestos que han sido probados y en algunos casos, encontrado útiles en el tratamiento de tumores. Este compuesto, que tiene la estructura mostrada en la Fig. 1, se describió por DeGraw et al., "Síntesis and Antitumor Activity of 10-propargil-10-deazaaminopterin", J. Medical Chem. 36:2228-2231 (1993) y mostró actuar como un inhibidor del crecimiento en la línea celular de múridos L1210 y a una menor extensión de la enzima dihidrofolato reductasa
("DHFR"). Además, se presentaron algunos resultados para las propiedades antitumorales del compuesto usando el modelo E0771 de tumor mamario de múridos. Este dato fue ambiguo debido al pequeño número de ratones utilizados en la prueba (3 por dosis), la ausencia de cualquier información de derivación clásica que pudiera cuantificar la fiabilidad de los datos, y el hecho de que la dosis mas alta utilizada era tóxica para los ratones. Sin embargo, asumiendo que estos datos tienen algún valor predictivo para la eficacia de un fármaco en el tratamiento de tumores humanos, podría ser mejor predecir un fármaco que, a niveles equivalentes de tolerancia, tuviera propiedades comparables a, o tal vez ligeramente mejores que el metotrexato.

Compendio de la invención

Sin embargo, de forma sorprendente, se ha demostrado que, cuando se prueban en un modelo de xenoinjerto para su eficacia frente a tumores humanos, las composiciones altamente purificadas de 10-propargil-10-desazaaminopterina son muy superiores al metotrexato ("MTX") e incluso son superiores a edatrexato ("EDX"), y un candidato clínico mas reciente. Además, la 10-propargil-10-desazaaminopterina mostró una sorprendente capacidad para curar tumores de forma tal que no había evidencia de crecimiento tumoral varias semanas después del cese de la terapia. Por ello, un primer aspecto de la presente invención es una composición que comprende 10-propargil-10-desazaaminopterina, caracterizada por que la composición está libre de 10-desazaaminopterina a niveles detectados por cromatografía líquida de alta resolución en una escala tal como se predice en la Figura 3. Esta composición puede se utilizada de acuerdo con la invención para tratar tumores, particularmente tumores mamarios humanos y cáncer de pulmón humano.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la estructura del 10-propargil-10dAM;

La Fig. 2 muestra un HPLC de una preparación impura de 10-propargil-10dAM preparada de acuerdo con el estado de la técnica anterior;

La Fig. 3 muestra un HPLC de una preparación altamente purificada de 10-propargil-10dAM de acuerdo con la invención;

La Fig. 4 muestra un esquema sintético útil en la preparación del compuesto de acuerdo con la invención;

La Fig. 5 enumera los resultados de las pruebas de toxicidad en ratones;

La Fig. 6 enumera los resultados de las pruebas de toxicidad en ratas; y

La Fig. 7 muestra las concentraciones de plasma medias tras la administración de 10-propargil-10dAM en perros.

Descripción detallada de la invención

Esta solicitud se refiere a 10-propargil-10dAM "altamente purificado". Tal como se utiliza en la memoria y reivindicaciones de la presente memoria, los compuestos que están "altamente purificados" contienen 10-propargil-10dAM sustancialmente libre de otros derivados de ácido fólico, particularmente 10-desazaaminopterina, que puede interferir con la actividad antitumoral de 10-propargil-10dAM. Una composición dentro del alcance de la invención puede incluir vehículos o excipientes para formular la 10-propargil-10dAM en una forma de dosis aceptable para uso terapéutico.

10-propargil-10dAM puede ser sintetizado utilizando el método descrito en el artículo de DeGraw, mas arriba o en el Ejemplo 7 de la Patente de EE.UU. Nº 5.354.751. La evaluación de HPLC del producto preparado por este método muestra la presencia de una cantidad sustancial (\sim4,6%) de una impureza A (Fig. 2) que tiene un tiempo de retención consistente con la 10-desazaaminopterina. Por ello, si este enfoque sintético es empleado, se necesita mas purificación mas allá de lo descrito en el artículo de DeGraw et al. Dicha purificación puede darse por HPLC o cristalización adicional para eliminar la 10-desazaaminopterina y otros derivados del ácido fólico que puedan estar
presentes.

La Fig. 3 muestra un HPLC de una preparación altamente purificada que consiste esencialmente de 10-propargil-10dAM de acuerdo con la invención, preparado utilizando el método descrito en el Ejemplo1. En este caso, la cantidad de 10-propargil-10dAM (determinada por el área del pico de HPLC) se aproxima al 98%, y el pico correspondiente a 10-desazaaminopterina no es detectado por el programa de procesamiento, aunque hay una onda de línea base menor en esta área.

La preparación de 10-propargil-10dAM altamente purificada de acuerdo con la invención se probó para citotoxicidad frente a líneas celulares tumorales humanas y las propiedades antitumorales utilizando xenoinjertos de líneas tumorales humanas en ratones desnudos tal como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados de estas pruebas se enumeran en las Tablas 1 y 2. Tal como se muestra, 10-propargil-10dAM efectuó regresión completa de carcinoma mamario MX-1 humano a una mayor extensión que MTX (que no causó regresión) o EDX, y además fue capaz de efectuar curas en 9 de los 20 ratones en prueba. 10-propargil-10dAM también fue mas eficaz que MTX y EDX frente a xenoinjertos de cáncer de pulmón LX-1 humano y llevó a curas en 4 de los 10 ratones en prueba. Se observaron resultados similares para células de cáncer de pulmón A549 humanas. Este nivel de eficacia está en mayor exceso que cualquier cosa que pudiera haberse predicho basándonos en los datos de E0771, que aparecían en el artículo de DeGraw et al. Además, en ese estudio ningún ratón tratado con el nivel de dosis no tóxica menor (24 mg/kg) de 10-propargil-10dAM mostró regresión completa de los tumores y el efecto medio del compuesto no fue mejor que MTX. Estos ratones tratados con 10-P-dAM mostraron un incremento en el tamaño de tumor al final de tres semanas, indicando que no se efectuó una cura. Por ello, es muy sorprendente que el compuesto altamente purificado pueda ser usado frente a tumores humanos a unos niveles de dosis mucho menores (3 mg/kg) y consigan niveles de eficacia mucho mayores y curas mucho mas aparentes.

Aunque no hay pretensión de vincularse a ningún mecanismo en particular para este incremento en la actividad, se cree que la presencia de cantidades incluso relativamente pequeñas de otros derivados de ácido fólico como el 4,6% de 10-desazaaminopterina observado en las muestras preparadas en el artículo de DeGraw et al., pueden competir con la 10-propargil-10dAM, inhibiendo de forma eficaz su actividad. Esto podría suceder a nivel de la poliglutamilación de 10-propargil-10dAM por la folil poliglutamato sintetasa en células tumorales humanas. La ventaja de la 10-propargil-10dAM como sustrato para este determinante citotóxico podría estar comprometida por la presencia de 10-dAM, que interacciona mas eficazmente con esta enzima, pero se metaboliza deficientemente, inhibiendo de forma competitiva con ello la interacción de 10-propargil-10dAM con esa enzima. Sin embargo, a pesar del mecanismo, las composiciones altamente purificadas de la invención son marcadamente mas activas frente a células cancerosas humanas de lo que podría predecirse basándonos en los datos presentados en el artículo de DeGraw. Esto también se muestra por la aumentada toxicidad de 10-propargil-10dAM, encontrada consistentemente, comparada con EDX frente a las células tumorales humanas, y que contrasta con la equivalencia relativa de estos dos compuestos frente a líneas celulares tumorales en múridos tal como describieron DeGraw et al. Esta actividad potenciada frente a células tumorales humanas puede ser utilizada para proporcionar beneficios terapéuticos a pacientes humanos que sufren de cáncer, particularmente de cáncer de pecho o cáncer de pulmón.

Para este propósito, 10-propargil-10dAM altamente purificada está ventajosamente formulado como parte de una preparación farmacéutica. La forma de dosis específica dependerá del método de administración, pero puede incluir pastillas, cápsulas, líquidos orales, y soluciones inyectables para administración intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. Basándose en la eficacia relativa de TMX, EDX y la 10-Propargil-10-desazaaminopterina, sustancialmente libre de 10-desazaaminopterina frente a tumores de xenoinjerto humanos, y en las dosis de MTX y EDX encontradas apropiadas en ensayos clínicos en humanos, las dosis de 10-propargil-10-desazaaminopterina, sustancialmente libre de 10-desazaaminopterina en el intervalo de 40 a 120 mg/m^{2} de superficie corporal/día podrían se eficaces, dependiendo del programa de tratamiento. Parece que dosis mas altas podrían estar contraindicadas debido a la toxicidad observada e dichos niveles en estudios animales descritos mas abajo.

La 10-propargil-10dAM de acuerdo con la invención también puede ser formulada en combinación con una variedad de otros compuestos citotóxicos y antitumorales, incluyendo alcaloides de la vinca como vinblastina, navelbina y vindesina; 5-fluorouracilo; agentes alquilantes como ciclofosfamida o ifosfamida; cisplatino o carboplatino; leucovorina; taxoles como paclitaxel o docetaxel; y antibióticos como doxorrubicina y mitomicina. También pueden ser utilizadas las combinaciones de 10-propargil-10dAM con varios de estos agentes antitumorales.

Ejemplo 1

La Fig. 4 muestra un esquema sintético útil en la preparación de 10-propargil-10dAM de acuerdo con la invención. Una mezcla de 60% de NaOH en dispersión de aceite (1,06 g, 26,5 mmol) en 18 ml de THF tamizado y secado se enfrió a 0ºC. La mezcla fría se trató con una solución de éster dimetílico de ácido homotereftálico (5,0 g, 24 mmol. Compuesto 1 en Fig. 4) en THF seco (7 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora a 0ºC. Se añadió bromuro de propargilo (26,4 mg) y la mezcla se agitó a 0ºC durante una hora mas, y luego a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla resultante se trató con 2,4 ml de ácido acético al 50% y luego se vertió en 240 ml de agua. La mezcla se extrajo con éter (2 S 150 ml). Los extractos de éter se combinaron, secaron en Na_{2}SO_{4}, y se concentraron en in aceite naranja-amarillo. La cromatografía en gel de sílice [600 ml de 110 \mum - 60 \mum (maya de 230-400)] con elución por ciclohexano-Ácido EtO (8:1) dieron el producto éster dimetílico de ácido \alpha-propargilhomotereftálico (Compuesto 2) como un sólido blanco (4,66) que apareció por TLC (ciclohexano-Ácido EtO 3:1) como homogéneo. Sin embargo, los datos de espectro de masas de este producto, mostraron que éste es una mezcla del producto deseado 2, y el compuesto dipropargilado. No se detectó material de partida 1. HPLC mostró que la relación de productos mono- a di-propargilados es de aproximadamente 3:1. Mientras que el producto dipropargilado, a diferencia del compuesto 1, no puede producir un co-producto no deseado en el siguiente paso de la reacción, este material es apropiado para la conversión al compuesto 3. Es muy importante la ausencia del compuesto de partida 1 en el producto utilizado para proceder a la síntesis, con el fin de evitar la formación secuencial de 10-dAM durante la carga de transformación al producto final, debido a que la eliminación completa a partir de 10-dAm a partir de 10-propargil-1-dAM es muy difícil.

Se formó una mezcla combinando 0,36 g de NaH al 60% (9 mmol) en una dispersión de aceite con 10 ml de DMF seco y se enfrió a 0-5ºC. La mezcla fría se trató gota a gota con una solución del producto de la primera reacción (compuesto 2) (2,94 g, 12 mmol) en 10 ml de DMF seco y luego se agitó a 0ºC durante 30 minutos. Tras enfriarlo a -25ºC, se añadió gota a gota una solución de hidrobromuro de 2,4-diamino-6-(bromometil)pterina 0,2 2 propanol (1,00 g, 2,9 mmol) en 10 ml de DMF seco, mientras la temperatura se mantenía cerca de -25ºC. Se permitió que la temperatura de la mezcla agitada alcanzara los -10ºC sobre un periodo de 2 horas. Tras 2 horas mas a -10ºC, se permitió que la temperatura alcanzase los 20ºC; la agitación a temperatura ambiente se continuó durante 2 horas mas. Luego, la reacción se ajuntó a pH 7 por adición de CO_{2} sólido. Tras la concentración in vacuo para eliminar el disolvente, el residuo se agitó con dietil éter y el material insoluble en éter se recogió, lavó con agua, y se secó in vacuo para dar 1,49 g de un producto bruto. Este producto bruto se disolvió en CHCl_{3}-MeOH (10:1) para aplicarlo a una columna de gel de sílice. La elución por el mismo sistema de disolvente alcanzó el éster metílico del ácido 10-popargil-10-carbometoxi-4-deoxi-4-amino-10-desazapteroico, que era homogéneo a TLC en un 40% de rendimiento (485 mg).

Una suspensión agitada del compuesto 3 (400 mg, 0,95 mmol) en 2-metoxietanol (5 ml) se trató con agua (5 ml) y luego con solución de hidróxido sódico al 10% (3,9 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, durante el tiempo en el que de da la solución. La solución se ajustó a pH 8 con ácido acético y se concentró bajo alto vacío. El residuo resultante se disolvió en 15 ml de agua y se acidificó a pH 5,5-5,8 dando como resultado la formación de un precipitado. El precipitado se recogió, lavó con agua y se secó in vacuo para recuperar 340 mg del compuesto 4 (91% de rendimiento). Los análisis de HPLC indicaron una pureza de producto del 90%.

El compuesto 4 (330 mg) se decarboxiló al calentarlo en 15 ml de DMSO a 115-120ºC durante 10 minutos. Una prueba por HPLC tras 10 minutos confirmó que la conversión se completó esencialmente. Se eliminó el DMSO por destilación in vacuo (baño a 40ºC). El residuo se agitó con NaOH 0,5 N para dar una solución clara. La acidificación a pH 5 con HCl 1 N dio el ácido 10-propargil-4-deoxi-4-amino-10-desazapteroico (compuesto 5) como un sólido amarillo en un rendimiento del 70%. El HPLC indicó una pureza de producto en esta etapa del 90%.

El compuesto 5 (225 mg, 0,65 mmol) se acopló con hidrocloruro L-glutamato de dimetilo (137 mg, 0,65 mmol) usando reactivo BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino) fosfonio (287 mg, 1,46 mmol). La mezcla se agitó con agua, y el producto bruto insoluble en agua se recogió y secó in vacuo. El producto bruto (350 mg) se purificó por cromatografía en gel de sílice con elución por CHCl_{3}-MeOH (10:1) que contenía trietilamina (0,25% en volumen) para recuperar 165 mg del ester dimetílico de 10-propargil-10-desazaaminopterina (compuesto 6, 6,50% de rendimiento). Que era homogéneo a TLC (CHCl_{3}-MeOH 5:1).

El compuesto 6 (165 mg, 0,326 mmol) se suspendió en 10 ml de MeOh agitado al que se añadió 0,72 ml (0,72 meq) de NaOH 1 N. La agitación a temperatura ambiente se continuó hasta que se dio la solución tras unas cuantas horas. La solución se guardó a 20-25ºC durante 8 horas, luego se diluyó con 10 ml de agua. La evaporación bajo presión reducida eliminó el etanol, y la solución acuosa concentrada se dejó a 20-25ºC durante otras 24 horas. Luego, el HPLC mostró que se completa la hidrólisis del ester. La solución acuosa clara se acidificó con ácido acético a pH 4,0 para precipitar la 10-propargil-10-desazaaminopterina como un sólido amarillo pálido. El producto recogido, lavado con agua y secado in vacuo pesó 122 mg (79% de rendimiento). Ensayos por análisis elemental, RMN de protones y espectroscopia de masas fueron consistentes con la estructura asignada. El análisis de HPLC indicó una pureza del 98% y estableció que el producto estaba libre de 10-desazaaminopterina.

Ejemplo 2

La preparación de 10-propargil-10-dAM altamente purificada de acuerdo con el Ejemplo 1 se probó para propiedades antitumorales utilizando un xenoinjerto de líneas tumorales humanas en ratones desnudos. Los xenoinjertos de carcinoma mamario MX-1 humano se implantaron dentro de ratones desnudos por procedimientos clásicos.

Para probar las propiedades antitumorales de la 10-propargil-10-dAM frente a células tumorales, 3 mg/kg del compuesto se administró una vez al día a cada uno de los veinte ratones durante un total de cinco días, empezando tres días después de la implantación del tumor. Para comparar, también se evaluaron controles no tratados (20 ratones), ratones tratados con metotrexato (10 ratones; dosis de 2 mg/kg en el mismo programa de tratamiento), y ratones tratados con edetrexato (20 ratones; dosis de 1,5 mg/kg en el mismo programa de tratamiento). Todas estas dosis son "dosis máximas toleradas" y por ello, son una base apropiada para comparar en base a la equitoxicidad. El diámetro medio del tumor se midió 14 días después del comienzo del tratamiento, es decir 7 días después del cese del tratamiento. Los ratones que no tenían tumor que se pudiera medir en este tiempo se consideraba que habían experimentado una regresión completa. Además, los ratones libres de tumor a los 14 días se controlaron tres semanas después del cese de la terapia para la reaparición de tumores. Los ratones libres de tumor al final de las tres semanas tras la terapia se consideraron curados. Los resultados se enumeran en la Tabla 1.

1

Como se puede observar, 10-propargil-10dAM es sustancialmente mas eficaz que MTX o EDX, y efectuó un número sustancial de curas.

Ejemplo 3

El ejemplo se repitió utilizando xenoinjertos de cáncer de pulmón LX-1 humano en ratones desnudos. Los resultados se enumeran en la Tabla 2.

2

De nuevo, 10-propargil-10dAM mostró ser sustancialmente mas eficaz que MTX o EDX, y efectuó un número sustancial de curas.

Ejemplo 4

El ejemplo se repitió utilizando xenoinjertos de cáncer de pulmón A459 humano en ratones desnudos. Los resultados se enumeran en la Tabla 3.

3

Ejemplo 5

Se realizaron estudios de citotoxicidad en cuatro líneas celulares tumorales humanas para comparar la citotoxicidad de EDX con 10-propargil-10dAM usando un pulso de exposición de 3 horas a cada compuesto. Se probaron tres experimentos duplicados para cada línea celular para cada compuesto. Los resultados se enumeran en la Tabla 4.

4

En cada caso, la 10-propargil-10dAM era sustancialmente mas tóxica que EDT frente a las líneas celulares tumorales humanas.

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Ejemplo 6

La toxicidad de la 10-propargil-10dAM se evaluó en ratas, ratones y perros. Ratas CD macho y ratones B6D2F_{1} (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) y perros jóvenes adultos Beagle (Marshall Farms USA, Inc., Northrose, NY) se utilizaron en las pruebas. Todos los animales se mantuvieron en habitaciones con medio ambiente controlado con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Los ratones y ratas se recibieron cuando tenían 5 semanas de vida y se observaron durante 1 a 2 semanas antes del estudio y sólo se utilizaron si crecían si durante la observación preliminar se ajustaban a los parámetros de laboratorio para la ganancia de peso. Los perros se observaron al menos 2-3 semanas antes de su uso, durante ese periodo se pesaron y examinaron a intervalos regulares para asegurar buena salud. Durante el periodo de prueba, todos los animales fueron pesados diariamente y observados en cuanto a su apetito, estado de las heces, apariencia general y signos de toxicidad. Los perros también fueron examinados diariamente para monitorizar la temperatura corporal, el ritmo cardiaco, y el ritmo respiratorio.

Para todos los tratamientos, la dosis de fármaco fue pesada y disuelta en solución salina isotónica bacteriostática, por adición de aproximadamente 2 equivalentes molares de NaOH 1 N. El pH de esta solución se ajustó a 7-7,2 por adición de solución de NaOH determinado usando un pH-metro. Las soluciones se usaron tanto inmediatamente o tras descongelar las preparaciones que se almacenaron a -20ºC. Se hicieron inyecciones en ratones y ratas en un volumen constante de 0,01 ml/g de peso corporal.

Toxicidad en Ratones

A ratones B6D2F_{1}, cinco por grupo, se les dio 10-propargil-10dAM i.p. semanalmente durante tres semanas (días 1, 8 y 15) a concentraciones variables tal como se enumera en la Tabla 5.

6

Los resultados de cambios de peso corporal y letalidad están enumerados en la Fig. 5. Como se muestra, a 100, 200 y 300 mg/kg hubo una disminución inicial moderada en el peso corporal (hasta 2 gramos), pero no mas caídas en las siguientes dosis. Todos los ratones en estos tres grupos de dosis recuperaron el peso en las semanas 3 y 4 y sobrevivieron. A dosis de 400 mg/kg, i.p. QWX3, cuatro de los cinco ratones murieron en los días 19, 20, 23 y 24, y a 600 mg/kg, cuatro de los cinco ratones murieron en los días 9, 18, 19 y 21. Estos animales tratados con las dos dosis más altas tuvieron mas del 20% de pérdida de peso, pelo alterado y diarrea. Sin embargo, los ratones supervivientes ganaron peso y se pusieron al nivel del grupo control dos semanas después de las inyecciones finales. La LD50 aproximada fue alrededor de 370 mg/kg, i.p. QWX3 cuando se estimaba con la relación dosis efecto y la determinación del efecto mediana. (Chou et al., Encyclopedia of Human Biology, R. Dalbecco, ed. Vol. 2, pp. 271-279, Academic Press, 1991).

Toxicidad en Ratas

A ratas CD, cinco por grupo, se les dio 10-propargil-10dAM i.v. semanalmente durante tres semanas (días 1, 8 y 15) a concentraciones variables tal como se enumera em la Tabla 6.

8

Los resultados de cambios de peso corporal y letalidad están enumerados en la Fig. 6. A 50 mg/kg, i.v. QWX3, no se observaron cambios aparentes en el peso corporal; a 100 mg/kg, hubo aproximadamente un descenso de peso corporal de 10 gramos en la tercera dosis, y uno de los cinco animales murió en el día 23. Los animales restantes ganaron peso, pero a una relación menor que los animales control.

A 150 mg/kg, i.v. QWX3, tres de las cinco ratas murieron en los días 18, 20 y 23. A 200 mg/kg, i.v. QWX3 todas las ratas murieron en los días 12, 14, 15, 20 y 20, respectivamente. A 300 mg/kg, i.v. QWX3 también murieron las cinco ratas, pero, de alguna forma, mucho mas pronto que aquellas de dosis de 200 mg/kg, en los días 11, 11, 12, 12, y 14, respectivamente. No se observó toxicidad inmediata en ninguna de las ratas tras la inyección de las dosis 150-300 mg/kg. Estas ratas empezaron a perder peso al día siguiente, y tenían el pelo alterado con evidencia de diarrea y deshidratación, que culminó al día o los tres días antes de la muerte. Estos tres signos persistieron a lo largo del curso del experimento y se agravaron por la segunda y tercera inyección.

Los datos de estos experimentos no permitieron un cálculo preciso de la LD_{10} o LD_{50}. Una estimación cautelosa de LD_{10} en ratas con la relación dosis-efecto y la determinación del efecto medio es aproximadamente 75 mg/kg, i.v. QWX3 y LD_{50} es aproximadamente 110 mg/kg i.v. QWX3.

Toxicidad en Perros

Ocho machos Beagle que pesan de 9,4 a 10,6 libras se dividieron en cuatro pares. Los pares se trataron con inyecciones intravenosas de 10-propargil-10dAM semanalmente durante tres semanas (días 1, 8 y 15) a 0 mg/kg (perros A y B9; 3 mg/kg (perros C y D); 8 mg/kg (perros E y F) y 12 mg/kg (perros G y H). A 3 mg/kg y 8 mg/kg se dio una disminución máxima de pérdida de peso corporal de 2 a 3 kg en el día 20, seguido de recuperación de peso corporal a partir de entonces hasta el final del periodo de observación de 35 días. A 12 mg/kg se dio disminución fija de peso corporal hasta 3 kg (o mas del 20% de pérdida), y los animales se volvieron moribundos en los días 12 y 14, antes de la tercera dosis.

Los signos principales de toxicidad se observaron para los perros tratados con 8 mg/kg o 12 mg/kg, que incluían vómitos, diarrea, deposiciones acuosas o sanguinolentas, letargo, anorexia y debilidad generalizada. A 3 mg/kg, i.v. QWX3, no hubo síntomas aparentes. La LD_{50} estimada es aproximadamente 8 mg/kg, i.v. , QWX3.

Se recogieron muestras de sangre de cada perro durante la prueba. No se observaron cambios marcados o persistentes en la química sanguínea o en el contaje de células sanguíneas, excepto en las fases terminales de toxicidad. Hubo algunas disminuciones en los contajes de leucocitos, linfocitos, neutrófilos, disminución en hemoglobina, proteína total y albúmina y se observaron aumentos en amilasa y monocitos, especialmente en las dos dosis mas altas.

Los perros G y H murieron por eutanasia y se realizó una necropsia completa en los días 12 y 14, respectivamente. Un animal de cada uno de los otros pares murieron por eutanasia para examinen histopatológico en el día 33 (perro E) o 34 (perros B y C) del experimento.

En el perro G, muchos de los órgano parecían normales. La mucosa del intestino delgado y grueso mostraba edema u hemorragia. El estómago y el intestino delgado y grueso estaban vacíos. EL perro H estaba severamente deprimido, con respiración poco profunda y ritmo cardiaco reducido en el día 14 antes de la eutanasia. En la eutanasia, se encontró que el estómago estaba lleno de mucosa teñida de bilis, y los intestinos estaban rellenos de deposiciones acuosas pero sin signos de sangre. No se observaron úlceras en el estómago, intestino o esófago. El hígado estaba pálido y lleno de granos. El bazo era rojo oscuro y rugoso en la superficie.

Para el perro E que recibió 8 mg/kg, i.v. QWX3, muchos de los órganos parecían normales pero ambos lados del pulmón eran rosa con unos pocos granos sanguinolentos. El intestino grueso y delgado y el hígado mostraban color lavanda y los riñones mostraban edema y color rojo. El estómago e intestinos estaban llenos con comida, y la vejiga llena con orina.

El perro C, que recibió 3 mg/kg, i.v. QWX3, parecía normal en el día 34 antes de la eutanasia. Muchos de los órganos parecían normales. El pulmón derecho estaba rosa, el intestino grueso y delgado en color rojo. El hígado mostraba color rojo oscuro. El estómago y los intestinos estaban llenos con comida, y la vejiga llena con orina.

El examen histopatológico de los tejidos de los perros tratados con 0 mg/kg y 3 mg/kg i.v., QWX3, no mostró lesiones significativas en las muestras de órganos recogidos. A 8 mg/kg, se observó, i.v. QWX3, el intestino grueso y ligera colitis multifocal. A 12 mg/kg , i.v. QWX3, se observó esofaguitis ulcerativa crónica de sub-aguda a crónica y enterocolitis necrotizante severa. Otros órganos, por ejemplo, cerebro, corazón, hígado, pulmón, riñón, glándulas salivares, testículos y bazo no mostraban lesiones significativas.

Ejemplo 7

Para monitorizar la farmacocinética de la 10-propargil-10dAM, se dieron dosis únicas de 3 mg/kg de forma intravenosa a cada uno de los dos perros, I y J. Se recogieron muestras de sangre a los -5 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 3r, 4 h, 6 h, 24 h y 48 h. Las concentraciones en plasma de la 10-propargil-10dAM se determinaron por un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna Econosphere C18, fase móvil de 15% acetonitrilo/KH_{2}PO_{4} 50 mm, pH 7,0, con una relación de flujo de 1 ml/min a temperatura ambiente. El volumen de inyección fue de 1 \mul. El tiempo de retención de la 10-propargil-10dAM era de 18,5 minutos.

Las semi-vida del plasma (t_{1/2}) para el perro I era de 26,7 minutos, 49 horas y 37,4 horas para las fases \alpha \beta y \gamma de la cinética. Para el perro J, los valores de t_{1/2} observados fueron de 21,2 min, 1,26 h y 16,3 h. Las concentraciones promedio de plasma a varios tiempos se muestran en la Fig. 7.

Se recogieron muestras de orina de cada perro a los 30 min, 1 hr, 2 hr y 4 hr tras la administración de la 10-propargil-10dAM y se analizaron por HPLC. La 10-propargil-10dAM se excretó principalmente sin cambio (tiempo de retención de 18,5 minutos). Hubo pequeñas cantidades de un metabolito con un tiempo de retención de 6,3 min, que dio <0,31% y <3,5% de la 10-propargil-10dAM urinaria total a 1 h y 4 h, respectivamente.

Claims

1. Una composición que comprende 10-propargil-10-desazaaminopterina, caracterizada porque la composición está libre de 10-desazaaminopterina a niveles detectados por cromatografía líquida de alta resolución en una escala mostrada en la Figura 3.

2. Una composición que comprende 10-propargil-10-desazaaminopterina que está libre de 10-desazaaminopterina.

3. Una composición farmacéutica que comprende una composición según la reivindicación 1 o 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Una composición según la reivindicación 3, que además comprende al menos un compuesto citotóxico o antitumoral adicional.

5. Una composición según la reivindicación 4, donde el al menos un compuesto citotóxico o antitumoral adicional se selecciona de alcaloides de la vinca, 5-fluorouracilo, agentes alquilantes, cisplatino, carboplatino, leucovorina, taxoles y antibióticos.

6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento de tumores.

7. Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

8. Uso según la reivindicación 7, donde la 10-propargil-10-desazaaminopterina se formula para administración en cantidades de 40 a 120 mg/m^{2} de superficie corporal/día.

9. Uso según la reivindicación 7, donde dicha composición comprende al menos un compuesto citotóxico o antitumoral adicional.

10. Uso según la reivindicación 9, donde el al menos un compuesto citotóxico o antitumoral adicional se selecciona de alcaloides de la vinca, 5-fluorouracilo, agentes alquilantes, cisplatino, carboplatino, leucovorina, taxoles y antibióticos.

11. Uso según la reivindicación 7, donde el tumor es un tumor de mama o un tumor de pulmón.