ES2310239T3 - Polimorfismos mitocondriales ligados a una predisposicion para el desarrollo de cicatrizacion o fibrosis inadecuadas. - Google Patents
Polimorfismos mitocondriales ligados a una predisposicion para el desarrollo de cicatrizacion o fibrosis inadecuadas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2310239T3 ES2310239T3 ES03718946T ES03718946T ES2310239T3 ES 2310239 T3 ES2310239 T3 ES 2310239T3 ES 03718946 T ES03718946 T ES 03718946T ES 03718946 T ES03718946 T ES 03718946T ES 2310239 T3 ES2310239 T3 ES 2310239T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fibrosis
- mutation
- mitochondrial
- mutations
- condition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Un procedimiento in vitro para diagnosticar o detectar una predisposición para una afección al menos parcialmente caracterizada por fibrosis o cicatrización inadecuadas, comprendiendo el procedimiento examinar el gen de ARNr16s del genoma mitocondrial de un sujeto de interés para detectar la presencia de un polimorfismo genético o mutación ligada al desarrollo de la afección.
Description
Polimorfismos mitocondriales ligados a una
predisposición para el desarrollo de cicatrización o fibrosis
inadecuadas.
La presente invención se refiere a
procedimientos para realizar pruebas genéticas de muestras para
determinar la presencia de polimorfismos o mutaciones que están
ligados a una predisposición genética para desarrollar afecciones
al menos parcialmente caracterizadas por una cicatrización o
fibrosis inadecuadas.
Una cicatriz es una estructura morfológica
anormal que es el resultado de una lesión o herida previa (por
ejemplo una incisión, una escisión o un trauma). Las cicatrices
están compuestas de un tejido conectivo que es predominantemente
una matriz de colágeno de tipos 1 y 3 y fibronectina. La cicatriz
puede estar constituida por fibras de colágeno en una organización
anormal (como se ven en las cicatrices de la piel) o puede ser, una
acumulación anormal de tejido conectivo (como se ve en las
cicatrices del sistema nervioso central o en la cicatrización
patológica de la
piel).
piel).
La cicatrización es una consecuencia habitual
del proceso de curación en la mayoría de los tejidos de animales y
seres humanos. En la piel, las cicatrices pueden adoptar la forma de
una depresión por debajo de la superficie de la piel o pueden estar
elevadas y sobresalir de la superficie de la piel. Las cicatrices
hipertróficas son una forma más grave de cicatrización que puede
surgir en determinadas afecciones o en determinados individuos. Las
cicatrices hipertróficas están elevadas por encima de la superficie
normal de la piel y contienen un exceso de colágeno que queda
dispuesto según una organización anormal. Un queloide es una forma
de cicatrización patológica que no sólo está elevada por encima de
la superficie de la piel, sino que también se extiende más allá de
los límites de la lesión original. En un queloide hay un exceso de
tejido conectivo que está organizado de manera anormal
predominantemente en bandas vorticiales de tejido colagenoso.
Se cree que existen predisposiciones genéticas
para formar una cicatrización inadecuada y particularmente
patológica (por ejemplo, cicatrices hipertróficas y queloides). Por
ejemplo, las razas afrocaribeñas y mongoloides son particularmente
propensas a desarrollar cicatrices queloides. Además pueden
desarrollarse en familias una predisposición a desarrollar
cicatrices hipertróficas y queloides.
Existen numerosas situaciones médicas en las que
la formación de cicatrices representa un problema. Son ejemplos de
tales situaciones las cicatrices de la piel en las que una excesiva
formación de tejido cicatrizal puede ser perjudicial para la
función tisular y particularmente cuando se produce contracción
cicatrizal (por ejemplo quemaduras de la piel y heridas que
deterioran la flexibilidad de una articulación). Es también muy
deseable la reducción de la cicatrización para la piel cuando son
importantes las consideraciones cosméticas. En la piel, las
cicatrices hipertróficas o queloides (particularmente en las razas
afrocaribeñas y mongoloides) pueden ocasionar deterioro funcional y
cosmético y existe una necesidad de impedir su presentación. La
formación de tejido cicatrizal derivada de los injertos de piel
tanto en los sitios donantes como en los sitios de aplicación de
piel artificial también puede ser problemática y necesita
minimizarse o evitarse. Dada la importancia de la cicatrización en
tales situaciones, podrá apreciarse que existe una necesidad de
estar en condiciones de hacer pruebas a un sujeto para investigar
si será o no será susceptible a desarrollar una cicatrización
inadecuada.
Además de las cicatrices de la piel, la
cicatrización o fibrosis interna puede ser muy perjudicial y se
incluyen ejemplos específicos:
(i) Dentro del sistema nervioso central, la
cicatrización glial puede impedir la reconexión neuronal (por
ejemplo, tras una neurocirugía o de lesiones que penetran en el
cerebro).
(ii) La cicatrización en el ojo puede ser
perjudicial. En la córnea, la cicatrización puede dar lugar a
opacidad anormal y conducir a problemas de visión o incluso a la
ceguera. En la retina, la cicatrización puede ocasionar alabeo o
desprendimiento de retina y como consecuencia ceguera. La
cicatrización después de la curación de las heridas en operaciones
para aliviar la presión en el glaucoma (por ejemplo en la cirugía de
filtración del glaucoma) da como resultado en el fracaso de la
cirugía, por lo que el humor acuoso no puede drenarse y por
consiguiente vuelve el glaucoma.
(iii) La formación de tejido cicatrizal en el
corazón (por ejemplo, tras una cirugía o de un infarto de miocardio)
puede dar lugar a una función cardíaca anormal.
(iv) Las operaciones que involucran al abdomen o
a la pelvis, a menudo dan lugar a adherencias entre vísceras. Por
ejemplo, las adherencias entre elementos del intestino y la pared
corporal pueden formar y causar retorcimiento del circuito
intestinal, lo que conduce a isquemia, gangrena y a la necesidad de
un tratamiento de emergencia (en caso de no tratarse, pueden
incluso ser fatales). Asimismo, los traumatismos o incisiones en los
intestinos pueden llevar a la formación de tejido cicatrizal y la
contracción cicatrizal en las constricciones puede causar oclusión
del lumen de los intestinos, lo que nuevamente puede representar un
riesgo para la vida.
(v) La cicatrización en la pelvis en la región
de las trompas de Falopio puede llevar a la infertilidad.
(vi) La cicatrización después de lesiones en los
músculos puede dar como resultado una contracción anormal y por
consiguiente una función muscular pobre.
(vii) La formación de tejido cicatrizal o
fibrosis después de lesiones en los tendones y ligamentos puede dar
como resultado una importante pérdida de la función.
El hecho de que exista una serie de afecciones
médicas que son conocidas como trastornos fibróticos está
relacionado con lo expuesto anteriormente, en los que el desarrollo
de un exceso de tejido fibrótico, conduce a una desorganización
patológica y a un mal funcionamiento del tejido. Los trastornos
fibróticos están caracterizados por la acumulación de tejido
fibroso (predominantemente colágenos) de manera anormal dentro del
tejido. La acumulación de tales tejidos fibrosos puede dar como
resultado una diversidad de enfermedades. Estas enfermedades no
necesariamente tienen que estar ocasionadas por cirugía, lesión
traumática o heridas. Los trastornos fibróticos son usualmente
crónicos. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen la cirrosis
del hígado, fibrosis hepática, glomerulonefritis, fibrosis
pulmonar, fibrosis quística, esclerodermia, fibrosis de miocardio,
fibrosis tras el infarto de miocardio, fibrosis del sistema
nervioso central tras un ictus o de trastornos neurodegenerativos
(por ejemplo la Enfermedad de Alzheimer), vitreorretinopatía
proliferativa (PVR) y artritis.
Como en el caso de la cicatrización, se cree que
hay una influencia genética en el desarrollo de muchos trastornos
fibróticos o en la gravedad de los mismos. En algunos casos, la
influencia genética puede ser directamente responsable del
desarrollo del trastorno mientras que para otros trastornos
fibróticos puede haber un factor genético que influya en el
desarrollo fibrótico que es secundario a la causa primaria del
trastorno (por ejemplo, en la fibrosis quística).
Un ejemplo de un trastorno que incluye fibrosis
y del que también se cree que está influenciado por la genética, es
la enfermedad de Dupuytren (DD).
La DD es una fibromatosis palmar nodular que
ocasiona contractura progresiva y permanente de los dedos. La DD es
un trastorno irreversible, progresivo con una alta tasa de
recurrencia tras la excisión quirúrgica. Con frecuencia es familiar
y es común en los individuos de extracción norteeuropea. Más del 25%
de los varones de razas célticas de más de 60 años de edad
presentan signos de DD y se considera que es una de los trastornos
hereditarios más comunes del tejido conectivo en los caucásicos.
Hasta el momento no se ha identificado en la
bibliografía gen individual alguno como responsable de esta
afección. Además, no está claro si la DD es una afección
oligogénica compleja o un sencillo desorden mendeliano monogénico.
Por consiguiente, la identificación de loci genéticos susceptibles
proporcionaría un enfoque ideal para desvelar el componente
hereditario de esta enfermedad común y sería también valiosa en el
posterior desarrollo de estrategias de tratamiento y manejo de la
DD.
De lo expuesto anteriormente se apreciará que
existe una necesidad de ser capaces de evaluar a los individuos en
cuanto a su susceptibilidad para desarrollar afecciones al menos
parcialmente caracterizadas por fibrosis o cicatrización inadecuada
y también de evaluar el pronóstico para un individuo que padezca de
una afección de este tipo. Una manera en la que esto puede
enfocarse es proceder a la identificación de los polimorfismos o
mutaciones de un gen que puedan estar asociados a una determinada
afección médica. Una vez identificados, tales polimorfismos o
mutaciones pueden proporcionar información útil a los médicos que
necesiten manejar, tratar o establecer una susceptibilidad para
desarrollar una afección. Una manera en la que puede usarse la
información es en el desarrollo de una prueba
genética.
genética.
El análisis genético puede definirse como la
prueba analítica del ácido nucleico de un paciente para determinar
si el ADN de un paciente contiene mutaciones (o polimorfismos) que
ocasionen o incrementen la susceptibilidad a desarrollar una
afección o que estén en asociación con el gen que ocasiona la
afección y sean por consiguiente potencialmente indicativos de una
predisposición para esa afección.
La detección temprana de una predisposición para
desarrollar una afección constituye la mejor oportunidad para la
intervención médica. La identificación genética temprana del riesgo
puede mejorar el pronóstico de un paciente mediante una
intervención temprana antes de que se manifiesten los síntomas
clínicos.
En los casos en que los pacientes con síntomas
similares se tratan con el mismo tratamiento con éxito variable, el
análisis genético puede diferenciar pacientes con una base genética
de los que desarrollan los síntomas sin tenerla, conduciendo de
este modo a la necesidad potencial de diferentes enfoques de
tratamiento.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar procedimientos de selección genética para indicar un
riesgo o una predisposición a desarrollar afecciones que estén al
menos parcialmente caracterizadas por fibrosis o cicatrización
inadecuadas.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención se proporciona un procedimiento in vitro para
diagnosticar o detectar una predisposición a desarrollar una
afección al menos parcialmente caracterizada por la fibrosis o
cicatrización inadecuadas, el procedimiento comprende el examen del
ARNr16s del genoma mitocondrial de un sujeto de interés para
detectar la presencia de un polimorfismo o mutación genéticos
ligados al desarrollo de la afección.
El procedimiento de acuerdo con el primer
aspecto de la invención permite al investigador identificar un
sujeto que expresa polimorfismos o mutaciones genéticas en el
ARNr16s del genoma mitocondrial para determinar aquellos sujetos
que tienen o están en mayor riesgo de desarrollar una afección al
menos parcialmente caracterizada por una fibrosis o cicatrización
inadecuadas. Esto permite poner en marcha acciones adecuadas para
prevenir o disminuir la probabilidad de inicio de la afección o
para permitir el tratamiento de la misma. El procedimiento también
es útil para establecer un pronóstico para un sujeto que tiene
diagnóstico de una afección particular.
Se entiende por "polimorfismo" una región
de un gen o de elementos reguladores del mismo, en la que la
secuencia de bases de nucleótidos puede variar entre individuos.
Existe un genotipo predominante a menudo que representa la forma
habitual, o tipo salvaje, de un gen con subseries de una población
que tienen un polimorfismo que confiere un genotipo distinto.
Ciertos polimorfismos pueden ser predominantes en los individuos de
determinadas extracciones étnicas o de zonas geográficas
específicas. Un polimorfismo puede no afectar a la función del gen;
puede conducir a la aparición de diferencias en la función del gen;
puede producir un producto génico inactivo; o puede modular la
producción del producto del gen.
Se entiende por "mutación" una región de un
gen o de elementos reguladores del mismo, donde la secuencia de
bases de nucleótidos varía respecto al genotipo usual (es decir el
tipo salvaje). La mutación puede ser una sustitución, adición o
deleción de bases. Una mutación puede no afectar a la función del
gen; puede conducir a la aparición de diferencias en la función del
gen; puede producir un producto de gen inactivo; o puede modular la
producción del producto del gen.
Se entiende por "elementos reguladores" al
ADN que está involucrado en la regulación de la transcripción del
gen. Por ejemplo, las secuencias de unión al factor de
transcripción, la caja TATA y en particular el promotor de PL y
PH1. El promotor de PL y PH1 es un promotor predominante localizado
en la región de control que incluye un bucle (D) de desplazamiento
e influye en la transcripción de todos los genes mitocondriales.
Se entiende por "genoma mitocondrial" al
material genético encontrado dentro de la mitocondria de las células
de un sujeto analizado. Este material genético incluye todos los
genes y particularmente las secuencias codificadoras y los
elementos reguladores de los mismos.
El genoma mitocondrial es un ADN circular de
doble hebra de 16.558 pares de bases (menos que 10-5
veces el tamaño del genoma nuclear) compartimentalizado dentro de
cada mitocondria. El ADN mitocondrial (ADNmt) está típicamente
presente en
10-3-10-4 copias en
cada célula. Existen sin embargo, 102 copias en el espermatozoide y
105 en el oocito.
Se reconoce a las mitocondrias como componentes
importantes y vitales del citoplasma de las células eucariotas. Las
mitocondrias son responsables de la generación de energía en forma
de trifosfato de adenosina (ATP) a través del proceso de
fosforilación oxidativa (OXPHOS). Las mitocondrias también tienen
una función en la regulación de la muerte celular programada, o
apoptosis. La membrana mitocondrial interna contiene un número de
factores promotores de la apoptosis tales como cyt c, Smac, DIABLO,
AIF y caspasas. La apertura de los poros de transición de
permeabilidad mitocondrial causa hinchazón de la membrana y
liberación de estos factores apoptóticos al interior del citoplasma
celular.
En comparación con el genoma nuclear, el ADNmt
es extremadamente compacto con sólo 1 kb de secuencia no
codificadora conocido como bucle de desplazamiento (bucle D). El
bucle D forma un tríplex y es el sitio de origen de la replicación
mitocondrial. No hay intrones y el ADNmt no está cubierto por
histonas protectoras como el ADN nuclear. El genoma mitocondrial
está unido a la membrana mitocondrial interna próximo a la
cadena
respiratoria.
respiratoria.
El ADNmt comprende 13 genes codificadores de
proteínas. La secuencia completa del ADNmt humano es conocida por
los expertos en la técnica como la Secuencia de Referencia de
Cambridge (CRS) (Anderson y col., Nature, 9 de abril de 1981; 290
(5806): 457-465). Recientemente se ha secuenciado
nuevamente el ADNmt y se ha revisado además la CRS (Andrews y col.,
Nat Genet, octubre de 1999; 23 (2): 147).
Las secuencias del ADNmt pueden variar
típicamente en unos 50 nucleótidos (0,3%) entre seres humanos no
relacionados. Usualmente existe una única variante de secuencia de
ADNmt en todas las células de la mayoría de los seres humanos. A
esto se lo denomina homoplasmia.
Sin embargo, la tasa de mutaciones en el ADNmt
humano es 10-20 veces la del ADN nuclear. Se cree
que esta tasa de mutación se debe en parte en fallos de corrección
de las enzimas ADNmt polimerasas. Además, la cadena respiratoria es
una potente fuente de radicales libres de oxígeno que se cree causan
mutaciones en el ADNmt.
Las variaciones en la secuencia del ADNmt puede
ser hereditarias o pueden crearse in situ (somáticas).
Los trastornos mitocondriales están entre los
grupos más comunes de errores congénitos del metabolismo con una
incidencia estimada de 1 cada 10.000 nacimientos vivos. Las
afecciones mitocondriales están relacionadas con enfermedades en el
sistema mitocondrial de fosforilación oxidativa (OXPHOS), la ruta
que conduce a la producción del ATP. En este complejo sistema
OXPHOS están implicadas ochenta y cinco proteínas codificadas por
el genoma mitocondrial y el nuclear, de ahí la diversidad de
fenotipos clínicos que pueden verse en mutaciones genéticas del
sistema OXPHOS.
Existen cuatro diferencias fundamentales entre
la genética mendeliana y la mitocondrial, que incluyen la herencia
por linaje materno, poliplasmia, heteroplasmia y efecto umbral. El
fenotipo y la expresión clínica de una mutación de ADNmt patogénica
específica están afectados por la posición de la mutación dentro del
genoma mitocondrial pero también por la proporción de mitocondrias
mutantes con respecto a las de tipo salvaje dentro de la células. A
esto se lo denomina algunas veces carga mutacional; el grado de
heteroplasmia para una mutación de ADNmt dentro de la célula.
El efecto umbral se refiere a un número crítico
de ADN mutados que es necesario que estén presentes para que se
produzca una disfunción mitocondrial. El umbral hallado en una
expresión bioquímica podría tener 60% de mutaciones como deleciones
del ADNmt y 95% de mutaciones en el ARNt. Los requerimientos
energéticos de un tejido específico podrían afectar el grado de
disfunción tisular.
Las mutaciones del ADNmt comprenden mutaciones
puntuales (sustituciones) y reorganizaciones (deleciones y
duplicaciones) pero no mutaciones del sitio de empalme, ya que no
hay intrones. Se cree que las mutaciones puntuales se heredan
comúnmente por vía materna pero las reorganizaciones son con
frecuencia esporádicas.
Sólo las hembras transmiten rasgos con base
mitocondrial (mutaciones mitocondriales heredadas). Un rasgo se
transmite directamente de generación en generación. Esto sugiere
herencia dominante pero difiere de la genética mendeliana clásica.
Tanto machos como hembras se ven afectados. Las hembras transmiten
el rasgo a toda su descendencia, lo que no concuerda con la
transmisión de genes en el núcleo. La visión de consenso, por
consiguiente, es que bajo condiciones normales el ADNmt de los
mamíferos se hereda exclusivamente por línea materna. Hay una
eliminación selectiva del ADNmt del espermatozoide en cruces
intraespecies, aunque las mitocondrias del espermatozoide
contribuyen con el cigoto en la fertilización. Por consiguiente,
todos los hijos de una hembra son clónicos para el ADNmt. La
transmisión maternal clónica y una aumentada tasa de mutación
contribuyen a acumular nuevas mutaciones de ADNmt dentro de la
población.
Homoplasmia se refiere a la presencia del ADNmt
idéntico que se encuentra normalmente en una célula individual. En
comparación, la heteroplasmia es la coexistencia de mitocondrias que
contienen secuencias genómicas diferentes (ADNmt de tipo salvaje y
mutante) en la misma célula. La heteroplasmia puede implicar la
presencia de una mutación perjudicial en el ADNmt aunque también
pueden existir polimorfismos heteroplásmicos benignos. Durante la
división celular, el ADNmt se replica a sí mismo, pero a diferencia
de los genes nucleares, las nuevas moléculas mitocondriales se
segregan pasivamente en las células hijas. Una mutación mitocondrial
es un cambio aleatorio en una única molécula. Con el tiempo, la
segregación de oportunidades lleva a la proliferación de mutantes
en una célula. Pueden encontrarse diferentes niveles de
heteroplasmia para mutaciones mitocondriales individuales en
diversos tejidos por la segregación pasiva del ADNmt en la división
celular. En los seres humanos, la heteroplasmia mitocondrial está
asociada con enfermedades. La gravedad de algunas afecciones
patogénicas tales como trastornos neuromusculares se correlaciona
con un elevado número de ADNmt mutantes en el músculo esquelético
(tejido postmitótico). Por consiguiente, una variedad de fenotipos
clínicos desde asintomáticos hasta gravemente afectados están
asociados con niveles variables de heteroplasmia dentro de un
linaje.
En algunos tejidos y órganos puede tener lugar
la selección y conducir a un nivel reducido o aumentado de ADN
mutante. En este modelo, la selección negativa disminuirá el nivel
de un mutante en el transcurso del tiempo, mientras que los niveles
de ADNmt mutante pueden aumentar durante la vida en tejidos
particulares. En algunos tejidos los altos niveles de carga de
mutación se han asociado con progresión de enfermedades. Las
mitocondrias defectuosas con una carga de mutación aumentada pueden
proliferar selectivamente (tal vez como parte de un proceso
compensador) en respuesta a un defecto de la cadena respiratoria.
Esta selección positiva puede llevar a niveles aumentados de ADNmt
mutante dentro de un tejido postmitótico tal como el músculo.
Una característica especial de la enfermedad
mitocondrial es la heterogeneidad que se encuentra en la afección
clínica desde órganos únicos hasta enfermedades multisistémicas. Se
conocen más de 50 mutaciones patógenas del ADNmt por sustitución de
bases. Las sustituciones de bases están divididas en mutaciones sin
sentido que afectan los 13 genes que codifican proteínas y aquellas
que afectan al ARNr y al ARNt con efectos globales sobre la
síntesis proteica mitocondrial. Se han encontrado muchas más
reorganizaciones de ADNmt (deleciones e inserciones) en una
diversidad de trastornos degenerativos.
Las mutaciones mitocondriales más comúnmente
dadas a conocer son A3243G presente en MELAS (miopatía,
encefalopatía, acidosis láctica y episodios análogos al ictus),
AS344G en MERFF (epilepsia mioclónica, fibras rojas rasgadas),
T8993G/C en NARP (neuropatía, ataxia, neuritis pigmentosa),
neuropatía óptica congénita de Leber (LHON) y en el síndrome de
Leigh. Las mutaciones en el genoma nuclear podrían también afectar
la función mitocondrial al inactivar el sistema OXPHOS o
desestabilizar el ADNmt. Por ejemplo en la ataxia de Friedreich.
Existen evidencias acumuladas que indican que la
implicación de las mutaciones mitocondriales que llevan a
trastornos hereditarios pueden ser la base de un gran porcentaje de
los trastornos heterogéneos, comunes, de inicio tardío tales como
el deterioro neurosensitivo y la diabetes y otros trastornos
relacionados con la edad. La Tabla 1 presenta una variedad de
trastornos clínicos bien caracterizados que pueden estar ligados a
una diversidad de mutaciones del ADNmt.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores formaron una hipótesis de que el
desarrollo de una afección al menos parcialmente caracterizada por
la fibrosis o cicatrización inadecuadas (por ejemplo, DD) puede
estar ligado a mutaciones o polimorfismos en el genoma
mitocondrial. La hipótesis se basó en la observación de que algunos
de DD demuestran enfermedades heredadas por vía materna. Como los
trastornos mitocondriales se heredan por vía materna, decidieron
probar su hipótesis comparando el ADNmt de los sujetos con DD con
el de sujetos control.
Los inventores llevaron a cabo experimentos para
someter a selección el genoma mitocondrial para polimorfismos o
mutaciones que pueden estar asociados con una afección al menos
parcialmente caracterizada por fibrosis o cicatrización
inadecuadas. Habiendo establecido tal asociación, los inventores
establecieron que el ADN tomado de un sujeto puede analizarse para
ayudar a establecer un diagnóstico de la afección o para establecer
si un sujeto está o no predispuesto a desarrollar tal afección.
La afección puede ser una forma de cicatrización
patológica de la piel (por ejemplo, cicatrización hipertrófica o
formación de queloides) o una cicatriz o fibrosis interna como se ha
mencionado anteriormente. Alternativamente la afección puede ser
una enfermedad fibrótica o un trastorno fibrótico, también como se
ha mencionado anteriormente.
El procedimiento de la invención puede usarse
para ayudar a diagnosticar o detectar trastornos fibróticos de la
piel tales como:
La esclerodermia
La esclerosis sistémica
El síndrome Crest
La esclerosis tuberosa con manchas en la
piel
El colagenoma cutáneo familiar
Los trastornos metabólicos e inmunológicos de la
piel (porfiria cutánea tardía, enfermedad crónica de injerto
versus huésped)
La facsitis eosinofílica
El lupus eritematoso discoide, la
dermatomiositis
La enfermedad mixta del tejido conectivo
La fibrosis cutánea inducida por fármacos -
bleomicina, PVC, silicatos
La enfermedad de Peyronie
La fibrosis submucosa oral
La fibrosis inducida tras exposiciones
alimentarias y medioambientales.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento también es útil en el
diagnóstico o la detección de trastornos fibróticos de otros
órganos. Estos incluyen:
La fibrosis pulmonar/cardíaca
La cirrosis/fibrosis hepática
La fibrosis renal
La fibrosis del tracto gastrointestinal
La fibrosis inducida por fármacos (por ejemplo
tras un trasplante de órgano)
La fibrosis del sistema nervioso central y
periférico
La fibrosis del sistema vascular (de venas y
arterias)
La fibrosis del tracto genitourinario masculino
y femenino
Ginecológicos (fibrosis de las trompas de
Falopio, fibromas uterinos).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento del primer aspecto de la
invención es particularmente adecuado para diagnosticar o detectar
una predisposición a contraer la Enfermedad de Dupuytren (DD).
Los estudios se realizaron (como se resume con
más detalle en los Ejemplos) en ADNmt aislado de miofibroblastos.
En muchos estudios se ha demostrado que los miofibroblastos son una
célula clave responsable de la contracción tisular en DD y también
se ha informado que contienen un gran número de mitocondrias.
Los inventores usaron Cromatografía Líquida de
Alto Rendimiento Desnaturalizante (DHPLC) en combinación con el
Sistema de Análisis de Fragmentos de Ácido Nucleico Transgenomic
WAVE (WAVE System) para investigar polimorfismos o mutaciones en el
genoma mitocondrial. Estos aparatos pueden usarse en una técnica
automática de alta eficacia, coste efectiva para la detección de
mutaciones desconocidas (Jones y col., Human Mutation 2001;
17(3): 233-234.). La técnica usa una matriz
de perlas de divinilbenceno disponible comercialmente (DNASep,
Transgenomic Inc. Ne, EEUU) y una HPLC de fase inversa con par
iónico para detectar especies de ADN heterodúplex presentes en
muestras que contienen una mutación, que se forman posteriormente a
la amplificación por PCR. La elución diferencial de hetero y
homodúplex puede producirse mediante la aplicación de condiciones
parcialmente desnaturalizantes (por ejemplo, por medio de la
elevación de la temperatura). En un punto donde el ADN comienza a
fundirse la diferencia de contenido helicoidal de especies homo y
heterodúplex puede maximizarse cambiando de esta manera el grado en
el que cada especie se une a la matriz. Esta elución diferencial de
especies homo y heterodúplex lleva a un cambio en los patrones del
cromatograma y por consiguiente a la identificación de la presencia
de una mutación. Es importante destacar que, a diferencia de otras
técnicas, la DHPLC es capaz de detectar niveles extremadamente
bajos de mutantes dentro de una población de tipo salvaje. Esta
capacidad de la DHPLC la hace adecuada para la exploración del
genoma mitocondrial.
Como se ilustra en el Ejemplo 1, los inventores
encontraron que ciertos polimorfismos o mutaciones en el ADNmt se
correlacionan significativamente con el desarrollo de afecciones al
menos parcialmente caracterizadas por fibrosis o cicatrización
inadecuadas. Los ejemplos de polimorfismos o mutaciones de
preferencia que pueden detectarse según la invención se encuentran
en las siguientes posiciones en el genoma mitocondrial:
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores encontraron que las mutaciones en
la región ARNr16s del genoma mitocondrial están correlacionadas con
afecciones según el procedimiento de la invención.
La mutación puede estar contenida dentro de un
fragmento de 342 pb (es decir, en las posiciones
3192-3533 del genoma) del gen de ARNr16s con la
siguiente secuencia de nucleótidos:
Como alternativa, la mutación puede estar
contenida dentro de un fragmento de 442 pb (es decir en las
posiciones 2415-2856 del genoma) del gen de ARNr16s
con la siguiente secuencia de nucleótidos:
Una mutación de mayor preferencia se encuentra
en la posición 2839 del genoma mitocondrial. Esta mutación
representa una inserción de un nucleótido timidina (T) después del
nucleótido Guanosina (G) (G2839G/T). El ejemplo 1 ilustra que 16
de 18 muestras de pacientes con DD tenían el genotipo GT mientras
que todos los controles (CW) tenían el genotipo salvaje (G).
\vskip1.000000\baselineskip
La NADH-quinona oxidorreductasa
(Complejo I) es uno de los tres complejos enzimáticos transducción
de energía de la cadena respiratoria en la mitocondria. Es el punto
de entrada para la fracción más importante de electrones que
atraviesa la cadena respiratoria y da como resultado eventualmente
la reducción del oxígeno. Se presume que el Complejo I es uno de
los sistemas enzimáticos unidos a membrana más intrincados, que se
conocen hasta la fecha, está compuesto por al menos 43 polipéptidos
distintos. De éstos, 7 están codificados por el ADNmt (ND 1,2, 3,
4, 4L, 5 y 6).
La mutación puede estar contenida dentro de un
fragmento de 179 pb (es decir en las posiciones
3429-3607 del genoma) del gen de ND1 con la
siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa, la mutación puede estar
contenida dentro de un fragmento de 242 pb (es decir en las
posiciones 3608-3849 del genoma) del gen de ND1 con
la siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa, la mutación puede estar
contenida dentro de un fragmento de 470 pb (es decir en las
posiciones 3959-4428 del genoma) del gen de ND1 con
la siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró un patrón de DHPLC llamativo en la
región ND2 en el 94% de los casos que solo estuvo presente en el
45% de los controles. Esto indicó que estaba presente una mutación
ligada a las afecciones según la invención.
Se encontraron otras dos mutaciones nuevas en la
región ND2 (en las posiciones A4916G y G5045A) en sujetos con DD y
pueden detectarse en un análisis de acuerdo con la presente
invención.
La mutación puede estar contenida dentro de un
fragmento de 396 pb (es decir en las posiciones
4846-5241 del genoma) del gen de ND2 con la
siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
Como alternativa, la mutación puede estar
contenida dentro de un fragmento de 531 pb (es decir en las
posiciones 4180-4710 del genoma) del gen de ND2 con
la siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontraron múltiples mutaciones nuevas en
pacientes con DD que mostraron un patrón de DHPLC muy similar entre
al menos dos sujetos. Estos cambios de secuencias no estaban
presentes en ninguno de los controles. La mayoría de los cambios
encontrados por secuenciación revelaron la nueva presencia de
heteroplasmia que incluyó G15274C/G; A15282C/A; G15319C/G;
T15332C/T: G15336G/C; T15339T/C; T15362C/T y 15434insC. Todos estos
cambios estaban en la región del Citocromo b.
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró un cambio prominente en el patrón de
DHPLC de pacientes con DD dentro de las posiciones 6688 y 6849 del
genoma (la región CO I). Todos los sujetos con DD tuvieron un patrón
de DHPLC con un pico único mientras que sólo el 27% de las muestras
de control tuvieron un patrón similar.
La mutación puede estar contenida dentro de un
fragmento de 162 pb (es decir en las posiciones
6688-6849 del genoma) del gen de CO I con la
siguiente secuencia de nucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo adicional ha establecido que los
sujetos con otros trastornos fibróticos (por ejemplo, esclerodermia
o fibrosis renal) y los sujetos susceptibles de desarrollar
cicatrización grave/patológica (por ejemplo queloides) también
tienen una alta frecuencia de estas mutaciones. Por consiguiente, el
polimorfismo o mutación puede examinarse según el procedimiento de
la invención para diagnosticar o detectar una predisposición a
desarrollar una diversidad de afecciones al menos parcialmente
caracterizadas como fibrosis o cicatrización inadecuadas.
Pueden usarse diversas técnicas para detectar
polimorfismos o mutaciones de acuerdo con el procedimiento de la
invención.
Una técnica de preferencia es DHPLC. La técnica
está descrita con más detalle en el Ejemplo. Puede usarse o
adaptarse la técnica de DHPLC de Van Den Bosch y col. (Nucleic Acids
Res 15 de octubre de 2000; 28(20): E89) para el uso de
acuerdo con el procedimiento de la invención.
Otra técnica de preferencia implica la Digestión
con Enzimas de Restricción (RED) y se basa en el hecho de que los
polimorfismos o mutaciones pueden conducir a la producción de
fragmentos de ADN de distintos tamaños tras el tratamiento con una
enzima de restricción (por la introducción o deleción de un sitio de
restricción). Estos fragmentos pueden visualizarse en geles y el
polimorfismo identificarse en base al número y tamaño (es decir, de
la distancia recorrida en el gel) de los fragmentos de una muestra
de ADN obtenida de un sujeto.
Resulta de preferencia que el ADNmt se aísle y a
continuación se amplifique previo a la detección del polimorfismo o
mutación. De preferencia esta amplificación se efectúa por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, un
procedimiento de preferencia de acuerdo con la invención conocido
como el procedimiento del polimorfismo de la longitud del fragmento
de restricción por PCR (PCR-RFLP) y supone la
amplificación por PCR del ADN que contiene el polimorfismo o
mutación previo a la RED y su posterior análisis. Para algunos
polimorfismos ni el alelo de tipo salvaje ni el alelo mutante
suprime o introduce un sitio de enzima de restricción. Cuando éste
es el caso, puede introducirse un sitio de enzima de restricción
diseñando específicamente cebadores de PCR que introduzcan sitios
de restricción en el producto amplificado. El sitio enzimático
introducido permite establecer una diferenciación entre los alelos
polimórficos y los de tipo salvaje mediante análisis del tamaño.
Por ejemplo si los productos de restricción del producto amplificado
se analizan mediante electroforesis en gel (en gel de agarosa o de
poliacrilamida, por ejemplo), los alelos con el sitio de la enzima
de restricción introducido producirán una banda extra en el
gel.
Otras técnicas que pueden usarse para detectar
polimorfismos según la presente invención incluyen:
(1) La secuenciación directa de la región
polimórfica de interés (por ejemplo, usando kits disponibles
comercialmente tales como el Cy5TM Thermo Sequenase^{TM} dye
terminator kit - Amersham Pharmacia Biotech);
(2) La Hibridación de Oligonucleótidos
Específica de Secuencia (SSO) (que incluye la transferencia de
puntos o de líneas de moléculas de ADN amplificado que comprenden
la región polimórfica; la hibridación con sondas marcadas que están
diseñadas para que sean específicas para cada variante polimórfica;
y la detección de dicha marca-
ción);
ción);
(3) El Análisis de Heterodúplex y del
polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP) (que supone el
análisis de las disposiciones de las bandas de electroforesis de
moléculas de ADN desnaturalizado amplificado que comprenden la
región polimórfica);
(4) El Cebado Específico de Secuencia (SSP)
[también descrito como Sistema de Mutación Refractario a la
Amplificación (ARMS)];
(5) La exploración de Mutaciones [por ejemplo
usando el kit de exploración de mutaciones PASSPORTTM (Amersham
Pharmacia Biotech)];
(6) El Análisis por Escisión Química de Cadenas
con Apareamientos Erróneos;
(7) El Análisis no Isotópico por Digestión con
ARNasa (Ambion Ltd.);
(8) El Análisis por Escisión Enzimática de
Cadenas con Apareamientos Erróneos; y
(9) El Análisis de Extensión de Nucleótidos
Individuales.
Cuando es necesario amplificar por medio de PCR,
se necesita diseñar los cebadores de PCR para que sean adecuados
para amplificar una región alrededor del polimorfismo o mutación
relevante.
La serie 6 de cebadores de PCR (véase Ejemplo 1
y SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10 a continuación) son cebadores de
preferencia para detectar mutaciones en el gen de ARNr16s. La
amplificación con estos cebadores puede continuar con la digestión
con la enzima de restricción Ddel (para generar fragmentos de ADN
más pequeños) como se describe en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
- Cebador directo de la serie 6 de cebadores: 5' ctc act gtc aac cca aca cag g 3' (SEC ID Nº 9).
- Cebador inverso de la serie 6 de cebadores: 5' tgt gtt gtg ata agg gtg gag ag 3' (SEC ID Nº10)
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores adecuados para amplificar
específicamente la mutación en la posición 2839 se presentan a
continuación como SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 12.
\vskip1.000000\baselineskip
- Cebador directo: 5' tgc att aaa aat ttc ggt tgg 3' (SEC ID Nº 11) (longitud 21 pb; No GC7; No AT14; %GC 33%; Tm = 48,81)
- Cebador inverso: 5' tgt cct gat cca aca tcg ag 3' (SEC ID Nº 12) (longitud 20 pb; No GC10; No AT10; %GC 50%; Tm = 54,22)
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden usarse los cebadores de SEC ID Nº 11 y
SEC ID Nº 12 para amplificar la región del genoma mitocondrial que
contiene la mutación de la posición 2839. A continuación puede
secuenciarse el ADNmt para identificar el genotipo (es decir una
técnica de secuenciación directa).
El ADNmt puede aislarse de muestras de sangre o
tejido (por ejemplo cabello, frotis bucales orales, uñas o piel) o
de otras fuentes adecuadas usando procedimientos convencionales. De
preferencia el ADN se aísla de sangre entera o granulocitos, fascia
palmar, fascia plantar o fascia peniana. También representan una
fuente de ADNmt de preferencia los miofibroblastos para analizar de
acuerdo con el procedimiento de la invención.
De preferencia el procedimiento se usa para
examinar el ADNmt de un ser humano. Sin embargo se apreciará que el
ADN derivado de sujetos animales de interés veterinario también
pueden analizarse de acuerdo con el procedimiento de la
invención.
Una predicción o diagnóstico basado en el
procedimiento según la presente invención depende de que se
establezca una asociación entre una afección particular y el
polimorfismo específico o mutación en cuestión. Los inventores
establecieron tales asociaciones llevando a cabo otros experimentos
y realizando análisis estadísticos. Contar con datos basados en los
análisis de asociación permite al clínico interpretar la importancia
de los genotipos identificados secuenciando el ADN de acuerdo con
el procedimiento de la invención. El clínico puede entonces tomar
una decisión con respecto a la probabilidad de que un paciente
desarrolle o presente una determinada enfermedad o un determinado
trastorno. Tal conocimiento es importante para manejar clínicamente
afecciones específicas asociadas con la fibrosis o cicatrización
inadecuadas. Se apreciará que los datos relativos a la asociación
de un determinado genotipo en particular con una afección pueden
proporcionarse a un usuario del procedimiento según la invención
(por ejemplo, un técnico o un clínico) incorporando una hoja de
datos como parte de un kit (véase a
continuación).
continuación).
El análisis genético puede llevarse a cabo en un
período prenatal, perinatal o postnatal cuando se desee analizar si
es probable que un neonato o un niño haya heredado una
predisposición a desarrollar una afección al menos parcialmente
caracterizada por fibrosis o cicatrización inadecuadas. Esto es
particularmente útil cuando se cree que hay un historial familiar
de desarrollo de la afección.
El análisis es particularmente útil para
analizar sujetos previos a la operación. Los resultados de un
análisis de este tipo son útiles para establecer si podría o no
haber complicaciones en la curación en el caso de un sujeto que
deba ser sometido a cirugía (por ejemplo, cicatrización
hipertrófica, formación de queloides o
cicatrización/fibrosis
interna).
interna).
El análisis es también útil previo a establecer
un régimen terapéutico para tratar una afección con características
de cicatrización o fibrosis inadecuadas. Un médico clínico pueden
usar los resultados del análisis de acuerdo con la invención como
ayuda en la selección de los medicamentos a usar y de la
dosificación de los mismos.
Resulta de mayor preferencia que el
procedimiento de la invención se use para analizar sujetos con un
historial familiar de desarrollo de una afección al menos
parcialmente caracterizada por una cicatrización o fibrosis
inadecuadas.
inadecuadas.
Los diversos elementos necesarios para que un
técnico lleve a cabo el procedimiento del primer aspecto de la
invención pueden incorporarse en un kit. Por consiguiente, de
acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se
proporciona un kit que comprende:
A) Cebadores de PCR para amplificar
polimorfismos genéticos en el ARNr16s del genoma mitocondrial que
están ligados a una afección caracterizada por cicatrización o
fibrosis inadecuadas;
B) Muestras de ADN de control de genotipo
conocido para cada polimorfismo, y
C) Una ficha de datos que perfile el nexo
existente entre un polimorfismo particular y una afección al menos
parcialmente caracterizada por cicatrización o fibrosis
inadecuadas.
Resulta de preferencia que el kit comprenda
cebadores específicos para una secuencia diana del ADN de la muestra
que se sabe contiene un polimorfismo o mutación de interés. Por
ejemplo, los cebadores de PCR adecuados para un kit para obtener el
genotipo de la mutación G2838G/T son los cebadores de SEC ID Nº 9 y
SEC ID Nº 10 o los cebadores de SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 12.
El kit puede comprender además:
D) Una enzima de restricción adecuada para
generar fragmentos de la muestra de ADNmt;
E) Protocolos para amplificación por PCR,
digestión con enzimas de restricción de productos de PCR y
electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de ADN; y
F) Tampones apropiados.
Los tampones proporcionados con el kit pueden
estar en forma líquida y de preferencia se proporcionan en forma de
alícuotas previamente medidas. Como alternativa, los tampones pueden
estar en forma concentrada (o incluso en forma de polvo) para su
dilución.
El kit puede comprender además recipientes de
reacción adecuados, tubos de centrífuga, etc.
Los inventores encontraron que los moduladores
de los productos de los genes del genoma mitocondrial pueden usarse
para tratar cada una de las afecciones a que se hace referencia con
relación al primer aspecto de la invención. Resulta de preferencia
que los moduladores se usen para tratar le enfermedad de Dupuytren
(DD).
Varias clases de compuestos pueden usarse como
tales moduladores. Estos compuestos incluyen:
(i) inhibidores o activadores de los productos
de los genes mitocondriales (por ejemplo, inhibidores alostéricos o
competitivos);
(ii) compuestos que regulan la síntesis de
productos de los genes mitocondriales;
(iii) compuestos que regulan la liberación de
productos de los genes mitocondriales;
(iv) compuestos que regulan la tasa de
inactivación o metabolismo de los productos de los genes
mitocondria-
les;
les;
(v) compuestos que regulan la expresión y/o
transcripción de los productos de genes mitocondriales (por ejemplo,
ribozimas o moléculas de ADN antisentido); y
(vi) anticuerpos o intracuerpos surgidos contra
los productos de los genes mitocondriales.
Resulta de preferencia que el producto genético
modulado el Complejo I de la cadena respiratoria; el Complejo III
(Citocromo b) de la cadena respiratoria; o el Complejo IV (Citocromo
C Oxidasa) de la cadena respiratoria. Resulta de mayor preferencia
que el producto genético modulado sea ARNr16s.
Las moléculas antisentido, anticuerpos e
intraanticuerpos de preferencia estar dirigidos contra una
cualquiera de las secuencias SEC ID Nº 1 - 12.
Los moduladores pueden usarse para tratar
afecciones existentes pero también pueden usarse cuando se considere
médicamente necesario un tratamiento profiláctico. Por ejemplo,
cuando se considera necesario iniciar una terapia antes de una
cirugía electiva para evitar el desarrollo de cicatrización
hipertrófica o queloides.
Los moduladores pueden tomar una cantidad de
formas diferentes dependiendo, en particular de la manera en que se
van a usar. Por consiguiente, por ejemplo, la composición puede
estar en la forma un polvo, comprimido, cápsula, líquido, ungüento,
crema, gel, hidrogel, aerosol, vaporizador, micela, parche
transdérmico, liposoma o cualquier otra forma adecuada que pueda
administrarse a una persona o a un animal. Podrá apreciarse que el
vehículo de la composición de la invención será uno que tenga buena
tolerancia para el sujeto al que se le administra y que permita la
administración de los compuestos a este sujeto.
Los moduladores pueden usarse de varias maneras.
Por ejemplo, puede ser necesaria la administración sistémica en
cuyo caso el modulador puede estar contenido dentro de una
composición que puede, por ejemplo, ingerirse por vía oral en la
forma de un comprimido, cápsula o líquido. Como alternativa, la
modulación puede administrarse por medio de inyección en el
torrente sanguíneo. Las inyecciones pueden ser intravenosas (en bolo
o por infusión) o subcutáneas (en bolo o por infusión). Los
moduladores pueden también administrarse por inhalación (por
ejemplo, por vía intranasal).
Resulta de preferencia que los moduladores sean
para administración tópica al tejido afectado, o que se espera
pueda estar afectado, por la afección.
\newpage
El modulador puede también incorporarse dentro
de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Tales
dispositivos pueden, por ejemplo, insertarse sobre o bajo la piel y
el modulador puede liberarse durante semanas o incluso meses. Tal
dispositivo puede ser particularmente útil para pacientes con
afecciones crónicas. Los dispositivos pueden ser particularmente
ventajosos cuando se usa un modulador que normalmente podría
requerir administración
frecuente.
frecuente.
Podrá apreciarse que la cantidad necesaria de un
modulador está determinada por la actividad biológica y la
biodisponibilidad que a su vez dependen del modo de administración,
las propiedades fisicoquímicas del compuesto usado y de si el
modulador se está usando como una monoterapia o en una terapia
combinada. La frecuencia de administración estará influida también
por los factores antes mencionados y particularmente la semivida del
modulador dentro del sujeto que se está tratando.
Pueden usarse procedimientos conocidos, tales
como los utilizados convencionalmente por la industria farmacéutica
(por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos,
etc.), para establecer las formulaciones específicas de las
composiciones y los regímenes terapéuticos precisos (tales como
dosis diaria del modulador y la frecuencia de administración).
Un medio de preferencia de uso de los
moduladores de proteínas o péptidos es administrar el modulador al
tejido afectado por medio de terapia génica. Tal medio puede ser un
sistema de administración para uso en una técnica de terapia
génica, comprendiendo dicho sistema de administración una molécula
de ADN que codifica una proteína que modula directa o
indirectamente los productos de los genes del genoma mitocondrial,
siendo dicha molécula de ADN capaz de ser transcrita para permitir
la expresión de dicha proteína y de esta manera tratar una afección
al menos parcialmente caracterizada por fibrosis o cicatrización
inadecuadas.
Tales sistemas de administración son muy
adecuados para alcanzar niveles sostenidos de una proteína que
modula directa o indirectamente los productos de los genes del
genoma mitocondrial durante un período de tiempo más prolongado que
el posible para la mayoría de los regímenes terapéuticos
convencionales. El sistema de administración puede usarse para
inducir la expresión continua de la proteína a partir de células que
se han transformado con la molécula de ADN. Por consiguiente, aún
cuando la proteína tenga una semivida muy corta como un agente
in vivo, pueden expresarse cantidades terapéuticamente
eficaces de la proteína de manera continua desde el tejido
tratado.
tratado.
Además, el sistema de administración puede
usarse para proporcionar la molécula de ADN (y por consiguiente la
proteína que es un agente terapéutico activo) sin la necesidad de
usar vehículos farmacéuticos convencionales tales como los
requeridos en comprimidos, cápsulas o líquidos.
El sistema de administración es tal que la
molécula de ADN sea capaz de expresarse (cuando el sistema de
administración se administra a un paciente) para producir una
proteína que tiene actividad directa o indirectamente para modular
la actividad de los productos de los genes mitocondriales. Se
entiende por "directamente" que el producto de la expresión
del gen per se tiene la actividad requerida. Se entiende por
"indirectamente" que el producto de la expresión del gen sufre
o media (por ejemplo, como una enzima) al menos otra reacción para
proporcionar un modulador eficaz para tratar la afección.
La molécula de ADN puede estar contenida dentro
de un vector adecuado para formar un vector recombinante. El vector
puede ser por ejemplo un plásmido, cósmido o fago. Tales vectores
recombinantes son muy útiles en los sistemas de administración de
la invención para transformar células con la molécula de ADN.
Los vectores recombinantes pueden también
incluir otros elementos funcionales, Por ejemplo, los vectores
recombinantes pueden diseñarse de manera tal que el vector se
replicará de manera autónoma en la célula. En este caso, pueden ser
necesarios en el vector recombinante elementos que inducen la
replicación del ADN. Como alternativa, el vector recombinante puede
diseñarse de manera tal que el vector y la molécula de ADN
recombinante se integren en el genoma de una célula. En este caso
resultan deseables las secuencias de ADN que favorecen la
integración buscada (por ejemplo de recombinación homóloga). Los
vectores recombinantes pueden también tener ADN que codifique genes
que puedan usarse como marcadores seleccionables en el proceso de
clonación.
El vector recombinante puede también comprender
además un promotor o regulador para controlar la expresión del gen
según sea necesario.
La molécula de ADN puede (pero no
necesariamente) ser una que se incorpore en el ADN de las células
del sujeto que se está tratando. Las células indiferenciadas pueden
transformarse de manera estable y dar lugar a la producción de
células hijas genéticamente modificadas (en cuyo caso puede ser
necesaria la regulación de la expresión en el sujeto, por ejemplo,
con factores de transcripción específicos o activadores de genes).
Como alternativa, el sistema de administración puede diseñarse para
favorecer la transformación inestable o transitoria de células
diferenciadas en el sujeto que se está tratando. Cuando éste es el
caso, puede resultar menos importante la regulación de la expresión
porque la expresión de la molécula de ADN se detendrá cuando mueran
las células transformadas o detengan la expresión de proteínas (de
manera ideal cuando la afección ha sido tratada o evitada).
\newpage
El sistema de administración puede proporcionar
una molécula de ADN al sujeto sin la necesidad de incorporarla en
un vector. Por ejemplo, la molécula de ADN puede incorporarse dentro
de un liposoma o una partícula viral. Como alternativa, la molécula
de ADN "desnuda" puede insertarse dentro de las células del
sujeto por medios adecuados, por ejemplo por captación endocitótica
directa.
La molécula de ADN puede transferirse a las
células de un sujeto a tratar por transfección, infección,
microinyección, fusión celular, fusión de protoplastos o bombardeo
balístico. Por ejemplo, la transferencia puede ser por medio de
transfección balística con partículas recubiertas de oro, liposomas
que contienen la molécula de ADN, vectores virales (por ejemplo,
adenovirus) y medios parar proporcionar captación directa del ADN
(por ejemplo, endocitosis) por medio de la aplicación de la
molécula de ADN directamente al cerebro por vía tópica o por
inyec-
ción.
ción.
Resulta de preferencia que se usen
procedimientos diseñados para apuntar a afecciones originadas por
las mitocondrias para implementar los tratamientos descritos en
este documento. por ejemplo, puede adoptarse un enfoque antigenómico
usando ácidos nucleicos peptídicos (PNA). También pueden usarse
terapias de reemplazo celular endógeno y terapias génicas
alotrópicas para el tratamiento de enfermedades del ADNmt. Tal
terapia ha sido revisada recientemente por Turnbull y Lightowlers
(Nat. Genet. 30 de abril de 2002 30(4):
345-346) y podrá apreciarse que las técnicas
terapéuticas descritas en ese documento (e incorporadas en este
documento por referencia) pueden usarse en procedimientos de
preferencia de tratamiento según la presente invención.
La invención se describirá además, sólo por
medio de ejemplos, con referencia a los dibujos que acompañan, en
los que:
La Figura 1 es una representación esquemática de
la técnica de DHPLC modificada de Van Den Bosch y col. (Nucleic
Acids Res 15 de octubre de 2000; 28(20): E89; supra)
como se usa en el Ejemplo 1;
La Figura 2 es una representación esquemática
del genoma mitocondrial que muestra la posición de las series de
cebadores usadas para la amplificación en el Ejemplo 1;
La Figura 3 ilustra la amplificación con la
serie de cebadores 2 de un producto de 331 pb del genoma
mitocondrial que muestra la fidelidad aumentada de la polimerasa
Optimase usada en el Ejemplo 1 comparada con la polimerasa Expand
DNA (Roche) en la que los dibujos dentro del gráfico desde la parte
superior hasta la inferior representan Expand 2, Expand 2, Pho 12 y
Pho 12;
La Figura 4 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de Cebadores 4 en el
fragmento 3; en DD7 y DD12 comparado con el patrón WT en DD1 en el
que los dibujos dentro del gráfico desde la parte superior hasta la
inferior representan los mutantes en DD7, DD12 y DD1,
respectivamente;
La Figura 5 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de Cebadores 4 en el
fragmento 3 en el Ejemplo 1 en el que los dibujos dentro del gráfico
desde la parte superior hasta la inferior representan CW 19
comparado con CW 13;
La Figura 6 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de cebadores 5 en el
Ejemplo 1 en el que los dibujos dentro del gráfico desde la parte
superior hasta la inferior representan DD7, DD1 y CW3;
La Figura 7 es un gráfico que ilustra DHPLC para
la mutación en 1690 pb identificada usando la serie de Cebadores 5
en el Ejemplo 1 en el que los dibujos dentro del gráfico desde la
parte superior hasta la inferior representan DD1, CW19 y DD7;
La Figura 8 es un gráfico que ilustra DHPLC para
la mutación en 1811 pb identificada usando la serie de Cebadores 5
en el Ejemplo 1 en el que los dibujos dentro del gráfico desde la
parte superior hasta la inferior representan DD6, DD12, DD20, CW3,
CW4, CW10, CW12 y DD7;
La Figura 9 es un gráfico que ilustra una
muestra afectada frente a una muestra control con la mutación
evidente como un patrón de doble pico aumentado en el fragmento 5
identificada usando la serie de Cebadores 6 del Ejemplo 1 en el que
los dibujos dentro del gráfico desde la parte superior hasta la
inferior representan DD5 y CW3:
La Figura 10 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de Cebadores 7 en el
Ejemplo 1 en el que los dibujos dentro del gráfico desde la parte
superior hasta la inferior representan DD1, DD2, DD11, DD14, DD17,
DD18 y DD5;
La Figura 11 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de Cebadores 8 en el
Ejemplo 1:
La Figura 12 es un gráfico que ilustra mutantes
por DHPLC identificados usando la serie de cebadores 9 en el
fragmento 4; en DD12, CW3 y CW10 en el Ejemplo 1;
La Figura 13 es un gráfico que ilustra un patrón
de un pico encontrado en todas las muestras de DD mientras que sólo
el 83% de los controles (CW) tienen el patrón de un pico
identificado usando la serie de Cebadores 10 en el Ejemplo 1 en el
que los dibujos dentro del gráfico desde la parte superior hasta la
inferior representan CW5 y DD1:
y
y
La Figura 14 es un gráfico que ilustra mutantes
de sitio de restricción por DHPLC identificados usando la serie de
cebadores 16 en CW4 y CW6 en el Ejemplo1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las muestras se tomaron de un grupo de pacientes
con enfermedad de Dupuytren (DD) y un grupo de control para
investigar la correlación entre polimorfismo y la afección.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores modificaron la técnica de DHPLC
de Van Den Bosch y col. (Nucleic Acids Res 15 de octubre de 2000;
28(20): E89) para explorar el genoma mitocondrial para
mutaciones que puedan estar ligadas a la DD.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores modificaron la técnica de DHPLC
de Van Den Bosch y col. (supra) para permitir llevar a cabo
la exploración de mutaciones de genoma mitocondrial de grandes
muestras de poblaciones más rápidamente a costes razonables. Los
cambios realizados se resumen en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 1 se ilustra una representación
esquemática del proceso, modificado sobre el de Van Den Bosch y
col. La Figura 1 muestra una amplificación por PCR usando la
polimerasa de ADN Optimase del genoma mitocondrial total usando una
serie de 18 cebadores diseñados específicamente. En DHPLC de rutina
se usan cuatro fragmentos de la serie de amplificación pero los
catorce restantes sufren digestión por restricción para producir una
variedad de fragmentos, que pueden a continuación someterse a DHPLC
múltiplex usando un total de 29 parámetros diferentes (gradiente y
temperatura). Las muestras positivas se indican por medio de un
cambio en el patrón del cromatograma y las mutaciones presentes se
verifican por secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las mejoras realizadas a la técnica de
DHPLC de Den Bosch y col. se originan a partir del diseño de
cebadores, que se diseñaron teniendo en cuenta los siguientes
criterios:
1. Fragmentos individuales para DHPLC (no
múltiplex) de la región hipervariable del genoma mitocondrial.
2. Consideración de los principales genes
codificadores individuales.
3. Consideración de mutaciones conocidas que
causan enfermedades.
En la Figura 2 se ilustran las posiciones de los
cebadores y estos criterios. Con referencia a la exploración de la
región hipervariable, se usaron 3 amplificaciones solapadas por PCR
en lugar de un fragmento grande con posterior digestión por medio
de enzimas de restricción como en la técnica original. La naturaleza
hipervariable, aunque no codificante, de esta región lleva a
grandes cantidades de de patrones de DHPLC positivos que se
verificaron por secuenciación usando esta estrategia.
Aunque se necesitó un mayor número de PCR para
la amplificación de todo el genoma que el usado en la técnica
original, los inventores creen que esto valió la pena porque fue
necesario adquirir menos enzimas de restricción (5 en lugar de 10)
y lo que es más importante, se necesitaron menos condiciones para la
exploración por DHPLC. La disminución en las condiciones de
exploración de 65 a 29 fue un elemento que ahorró costes y tiempo
real, que se acentúa con la necesidad de explorar grandes
cantidades de muestras en un escenario de investigación como el de
este proyecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Dada la naturaleza heteroplásmica de las
poblaciones mitocondriales, una técnica de detección de mutaciones
debe tener suficiente sensibilidad para encontrar pequeñas
proporciones de una mutación en una población predominantemente de
tipo salvaje. Teniendo esto en cuenta, un criterio clave para esta
aplicación es la alta fidelidad en la preparación de las muestras
por amplificación mediante PCR. Todas las enzimas Taq ADN polimerasa
tienen un nivel inherente de errores de incorporación que dependen
de su origen y del procedimiento de uso. Cada error de
incorporación durante la amplificación mediante PCR es el
equivalente de un heterodúplex aleatorio de bajo nivel, que puede
visualizarse con la técnica de DHPLC. Por consiguiente, es
recomendable mantener estos errores de incorporación en el nivel
más bajo posible y así obtener la mayor posibilidad de éxito. Los
inventores sustituyeron una nueva polimerasa de corrección
(polimerasa de ADN Optimase, Transgenomic Inc), que ha demostrado
tener niveles de fidelidad extremadamente altos. La Figura 3 muestra
el patrón de WT obtenido para la serie de cebadores 2 usando la
polimerasa Optimase comparado con la polimerasa de ADN Expand
(Roche). El patrón de pico más agudo obtenido bajo las condiciones
de desnaturalización parcial usando la polimerasa de ADN Optimase
es indicativo de la mayor fidelidad de la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Casos: En el estudio se enrolaron pacientes con
enfermedad de Dupuytren (DD) heredada por vía materna (n =20). El
intervalo de edades fue de entre 37 y 90 años con una media de edad
de 56,9 años. Todos los casos eran caucásicos no relacionados de la
región noroeste de Inglaterra; los casos de Dupuytren de RU se
identificaron en su mayoría a través de códigos clínicos de
informes operativos del South Manchester University Hospital Trust
y del Wrightington Hospital en la región noroeste. Se realizó una
historia clínica completa a cada paciente según proforma. Se
examinaron ambas manos y pies de cada individuo. Todos los casos
tenían diagnóstico confirmado de DD preoperatorio con la presencia
de nódulos característicos de Dupuytren en la palma de la mano y/o
dedos con contractura de la articulación metacarpofalángica (MCPJ)
o de la articulación falángica proximal (PIPJ).
Controles: Todos los individuos de control
(n=20) eran hombres y mujeres caucásicos sanos de edad, sexo y
etnia coincidente seleccionados de la misma región del noroeste de
Inglaterra. También se realizó una historia clínica completa según
proforma. Se examinaron todas las cicatrices y ambas manos de cada
individuo para descartar la presencia de cualquier trastorno
fibrótico de la piel. Ninguno de los controles tenía evidencia de DD
y no se informaron antecedentes familiares de DD.
Los comités de ética locales y de los hospitales
dieron su aprobación para el estudio. Se obtuvieron consentimientos
por escrito de todos los individuos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron muestras de sangre de los sujetos
usando una técnica de flebotomía convencional. Se recogieron 15 ml
de sangre venosa de cada sujeto. Se extrajo el ADN de las células de
sangre periférica usando un kit de extracción de ADN disponible
comercialmente (Qiagen, RU). Se midieron las concentraciones de ADN
y se diluyó en tampón hasta 100 ng/\mul usando tampón Qiagen
estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron dieciocho series de cebadores para
amplificar el genoma mitocondrial completo. El detalle de los
fragmentos mitocondriales que amplifican se presenta en la Tabla 3 y
las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro series de cebadores produjeron fragmentos
que pudieron analizarse inmediatamente por DHPLC simple mientras
que los restantes 14 cebadores amplificaron productos con un tamaño
de fragmento de 800-2000b que se usaron en un
análisis de DHPLC múltiplex tras la posterior digestión de
restricción. Se combinaron los cebadores hacia adelante e inversos
para cada serie de fragmentos a una concentración de 5 \muM para
cada cebador.
Los cebadores de secuenciación usados para la
verificación de mutación se obtuvieron de la serie de cebadores de
amplificación original detallada anteriormente, diseñados usando el
programa Primer 3 (htt://www.genome.wi.mit.
edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgipr) o de la bibliografía (Levin y col. 1999).
edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgipr) o de la bibliografía (Levin y col. 1999).
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de PCR se realizaron en un
volumen de 100 \mul que contenían aproximadamente 100 ng de ADN
genómico como molde, cada dNTP en concentración de 200 \muM
(Cruachem Ltd), 30 pmol de cada cebador hacia adelante e inverso,
2,5 unidades de polimerasa de ADN Optimase y 10 x tampón de reacción
Optimase que contenía MgSO_{4} 1,5 mM (Transgenomic Ltd). la
amplificación tuvo lugar usando un ciclador Tetrad Thermal MJ de
investigación con las condiciones de los ciclos que se resumen en la
Tabla 5. Se probó una pequeña cantidad (5 \mul) del producto de
PCR en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y se
visualizó bajo luz ultravioleta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron las enzimas de restricción (AluI,
DdeI, Hae III, MboI y MspI - New England Biolabs) para digerir los
diversos fragmentos de PCR como se indica en la tabla 3. Se
mezclaron 88,5 \mul del producto de PCR con 10 \mul del tampón
de la enzima de restricción relevante y 1,5 \mul de la enzima de
restricción. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 2 horas y se
probó una pequeña proporción (10 \mul) en un gel de agarosa al 2%
teñido con bromuro de etidio. Las muestras que contenían un patrón
de restricción aberrante se identificaron. Este cambio en el tamaño
de los fragmentos creado por un cambio en el patrón de restricción
podía llevar a una alteración de las temperaturas predichas del
análisis por DHPLC. El hecho de que el genoma mitocondrial tenga
una composición relativamente constante y de que se identificaran
muy pocos mutantes del sitio de restricción no condujo a los
investigadores a cambiar las temperaturas de análisis a las que se
muestran en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Previo al análisis por DHPLC se sometieron todas
las muestras a la etapa de formación de heterodúplex constituida
por calentamiento a 95ºC durante 5 minutos y a continuación
enfriamiento a una velocidad de 1,5ºC por minuto hasta alcanzar una
temperatura de 25ºC usando el instrumento termociclador MJ
Tetrad.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de las muestras usando las
temperaturas predichas (WAVEMAKER^{TM} software Transgenomic Inc,
NE, EEUU) que se muestran en la Tabla 3 se llevó a cabo usando el
Sistema de Análisis de Fragmento de Ácidos Nucleicos WAVE y
tecnología DNASep Cartridge (Transgenomic lnc, NE, EEUU). La fase
móvil en gradiente estaba constituida por Tampón A (Acetato de
trietilamonio 0,1M pH 7,0) y Tampón B Acetato de trietilamonio 0,1M
pH 7,0 y acetonitrilo al 25%). Estos eluyentes se mezclaron para
producir un gradiente lineal con variación del Tampón B entre 45 y
67% durante un período de 12 minutos. Se adoptaron los
procedimientos de lavado del cartucho recomendados para esta
aplicación; un lavado de 0,5 minutos usando acetonitrilo al 75% al
finalizar el gradiente lineal. Se inyectaron 10-15
\mul de muestra de manera rutinaria por análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR para verificación de mutaciones por
secuenciación se llevó a cabo como se resumió anteriormente la
serie de cebadores relevante. Las muestras se trataron con ExoSaplT
previo a la precipitación con etanol. La secuenciación por ciclos,
según los protocolos de los fabricantes se realizó usando un
secuenciador Applied Biosystems 3100.
Tres series de cebadores (MT1-3)
amplificaron la mayor parte de la región hipervariable (bucle D) del
genoma mitocondrial. Esta región es no codificadora y se extiende
desde 15887 hasta 648 pb del genoma mitocondrial. Es
característicamente muy polimórfico.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores amplificó la región
15974-16409 pb, dando un fragmento de 436 pb. Se
detectaron variaciones múltiples y no específicas en el patrón de
DHPLC a través de las muestras afectadas y los controles. Estas
variaciones representaron un gran número de mutaciones aleatorias.
No hubo ningún patrón único dominante en ninguna de las muestras.
Esto indicó que no había mutaciones obvias causantes de enfermedad.
Estos hallazgos se reflejan en los resultados de secuenciación
(resumidos en la Tabla 6). Se secuenciaron DD11, CW1, CW4 (WT) como
muestras representativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores amplificó la región
16341-102 pb, dando un fragmento de 331 pb.
De manera algo sorprendente, a la luz de la
naturaleza hipervariable de esta región, el análisis por DHPLC no
dio cambios obvios entre la población afectada y la de control. No
se enviaron muestras para secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores 3 amplificó la región
29-480 pb, dando un fragmento de 452 pb. Los
resultados de este fragmento de 452 pb fueron similares a los
obtenidos con la serie de Cebadores 1. Los resultados de DHPLC
mostraron un patrón de variabilidad de grado elevado que confirmó la
naturaleza altamente polimórfica de esta región. Esto indicó que no
había mutaciones causantes de enfermedad evidentes porque no hubo
patrón dominante único presente en ninguna de las muestras. Los
datos de secuenciación se resumen en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
368-1713 pb (que codifica 12sr ARN en
648-1601 pb) dando un producto de 1346 pb que se
digirió con MboI para dar fragmentos de 211, 276, 372 y 487 pb. El
diseño del cebador necesitó un grado de solapamiento para asegurar
la total cobertura de la región mitocondrial y por consiguiente el
comienzo del cebador 4 cubre 300 pb de la porción terminal de la
región del bucle D.
La mutación DEAF conocida está presente en esta
región en la posición 1555. En las muestras analizadas no se
observaron mutantes del sitio de restricción pero se identificaron
mutantes por DHPLC como se muestra en las Figuras 4 y 5 (véanse las
flechas). Se enviaron cinco muestras para secuenciación; mutantes
por DHPLC DD1, DD7 y DD12 en el fragmento 3 y CW5 con una inserción
potencial en el fragmento 2. Se secuenció CW3 como un control para
estas regiones. Las mutaciones identificadas en estas muestras se
resumen en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
1650-2841 pb dando un producto de 1192 pb que se
digirió con Hae III para dar fragmentos de 273, 394 y 525 pb. No se
observaron mutantes del sitio de restricción. Los mutantes por
DHPLC se identificaron como se muestra en la Figura 6. El grado de
desnaturalización dificultó la identificación del fragmento preciso
que contenía el mutante y por consiguiente se realizó la
secuenciación de los fragmentos dos y tres. Se enviaron tres
muestras DD1, 6 y CW3 como representativas de cambios en el patrón
de DHPLC con DD7 como patrón de referencia en esta región (Fig. 6).
La mutación secuenciada en la posición 1690 en la muestra DD1 tenía
un patrón de DHPLC similar como en CW19, que por consiguiente tiene
probabilidad de contener esta mutación desconocida (Tabla 6 y Fig.
7). La mutación conocida en la muestra CW 3 en la posición 1811 pb
(A>G) comparte su patrón de DHPLC con otras 6 muestras (CW4, 10
y 12: DD 6, 12, 20).
\newpage
Esta serie de cebadores cubre la región
2415-3811 pb dando un producto de 1397 pb que se
digirió con DdeI para dar fragmentos de 125, 210, 278, 342 y 442
pb. El análisis de DHPLC mostró un cambio importante entre el
control (CW) y la población afectada (DD) en el fragmento 5 como se
ilustra en la Figura 9. En las muestras DD hubo un patrón de dos
picos mucho más pronunciado en este fragmento comparado con las
muestras de control que mostraron un pico principal y meseta. Se
enviaron cuatro muestras como representativas para secuenciación,
DD3 y DD11 con CW3 y CW5 como controles.
De cada 20 casos hubo 2 fallos de PCR. 16 de
cada 18 muestras DD tuvieron un patrón de DHPLC mutante (G>GT en
la posición 2839) en comparación en el patrón de referencia en todos
los controles. Ninguno de los controles tuvo el patrón mutante.
Esto representa una correlación significativa entre el mutante GT y
la incidencia de DD. Por consiguiente, un procedimiento de
preferencia según la invención detecta una mutación en la posición
2839 del genoma mitocondrial.
Se identificó otra mutación en una de las
muestras de control CW3 en la posición T2706C. Esta no estuvo
presente en ninguna de las muestras secuenciadas de los casos y
controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
3429-4428 pb dando un producto de 1000 pb que se
digirió con HaeIII para dar fragmentos de 109, 179, 242 y 470 pb.
En las muestras no hubo mutantes del sitio de restricción presentes.
El análisis por DHPLC mostró un cambio potencialmente interesante
en siete de cada 20 muestras afectadas como se ilustra en la Figura
10. Es probable que el cambio esté localizado en algún sitio en los
fragmentos 2, 3 ó 4. Se enviaron todas las muestras positivas (DD1,
2, 5, 11,14, 17, 18) para análisis de secuencia con CW1, 9 y 15
como muestras de control (véase Tabla 6 para mutaciones).
DD1, 2, 11, 14, 17, 18 mostraron todos un patrón
de DHPLC diferente al patrón de referencia (Fig. 10). DD1 y 14
tienen el mismo patrón, sin embargo DD11 es diferente a todos los
patrones en este grupo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
4180-5488 pb dando un producto de 1309 pb que se
digirió con MspI para dar fragmentos de 135, 247, 396 y 531 pb. No
hay mutaciones conocidas de enfermedades informadas en esta región.
No hubo mutante del sitio de restricción presente en la muestra
analizada. El análisis por DHPLC mostró un cambio potencialmente
interesante en 94% de los casos que tenían un patrón de dos picos
comparado con 47% de los controles (Figura 11). Se enviaron tres
muestras positivas (DD10,17 y 18) para análisis de secuencia con
CW2 como muestras de referencia (véase Tabla 6).
Los inventores creen que el área
4180-4526 puede tener una mutación que será
relevante para afecciones tales como DD ya que 2 de cada 3 muestras
DD tenían cambios dentro de este área.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
5347-6382 pb dando un producto de 1036 pb que se
digirió con HaeIII para dar fragmentos de 122, 190, 233 y 491 pb.
No hay mutaciones conocidas de enfermedades en esta región. Tres
muestras DD12, CW3 y CW10 mostraron la misma mutación del sitio de
restricción que destruyó el sitio de escisión de HaeIII entre
5836-5839 pb (conocido). Esta mutación del sitio de
restricción y un ejemplo de los mutantes por DHPLC (presentes en el
Fragmento 4) pueden verse en la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
6318-7707 pb dando un producto de 1390 pb que se
digirió con MspI para dar fragmentos de 117, 162, 253, 354 y 504
pb. En el fragmento 2, el 100% de las muestras DD tenían un patrón
de un pico mientras que sólo el 27% de los controles tienen el
patrón de un pico. En la Figura 13 se ilustra el cambio de patrón
de DHPLC. Se enviaron siete muestras para secuenciación, 3 casos de
DD (DD1, 12 y 20) y 4 controles (CW1, 3, 5 y 7). Sin embargo, la
secuenciación no reveló cambios en la secuencia del fragmento 2 del
cebador 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
7644-8784 pb dando un producto de 1141 pb que se
digirió con HaeIII para dar fragmentos de 141, 181, 212, 243 y 364
pb. Hay dos mutaciones del sitio de restricción diferentes
conocidas encontradas en las muestras que destruyen los sitios de
HaeIII.
Las muestras DD10 y CW14 tienen el sitio de
restricción destruido en 8250 pb (G>A). Se encontró otra mutación
del sitio de restricción en la posición 7980 (A>G) en la muestra
DD12. Hay una deleción de 9 pb (caccccctc) en las muestras DD1 7 y
CW10 en la posición 8269-8277. Los dos mutantes del
sitio de restricción y la deleción de 9 pb se confirmaron por
secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
8643-9458 pb dando un producto de 816 pb que se
digirió con DdeI para dar fragmentos de 187, 239 y 390 pb. No hay
mutantes del sitio de restricción en las muestras analizadas.
Se identificó una mutación desconocida presente
en un caso y dos controles en la posición 8696 (G>A). También se
encontró otra mutación puntual en un control solamente en la
posición 9264 (C>T). No hubo otros cambios de patrón de DHPLC
similares en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
9397-11387 pb dando un producto de 201 pb que se
digirió con AluI para dar fragmentos de 248, 312, 366, 487 y 588
pb. No hay mutaciones de enfermedades conocidas. Se identificaron
dos mutantes del sitio de restricción DD17 y CW3 que destruyen el
sitio de AluI 9643-9647 pb (conocido).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
11322-12582 pb dando un producto de 1531 pb que se
digirió con HaeIII y vlspl para dar fragmentos de 178, 366, 435 y
552 pb. Existe una mutación conocida para la enfermedad LHON
(neuropatía óptica hereditaria de Leber) (G11778A). No hay mutantes
del sitio de restricción en este área.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
12753-13264 pb dando un producto de 512 pb. Este fue
un simple fragmento de DHPLC que se analizó sin digestión de
restricción a 59ºC. No hubo cambios evidentes en el patrón de DHPLC
entre las poblaciones afectadas y de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
13172-14610 pb dando un producto de 1439 pb que se
digirió con AluI y Ddel para dar fragmentos de 129, 177, 289, 382 y
462 pb. Existe dos mutaciones conocidas para la enfermedad LHON
(neuropatía óptica hereditaria de Leber) (A14495G y T14484C). Hay
tres mutantes del sitio de restricción en este área. Los dos
primeros son mutaciones conocidas; el primero se encuentra en CW4,
que destruye el sitio AluI 14014-14017 y un segundo
en el sitio de AluI en 14303-14306. El tercer
mutante del sitio de restricción es desconocido y se encuentra en
la muestra CW6 que destruye el sitio de Ddel
14433-14437) que se muestra en la Figura 14 con un
patrón de DHPLC aberrante en la muestra CW 19.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
14427-15590 pb dando un producto de 1164 pb que se
digirió con MboI para dar fragmentos de 191,235, 297 y 441 pb. Se
identificaron tres mutantes del sitio de restricción en DD12, CW13
y CW20 que destruyeron el sitio de MboI
(14868-14871). Las mutaciones identificadas en DD18
se muestran en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de cebadores cubre la región
15424-16451 pb dando un producto de 1028 pb que se
digirió con AluI para dar fragmentos de 218, 353 y 457 pb. No hay
mutaciones conocidas pero se identificaron tres mutantes del sitio
de restricción en DD17, CW9 y CW11 que crean un sitio de AluI en el
fragmento 2 (15424-15776) separándolo en un
producto de 165 y 188 pb (AGCT).
La secuenciación de DD17 identificó mutaciones
en 15606 (A>G) y 15451 (G>T).
\newpage
La Tabla 6 resume las mutaciones identificadas
en el Ejemplo 1 a través del genoma mitocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia del sitio hipervariable en la
región no codificadora del ADNmt humano se ha documentado bien en
el pasado. Se cree que los sitios hipervariables representan puntos
conflictivos ya que las mutaciones somáticas y de la línea germinal
se producen de preferencia en este sitio. Se encontró que esta
región es un punto conflictivo en cánceres de pulmón, vejiga y
cabeza y cuello. Las mutaciones en esta región pueden estar
relacionadas con la función del bucle D como sitio regulador para la
replicación y expresión del ADNmt. No se conoce aún la
característica única de estos sitios hipervariables que los hace
puntos mutacionales tan conflictivos.
Los cebadores 1 a 3 cubren la mayor parte de la
región del bucle D con los últimos 300 pb cubiertos por el cebador
4. Se observó un número de alteraciones y cambios de patrón
presentes aleatoriamente a través del análisis por DHPLC para la
serie de cebadores 1 y 3. Esto se refleja en los datos de
secuenciación donde se observa un número de cambios tanto en las
muestras de control como en las de casos. En general, no se
encontraron mutaciones específicas de enfermedad en estas series de
cebadores.
En el cebador 1, se encontraron 10 mutaciones
conocidas en casos de DD y 5 mutaciones puntuales y 5
heteroplásmicas con 2 mutaciones puntuales desconocidas en los
controles. También se encontraron dos mutaciones puntuales
conocidas en casos y una en un control.
No hubo cambios evidentes en el patrón de DHPLC
en el cebador 2 y por consiguiente no se enviaron muestras para
secuenciación aunque, en la base de datos de referencia de
polimorfismos mitocondriales (http://infinity.gen.emory.
edu/mitomap.html) había veinte mutaciones más informadas en esta región. La comparación de patrones de DHPLC, por ejemplo entre el cebador 1 y el 2 muestra variabilidad significativamente disminuida en el análisis del cebador 2 y en particular, no se identificaron cambios o alteraciones importantes del patrón. Además, estos cambios informados pueden no estar actualmente presentes dentro de la población de muestras.
edu/mitomap.html) había veinte mutaciones más informadas en esta región. La comparación de patrones de DHPLC, por ejemplo entre el cebador 1 y el 2 muestra variabilidad significativamente disminuida en el análisis del cebador 2 y en particular, no se identificaron cambios o alteraciones importantes del patrón. Además, estos cambios informados pueden no estar actualmente presentes dentro de la población de muestras.
En el cebador 3 se identificaron dos mutaciones
puntuales desconocidas en los controles. Se identificaron dos
mutaciones conocidas y una desconocida en el cebador 4, cuyas
posiciones indicaron que pertenecían a la región del bucle D. Sólo
dos de cada veinte casos demostraron este patrón de DHPLC, que
estuvo ausente en todos los controles. Esto se confirmó por
secuenciación. Como conclusión, no hay una gran correlación entre
polimorfismos del bucle D y DD.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador 4 cubre completamente el ARNr12s. El
cebador 5 cubre la mayor parte del ARNr16s con el comienzo y el
final de ARNr16s cubiertos por los cebadores 4 y 6 respectivamente.
No se han encontrado mutaciones en la región de ARNr12s. No hay
hallazgos sorprendentes en vista del hecho de que esta región no es
un punto conflictivo tal como la región hipervariable y la
incidencia de mutaciones debería ser menor. Existen sin embargo
mutaciones de enfermedades informadas en la región de ARNr12s que
incluyen los siguientes ejemplos; SNHL (1095C), DM (1310T, 1438T) y
DEAF (1555G).
Se identificó una mutación ya conocida en la
posición 1811 pb en el ARNr16s, que estuvo presente en 3 casos y 4
controles. Además, se identificó una mutación en la posición 1690 en
un caso con un patrón de DHPLC similar en un control - con
probabilidad de ser la misma secuencia. La distribución de estas
mutaciones (1690 y 1811 pb) entre los casos y los controles no
parece mostrar ninguna importancia con DD.
Se identificó una mutación heteroplásmica
desconocida en la posición 2839 pb que era un cambio de pares de
base G a G/T en la región del ARNr16s de la mitocondria. El cambio
de patrón de DHPLC fue claramente evidente en aproximadamente en el
90% de los casos y estuvo ausente en todos los controles. Como se
indicó anteriormente, esta mutación demostró una relación
importante con DD. Por consiguiente esta mutación representa una
mutación de mayor preferencia que puede analizarse según el
procedimiento de la invención.
Se identificó también una mutación nueva en un
único control, que no estaba presente en ninguna de las otras
muestras secuenciadas. La elevada prevalencia del cambio de patrón
de DHPLC y su marcada diferenciación entre casos y controles puede
indicar potencialmente importancia de enfermedades. Se presume que
una mutación heterosplásmica en ARNr16s altera la síntesis
mitocondrial de proteínas.
Se han descrito otras mutaciones conocidas de
enfermedades en la región de ARNr16s. Estas incluyen las siguientes,
síndrome de Rett (2835T), MELAS (3093G) y ADPD (3196A).
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontraron tres muestras (una DD y dos de
control) donde se había destruido el sitio de restricción de HaeIII
en 5837 pb que dieron lugar a la distribución de fragmentos
diferentes. La secuencia de corte era GGCC. La posición de esta
mutación se encuentra dentro de la región codificadora del ARNt
entre ND2 y COI. Al buscar en la base de datos mitomap Enfermedades
de Sustitución de Bases de ADN Mitocondrial para mutaciones de ARNr
y ARNt
(http://www.gen.emory.edu/cgi-bin/MITOMAP/bin/tb19gen.pl),
resulta evidente que la mutación en la posición 5837 no se había
informado previamente. Esta mutación está en una frecuencia
relativamente baja en las muestras analizadas y está presente en
casos y en controles, por consiguiente no parece tener importancia
para la
DD.
DD.
Se encontró una deleción de 9 pb desconocida en
la posición 8260-8277, que se encuentra en el ARNt
(K) en un caso y en un control. Es interesante destacar que se
había informado previamente una deleción de 9 pb en las posiciones
8271-8281
(http://www.gen.emory.edu/cgi-bin/MITOMAP/bin/tb110gen.pl);
sin embargo, esta deleción informada no está exactamente en la
misma localización pero se superpone con la que encontraron los
inventores. Existe una mutación publicada dentro de esta región
(A7445G) asociada con queratoderma palmoplantar (PPK). PPK afecta
las palmas y las plantas y se supone que es un trastorno genético
heterogéneo de la piel.
\vskip1.000000\baselineskip
Complejo I: (Cebador
7,8,13,14,15,16)
Se encontró un patrón sorprendente de DHPLC en
la región ND2 en el 94% de los casos que solo estaba presente en
45% de los controles. También se encontraron dos mutaciones nuevas
en las posiciones A4916G y G5045A en dos casos que también estaban
presentes en la región ND2.
La NADH-quinona oxidorreductasa
(complejo I) es uno de los tres complejos enzimáticos transductores
de energía de la cadena respiratoria en la mitocondria. Es el punto
de entrada para la principal fracción de electrones que atraviesan
la cadena respiratoria y dan lugar eventualmente a la reducción del
oxígeno. Se presume que el Complejo I es uno de los sistemas
enzimáticos unidos a membrana más intrincados, que se conocen hasta
la fecha, está compuesto por al menos 43 polipéptidos distintos. De
éstos, 7 están codificados por el ADNmt
Se encontró un mutante del sito de restricción
AluI en la posición 14015 en un control. Esta es una mutación
conocida en la región ND5. Se encontró también otra mutación puntual
A13220C en una muestra de control en ND5. Ninguna de las mutaciones
en la región ND 5 estaban en la población afectada, por consiguiente
se presume que no son importantes para enfermedades.
En la región ND6 se identificaron tres
mutaciones diferentes, que estaban presentes en las muestras de
control solamente. Se encontró un mutante conocido del sito de
restricción AluI en la posición 14303 y un mutante nuevo del sitio
de restricción Ddel en 14433 en otra muestra de control. Se
identificó una única mutación de pares de bases en la posición
A14586G en una muestra de control. Como no se presentaron mutaciones
en las muestras afectadas, se presume que la región ND6 no está
relacionada con DD.
Un gran número de enfermedades humanas
mitocondriales involucran defectos estructurales y funcionales a
nivel del complejo I de enzimas. Una diversidad de enfermedades
neuromusculares, incluidas la epilepsia mioclónica y las fibras
rojas rasgadas (MERRF); la encefalopatía mitocondrial, acidosis
láctica y episodios análogos al ictus (MELAS); Oftalmoplejía
Externa Crónica Plus (CEOP); síndrome de
Kearns-Sayre (KSS); y casos de neuropatía óptica
hereditaria de Leber (LHON) parecen estar asociadas con un defecto
en el complejo I. El defecto identificado en la mayoría de tales
casos es una mutación puntual en el ADNmt.
\newpage
Complejo
II
Este complejo está codificado por ADN nuclear y
por consiguiente no se explora como parte de la selección del ADNmt
total.
\vskip1.000000\baselineskip
Complejo III: Cytb (Cebadores
P17,18)
Se identificaron múltiples mutaciones nuevas en
dos casos que mostraron un patrón de DHPLC muy similar. Estos
cambios de secuencia no estaban presentes en ninguno de los
controles. La mayoría de los cambios encontrados por secuenciación
revelaron la presencia nueva de heteroplasmia que incluyó G15274C/G:
A15282C/A; G15319C/G: T15332C/T; G15336G/C; T15339T/C; T15362C/T y
15434insC. Todos estos cambios estaban en la región Cytb. También
se identificó un mutante conocido del sitio de restricción en un
caso y en dos controles en la posición Mbol 14869. Aunque las
múltiples mutaciones heteroplásmicas identificadas en los casos
están presentes con una frecuencia baja, están ausentes en los
controles y pueden por consiguiente tener cierta importancia para la
enfermedad. La presencia de los mutantes de restricción no es
específica de enfermedad ya que es más frecuente en la población de
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Complejo
IV
Se encontraron cambios prominentes en el patrón
de DHPLC en las muestras dentro de 6688 y 6849 de la región COI.
Todos los casos tenían el patrón de pico único de tipo salvaje,
mientras que sólo el 27% de las muestras de control tenían un
patrón similar. Resulta sorprendente que la secuenciación no halla
dado una sustitución evidente de pares de base dentro de esta
región. Una hipótesis sería que la mutación está en un nivel muy
bajo para identificarla por secuenciación.
Se confirmaron dos mutaciones de restricción por
secuenciación localizadas en la región COII. La mutación de
restricción en la posición 8250 está presente en un caso y en un
control solamente. Existe una mutación de restricción única en la
posición 7980 en un caso. La frecuencia y distribución de las
mutaciones en esta región no son suficientes para estar asociadas a
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Complejo
V
Se identificó un cambio en el patrón de DHPLC en
un caso y en dos controles en la posición G8696A que se confirmó
por secuenciación. Este se localizó en la región ATPasa 6 del genoma
mitocondrial. Existe una mutación de enfermedad conocida NARP
(debilidad neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa) (T8993G) en
esta región. Se asume que la mutación hallada no está relacionada
con DD por su baja prevalencia entre los casos.
Se han relacionado una gran diversidad de
afecciones a las mutaciones en los genes mitocondriales. Algunos de
estos genes están localizados en el ADN nuclear (ADNn) o en el
ADNmt. Los patrones de herencia de trastornos mitocondriales pueden
también variar de materno, mendeliano y una combinación de los dos.
Sólo se ha investigado el ADNmt en linajes heredados por vía
materna para la presencia de mutaciones relacionadas con los casos y
controles de este ensayo. La identificación de polimorfismos nuevos
en la región de ARNr16s que está presente en más del 90% de los
casos y ausente en los controles es un hallazgo importante. Es
posible que esta mutación sea patogénica y pueda causar un defecto
en la fosforilación oxidativa al interferir con la síntesis
mitocondrial de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica original para la identificación de
mutaciones en el genoma mitocondrial usando una técnica DHPLC
múltiplex (Van den Bosch y col. 2000) enfocó el tema de detección de
mutaciones desde un punto de vista diagnóstico; para explorar unas
pocas muestras de manera que sea insignificante la posibilidad de
perder cualquier mutación de diagnóstico. Aunque este es el
resultado ideal para cualquier proyecto de detección de mutaciones,
no siempre resulta realista este ideal de hallar todas las
mutaciones cuando se explora un gran área genómica con múltiples
muestras. Sin embargo, la DHPLC es el mejor enfoque para llevar a
cabo tales proyectos de exploración ya que necesita muy poco
compromiso para el tamaño de muestra, por la automatización de los
instrumentos, o para la precisión, por su capacidad para encontrar
mutaciones de una manera independiente de la posición. Las
publicaciones de análisis cegados asignan repetidas veces una
eficacia de 95-100% en el hallazgo de mutaciones por
medio del uso de DHPLC. Resulta importante destacar también que con
respecto a la detección de la presencia de mutaciones
heteroplásmicas, también se ha informado su capacidad para detectar
la presencia incluso de cantidades pequeñas de heterodúplex que
indican una mutación.
La detección de mutaciones por DHPLC es
dependiente de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
amplificar el ADN genómico humano para análisis. Al igual que todas
las enzimas, las Taq ADN polimerasas tiene una tasa de error
inherente de aproximadamente 8,0 x 10^{-6} hasta 2 x 10^{-4}.
Estos errores de incorporación por la Taq polimerasa se dejan sin
corrección y se copian a continuación en ciclos posteriores de
amplificación. Como alternativa, las enzimas polimerasa de
corrección (Pfu y Pwo) tienen una tasa de error más baja de
aproximadamente 1,3 x 10^{-6}. Cada error introducido en la
amplificación puede considerarse equivalente a una mutación
aleatoria de bajo nivel. Entre los sistemas normales de detección de
mutaciones estos errores, aunque se replican en futuros ciclos de
amplificación por PCR, estarán a un nivel considerablemente más bajo
que una mutación heterocigota verdadera. Por esta razón la
fidelidad de la enzima de PCR puede no ser un tema principal para
la detección rutinaria de mutaciones excepto en casos extremos de
nivel bajo de molde y condiciones de ciclos de PCR excesivas. Sin
embargo, cuando se detectan mutaciones en poblaciones de ADN donde
no hay una proporción igual de alelos de tipo salvaje y mutantes
(muestra de tumores o detección mitocondrial, por ejemplo) la
fidelidad de la enzima desempeñará una función importante. En casos
extremos los niveles de mutación y errores por incorporaciones
erróneas por la enzima de PCR pueden ser comparables.
Los errores de incorporación por la enzima Taq
pueden verse en un cromatograma de DHPLC, a la temperatura de
análisis del fragmento, como una meseta característica del pico
principal. La DHPLC distingue las mutaciones como cambios con
respecto a un patrón de referencia, una señal de mutación positiva
no siempre es un patrón de pico definido. Estos últimos dos hechos
tomados en conjunto pueden significar que pueden presentarse cambios
muy pequeños en el patrón que podrían enmascarar los picos de
incorporaciones erróneas que preceden al pico de referencia. Por
esta razón, en particular cuando se explora el genoma mitocondrial,
se ha elegido usar una polimerasa de corrección nueva (ADN
polimerasa Optimase^{TM}, Transgenomic Inc. NE, EEUU) que ha
mostrado tener el nivel más bajo de incorporaciones erróneas en
comparación con otras polimerasas de corrección y basadas en Taq
comercialmente disponibles. La Figura Y5 ilustra esta comparación
calculando el porcentaje de heterodúplex formados usando una serie
de enzimas comercialmente disponibles.
Como un sustrato para la amplificación por PCR,
se ha aislado ADN genómico de la sangre de 40 muestras de casos y
controles de edades y sexos coincidentes. La obtención de las
muestras de sangre es relativamente no invasiva en comparación con
la disección de tejidos y además pueden obtenerse cantidades
razonables de material. Es importante destacar sin embargo con
respecto a los síndromes mitocondriales que puede haber expresión
específica de tejido en relación con enfermedades relacionadas con
mitocondrias. Es por consiguiente posible que puedan no encontrarse
en sangre los niveles más altos de mutaciones. Sin embargo,
definitivamente las mutaciones patogénicas de ADNmt son
probablemente heteroplásmicas y por esta razón no se necesitó
mezclar las muestras con una muestra de referencia (de tipo
salvaje) para asegurar la presencia de una afección heterocigota y
de esta manera la detección de mutaciones. Además sería imposible
encontrar un tipo salvaje verdadero por definición de la tasa de
mutación relativamente elevada dentro del genoma mitocondrial si
fuese necesario.
Se eligió amplificar el genoma mitocondrial con
un total de 18 fragmentos superpuestos usando la polimerasa
Optimase. Cuatro de estos fragmentos se diseñaron para someterlos a
DHPLC "normal" con una variación de tamaños desde 331 hasta
550 pb. En particular, tres de estos fragmentos se extienden en la
región hipervariable; al dividir estos en reacciones de PCR
individuales hará más fácil este enfoque de reconocimiento y
verificación con DHPLC. Las restantes catorce reacciones de PCR que
cubren el resto de la región codificadora del genoma se someten a
digestión de restricción con una combinación de 5 enzimas de
restricción para producir combinaciones de fragmentos de DHPLC
múltiplex que se analizan a un intervalo de temperaturas. El genoma
mitocondrial tiene una composición de GC relativamente constante
que hace que el intervalo de temperaturas necesarias para tal
exploración por DHPLC sea menor que el sería normalmente necesario
para otros genomas. Podría decirse también que la exactitud de la
DHPLC para localizar mutaciones puede atribuirse principalmente a su
capacidad para encontrar mutaciones en un intervalo de
temperaturas. En la técnica original es importante la elección de
exploraciones repetidas en intervalos de un grado. Los inventores
creen que este nivel de exploración es muy conservador y puede ser
aceptable para un enfoque de diagnóstico donde resulta crítica la
certeza con respecto al diagnóstico del paciente. La capacidad para
detectar mutaciones con intervalos de al menos 2-3ºC
o con ventanas de temperaturas significativamente mayores en
combinación con el rediseño de la serie de cebadores permite
achicar la elección de temperaturas desde 65 análisis diferentes
hasta 29 condiciones para explorar todos los fragmentos del genoma
mitocondrial.
El criterio fundamental a considerar cuando se
utiliza DHPLC para la detección de mutaciones es estar seguro al
llamar a las mutaciones como cambios definidos en el patrón. Se ha
mostrado que se alcanzan las mayores eficacias para encontrar
mutaciones cuando ésta llamada de cambio de patrón se realiza en su
nivel más simple. Es importante destacar que incluso pequeños
cambios en la forma del pico pueden estar correlacionados con la
presencia de una mutación. No resulta estrictamente posible en un
contexto de exploración localizar un cambio de patrón con una base
de ADN particular o un cambio de posición ya que los patrones
obtenidos han mostrado ser dependientes del cambio de bases, del
contexto de secuencia local y total de los fragmentos. Esto podría
argumentarse es aún más crítico con respecto a la localización de
mutaciones en poblaciones mitocondriales por los razonamientos
anteriormente discutidos. Una dificultad añadida es la verificación
de la mutación que normalmente se produce por secuenciación. La
secuenciación considerará cada posición de base y llamará la base
que predomina en esa posición como la secuencia de lectura correcta.
Si "ve" dos bases en cualquier posición puede llamar a la base
como N; y el control posterior del electroforetograma determinará a
continuación la naturaleza heterocigota de esa posición.
Desafortunadamente cuando las bases en una posición no tienen igual
magnitud pueden no significar N. Se ha mostrado que la secuenciación
tiene dificultades para reconocer heterocigocidad en un nivel menor
al 30%. Con respecto a esta investigación sin embargo, los
inventores tienen una situación donde podrán detectar mutaciones en
un nivel extremadamente bajo pero tendrán dificultades para
verificar por secuenciación. Hasta un punto, esto ha sido sorteado
por el control individual de las lecturas de secuencias para
detectar heteroplasmia; siendo prueba de esto la identificación de
la mutación heteroplásmica en el cebador 6. En casos extremos otras
publicaciones han mostrado que ha sido necesario clonar el ADN
potencialmente mutante y posteriormente secuenciar grandes
cantidades de clones individuales para verificar potenciales
mutantes. Una estrategia alternativa sería recoger la porción de
heterodúplex del ADN mutante enriqueciendo de esta manera la
población de secuenciación para el alelo mutante con la esperanza de
que el nivel fuera tal que permitiera obtener la llamada correcta
de secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cree que hay cuatro criterios principales que
avalan el papel deletéreo de una nueva mutación. En primer lugar,
la mutación no debe ser un polimorfismo neutral; en segundo lugar el
cambio de bases debe afectar una región conservada durante la
evolución y funcionalmente importante; en tercer lugar las
mutaciones deletéreas son usualmente heteroplásmicas y en cuarto
lugar el grado de heteroplasmia en los miembros de diferentes
familias tiene que estar de acuerdo con la gravedad de los
síntomas.
Con respecto al primer criterio, se ha
controlado a través de las bases de datos de mitocondrias existentes
y no se ha podido localizar la mutación G2389G/T. Los inventores
creen por consiguiente que representa un polimorfismo nuevo. Aunque
la relación con DD es clara, los inventores no están seguros de la
importancia funcional de este polimorfismo funcional. Una
investigación bioinformática está aún en proceso para determinar su
importancia funcional y evolutiva. Este polimorfismo particular es
heteroplásmico y está ausente en toda la población de control. No
se ha determinado el grado de heteroplasmia dentro de los linajes
familiares usados en este estudio, sin embargo, el examen clínico
de los miembros afectados de algunos de los linajes usados
demuestra una diversidad de expresión fenotípica en
DD.
DD.
Las mutaciones mitocondriales que dan lugar a
deterioro funcional en la cadena respiratoria son patogénicas. Sin
embargo, la relación de genotipo y fenotipo en el ADNmt y los
trastornos afectados son difíciles de entender. No resulta claro
porqué los defectos en la ruta metabólica que dan lugar a crisis de
energía pueden presentarse con tal variedad de síntomas y
diversidad de tejidos y órganos. La misma mutación de ADNmt puede
producir fenotipos muy diferentes y mutaciones diferentes pueden
producir fenotipos similares. Esto puede ser por las relaciones
variables entre tipo salvaje y mutante de ADNmt, al efecto de
modulación de otros genes mitocondriales y nucleares y a los
diferentes umbrales de expresión bioquímica para el tejido y la
mutación particular involucrada.
La acumulación de cambios de bases en el ADNmt
se produce durante una escala de tiempo corta para generar
polimorfismos dentro de poblaciones de la misma base étnica, tal
como caucásicos. Hay polimorfismos de ADNmt distintivos de
diferentes poblaciones de seres humanos y existe la presencia de
polimorfismos heteroplásmicos dentro de un individuo. Sin embargo,
la mayoría de los individuos son homoplásmicos, lo que según se
presume surge de un grave cuello de botella en el desarrollo del
oocito.
Se ha propuesto que los ADNmt con mutaciones
sustanciales se replican más rápidamente y por consiguiente tienen
una ventaja selectiva sobre los ADNmt normales. Esto puede explicar
la observación de que se hallan encontrado elevadas proporciones de
ADNmt mutado en tejidos específicos tales como el músculo en
comparación con otros tejidos como el hígado con una menor
proporción de mutaciones. Se presume que el porcentaje de ADNmt
mutado aumenta con la edad en el músculo. Si el número total de
fibras musculares no cambia de manera apreciable después del
nacimiento, la replicación del ADNmt está disociada de la división
celular y hay una selección positiva para la células defectuosas
con ADNmt mutado. Se cree que la variación en la edad de inicio de
se debe al porcentaje de ADNmt presente en el nacimiento y después
del nacimiento, es la tasa de acumulación de ADNmt mutado comparado
con los ADNmt normales.
Una serie de estudios interesantes han
proporcionado evidencias para futuros tratamientos de enfermedades
mitocondriales. Los PNA son ácidos nucleicos peptídicos específicos
de secuencia que han mostrado unión selectiva al ADNmt e inhibición
de la replicación del ADNmt. Estos agentes pueden reducir el
porcentaje del ADNmt mutante hasta un nivel inferior al umbral en
la célula y como resultado pueden llevar a la corrección del defecto
bioquímico mitocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una técnica mejorada de Cromatografía
Líquida de Alto Rendimiento Desnaturalizante (DHPLC) múltiplex para
seleccionar el genoma mitocondrial completo en veinte casos de
enfermedad de Dupuytren con un patrón de herencia transmitido por
vía materna y veinte controles coincidentes caucásicos.
Usando este enfoque se confirmó un número de
mutaciones conocidas y lo que es más importante se identificaron
varias mutaciones desconocidas. Una proporción de estas mutaciones
nuevas estaban en la región del bucle D y en el complejo I, III y V
solo en los casos de DD.
Lo más interesante, resultó claramente evidente
una mutación heteroplásmica desconocida en la posición 2839 pb que
era un cambio de pares de bases G a G/T en la región de ARNr16s en
aproximadamente 90% de los casos de DD y que estaba ausente en
todos los controles. Esta mutación puede afectar la síntesis
mitocondrial de proteínas de una manera específica de tejido.
La técnica de DHPLC usada en la invención es un
procedimiento sólido y preciso para predecir mutaciones
mitocondriales y los inventores pudieron identificar mutaciones
previamente conocidas y algunas mutaciones nuevas relacionadas con
enfermedad. Entender la base genética detallada de la enfermedad de
Dupuytren es fundamental para proporcionar consejo de diagnóstico y
pronóstico futuro a los pacientes y para desarrollar regímenes
terapéuticos nuevos para el tratamiento de esta afección. Este es
el primer informe de un estudio de DD y mutaciones mitocondriales
usando DHPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Habiendo establecido una correlación entre una
afección caracterizada por fibrosis o cicatrización inadecuadas y
un genotipo conferido por el polimorfismo de ADNmt 2839, se repitió
el procedimiento del Ejemplo 1 para seleccionar sujetos según el
procedimiento del primer aspecto de la invención para establecer el
genotipo del sujeto.
Un médico clínico puede usar los resultados del
análisis genético a continuación para proporcionar consejo médico a
individuos que tienen la mutación. Por ejemplo, los individuos
asintomáticos en los que se descubre el alelo mutante puede recibir
consejo sobre su riesgo aumentado de desarrollar una afección
caracterizada por fibrosis o cicatrización inadecuadas. Si es
adecuado, puede aconsejarse a tales individuos a realizar cambios
en el estilo de vida y/o recibir tratamiento profiláctico. Puede
aconsejarse a los individuos que tienen la mutación 2839, que ya
están sufriendo la afección caracterizada por fibrosis o
cicatrización inadecuadas, que ajusten su medicación o hábitos ya
que están potencialmente en riesgo de desarrollar una forma más
grave de la afección.
Claims (15)
1. Un procedimiento in vitro para
diagnosticar o detectar una predisposición para una afección al
menos parcialmente caracterizada por fibrosis o
cicatrización inadecuadas, comprendiendo el procedimiento examinar
el gen de ARNr16s del genoma mitocondrial de un sujeto de interés
para detectar la presencia de un polimorfismo genético o mutación
ligada al desarrollo de la afección.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en
el que se examina una región alrededor de la posición 2839 del
genoma mitocondrial para detectar la presencia de un polimorfismo o
una mutación.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2 en
el que se examina una inserción de un nucleótido timidina (T)
después del nucleótido guanosina (G) (G2839G/T) en la posición 2839
del genoma mitocondrial.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que la afección es la
enfermedad de Dupuytren.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que la afección es un
queloide o cicatriz hipertrófica.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que la afección es una
cualquiera de esclerodermia; esclerosis sistémica; síndrome de
Crest; esclerosis tuberosa con manchas en la piel; colagenoma
cutáneo familiar; trastornos metabólicos e inmunológicos de la piel;
facsitis eosinofílica; lupus eritematoso discoide; dermatomiositis;
enfermedad mixta del tejido conectivo; fibrosis cutánea inducida por
fármacos; fibrosis submucosa oral; fibrosis inducida tras
exposiciones alimentarias y medioambientales; fibrosis
pulmonar/cardíaca; cirrosis/fibrosis hepática; fibrosis renal;
fibrosis inducida por fármacos; fibrosis del sistema nervioso
central y periférico; fibrosis del sistema vascular; fibrosis del
tracto genitourinario masculino y femenino; y fibrosis
ginecológicas.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que la afección es una
cualquiera de cirrosis hepática, fibrosis hepática,
glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística,
esclerodermia, fibrosis miocárdica, fibrosis tras el infarto de
miocardio, y fibrosis del sistema nervioso central tras un ictus o
trastornos neurodegenerativos.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el ADN mitocondrial se aísla
de muestras de sangre o tejidos tomados del sujeto y a continuación
se examina para detectar la presencia de un polimorfismo genético o
mutación ligada al desarrollo de la afección.
9. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el ADN mitocondrial se
amplifica antes de examinarlo para detectar la presencia de un
polimorfismo genético o mutación.
10. El procedimiento según la reivindicación 9
en el que el ADN mitocondrial se amplifica usando la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR).
11. El procedimiento según la reivindicación 10
en el que se usa un par de cebadores de PCR de SEC ID Nº 9 y 10 o
un par de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12 para amplificar el ADN
mitocondrial.
12. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el genoma mitocondrial se
examina por digestión de restricción y análisis de tamaño.
13. Un kit, para uso en el procedimiento según
una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que
comprende:
A) Cebadores de PCR para amplificar
polimorfismos genéticos o mutaciones en el gen de ARNr16s
mitocondrial que están ligados a una afección caracterizada
por cicatrización o fibrosis inadecuadas;
B) Muestras de ADN de control de genotipo
conocido para cada polimorfismo o mutación, y
C) Una ficha de datos que perfile el nexo
existente entre un polimorfismo particular y una afección al menos
parcialmente caracterizada por cicatrización o fibrosis
inadecuadas.
14. El kit según la reivindicación 13 en el que
los cebadores de PCR son como se definió en la reivindicación
11.
15. El kit según las reivindicaciones 13 o 14 en
el que el kit comprende además una enzima de restricción adecuada
para generar fragmentos de ADN.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0209812 | 2002-04-30 | ||
| GBGB0209812.7A GB0209812D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | Genetic testing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2310239T3 true ES2310239T3 (es) | 2009-01-01 |
Family
ID=9935744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03718946T Expired - Lifetime ES2310239T3 (es) | 2002-04-30 | 2003-04-23 | Polimorfismos mitocondriales ligados a una predisposicion para el desarrollo de cicatrizacion o fibrosis inadecuadas. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050239071A1 (es) |
| EP (1) | EP1520039B1 (es) |
| JP (1) | JP4384025B2 (es) |
| AT (1) | ATE404696T1 (es) |
| AU (1) | AU2003222980B2 (es) |
| CA (1) | CA2482812A1 (es) |
| DE (1) | DE60322901D1 (es) |
| DK (1) | DK1520039T3 (es) |
| ES (1) | ES2310239T3 (es) |
| GB (1) | GB0209812D0 (es) |
| HK (1) | HK1070109A1 (es) |
| WO (1) | WO2003093506A2 (es) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9928508B2 (en) | 2000-08-04 | 2018-03-27 | Intellectual Ventures I Llc | Single sign-on for access to a central data repository |
| US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| JP2006516193A (ja) | 2002-12-06 | 2006-06-29 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法 |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8394945B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-03-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| EP2423326B1 (en) * | 2004-05-07 | 2014-01-08 | Celera Corporation | Genetic polymorphism associated with liver fibrosis methods of detection and uses thereof |
| EP1766659A4 (en) | 2004-05-24 | 2009-09-30 | Ibis Biosciences Inc | MASS SPECTROMETRY WITH SELECTIVE ION FILTRATION THROUGH DIGITAL THRESHOLD COMPARISON |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
| WO2006094238A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| WO2007014045A2 (en) | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
| WO2007118222A2 (en) | 2006-04-06 | 2007-10-18 | Ibis Biosciences, INC | Compositions for the use in identification of fungi |
| CA2663029C (en) | 2006-09-14 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| JP5680304B2 (ja) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 迅速な法医学的ｄｎａ分析法 |
| US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| WO2010033599A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
| WO2010104798A1 (en) | 2009-03-08 | 2010-09-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection methods |
| US9393564B2 (en) | 2009-03-30 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection systems, devices, and methods |
| US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
| US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
| EP3098325A1 (en) | 2009-08-06 | 2016-11-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection |
| EP3225695A1 (en) | 2009-10-15 | 2017-10-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| WO2011115840A2 (en) | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Parasite detection via endosymbiont detection |
| FI20100211A0 (fi) * | 2010-05-19 | 2010-05-19 | Mas Metabolic Analytical Servi | Menetelmä ateroskleroosialttiuden geneettiseksi diagnosoimiseksi |
| CN103981255B (zh) * | 2014-04-01 | 2016-06-01 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒 |
| KR101651817B1 (ko) * | 2015-10-28 | 2016-08-29 | 대한민국 | Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트 |
| KR102026138B1 (ko) * | 2017-08-02 | 2019-09-27 | 충남대학교산학협력단 | Crif1 억제제를 함유하는 켈로이드 및 비후성 반흔 형성 억제 또는 치료용 조성물 |
| CN110221011A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-09-10 | 南京鼓楼医院 | 系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4273869A (en) * | 1979-04-16 | 1981-06-16 | The Regents Of The University Of Minnesota | Cystic fibrosis detection method |
| SU1731489A1 (ru) * | 1986-09-25 | 1992-05-07 | Институт электроники им.У.А.Арифова | Устройство дл электроэрозионной прошивки отверстий |
-
2002
- 2002-04-30 GB GBGB0209812.7A patent/GB0209812D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-04-23 US US10/512,454 patent/US20050239071A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-23 DE DE60322901T patent/DE60322901D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-23 EP EP03718946A patent/EP1520039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-23 DK DK03718946T patent/DK1520039T3/da active
- 2003-04-23 JP JP2004501642A patent/JP4384025B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-23 WO PCT/GB2003/001717 patent/WO2003093506A2/en active IP Right Grant
- 2003-04-23 CA CA002482812A patent/CA2482812A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-23 AT AT03718946T patent/ATE404696T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-04-23 AU AU2003222980A patent/AU2003222980B2/en not_active Ceased
- 2003-04-23 ES ES03718946T patent/ES2310239T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-04-21 HK HK05103423A patent/HK1070109A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003222980A1 (en) | 2003-11-17 |
| JP4384025B2 (ja) | 2009-12-16 |
| HK1070109A1 (en) | 2005-06-10 |
| ATE404696T1 (de) | 2008-08-15 |
| CA2482812A1 (en) | 2003-11-13 |
| DE60322901D1 (de) | 2008-09-25 |
| AU2003222980B2 (en) | 2008-03-06 |
| JP2005529592A (ja) | 2005-10-06 |
| WO2003093506A2 (en) | 2003-11-13 |
| GB0209812D0 (en) | 2002-06-05 |
| EP1520039A2 (en) | 2005-04-06 |
| DK1520039T3 (da) | 2008-11-17 |
| EP1520039B1 (en) | 2008-08-13 |
| WO2003093506A3 (en) | 2004-03-11 |
| US20050239071A1 (en) | 2005-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2310239T3 (es) | Polimorfismos mitocondriales ligados a una predisposicion para el desarrollo de cicatrizacion o fibrosis inadecuadas. | |
| Martin-Merida et al. | Toward the mutational landscape of autosomal dominant retinitis pigmentosa: a comprehensive analysis of 258 Spanish families | |
| Hansen et al. | Genetic heterogeneity in microcornea-cataract: five novel mutations in CRYAA, CRYGD, and GJA8 | |
| Wissinger et al. | Cone dystrophy with supernormal rod response is strictly associated with mutations in KCNV2 | |
| Chen et al. | The Smith‐Magenis syndrome [del (17) p11. 2]: Clinical review and molecular advances | |
| Martin-Merida et al. | Analysis of the PRPF31 gene in Spanish autosomal dominant retinitis pigmentosa patients: a novel genomic rearrangement | |
| Avila-Fernandez et al. | CERKL mutations and associated phenotypes in seven Spanish families with autosomal recessive retinitis pigmentosa | |
| Kljuic et al. | A nonsense mutation in the desmoglein 1 gene underlies striate keratoderma | |
| Nishino et al. | A Novel Mutation in the Mitochondrial tRNAThrGene Associated with a Mitochondrial Encephalomyopathy | |
| Patrono et al. | Missense and splice site mutations in SPG4 suggest loss-of-function in dominant spastic paraplegia | |
| Danciger et al. | CORD9 a new locus for arCRD: mapping to 8p11, estimation of frequency, evaluation of a candidate gene | |
| AU2009200195A1 (en) | Organic anion transport polypeptide related protein-4 (OATPRP4) gene in | |
| ES2269651T3 (es) | Polimorfismos en el gen zf9 ligados a una predisposicion para el desarrollo de una inapropiada formacion de tejido cicatrizal o fibrosis. | |
| Younger | Childhood muscular dystrophies | |
| JP4776841B2 (ja) | 脈管形成分野におけるＫｒｉｔ１遺伝子の使用 | |
| Croaker | Clinical and molecular biological studies in Hirschsprung's disease | |
| AU2002236024A1 (en) | Polymorphisms in the ZF9 gene linked to a predisposition for the development of inappropriate scarring of fibrosis | |
| Meyer | Detection, interpretation, and functional consequences of genomic copy number variation in human disease | |
| McMullan | The genetics of congenital isolated ptosis | |
| Baniaga | Pathogenic copy number variants (pCnvs) in individuals diagnosed on the autism spectrum disorder (ASd): A closer look at candidate genes | |
| Yu-Wai-Mana et al. | Progress in Retinal and Eye Research | |
| Goliath | Towards identifying the ADRP gene in a large South African family with retinitis pigmentosa | |
| Lafrenière | Molecular and genetic studies of progressive myoclonus epilepsy type 1 (EPM1) | |
| BG104533A (bg) | Ген за психоматични разстройства | |
| KR20070115336A (ko) | 당뇨 망막증 진단 키트 |