JP2005529592A - 遺伝子検査 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)中枢神経系における、グリア性瘢痕形成は、ニューロン再接続を妨げる(たとえば、神経外科手術または脳の貫通性傷害後など)。
(ii)眼球内の瘢痕形成は、有害である。角膜では、瘢痕形成の結果として、異常な乳白度になり、視力に問題が生じるか、あるいは失明に至る可能性もある。網膜では、瘢痕形成は、ゆがみまたは網膜剥離を引き起こし、次いで失明に至る。緑内障における眼圧低下のための手術(たとえば、緑内障濾過手術)における創傷治癒後の瘢痕形成の結果として、水性体液を排出することができなくなり、緑内障が再発することにより、手術が失敗に終わることとなる。
(iii)心臓における瘢痕形成(たとえば、手術または心筋梗塞後など)は、異常な心臓機能を引き起こし得る。
(iv)腹部および骨盤などに関わる手術は、内臓間の癒着に至ることがしばしばある。たとえば、胃腸と体壁の要素間の癒着は、腸ループにねじれを形成し、虚血、壊疽を引き起こし、次いで、緊急処置が必要になる(処置しないと死に至る場合もある)。同様に、胃腸に対する外傷または切開は、瘢痕形成および瘢痕拘縮に至ることがあり、それによって、再度生命を脅かす胃腸の内腔の閉塞を引き起こす狭窄の生じる可能性もある。
(v)卵管の領域での骨盤における瘢痕形成は、不妊の原因となりうる。
(vi)筋肉への傷害後の瘢痕形成の結果として、異常な拘縮が生じ、それによって筋肉機能が損なわれ得る。
(vii)腱および靭帯の傷害後の瘢痕形成または線維症の結果として、機能の重篤な喪失に至る。
肺/心臓線維症;肝線維症/硬変;腎線維症;胃腸管線維症;薬物誘発線維症(たとえば、臓器移植後など);中枢および末梢神経系線維症;血管系(静脈および動脈)線維症;男性および女性尿生殖器線維症;婦人科系(卵管線維症、子宮線維症)。
本発明者らは、ミトコンドリアゲノムの16srRNA領域における突然変異が、本発明の方法に従う状態と一致することを発見した。
TTAGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAACTTTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACAACATACCCATGGCCAACCTCCTACTCCTCATTGTACCCATTCTAATCGCAATGGCATTCCTAATGCTTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACC(配列番号:1)。
ctcactgtcaacccaacacaggCATGCTCATAAGGAAAGGTTAAAAAAAGTAAAAGGAACTCGGCAAATCTTACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCTAGCATCACCAGTATTAGAGGCACCGCCTGCCCAGTGACACATGTTTAACGGCCGCGGTACCCTAACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTTCCTTAAATAGGGACCTGTATGAATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATAACACAGCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTTATTAATGCAAACAGTACCTAACAAACCCACAGGTCCTAAACTACCAAACCTGCATTAAAAATTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAGTACATGC(配列番号:2)
NADH−キノン酸化還元酵素(複合体I)は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖の3つのエネルギー伝達酵素複合体の1つである。それは、呼吸鎖を移動し最終的に酸素を還元する電子の大部分が入るポイントである。複合体Iは、現在知られる最も複雑な膜結合酵素の1つと推測され、少なくとも43の異なるポリペプチドにより構成される。これらのうち、7つはmtDNA(ND1、2、3、4、4L、5および6)によりコードされている。
ccctacgggctactacaacccTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTCACCATCGCTCTTCTACTATGAACCCCCCTCCCCATACCCAACCCCCTGGTCAACCTCAACCTAGG(配列番号:3)。
CCTCCTATTTATTCTAGCCACCTCTAGCCTAGCCGTTTACTCAATCCTCTGATCAGGGTGAGCATCAAACTCAAACTACGCCCTGATCGGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACAATCTCATATGAAGTCACCCTAGCCATCATTCTACTATCAACATTACTAATAAGTGGCTCCTTTAACCTCTCCACCCTTATCACAACACAAGAACACCTCTGATTACTCCTGCCATCATGACCCTTGG(配列番号:4)。
CCCCTTCGCCCTATTCTTCATAGCCGAATACACAAACATTATTATAATAAACACCCTCACCACTACAATCTTCCTAGGAACAACATATGACGCACTCTCCCCTGAACTCTACACAACATATTTTGTCACCAAGACCCTACTTCTAACCTCCCTGTTCTTATGAATTCGAACAGCATACCCCCGATTCCGCTACGACCAACTCATACACCTCCTATGAAAAAACTTCCTACCACTCACCCTAGCATTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAAGAAATATGTCTGATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGACTATGAGAATCGAACCCATCCCTGAGAATCCAAAATTCTCCGTGCCACCTATCACACCCCATCCTAAAGTAAggtcagctaaataagctatcggg(配列番号:5)。
CGGCCTGCTTCTTCTCACATGACAAAAACTAGCCCCCATCTCAATCATATACCAAATCTCTCCCTCACTAAACGTAAGCCTTCTCCTCACTCTCTCAATCTTATCCATCATAGCAGGCAGTTGAGGTGGATTAAACCAAACCCAGCTACGCAAAATCTTAGCATACTCCTCAATTACCCACATAGGATGAATAATAGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACATAACCATTCTTAATTTAACTATTTATATTATCCTAACTACTACCGCATTCCTACTACTCAACTTAAACTCCAGCACCACGACCCTACTACTATCTCGCACCTGAAACAAGCTAACATGACTAACACCCTTAATTCCATCCACCCTCCTCTCCCTAGGAGGCCTGCCCCCGCTAAC(配列番号:6)
acttcctaccactcaccctagcATTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAAGAAATATGTCTGATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGACTATGAGAATCGAACCCATCCCTGAGAATCCAAAATTCTCCGTGCCACCTATCACACCCCATCCTAAAGTAAGGTCAGCTAAATAAGCTATCGGGCCCATACCCCGAAAATGTTGGTTATACCCTTCCCGTACTAATTAATCCCCTGGCCCAACCCGTCATCTACTCTACCATCTTTGCAGGCACACTCATCACAGCGCTAAGCTCGCACTGATTTTTTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACATGCTAGCTTTTATTCCAGTTCTAACCAAAAAAATAAACCCTCGTTCCACAGAAGCTGCCATCAAGTATTTCCTCACGCAAGCAACCGCATCCATAATCCTTCTAATAGCTATCCTCTTCAACAATATACTCTC(配列番号:7)。
DD患者において、少なくとも2人の被験者間で非常によく似たDHPLCパターンを示す複数の新規な突然変異が発見された。これらの配列変化は、どの対照にも存在しなかった。配列決定により発見された変化の大部分は、ヘテロプラスミーが新たに存在することを明らかにし、それには以下のものが含まれた:G15274C/G;A15282C/A;G15319C/G;T15332C/T;G15336G/C;T15339T/C;T15362C/Tおよび15434insC。これら全ての変化は、シトクロムb領域におけるものであった。
DD患者由来の試料において、際だったDHPLCパターン変化が、そのゲノムの6688および6849の中(COI領域)に見られた。DD被験者は全て単一ピークのDHPLCパターンを示したが、一方対照試料では同様のパターンを示すのは27%に過ぎなかった。
CGGAAAAAAAGAACCATTTGGATACATAGGTATGGTCTGAGCTATGATATCAATTGGCTTCCTAGGGTTTATCGTGTGAGCACACCATATATTTACAGTAGGAATAGACGTAGACACACGAGCATATTTCACCTCCGCTACCATAATCATCGCTATCCCCA(配列番号:8)。
(1)対象の多型領域の直接配列決定(たとえば、Cy5TM Thermo Sequence dye terminator kit(Amersham Pharmacia Biotech)などの市販のキットを用いる);
(2)配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(Sequence Specific Oligonucleotide Hybridization:SSO)(多型領域を含む増幅DNA分子のドットまたはスロットブロッティング;各多型変異体に特異的であるように設計される標識プローブとのハイブリダイゼーション;および該標識の検出を含む);
(3)ヘテロ二本鎖および一本鎖コンホーメーション多型(Heteroduplex and single-stranded conformation polymorphism:SSCP)解析(多型領域を含む変性増幅DNA分子の電気泳動バンドパターンの解析を含む);
(4)配列特異的プライミング(Sequence Specific Priming:SSP)[増幅不応性突然変異システム(Amplification Refractory Mutation System:ARMS)ともいう];
(5)突然変異走査[たとえば、PASSPORTTM 突然変異走査キット(Amersham Pharmacia Biotech)などを用いる];
(6)ミスマッチの化学的切断解析;
(7)非同位体RNase切断アッセイ(Ambion Ltd.);
(8)酵素ミスマッチ切断アッセイ;および
(9)単一ヌクレオチド伸長アッセイ。
プライマーセット6 フォワードプライマー:5’ ctc act gtc aac cca aca cag g 3’ (配列番号:9)
プライマーセット6 リバースプライマー: 5’ tgt gtt gtg ata agg gtg gag ag 3’ (配列番号:10)
フォワードプライマー:5’ tgc att aaa aat ttc ggt tgg 3’ (配列番号:11)
(長さ 21bp;GC数 7;AT数 14;%GC 33%;Tm=48.81)
リバースプライマー:5’ tgt cct gat cca aca tcg ag 3’ (配列番号:12)
(長さ 20bp;GC数 10;AT数 10;%GC 50%;Tm 54.22)
(A)不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態に関連するミトコンドリアゲノムにおける遺伝子多型を増幅するためのPCRプライマー;および
(B)各多型のための既知の遺伝子型の対照DNA試料。
(C)mtDNA試料の断片を作成するための適当な制限酵素;
(D)特定の多型と疾患との間の関連の概要をまとめるデータカード;
(E)PCR増幅、PCR産物の制限酵素消化およびDNA断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコール;
(F)適切な緩衝液。
(i) ミトコンドリア遺伝子産物のインヒビター(阻害物質)またはアクチベーター(活性化物質)(例えば、アロステリックな、または競合的インヒビター);
(ii) ミトコンドリア遺伝子産物の合成を調節する化合物;
(iii) ミトコンドリア遺伝子産物の放出を調節する化合物;
(iv) ミトコンドリア遺伝子産物の不活化または代謝の速度を調節する化合物;
(v) ミトコンドリア遺伝子産物の発現および/または転写を調節する化合物(例えば、リボザイムまたはアンチセンスDNA分子);および
(vi) ミトコンドリア遺伝子産物に対する抗体またはイントラボディ(intrabody)。
デュピュイトラン病(DD)患者の群および対照群から試料を採取して、多型とその状態との間の一致を検討した。
発明者らは、Van Den Bosch らのDHPLC技術 (Nucleic Acids Res 2000 Oct 15; 28(20): E89) を改変し、DDに関連する可能性のある突然変異についてミトコンドリアゲノムを走査した。
発明者らは、Van Den Bosch らのDHPLC技術(前述)を改変し、大きな試料集団のミトコンドリアゲノム突然変異走査を手ごろな費用でより迅速に達成できるようにした。行った変更を表2に概説する。
Van Den Bosch らのDHPLC技術に施した改良は全て、以下の基準に留意して設計したプライマー設計に由来する:
1.DHPLC(非マルチプレックス)のためのミトコンドリアゲノムの超可変領域の個々の断片。
2.個々の主要コーデイング遺伝子の考慮。
3.突然変異を引き起こす既知の疾患の考慮。
ミトコンドリア集団のヘテロプラスミックな性質のため、突然変異検出技術は、大部分が野生型である集団において小さな突然変異の集団を発見するのに十分な感受性を有さなければならない。このことを考慮すると、この適用に重要な基準は、PCR増幅よる試料調製の忠実度が高いことである。全てのTaqDNAポリメラーゼ酵素は、それらの起源および使用方法に依存する固有の誤取り込みのレベルを有する。PCR増幅中のそれぞれの誤取り込みは、ランダムな低レベルのヘテロ二本鎖と同等であり、DHPLC技術により可視化することができる。それ故、これらの誤取り込みを可能な限り低いレベルに維持し、それにより成功の見込みを最大とすることが望ましい。我々は、非常に高レベルの忠実度を有することが示されている、新規なプルーフリーディングポリメラーゼ(オプティマーゼDNAポリメラーゼ(Optimase DNA polymerase)、Transgenomic Inc)に置き換えた。図3は、エクスパンドDNAポリメラーゼ(Expand DNA polymerase、Roche)と比較して、オプティマーゼポリメラーゼを用いてプライマーセット2について得られた野生型パターンを示す。オプティマーゼDNAポリメラーゼを使用して一部変性条件下に得られたシャープなピークパターンは、この酵素の忠実度の上昇を示す。
1.1.2(a) 試料収集
患者:母系遺伝を伴うデュピュイトラン病(DD)患者(n=20)が本研究に参加した。年齢は37から90歳の範囲であり、平均年齢は56.9歳であった。患者は全て、血縁関係のない英国イングランド北西地域出身のカフカス人であった。デュピュイトラン病患者はほとんど、北西地域にあるSouth Manchester University Hospital Trust and Wrightington Hospital の手術記録臨床コードにより同定された。完全な病歴は、各患者についてプロフォーマ(proforma)を用いて得た。各個人の両手両足を調べた。全ての患者が、掌および/または指に特徴的なデュピュイトラン小塊を有し、中手指節関節(MCPJ)または近位指間接(PIPJ)のいずれかの拘縮を伴っており、手術前にDDの確定診断を受けた。
標準的静脈切開技術を用いて、被験者から血液試料を収集した。全ての被験者から静脈血15mLを回収した。市販のDNA抽出キット(Qiagen, UK)を用いて、末梢血細胞よりDNAを抽出した。DNA濃度を測定し、滅菌 Qiagen バッファーを用いて、100ng/μl(バッファー)に希釈した。
ミトコンドリアゲノム全体を増幅するため、18のプライマーのセットを設計した。それらが増幅するミトコンドリア断片の詳細は、表3に示し、プライマー配列は表4に示す。
鋳型としてゲノムDNA約100ng、各dNTP200μM(Cruachem Ltd)、フォワードおよびリバースプライマー各30pmol、オプティマーゼDNAポリメラーゼ2.5ユニットおよび1.5mM MgSO4含有10xオプティマーゼ反応バッファー(Transgenomic Ltd)を含有する100μlの容量にて、PCR反応を行った。 MJ research Tetrad Thermal cycler を用いて、表5に概説するサイクル条件にて増幅を行った。少量(5μl)のPCR産物を、エチジウムブロマイドで染色して紫外線光の下で可視化した2%アガロースゲルにおいて検査した。
表3に示すように、様々なPCR断片を消化するため、制限酵素(Alu1、Dde1、HaeIII、Mbo1およびMsp1−New England Biolabs)を使用した。88.5μlのPCR産物を、適当な制限酵素バッファー10μlおよび制限酵素1.5μlと混合した。試料を37℃で2時間インキュベートし、ごく一部(10μl)を、エチジウムブロマイドで染色した2%アガロースゲルにおいて検査した。異常な制限パターンを含む試料が同定された。制限酵素消化パターンの変化によって創出されたこの断片サイズの変化は、予測したDHPLC解析温度を修正させ得るものであった。ミトコンドリアゲノムは比較的一定した組成を有すること、および制限酵素認識部位変異体はわずかしか同定されなかったことから、我々は解析温度を表3に示すものに変更しなかった。
DHPLC解析に先だって、全ての試料を、MJ Tetrad サーマルサイクリング装置を用いるヘテロ二本鎖形成ステップ(95oCで5分間加熱し、その後1分につき1.5℃の速度で25℃に到達するまで冷却することから構成される)にかけた。
WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System および DNASep Cartridge 技術(Transgenomic Inc, NE, USA)を使用して、表3に示す予測した温度(WAVEMAKERTM ソフトウェア−Transgenomic Inc, NE, USA)を用いて試料解析を行った。勾配移動相はバッファーA(0.1Mトリエチル酢酸アンモニウム、pH7.0)およびバッファーB(0.1Mトリエチル酢酸アンモニウム、pH7.0および25%アセトニトリル)より構成された。これらの溶出剤を混合し、バッファーBを12分間かけて45から67%の間で変化させる直線勾配を形成した。この適用に推奨されるカートリッジ洗浄方法を採用した;直線勾配の最後に75%アセトニトリルを用いて0.5分洗浄。通常1解析につき10−15μlの試料を注射した。
配列決定による突然変異の確認のためのPCRを、適当なプライマーセットを用いて前述のように実行した。エタノール沈殿の前に試料に ExoSapIT を処置した。Applied Biosystems 3100 Sequencer を用いて、製造元のプロトコールに従い、サイクルシークエンシングを行った。
1.2.1 超可変領域
3つのプライマーセット(MT1−3)は、ミトコンドリアゲノムの超可変領域(D−ループ)の大部分を増幅した。この領域は非コード領域であり、ミトコンドリアゲノムの15887から648bpに及ぶ。それは特徴的に非常に多型性である。
本プライマーセットは、15974−16409bpの領域を増幅し、436bpの断片を形成した。罹患および対照の試料の全体にわたり、複数かつ非特異的なDHPLCパターンバリエーションが検出された。これらのバリエーションは、多数のランダムな突然変異を表す。単一の優勢なパターンは、いずれの試料にも存在しなかった。このことは、明らかな疾患誘発突然変異が存在しないことを示した。これらの知見は、配列決定の結果と酷似していた(表6に要約)。DD11、CW1、CW4(WT)を代表的試料として配列決定した。
本プライマーセットは、16341−102bpの領域を増幅し、331bpの断片を形成した。
プライマーセット3は、29−480bpの領域を増幅し、452bpの断片を形成した。この452bpの断片からの結果は、プライマーセット1により得られたものと同様であった。DHPLCの結果は高度のパターン変動性を示し、本領域の高度な多型性が確認された。いずれの試料にも単一の優性なパターンは存在しないことから、このことは、明らかな疾患誘発突然変異が存在しないことを示した。配列決定のデータは表6にまとめる。
1.2.2(a) プライマー4
本プライマーセットは、368−1713bpの領域(648−1601bpにおいて12srRNAをコード)をカバーして1346bpの産物を形成し、その産物をMbo1により消化すると211、276、372および487bpの断片が形成された。プライマー設計は、ミトコンドリア領域を確実に完全にカバーするためある程度の重複を必要とし、従ってプライマー4のはじまりは、D−ループ領域の末端部分の300bpをカバーする。
本プライマーセットは、1650−2841bpの領域をカバーして1192bpの産物を形成し、その産物をHaeIIIにより消化すると273、394および525bpの断片が形成された。制限酵素認識部位変異体は観察されなかった。図6に示すように、DHPLC変異体が同定された。その溶解温度のため、変異体を含有する正確な断片を同定することが難しかったことから、断片2および3を配列決定した。DHPLCパターン変化の代表としてDD1、6およびCW3の3つの試料を、本領域の参考パターンとしてDD7を、配列決定した(図6)。配列決定した、試料DD1における1690の位置の突然変異は、CW19と同様のDHPLCパターンを有したことから、CW19はこの未知の突然変異を含むようである(表6および図7)。試料CW3における1811bpの位置の既知の突然変異(A>G)は、他の6つの試料とそのDHPLCパターンを共有する(CW4、10および12;DD6、12、20)。
本プライマーセットは、2415−3811bpの領域をカバーして1397bpの産物を形成し、その産物をDde1により消化すると125、210、278、342および442bpの断片が形成された。図9に示すように、DHPLC解析により、断片5において対照集団(CW)と罹患集団(DD)との間に大きな変化が示された。本断片に、主要なピークと肩を示す対照試料と比較して、DD試料にはよりはっきりとした2ピークパターンが存在した。DD3並びにDD11および対照としてCW3並びにCW5の4つの試料を、配列決定のための代表として配列決定した。
本プライマーセットは、3429−4428の領域をカバーして1000bpの産物を形成し、その産物をHaeIIIで消化すると109、179、242および470bpの断片が形成された。その試料に制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。図10に示すように、DHPLC解析により、興味深い可能性のある変化が、20の罹患試料のうち7つに示された。その変化は、断片2、3または4のどこかに位置するようである。全ての陽性試料(DD1、2、5、11、14、17、18)を、対照試料としてのCW1、9および15と共に、配列解析にかけた(突然変異について表6参照)。
本プライマーセットは、4180−5488bpの領域をカバーして1309bpの産物を形成し、その産物をMspIにより消化すると135、247、396および531bpの断片が形成された。本領域には、既知の既報の疾患突然変異は存在しない。解析した試料には、制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。DHPLC解析により、対照の47%に対して、患者の94%に、2ピークパターンを有する興味深い可能性のある変化が示された(図11)。3つの陽性試料(DD10、17および18)を、参考試料としてのCW2と共に、配列解析にかけた(表6参照)。
本プライマーセットは、5347−6382bpの領域をカバーして1036bpの産物形成し、その産物をHaeIIIで消化すると122、190、233および491bpの断片が形成された。本領域には、既知の疾患突然変異は存在しない。DD12、CW3およびCW10の3つの試料が、5836−5839bpの間でHaeIII切断部位を破壊する、同じ制限酵素認識部位突然変異を示した(既知)。本制限酵素認識部位突然変異およびDHPLC変異体の例(断片4に存在)は、図12に見ることが出来る。
本プライマーセットは、6318−7707の領域をカバーして1390bpの産物を形成し、その産物をMspIにより消化すると117、162、253、354および504bpの断片が形成された。断片2において、DD試料は100%が1ピークパターンを有するが、対照では27%のみが1ピークパターンを有する。そのDHPLCパターン変化を図13に示す。DD患者3人(DD1、12および20)および対照4人(CW1、3、5および7)の、7つの試料を配列決定した。しかしながら、配列決定により、プライマー10の断片2の配列には変化がないことが明らかとなった。
本プライマーセットは、7644−8784の領域をカバーして1141bp産物を形成し、その産物をHaeIIIにより消化すると141、181、212、243および364bpの断片が形成された。HaeIII部位を破壊する2つの既知の相異なる制限酵素認識部位突然変異が、我々の試料に見られた。
本プライマーセットは、8643−9458bpの領域をカバーして816bpの産物を形成し、その産物をDdeIにより消化すると187、239および390bpの断片が形成された。解析した試料に制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。
本プライマーセットは、9397−11387bpの領域をカバーして2001bpの産物を形成し、その産物をAlu1により消化すると248、312、366、487および588bpの断片が形成された。既知の疾患突然変異は存在しない。9643−9647bpのAlu1部位を破壊する2つの制限酵素認識部位変異体(既知)、DD17およびCW3、が同定された。
本プライマーセットは、11322−12582bpの領域をカバーして1531bpの産物を形成し、その産物をHaeIIIおよびMspIにより消化すると178、366、435および552bpの断片が形成された。LHON疾患(レーバー遺伝性視神経症)についての既知の突然変異(G11778A)が存在する。本領域に制限酵素認識部位変異体は存在しない。
本プライマーセットは、12753−13264bpの領域をカバーして512bpの産物を形成する。これは、59℃で制限酵素消化なしに解析される単純DHPLC断片であった。罹患および対照の集団の間で、DHPLCパターンに明らかな変化は存在しなかった。
本プライマーセットは、13172−14610bpの領域をカバーして1439bpの産物を形成し、その産物をAluIおよびDde1により消化すると129、177、289、382および462bpの断片が形成された。LHON疾患(レーバー遺伝性視神経症)についての2つの既知の疾患突然変異(A14495GおよびT14484C)が存在した。3つの制限酵素認識部位変異体が本領域に存在する。はじめの2つは、既知の突然変異である;第1のものはCW4に見られ、14014−14017のAlu1部位を破壊し、第2は14303−14306のAlu1部位に存在する。Dde1部位(14433−14437)を破壊する第3の制限酵素認識部位変異体は未知であり、試料CW6に見られ、それは試料CW19における異常なDHPLCパターンと共に図14に示される。
本プライマーセットは、14427−15590の領域をカバーして1164bpの産物を形成し、その産物をMboIにより消化すると191、235、297および441bpの断片が形成された。Mbo1部位(14868−14871)を破壊する制限酵素認識部位変異体が3つ、DD12、CW13およびCW20に同定された。DD8において同定された突然変異を表6に示す。
本プライマーセットは、15424−16451の領域をカバーして1028bpの産物を形成し、その産物をAluIにより消化すると218、353および457bpの断片が形成された。既知の突然変異は存在しないが、断片2(15424−15776)にAlu1部位を創出してこれを165および188bpの産物に分割する制限酵素認識部位変異体(AGCT)が3つ、DD17、CW9およびCW11に同定された。
1.3.1 突然変異
1.3.1(a) D−ループまたは超可変領域(プライマー1−4)
超可変部位がヒトmtDNAの非コード領域に存在することは、過去に十分に立証されている。超可変部位は、生殖細胞および体細胞突然変異が優先的にこの部位で起こることから、突然変異ホットスポットを表すと考えられている。本領域は、肺、膀胱および頭頚部癌における突然変異ホットスポットであることが発見された。本領域における突然変異は、mtDNAの複製および発現のための調節部位としてのD−ループの機能に関係する可能性がある。これら超可変部位をそのような突然変異ホットスポットとするそれら独自の特徴は、未だ知られていない。
プライマー4は、12srRNAを完全にカバーする。プライマー5は16srRNAの大部分をカバーし、16srRNAのはじめおよび終わりはプライマー4および6にそれぞれカバーされる。我々は、12srRNA領域には突然変異を発見しなかった。この領域は超可変領域のように突然変異ホットスポットではなく、突然変異の発生率がより低いという事実から見て、このことは驚くべき知見ではない。しかしながら、12srRNA領域には、以下を含む疾患突然変異が報告されている;SNHL(1095C)、DM(1310T,1438T)およびDEAF(1555G)。
我々は、5837bpにおけるHaeIII制限酵素認識部位が破壊された結果相異なる断片分布となる3つの試料(DD1人および対照2人)を発見した。切断配列はGGCCであった。この突然変異の位置は、ND2とCOIとの間のtRNAコード領域内に含まれる。マイトマップ(mitomap)データベース(http://www.gen.emory.edu/cgi-bin/MITOMAP/bin/tbl9gen.pl)においてミトコンドリアDNA塩基置換疾患をrRNAおよびtRNA突然変異について検索すると、5837の位置の突然変異はこれまでに報告されていないことがわかった。この突然変異は、我々の試料においては比較的頻度が低く、我々の患者および対照の両方に存在するので、これはDDとは関連がないようである。
複合体I:(プライマー7、8、13、14、15、16)
NADHデヒドロゲナーゼ(ユビキノン)鎖1−6 (ND1、2、3、4、4L、5および6)
我々は、94%の患者において、対照では45%にしか存在しない、目立ったDHPLCパターンをND2領域に発見した。我々はまた、2人の患者において、同じくND2領域に存在する2つの新規な突然変異をA4916GおよびG5045Aの位置に発見した。
本複合体は、核DNAによりコードされるので、mtDNA全体のスクリーニングの一部としては走査されない。
シトクロムb−c1複合体 ユビキノール−シトクロムcレダクターゼ シトクロムb−ミトコンドリア
我々は、2人の患者において、非常によく似たDHPLCパターンを示す複数の新規な突然変異を同定した。これらの配列変化は、我々の対照のいずれにも存在しなかった。配列決定によって発見された変化の大部分は、ヘテロプラスミーが新たに存在することを明らかにし、それには、G15274C/G;A15282C/A;G15319C/G;T15332C/T;G15336G/C;T15339T/C;T15362C/Tおよび15434insCが含まれた。これら変化は全て、Cytb領域におけるものであった。既知の制限酵素認識部位変異体もまた、1人の患者および2人の対照においてMboI 14869の位置に同定された。我々の患者において同定された複数の未知のヘテロプラスミックな突然変異は存在の頻度は低いものの、我々の対照には存在しないので、本疾患と何らかの関連を有する可能性がある。制限酵素認識部位変異体は対照集団においてより多く存在することから、その存在は疾患特異的ではない。
我々は、我々の試料において、COI領域の6688および6849に目立ったDHPLCパターン変化を発見した。全ての患者が野生型シングルピークパターンを有するのに対して、対照試料では27%のみが同様のパターンを有した。配列決定によってこの領域内に明らかな塩基対置換が見られなかったのは驚くべきことである。1つには、本突然変異が配列決定によって同定するにはレベルが低すぎることが考えられる。
1人の患者および2人の対照において、G8696Aの位置にDHPLCパターン変化が同定され、それは配列決定によって確認された。これは、ミトコンドリアゲノムのATPアーゼ6の領域に位置した。既知の疾患突然変異であるNARP(Neurogenic weakness, ataxia and retinitis pigmentosa)(T8993G)が、本領域に存在する。我々は、我々の発見した突然変異は患者間の普及率が低いことから、DDに関連しないと推測する。
マルチプレックスDHPLC技術(Van den Bosch ら、2000)を用いてミトコンドリアゲノムにおいて突然変異を同定する元の技術は、診断的見地から突然変異検出の問題を扱った;何らかの診断的突然変異を見逃す可能性は無視できる程度であろう方法で、少数の試料を走査する。これはどのような突然変異検出計画にとっても理想的な結果であるが、全ての突然変異を発見するというこの理想は、複数の試料について大きなゲノム領域を走査する場合必ずしも現実的ではない。しかしながら、DHPLCは、検出手段の自動化のため試料サイズについて、または非位置依存的様式にて突然変異を発見するその能力のため精度について、妥協する必要がほとんど無いので、このような走査計画を行うには最良の方法である。盲検解析の論文は繰り返し、DHPLCを用いる突然変異の発見には95−100%の効率があるとしている。ヘテロプラスミックな突然変異の存在を検出することに関して重要なことに、突然変異を示唆するヘテロ二本鎖の存在が少量でも検出できる能力についても、報告されている。
新規突然変異の有害な役割を支持するについて、4つの主要な基準が存在すると考えられる。第1に、突然変異は、中立の多型であってはならない;第2に、塩基変化は、進化において保存され、かつ機能的に重要な領域に、影響を及ぼさなければならない;第3に、有害な突然変異は、通常ヘテロプラスミックでなければならず、第4に、相異なる家族メンバーにおけるヘテロプラスミーの程度は、症状の重症度と一致しなければならない。
母系伝達遺伝パターンを有する20人のデュピュイトラン病患者および20人の対応するカフカス人対照におけるミトコンドリアゲノム全体の走査に、強化マルチプレックス熱変性高速液体クロマトグラフィー(Denaturing High Performance Liquid Chromatography、DHPLC)技術を用いた。
不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態と2839mtDNA多型により与えられる遺伝子型との間の一致を確証するため、実施例1の方法論を繰り返して本発明の第一の局面の方法に従い被験者を走査し、被験者の遺伝子型を確立した。
Claims (22)
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断または検出するためのin vitro方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムの16srRNA領域を調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
- ミトコンドリアゲノムの2839の位置の周辺の領域を調べて遺伝子多型または突然変異の存在を検出する、請求項1記載の方法。
- ミトコンドリアゲノムの2839の位置におけるグアノシンヌクレオチド(G)の後ろへのチミジンヌクレオチド(T)の挿入(G2839G/T)を調べる、請求項2記載の方法。
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断または検出するためのin vitro方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムのNADH−キノン酸化還元酵素(複合体I)のND2遺伝子を調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断または検出するためのin vitro方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムのシトクロムb(複合体III)領域を調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断または検出するためのin vitro方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムのシトクロムcオキシダーゼ(複合体IV)領域のCOI遺伝子を調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
- 該状態がデュピュイトラン病である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 該状態がケロイドまたは肥厚性瘢痕である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 該状態が以下のいずれかである、請求項1から6のいずれかに記載の方法:強皮症;全身性硬化症;クレスト症候;皮膚斑点を伴う結節硬化症;家族性皮膚コラーゲン腫;皮膚の代謝および免疫疾患;好酸球筋膜炎;円板状エリテマトーデス;皮膚筋炎;混合結合組織疾患;薬物誘発性皮膚線維症;口腔粘膜下線維症;食事および環境暴露によって誘発される線維症;肺/心臓線維症;肝線維症/硬変;腎線維症;薬物誘発線維症;中枢及び末梢神経系線維症;血管系線維症;男性および女性尿生殖路繊維症;および婦人科系線維症。
- 該状態が以下のいずれかである、請求項1から6のいずれかに記載の方法:肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺線維症、嚢胞性繊維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症および脳卒中または神経変性疾患後の中枢神経系線維症。
- 被験者から採取した血液または組織試料からミトコンドリアDNAを単離し、そして調べて、該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出する、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
- ミトコンドリアDNAを調べて遺伝子多型または突然変異の存在を検出する前にミトコンドリアDNAを増幅する、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてミトコンドリアDNAを増幅する、請求項12に記載の方法。
- 配列番号:1および2または配列番号:3および4のPCRプライマーを利用してミトコンドリアDNAを増幅する、請求項13に記載の方法。
- ミトコンドリアゲノムを制限酵素消化およびサイズ解析によって調べる、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
- 以下のものを含む、請求項13から15のいずれかに記載の方法に使用するためのキット:
A)不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態に関連するミトコンドリアゲノムにおける遺伝子多型または突然変異を増幅するためのPCRプライマー、および、
B)各多型または突然変異のための既知の遺伝子型の対照DNA試料。 - PCRプライマーが請求項14に規定されるものである、請求項16記載のキット。
- DNA断片を形成するための適当な制限酵素をさらに含む、請求項16または17記載のキット。
- 特定の多型とある状態との間の関連の概要をまとめるデータカードおよび/またはPCR増幅、PCR産物の制限酵素消化およびDNA断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコールをさらに含む、請求項16から18のいずれかに記載のキット。
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を処置するための医薬の製造に用いる、ミトコンドリアゲノム遺伝子産物の調節物質の使用。
- 直接的または間接的にミトコンドリアゲノム遺伝子産物を調節するタンパク質をコードするDNA分子を含む遺伝子治療技術に用いる送達系であって、該DNA分子は転写されて該タンパク質を発現させる能力があり、およびそれにより不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を処置する能力がある、送達系。
- 不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断また検出するためのin vitro方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムを調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
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