JP4384025B2

JP4384025B2 - 遺伝子検査

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Publication number: JP4384025B2
Application number: JP2004501642A
Authority: JP
Inventors: マーク・ウィリアム・ジェイムズ・ファーガソン; ウィリアム・アーネスト・ロイス・オリアー; アーデシャー・バヤット
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2023-04-23
Also published as: DE60322901D1; DK1520039T3; AU2003222980B2; HK1070109A1; ATE404696T1; CA2482812A1; ES2310239T3; WO2003093506A3; JP2005529592A; EP1520039A2; GB0209812D0; US20050239071A1; AU2003222980A1; EP1520039B1; WO2003093506A2

Description

発明の詳細な説明

本発明は、試料を遺伝子検査し、不適当な瘢痕形成または線維症によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発症への遺伝的素因に関連する多型または突然変異の存在を決定する方法に関する。

瘢痕は、先の傷害や創傷（たとえば、切開、摘出または外傷性傷害など）に起因する異常な形態学的構造である。瘢痕は、主として１型および３型コラーゲンならびにフィブロネクチンを基質とする結合組織からなる。瘢痕は、異常な組織形成におけるコラーゲン線維からなる場合もあり（皮膚の正常な瘢痕にみられる）、あるいは結合組織の異常な蓄積である場合もある（中枢神経系の瘢痕または皮膚の病的な瘢痕形成にみられる）。

瘢痕形成は、ほとんどの成体動物およびヒトの組織における治癒過程の通常の結果である。皮膚において、瘢痕は、皮膚の表面下に押さえられているか、あるいは表面より盛り上がっている。肥厚性瘢痕は、特定の状態または特定の個体において生じ得る、より重篤な瘢痕形成の形態である。肥厚性瘢痕は、皮膚の正常な表面より盛り上がっており、異常なパターンに配置された過剰のコラーゲンを含む。ケロイドは、皮膚の表面より盛り上がるばかりでなく、もとの傷害の境界を越えて広がる病的瘢痕形成の１つの形態である。ケロイドには、主としてコラーゲン性組織の渦巻きに異常な様式で組織化された過剰の結合組織が存在する。

不適当で、特に病的な瘢痕（たとえば、肥厚性瘢痕およびケロイドなど）を形成するのは、遺伝的素因であると考えられる。たとえば、アフリカ系カリブ人およびモンゴロイド人種は、特にケロイド瘢痕を発症する傾向がある。更に、肥厚性瘢痕およびケロイドを発症する素因は家系特有である可能性がある。

瘢痕形成が問題となる医学的状況は多い。このような状況の例は、過剰の瘢痕形成が組織の機能にとって有害な皮膚の瘢痕であり、特に、瘢痕拘縮が起こる場合である（たとえば、関節の柔軟性を損なう皮膚の火傷および創傷など）。美容上の考慮が重要である場合に皮膚の瘢痕形成を減少させることも非常に望ましい。皮膚において、肥厚性またはケロイド瘢痕は（特に、アフリカ系カリブ人およびモンゴロイド人種において）、機能的および美容上の減損を引き起こしうるものであり、それらの発生を防止する必要がある。２箇所のドナー部位における皮膚移植および人工皮膚の適用に起因する瘢痕形成も問題を含むものであり、出来るだけ少なく、または防止する必要がある。このような状況における瘢痕形成の重要性を考えると、当然のことながら、被験者が不適当な瘢痕形成を発症しやすいか否かを調べるために被験者を検査することが可能である必要がある。

皮膚の瘢痕と同様に、内部の瘢痕形成または線維症は、非常に有害であり、その具体例として、以下のものが挙げられる：
（ｉ）中枢神経系における、グリア性瘢痕形成は、ニューロン再接続を妨げる（たとえば、神経外科手術または脳の貫通性傷害後など）。
（ii）眼球内の瘢痕形成は、有害である。角膜では、瘢痕形成の結果として、異常な乳白度になり、視力に問題が生じるか、あるいは失明に至る可能性もある。網膜では、瘢痕形成は、ゆがみまたは網膜剥離を引き起こし、次いで失明に至る。緑内障における眼圧低下のための手術（たとえば、緑内障濾過手術）における創傷治癒後の瘢痕形成の結果として、水性体液を排出することができなくなり、緑内障が再発することにより、手術が失敗に終わることとなる。
（iii）心臓における瘢痕形成（たとえば、手術または心筋梗塞後など）は、異常な心臓機能を引き起こし得る。
（iv）腹部および骨盤などに関わる手術は、内臓間の癒着に至ることがしばしばある。たとえば、胃腸と体壁の要素間の癒着は、腸ループにねじれを形成し、虚血、壊疽を引き起こし、次いで、緊急処置が必要になる（処置しないと死に至る場合もある）。同様に、胃腸に対する外傷または切開は、瘢痕形成および瘢痕拘縮に至ることがあり、それによって、再度生命を脅かす胃腸の内腔の閉塞を引き起こす狭窄の生じる可能性もある。
（ｖ）卵管の領域での骨盤における瘢痕形成は、不妊の原因となりうる。
（vi）筋肉への傷害後の瘢痕形成の結果として、異常な拘縮が生じ、それによって筋肉機能が損なわれ得る。
（vii）腱および靭帯の傷害後の瘢痕形成または線維症の結果として、機能の重篤な喪失に至る。

上述した事項に関連するのは、過剰の線維組織の発症によって組織の病的混乱状態および機能不全が引き起こされる、線維性障害として知られる多くの医学的状態があるという事実である。線維性障害は、組織内の異常な様式での線維性組織（主としてコラーゲン）の蓄積を特徴とする。このような線維性組織の蓄積は、種々の疾患過程に起因する。これらの疾患は、必ずしも、手術、外傷性傷害または創傷によって引き起こされなくてもよい。線維性障害は、通常、慢性である。線維性障害の例として、肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺線維症、嚢胞性繊維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症、脳卒中または神経変性疾患（たとえば、アルツハイマー病など）後の中枢神経系線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）および関節炎が挙げられる。

瘢痕形成の場合、多くの線維性障害の発症またはその重症度において遺伝的影響があると考えられる。ある場合には、遺伝的影響は障害の発症についての直接的原因であり、他の線維性障害では、その障害の一次的原因に対して二次的である線維性障害の発症に影響を及ぼす遺伝的因子がある（たとえば、嚢胞性繊維症など）。

線維症が関連し、遺伝によって影響を及ぼされると考えられる障害の一例は、デュピュイトラン病（Dupuytren's disease：ＤＤ）である。

ＤＤは、指の進行性および永続性拘縮を引き起こす結節性手掌線維腫症である。ＤＤは、外科的切除後に再発率の高い不可逆的で進行性の障害である。それは、しばしば家族性であり、北欧系の個人によく見られる。６０歳以上のケルト民族の男性の２５％以上において、ＤＤの徴候が見られ、カフカス人における結合組織の最も一般的な遺伝性の障害の１つであると考えられる。

該状態の原因となる単一の遺伝子を同定した文献はこれまでに発表されていない。さらに、ＤＤが複数の遺伝子の主働による状態であるか、単純な単一遺伝子のメンデル型遺伝病であるかは不明である。したがって、影響を受けやすい遺伝子座の同定は、この普及している疾患の遺伝的構成要素を解明する理想的なアプローチを提供し、ＤＤに対する処置および管理方策の次なる開発においても価値があるであろう。

上述の内容から当然のことながら、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を発症することに対する罹患性について個人を評価すること、およびまたこのような状態を患っている個人について予後を評価することが可能であることが必要である。これに近づき得る１つの手段は、特定の医学的状態に関連する遺伝子における多型または突然変異の同定である。いったん同定されると、このような多型は、状態の発症に対する管理、処置または罹患性の確証を必要とする医師に有用な情報を提供することができる。情報を用いることができる１つの手段は、遺伝子検査の開発においてである。

遺伝子検査は、ある状態への罹患性を生じさせるかまたは増大させる突然変異（または多型）、もしくは該状態を引き起こす遺伝子に関連することからその状態への素因を潜在的に示す突然変異（または多型）を、患者のＤＮＡが含むかどうかを決定するための、患者の核酸の解析検査として定義するこができる。

ある状態への素因の早期検出は、医学的介入にとって最高の機会を与える。危険度の早期遺伝的同定は、臨床的症状が現れる前の早期介入を通して、患者の予後を改善し得る。

遺伝子検査は、同じ治療論によって同様の症状をもつ患者の治療を行って成功の程度が相異する場合に、患者をその症状についての発症的基盤よりもむしろ遺伝子的基盤により区別することができ、これにより相異なる治療方法の潜在的必要性が生じる。

本発明の１つの目的は、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への危険性または素因を示すための遺伝子スクリーニング方法を提供することである。

本発明の第一の局面により、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因を診断または検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムを調べて該状態の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法が提供される。

本発明の第一の局面の方法は、研究者が、ミトコンドリアゲノムにおいて遺伝子多型または突然変異を発現する被験者を同定し、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を有する、または該状態が発症する危険性の高い、被験者を決定することを可能にする。これにより、該状態の発現の可能性を予防するため、または減少させるため適当な措置をとることが可能となり、あるいはその適当な処置が可能となる。該方法はまた、既に特定の状態を患っていると診断されている被験者の予後を確証するのに有用である。

「多型」は、ヌクレオチド塩基配列が個体間で変化し得る遺伝子またはその調節エレメントの領域を意味する。相異なる遺伝子型を与える多型を有する集団のサブセットと共に、遺伝子の通常の形態または野生型に相当する優勢な遺伝子型が存在することが多い。特定の多型は、特定の人種的背景に属する個体、または特定の地理的領域出身の個体によく見られる。多型は、遺伝子の機能に影響を及ぼさない場合がある；遺伝子の機能に差異を与える場合がある；不活性な遺伝産物を産生する場合がある；または遺伝産物の産生を調節する場合があある。

「突然変異」は、ヌクレオチド塩基配列が通常の遺伝型（即ち、野生型）と異なる、遺伝子またはその調節エレメントの領域を意味する。突然変異は、塩基置換、付加または欠失であってよい。突然変異は、遺伝子の機能に影響を及ぼさない場合がある；遺伝子の機能に差異を与える場合がある；不活性な遺伝産物を産生する場合がある；または遺伝産物の産生を調節する場合がある。

「調節エレメント」は、遺伝子の転写の調節に関与するＤＮＡを意味する。たとえば、転写因子結合配列、ＴＡＴＡボックス、および特にＰＬおよびＰＨ１プロモーターである。ＰＬおよびＰＨ１プロモーターは、置換（displacement、Ｄ）−ループを含み全てのミトコンドリア遺伝子の転写に影響する制御領域に存在する、主要なプロモーターである。

「ミトコンドリアゲノム」は、検査を受ける被験者の細胞のミトコンドリア内部に見られる遺伝物質を意味する。この遺伝物質は、全ての遺伝子、特にコード配列およびその調節エレメントを含む。

ミトコンドリアゲノムは、各ミトコンドリア内に区分された１６，５５８塩基対（核ゲノムの大きさの１０^−５倍未満）の二本鎖環状ＤＮＡである。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、典型的には、各細胞に１０^３−１０^４の同一コピーが存在する。しかしながら、精子においては１０^２コピー存在し、卵母細胞においては１０^５コピー存在する。

ミトコンドリアは、真核細胞の細胞質の重要かつ不可欠な要素として認識されている。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の過程を介するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形でのエネルギーの生成に関与する。ミトコンドリアはまた、プログラム細胞死、またはアポトーシスの調節に関与する。ミトコンドリア内膜は、数多くのアポトーシス促進因子、例えばｃｙｔｃ、Ｓｍａｃ、ＤＩＡＢＬＯ、ＡＩＦおよびカスパーゼ、を含む。ミトコンドリア透過性遷移孔（mitochondrial permeability transition pore）が開口するとその膜が膨張し、これらのアポトーシス因子が細胞質に放出される。

核ゲノムと比較すると、ｍｔＤＮＡは、非コード配列が置換ループ（Ｄ−ループ）として知られるほんの１ｋｂだけで非常にコンパクトである。Ｄ−ループは三重らせんを形成しており、ミトコンドリア複製の開始点である。イントロンがなく、ｍｔＤＮＡは核ＤＮＡのように保護的ヒストンによって覆われていない。ミトコンドリアゲノムは、ミトコンドリア内膜につながれて呼吸鎖に近接している。

ＭｔＤＮＡは、１３のタンパク質コード遺伝子より構成される。ヒトｍｔＤＮＡの完全配列は、ケンブリッジ・リファレンス・シークエンス（Cambridge Reference Sequence）（ＣＲＳ）(Anderson et al., Nature 1981 Apr 9; 290(5806): 457-65)として、当業者に知られている。ｍｔＤＮＡは最近再び配列決定され、ＣＲＳはさらに改訂された (Andrews et al., Nat Genet 1999 Oct; 23(2): 147)。

ｍｔＤＮＡの配列は、典型的には、血縁関係のないヒトにおいて５０ヌクレオチド（０．３％）異なり得る。通常ほとんどのヒトで全細胞に、１つのｍｔＤＮＡ配列変異体が存在する。これはホモプラスミー（homoplasmy）と呼ばれる。

しかしながら、ヒトｍｔＤＮＡにおける突然変異率は、核ＤＮＡの１０−２０倍である。この突然変異率は、少なくとも一部はプルーフリーディングｍｔＤＮＡポリメラーゼ酵素の不足に起因すると考えられる。更に、呼吸鎖は、ｍｔＤＮＡにおいて突然変異を引き起こすと考えられている酸素フリーラジカルの有力な供給源である。

ｍｔＤＮＡの配列のバリエーションは、ｉｎｓｉｔｕで（体細胞性に）受け継がれるか、あるいは創出される場合もある。

ミトコンドリア障害は、先天性の代謝異常の最も一般的な群に入り、推定発生率は出生１０，０００人に１人である。ミトコンドリアの状態は、ＡＴＰの産生をもたらす経路であるミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）系における疾患に関する。ミトコンドリアおよび核ゲノムの両方にコードされる８５のタンパク質がその複雑なＯＸＰＨＯＳ系に関与するので、ＯＸＰＨＯＳ系の遺伝子突然変異では様々な臨床的表現型が見られる。

メンデルの遺伝学とミトコンドリアの遺伝学の間には４つの基本的相違が存在し、それには母方の家系による継承、ポリプラスミー、ヘテロプラスミーおよび閾値効果（threshold effect）が含まれる。特定の病理的ｍｔＤＮＡ突然変異の表現系および臨床的発現は、ミトコンドリアゲノム内の突然変異の位置だけでなく、細胞内の野生型ミトコンドリアに対する変異体の割合の影響も受ける。これは、時に、突原変異荷重（mutational load）、細胞内のｍｔＤＮＡについてのヘテロプラスミーの程度、と呼ばれる。

閾値効果は、ミトコンドリア機能障害が起こるために存在する必要がある変異ＤＮＡの臨界数を意味する。ある生化学的発現で見られる閾値は、ｍｔＤＮＡ欠失である突然変異を６０％およびｔＲＮＡに見られる突然変異を９５％保有しうるであろう。特定の組織におけるエネルギー要求性は、組織機能障害の程度に影響しうるであろう。

ＭｔＤＮＡ突然変異は、点突然変異（置換）およびリアレンジメント（欠失および複製）を含むが、イントロンがないためスプライス部位の突然変異は含まない。点突然変異は一般的に母性遺伝と考えられているが、リアレンジメントはしばしば散発的に起こる。

雌のみがミトコンドリアに基づく形質（遺伝性ミトコンドリア突然変異）を伝達する。形質は、世代から世代へ直接伝達される。このことは優性遺伝を示唆するが、古典的メンデル遺伝学とは異なる。雄および雌の両方が影響を受ける。雌は、その全ての子孫にその形質を伝達し、それは核における遺伝子の伝達と一致しない。それ故、正常な条件下では哺乳類ｍｔＤＮＡはもっぱら母系に従い遺伝するというのが大多数の見解である。精子ミトコンドリアは受精においてその受精卵に寄与するにも関わらず、種内交配において精子ｍｔＤＮＡは選択的に除去される。それ故、ある雌の全ての子供はｍｔＤＮＡについてクローン性である。このクローン性母系伝達および突然変異率の上昇が、集団において新規なｍｔＤＮＡ突然変異が蓄積する原因である。

ホモプラスミーは、通常個々の細胞に同一のｍｔＤＮＡが存在することを意味する。それに対し、ヘテロプラスミーは相異なるゲノム配列（野生型および変異ｍｔＤＮＡ）を含有するミトコンドリアが同じ細胞内に共存することである。ヘテロプラスミーは、良性のヘテロプラスミー多型も存在するものの、ｍｔＤＮＡにおける有害な突然変異の存在を示唆し得る場合がある。細胞分裂中、ｍｔＤＮＡはそれ自身で複製するが、核遺伝子とは異なり、その新規ミトコンドリア分子は娘細胞に受動的に分離する。ミトコンドリア突然変異は、１つの分子におけるランダムな変化である。やがて、偶発分離（chance segregation）は、細胞における変異体の増殖をもたらす。細胞分裂におけるｍｔＤＮＡの受動的分離のため、個々のミトコンドリア突然変異についてのヘテロプラスミーのレベルは、様々な組織において相違する。ヒトにおいて、ミトコンドリア性ヘテロプラスミーは疾患と関連する。幾つかの病的状態、例えば神経筋障害、の重症度は、骨格筋（分裂後組織）における変異ｍｔＤＮＡの数の多さと一致する。それ故、無症候から重症までの一連の臨床学的表現型は、家系内のヘテロプラスミーの様々なレベルと関連する。

ある組織および臓器においては、選択が働き、変異ＤＮＡのレベルが減少または増加する場合がある。このモデルにおいて、ネガティブ選択は時間とともに変異体のレベルを減少させるであろうが、一方、変異ｍｔＤＮＡのレベルが生存中に特定の組織において増加することがある。幾つかの組織において、高レベルの突然変異荷重が、疾患の進行に関連している。突然変異荷重が増加した異常なミトコンドリアは、（おそらく補完的作用の一部として）呼吸鎖異常に応答して選択的に増殖しうる。このポジティブ選択は、筋肉のような分裂後組織内で変異ｍｔＤＮＡのレベルを増加させ得る。

ミトコンドリア疾患の特別な特徴は、単一の臓器から多組織の疾患まで、臨床症状において見られる不均一性である。５０を超える病的なｍｔＤＮＡ塩基置換突然変異が知られている。この塩基置換は、１３のタンパク質コード遺伝子に影響するミスセンス突然変異およびｒＲＮＡおよびｔＲＮＡに影響しミトコンドリアのタンパク質合成に広範な影響を与えるミスセンス突然変異の両者に分類される。さらに多くのｍｔＤＮＡリアレンジメント（欠失および挿入）が様々な変性疾患において見られている。

最も頻繁に報告されているミトコンドリア突然変異は、ＭＥＬＡＳ（myopathy, enchephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes）に存在するＡ３２４３Ｇ、ＭＥＲＦＦ（myoclonus epileplsy, ragged red fibres）におけるＡ８３４４Ｇ、ＮＡＲＰ（neuropathy, ataxia, neuritis pigmentosa）におけるＴ８９９３Ｇ／Ｃ、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）およびリー症候群（Leigh syndrome）である。核ゲノムにおける突然変異もまた、ＯＸＰＨＯＳ系を不活化することにより、またはｍｔＤＮＡを不安定化することにより、ミトコンドリア機能に影響し得る。例えば、フリードライヒ失調症（Friedreich's ataxia）である。

遺伝性障害をもたらすミトコンドリア突然変異が、一般的な、遅発性の、不均一な疾患、例えば感覚神経障害および糖尿病並びに他の加齢に伴う疾患の大部分の基礎として、関与している可能性があることを示唆する証拠が増えてきている。表１に、様々なｍｔＤＮＡ突然変異が関連している可能性のある、十分に特徴決定された臨床的障害をあげる。

本発明者らは、不適当な線維症または瘢痕によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態（例えばＤＤ）の発症が、ミトコンドリアゲノムにおける突然変異または多型に関連している可能性があるという仮説を立てた。本仮説は、一部のＤＤ患者が母性遺伝疾患を発症するという認識に基づいていた。ミトコンドリア性疾患は母性遺伝なので、本発明者らは、ＤＤ被験者および対照被験者由来のｍｔＤＮＡを比較することにより、自身の仮説を試験することにした。

本発明者らは、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態に関連する可能性のある多型および突然変異について、ミトコンドリアゲノムをスクリーニングする実験を行った。このような関連を確証して、本発明者らは、被験者由来のＤＮＡを分析して、該状態の診断の確立を助けることができる、または被験者がこのような状態を発症する素因をもっているかどうかを確かめることができることを確証した。

該状態は、上述したような皮膚の病的瘢痕形成（たとえば、肥厚性瘢痕形成またはケロイド）の形態または内部の瘢痕もしくは線維症である。あるいは、該状態は、また上述したように、線維性疾患または障害であり得る。

本発明方法は、以下にあげる皮膚の線維性障害の診断または検出を助けるために用いることが出来る：強皮症；全身性硬化症；クレスト症候；皮膚斑点を伴う結節硬化症；家族性皮膚コラーゲン腫；皮膚の代謝および免疫疾患（晩発性皮膚ポルフィリン症、慢性移植片対宿主病）；好酸球筋膜炎；円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎；混合結合組織疾患；薬物誘発性皮膚線維症−ブレオマイシン、ＰＶＣ、シリケート；ペイロニー病；口腔粘膜下線維症；食事および環境暴露によって誘発される線維症。

本方法はまた、他の臓器の線維性障害の検出または診断に有用である。このような障害として、以下のものが挙げられる：
肺／心臓線維症；肝線維症／硬変；腎線維症；胃腸管線維症；薬物誘発線維症（たとえば、臓器移植後など）；中枢および末梢神経系線維症；血管系（静脈および動脈）線維症；男性および女性尿生殖器線維症；婦人科系（卵管線維症、子宮線維症）。

本発明の第一の局面の方法は、デュピュイトラン病（ＤＤ）の素因を診断または検出するのに特に適する。

筋線維芽細胞から単離したｍｔＤＮＡについて研究をおこなった（詳細については実施例において説明）。筋線維芽細胞は、多くの研究においてＤＤにおける組織収縮に重要な細胞であることが示されており、また多数のミトコンドリアを含むことが報告されている。

本発明者らは、熱変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）をトランスジェノミックウェーブ核酸断片解析システム（Transgenomic Wave Nucleic Acid Fragment Analysis System、WAVE System）とともに使用し、ミトコンドリアゲノムにおける多型または突然変異を調べた。これら装置は、未知の突然変異を検出するのに、効率が高く、経費効率がよく、そして自動化された技術に用いることができる（Jones et al., Human Mutation 2001; 17(3): 233-234.）。本技術は、市販のジビニルベンゼンビースマトリックス（DNASep, Transgenomic Inc, Ne, USA）およびイオン対逆層ＨＰＬＣを利用して、突然変異を含む試料に存在するヘテロ二本鎖ＤＮＡ種（ＰＣＲ増幅の結果形成する）を検出する。ヘテロおよびホモ二本鎖は、一部熱変性条件を適用することにより（例えば温度上昇により）、区別して溶出することができる。ＤＮＡが溶解し始める点でホモおよびヘテロ二本鎖種のヘリックス含量の差が最大となり、各々の種のマトリックスへの結合の程度が変化する。このようにホモおよびヘテロ二本鎖を区別して溶出すると、クロマトグラムパターンが変化し、突然変異の存在を同定することができる。重要なことは、ＤＨＰＬＣは、他の技術と異なり野生型集団における非常の低いレベルの変異体を検出することができることである。この能力により、ＤＨＰＬＣはミトコンドリアゲノムを調べるのに適している。

実施例１に示すように、本発明者らは、ｍｔＤＮＡにおけるある種の多型または突然変異が、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発症と有意に一致することを発見した。本発明に従い検出することができる好ましい多型または突然変異の例は、ミトコンドリアゲノムの以下の位置に見られる：

（ａ）ミトコンドリアゲノムの１６ｓｒＲＮＡ領域における突然変異
本発明者らは、ミトコンドリアゲノムの１６ｓｒＲＮＡ領域における突然変異が、本発明の方法に従う状態と一致することを発見した。

突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の３４２ｂｐ断片（即ち、該ゲノムの３１９２−３５３３の位置）内に含まれ得る：
TTAGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAACTTTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACAACATACCCATGGCCAACCTCCTACTCCTCATTGTACCCATTCTAATCGCAATGGCATTCCTAATGCTTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACC（配列番号：１）。

あるいは、突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の４４２ｂｐ断片（即ち該ゲノムの２４１５−２８５６の位置）内に含まれ得る：
ctcactgtcaacccaacacaggCATGCTCATAAGGAAAGGTTAAAAAAAGTAAAAGGAACTCGGCAAATCTTACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCTAGCATCACCAGTATTAGAGGCACCGCCTGCCCAGTGACACATGTTTAACGGCCGCGGTACCCTAACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTTCCTTAAATAGGGACCTGTATGAATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCCCGTGAAGAGGCGGGCATAACACAGCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTTATTAATGCAAACAGTACCTAACAAACCCACAGGTCCTAAACTACCAAACCTGCATTAAAAATTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAGTACATGC（配列番号：２）

最も好ましい突然変異は、ミトコンドリアゲノムの２８３９の位置に見られる。この突然変異は、グアノシンヌクレオチド（Ｇ）の後へのチミジンヌクレオチド（Ｔ）の挿入である。実施例１は、ＤＤ患者由来の試料の１６／１８がＧＴ遺伝子型を有し、一方対照（ＣＷ）は全て野生型（Ｇ）遺伝子型を有していたことを示す。

（ｂ）呼吸鎖複合体Ｉのポリペプチドにおける突然変異
ＮＡＤＨ−キノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖の３つのエネルギー伝達酵素複合体の１つである。それは、呼吸鎖を移動し最終的に酸素を還元する電子の大部分が入るポイントである。複合体Ｉは、現在知られる最も複雑な膜結合酵素の１つと推測され、少なくとも４３の異なるポリペプチドにより構成される。これらのうち、７つはｍｔＤＮＡ（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）によりコードされている。

突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＮＤ１遺伝子の１７９ｂｐ断片（即ち、該ゲノムの３４２９−３６０７の位置）内に含まれ得る：
ccctacgggctactacaacccTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTCACCATCGCTCTTCTACTATGAACCCCCCTCCCCATACCCAACCCCCTGGTCAACCTCAACCTAGG（配列番号：３）。

あるいは、突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＮＤ１遺伝子の２４２ｂｐ断片（即ち該ゲノムの３６０８−３８４９の位置）内に含まれ得る：
CCTCCTATTTATTCTAGCCACCTCTAGCCTAGCCGTTTACTCAATCCTCTGATCAGGGTGAGCATCAAACTCAAACTACGCCCTGATCGGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACAATCTCATATGAAGTCACCCTAGCCATCATTCTACTATCAACATTACTAATAAGTGGCTCCTTTAACCTCTCCACCCTTATCACAACACAAGAACACCTCTGATTACTCCTGCCATCATGACCCTTGG（配列番号：４）。

あるいは、突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＮＤ１遺伝子の４７０ｂｐ断片（即ち該ゲノムの３９５９−４４２８の位置）内に含まれ得る：
CCCCTTCGCCCTATTCTTCATAGCCGAATACACAAACATTATTATAATAAACACCCTCACCACTACAATCTTCCTAGGAACAACATATGACGCACTCTCCCCTGAACTCTACACAACATATTTTGTCACCAAGACCCTACTTCTAACCTCCCTGTTCTTATGAATTCGAACAGCATACCCCCGATTCCGCTACGACCAACTCATACACCTCCTATGAAAAAACTTCCTACCACTCACCCTAGCATTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAAGAAATATGTCTGATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGACTATGAGAATCGAACCCATCCCTGAGAATCCAAAATTCTCCGTGCCACCTATCACACCCCATCCTAAAGTAAggtcagctaaataagctatcggg（配列番号：５）。

ＮＤ２領域に、対照では４５％にしか存在しない顕著なＤＨＰＬＣパターンが、患者の９４％に見られた。このことは、突然変異が本発明の状態に関連して存在することを示唆した。

ＤＤ被験者において、ＮＤ２領域に２つの更なる新規な突然変異（Ａ４９１６ＧおよびＧ５０４５Ａの位置）が発見されたが、それらは本発明による検査で検出することができる。

突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＮＤ２遺伝子の３９６ｂｐ断片（即ち、該ゲノムの４８４６−５２４１の位置）内に含まれ得る：
CGGCCTGCTTCTTCTCACATGACAAAAACTAGCCCCCATCTCAATCATATACCAAATCTCTCCCTCACTAAACGTAAGCCTTCTCCTCACTCTCTCAATCTTATCCATCATAGCAGGCAGTTGAGGTGGATTAAACCAAACCCAGCTACGCAAAATCTTAGCATACTCCTCAATTACCCACATAGGATGAATAATAGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACATAACCATTCTTAATTTAACTATTTATATTATCCTAACTACTACCGCATTCCTACTACTCAACTTAAACTCCAGCACCACGACCCTACTACTATCTCGCACCTGAAACAAGCTAACATGACTAACACCCTTAATTCCATCCACCCTCCTCTCCCTAGGAGGCCTGCCCCCGCTAAC（配列番号：６）

あるいは、突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＮＤ２遺伝子の５３１ｂｐ断片（即ち該ゲノムの４１８０−４７１０の位置）内に含まれ得る：
acttcctaccactcaccctagcATTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAAGAAATATGTCTGATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGACTATGAGAATCGAACCCATCCCTGAGAATCCAAAATTCTCCGTGCCACCTATCACACCCCATCCTAAAGTAAGGTCAGCTAAATAAGCTATCGGGCCCATACCCCGAAAATGTTGGTTATACCCTTCCCGTACTAATTAATCCCCTGGCCCAACCCGTCATCTACTCTACCATCTTTGCAGGCACACTCATCACAGCGCTAAGCTCGCACTGATTTTTTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACATGCTAGCTTTTATTCCAGTTCTAACCAAAAAAATAAACCCTCGTTCCACAGAAGCTGCCATCAAGTATTTCCTCACGCAAGCAACCGCATCCATAATCCTTCTAATAGCTATCCTCTTCAACAATATACTCTC（配列番号：７）。

（ｃ）呼吸鎖複合体ＩＩＩ（シトクロムｂ）のポリペプチドにおける突然変異
ＤＤ患者において、少なくとも２人の被験者間で非常によく似たＤＨＰＬＣパターンを示す複数の新規な突然変異が発見された。これらの配列変化は、どの対照にも存在しなかった。配列決定により発見された変化の大部分は、ヘテロプラスミーが新たに存在することを明らかにし、それには以下のものが含まれた：Ｇ１５２７４Ｃ／Ｇ；Ａ１５２８２Ｃ／Ａ；Ｇ１５３１９Ｃ／Ｇ；Ｔ１５３３２Ｃ／Ｔ；Ｇ１５３３６Ｇ／Ｃ；Ｔ１５３３９Ｔ／Ｃ；Ｔ１５３６２Ｃ／Ｔおよび１５４３４ｉｎｓＣ。これら全ての変化は、シトクロムｂ領域におけるものであった。

（ｄ）呼吸鎖複合体ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼ）のポリペプチドにおける突然変異
ＤＤ患者由来の試料において、際だったＤＨＰＬＣパターン変化が、そのゲノムの６６８８および６８４９の中（ＣＯＩ領域）に見られた。ＤＤ被験者は全て単一ピークのＤＨＰＬＣパターンを示したが、一方対照試料では同様のパターンを示すのは２７％に過ぎなかった。

本突然変異は、以下のヌクレオチド配列を有する、ＣＯＩ遺伝子の１６２ｂｐ断片（即ち、該ゲノムの６６８８−６８４９の位置）内に含まれ得る：
CGGAAAAAAAGAACCATTTGGATACATAGGTATGGTCTGAGCTATGATATCAATTGGCTTCCTAGGGTTTATCGTGTGAGCACACCATATATTTACAGTAGGAATAGACGTAGACACACGAGCATATTTCACCTCCGCTACCATAATCATCGCTATCCCCA（配列番号：８）。

更なる研究により、他の繊維性障害(例えば、強皮症または腎線維症)を有する被験者および重度の／病的な瘢痕（例えば、ケロイド）を発症する傾向のある被験者もまた、これらの突然変異の頻度が高いことが確証された。それ故、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる様々な状態の素因を診断または検出するため、その多型または突然変異を本発明の方法に従い検討することができる。

本発明の方法に従い多型または突然変異を検出するには、様々な技術を用いることができる。

好ましい技術の１つはＤＨＰＬＣである。本技術は実施例１に詳説する。本発明の方法に従い使用するため、Van Den Bosch ら(Nucleic Acids Res 2000 Oct 15; 28(20): E89)のＤＨＰＬＣ技術を用いるか、あるいはそれを適応させることができる。

別の好ましい技術には制限酵素消化（制限酵素 Digestion、RED)が含まれ、これは、多型または突然変異が、(制限酵素部位の導入または欠失により）制限酵素処理後に相異なる大きさのＤＮＡ断片を生じさせることがあるという事実に基づいている。これらの断片はゲル上で可視化することができ、その多型は、被験者由来のＤＮＡ試料の断片の数および大きさ（即ち、ゲル上を移動した距離）に基づいて同定することができる。

ｍｔＤＮＡは、多型または突然変異の検出に先立って単離し、そして増幅することが好ましい。この増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によることが好ましい。例えば本発明の好ましい方法はＰＣＲ−制限断片長多型法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）として知られており、ＲＥＤ（制限酵素消化）およびその後の解析に先立って、その多型または突然変異を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅することを含む。一部の多型は、野生型または変異体アリルのいずれの制限酵素部位も消失あるいは導入しない。この場合、増幅産物に制限酵素部位を導入する特別に設計されたＰＣＲプライマーによって、制限酵素部位を導入することができる。導入された酵素部位により、多型アリルと野生型との間をサイズ解析により区別することが可能となる。たとえば、増幅産物の制限産物をゲル電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミドゲルなど）によって解析する場合、導入された制限酵素部位をもつアリルは、ゲル上に特別なバンドを生じるであろう。

本発明により多型を検出するのに用いることができる他の技術には、以下のものが含まれる：
（１）対象の多型領域の直接配列決定（たとえば、Cy5^TM Thermo Sequence dye terminator kit（Amersham Pharmacia Biotech）などの市販のキットを用いる）；
（２）配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Sequence Specific Oligonucleotide Hybridization：ＳＳＯ）（多型領域を含む増幅ＤＮＡ分子のドットまたはスロットブロッティング；各多型変異体に特異的であるように設計される標識プローブとのハイブリダイゼーション；および該標識の検出を含む）；
（３）ヘテロ二本鎖および一本鎖コンホーメーション多型（Heteroduplex and single-stranded conformation polymorphism：ＳＳＣＰ）解析（多型領域を含む変性増幅ＤＮＡ分子の電気泳動バンドパターンの解析を含む）；
（４）配列特異的プライミング（Sequence Specific Priming：ＳＳＰ）［増幅不応性突然変異システム（Amplification Refractory Mutation System：ＡＲＭＳ）ともいう］；
（５）突然変異走査［たとえば、PASSPORT^TM 突然変異走査キット(Amersham Pharmacia Biotech)などを用いる］；
（６）ミスマッチの化学的切断解析；
（７）非同位体ＲＮａｓｅ切断アッセイ(Ambion Ltd.)；
（８）酵素ミスマッチ切断アッセイ；および
（９）単一ヌクレオチド伸長アッセイ。

ＰＣＲ増幅が必要な場合、ＰＣＲプライマーは、該当の多型または突然変異周辺の領域を増幅するのに適するように設計する必要がある。

ＰＣＲプライマーセット６（例えば、以下の実施例１および配列番号：９および配列番号：１０を参照）が、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子において突然変異を検出するために好ましいプライマーである。実施例１に記載されるように、これらプライマーによる増幅に続けて、（より小さいＤＮＡ断片を生じさせるため）Ｄｄｅ１制限酵素消化してもよい。
プライマーセット６フォワードプライマー:５’ ctc act gtc aac cca aca cag g ３’ （配列番号：９）
プライマーセット６リバースプライマー: ５’ tgt gtt gtg ata agg gtg gag ag ３’ （配列番号：１０）

２８３９における突然変異を特異的に増幅するのに適したプライマーを、以下に配列番号：１１および配列番号：１２として挙げる。
フォワードプライマー:５’ tgc att aaa aat ttc ggt tgg ３’ （配列番号：１１）
（長さ２１ｂｐ；ＧＣ数７；ＡＴ数１４；％ＧＣ３３％；Ｔｍ＝４８．８１）
リバースプライマー:５’ tgt cct gat cca aca tcg ag ３’ （配列番号：１２）
（長さ２０ｂｐ；ＧＣ数１０；ＡＴ数１０；％ＧＣ５０％；Ｔｍ５４．２２）

配列番号：１１および配列番号：１２のプライマーは、２８３９突然変異を含むミトコンドリアゲノムの領域を増幅するのに用いることができる。増幅されたｍｔＤＮＡをその後配列決定し、その遺伝子型を同定することができる（即ち、直接配列決定技術）。

ｍｔＤＮＡは、血液または組織試料（例えば、毛髪、口腔頬側スワブ、爪または皮膚）あるいは他の適したソースから、常套的方法を用いて単離することができる。好ましくはＤＮＡは、全血または顆粒球、手掌筋膜、足底筋膜もしくは陰茎筋膜から単離する。筋線維芽細胞もまた、本発明の方法による検査のための好ましいｍｔＤＮＡソースである。

本方法は、ヒト被験者由来のｍｔＤＮＡを検討するのに用いることが好ましい。しかしながら、獣医学的対象の被験動物由来のＤＮＡもまた、本発明の方法により検査することができることは理解されるであろう

本発明の方法に基づく予測または診断は、問題とする特定の状態と特異的多型または突然変異との間に形成させる関連性に依存する。このような関連性は、本発明者が、さらなる実験を行い、統計的解析を行うことによって確証された。関連性解析に基くデータを蓄えることによって、臨床医が、本発明方法に従いＤＮＡを配列決定することによって同定された遺伝子型の重要性を解釈するのが可能になる。次いで、臨床医は、患者が特定の疾患または障害を発症している、または保有している可能性に関して判断を下すことができる。このような知識は、不適当な瘢痕形成または線維症に関連する特定の状態の臨床管理において重要である。当然のことながら、特定の遺伝子型と状態との関連性に関するデータは、キットの一部としてデータシートを組み込むことによって、本発明方法の利用者（技術者または臨床医）に提供される（後記参照）。

新生児または小児が、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発症の素因を受け継いでいるかどうかを検査することが必要である場合、遺伝子検査は、胎児期、周産期または出生後のいずれかに行うことができる。これは、該状態の発症の家族暦がある場合、特に有用である。

本検査は、手術前に被験者を検査するのに特に有用である。このような検査の結果は、手術を受けようとする被験者について治癒合併症（たとえば、肥厚性瘢痕形成、ケロイドまたは内部線維症／瘢痕形成）が起こり得るかどうかを明らかにするのに有用である。

本検査は、不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態を処置するために治療処方計画を確立する前にも有用である。本発明の検査の結果は、臨床医が用いて、使用する医薬およびその用量の選択に役立てることができる。

本発明方法は、不適当な瘢痕形成または線維症によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発症の家族暦をもつ被験者を検査するのに用いるのが最も好ましい。

本発明の第１の局面の方法を行う技術者にとって必要な種々の要素は、キットに組み込むことができる。したがって、本発明の第２の局面に従い、以下を含むキットが提供される：
（Ａ）不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態に関連するミトコンドリアゲノムにおける遺伝子多型を増幅するためのＰＣＲプライマー；および
（Ｂ）各多型のための既知の遺伝子型の対照ＤＮＡ試料。

キットが、対象の多型または突然変異を含むことがわかっている試料ＤＮＡの標的配列に特異的なプライマーを含むことが好ましい。たとえば、Ｇ２８３８Ｇ／Ｔ突然変異の遺伝子型を特定するためのキットに適するＰＣＲプライマーは、配列番号９および配列番号１０のプライマー、または配列番号１１および配列番号１２のプライマーである。

キットは、さらに以下のものを含むことができる：
（Ｃ）ｍｔＤＮＡ試料の断片を作成するための適当な制限酵素；
（Ｄ）特定の多型と疾患との間の関連の概要をまとめるデータカード；
（Ｅ）ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素消化およびＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコール；
（Ｆ）適切な緩衝液。

キットで提供される緩衝液は、液体であってよく、測定済みのアリコートとして提供されるのが好ましい。あるいは、緩衝液は希釈用の濃縮形態（または粉末形態）であってよい。

キットは、さらに適当な反応容器、遠沈管などを含むことができる。

本発明の第３の局面により、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を処置するための医薬を製造に用いる、ミトコンドリアゲノム遺伝子産物の調節物質の使用が提供される。

本発明の第４の局面により、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする被験者に治療上有効量のミトコンドリアゲノム遺伝子産物の調節物質を投与することを含む方法、が提供される。

本発明者らは、本発明の第３および第４の局面による調節物質は、本発明の第１の局面に関して説明した各状態を処置するために使用することができることを発見した。該調節物質は、デュピュイトラン病（ＤＤ）を処置するために使用することが好ましい。

本発明の調節物質として使用することができる化合物には、幾つかのクラスがある。これら化合物は、以下のものを含む:
（ｉ）ミトコンドリア遺伝子産物のインヒビター（阻害物質）またはアクチベーター（活性化物質）（例えば、アロステリックな、または競合的インヒビター）；
（ｉｉ）ミトコンドリア遺伝子産物の合成を調節する化合物；
（ｉｉｉ）ミトコンドリア遺伝子産物の放出を調節する化合物；
（ｉｖ）ミトコンドリア遺伝子産物の不活化または代謝の速度を調節する化合物；
（ｖ）ミトコンドリア遺伝子産物の発現および／または転写を調節する化合物（例えば、リボザイムまたはアンチセンスＤＮＡ分子）；および
（ｖｉ）ミトコンドリア遺伝子産物に対する抗体またはイントラボディ（intrabody）。

調節される遺伝子産物は、呼吸鎖複合体Ｉ；呼吸鎖複合体ＩＩＩ（シトクロムｂ）；呼吸鎖複合体ＩＶ（シトクロムＣオキシダーゼ）であることが好ましい。最も好ましくは、調節される遺伝子産物は、１６ｓｒＲＮＡである。

好ましいアンチセンス分子、抗体およびイントラボディは、配列番号：１−１２のいずれかに対するものであってよい。

調節物質は、既存の状態を処置するために使用することができるが、予防的処置が医学的に必要と考えられる場合にも使用することができる。例えば、肥厚性瘢痕形成またはケロイドの発症を防ぐために、待機手術の前に治療を開始することが必要と考えられる場合である。

本発明の第３および第４の局面の調節物質は、特にそれらの使用方法に依存して、数多くの相異なる形態をとることができる。つまり、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチ、リポソームの形態、または人または動物に投与することができる他の適した形態であってよい。本発明の組成物のビークルは、それを投与される被験者が十分に耐えられるものであり、また該化合物を被験者に送達することができるものでなければならないことは、理解されるであろう。

本発明の調節物質は、様々な方法で使用することができる。例えば、全身性投与が必要な場合、調節物質は、例えば錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口により摂取することができる組成物に含めることができる。あるいは、調節物質は、血流へ注射することにより投与することができる。注射は、静脈内（ボーラスまたは輸液）または皮下（ボーラスまたは輸液）であってよい。調節物質はまた、吸入（例えば鼻腔内）により投与してもよい。

調節物質は、該状態の患部組織、または患部となりうる組織に、局所投与されることが好ましい。

調節物質はまた、持続放出または遅延放出装置に組み込むことができる。このような装置は、例えば、皮膚に、また皮下に挿入することができ、調節物質を数週間または数ヶ月かけて放出し得る。このような装置は、慢性症状の患者に特に有用である。本装置は、通常頻回投与を必要とするであろう調節物質を用いる場合に、特に好都合であろう。

必要な調節物質の量は、投与様式、用いた化合物の物理化学的性質、および調節物質が単独療法として用いられるか、あるいは併用療法において用いられるか、に依存する、生物活性および生物学的利用能により決定されることは、理解されるであろう。投与頻度もまた、前述の因子、および特に処置をうける被験者内での調節物質の半減期の影響をうける。

組成物の具体的製剤および正確な治療計画（例えば調節物質の１日投与量および投与頻度）を確立するには、既知の手段、例えば製薬業界で常套的に用いられるもの（例えば、ｉｎｖｉｖｏ実験、臨床試験など）を用いることができる。

タンパク質またはペプチド調節物質の好ましい使用方法は、該調節物質を遺伝子治療によって患部組織に送達するものである。それ故、本発明の第５の局面により、直接的または間接的にミトコンドリアゲノム遺伝子産物を調節するタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子治療技術に用いる送達系であって、該ＤＮＡ分子は転写されて該タンパク質を発現させる能力があり、およびそれにより不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を処置する能力がある、送達系、が提供される。

本発明の第５の局面による送達系は、ミトコンドリアゲノム遺伝子産物を直接的、または間接的に調節するタンパク質のレベルを、大抵の常套的治療計画で可能な期間よりも長期間にわたり維持するのに非常に適する。本送達系は、そのＤＮＡ分子により形質転換されている細胞による持続的タンパク質発現を誘導するために用いることができる。それ故、たとえｉｎｖｉｖｏにおいてそのタンパク質の半減期が物質としては非常に短くても、処置した組織から治療上有効量のタンパク質を持続的に発現させることができる。

さらに、本発明の送達系は、常套的製薬ビークル、例えば錠剤、カプセルまたは液体に必要とされるビークル、を使用する必要なく、ＤＮＡ分子（およびその結果、活性ある治療物質であるそのタンパク質）を提供するために使用することができる。

本発明の送達系は、（本送達系が患者に投与される場合に）そのＤＮＡ分子が発現する能力を有し、ミトコンドリア遺伝子産物活性を調節する活性を直接的または間接的に有するタンパク質を産生するものである。「直接的」とは、遺伝子発現産物自体が所望の活性を有することを意味する。「間接的」とは、遺伝子発現産物が（例えば酵素として）少なくとも１つの更なる反応を経て、または仲介して、該状態を処置するのに有効な調節物質を提供することを意味する。

ＤＮＡ分子は、適したベクター内に含まれ、組換えベクターを形成することができる。該ベクターは、例えばプラスミド、コスミドまたはファージであってよい。そのような組換えベクターは、本発明の送達系において、そのＤＮＡ分子により細胞を形質転換するのに非常に有用である。

組換えベクターはまた、他の機能的要素を含んでも良い。例えば、組換えベクターは、細胞において該ベクターが自己複製するように設計することができる。この場合、ＤＮＡ複製を誘導する要素が組換えベクターに必要とされ得る。あるいは、組換えベクターは、該ベクターおよび組換えＤＮＡ分子が細胞のゲノムと一体化するように設計することができる。この場合、標的を絞った一体化（例えば相同的組換えによる）に有利に働くＤＮＡ配列が望ましい。組換えベクターはまた、クローニング工程において選択的マーカーとして使用することができる遺伝子をコードするＤＮＡを有しても良い。

組換えベクターはまた、必要とされる遺伝子の発現を制御するプロモーターまたはレギュレーターをさらに含むことができる。

ＤＮＡ分子は、処置をうけている被験者の細胞のＤＮＡに組み込まれるものであってもよい（しかし必ずしもそうでなくてよい）。未分化な細胞を安定的に形質転換し、遺伝子組換え娘細胞を産生することができる（この場合、例えば特異的転写因子または遺伝子アクチベーターにより、被験者における発現を調節することが必要である）。あるいは、本送達系は、処置を受けている被験者の分化した細胞の、不安定な、または一過性の形質転換に有利に働くように設計することができる。この場合、その形質転換細胞が死ぬか、またはそのタンパク質を発現しなくなる時に（理想的にはその状態が処置されたか、または予防された時に）そのＤＮＡ分子の発現が止まるであろうことから、発現の調節はそれほど重要でないであろう。

本送達系は、ＤＮＡ分子をベクターに組み込まずに被験者に提供することができる。例えば、ＤＮＡ分子をリポソームまたはウィルス粒子内に組み込むことができる。あるいは、「裸の」ＤＮＡ分子を、適した方法、例えば直接的エンドサイトーシス的取り込み、により、被験者の細胞に挿入することができる。

ＤＮＡ分子は、トランスフェクション、感染、微量注入、細胞融合、原形質融合、または弾道砲撃（ballistic bombardment）により、処置をうける被験者の細胞に移行させることができる。例えば、移行は、コート化金粒子による弾道トランスフェクション、ＤＮＡ分子含有リポソーム、ウィルスベクター（例えば、アデノウィルス）、および、ＤＮＡ分子を脳に直接局所的に適用することにより、または注射することにより、直接的にＤＮＡを取り込ませる手段（例えば、エンドサイトーシス）によるものであってよい。

ミトコンドリアに起因する状態を標的として設計された方法は、本発明の第３、第４、または第５の局面により規定される処置を実施するために用いることが好ましい。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用して、アンチゲノム的アプローチを採用することができる。内生細胞置換治療および同素形（allotropic）遺伝子治療もまた、ｍｔＤＮＡ疾患を処置するために用いることができる。このような治療は、最近 Turnbull & Lightowlers (Nat Genet 2002 April 30(4): 345-346)に総説されており、そこに開示される（および引用により本明細書に含まれる）治療技術は、本発明による好ましい処置方法に用いることができることは、理解されるであろう。

実施例１：ｍｔＤＮＡにおけるデュピュイトラン病に関連する突然変異の同定
デュピュイトラン病(ＤＤ)患者の群および対照群から試料を採取して、多型とその状態との間の一致を検討した。

１．１方法
発明者らは、Van Den Bosch らのＤＨＰＬＣ技術 (Nucleic Acids Res 2000 Oct 15; 28(20): E89) を改変し、ＤＤに関連する可能性のある突然変異についてミトコンドリアゲノムを走査した。

１．１．１ Van Den Bosch らのＤＨＰＬＣ技術に対する改変
発明者らは、Van Den Bosch らのＤＨＰＬＣ技術（前述）を改変し、大きな試料集団のミトコンドリアゲノム突然変異走査を手ごろな費用でより迅速に達成できるようにした。行った変更を表２に概説する。

Van Den Bosch らの技術を改変した工程の略図を、図１に示す。図１は、特別に設計された１８のプライマーのセットを使用する、オプティマーゼＤＮＡポリメラーゼによるミトコンドリアゲノム全体のＰＣＲ増幅を示す。その増幅セットのうち４つの断片は通常のＤＨＰＬＣで使用するが、残りの１４は制限酵素消化して様々な断片を形成し、それらをその後全部で２９の相異なるパラメーター（勾配および温度）を用いてマルチプレックスＤＨＰＬＣにかけることができる。陽性試料はクロマトグラムパターンの変化により示され、存在する突然変異は配列決定によって確認する。

１．１．１（ａ）プライマー設計の重要性
Van Den Bosch らのＤＨＰＬＣ技術に施した改良は全て、以下の基準に留意して設計したプライマー設計に由来する：
１．ＤＨＰＬＣ（非マルチプレックス）のためのミトコンドリアゲノムの超可変領域の個々の断片。
２．個々の主要コーデイング遺伝子の考慮。
３．突然変異を引き起こす既知の疾患の考慮。

プライマー位置およびこれらの基準を、図２に示す。超可変領域の走査に関して、元の技術のように１つの大きな断片で後に制限酵素消化するかわりに、３つの重複するＰＣＲ増幅を用いた。この領域の、コードしないが超可変な性質は、数多くの陽性ＤＨＰＬＣパターンをもたらし、それらは本方策を用いて配列決定することにより確認された。

ゲノム全体の増幅には元の技術において用いられるよりも多数のＰＣＲが必要であったが、購入しなければならない制限酵素が少なく（１０に対して５）、そしてより重要なことに、用いなければならないＤＨＰＬＣ走査条件が少ないことから、我々はこれは価値があったと考える。走査条件の６５から２９への減少は、実時間および費用を節約する要素であり、本計画で行うように、ある研究設定において多数の試料を走査する必要がある場合に際だつものである。

１．１．１（ｂ）ＰＣＲ酵素選択の重要性
ミトコンドリア集団のヘテロプラスミックな性質のため、突然変異検出技術は、大部分が野生型である集団において小さな突然変異の集団を発見するのに十分な感受性を有さなければならない。このことを考慮すると、この適用に重要な基準は、ＰＣＲ増幅よる試料調製の忠実度が高いことである。全てのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、それらの起源および使用方法に依存する固有の誤取り込みのレベルを有する。ＰＣＲ増幅中のそれぞれの誤取り込みは、ランダムな低レベルのヘテロ二本鎖と同等であり、ＤＨＰＬＣ技術により可視化することができる。それ故、これらの誤取り込みを可能な限り低いレベルに維持し、それにより成功の見込みを最大とすることが望ましい。我々は、非常に高レベルの忠実度を有することが示されている、新規なプルーフリーディングポリメラーゼ（オプティマーゼＤＮＡポリメラーゼ（Optimase DNA polymerase）、Transgenomic Inc)に置き換えた。図３は、エクスパンドＤＮＡポリメラーゼ（Expand DNA polymerase、Roche)と比較して、オプティマーゼポリメラーゼを用いてプライマーセット２について得られた野生型パターンを示す。オプティマーゼＤＮＡポリメラーゼを使用して一部変性条件下に得られたシャープなピークパターンは、この酵素の忠実度の上昇を示す。

１．１．２実験手順
１．１．２（ａ）試料収集
患者：母系遺伝を伴うデュピュイトラン病（ＤＤ）患者（ｎ＝２０）が本研究に参加した。年齢は３７から９０歳の範囲であり、平均年齢は５６．９歳であった。患者は全て、血縁関係のない英国イングランド北西地域出身のカフカス人であった。デュピュイトラン病患者はほとんど、北西地域にあるSouth Manchester University Hospital Trust and Wrightington Hospital の手術記録臨床コードにより同定された。完全な病歴は、各患者についてプロフォーマ（proforma）を用いて得た。各個人の両手両足を調べた。全ての患者が、掌および／または指に特徴的なデュピュイトラン小塊を有し、中手指節関節（ＭＣＰＪ）または近位指間接（ＰＩＰＪ）のいずれかの拘縮を伴っており、手術前にＤＤの確定診断を受けた。

対照：対照個人（ｎ＝２０）は全て、イングランド北西の同じ地域から選ばれた、年齢、性別および民族的に一致した健常カフカス人男性及び女性であった。完全な病歴は同じく、プロフォーマ（proforma）を用いて得た。各個人の瘢痕および両手を調べ、何らかの皮膚の繊維性障害の存在を除外した。いずれの対照もＤＤの証拠を有さず、ＤＤの家族歴も報告されなかった。

地域および病院の倫理委員会が本研究を許可した。全ての個人から書面による同意を得た。

１．１．２（ｂ）ＤＮＡ抽出
標準的静脈切開技術を用いて、被験者から血液試料を収集した。全ての被験者から静脈血１５ｍＬを回収した。市販のＤＮＡ抽出キット（Qiagen, UK）を用いて、末梢血細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度を測定し、滅菌 Qiagen バッファーを用いて、１００ｎｇ／μｌ（バッファー）に希釈した。

１．１．２（ｃ）プライマー設計
ミトコンドリアゲノム全体を増幅するため、１８のプライマーのセットを設計した。それらが増幅するミトコンドリア断片の詳細は、表３に示し、プライマー配列は表４に示す。

４つのプライマーセットは単純ＤＨＰＬＣによりすぐに解析可能な断片を形成し、一方残りの１４のプライマーは、続いて制限酵素消化した後にマルチプレックスＤＨＰＬＣに用いる、８００−２０００ｂｐの断片サイズの産物を増幅した。各断片セットにつき、フォワードおよびリバースプライマーを、各プライマー５μＭの濃度で組み合わせた。

突然変異の確認に用いた配列決定プライマーは、プライマー３プログラム(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/プライマー/プライマー3_www.cgipr)を用いて設計した前述の元の増幅プライマーセットから、あるいは文献(Levin et al 1999)から得た。

１．１．２（ｄ）ＰＣＲ手順
鋳型としてゲノムＤＮＡ約１００ｎｇ、各ｄＮＴＰ２００μＭ（Cruachem Ltd）、フォワードおよびリバースプライマー各３０ｐｍｏｌ、オプティマーゼＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットおよび１．５ｍＭＭｇＳＯ_４含有１０ｘオプティマーゼ反応バッファー（Transgenomic Ltd）を含有する１００μｌの容量にて、ＰＣＲ反応を行った。 MJ research Tetrad Thermal cycler を用いて、表５に概説するサイクル条件にて増幅を行った。少量（５μｌ）のＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドで染色して紫外線光の下で可視化した２％アガロースゲルにおいて検査した。

１．１．２（ｅ）制限酵素消化
表３に示すように、様々なＰＣＲ断片を消化するため、制限酵素（Ａｌｕ１、Ｄｄｅ１、ＨａｅＩＩＩ、Ｍｂｏ１およびＭｓｐ１−New England Biolabs)を使用した。８８．５μｌのＰＣＲ産物を、適当な制限酵素バッファー１０μｌおよび制限酵素１．５μｌと混合した。試料を３７℃で２時間インキュベートし、ごく一部（１０μｌ）を、エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲルにおいて検査した。異常な制限パターンを含む試料が同定された。制限酵素消化パターンの変化によって創出されたこの断片サイズの変化は、予測したＤＨＰＬＣ解析温度を修正させ得るものであった。ミトコンドリアゲノムは比較的一定した組成を有すること、および制限酵素認識部位変異体はわずかしか同定されなかったことから、我々は解析温度を表３に示すものに変更しなかった。

１．１．２（ｆ）ヘテロ二本鎖形成
ＤＨＰＬＣ解析に先だって、全ての試料を、MJ Tetrad サーマルサイクリング装置を用いるヘテロ二本鎖形成ステップ（９５^ｏＣで５分間加熱し、その後１分につき１．５℃の速度で２５℃に到達するまで冷却することから構成される）にかけた。

１．１．２（ｇ）ＤＨＰＬＣ解析
WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System および DNASep Cartridge 技術（Transgenomic Inc, NE, USA）を使用して、表３に示す予測した温度（WAVEMAKER^TM ソフトウェア−Transgenomic Inc, NE, USA）を用いて試料解析を行った。勾配移動相はバッファーＡ（０．１Ｍトリエチル酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０）およびバッファーＢ（０．１Ｍトリエチル酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０および２５％アセトニトリル）より構成された。これらの溶出剤を混合し、バッファーＢを１２分間かけて４５から６７％の間で変化させる直線勾配を形成した。この適用に推奨されるカートリッジ洗浄方法を採用した；直線勾配の最後に７５％アセトニトリルを用いて０．５分洗浄。通常１解析につき１０−１５μｌの試料を注射した。

１．１．２（ｈ）配列決定（シークエンシング）
配列決定による突然変異の確認のためのＰＣＲを、適当なプライマーセットを用いて前述のように実行した。エタノール沈殿の前に試料に ExoSapIT を処置した。Applied Biosystems 3100 Sequencer を用いて、製造元のプロトコールに従い、サイクルシークエンシングを行った。

１．２結果
１．２．１超可変領域
３つのプライマーセット（ＭＴ１−３）は、ミトコンドリアゲノムの超可変領域（Ｄ−ループ）の大部分を増幅した。この領域は非コード領域であり、ミトコンドリアゲノムの１５８８７から６４８ｂｐに及ぶ。それは特徴的に非常に多型性である。

１．２．１（ａ）プライマー１
本プライマーセットは、１５９７４−１６４０９ｂｐの領域を増幅し、４３６ｂｐの断片を形成した。罹患および対照の試料の全体にわたり、複数かつ非特異的なＤＨＰＬＣパターンバリエーションが検出された。これらのバリエーションは、多数のランダムな突然変異を表す。単一の優勢なパターンは、いずれの試料にも存在しなかった。このことは、明らかな疾患誘発突然変異が存在しないことを示した。これらの知見は、配列決定の結果と酷似していた（表６に要約）。ＤＤ１１、ＣＷ１、ＣＷ４（ＷＴ）を代表的試料として配列決定した。

１．２．１（ｂ）プライマー２
本プライマーセットは、１６３４１−１０２ｂｐの領域を増幅し、３３１ｂｐの断片を形成した。

本領域の超可変的性質に照らして、多少驚くべきことに、ＤＨＰＬＣ解析によって患者および対照の集団の間で明らかな変化は生じなかった。いずれの試料も配列決定しなかった。

１．２．１（ｃ）プライマー３
プライマーセット３は、２９−４８０ｂｐの領域を増幅し、４５２ｂｐの断片を形成した。この４５２ｂｐの断片からの結果は、プライマーセット１により得られたものと同様であった。ＤＨＰＬＣの結果は高度のパターン変動性を示し、本領域の高度な多型性が確認された。いずれの試料にも単一の優性なパターンは存在しないことから、このことは、明らかな疾患誘発突然変異が存在しないことを示した。配列決定のデータは表６にまとめる。

１．２．２コード領域
１．２．２（ａ）プライマー４
本プライマーセットは、３６８−１７１３ｂｐの領域（６４８−１６０１ｂｐにおいて１２ｓｒＲＮＡをコード）をカバーして１３４６ｂｐの産物を形成し、その産物をＭｂｏ１により消化すると２１１、２７６、３７２および４８７ｂｐの断片が形成された。プライマー設計は、ミトコンドリア領域を確実に完全にカバーするためある程度の重複を必要とし、従ってプライマー４のはじまりは、Ｄ−ループ領域の末端部分の３００ｂｐをカバーする。

既知の突然変異ＤＥＡＦは、本領域の１５５５の位置に存在する。解析した試料に制限酵素認識部位変異体は観察されなかったが、図４および５に示すように（矢印を参照）、ＤＨＰＬＣ変異体が同定された。５つの試料を配列決定した；断片３におけるＤＤ１、ＤＤ７およびＤＤ１２のＤＨＰＬＣ変異体および断片２に潜在的挿入を有するＣＷ５。これら両方の領域の対照としてＣＷ３を配列決定した。これら試料において同定された突然変異は、表６にまとめる。

１．２．２（ｂ）プライマー５
本プライマーセットは、１６５０−２８４１ｂｐの領域をカバーして１１９２ｂｐの産物を形成し、その産物をＨａｅＩＩＩにより消化すると２７３、３９４および５２５ｂｐの断片が形成された。制限酵素認識部位変異体は観察されなかった。図６に示すように、ＤＨＰＬＣ変異体が同定された。その溶解温度のため、変異体を含有する正確な断片を同定することが難しかったことから、断片２および３を配列決定した。ＤＨＰＬＣパターン変化の代表としてＤＤ１、６およびＣＷ３の３つの試料を、本領域の参考パターンとしてＤＤ７を、配列決定した（図６）。配列決定した、試料ＤＤ１における１６９０の位置の突然変異は、ＣＷ１９と同様のＤＨＰＬＣパターンを有したことから、ＣＷ１９はこの未知の突然変異を含むようである（表６および図７）。試料ＣＷ３における１８１１ｂｐの位置の既知の突然変異（Ａ＞Ｇ）は、他の６つの試料とそのＤＨＰＬＣパターンを共有する（ＣＷ４、１０および１２；ＤＤ６、１２、２０）。

１．２．２（ｃ）プライマー６
本プライマーセットは、２４１５−３８１１ｂｐの領域をカバーして１３９７ｂｐの産物を形成し、その産物をＤｄｅ１により消化すると１２５、２１０、２７８、３４２および４４２ｂｐの断片が形成された。図９に示すように、ＤＨＰＬＣ解析により、断片５において対照集団（ＣＷ）と罹患集団（ＤＤ）との間に大きな変化が示された。本断片に、主要なピークと肩を示す対照試料と比較して、ＤＤ試料にはよりはっきりとした２ピークパターンが存在した。ＤＤ３並びにＤＤ１１および対照としてＣＷ３並びにＣＷ５の４つの試料を、配列決定のための代表として配列決定した。

２０人の患者の内、２つのＰＣＲが失敗した。全ての対照における参考パターンと比較して、１８のＤＤ試料のうち１６が変異体ＤＨＰＬＣパターンを有した（２８３９の位置のＧ＞ＧＴ）。対照はいずれも変異体パターンを有さなかった。このことは、ＧＴ変異体とＤＤの発生率との間の、顕著な一致を表す。即ち、本発明の好ましい方法は、ミトコンドリアゲノムの２８３９の位置の突然変異を検出する。

別の突然変異が、対照試料の１つであるＣＷ３においてＴ２７０６Ｃの位置に同定された。これは、配列決定したいずれの患者および対照試料にも存在しなかった。

１．２．２（ｄ）プライマー７
本プライマーセットは、３４２９−４４２８の領域をカバーして１０００ｂｐの産物を形成し、その産物をＨａｅＩＩＩで消化すると１０９、１７９、２４２および４７０ｂｐの断片が形成された。その試料に制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。図１０に示すように、ＤＨＰＬＣ解析により、興味深い可能性のある変化が、２０の罹患試料のうち７つに示された。その変化は、断片２、３または４のどこかに位置するようである。全ての陽性試料（ＤＤ１、２、５、１１、１４、１７、１８）を、対照試料としてのＣＷ１、９および１５と共に、配列解析にかけた（突然変異について表６参照）。

ＤＤ１、２、１１、１４、１７、１８は全て、参考パターンと異なるＤＨＰＬＣパターンを示した（図１０）。ＤＤ１および１４は同じパターンであるが、ＤＤ１１はこのグループの全てのパターンと異なる。

１．２．２（ｅ）プライマー８
本プライマーセットは、４１８０−５４８８ｂｐの領域をカバーして１３０９ｂｐの産物を形成し、その産物をＭｓｐＩにより消化すると１３５、２４７、３９６および５３１ｂｐの断片が形成された。本領域には、既知の既報の疾患突然変異は存在しない。解析した試料には、制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。ＤＨＰＬＣ解析により、対照の４７％に対して、患者の９４％に、２ピークパターンを有する興味深い可能性のある変化が示された（図１１）。３つの陽性試料（ＤＤ１０、１７および１８）を、参考試料としてのＣＷ２と共に、配列解析にかけた（表６参照）。

３つのＤＤ試料のうち２つが４１８０−４５２６の領域内に変化を有したことから、発明者らは、本領域がＤＤのような状態に関係するであろう突然変異を有している可能性があると考える。

１．２．２（ｆ）プライマー９
本プライマーセットは、５３４７−６３８２ｂｐの領域をカバーして１０３６ｂｐの産物形成し、その産物をＨａｅＩＩＩで消化すると１２２、１９０、２３３および４９１ｂｐの断片が形成された。本領域には、既知の疾患突然変異は存在しない。ＤＤ１２、ＣＷ３およびＣＷ１０の３つの試料が、５８３６−５８３９ｂｐの間でＨａｅＩＩＩ切断部位を破壊する、同じ制限酵素認識部位突然変異を示した（既知）。本制限酵素認識部位突然変異およびＤＨＰＬＣ変異体の例（断片４に存在）は、図１２に見ることが出来る。

１．２．２（ｇ）プライマー１０
本プライマーセットは、６３１８−７７０７の領域をカバーして１３９０ｂｐの産物を形成し、その産物をＭｓｐＩにより消化すると１１７、１６２、２５３、３５４および５０４ｂｐの断片が形成された。断片２において、ＤＤ試料は１００％が１ピークパターンを有するが、対照では２７％のみが１ピークパターンを有する。そのＤＨＰＬＣパターン変化を図１３に示す。ＤＤ患者３人（ＤＤ１、１２および２０）および対照４人（ＣＷ１、３、５および７）の、７つの試料を配列決定した。しかしながら、配列決定により、プライマー１０の断片２の配列には変化がないことが明らかとなった。

１．２．２（ｈ）プライマー１１
本プライマーセットは、７６４４−８７８４の領域をカバーして１１４１ｂｐ産物を形成し、その産物をＨａｅＩＩＩにより消化すると１４１、１８１、２１２、２４３および３６４ｂｐの断片が形成された。ＨａｅＩＩＩ部位を破壊する２つの既知の相異なる制限酵素認識部位突然変異が、我々の試料に見られた。

試料ＤＤ１０およびＣＷ１４は、制限酵素認識部位が８２５０ｂｐで破壊されている（Ｇ＞Ａ）。試料ＤＤ１２に、７９８０の位置における別の制限酵素認識部位突然変異（Ａ＞Ｇ）が見られた。試料ＤＤ１７およびＣＷ１０に、８２６９−８２７７の位置の９ｂｐの欠失（ｃａｃｃｃｃｃｔｃ）が存在する。２つの制限酵素認識部位変異体および９ｂｐの欠失は、配列決定により確認した。

１．２．２（ｉ）プライマー１２
本プライマーセットは、８６４３−９４５８ｂｐの領域をカバーして８１６ｂｐの産物を形成し、その産物をＤｄｅＩにより消化すると１８７、２３９および３９０ｂｐの断片が形成された。解析した試料に制限酵素認識部位変異体は存在しなかった。

我々は、１人の患者および２人の対照において８６９６の位置に存在する未知の突然変異（Ｇ＞Ａ）を同定した。別の点突然変異も、１人の対照においてのみ、９２６４の位置に見られた（Ｃ＞Ｔ）。他の同様のＤＨＰＬＣパターン変化は、我々の試料には存在しなかった。

１．２．２（ｊ）プライマー１３
本プライマーセットは、９３９７−１１３８７ｂｐの領域をカバーして２００１ｂｐの産物を形成し、その産物をＡｌｕ１により消化すると２４８、３１２、３６６、４８７および５８８ｂｐの断片が形成された。既知の疾患突然変異は存在しない。９６４３−９６４７ｂｐのＡｌｕ１部位を破壊する２つの制限酵素認識部位変異体（既知）、ＤＤ１７およびＣＷ３、が同定された。

１．２．２（ｋ）プライマー１４
本プライマーセットは、１１３２２−１２５８２ｂｐの領域をカバーして１５３１ｂｐの産物を形成し、その産物をＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩにより消化すると１７８、３６６、４３５および５５２ｂｐの断片が形成された。ＬＨＯＮ疾患（レーバー遺伝性視神経症）についての既知の突然変異（Ｇ１１７７８Ａ）が存在する。本領域に制限酵素認識部位変異体は存在しない。

１．２．２（ｌ）プライマー１５
本プライマーセットは、１２７５３−１３２６４ｂｐの領域をカバーして５１２ｂｐの産物を形成する。これは、５９℃で制限酵素消化なしに解析される単純ＤＨＰＬＣ断片であった。罹患および対照の集団の間で、ＤＨＰＬＣパターンに明らかな変化は存在しなかった。

１．２．２（ｍ）プライマー１６
本プライマーセットは、１３１７２−１４６１０ｂｐの領域をカバーして１４３９ｂｐの産物を形成し、その産物をＡｌｕＩおよびＤｄｅ１により消化すると１２９、１７７、２８９、３８２および４６２ｂｐの断片が形成された。ＬＨＯＮ疾患（レーバー遺伝性視神経症）についての２つの既知の疾患突然変異（Ａ１４４９５ＧおよびＴ１４４８４Ｃ）が存在した。３つの制限酵素認識部位変異体が本領域に存在する。はじめの２つは、既知の突然変異である；第１のものはＣＷ４に見られ、１４０１４−１４０１７のＡｌｕ１部位を破壊し、第２は１４３０３−１４３０６のＡｌｕ１部位に存在する。Ｄｄｅ１部位（１４４３３−１４４３７）を破壊する第３の制限酵素認識部位変異体は未知であり、試料ＣＷ６に見られ、それは試料ＣＷ１９における異常なＤＨＰＬＣパターンと共に図１４に示される。

１．２．２（ｎ）プライマー１７
本プライマーセットは、１４４２７−１５５９０の領域をカバーして１１６４ｂｐの産物を形成し、その産物をＭｂｏＩにより消化すると１９１、２３５、２９７および４４１ｂｐの断片が形成された。Ｍｂｏ１部位（１４８６８−１４８７１）を破壊する制限酵素認識部位変異体が３つ、ＤＤ１２、ＣＷ１３およびＣＷ２０に同定された。ＤＤ８において同定された突然変異を表６に示す。

１．２．２（ｏ）プライマー１８
本プライマーセットは、１５４２４−１６４５１の領域をカバーして１０２８ｂｐの産物を形成し、その産物をＡｌｕＩにより消化すると２１８、３５３および４５７ｂｐの断片が形成された。既知の突然変異は存在しないが、断片２（１５４２４−１５７７６）にＡｌｕ１部位を創出してこれを１６５および１８８ｂｐの産物に分割する制限酵素認識部位変異体（ＡＧＣＴ）が３つ、ＤＤ１７、ＣＷ９およびＣＷ１１に同定された。

ＤＤ１７の配列決定により、１５６０６（Ａ＞Ｇ）および１５４５１（Ｇ＞Ｔ）の位置に突然変異が同定された。

表６に、実施例１においてミトコンドリアゲノム全体にわたり同定された突然変異をまとめる。

１．３考察
１．３．１突然変異
１．３．１（ａ）Ｄ−ループまたは超可変領域（プライマー１−４）
超可変部位がヒトｍｔＤＮＡの非コード領域に存在することは、過去に十分に立証されている。超可変部位は、生殖細胞および体細胞突然変異が優先的にこの部位で起こることから、突然変異ホットスポットを表すと考えられている。本領域は、肺、膀胱および頭頚部癌における突然変異ホットスポットであることが発見された。本領域における突然変異は、ｍｔＤＮＡの複製および発現のための調節部位としてのＤ−ループの機能に関係する可能性がある。これら超可変部位をそのような突然変異ホットスポットとするそれら独自の特徴は、未だ知られていない。

プライマー１から３は、Ｄ−ループ領域の大部分をカバーし、末端３００ｂｐはプライマー４によりカバーされる。プライマーセット１および３についてのＤＨＰＬＣ解析全体にわたり数多くのシフトおよびパターン変化がランダムに存在することが観察された。このことは配列決定データに反映されており、そこでは対照および患者試料の両方に多くの変化が見られた。全体として、これらプライマーセットにおいては、疾患特異的突然変異は見られなかった。

プライマー１において、我々は、ＤＤ患者に１０の未知の突然変異、５つの点突然変異および５つのヘテロプラスミックな突然変異を、および対照に２つの未知の点突然変異を発見した。我々はまた、患者に２つおよび対照に１つの、既知の点突然変異を発見した。

プライマー２においては、ミトコンドリア多型リファレンスデータベース（http://infinity.gen.emory.edu/mitomap.html）において本領域に２０以上の突然変異が報告されているものの、明らかなＤＨＰＬＣパターン変化は存在しなかったので、いずれの試料も配列決定しなかった。ＤＨＰＬＣパターンを比較、例えばプライマー１と２との間で比較すると、プライマー２解析において変動性が顕著に減少していることが示され、また、特に、大きなパターン変化またはシフトは同定されなかった。さらに、これら既報の変化は、我々の試料集団には実際には存在しない可能性がある。

プライマー３において、対照に２つの未知の点突然変異が同定された。我々は、プライマー４において、２つの既知の、および１つの未知の突然変異を同定し、それらの位置はそれらがＤ−ループ領域に属することを示した。患者２０人のうち２人だけがこのＤＨＰＬＣパターンを示し、対照ではいずれにも存在しなかった。これは、配列決定により確認された。結論として、Ｄ−ループ多型とＤＤの間には、強い相互関係は存在しない。

１．３．１（ｂ）リボソームＲＮＡ−ｒＲＮＡ１２ｓ、１６ｓ（プライマー４−６）
プライマー４は、１２ｓｒＲＮＡを完全にカバーする。プライマー５は１６ｓｒＲＮＡの大部分をカバーし、１６ｓｒＲＮＡのはじめおよび終わりはプライマー４および６にそれぞれカバーされる。我々は、１２ｓｒＲＮＡ領域には突然変異を発見しなかった。この領域は超可変領域のように突然変異ホットスポットではなく、突然変異の発生率がより低いという事実から見て、このことは驚くべき知見ではない。しかしながら、１２ｓｒＲＮＡ領域には、以下を含む疾患突然変異が報告されている；ＳＮＨＬ（１０９５Ｃ）、ＤＭ（１３１０Ｔ，１４３８Ｔ）およびＤＥＡＦ（１５５５Ｇ）。

既知の突然変異が１６ｓＲＮＡの１８１１ｂｐの位置に同定され、それは３人の患者および４人の対照に存在した。さらに、１人の患者において、ある対照におけるものと同様のＤＨＰＬＣパターン示す（同じ配列のようである）未知の突然変異が、１６９０の位置に同定された。これら両方の突然変異（１６９０および１８１１ｂｐ）の患者および対照間の分布は、ＤＤに対して何ら意義を示さないようである。

２８３９ｂｐの位置において、ミトコンドリアの１６ｓｒＲＮＡ領域におけるＧからＧ／Ｔ塩基対への変化である未知のヘテロプラスミックな突然変異が同定された。そのＤＨＰＬＣパターン変化は、約９０％の患者において非常に明らかであり、いずれの対照にも存在しなかった。前述のように、本突然変異は、ＤＤと顕著な関連を示した。つまり、本突然変異は、本発明方法により検査することができる最も好ましい突然変異を表す。

新規な突然変異が１人の対照においても同定され、それは配列決定した他の試料のいずれにも存在しなかった。本ＤＨＰＬＣパターンの普及率およびその著しい患者および対照間の区別化は、潜在的に疾患関連性を示しうる。１６ｓｒＲＮＡにおけるヘテロプラスミックな突然変異は、ミトコンドリアのタンパク質合成を変化させると推測される。

他の既知の突然変異が、１６ｓｒＲＮＡ領域において報告されている。これらは、以下のものを含む：レット症候群（２８３５Ｔ）、ＭＥＬＡＳ（３０９３Ｇ）およびＡＤＰＤ（３１９６Ａ）。

１．３．１（ｃ）ｔＲＮＡ
我々は、５８３７ｂｐにおけるＨａｅＩＩＩ制限酵素認識部位が破壊された結果相異なる断片分布となる３つの試料（ＤＤ１人および対照２人）を発見した。切断配列はＧＧＣＣであった。この突然変異の位置は、ＮＤ２とＣＯＩとの間のｔＲＮＡコード領域内に含まれる。マイトマップ（ｍｉｔｏｍａｐ）データベース（http://www.gen.emory.edu/cgi-bin/MITOMAP/bin/tbl9gen.pl）においてミトコンドリアＤＮＡ塩基置換疾患をｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ突然変異について検索すると、５８３７の位置の突然変異はこれまでに報告されていないことがわかった。この突然変異は、我々の試料においては比較的頻度が低く、我々の患者および対照の両方に存在するので、これはＤＤとは関連がないようである。

１人の患者および１人の対照において、未知の９ｂｐの欠失がｔＲＮＡ（Ｋ）の位置にあたる８２６０−８２７７の位置に発見された。興味深いことに、８２７１−８２８１の位置における９ｂｐの欠失が以前に報告されている(http://www.gen.emory.edu/cgi-bin/MITOMAP/bin/tbl10gen.pl)；しかしながら、この既報の欠失は、我々の発見したものと重複するものの、全く同じ位置ではない。掌蹠角皮症（ＰＰＫ）に関連する既報の突然変異（Ａ７４４５Ｇ）が、この領域内に存在する。ＰＰＫは、掌および足底に影響し、不均一な遺伝的皮膚疾患と推測される。

１．３．１（ｄ）ＯＸＰＨＯＳポリペプチドサブユニット
複合体Ｉ：（プライマー７、８、１３、１４、１５、１６）
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）鎖１−６（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）
我々は、９４％の患者において、対照では４５％にしか存在しない、目立ったＤＨＰＬＣパターンをＮＤ２領域に発見した。我々はまた、２人の患者において、同じくＮＤ２領域に存在する２つの新規な突然変異をＡ４９１６ＧおよびＧ５０４５Ａの位置に発見した。

ＮＡＤＨ−キノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖の３つのエネルギー伝達酵素複合体の１つである。それは、呼吸鎖を移動し最終的に酸素を還元する電子の大部分が入るポイントである。複合体Ｉは、現在知られる最も複雑な膜結合酵素の１つと推測され、少なくとも４３の異なるポリペプチドにより構成される。これらのうち、７つがｍｔＤＮＡによりコードされる。

１４０１５の位置におけるＡｌｕＩ制限酵素認識部位変異体が、１人の対照に発見された。これは、ＮＤ５領域における既知の突然変異である。別の点突然変異であるＡ１３２２０Ｃもまた、１つの対照試料においてＮＤ５に発見された。ＮＤ５領域における我々の突然変異はいずれも罹患集団には存在しなかったので、疾患と関連しないと思われる。

我々は、ＮＤ６領域に、対照試料にしか存在しない３つの相異なる突然変異を同定した。１４３０３の位置における既知のＡｌｕＩ制限酵素認識部位変異体、および別の対照試料における１４４３３の位置の新規なＤｄｅＩ制限酵素認識部位変異体を発見した。１つの対照試料において、Ａ１４５８６Ｇの位置に、一塩基対突然変異を同定した。我々の罹患試料には突然変異は存在しなかったので、ＮＤ６領域はＤＤと関連しないようである。

多くのヒトミトコンドリア疾患が、酵素複合体Ｉのレベルでの構造的および機能的異常に関与する。ＭＥＲＲＦ（myoclonic epilepsy and ragged red fibers）、ＭＥＬＡＳ（mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes）、慢性外眼筋麻痺プラス（Chronic External Ophthalmoplegia Plus、ＣＥＯＰ)、Kearns-Sayre 症候群（ＫＳＳ）を含む様々な神経筋疾患；およびレーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）の症状は、複合体Ｉの異常に関連するようである。そのような患者のほとんどで同定された異常は、ｍｔＤＮＡにおける点突然変異である。

複合体ＩＩ：コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体
本複合体は、核ＤＮＡによりコードされるので、ｍｔＤＮＡ全体のスクリーニングの一部としては走査されない。

複合体ＩＩＩ：Ｃｙｔｂ（プライマーＰ１７、１８）
シトクロムｂ−ｃ１複合体ユビキノール−シトクロムｃレダクターゼシトクロムｂ−ミトコンドリア
我々は、２人の患者において、非常によく似たＤＨＰＬＣパターンを示す複数の新規な突然変異を同定した。これらの配列変化は、我々の対照のいずれにも存在しなかった。配列決定によって発見された変化の大部分は、ヘテロプラスミーが新たに存在することを明らかにし、それには、Ｇ１５２７４Ｃ／Ｇ；Ａ１５２８２Ｃ／Ａ；Ｇ１５３１９Ｃ／Ｇ；Ｔ１５３３２Ｃ／Ｔ；Ｇ１５３３６Ｇ／Ｃ；Ｔ１５３３９Ｔ／Ｃ；Ｔ１５３６２Ｃ／Ｔおよび１５４３４ｉｎｓＣが含まれた。これら変化は全て、Ｃｙｔｂ領域におけるものであった。既知の制限酵素認識部位変異体もまた、１人の患者および２人の対照においてＭｂｏＩ１４８６９の位置に同定された。我々の患者において同定された複数の未知のヘテロプラスミックな突然変異は存在の頻度は低いものの、我々の対照には存在しないので、本疾患と何らかの関連を有する可能性がある。制限酵素認識部位変異体は対照集団においてより多く存在することから、その存在は疾患特異的ではない。

複合体ＩＶ：シトクロムｃオキシダーゼ鎖Ｉ−ＩＩＩ（ＣＯＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）（プライマー９、１０、１１、１２、１３）
我々は、我々の試料において、ＣＯＩ領域の６６８８および６８４９に目立ったＤＨＰＬＣパターン変化を発見した。全ての患者が野生型シングルピークパターンを有するのに対して、対照試料では２７％のみが同様のパターンを有した。配列決定によってこの領域内に明らかな塩基対置換が見られなかったのは驚くべきことである。１つには、本突然変異が配列決定によって同定するにはレベルが低すぎることが考えられる。

配列決定によって、ＣＯＩＩ領域に位置する２つの制限酵素認識部位突然変異が確認された。８２５０の位置における制限酵素認識部位突然変異は、１人の患者および１人の対照にのみ存在する。１人の患者において、単一の制限酵素認識部位突然変異が７９８０の位置に発見された。本領域における当該突然変異の頻度および分布は、疾患に関連するというには十分でない。

複合体Ｖ：ＡＴＰアーゼ合成酵素タンパク質６＆８（プライマーＰ１１、１２）
１人の患者および２人の対照において、Ｇ８６９６Ａの位置にＤＨＰＬＣパターン変化が同定され、それは配列決定によって確認された。これは、ミトコンドリアゲノムのＡＴＰアーゼ６の領域に位置した。既知の疾患突然変異であるＮＡＲＰ（Neurogenic weakness, ataxia and retinitis pigmentosa）（Ｔ８９９３Ｇ）が、本領域に存在する。我々は、我々の発見した突然変異は患者間の普及率が低いことから、ＤＤに関連しないと推測する。

様々な状態が、ミトコンドリア遺伝子における突然変異と関連している。これら遺伝子の幾つかは、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）またはｍｔＤＮＡのいずれかに存在する。ミトコンドリア障害における遺伝パターンもまた、母系、メンデル、およびその２つの組み合わせと多岐にわたり得る。我々は、我々の患者および対照に関して、突然変異の存在について母系遺伝家系においてｍｔＤＮＡのみを調べた。患者の９０％以上に存在し対照には存在しない１６ｓｒＲＮＡ領域における新規多型の同定は、重要な発見である。この突然変異が病的であり、ミトコンドリアタンパク質合成を妨害することにより酸化的リン酸化異常を引き起こす可能性があることが考えられる。

１．３．２技術
マルチプレックスＤＨＰＬＣ技術（Van den Bosch ら、２０００）を用いてミトコンドリアゲノムにおいて突然変異を同定する元の技術は、診断的見地から突然変異検出の問題を扱った；何らかの診断的突然変異を見逃す可能性は無視できる程度であろう方法で、少数の試料を走査する。これはどのような突然変異検出計画にとっても理想的な結果であるが、全ての突然変異を発見するというこの理想は、複数の試料について大きなゲノム領域を走査する場合必ずしも現実的ではない。しかしながら、ＤＨＰＬＣは、検出手段の自動化のため試料サイズについて、または非位置依存的様式にて突然変異を発見するその能力のため精度について、妥協する必要がほとんど無いので、このような走査計画を行うには最良の方法である。盲検解析の論文は繰り返し、ＤＨＰＬＣを用いる突然変異の発見には９５−１００％の効率があるとしている。ヘテロプラスミックな突然変異の存在を検出することに関して重要なことに、突然変異を示唆するヘテロ二本鎖の存在が少量でも検出できる能力についても、報告されている。

突然変異のＤＨＰＬＣ検出は、解析するヒトゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に依存する。全ての酵素のように、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、約８．０ｘ１０^−６から２ｘ１０^−４の固有の誤り率を有する。Ｔａｑポリメラーゼによるこれらの誤取り込みは、修正されずに残り、その後続く増幅ラウンドで複製される。これに対し、プルーフリーディングポリメラーゼ酵素（ＰｆｕおよびＰｗｏ）は、約１．３ｘ１０^−６の低い誤り率を有する。増幅の際に導入された各誤りは、ランダムな低レベルの突然変異と同等であると考えることができる。通常の突然変異検出システムでは、これらの誤りは、ＰＣＲ増幅の更なるラウンドで複製されるものの、本来のヘテロ接合体突然変異よりも非常に低いレベルであろう。このため、ＰＣＲ酵素の忠実度は、テンプレートレベルが低くＰＣＲサイクル条件が過剰である極端な場合を除き、通常の突然変異検出では重要な問題ではないかもしれない。しかしながら、野生型と変異体アリルの割合が等しくないＤＮＡ集団において突然変異を検出する場合（例えば、腫瘍試料またはミトコンドリア検出）、酵素の忠実度は、より重要な役割を果たすであろう。極端な場合、突然変異のレベルとＰＣＲ酵素による誤取り込みの誤りが同程度であり得る。

Ｔａｑ酵素による誤取り込みは、ＤＨＰＬＣクロマトグラムによって、その断片の解析温度において主要なピークに対する特徴的な肩として可視化される。ＤＨＰＬＣは、突然変異を参考パターンに対する変化とみなす−突然変異陽性の見なしは、常に定まったピークパターンではない。これら後者２つの事実をあわせると、主要な参考ピークの前の誤取り込みのピークによって隠れてしまう可能性がある非常に小さな変化がパターンに起こる場合があることを意味し得る。このため、特にミトコンドリアゲノムを走査するにあたり、我々は、市販の他のプルーフリーディングおよびＴａｑ基盤ポリメラーゼと比較して誤取り込みレベルが最低であることが示されている、新規なプルーフリーディングポリメラーゼ（Optimase^TM DNA polymerase, Transgenomic Inc, NE, USA）を使用することを選択した。図Ｙ５は、多くの市販の酵素を使用して形成されたヘテロ二本鎖の割合を計算することによって、この比較を示す。

ＰＣＲ増幅の基質として、４０人の患者および年齢、性別の一致した対照の試料からゲノムＤＮＡを単離した。血液試料の取得は、組織解剖と比べて比較的非侵襲的であり、その上適当な量の材料を得ることができる。しかしながら、ミトコンドリア症候群に関して重要なことに、ミトコンドリア関連疾患に関して組織特異的発現が存在する場合があることである。それ故、血液においては最高の突然変異レベルが発見できない可能性がある。しかしながら、好ましいこととして、病的なｍｔＤＮＡ突然変異はヘテロプラスミックなようであり、このため、ヘテロ接合体状態が存在することを確かめるため、ひいては突然変異を検出するため、試料を参考（野生型）試料と混合する必要があるとは思われなかった。更に、ミトコンドリアゲノム内の突然変異率が比較的高いことからして当然、真の野生型を発見するのは、必要ではあるが不可能であろう。

我々は、オプティマーゼポリメラーゼを用いて、全部で１８の重複する断片によりミトコンドリアゲノムを増幅することを選択した。これら断片のうち４つは「通常の」ＤＨＰＬＣにかけるように設計されており、大きさは３３１から５５０ｂｐに及ぶ。特に、これら断片の内３つは超可変領域に及ぶ；これらを個々のＰＣＲ反応に分割すると、本方法によるＤＨＰＬＣ認識および確認が容易になるであろう。該ゲノムのコード領域の残りをカバーする残りの１４のＰＣＲ反応は、５つの制限酵素の組み合わせによる制限酵素消化を受け、ある温度範囲で解析されるマルチプレックスＤＨＰＬＣ断片の組み合わせを形成する。ミトコンドリアゲノムは、比較的一定のＧＣ組成を有し、このことは、このようなＤＨＰＬＣ走査に必要な温度範囲を通常他のゲノムについて必要とされるであろうものよりも小さくする。また、突然変異を位置付ける際のＤＨＰＬＣの正確さは、主にある温度範囲にわたり突然変異を発見するその能力に起因しうるとも言える。元の技術において注目すべきは、１℃間隔で走査を繰り返すことを選択する点である。我々は、この走査のレベルは慎重過ぎ、患者の診断に関する確実性が重要な診断方法については許容され得ると考える。プライマーセットの再設計と併せて非常に大きい温度枠でなければ少なくとも２−３℃にわたり突然変異を検出できる能力により、ミトコンドリアゲノムの全ての断片を走査するための温度の選択を、相異なる６５の解析から２９の条件まで狭めることが可能となる。

ＤＨＰＬＣを突然変異検出について利用する場合に考慮すべき重要な基準は、突然変異をパターンにおける個別の変化とみなせる確信があることである。突然変異の発見の最高の効率は、このパターン変化の見なしがその最も単純なレベルで行われる場合に達成される。重要なことに、ピークの形の小さな変化でさえも、突然変異の存在に相当する場合がある。得られたパターンは、塩基変化、局所および全体の断片配列の状況に依存することが示されているので、パターン変化を特定のＤＮＡ塩基または位置の変化と定めるのは、走査との関係で厳密に可能とは言えない。このことは、前述の理由により、ミトコンドリア集団において突然変異の位置を定めるのに関してより一層重要であると論じられる可能性がある。さらなる困難は、通常配列決定により通常起こる突然変異の確認である。配列決定は、各塩基位置を見て、その位置において優勢な塩基を、読まれた正しい配列と見なすであろう。それが１つの位置において２つの塩基を「見た」場合、その塩基をＮと見なす；その後エレクトロフェレトグラム（electropheretogram）をチェックすれば、その位置のヘテロ接合体的性質が決定されるであろう。残念なことに、ある位置の塩基の規模が等しくない場合、それはＮと表されない場合がある。配列決定は、３０％未満のヘテロ接合性を認識するのが難しいことが示されている。それ故、我々は本研究に関して、非常に低いレベルまで突然変異を検出できる可能性があるものの、配列決定による確認が困難であるという状況にある。これは、ある程度までは、配列読み取りを個々にチェックして、ヘテロプラスミーを検出することにより回避されている；この証拠が、プライマー６におけるヘテロプラスミックな突然変異の同定である。極端な場合では、他の文献は、変異体の可能性のあるＤＮＡをクローニングし、そして多数の個々のクローンを配列決定して可能性ある変異体を確認することが必要であることを示した。それに代わる方法は、正しく配列の見なしが得られるレベルを期待して、変異体ＤＮＡのヘテロ二本鎖部分を収集し、それにより配列決定集団を変異体アリルについて濃縮するものであろう。

１．３．３Ｇ２８３９Ｇ／Ｔ変異体の妥当性
新規突然変異の有害な役割を支持するについて、４つの主要な基準が存在すると考えられる。第１に、突然変異は、中立の多型であってはならない；第２に、塩基変化は、進化において保存され、かつ機能的に重要な領域に、影響を及ぼさなければならない；第３に、有害な突然変異は、通常ヘテロプラスミックでなければならず、第４に、相異なる家族メンバーにおけるヘテロプラスミーの程度は、症状の重症度と一致しなければならない。

第１の基準に関して、我々は既存のミトコンドリアデータベースを調べたが、Ｇ２３８９Ｇ／Ｔ突然変異の位置を見つけることはできなかった。それ故我々は、それが新規な多型を表すと考える。ＤＤとの関連は明らかだが、我々はこの特定の多型の機能的重要性について確信がもてない。その機能的および進化的重要性を決定すべく、いまだバイオインフォマティック検索を行っている最中である。この特定の多型はヘテロプラスミックであり、我々の対照集団には存在しない。我々の家系内のヘテロプラスミーの程度は測定されていないが、我々の家系の幾つかの罹患メンバーの臨床試験により、ＤＤにおける様々な表現型発現が示されている。

呼吸鎖の機能障害をもたらすミトコンドリア突然変異は病的である。しかしながら、ｍｔＤＮＡおよび罹患障害における遺伝子型および表現型の関係は理解が難しい。結果としてエネルギー危機をもたらす代謝経路における異常が、なぜそのような一連の症状を伴い、また様々な組織および臓器に存在し得るのかは不明である。同じｍｔＤＮＡ突然変異が非常に異なる表現型を生じる場合があり、相異なる突然変異が同様の表現型を生じる場合がある。これは、変異体ｍｔＤＮＡに対する野生型の様々な比率、他のミトコンドリアおよび核遺伝子の調節作用、および関与する組織および特定の突然変異についての生化学的発現の相異なる閾値に起因するのかもしれない。

ｍｔＤＮＡにおける塩基変化の蓄積は、短い時間スケールの間に起こり、同じ広範な人種背景の集団、例えばカフカス人、に多型を生じる。相異なるヒト集団を区別するｍｔＤＮＡ多型および個人におけるヘテロプラスミック多型が存在する。しかしながら、ほとんどの個人はホモプラスミックであり、これは卵母細胞の発達における厳しいボトルネックに起因すると考えられる。

実質的な突然変異を有するｍｔＤＮＡはより迅速に複製するため、正常なｍｔＤＮＡを上回る選択優位性を有すると考えられている。このことは、筋肉のような特別な組織に、肝臓のような突然変異の比率が低い他の組織と比較して、変異ｍｔＤＮＡが高い比率で存在するという知見を説明し得る。筋肉において、変異ｍｔＤＮＡの割合は、年齢とともに増加すると考えられる。生後筋肉繊維の総数が目に見えて変化しないならば、ｍｔＤＮＡ複製は細胞分裂と切り離され、変異ｍｔＤＮＡを有する異常細胞についての陽性選択が存在することになる。発症の年齢のバリエーションは、出生時に存在するｍｔＤＮＡの割合および出生後は正常ｍｔＤＮＡに対する変異ｍｔＤＮＡの蓄積率に起因すると考えられる。

数多くの興味深い研究により、ミトコンドリア疾患の将来的処置についての証拠が得られた。ＰＮＡは、変異体ｍｔＤＮＡに選択的に結合してｍｔＤＮＡ複製を阻害することが示されている、配列特異的ペプチド核酸である。これらの物質は、その細胞において変異体ｍｔＤＮＡの割合を亜閾値（sub-threshold）レベルまで減少させ、その結果ミトコンドリアの生化学的異常の修正をもたらし得る。

１．４結論
母系伝達遺伝パターンを有する２０人のデュピュイトラン病患者および２０人の対応するカフカス人対照におけるミトコンドリアゲノム全体の走査に、強化マルチプレックス熱変性高速液体クロマトグラフィー（Denaturing High Performance Liquid Chromatography、ＤＨＰＬＣ）技術を用いた。

我々は、この方法を用いて、数多くの既知の突然変異を確認し、より重要なことに、幾つかの未知の突然変異を同定した。これら新規の突然変異の一部は、ＤＤ患者のみにおいて、Ｄ−ループ領域および複合体Ｉ、ＩＩＩおよびＶに存在した。

より興味深いことに、１６ｓｒＲＮＡ領域におけるＧからＧ／Ｔへの塩基対変化である、２８３９ｂｐの位置における未知のヘテロプラスミックな突然変異は、約９０％のＤＤ患者において非常に明らかであり、対照ではいずれにも存在しなかった。この突然変異は、組織特異的様式にて、ミトコンドリアタンパク質合成に影響する可能性がある。

我々のＤＨＰＬＣ技術は、ミトコンドリア突然変異を予測する強力かつ正確な方法であり、我々は、既知の、および幾つかの新規な疾患関連突然変異を同定することができた。患者に対して将来的な予後的および診断的助言を与えるため、およびこの状態を処置するための新規治療法を開発するため、デュピュイトラン病の詳細な遺伝子基盤を理解することが重要である。これは、ＤＨＰＬＣを用いてＤＤおよびミトコンドリア突然変異を研究した最初の報告である。

実施例２
不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態と２８３９ｍｔＤＮＡ多型により与えられる遺伝子型との間の一致を確証するため、実施例１の方法論を繰り返して本発明の第一の局面の方法に従い被験者を走査し、被験者の遺伝子型を確立した。

その後、本遺伝子検査の結果を臨床医が用いて、その突然変異を有する個人に医学的助言を与えることができるであろう。例えば、該変異体アリルを有することがわかった無症候の個人に、不適当な瘢痕形成および線維症によって特徴付けられる状態を発症する危険性が高いことを助言することができるであろう。適すれば、そのような個人に、ライフスタイルを変え、かつ／または予防的処置を受けるよう助言することができるであろう。既に不適当な瘢痕形成および線維症によって特徴付けられる状態を患っている２８３９突然変異を有する個人には、該状態をより重度の形態で発症する危険性が潜在的にあるので、彼らの薬物療法および習慣を調節するよう助言することができる。

例示のみを目的に、添付の図面を参照して本発明をさらに説明する。

図１は、実施例１で用いた、改変した Van Den Bosch ら（Nucleic Acids Res 2000 Oct 15; 28(20): E89)、前述）のＤＨＰＬＣ技術の略図である。図２は、実施例１において増幅のため使用したプライマーセットの位置を示すミトコンドリアゲノムの略図である。図３は、プライマーセット２によるミトコンドリアゲノム由来の３３１ｂｐの産物の増幅を示し、実施例１で用いたオプティマーゼポリメラーゼの、エクスパンドＤＮＡポリメラーゼ（Roche）と比較して増強された忠実度を示しており、ここでグラフ内のトレースは、上から下へ、エクスパンド２、エクスパンド２、Ｐｈｏ１２およびＰｈｏ１２を表す。図４は、プライマーセット４を用いて断片３に同定されたＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフであり、ＤＤ１における野生型パターンと比較したＤＤ７およびＤＤ１２におけるものであり、ここでグラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＤＤ７、ＤＤ１２およびＤＤ１における変異体を表す。図５は、実施例１において、プライマーセット４を用いて断片３に同定されたＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、ＣＷ１９および比較したＣＷ１３を示す。図６は、実施例１において、プライマーセット５を用いて同定したＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＤＤ７、ＤＤ１およびＣＷ３を示す。図７は、実施例１において、プライマーセット５を用いて同定した１６９０ｂｐにおける突然変異を示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＤＤ１、ＣＷ１９およびＤＤ７を示す。図８は、実施例１において、プライマーセット５を用いて同定した１８１１ｂｐにおける突然変異についてのＤＨＰＬＣを示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、ＤＤ６、ＤＤ１２、ＤＤ２０、ＣＷ３、ＣＷ４、ＣＷ１０、ＣＷ１２およびＤＤ７を示す。図９は、実施例１のプライマーセット６を用いて同定された断片５における強化二重ピークパターンとして明らかな突然変異について、罹患試料対対照試料を示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＤＤ５およびＣＷ３を示す。図１０は、実施例１において、プライマーセット７を用いて同定されたＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ１１、ＤＤ１４、ＤＤ１７、ＤＤ１８およびＤＤ５である。図１１は、実施例１において、プライマーセット８を用いて同定されたＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフである。図１２は、実施例１において、ＤＤ１２、ＣＷ３およびＣＷ１０に、プライマーセット９を用いて断片４に同定されたＤＨＰＬＣ変異体を示すグラフである。図１３は、実施例１において、プライマーセット１０を用いて同定された、全てのＤＤ試料に見られるのに対して対照（ＣＷ）では８３％のみが有する１ピークパターンを示すグラフであり、ここで、グラフ内のトレースは、上から下へ、それぞれＣＷ５およびＤＤ１である。図１４は、実施例１において、ＣＷ４およびＣＷ６に、プライマーセット１６を用いて同定されたＤＨＰＬＣ制限酵素認識部位変異体を示すグラフである。

Claims

デュピュイトラン病の素因を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、対象の被験者に由来するミトコンドリアゲノムの１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の２８３９の位置の周辺の領域を調べて該疾患の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
ミトコンドリアゲノムの２８３９の位置におけるグアノシンヌクレオチド（Ｇ）の後ろへのチミジンヌクレオチド（Ｔ）の挿入（Ｇ２８３９Ｇ／Ｔ）を調べる、請求項１記載の方法。
被験者から採取した血液または組織試料からミトコンドリアＤＮＡを単離し、そして調べて、該疾患の発症に関連する遺伝子多型または突然変異の存在を検出する、請求項１または２に記載の方法。
ミトコンドリアＤＮＡを調べて遺伝子多型または突然変異の存在を検出する前にミトコンドリアＤＮＡを増幅する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてミトコンドリアＤＮＡを増幅する、請求項４に記載の方法。
配列番号９および１０のＰＣＲプライマー対を利用してミトコンドリアＤＮＡを増幅する、請求項５に記載の方法。
ミトコンドリアゲノムを制限酵素消化およびサイズ解析によって調べる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
以下のものを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法に使用するためのキット：
Ａ）デュピュイトラン病に関連するミトコンドリア１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の２８３９の位置の周辺の領域における遺伝子多型または突然変異を増幅するためのＰＣＲプライマー、および、
Ｂ）各多型または突然変異のための既知の遺伝子型の対照ＤＮＡ試料。
ＰＣＲプライマーが請求項６に規定されるものである、請求項８記載のキット。
ＤＮＡ断片を形成するための適当な制限酵素をさらに含む、請求項８または９に記載のキット。
特定の多型とデュピュイトラン病との間の関連の概要をまとめるデータカードおよび／またはＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素消化およびＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコールをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のキット。