KR20070115336A - 당뇨 망막증 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당뇨 망막증 진단 키트에 관한 것으로 더욱 상세하게는 당뇨망막증에 특이적 혈관내피성장인자와 혈관내피성장인자 수용체 1의 유전자형을 이용한 진단 키트에 관한 것이다.
당뇨 망막증, 진단 키트
Description
도 1 내지 3은 본 발명의 PCR 반응 조건과 이를 통해 생성되는 단편의 서열을 나타낸 그림이다. 그림에서 방향은 (5'→ 3')이고, ▼로 표기된 부위는 각 단편에 따라 Bsr I 또는 NSP I에 의해 절단되는 부위이고 대문자로 표시되는 부분은 Bsr I 또는 NSP I가 인지하는 서열이다. 밑줄 친 부위는 프라이머의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 염기는 '변이서열'이다.
도 4는 전기 영동 결과의 DNA 패턴을 나타내는 젤 사진이다. 젤 사진에서 좌측부터 1번 레인은 vfr1의 G 유전자형을 보이는 사람, 2: vfr1의 A 유전자형을 보이는 사람, 3: vfr1의 PCR 생성물, 4: vf2의 T 유전자형을 보이는 사람, 5: vf2의 C 유전자형을 보이는 사람, 6: vf2의 PCR 생성물, 7: vf1의 T 유전자형을 보이는 사람, 8: vf1의 C 유전자형을 보이는 사람, 9: vf1의 PCR 생성물을 가장 우측은 마커를 나타낸다. 도 4에서 vf1은 절단된 아주 짧은 2종류의 밴드가 관찰되거나 밴드가 보이지 않으면, 이는 제한효소 위치에 T 유전자형(lane 7)이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 1 종류의 밴드가 나타나면 NSP I 제한효소 절단부위가 사라진 C 유전자형(lane 8)이 있는 것이다. 이때, T 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다. vf2는 절단된 짧은 3종류의 밴드가 관찰되 면, 이는 제한효소 위치에 T 유전자형(lane 4)이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 2 종류의 밴드가 나타나면 Bsr I 제한효소 절단부위가 사라진 C 유전자형(lane 5)이 있는 것이다. 이때, T 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다. vfr1은 절단된 짧은 4종류 이상의 밴드가 관찰되면, 이는 제한효소 위치에 A 유전자형(lane 2)이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 3 종류의 밴드가 나타나면 Bsr I 제한효소 절단부위가 사라진 G 유전자형(lane 1)이 있는 것이다. 이때, A 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다.
본 발명은 당뇨 망막증 진단 키트에 관한 것으로 더욱 상세하게는 당뇨망막증에 특이적 혈관내피성장인자와 혈관내피성장인자 수용체 1의 유전자형을 이용한 진단 키트에 관한 것이다.
일반적으로 서구적 식습관 등으로 인하여 당뇨 및 그에 따른 당뇨망막증으로 인한 실명의 비율이 점점 증가하고 이에 따른 의료비 부담이 증대되고 있다.
당뇨망막증은 2003년 기준 한국의 당뇨환자 400만 명 환자 중 20년 이상된 당뇨병환자의 70%가 이 질환에 걸려있고 10년 후 한국의 실명원인 1위로 추정된다 (자료출처: "건강보험심사평가원", 중앙일보, 2005년 3월 14일자). 세계적으로도 약 4000만 명이 맹인이며 또 다른 1억 명은 시각 손상을 가지고 있다(Schein OD, 1998).
당뇨망막증은 망막 내 혈관 손실이 일어나 혈액공급이 원활하지 못하여 저산소 상태가 되고 이때 혈관 유도 인자 등의 유도에 의해 그 부위에 비정상적인 혈관이 과도하게 형성되어 발생하는 일종의 혈관질환이다(Smith LE, 2002). 망막 내 신생혈관형성은 후천성 실명의 주요원인이다. 또한 당뇨망막증은 당뇨병이 잘 조절되어 혈당이 정상범위에서 유지된다 하더라도 당뇨병이 발병한 지 10-15년이 되면 흔히 나타난다.
따라서 조속한 당뇨망막증 진단기술의 확보와 진단제의 산업화가 요구되며 이를 통해 당뇨망막증에 걸린 경우 합병증 발생의 위험을 예측할 수 있는 기반을 마련하고 개개인에 맞는 체계적인 예방대책을 세우는 것이 시급하다.
VEGF는 망막의 혈관 이상증식과 밀접히 관련되어 있고 최근 여러 연구를 통해 VEGF의 SNP가 당뇨망막증과 관련됨이 밝혀지고 있다. 또 SNP를 검출할 수 있는 기술의 진보로 이를 이용한 유전자형 진단제 개발이 가능해졌다.
일반적으로 진단에 사용되는 진단용 칩은 분석결과의 해석을 위한 고가의 장비가 필요하며 시간소모도 큰 단점이 있어 대량의 유전자 분석 기술이지만 간편하고 빠른 분석을 요구하는 임상시료에는 한계가 있다. 따라서 소수의 질환 특이적 유전자를 이용한 체외진단의약품 개발이 요구된다.
현재 Mutiplex PCR기법, PCR-RFLP 등 다양한 SNP 검출 방법이 통용되고 있으 며 특히 PCR 기법을 이용한 분석은 상대적으로 비용이 저렴하며 해상도도 높아 이를 이용한 B형 간염 바이러스(HBV) 등의 바이러스 유래 질병의 진단제로 상용화되고 있다. 분석된 유전자 다형성의 종류 및 빈도는 인종 간의 차이가 가장 크며, 지금까지 진행되어 온 국내외의 연구 결과에 의하면 백인 또는 흑인에서 많이 나타나는 유전자 다형성이 동양인에게는 나타나지 않는 경우가 빈번한 문제점이 있다.
또 현재 당뇨망막증환자는 30만 명으로 이에 따른 의료비는 수조 원에 이르나 이 시장에 통용되는 진단제는 전무하다. 그러므로 당뇨망막증 진단제의 개발을 통해 약 100만 명의 당뇨병환자에게 사용해 당뇨망막증을 예진할 수 있다. 또한 당뇨환자관련 의료비용도 수조 원에 달하며 또한 그 비용이 당뇨망막증과 같은 합병증의 발생으로 증가하고 있어 실명 가능성을 가지고 있는 수많은 환자들을 위해 효과적인 조기 진단제 개발은 사회적 의료비의 감소 및 환자의 잠재적 불안요인 제거로 작용할 수 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 당뇨 망막증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자 및 혈관 내피 성장인자 수용체 1(Vascular endothelial growth factor receptor 1;VEGFR1) 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머; 및 b) 제한 효소를 포함하는 당뇨 망막증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 a)혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 2029번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; b)혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 1514번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; 및 c)혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 수용체 유전자의 4612번째 A 염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정하지 아니한다.
또한 본 발명에서 사용된 제한 효소는 Nsp I, Bsr I, Nla III, 및 Hsp92 II로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은
a) 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하는 단계;
b) 상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
c) 상기 제 4항의 프라이머 서열인 서열번호 1 내지 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 DNA를 증폭하는 단계;
d) 상기 증폭된 PCR 산물을 제 3항의 제한 효소를 처리하는 단계;
e) 상기 제한 효소 처리된 산물을 전기 영동하는 단계;
f) 상기 전기 영동한 젤의 DNA 패턴을 관찰하는 단계를 포함하는 당뇨 망막증을 진단하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 당뇨망막증과 관련성을 가지는 사람 혈관내피성장인자와 혈관내피성자인자 수용체 1 유전자의 3' 말단 비해독부위 부분의 핵산염기서열 중 단일염기변이에 따른 각각의 다른 유전자형을 확인하기 위한 폴리머라아제 연쇄중합반응(PCR)용 키트의 개발에 관한 것이다.
바람직한 형태의 본 발명의 당뇨 망막증 진단용 VEGF와 VEGFR1(FLT1)의 유전자형 진단키트의 내용물은 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, dNTP, MgSo4, Taq polymerase, Bsr I, Nsp I의 제한효소와 PCR 반응 완충액, 사용설명서, 포장용기, 프라이머 보관액 등을 포함한다. 이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: 혈액, 머리카락, 구강점막에서 지놈 DNA 추출
지놈DNA는 혈액, 머리카락, 구강점막에서 추출하며 통상적인 방법에 따라 순수 분리하였다. 예를 들어, 'SDS/단백질분해효소K'방법을 사용할 수 있다. (Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) 또는 QIAamp DNA Mini Kit 250(Qiagen 51106)을 사용할 수 있다. DNA의 농도가 낮을 경우 다음과 같은 방법으로 DNA를 농축하여 사용하였다. DNA 용액에 1/10 부피의 3 M Sodium acetate(pH 5.3)과 2.5배 해당하는 부피의 에탄올을 넣고 부드럽게 섞은 다음 - 20℃에서 1시 간 이상동안 방치하였다. 4℃, 13000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% 에탄올을 넣고 4℃, 13000rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 에탄올을 건조시킨 다음 적정량의 증류수를 넣어 녹였다.
실시예 2: PCR 및 제한효소 처리
VEGF, VEGFR1(FLT1)의 PCR 증폭을 위한 프라이머 서열 및 이용되는 제한효소는 표 1과 같다.
센스 서열
5'-tctgcgcagagcactttg-3' (vf1F; 서열번호 1)
5'-taatgttattggtgtcttcac-3' (vf2F; 서열번호 2)
5'-cctcacatgtcttaggcctgc-3' (vfr1F; 서열번호 3)
안티센스 서열
5'-ctctaatcttccgggctcg-3' (vf1R; 서열번호 4)
5'-ttaaccaagaatactgaaaaa-3' (vf2R; 서열번호 5)
5'-gttcacctacgaccacgctg-3'(vfr1R; 서열번호 6)
또한 본 발명은 하기와 같은 프라이머를 사용할 수도 있다.
* VEGF<vf1> 3025039
센스 5'agatcacaggtacagggatg -3(서열번호 7)
안티센스 5'aactcagaagcaggtgagag -3(서열번호 8)
센스 5'gactgctgtggacttgagtt -3(서열번호 9)
안티센스 5'atccctgtacctgtgatctg -3(서열번호 10)
센스 5'gactgctgtggacttgagtt -3(서열번호 11)
안티센스 5' catccctgtacctgtgatct-3(서열번호 12)
센스 5' atgagagactctggcatgat-3(서열번호 13)
안티센스 5' atccctgtacctgtgatctg-3(서열번호 14)
* VEGF<vf2> 3025040
센스 5'gcagagcactttgggtcc-3(서열번호 15)
안티센스 5'caagaaaaataaaatggcga -3(서열번호 16)
센스 5'gcagagcactttgggtcc-3(서열번호 17)
안티센스 5'ggtgatttagcagcaagaaa -3(서열번호 18)
센스 5'gcagagcactttgggtcc -3(서열번호 19)
안티센스 5' aaaaataaaatggcgaatcc-3(서열번호 20)
센스 5'gcagagcactttgggtcc -3(서열번호 21)
안티센스 5'gaaaaataaaatggcgaatc -3(서열번호 22)
* VEGFR1<vfr1> 3812867
센스 5'tttttccttttcctcctca -3(서열번호 23)
안티센스 5'agaaatccttcctaaaccca -3(서열번호 24)
센스 5'tttttccttttcctcctcac -3(서열번호 25)
안티센스 5'gagaaatccttcctaaaccc -3(서열번호 26)
센스 5'tttttccttttcctcctca -3(서열번호 27)
안티센스 5'gagaaatccttcctaaaccc -3(서열번호 28)
센스 5'ctagaggactcccgagatg -3(서열번호 29)
안티센스 5' agaaatccttcctaaaccca-3(서열번호 30)
상기 프라이머는 대한민국 바이오니아(주)에 합성을 의뢰하여 제조하였다.
PCR 반응 조건과 이를 통해 생성되는 단편의 서열은 도 1∼3을 참조한다. 도 1 내지 3에서 방향은 (5'→ 3')이고, ▼로 표기된 부위는 각 단편에 따라 Bsr I 또는 Nsp I에 의해 절단되는 부위이고 대문자로 표시되는 부분은 Bsr I 또는 Nsp I가 인지하는 서열이다. 밑줄 친 부위는 프라이머의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 염기는 '변이서열'이다. PCR 결과물에 Bsr I (NEB R0527L) 1 U 또는 NSP I(NEB, R0602L) 1 U, 5 mM potassium acetate, 2 mM Tris-acetate, 1 mM magnesium acetate, 0.1 mM DTT (pH 7.9 @ 25℃) 반응 조성하에서 25℃에서 2시간 연차적으로 45℃에서도 2시간 동안 반응을 실시하였다.
실시예 3: 전기영동
제한효소 반응이 완료된 PCR 생성물을 loading buffer(0.25% bromophenol blue, 30% glucose)와 혼합하고, DNA단편은 0.5 X TAE 완충용액에 담긴 2% agarose gel (USB Co.)에서 전개하였다. 전기영동은 실온에서 약 30분 동안 100V로 수평 전기영동장치에서 수행한다. 전기영동이 끝난 후 겔을 0.5mg/ml 농도의 EtBR (Ethidium Bromide)로 염색시킨 후, UV transilluminator를 이용하여 밴드 크기를 관찰하였다.
실시예 4: 실험결과의 관찰
전기영동 결과 나타난 DNA 밴드 형태를 관찰하였다(도 4 참조). 도 4에서 알수 있는 바와 같이 만일 vf1은 절단된 짧은 2종류의 밴드가 관찰되거나 밴드가 보이지 않으면, 이는 제한효소 위치에 C 유전자형이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 1 종류의 밴드가 나타나면 NSP I 제한효소 절단부위가 사라진 T 유전자형이 있는 것이다. 이때, T 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다.
또 vf2는 절단된 짧은 3종류의 밴드가 관찰되면, 이는 제한효소 위치에 T 유전자형이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 2 종류의 밴드가 나타나면 Bsr I 제한효소 절단부위가 사라진 C 유전자형이 있는 것이다. 이때, T 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다.
또한 vfr1은 절단된 짧은 4종류 이상의 밴드가 관찰되면 이는 제한효소 위치에 A 유전자형이 있는 것이고, 만일 절단되지 않은 상기보다 상대적으로 긴 3 종류의 밴드가 나타나면 Bsr I 제한효소 절단부위가 사라진 G 유전자형이 있는 것이다. 이때, A 유전자형이 검출되면 이 사람은 이 유전자형을 갖지 않는 사람에 비해서 당뇨망막증에 걸릴 상대적 위험성이 더욱 높다고 판단할 수 있다.
상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 당뇨 망막증을 용이하고, 간편하게 진단할 수 있는 키트를 제공한다.
<110> EYEGENE INC.
<120> KIT FOR DIAGNOSING DIABETIC RETINOPATHY
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ctctaatctt ccgggctcg 19
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer for vf2
<400> 21
gcagagcact ttgggtcc 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer for vf2
<400> 22
gaaaaataaa atggcgaatc 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer for vfr1
<400> 23
tttttccttt tcctcctca 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense primer for vfr1
<400> 24
agaaatcctt cctaaaccca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Sense primer for vfr1
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tttttccttt tcctcctcac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense primer for vfr1
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gagaaatcct tcctaaaccc 20
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<212> DNA
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tttttccttt tcctcctca 19
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<223> Sense primer for vfr1
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ctagaggact cccgagatg 19
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<212> DNA
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<223> Antisense primer for vfr1
<400> 30
agaaatcctt cctaaaccca 20
Claims (5)
- a) 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자 및 혈관 내피 성장인자 수용체 1(Vascular endothelial growth factor receptor 1;VEGFR1) 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머; 및b) 제한 효소를 포함하는 당뇨 망막증 진단용 키트.
- 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 2029번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; b)혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 1514번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; 및 c)혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 수용체 유전자의 4612번째 A 염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 유전자인 것을 특징으로 하는 당뇨 망막증 진단용 키트.
- 제 1항에 있어서, 상기 제한 효소는 Nsp I, Bsr I, Nla III, 및 Hsp92 II로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 당뇨 망막증 진단용 키트.
- 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 당뇨 망막증 진단용 키트.
- a) 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하는 단계;b) 상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;c) 상기 제 4항의 프라이머 서열인 서열번호 1 내지 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 DNA를 증폭하는 단계;d) 상기 증폭된 PCR 산물을 제 3항의 제한 효소를 처리하는 단계;e) 상기 제한 효소 처리된 산물을 전기 영동하는 단계;f) 상기 전기 영동한 젤의 DNA 패턴을 관찰하는 단계를 포함하는 당뇨 망막증을 진단하는 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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