ES2269651T3 - Polimorfismos en el gen zf9 ligados a una predisposicion para el desarrollo de una inapropiada formacion de tejido cicatrizal o fibrosis. - Google Patents

Polimorfismos en el gen zf9 ligados a una predisposicion para el desarrollo de una inapropiada formacion de tejido cicatrizal o fibrosis. Download PDF

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Abstract

Método in vitro para diagnosticar o detectar una predisposición a desarrollar un estado seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de cicatrización patológica de la piel, cicatrización o fibrosis interna o un(a) trastorno o enfermedad fibrótico(a), comprendiendo el método el paso de examinar el gen Zf9 sacado de un sujeto de interés para detectar la presencia de un polimorfismo genético consistente en la sustitución de Adenosina por Guanosina en una posición situada a 1022 bases en el lado 3'' del origen de transcripción del gen Zf9, estando dicha posición definida como la posición 43 de la ID SEC Nº 1.

Description

Polimorfismos en el gen Zf9 ligados a una predisposición para el desarrollo de una inapropiada formación de tejido cicatrizal o fibrosis.
La presente invención se refiere a métodos para realizar el análisis genético de muestras para determinar la presencia en el gen Zf9 de polimorfismos que vayan ligados a una predisposición genética a desarrollar estados que estén al menos parcialmente caracterizados por una inapropiada formación de tejido cicatrizal o fibrosis.
Una cicatriz es una estructura morfológica anormal que se deriva de una previa lesión o herida (como p. ej. una incisión, una escisión o un trauma). Las cicatrices se componen de un tejido conectivo que es predominantemente una matriz de colágeno de los tipos 1 y 3 y fibronectina. La cicatriz puede constar de fibras de colágeno dispuestas según una organización anormal (como se ve en las cicatrices normales de la piel), o bien puede ser una acumulación anormal de tejido conectivo (como la que se ve en las cicatrices del sistema nervioso central o en la cicatrización patológica de la piel).
La cicatrización es una consecuencia habitual del proceso de curación en la mayoría de los tejidos animales y humanos. En la piel las cicatrices pueden adoptar la forma de una depresión debajo de la superficie, o bien pueden presentar la forma de una elevación que sobresalga de la superficie de la piel. Las cicatrices hipertróficas son una forma más severa de cicatrización que puede surgir en determinados estados o en determinados individuos. Las cicatrices hipertróficas están elevadas por encima de la superficie normal de la piel y contienen un exceso de colágeno que queda dispuesto según una disposición anormal. Un queloide es una forma de cicatrización patológica que no tan sólo está elevada por encima de la superficie de la piel, sino que se prolonga asimismo hasta más allá de los límites de la lesión original. En un queloide hay un exceso de tejido conectivo que está organizado de manera anormal predominantemente en bandas vorticiales de tejido colagenoso.
Se cree que hay predisposiciones genéticas a formar una cicatrización inapropiada y en particular patológica (como p. ej. cicatrices hipertróficas y queloides). Por ejemplo, las razas afrocaribeñas y mongoloides son particularmente propensas a desarrollar cicatrices queloideas.
Hay numerosas situaciones médicas en las que la formación de cicatrices representa un problema. Son ejemplos de tales situaciones las cicatrices de la piel en las que una excesiva formación de tejido cicatrizal puede ser perjudicial para la función tisular, particularmente cuando se produce contractura cicatrizal (como sucede por ejemplo en el caso de las quemaduras de la piel y de las heridas que deterioran la flexibilidad de una articulación). Es también muy deseable la reducción de la cicatrización a la piel cuando son importantes las consideraciones cosméticas. En la piel, las cicatrices hipertróficas o queloideas (particularmente en las razas afrocaribeñas y mongoloides) pueden ocasionar deterioro funcional y cosmético, y hay necesidad de impedir que se produzcan. La formación de tejido cicatrizal derivada de los injertos de piel tanto en los sitios donantes como debido a la aplicación de piel artificial puede ser también problemática y tiene que ser minimizada o impedida. Dada la importancia de la cicatrización en tales situaciones, se comprenderá que hay necesidad de estar en condiciones de analizar a un sujeto para investigar si será o no será susceptible de desarrollar una cicatrización inapropiada.
Además de en las cicatrices de la piel, la cicatrización o fibrosis interna puede ser muy perjudicial, y los ejemplos específicos de la misma incluyen los siguientes:
(I) Dentro del sistema nervioso central, la cicatrización glial puede impedir la reconexión neuronal (p. ej. a continuación de neurocirugía o de lesiones penetrantes del cerebro).
(II) La cicatrización en el ojo puede ser perjudicial. En la córnea, la cicatrización puede redundar en opacidad anormal y conducir a la aparición de problemas de visión o incluso a la ceguera. En la retina, la cicatrización puede ocasionar alabeo o desprendimiento de la retina, y en consecuencia la ceguera. La cicatrización a continuación de la curación de las heridas en las operaciones para aliviar la presión en el glaucoma (como p. ej. en la cirugía de filtración del glaucoma) redunda en el fracaso de la cirugía, con lo cual el humor acuoso no puede drenarse, y por consiguiente vuelve el glaucoma.
(III) La formación de tejido cicatrizal en el corazón (p. ej. a continuación de cirugía o del infarto de miocardio) puede dar lugar a una función cardíaca anormal.
(IV) Las operaciones que afectan al abdomen o a la pelvis a menudo redundan en adherencia entre vísceras. Por ejemplo, las adherencias entre elementos del intestino y la pared corporal pueden formar y ocasionar retorcimiento del circuito intestinal, lo cual conduce a la isquemia, a la gangrena y a la necesidad de efectuar un tratamiento de emergencia (puesto que en caso de no ser tratadas, pueden incluso resultar fatales). Análogamente, los traumatismos o las incisiones en los intestinos pueden conducir a la formación de tejido cicatrizal, y la contractura cicatrizal puede dar lugar a estrecheces que pueden ocasionar oclusión del lumen de los intestinos, lo cual puede representar asimismo un peligro para la propia vida.
(V) La cicatrización en la pelvis en la región de las trompas de Falopio puede conducir a la infertilidad.
(VI) La cicatrización a continuación de lesiones en los músculos puede redundar en una contracción anormal, y por consiguiente a un deterioro de la función muscular.
(VII) La formación de tejido cicatrizal o fibrosis a continuación de lesiones en los tendones y los ligamentos puede redundar en una seria pérdida de la función.
Está relacionado con lo expuesto anteriormente el hecho de que hay una serie de estados médicos que son conocidos como trastornos fibróticos, en los cuales el desarrollo de un exceso de tejido fibrótico conduce a un desarreglo patológico y a un mal funcionamiento del tejido. Los trastornos fibróticos están caracterizados por la acumulación de tejido fibroso (predominantemente colágenos) de manera anormal dentro del tejido. La acumulación de tales tejidos fibrosos puede ser consecuencia de una variedad de procesos morbosos. Estas enfermedades no necesariamente tienen que ser ocasionadas por cirugía, lesión traumática o heridas. Los trastornos fibróticos son habitualmente crónicos. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen la cirrosis del hígado, la fibrosis hepática, la glomerulonefritis, la fibrosis pulmonar, la fibrosis quística, la esclerodermia, la fibrosis miocárdica, la fibrosis a continuación del infarto de miocardio, la fibrosis del sistema nervioso central a continuación de un ataque o de trastornos neurodegenerativos (como p. ej. la Enfermedad de Alzheimer), la vitreorretinopatía proliferativa (PVR) y la artritis.
Como en el caso de la cicatrización, se cree que hay una influencia genética en el desarrollo de muchos trastornos fibróticos o en la gravedad de los mismos. En algunos casos, la influencia genética puede ser directamente responsable del desarrollo del trastorno, mientras que para otros trastornos fibróticos puede haber un factor genético que influencie a un desarrollo fibrótico que sea secundario a la causa primaria del trastorno (como p. ej. en el caso de la fibrosis quística).
Un ejemplo de un trastorno que conlleva fibrosis y del que también se cree que es influenciado por la genética, es el de la enfermedad de Dupuytren (DD).
La DD es una fibromatosis palmar nodular que ocasiona contractura progresiva y permanente de los dígitos. La DD es a menudo familiar y es común en los individuos de extracción norteeuropea. Los de más del 25% de los varones de razas célticas de más 60 años de edad presentan signos de DD, y se considera que éste es uno de los más comunes trastornos hereditarios del tejido conectivo en los caucásicos.
La dominancia autosómica con penetrancia variable ha sido propuesta como el probable modo de herencia para la DD. Sin embargo, hasta la fecha no ha sido identificado en la literatura gen individual alguno como responsable de este estado. Además, no está claro si la DD es un estado oligogénico complejo o un sencillo desorden mendeliano monogénico. En consecuencia, la identificación de susceptibles loci genéticos proporcionaría un enfoque ideal para desvelar el componente hereditario de esta enfermedad común, y sería también valiosa en el subsiguiente desarrollo de estrategias de tratamiento y manejo de la DD.
RATZIU VLAD et al ("Zf9, a Kruppel-like transcription factor up-regulated in vivo during early hepatic fibrosis." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 95, Nº 16, 4 de agosto de 1998 (1998-08-04), páginas 9500-9505, 4 Ago. 1998 ISSN: 0027-8424) describen que el gen Zf9 es expresado diferencialmente en las células que intervienen en la curación de las heridas y en la formación de cicatrices, pero no se describen polimorfismos asociados al mismo.
RATZIU V et al ("A key role for ZF9 in hepatic fibrosis via its transcriptional activation of TGF-beta-1 and types I and II TGF-beta receptor genes in rat stellate cells." HEPATOLOGY, vol. 26, Nº 4 PARTE 2, 1997, página 185A, 48ª Asamblea Anual de la Asociación Americana para el Estudio de las Enfermedades del Hígado; Chicago, Illinois, EE.UU.; 7-11 noviembre 1997 ISSN: 0270-9139) describen otro mecanismo en apoyo de la misma función para el gen Zf9.
Los DATABASE NCBI-SNP (DATABASE NCBI-SNP = polimorfismos nucleotídicos simples de la Base de Datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica) (el mapa de los SNP's (SNP's = polimorfismos nucleotídicos simples) de la base de datos de primera aparición: 63 14 diciembre 1999 (1999-12-14), sacados del Nº de accesión a la Base de Datos del NCBI rs17731) describen el polimorfismo nucleotídico simple en las bases en la posición 1022 en el lado 3' con respecto al origen de transcripción del gen Zf9, pero ninguna asociación con enfermedades fibróticas.
BURGE P ("Genetics of Dupuytren's disease." HAND CLINICS. UNITED STATES FEB 1999, vol. 15, Nº 1, febrero de 1999 (1999-02), páginas 63-71, ISSN: 0749-0712) describe la influencia de las alteraciones genéticas en la predisposición a un estado caracterizado por cicatrización o fibrosis inapropiada (enfermedad de Dupuytren; véase el Resumen). Se estudian la complejidad de los patrones hereditarios y la presencia de anormalidades cromosómicas en el tejido afectado (véanse las páginas 68-69). Adicionalmente, este documento explica los mecanismos de predisposición genética y estrategias para la identificación de los loci de susceptibilidad (véanse las páginas 69-70).
Se apreciará a la luz de lo expuesto anteriormente que hay necesidad de estar en condiciones de evaluar a los individuos en cuanto a su susceptibilidad para desarrollar estados al menos parcialmente caracterizados por una fibrosis o cicatrización inapropiada y también de evaluar el pronóstico para un individuo que padezca de un estado de este tipo. Una manera de hacer esto es la de proceder a la identificación de los polimorfismos o mutaciones de un gen que puedan ir asociados a un determinado estado médico. Una vez identificados, tales polimorfismos pueden proporcionar información útil a los médicos que necesiten manejar o tratar un estado o establecer una susceptibilidad a desarrollar un estado. Una manera de poder usar la información es la que radica en el desarrollo de un análisis genético.
El análisis genético puede ser definido como el sometimiento a ensayo analítico del ácido nucleico de un paciente para determinar si el DNA (DNA = ácido desoxirribonucleico) de un paciente contiene mutaciones (o polimorfismos) que ocasionen o incrementen la susceptibilidad a desarrollar un estado o que estén en asociación con el gen que ocasiona el estado y sean por consiguiente potencialmente indicativos de una predisposición a desarrollar ese estado.
La temprana detección de una predisposición a desarrollar un estado constituye la mejor oportunidad para la intervención médica. La temprana identificación genética del riesgo puede mejorar el pronóstico para un paciente mediante una temprana intervención antes de que se manifiesten los síntomas clínicos.
En los casos en los que pacientes con síntomas similares son tratados con éxito variable con la misma terapéutica, el análisis genético puede permitir diferenciar los pacientes en los que es genética la base de sus síntomas de aquéllos en los que es desarrollística la base de sus síntomas, lo que conducirá a la necesidad potencial de distintas formas de abordar la terapia.
Es un objetivo de la presente invención el de aportar métodos de selección genética para indicar un riesgo o una predisposición a desarrollar estados que estén al menos parcialmente caracterizados por fibrosis o cicatrización inapropiada.
Según un primer aspecto de la presente invención, se aporta un método in vitro para diagnosticar o detectar una predisposición a desarrollar un estado seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de cicatrización patológica de la piel, cicatrización o fibrosis interna o un(a) trastorno o enfermedad fibrótico(a), comprendiendo el método el paso de examinar el gen Zf9 sacado de un sujeto de interés para detectar la presencia de un polimorfismo genético consistente en la sustitución de Adenosina por Guanosina en una posición situada a 1022 bases en el lado 3' del origen de transcripción del gen Zf9, estando dicha posición definida como la posición 43 de la ID SEC Nº 1.
Entendemos por "polimorfismo" una región de un gen o de elementos reguladores del mismo donde la secuencia de bases nucleotídicas puede variar entre individuos. Hay a menudo un genotipo predominante que representa la forma habitual, o tipo salvaje, de un gen, con subconjuntos de una población que tienen un polimorfismo que confiere un genotipo distinto. Ciertos polimorfismos pueden ser predominantes en los individuos de determinadas extracciones étnicas o de zonas geográficas específicas. Un polimorfismo puede no afectar a la función del gen; puede conducir a la aparición de diferencias en la función del gen; puede producir un producto génico inactivo; o puede modular la producción del producto génico.
Entendemos por "mutación" una región de un gen o de elementos reguladores del mismo donde la secuencia de bases nucleotídicas puede variar con respecto al tipo salvaje. La mutación puede por ejemplo comprender una sustitución, deleción o adición de bases. Ciertas formas mutantes del gen pueden ser predominantes en individuos de determinadas extracciones étnicas o de zonas geográficas específicas. Una mutación puede no afectar a la función del gen; puede conducir a la aparición de diferencias en la función del gen; puede producir un producto génico inactivo; o puede modular la producción del producto génico.
Entendemos por "gen" todas las secuencias codificantes entre el codón de iniciación y el codón de terminación del gen Zf9 (incluyendo los intrones y los exones).
Entendemos por "elementos reguladores" el DNA que está en el lado 5' y en el lado 3' con respecto al gen e interviene en la regulación de la transcripción genética. Por ejemplo, las secuencias de unión para los factores de transcripción, la caja TATA, las regiones promotoras 5' y las regiones no traducidas 5' y 3' (UTRs).
El método según el primer aspecto de la invención le permite a un investigador identificar a un sujeto que tenga un polimorfismo genético o una mutación genética en el gen Zf9 o sus elementos reguladores para determinar aquellos sujetos que presenten o corran un mayor riesgo de desarrollar un estado como el definido por el primer aspecto de la invención. Esto permite adoptar apropiadas medidas para impedir o aminorar la probabilidad de iniciación del estado o para permitir que pueda ser efectuado un apropiado tratamiento del mismo. El método es también útil para establecer un pronóstico para un sujeto al que ya le haya sido diagnosticado que padece de un estado determinado.
El factor de transcripción Zf9 es una de las de una multitud de moléculas biológicas que está implicada en los procesos patofisiológicos que conducen al desarrollo de una cicatriz o tejido fibrótico. El gen para Zf9 ha sido mapeado en un locus del cromosoma humano 10p15. La secuencia de los cDNAs humano (y de rata) de longitud completa ha sido identificada por Ratziu et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 9500-9505, 1998), y la secuencia génica de Zf9 está a la disposición del público con el Nº de Accesión al Banco Genético AB017493.
El Zf9 es también conocido como la Proteína de Unión a los Elementos Promotores de la Región Central (COPEB o CPBP), como el Protooncogen 1 derivado de Células B (BCD1), como el Factor de Unión a los Sitios Ricos en GC (GC = guanina-citosina) (GBF), y como el Factor 6 tipo Krueppel (KLF6).
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Ratzui et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States: vol (95), Nº 16, pp. 9500-9505, 1998) describen cebadores directos e inversos que son adecuados para amplificar el polimorfismo genético A1140G en el gen ZF9.
Los inventores llevaron a cabo experimentos para someter a selección al gen Zf9 y a sus elementos reguladores para determinar los polimorfismos y mutaciones que puedan ir asociados a un estado al menos parcialmente caracterizado por fibrosis o cicatrización inapropiada. Habiendo establecido tal asociación, los inventores han establecido que el DNA tomado de un sujeto puede ser analizado para ayudar a establecer un diagnóstico del estado o a establecer si un sujeto está o no está predispuesto a desarrollar un estado de ese tipo.
El estado puede ser una forma de cicatrización patológica de la piel (como p. ej. la cicatrización hipertrófica o formación de queloides) o una cicatriz o fibrosis interna, como se ha mencionado anteriormente. Como alternativa, el estado puede ser una enfermedad fibrótica o un trastorno fibrótico, también como se ha mencionado anteriormente. Otros estados que pueden ser diagnosticados o detectados según el método de la invención incluyen trastornos fibróticos de la piel tales como los siguientes:
La esclerodermia
La esclerosis sistémica
El síndrome CREST
La esclerosis tuberosa con manchas en la piel
El colagenoma cutáneo familiar
La porfiria cutánea tardía
La enfermedad crónica de injerto versus huésped
La facsitis eosinofílica
El lupus eritematoso discoide, la dermatomiositis
La Enfermedad mixta del tejido conectivo
La fibrosis cutánea inducida con fármacos - bleomicina, PVC, silicatos
La enfermedad de Peyronie
La fibrosis submucosa oral
La fibrosis inducida a continuación de exposiciones dietarias y medioambientales.
Pueden ser también detectados o diagnosticados trastornos fibróticos de otros órganos. Éstos incluyen los siguientes:
La fibrosis pulmonar/cardíaca
La cirrosis/fibrosis hepática
La fibrosis renal
La fibrosis del tracto gastrointestinal
La fibrosis inducida por fármacos (p. ej. tras un trasplante de un órgano)
La fibrosis del sistema nervioso central y periférico
La fibrosis del sistema vascular (de las venas y las arterias)
La fibrosis del tracto genitourinario masculino y femenino
Los trastornos ginecológicos (la fibrosis de las trompas de Falopio, los fibromas uterinos).
El método del primer aspecto de la invención es particularmente adecuado para diagnosticar o detectar una predisposición a contraer la Enfermedad de Dupuytren.
El gen Zf9 a examinar es preferiblemente obtenido de un sujeto humano. Sin embargo, se entenderá que puede ser también analizado según el método de la invención DNA sacado de sujetos animales de interés veterinario.
El polimorfismo que puede ser detectado según el primer aspecto de la invención está situado en el DNA no traducido en el lado 3' con respecto a la secuencia codificante de Zf9, y está situado en la posición 1140 del Nº de Accesión al Banco Genético AB017493460 (Id de Análisis del NCBI (ss#) 20354; e Id del SNP de Referencia (rs#) 17731) y recibe aquí el nombre de "el polimorfismo 1140".
Este polimorfismo 1140 representa una mutación puntual de un nucleótido de Guanosina (G) que pasa a ser sustituido por un nucleótido de Adenosina (A). Fueron identificados para este polimorfismo los genotipos AA, AG y GG.
La mutación puntual está situada a 1022 bases del inicio de la secuencia codificante del gen Zf9, y se encuentra en la región no traducida 3'. Las dos formas alélicas tienen la siguiente secuencia de bases:
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Los experimentos iniciales establecieron que el genotipo GG y AG está significantemente sobrerrepresentado en los sujetos con Enfermedad de Dupuytren (DD), mientras que los de una más alta proporción de sujetos de control eran de un genotipo AA.
El trabajo adicional ha establecido que los sujetos con otros trastornos fibróticos (como p. ej. esclerodermia o fibrosis renal) y los sujetos que son susceptibles de desarrollar cicatrización severa/patológica (como p. ej. queloides) también tienen una alta frecuencia del alelo G. Por consiguiente, el polimorfismo puede ser examinado según el método de la invención para diagnosticar o detectar una predisposición a desarrollar los de una variedad de estados como los definidos por el primer aspecto de la invención.
Pueden usarse varias técnicas para detectar polimorfismos o mutaciones según el método de la invención.
Una técnica preferida supone la Digestión con Enzimas de Restricción (RED) y se basa en el hecho de que los polimorfismos pueden conducir a la producción de fragmentos de DNA de distintos tamaños a continuación del tratamiento con una enzima de restricción (debido a la introducción o deleción de un sitio de restricción por parte de la mutación que ocasiona el polimorfismo). Estos fragmentos pueden ser visualizados en geles, y el polimorfismo o mutante puede ser identificado sobre la base del número y del tamaño (es decir, de la distancia recorrida en el gel) de los fragmentos de una muestra de DNA sacada de un sujeto.
Preferiblemente, antes de la detección del polimorfismo se amplifica el DNA que comprende al gen Zf9 y/o a los elementos reguladores del mismo. Esta amplificación es preferiblemente efectuada por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, un método que es preferido según la invención y es conocido como el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (PCR-RFLP) está descrito en mayor detalle en el Ejemplo 1 y supone la amplificación por PCR de DNA que contiene el polimorfismo antes de la digestión con enzimas de restricción y del subsiguiente análisis.
Es necesario diseñar cebadores de PCR de forma tal que los mismos sean adecuados para amplificar una región en torno al polimorfismo relevante. Se indican a continuación como ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4 cebadores que son adecuados para amplificar el polimorfismo 1140.
Cebador directo: 5' GTCCAGGGTC ACCCACATAC 3' (ID SEC Nº 3)
Cebador inverso: 5' GTTCTGCACC CTACCCAGTT 3' (ID SEC Nº 4)
Para algunos polimorfismos o mutaciones ni el alelo de tipo salvaje ni el alelo mutante abule o introduce un sitio de enzima de restricción. Cuando éste es el caso, puede introducirse un sitio de enzima de restricción diseñando específicamente cebadores de PCR que introduzcan sitios de restricción en el producto amplificado. El sitio enzimático introducido permite establecer una diferenciación entre los alelos polimórficos y los de tipo salvaje mediante análisis del tamaño. Por ejemplo, si los productos de restricción del producto amplificado son analizados mediante electroforesis en gel (en gel de agarosa o de poliacrilamida, por ejemplo), los alelos con el sitio de la enzima de restricción introducido producirán una banda extra en el gel.
Otras técnicas que pueden ser usadas para detectar polimorfismos o mutaciones según la presente invención influyen las siguientes:
(1) La secuenciación directa de la región polimórfica de interés (p. ej. usando conjuntos de utensilios y sustancias de los que están disponibles comercialmente, tales como el Cy5^{MF} Thermo Sequenase^{MF} dye terminator kit - Amersham Pharmacia Biotech) (MF = Marca de Fábrica);
(2) La Hibridación de Oligonucleótidos Específica de Secuencia (SSO) (que supone la transferencia de puntos o de líneas de moléculas de DNA amplificado que comprenden la región polimórfica; la hibridación con sondas marcadas que están diseñadas para ser específicas para cada variante polimórfica; y la detección de dichas marcas);
(3) El Análisis de Heteroduplex y del polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP) (que supone el análisis de las disposiciones de las bandas de electroforesis de moléculas de DNA amplificado desnaturalizado que comprenden la región polimórfica);
(4) El Cebado Específico de Secuencia (SSP) [también descrito como Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación (ARMS)];
(5) El Escaneo de Mutaciones [p. ej. usando el conjunto de utensilios y sustancias PASSPORT^{MF} Mutation Scanning Kit (Amersham Pharmacia Biotech)];
(6) El Análisis por Digestión Química de Cadenas con Apareamientos Erróneos;
(7) El Análisis no Isotópico por Digestión con RNasa (Ambion Ltd.);
(8) El Análisis por Digestión Enzimática de Cadenas con Apareamientos Erróneos; y
(9) El Análisis de Extensión de Nucleótidos Individuales.
El método según el primer aspecto de la invención es particularmente adecuado para ser ejecutado con DNA genómico, y en particular con DNA genómico aislado. Tal DNA genómico puede ser aislado de muestras de sangre o tejido (como p. ej. cabello, frotis bucales orales, uñas o piel) o de otras fuentes adecuadas usando métodos convencionales. El DNA es preferiblemente aislado de sangre entera o granulocitos.
Un diagnóstico o predicción basado en el método según la presente invención depende de que se establezca una asociación entre un estado determinado y el específico polimorfismo o mutante en cuestión. Tales asociaciones fueron establecidas por los inventores llevando a cabo adicionales experimentos y efectuando análisis estadísticos (véase el Ejemplo, p. ej.). Se ha tratado anteriormente y se trata en los Ejemplos sobre la asociación con el polimorfismo 1140. Al contar con datos basados en los análisis de asociación, el clínico está en condiciones de interpretar la significancia de los genotipos identificados secuenciando DNA según el método de la invención. El clínico puede entonces hacer un enjuiciamiento sobre la probabilidad de que un paciente desarrolle o presente una determinada enfermedad o un determinado trastorno. Tal conocimiento es importante para manejar clínicamente estados específicos que vayan asociados a la fibrosis o cicatrización inapropiada. Se entenderá que los datos relativos a la asociación de un determinado genotipo en particular con un estado pueden serle proporcionados a un usuario del método según la invención (como p. ej. un técnico o un clínico) incorporando una hoja de datos como parte de un conjunto de utensilios y sustancias (véase lo expuesto más adelante).
El análisis genético puede ser efectuado prenatalmente, perinatalmente o postnatalmente cuando se desee analizar si es probable que un neonato o un niño haya heredado una predisposición a desarrollar un estado según el primer aspecto de la invención. Esto es particularmente útil cuando se crea que hay un historial familiar de desarrollo del estado.
El análisis es particularmente útil para analizar sujetos preoperatoriamente. Los resultados de un análisis de este tipo son útiles para establecer si podría o no podría haber complicaciones en la curación en el caso de un sujeto que deba ser sometido a cirugía (complicaciones tales como p. ej. cicatrización hipertrófica, formación de queloides o cicatrización/fibrosis interna).
El análisis es también útil antes de establecer un régimen terapéutico para tratar el estado. Los resultados del análisis según la invención pueden ser usados por un clínico para servir de ayuda en la selección de los medicamentos a usar y de la dosificación de los mismos.
Lo más preferido es que el método de la invención sea usado para analizar a los sujetos que tengan un historial familiar de desarrollo de un estado según el primer aspecto de la invención.
\newpage
Los distintos elementos que son necesarios para que un técnico ejecute el método del primer aspecto de la invención puede ser incorporados en un conjunto de utensilios y sustancias. Así, según un segundo aspecto de la presente invención se aporta un conjunto de utensilios y sustancias que comprende:
A) Un cebador de PCR directo que comprende 5' GTCCAGGGTC ACCCACATAC 3' (ID SEC Nº 3) y un cebador de PCR inverso que comprende 5' GTTCTGCACC CTACCCAGTT 3' (ID SEC Nº 4) para amplificar un polimorfismo genético de adenosina a guanosina en una posición que está situada a 1022 bases en el lado 3' del origen de transcripción del gen Zf9, estando dicha posición definida como la posición 43 de la ID SEC Nº 1; y
B) Muestras de DNA de control de genotipo conocido para el polimorfismo.
El conjunto de utensilios y sustancias puede comprender además:
C) Una enzima de restricción adecuada para generar fragmentos de la muestra de DNA;
D) Una ficha de datos que perfile el nexo existente entre un particular polimorfismo y una enfermedad;
E) Protocolos para amplificación por PCR, digestión con enzimas de restricción de productos de PCR y electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de DNA;
F) Los relevantes tampones.
Los tampones que se faciliten con el conjunto de utensilios y sustancias pueden estar en forma líquida y pueden ser preferiblemente facilitados en forma de partes alícuotas previamente medidas. Como alternativa, los tampones pueden estar en forma concentrada (o incluso en forma de polvo) para su dilución.
El conjunto de utensilios y sustancias puede comprender además adecuados recipientes de reacción, tubos centrífugos, etc.
Las de una multitud de moléculas biológicas están implicadas en el proceso fibrótico o de formación de tejido cicatrizal, y sería de esperar que sean muchos los distintos factores que conducen al desarrollo de una cicatriz o fibrosis. El factor de crecimiento TGF-\beta1 es un ejemplo de una molécula biológica que ha sido implicada como factor importante en el desarrollo de cicatrices y tejidos fibróticos. Se sabe del gen TGF-\beta1 que es polimórfico, y se ha informado en la literatura sobre varios polimorfismos del gen TGF-\beta1. Los inventores han explorado la hipótesis de que haya una asociación entre cuatro polimorfismos conocidos del gen TGF-\beta1 y el estado fibrótico que constituye la enfermedad de Dupuytren. Fue efectuada genotipificación del TGF-\beta1 en individuos caucásicos con DD, y la misma fue comparada con una población caucásica de control. Estos estudios establecieron que había una asociación negativa entre los controles caucásicos y los casos de enfermedad de Dupuytren para los polimorfismos del TGF-\beta1. El hecho de que los polimorfismos en un factor de crecimiento fibrótico tal como el TGF-\beta1 no presentasen asociación alguna con un estado caracterizado por fibrosis o cicatrización inapropiada ilustra cómo fue de sorprendente el descubrimiento de los inventores de que los polimorfismos en el gen para Zf9 presentasen tal asociación significante.
Se describe a continuación más ampliamente la invención tan sólo a título de ejemplo y haciendo referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales:
La Figura 1 es un electroferograma que ilustra el polimorfismo en la posición 1140 del Nº de Accesión al Banco Genético AB017493; y
la Figura 2 es una fotografía de un gel que ilustra la diferencia de tamaño de fragmentos de DNA amplificado que corresponden a los genotipos GG, AG y AA en el Ejemplo 1.
Ejemplo 1
Análisis del nexo de un polimorfismo de Zf9
Se tomaron muestras de un grupo de pacientes con Enfermedad de Dupuytren (DD) y de un grupo de control para investigar la correlación entre un polimorfismo de Zf9 y el estado.
1.1. Pacientes y métodos 1.1.1 Pacientes
Se incluyeron en el estudio pacientes con la enfermedad de Dupuytren (n = 138) (119 hombres y 19 mujeres). La gama de edades estaba situada entre los 37 y los 90 años, con una edad media de 55,8 años. Los casos eran todos ellos caucásicos no emparentados de la región noroccidental de Inglaterra, R.U. Los casos con la Enfermedad de Dupuytren fueron identificados mediante los códigos clínicos de los historiales operatorios del South Manchester University Hospital Trust y del Wrightington Hospital en la región noroccidental. Todos los pacientes fueron vistos por una persona médicamente cualificada que recogió un historial médico completo usando una proforma y examinó ambas manos de cada caso. Todos los casos vieron confirmado el diagnóstico de la enfermedad de Dupuytren preoperatoriamente con la presencia de los característicos nódulos de Dupuytren en la palma de la mano y/o en los dígitos con o sin contractura de las articulaciones metacarpofalángicas o de las articulaciones interfalángicas proximales.
Un grupo de control (n = 161) constaba de mujeres y hombres caucásicos sanos equiparados étnicamente y fue seleccionado de entre los expedientes de medicina general.
Los comités de ética locales y hospitalarios habían dado su aprobación al protocolo y a las proformas para el estudio. Fue obtenido de todos los individuos el consentimiento expresado por escrito.
1.1.2 Método de Extracción de DNA
Se tomaron muestras de sangre de todos los sujetos usando técnicas estándar (se tomaron 15 ml de sangre venosa).
El DNA fue extraído de células de sangre periférica usando un conjunto de utensilios y sustancias para la extracción de DNA que está disponible comercialmente (Qiagen, R.U.). Las concentraciones de DNA fueron medidas y diluidas en tampón hasta 100 ng/\mul usando tampón Qiagen estéril.
1.1.3 Método de Genotipificación
La genotipificación del Zf9 fue efectuada usando el método de la reacción en cadena de la polimerasa y el polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (PCR-RFLP).
Se comprobó que el polimorfismo elegido para el estudio estaba en la región no traducida 3' del gen Zf9 y correspondía al polimorfismo 1140 que ha sido descrito anteriormente (Id de Análisis del NCBI (ss#): 20354 Id del SNP de Referencia (rs#): 17731).
Las reacciones en cadena de la polimerasa fueron efectuadas en placas de microtitulación de 96 cavidades. Cada reacción en cadena de la polimerasa se hizo a base de 1 \mul de DNA (100 ng/\mul), 2,5 \mul de tampón de NH_{4} x1 (Bioline), 2,5 \mul de cada d'NTP 2mM (d'NTP = 2'-desoxinucleósido-5'-trifosfato) (Behring), 0,1 \mul de polimerasa de Taq de 0,1 unidades (polimerasa de Taq = polimerasa de Thermus aquaticus) (Bioline), 6 \mul de Betaína, 0,75 \mul de MgCl_{2} y 0,1 \mul de cada cebador directo e inverso 2,5 pmolar de la ID de Secuencia Nº 2 y 3 respectivamente, haciéndose con ello 25 \mul de mezcla de reacción con agua destilada autoclaveada. Se indican a continuación las secuencias de los cebadores que se usaron:
Cebador directo: GTCCAGGGTC ACCCACATAC (ID Sec Nº 3); y
Cebador inverso: GTTCTGCACC CTACCCAGTT 3' (ID Sec Nº 4)
La reacción en cadena de la polimerasa fue efectuada bajo las condiciones siguientes: 2 minutos de desnaturalización a 95ºC seguidos por 35 ciclos de adicional desnaturalización por espacio de 45 segundos a 95ºC; luego 1 minuto a cada temperatura de hibridación (como se indica en la tabla 1), y 45 segundos de extensión a 72ºC; habiéndose incluido un paso de alargamiento final de 5 minutos 1 a 72ºC.
Las condiciones de PCR-RFLP fueron las siguientes: El DNA amplificado (5 \mul) fue sometido a digestión con la enzima apropiada (0,8 \mul) incluyendo tampón (1 \mul) y llegando hasta 10 \mul de mezcla de reacción usando agua destilada. La digestión fue efectuada durante la noche en un ciclador térmico Hybaid Omnigene. La enzima usada fue Aci I (secuencia de reconocimiento ccgc). La enzima fue adquirida a la New England Biolabs. Los productos digeridos fueron fraccionados en geles de poliacrilamida al 4% y visualizados mediante bromuro de etidio y luz ultravioleta usando procedimientos estándar.
1.1.4 Análisis estadístico
La asociación con la DD fue investigada comparando la distribución de sus frecuencias alélicas entre los pacientes con DD y los controles usando una única prueba global de chi-cuadrado de Pearson. Se usó el programa de análisis de datos estadísticos STATA 6 para calcular los valores p y las razones de probabilidades.
1.2 Resultados
Los resultados de un electroferograma de la región que rodea a la región 1140 del Nº de Accesión al Banco de Genes AB017493 están representados en la Figura 1 y confirman la existencia del polimorfismo G/A.
Habiendo confirmado la existencia del polimorfismo, los fragmentos de DNA generados según el método 1.1.3 fueron pasados por geles de poliacrilamida como se ha especificado. La Figura 2 ilustra que distintos genotipos generaban fragmentos de DNA de un tamaño singular que podía ser fácilmente diferenciado leyendo el gel. En consecuencia, fueron generados geles para cada individuo tanto del grupo con DD como del grupo de control, y se hizo el análisis estadístico de todo nexo entre genotipo y estado de salud.
Se presentan en la Tabla 1 los análisis estadísticos de las muestras genotipificadas. Estos datos ilustran que el genotipo GG y AG está significantemente sobrerrepresentado en los sujetos que tienen la Enfermedad de Dupuytren (DD), mientras que eran de un genotipo AA los de una más alta proporción de sujetos de control.
En consecuencia, quedó establecido un nexo entre los genotipos GG y AG del polimorfismo 1140 en la región no traducida 3' del gen Zf9 y la DD. Se comprenderá que también existirá un nexo de este tipo con otros estados caracterizados por fibrosis o cicatrización inapropiada.
DD (n=138) Casos CONTROL (n=161=)
Frecuencia alélica
1(A) 84 (30%) 128 (40%)
2(G) 192 (70%) 194 (60%)
Frecuencia genotípica
1(A/A) 13 (9%) 23 (14%)
2(A/G) 58 (42%) 82 (51%)
3(G/G) 67 (49%) 56 (35%)
Valor p = 0,046
Ejemplo 2
Habiendo sido establecida una correlación entre un estado caracterizado por fibrosis o cicatrización inapropiada y un genotipo conferido por el polimorfismo 1140 para Zf9, fue repetida la metodología del Ejemplo 1 para seleccionar los sujetos según el método del primer aspecto de la invención para establecer el genotipo del sujeto.
Los resultados del análisis genético podrían ser entonces usados por un clínico para dar consejo médico a los individuos. Por ejemplo, los individuos asintomáticos para los que se hubiese descubierto que tuviesen el alelo G podrían ser informados de que corrían un incrementado riesgo de desarrollar un estado caracterizado por fibrosis o cicatrización inapropiada. Si ello fuese apropiado, podría recomendarse a tales individuos que incorporasen cambios en su estilo de vida y/o recibiesen tratamiento profiláctico. A los individuos que tengan el alelo G y estén ya padeciendo de un estado caracterizado por fibrosis o cicatrización inapropiada puede recomendárseles que ajusten su medicación o sus hábitos puesto que corren potencialmente el riesgo de desarrollar una forma más severa del estado.

Claims (14)

  1. \global\parskip0.930000\baselineskip
    1. Método in vitro para diagnosticar o detectar una predisposición a desarrollar un estado seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de cicatrización patológica de la piel, cicatrización o fibrosis interna o un(a) trastorno o enfermedad fibrótico(a), comprendiendo el método el paso de examinar el gen Zf9 sacado de un sujeto de interés para detectar la presencia de un polimorfismo genético consistente en la sustitución de Adenosina por Guanosina en una posición situada a 1022 bases en el lado 3' del origen de transcripción del gen Zf9, estando dicha posición definida como la posición 43 de la ID SEC Nº 1.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el estado es la Enfermedad de Dupuytren.
  3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que el estado es una cicatriz queloidea o hipertrófica.
  4. 4. Método según la reivindicación 1, en el que el estado es uno cualquiera de los miembros del grupo que consta de esclerodermia, esclerosis sistémica, síndrome CREST, esclerosis tuberosa con manchas en la piel, colagenoma cutáneo familiar, porfiria cutánea tardía, enfermedad crónica de injerto versus huésped, facsitis eosinofílica, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, enfermedad mixta del tejido conectivo, fibrosis cutánea inducida con fármacos, fibrosis submucosa oral, fibrosis inducida a continuación de exposiciones dietarias y medioambientales, fibrosis cardíaca/pulmonar, cirrosis/fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis inducida por fármacos, fibrosis del sistema nervioso central y periférico, fibrosis del sistema vascular, fibrosis del tracto genitourinario masculino y femenino y fibrosis ginecológica.
  5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que el estado es uno cualquiera de los miembros del grupo que consta de cirrosis hepática, fibrosis hepática, glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, esclerodermia, fibrosis miocárdica, fibrosis a continuación de infarto de miocardio, y fibrosis del sistema nervioso central a continuación de un ataque o trastornos neurodegenerativos.
  6. 6. Método según cualquier reivindicación precedente, en el que el gen ZF9 y los elementos reguladores del mismo se sacan de una muestra de DNA genómico.
  7. 7. Método según la reivindicación 6, en el que el DNA genómico es aislado de muestras de sangre o tejido.
  8. 8. Método según cualquier reivindicación precedente, en el que la presencia de un polimorfismo genético es determinada a continuación de la amplificación de al menos un fragmento del DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
  9. 9. Método según la reivindicación 8, en el que el DNA es sometido a amplificación por PCR usando los siguientes cebadores de PCR:
    Cebador directo: 5' GTCCAGGGTC ACCCACATAC 3' (ID SEC Nº 3); y Cebador inverso: 5' GTTCTGCACC CTACCCAGTT 3' (ID SEC Nº 4) \hskip0,25cm
  10. 10. Método según cualquier reivindicación precedente, en el que el gen ZF9 y los elementos reguladores del mismo son examinados mediante digestión de restricción y análisis de tamaño.
  11. 11. Conjunto de utensilios y sustancias que está destinado a ser usado en el método según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 y comprende:
    A) un cebador de PCR directo que comprende 5' GTCCAGGGTC ACCCACATAC 3' (ID SEC Nº 3) y un cebador de PCR inverso que comprende 5' GTTCTGCACC CTACCCAGTT 3' (ID SEC Nº 4) para amplificar un polimorfismo genético de adenosina a guanosina en una posición que está situada a 1022 bases en el lado 3' del origen de transcripción del gen Zf9, estando dicha posición definida como la posición 43 de la ID SEC Nº 1; y
    B) Muestras de DNA de control de genotipo conocido para el polimorfismo.
  12. 12. Conjunto de utensilios y sustancias según la reivindicación 11, en el que el conjunto de utensilios y sustancias comprende adicionalmente una enzima de restricción adecuada para generar fragmentos de DNA.
  13. 13. Conjunto de utensilios y sustancias según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en el que el conjunto de utensilios y sustancias comprende adicionalmente una ficha de datos que perfila el nexo entre un polimorfismo determinado y un estado y/o protocolos para la amplificación por PCR, la digestión de productos de PCR con enzimas de restricción y la electroforesis de fragmentos de DNA en gel de agarosa.
  14. 14. Conjunto de utensilios y sustancias según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el conjunto de utensilios y sustancias comprende adicionalmente tampones destinados a ser usados en el método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
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