ES2310048T3 - Composiciones y metodos para proteger organos, tejidos y celulas del daño mediado por el sistema inmunitario. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido HuHsp47.

Description

Composiciones y métodos para proteger órganos, tejidos y células del daño mediado por el sistema inmunitario.

Campo de la invención

El campo de la invención se compone de composiciones y métodos para la protección de tejidos, órganos y células del daño mediado por el sistema inmunitario.

Antecedentes de la invención

El trasplante de médula ósea (BMT) representa una forma de terapia curativa para los pacientes con enfermedades malignas. Los efectos beneficiosos del BMT no son debidos solamente a la quimioterapia y radioterapia de altas dosis sino también a mecanismos inmunitarios denominados efecto del injerto frente a la leucemia (GvL) (Sullivan et al., Blood 73: 1720 (1989); Weiden et al., N. Engl. J. Med. 300: 1068-1073 (1979)). Tanto las células destructoras naturales (NK) como los subconjuntos de células T contribuyen al GvL (Antin, Blood 82: 2273-2277 (1993); Hauch et al., Blood 75: 2250-2262 (1990)). Esto se basa en la observación de que la separación de los linfocitos T de las células madres da como resultado un gran aumento de las tasas de recaídas después de un BMT alogénico (Martin et al., Blood 66: 664-672 (1985)). También se ha demostrado recientemente que la perfusión de linfocitos de un donante a los pacientes que han recaído después de un trasplante alogénico de BM con reducción de células T, da como resultado un porcentaje importante de pacientes que vuelven a experimentar una remisión completa (Collins et al., Clinical Oncology 15: 433-444 (1997); Kolb et al., Blood 86: 2041-2050 (1995); Porter et al., N. Engl. Med. 330: 100-106 (1994)). La identificación y expansión in vitro de los subconjuntos de células NK y células T con actividad anti-tumoral de GvL, espontánea o adquirida, es un área de investigación activa.

El conocimiento de la biología de los linfocitos T citotóxicos (CTL) clásicos y su uso de TCR \alpha/\beta, CD3 y CD8 en el contexto de una apropiada expresión del MHC-I sobre las células diana es avanzado (Guidos et al., J. of Exp. Med. 172: 835-845 (1990); Weissman, Cell 76: 207-218 (1994)). Sin embargo, la biología de los subconjuntos más raros de células T citotóxicas y de células NK que no utilizan las moléculas anteriores en el sentido de la citotoxicidad clásica restringida por el MHC I sigue siendo un reto. Por ejemplo, el campo de la inmunología de los tumores es puesto a prueba con el hallazgo consistente de la actividad citotóxica de células T no convencionales y la expansión en el contexto de auto-reactividad y alo-reactividad de las dianas tumorales que carecen de las características clásicas de restricción por el MHC I (Hoglund et al., Immun. Rev. 155: 11-28 (1997)). Varias poblaciones distintas de células T y células NK han sido expandidas in vitro y utilizadas in vivo como células efectoras para inmunoterapia adoptiva.

Las células destructoras activadas por linfocina (LAK) son productos de cultivo a corto plazo dependientes de IL-2 con potencial proliferativo limitado derivado de las células NK. Las células LAK reconocen una amplia selección de células tumorales dianas y células tumorales autólogas in vitro, sin embargo, su eficacia in vivo está limitada por el requerimiento de la co-aplicación de IL-2 (Blaise et al., Eur. Cytokine Netw. 2: 121-129 (1991); Fortis et al., Cancer Immunol. Immumother 33: 128-132 (1991); Lee et al., J. Biol. Response Mod. 7: 43-53 (1988); Nalesnik et al., Trasplantation 63: 1200-1205 (1997); Rosenberg, J. Biol. Response Mod. 3: 501-511 (1984); Rosenberg et al., New England, J. of Med. 316: 889-897 (1987); Rosenberg et al., J. of Exp. Med. 161: 1169-1188 (1985); Teichmann et al., Leuk. Res. 16: 287-98 (1992). La administración sistémica de IL-2 está asociada con considerables toxicidades que se caracterizan por la destrucción endotelial, tanto in vitro como in vivo (Siegel et al., J. of Clin. Oncology 9: 694-704 (1991)). La terapia con células LAK ha llevado a una importante morbilidad incluso letalidad asociada con el síndrome de fuga vascular (VLS) (Glauser et al., Am., J. Med. Sci. 296: 406-412 (1988); Kotasek et al., Cancer Res. 48: 5528-5532
(1988); Kozeny et al., J. Clin. Oncology 6: 1170-1176 (1988); Rosenberg et al., Ann. Surg 210: 474-484.

Los linfocitos que infiltran tumores (TIL) requieren el aislamiento a partir de una muestra quirúrgica. Usualmente tienen una alta selectividad para sus respectivos tumores. Sin embargo, su generación tiende a ser lenta y está asociada con bajos rendimientos. Los antígenos específicos de tumores están raramente disponibles para asegurar la suficiente expansión in vitro o para cualquier tratamiento sucesivo, o para escalados de dosis (Rosenberg et al., New. Engl. J. of Med. 319: 1676-1680 (1988); Rosenberg et al., J. Nat. Canc. lnst. 86: 1159-1166 (1994)).

Las células destructoras inducidas por las citocinas (CIK) se generan en ausencia de células diana procedentes de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) mediante cultivo in vitro en presencia de IFN-\gamma, OKT-3, y IL-2. Las células CIK tienen actividad GvL superior in vivo en comparación con las LAK y son capaces de purgar a los ratones SCID de la carga de tumores hematopoyéticos letales (Lu et al., J. Immunol. 153: 1687-1696 (1994); Schmidt-Wolf et al., Ann. Hematol. 74: 51-56 (1997); Schmidt-Wolf et al., Exp. Hematol. 21: 1673-1679 (1993)). Como otras formas de células NK o T activadas, las CIK cultivadas en grandes cantidades presentan algo de citotoxicidad no deseada frente a las del endotelio (EC) cultivadas in vitro.

El síndrome de fuga vascular (VLS) es un importante efecto secundario asociado con la inmunoterapia adoptiva para tratar enfermedades tales como el cáncer. En particular, se ha comunicado que la IL-2 y las diferentes formas de células NK y células T activadas por la IL-2, pueden llevar a una toxicidad significativa incluyendo el VLS. Sin embargo, no se ha descrito ningún agente que sea capaz de inhibir la lisis de las células endoteliales mediante células NK y células T activadas, no clásicas restringidas por el MHC clase I (Blaheta et al., Immunology 94: 213-220 (1998); Finnegan et al., Cancer 82: 186-199 (1998); Utoguchi et al., Inflammation 21: 223-233 (1997)).

El daño vascular producido por el sistema inmunitario es una manifestación de una activación general del sistema inmunitario. Aunque la activación de la respuesta inmunitaria es extremadamente importante para la salud y el funcionamiento apropiado de un hospedante, hay una serie de situaciones en las que tal activación es indeseable. Un área particular está asociada con los trasplantes, en los que rara vez existe una concordancia perfecta entre el donante y el receptor de los antígenos MHC. Otra situación clínica es una enfermedad autoinmune. Los CTL atacan las células en las que el MHC y el péptido asociado son ambos endógenos, como ocurre en las enfermedades tales como la diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM). Otros sucesos indeseables de activación del sistema inmunitario están asociados con enfermedades tales como el shock séptico, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, asma, enfermedad del injerto frente al hospedante, enfermedad de las arterias coronarias y otras cardiomiopatías, síndrome de distrés respiratorio en adultos, cirrosis hepática vírica, y similares.

La inmunodepresión ha llegado a ser un método general en situaciones en las que se desea la inhibición de la activación de las células CTL, NK y otras células tipo NK. Sin embargo, los inmunodepresores tales como los corticoesteroides, la ciclosporina A, FK506, y similares, tienen numerosos efectos secundarios indeseables incluyendo, por ejemplo, un efecto inmunodepresivo general sobre todo el sistema inmunitario del hospedante. Existe por tanto, un interés sustancial por identificar nuevas composiciones que puedan proteger específicamente a los tejidos del daño causado por células tales como linfocitos T y otras células tipo NK, particularmente los CTL, a la vez que tengan un efecto inmunodepresivo menos universal sobre el sistema inmunitario y menos efectos secundarios, de manera que deje al hospedante con una proporción sustancial del sistema inmunitario para protección frente a infecciones casuales. Se proporcionan aquí métodos y composiciones para conseguir tal inmunodepresión específica.

Bibliografía relevante

Hoppe and Negrin, Blood, American Society of Hematology, Thirty-Ninth Annual Meeting, December 5-9 (1997), abstract no. 2019, Jiang et al., Immunology 87 (3): 481-486 (1996); Wada et al., Jpn. J. Cancer Res. 84(8): 906-913 (1993), Krensky et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 5: 809 (1996). XP-002278849 Kureha Chemicals, 1994 y JP 07233083 A (KUREHA CHEM IND CO LTD), 5 september 1995, abstract; WO 95/21614; Satch et al., The Journal of Cell Biology, Vol. 133, No. 2, 469-483 (April 1996); Verrico et al., British Journal of Cancer 76(6): 719-724 (1997) y EP 0 813 871.

El abstract Hoppe et al., 1997 se refiere al tratamiento de las HUVEC con Brefeldin A que las hace resistentes frente a las células activadas ClK CTL CD3+ 16-56+ y las células NK activadas por IL-2. Además, este abstract describe que la HuHsp47 recombinante clonada protege previamente a las HUVEC sensibles a la toxicidad de la destrucción no restringida por el MHC I mediante ClK CTL CD3+ 56+. Las células ensayadas no forman parte del sistema inmunitario activo y no permiten ninguna conclusión con respecto a la prevención o tratamiento de un daño celular mediado por el sistema inmunitario.

Satch, 1996 trata de la localización en la que Hsp47 se asocia y se disocia de las cadenas de procolágeno en los fibroblastos de embrión de pollo y además de esto apoya que la función de Hsp47 permanece abierta (página 482, último párrafo). En este documento no se describe ninguna composición farmacéutica para prevención o tratamiento de enfermedades relacionadas con el daño a las células, tejidos u órganos, mediado por el sistema inmunitario
humano.

Verrico et al., 1996, trata de la expresión de Hsp47 en fibroblastos de piel murinos, después de lesiones fotodinámicas y no proporciona ninguna indicación de su posible función en el sistema inmunitario humano.

El documento EP 0813871 trata de la inhibición de la producción de Hsp47 mediante derivados de Barberina con el fín de tratar las enfermedades causadas por sobreproducción de colágeno. No trata del sistema inmunitario humano.

XP-002278849 Kureha Chemicals, 1994 trata del aumento de la síntesis de colágeno en osteoblastos de rata y no proporciona ninguna base para el ensayo de Hsp47 con respecto al sistema inmunitario humano.

El documento WO 95/21614 publicado en 1995 proporciona compuestos estructuralmente relacionados con Brefeldin pero no da ninguna indicación sobre ningún uso en el aumento de Hsp47 para prevenir el daño mediado por el sistema inmunitario.

Sumario de la invención

Se proporcionan aquí una composición farmacéutica que comprende el polipéptido HuHsp47, composiciones y métodos para proteger las células, órganos y otros tejidos, tales como las células endoteliales vasculares, del daño causado por los linfocitos, células NK y células tipo NK. Estas composiciones son útiles bien por sí mismas o en combinación con otros agentes inmunodepresores u otros compuestos terapéuticos como una terapia combinada. Estas composiciones se pueden poner en contacto ex vivo con células, tejidos o un órgano. En algunas realizaciones, el material tratado se trasplanta después a un receptor. Las mencionadas composiciones se pueden introducir también in vivo por cualquier medio conveniente, en cantidad suficiente para proteger sustancialmente las células, órganos y/o otros tejidos del daño mediado por el sistema inmunitario. Dichas composiciones son preferiblemente polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 o ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos.

En una realización preferida, las células, tejidos u órganos se ponen en contacto con una cantidad inmunoprotectora de un polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47. Ejemplos de las enfermedades que causan el daño mediado por el sistema inmunitario incluyen diferentes enfermedades autoinmunes, la enfermedad del injerto frente al hospedante y la enfermedad del hospedante frente al injerto.

La invención incluye también moléculas quiméricas de polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 y formas marcadas de los mismos. Se describen también métodos para la inmunoterapia adoptiva en los que un conjunto expandido de linfocitos T es devuelto a un paciente con una cantidad inmunoprotectora de brefeldin o de un polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47.

Se describen también métodos para identificar las células que se unen a los polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia de aminoácidos del cDNA y de la proteína del Hsp47 humano, respectivamente.

La Figura 2 describe las secuencias relacionadas entre Hsp47, antígenos HLA-A e IL-12 así como las secuencias de consenso.

Las figuras 3A, 3B y 3C demuestran la lisis mediada por las CIK de tumores dianas y células endoteliales (EC).

La Figura 4 demuestra la lisis del tumor por CIK y la lisis de las EC como una función de la concentración de brefeldin A (BFA).

Las figuras 5A, 5B y 5C muestran la inmunodetección de la inducción de Hsp47 en extractos de células endoteliales no tratadas, tratadas con 3 \mug/ml y con 10 \mug/ml de BFA.

Las figuras 6A y 6B muestran la purificación por FPLC de p46 procedente de extractos de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) inducido por BFA.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de protección HUVEC-CIK con Hsp47 nativo purificado (p46.5).

Las figuras 8A y 8B muestran la clonación de un casete génico de huHsp47 mediante la introducción dirigida por la PCR de sitios de clonación y la separación electroforética de los productos de expresión.

La Figura 9 muestra que la rHsp47 proporcionada externamente protege a las células HUVEC de la lisis mediada por CIK.

La Figura 10 muestra un análisis Northern que confirma el aumento del mRNA de Hsp47 por tratamiento con BFA.

La Figura 11 muestra que la expresión recombinante de huHsp47 hace a las células HUVEC resistentes a la lisis mediada por CIK.

La Figura 12 muestra que el péptido "AVLSAEQLR" que es compartido por ambos Hsp47 y HLA-A2*201 protege a las células HUVEC de la lisis mediada por CIK.

La Figura 13 demuestra la protección frente a la enfermedad del injerto frente al hospedante mediante recombinante Hsp47 en conjunción con el trasplante de médula ósea.

Las figuras 14A y 14B demuestran la inducción de Hsp47 y otras proteínas por BFA.

Las figuras 15A, 15B y 15C representan los dominios estructurales de Hsp47, la truncación en C-terminal de diferentes dominios y su efecto sobre la lisis de las células EC.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan métodos y una composición para proteger células, órganos y tejidos, tales como las células endoteliales vasculares, de los daños mediados por el sistema inmunitario causados por linfocitos activados, células NK y otras células tipo NK. Los métodos y composiciones se utilizan para el tratamiento de una variedad de indicaciones adversas que están mediadas por las células activadas del sistema inmunitario incluyendo, por ejemplo, shock séptico, escleroderma, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, asma, enfermedad del injerto frente al hospedante, enfermedad de las arterias coronarias y otras cardiomiopatías, síndrome de distrés respiratorio en adultos, y cirrosis hepática vírica, y similares.

Las composiciones inmunoprotectoras de la presente invención comprenden polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47.

Como se usa aquí, el término "polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47" se refiere a cualquier polipéptido que tiene propiedades inmunoprotectoras que son similares a las del polipéptido Hsp47 como se define aquí. Por ejemplo, se ha demostrado que el polipéptido humano Hsp47 protege las células endoteliales de la lisis de las células CIK. Un polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 debe ser uno que comparte cualitativa o cuantitativamente ésta u otras propiedades inmunoprotectoras de la proteína Hsp47 humana.

En un aspecto de la invención, el polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 se caracteriza adicionalmente por un motivo de secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia global de consenso como se indica en la Figura 1. Este puede ser representado como AX_{1}X_{2}X_{3}AX_{4}X_{5}X_{6}R. En una realización preferida, X_{1} es V, L, A o T, X_{2} es L o H, X_{3} es S o V, X_{4} es D o E, X_{5} es Q, K o R, y X_{6} es L o V. Este puede ser representado alternativamente como A(v,l,a,t)(l,h)(s,v)A(d,e)(k,q,r)(l,v)R.

Un polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 puede comprender también una secuencia de consenso de IL-12 tal como la que se muestra en la Figura 2. Esta puede ser representada como AX_{1}LSAEX_{5}X_{6}R donde X_{1} es preferiblemente V, L o T, X_{5} es preferiblemente Q, K o R, y X_{6} es L o V. Este aspecto de la invención puede ser representado también como A(v,l,t)LSAE(q,k,r)(l,v)R.

En otro aspecto más de la invención, el polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 comprende la secuencia de consenso como se indica para HLA-A como se indica en la Figura 1. Esta puede ser representada como AX_{1}X_{2}X_{3}AEQLR. En esta realización, X_{1} es preferiblemente V o A, X_{2} es preferiblemente L o H, X_{3} es preferiblemente S o V. Este aspecto de la invención puede ser representado también como A(v,a)(l,h)(s,v)AEQLR.

En un aspecto de la invención particularmente preferido, el polipéptido relacionado con Hsp47 comprende la secuencia de consenso para Hsp como se indica en la Figura 2. Esta puede ser representada como AVLSAX_{4}X_{5}LR. En esta realización, X_{4} es preferiblemente D o E, y X_{5} es preferiblemente K o Q. Este aspecto de la invención puede ser representado también como AVLSA(d,e)(k,q)LR.

En otra realización preferida más, el polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 tiene la secuencia AX_{1}X_{2}
X_{3}AEQLR, donde X_{1}, X_{2} y X_{3} pueden ser cualquier aminoácido y polipéptidos Hsp47 preferiblemente comprendiendo la secuencia AVLSAEQLR.

La Figura 2 muestra la relación entre la secuencia peptídica que abarca los restos 96 a 104 de Hsp47 humano en comparación con motivos similares encontrados en otras moléculas específicas de antígeno HLA-A y en IL-12. Por consiguiente, en el método de reducir los daños mediados por el sistema inmunitario, cualquier polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 que incluye HLA-A, Hsp47 e IL-12 y fragmentos inmunoprotectores o variantes de los mismos.

Como se usa aquí, el término "polipéptido Hsp47" se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia indicada en la Figura 1. El término incluye también proteínas que tienen al menos una identidad del 70% de la secuencia de aminoácidos con la secuencia que se indica en la Figura 1, más preferiblemente mayor del 90%, lo más preferiblemente una identidad mayor del 95% con la secuencia indicada en la Figura 1. El término se refiere también a una proteína codificada por un ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico que tiene la secuencia indicada en la Figura 1 en condiciones moderadas o restrictivas como se indica en más detalle de aquí en adelante. La definición de polipéptido Hsp47 incluye también fragmentos inmunoprotectores y variaciones alélicas así como modificaciones introducidas por la técnica recombinante para sustituir, insertar o delecionar uno o más restos de aminoácidos.

La secuencia completa del cDNA de Hsp47 humano está indicada en la Figura 1A. Está dentro del nivel de los expertos en la técnica preparar polipéptidos Hsp47 purificados recombinantes o sintéticos. Está también dentro del nivel de los expertos en la técnica identificar otros cDNA de Hsp47 y polipéptidos a partir de vertebrados tales como mamíferos y emplear estos cDNA y polipéptidos Hsp47 no humanos en las mencionadas composiciones y métodos. Por ejemplo, se conocen homólogos de Hsp47 humano en los pollos y en las ratas. Como tales, los polipéptidos Hsp47 como se utilizan aquí incluyen polipéptidos Hsp47 y fragmentos y variantes inmunoprotectores de los mismos procedentes de todos los vertebrados, preferiblemente mamíferos y lo más preferiblemente los seres humanos. Con respecto a las variantes y fragmentos de las proteínas Hsp47 de longitud completa que se utilizan aquí, "inmunoprotector" y sus equivalentes gramaticales significa que la variante(s) o fragmento(s) son capaces de reducir o eliminar el daño a células, órganos o tejidos que es causado por los linfocitos activados, células NK o células tipo NK, en comparación con el daño a las células, órganos o tejidos que podrían ser causados por tales células en la ausencia del agente inmunoprotector.

Con respecto a los fragmentos peptídicos del polipéptido Hsp47 de longitud completa u otro polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 que se pueden utilizar aquí, estos fragmentos de la secuencia de aminoácidos tendrán generalmente al menos aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos, usualmente al menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 15 aminoácidos consecutivos y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia de la proteína Hsp47. La secuencia activa puede estar unida o ligada no covalentemente dentro de una cadena o como una cadena lateral de otros péptidos o proteínas, para una variedad de fines.

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Los polipéptidos inmunoprotectores Hsp47 así como otros polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 que se pueden utilizar aquí, pueden comprender una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras típicas se muestran en la Tabla 1 con el título de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones no producen un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados ejemplos de sustituciones en la Tabla 1, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

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TABLA 1

1

Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido Hsp47 que se utilizan en estas composiciones y métodos tendrán al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia nucleotídica, usualmente al menos aproximadamente 75%, más usualmente al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia nucleotídica con la correspondiente secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1A.

El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido Hsp47 identificadas aquí, se define como el porcentaje de restos aminoácidos de una secuencia candidato que son idénticos a los restos aminoácidos de la secuencia natural de Hsp47 humano (véase la Figura 1A), después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia nucleotídica" con respecto a las secuencias que codifican el polipéptido Hsp47 identificadas aquí, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos a los de la secuencia nucleotídica mostrados en la Figura 1, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia. Los valores de% de identidad usados aquí se generan mediante el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html. El programa WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se fijan para valores por defecto. Los parámetros ajustables están fijados con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular frente a la cual se está buscando la secuencia de interés; sin embargo, se pueden ajustar los valores para aumentar la sensibilidad. El valor de% de identidad de la secuencia de aminoácidos se determina por el número de restos idénticos concordantes dividido por el número total de restos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es aquella que tiene la mayoría de restos verdaderos en la región alineada (los espacios introducidos por el programa WU-Blast-2 para maximizar el resultado del alineamiento se ignoran).

Los polipéptidos Hsp47 u otros polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 que se pueden utilizar aquí pueden estar fusionados con secuencias de aminoácidos heterólogas con el fin de proporcionar proteínas quiméricas o de fusión que se podrán utilizar en la presente invención. Adicionalmente, los polipéptidos Hsp47 y los polipéptidos relacionados con Hsp47 que se pueden utilizar aquí, se pueden obtener a partir de la expresión recombinante de las secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos deseados. A este respecto, las secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos Hsp47 de la presente invención se hibridarán con la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1 en condiciones moderadamente restrictivas, preferiblemente en condiciones restrictivas. Como se usa aquí, "condiciones restrictivas" significa (1) emplear baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM (0,1 x SSC)/dodecilsulfato de sodio 0,1% a 50ºC, o (2) emplear durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (volumen/volumen) con seroalbúmina bovina al 0,1%/FicoII al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 nM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM (5x SSC) a 42ºC. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 6/8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%. Otro ejemplo más es la hibridización utilizando un tampón de sulfato de dextrano al 10%, 2 x SSC y formamida al 50% a 55ºC, seguido por un lavado de alta restricción que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente restrictivas" están descritas en Sambrook et al., cita anterior, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, y % de SDS) menos restrictivas que las descritas antes. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es una condición tal como la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de DNA de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. Los expertos reconocerán cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., cuando sea necesario acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

El término "aislado," cuando se utiliza para describir los diferentes polipéptidos Hsp47 o los polipéptidos relacionados con Hsp47 descritos aquí, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir típicamente con los usos de diagnóstico o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos en N-terminal o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido Hsp47 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, se preparará el polipéptido aislado mediante al menos una etapa de purificación. Los polipéptidos Hsp47 aislados preferiblemente no contienen anticuerpos específicos frente a Hsp47 unidos a ellos.

Un ácido nucleico "aislado" que codifica el polipéptido Hsp47 o los polipéptidos relacionados con Hsp47 es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa a partir de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la que está ordinariamente asociado en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido relacionado con Hsp47. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido relacionado con Hsp47 es distinta en la forma o en la posición de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido relacionado con Hsp47 se distinguen por tanto de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido relacionado con Hsp47 que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido relacionado con Hsp47 incluye las moléculas de ácido nucleico que codifica el polipéptido Hsp47 contenidas en células que expresan ordinariamente el polipéptido Hsp47 en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada operativamente en un particular organismo hospedante. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen una secuencia promotora, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El ácido nucleico está "operativamente ligado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o líder secretor está operativamente ligado al DNA para un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a los ribosomas está operativamente ligado a una secuencia codificadora si está colocado de forma que facilite la traducción. Generalmente, "operativamente ligado" significa que las secuencias de DNA que están ligadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El ligamiento se consigue mediante la unión a sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se utilizan adaptadores o enlaces sintéticos de oligonucleótidos de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales simples anti polipéptido Hsp47 (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes) y las composiciones de anticuerpo anti-Hsp47 con especificidad poliepitópica. Los anticuerpos preferiblemente no se unen a los epítopos reactivos con Mab N6 o Mab SPA470. En un aspecto, los anticuerpos son específicos para los epítopos definidos por las mencionadas secuencias de consenso. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto en las posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia", como se usan aquí, se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica, y terapia preventiva.

El término "mamífero" como se usa aquí, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los seres humanos, las vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.

Los polipéptidos relacionados con Hsp47 o los fragmentos de los mismos pueden ser marcados utilizando técnicas estándar para incorporar radio-marcas, por ejemplo, ^{32}P, marcas fluorescentes, etc. Se pueden añadir restos adicionales para facilitar la purificación del polipéptido solo o en conjunción con la unión a las células. Por ejemplo, los polipéptidos Hsp47 que incluyen una marca fluorescente facilitan la clasificación de las células activadas por fluorescencia. Adicionalmente, los restos que son capaces de interactuar con un campo magnético pueden estar ligados a Hsp47. En el último caso, se pueden usar perlas magnéticas unidas a avidina combinando las mismas con polipéptido marcado con biotina.

Se identificó Hsp47 como una proteína inducida en las células endoteliales tratadas con brefeldin A. En adición a la Hsp47 (identificada como la banda de 465 KDa en la Figura 14A y como p47 en la Figura 14B), otras proteínas son inducidas por brefeldin A. Estas incluyen la proteína denominada p27 en la Figura 14B y una banda débil por encima de p47 en la Figura 14B que tiene un peso molecular de aproximadamente 60-70 KDa. Tales proteínas adicionales pueden ser también polipéptidos inmunoprotectores útiles para inhibir la respuesta inmunitaria solos o en combinación con todas las otras proteínas inducidas por brefeldin A.

Las moléculas mencionadas se pueden utilizar para identificar células que se unen al polipéptido Hsp47 o un fragmento del mismo. Se puede realizar la detección de la presencia de tales marcas por cualquier técnica convencional, tal como radiografía, detección por fluorescencia, clasificación de células activadas por fluorescencia y divergencia en un campo magnético dependiendo del tipo particular de polipéptido Hsp47 modificado utilizado.

Las composiciones mencionadas se utilizan de muchas formas. Con fines de investigación, se pueden utilizar para analizar las rutas fisiológicas asociadas con la inmunoprotección y/o activación e inactivación de los linfocitos T, células NK y otras células del sistema inmunitario tipo NK así como para la inmunoprotección de diferentes tejidos de mamíferos, incluyendo el endotelio vascular. Por ejemplo, se pueden combinar los linfocitos, particularmente las líneas de células CTL que tienen dianas peptídicas conocidas en conjunción con las presentes composiciones, en presencia y ausencia de células presentadoras de antígeno a las que están restringidas las CTL. Después de la lisis por las CTL, se pueden separar entonces las células CTL activadas de las células CTL en reposo por medio del marcador CD69, cuyo marcador se regula por incremento in vitro después de la activación. Se puede conseguir la separación utilizando un FACS y un anti-CD69 marcado con fluorescencia.

Aislando las células más fluorescentes, por ejemplo las superiores al 25%, se pueden lisar entonces las células y aislar las proteínas asociadas con los marcadores indicados, por ejemplo, cromatografía, electroforesis no desnaturalizante, o similares. Alternativamente, se separan las proteínas utilizando electroforesis y después utilizando una transferencia Western u otra técnica con los péptidos marcados para identificar las proteínas con las que se une el péptido indicado. En lugar de una radiomarca, se puede emplear cualquier otro tipo de marca, normalmente una molécula orgánica pequeña, tal como biotina, un fluorescente, y similares. Cuando se usa biotina, después de la separación, se puede añadir avidina, donde la avidina está marcada con una marca como se ha descrito previamente.

Se pueden comparar también los linfocitos que han sido combinados con células presentadoras de antígeno en presencia y en ausencia de las mencionadas composiciones inmunoprotectoras. Se pueden preparar genotecas de cDNA en cada caso y se puede emplear análisis diferencial representacional, sustracción, o similares para detectar las diferencias en la expresión entre las células que han sido activadas en presencia y en ausencia de las composiciones. Se puede determinar también si los subconjuntos particulares de linfocitos u otras células del sistema inmunitario responden de forma diferente que otros subconjuntos a las composiciones inmunomoduladoras mediante su expresión o falta de expresión o una o más proteínas, particularmente las proteínas de la superficie de la membrana. De este modo, se pueden identificar los linfocitos que se pueden separar por leucoforesis o similares, con el fin de reducir un ataque no deseado de los linfocitos a los tejidos.

Dependiendo de su uso previsto, particularmente para administración a hospedantes mamíferos, los polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47, por ejemplo, polipéptidos Hsp47, se pueden modificar para cambiar su distribución en el torrente sanguíneo, disminuir o aumentar su unión a los componentes de la sangre, mejorando el tiempo de vida del polipéptido en el torrente sanguíneo, y similares. Los polipéptidos inmunoprotectores se pueden unir a estos otros componentes mediante enlaces que son escindibles o no escindibles en el entorno fisiológico de la sangre. Los polipéptidos inmunoprotectores pueden estar unidos en cualquier punto del polipéptido en el que esté presente un grupo funcional, tal como hidroxilo, tiol, carboxilo, amino, o similares. De forma deseable, la unión se realizará o en el N-terminal o en el C-terminal.

Las composiciones inmunoprotectoras relacionadas con Hsp47 de la presente invención se pueden unir también con una amplia variedad de otros oligopéptidos o proteínas para una serie de propósitos. Por ejemplo, los componentes de estas composiciones pueden estar ligados covalentemente a un inmunógeno para producir anticuerpos frente a los componentes de dichas composiciones, donde los anticuerpos pueden servir para la identificación de otros péptidos que tienen una conformación comparable. En adición, se pueden utilizar los anticuerpos para preparar anticuerpos anti-idiotípicos que pueden competir con las presentes proteínas o péptidos para unirse a un sitio diana. Estos anticuerpos anti-idiotípicos pueden ser usados entonces para identificar las proteínas a las que se unen las presentes proteínas y/o péptidos. Alternativamente, los polipéptidos inmunoprotectores se pueden expresar conjuntamente con otros péptidos o proteínas, de manera que sean una porción de la cadena, o interna, o el N- o C-terminal. Proporcionando la expresión de las presentes proteínas y péptidos, se pueden conseguir diferentes modificaciones post-expresión. Por ejemplo, empleando las secuencias codificadoras apropiadas, se puede proporcionar lipidación, por ejemplo, prenilación o miristilación. En esta situación, los polipéptidos inmunoprotectores estarán unidos a un grupo lipídico en un terminal, de manera que sean capaces de unirse a una membrana lipídica, tal como un liposoma. Para la administración, se pueden usar liposomas, en los que se pueden introducir fármacos dentro del lumen del liposoma, de manera que cooperen con los presentes polipéptidos para proteger los tejidos del daño mediado por el sistema inmunitario. De este modo, se pueden incluir los inmunodepresores en el lumen, de forma que las presentes composiciones y los inmunodepresores puedan actuar de manera localizada.

Los polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 tales como Hsp47 pueden ser PEGilados, en los que el grupo polietilenoxi se encarga de aumentar el tiempo de vida en el torrente sanguíneo. Los polipéptidos derivados de Hsp47 u otros polipéptidos inmunoprotectores pueden ser combinados también con otras proteínas, tales como la Fc de un isotipo IgG, que pueden ser de unión al complemento o no unidas al complemento, o con una toxina, tal como ricina, abrina, toxina diftérica, o similares, particularmente la cadena A.

Los polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 se pueden modificar de muchas formas. Se pueden preparar análogos de la secuencia mediante síntesis de oligopéptidos utilizando una sustitución en etapas de los aminoácidos en cada posición con alanina o valina, particularmente alanina. Generalmente el número total de aminoácidos sustituidos no excederá de 3, variando de 1 a 3, usualmente 1 a 2. Los métodos para hacer "exploración" de mutaciones son conocidos en la técnica, y se han utilizado satisfactoriamente con una serie de péptidos diferentes. Ejemplos de protocolos para exploración de mutaciones se pueden encontrar en Gustin, et al. Biotechniques 14: 22 (1993); Barany, Gene 37: 111-123 (1985); Colicelli, et al. Mol Gen Genet 199: 537-539 (1985), y Prentki, et al. Gene 29: 303-313 (1984).

Se pueden preparar estas composiciones preparando un gen que codifica un polipéptido inmunoprotector relacionado con Hsp47 tal como el polipéptido Hsp47 (véase, por ejemplo, la Figura 1A). Se puede introducir el gen en un vector de expresión apropiado, habiendo muchos vectores de expresión comercialmente disponibles, con lo que el gen se expresa entonces en un hospedante apropiado. Véase, Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Los polipéptidos inmunoprotectores relacionados con Hsp47 se pueden preparar por síntesis o utilizando técnicas recombinantes, como se ha indicado antes. Hay disponibles varios aparatos comerciales sintéticos, por ejemplo sintetizadores automáticos de Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Beckman, etc. Utilizando sintetizadores, los aminoácidos naturales pueden ser sustituidos con aminoácidos no naturales, particularmente D-estereoisómeros, cadenas laterales que tienen diferentes longitudes o funcionalidades, y similares. Para las técnicas recombinantes, se puede preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica una pluralidad de los presentes polipéptidos en tandem, con un aminoácido o secuencia interpuesto, que permite la escisión hasta el polipéptido o individual o cabeza del dímero de cola. Cuando la metionina está ausente, se puede tener una metionina interpuesta que permite la escisión a un aminoácido individual. Alternativamente, se pueden introducir secuencias de consenso, que son reconocidas por proteasas particulares para la escisión enzimática. La secuencia particular y el modo de preparación serán determinados según la conveniencia, cuestiones económicas, pureza requerida, y similares.

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La mayor parte de las veces, las composiciones que se utilizan comprenderán al menos 20% en peso del producto polipéptido deseado, más usualmente al menos aproximadamente 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente 95% en peso, y con fines terapéuticos. usualmente al menos aproximadamente 99,5% en peso, con relación a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Usualmente, los porcentajes se basan en el polipéptido total.

Por "brefeldin A" se indica el compuesto que tiene la fórmula 1,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a-decahidro-1,13-dihidroxi-6-metil-4H-ciclopent[f]oxaciclotridecin-4-ona, que se conoce habitualmente en la técnica como brefeldin A, así como cualquier otro miembro de la clase del fármaco brefeldin A u otros fármacos con el mismo o similar mecanismo de acción.

Por "cantidad inmunoprotectora" se indica la cantidad de brefeldin A o polipéptido inmunoprotector o ácido nucleico expresable que lo codifica, que es capaz de reducir o eliminar la destrucción de un tejido mediada por los linfocitos, las células NK o las células tipo NK, preferiblemente un tejido endotelial vascular. Las cantidades inmunoprotectoras pueden diferir dependiendo de la indicación para la que se emplea la composición y pueden ser determinadas empíricamente y sin experimentación excesiva por los expertos en la técnica.

Con respecto al brefeldin A, dicho fármaco, así como los fármacos de la misma clase y los fármacos que tienen el mismo o similares mecanismos de acción, son bien conocidos y se emplean rutinariamente en la técnica (véase, por ejemplo, Jiang et al., cita anterior y Wada et al., cita anterior).

Las presentes composiciones que incluyen polipéptidos relacionados con HuHsp47 y ácidos nucleicos expresables que codifican tales polipéptidos inmunoprotectores o sus combinaciones se pueden utilizar in vitro para inhibir la lisis por células T o NK de las células diana presentadoras de antígeno, particularmente las células endoteliales vasculares. Así, en investigación cuando se desea mantener mezclas de células, en las que los linfocitos deberían ser activados y destruir las células presentadoras de antígeno, tales como los macrófagos o linfocitos B, u otras células que pueden servir como células diana, por ejemplo, células neoplásicas, células infectadas por virus, o similares, se puede inhibir la lisis de tal modo que se puede mantener la población celular durante la investigación.

Las presentes composiciones que incluyen polipéptidos relacionados con HuHsp47 y ácidos nucleicos expresables que codifican tales polipéptidos inmunoprotectores o sus combinaciones también se pueden utilizar ex vivo. En los casos de trasplante de órganos o células, más particularmente de órganos sólidos o células particulares, por ejemplo, médula ósea, ya sea xenogénico o alogénico, el órgano o células del donante pueden estar bañados en un medio que comprende las presentes composiciones. De este modo, los linfocitos presentes con el implante serán inhibidos de participar en la enfermedad del injerto frente al hospedante. Generalmente, la concentración de la composición variará en el medio, dependiendo de la actividad de la composición, del nivel de inhibición deseado, de la presencia de otros compuestos que afectan a la activación de CTL, y similares. Usualmente, la concentración estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 100 \mug/ml de polipéptido, más usualmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 10 \mug/ml, aunque también se pueden usar concentraciones fuera de estos intervalos. Otros componentes del medio del baño generalmente serán constituyentes normalmente usados en una solución de conservación de órganos, por ejemplo HBSS. El tiempo durante el cual se debe mantener el órgano en el medio estará generalmente en el intervalo de aproximadamente 2 a 72 h.

Las presentes composiciones que incluyen polipéptidos relacionados con HuHsp47 y ácidos nucleicos expresables que codifican tales polipéptidos inmunoprotectores o sus combinaciones también se pueden emplear in vivo, administrando las presentes composiciones por cualquier medio conveniente para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o para facilitar los trasplantes de órganos o de células (por ejemplo, médula ósea). En el caso de trasplante, las presentes composiciones se pueden administrar antes del implante, empezando usualmente la administración no más tarde de aproximadamente 14 días antes del implante, siendo preferiblemente de al menos una dosis administrada en tres días de administración. Las presentes composiciones se pueden administrar en el periodo que comienza aproximadamente 6 h antes del implante y se puede continuar con un programa predeterminado, usualmente no después de 30 días, más usualmente no después de 20 días. Sin embargo, después del implante, las presentes composiciones se pueden administrar según sea necesario, dependiendo de la respuesta del receptor al órgano o a las células. En algunas situaciones, las presentes composiciones se pueden administrar crónicamente, mientras el implante esté presente en el hospedante. Otras formas de uso in vivo incluyen la inyección de las presentes composiciones en áreas de inflamación, por ejemplo, articulaciones, ligamentos, tendones y similares así como en diferentes órganos tales como el
hígado.

Otros inmunodepresores que pueden estar presentes durante el tratamiento in vitro, ex vivo o in vivo incluyen formas inyectables, parenterales o tópicas de cortisona, hidrocortisona, corticoesteroides modificados, Ciclosporina A, FK506, Imuran, azatioprina, D-penicilamida, MMF (Mofetyl), Metotrexato, ciclofosfamida, preparaciones de oro, salicilatos, sufazalisina, antipalúdicos y NSAIDS. También se pueden utilizar agentes biológicos conjuntamente con las presentes composiciones, incluyendo anti-CD5, Campath Mab, anti-CD4, toxina de fusión difteria-IL-2, TNF-R soluble y dímero, IL-1-R soluble, Mab quiméricos anti-TNF-alfa, Mab anti-ICAM-1, OKT3, suero anti-timocitos/A6, anti-IL6, anti-IL-2, antiCD7, así como anticuerpos frente a CD4, CD8, CD3, LFA-1 y CD28. Las dosis subterapéuticas serán empleadas, generalmente cuando están presentes, en no menos de aproximadamente 5% de la dosis normal, y no más de aproximadamente 75%, usualmente en el intervalo de aproximadamente 10 a 60%.

En algunos casos, las presentes composiciones se pueden administrar en combinación con diferentes inmunoestimulantes. Tales realizaciones existen cuando el sistema inmunitario ha sido comprometido, por ejemplo, por medio de agentes quimioterapéuticos. En tales casos, es deseable reforzar la respuesta inmunitaria. El uso de las presentes composiciones en combinación con inmunoestimulantes tales como IL-2 y otras interleucinas, interferones, citocinas o quimiocinas reduce los efectos secundarios asociados con los mismos. Tales efectos secundarios incluyen la mejora del síndrome de fuga vascular que a menudo se asocia con los tratamientos con inmunoestimulantes.

Generalmente, cuando se administra un bolus de la presente composición, estará en el intervalo de aproximadamente 0,1-50, más usualmente de aproximadamente 1-25 mg/kg, de hospedante. El hospedante puede ser cualquier mamífero incluyendo los animales domésticos, mascotas, animales de laboratorio, primates, particularmente los seres humanos. La cantidad generalmente se ajustará dependiendo de la semivida del fármaco o polipéptido inmunoprotector, donde la semivida será generalmente de al menos un minuto, más usualmente de al menos aproximadamente 10 min, de forma deseable en el intervalo de aproximadamente 10 min a 12 h. Las semividas cortas son aceptables, siempre que se pueda conseguir la eficacia con dosis individuales o perfusión continua o dosis repetitivas. Se pueden emplear las dosis en la porción más baja del intervalo e incluso dosis más bajas, cuando el fármaco o polipéptido tiene una mejor semivida o se proporciona como un depósito, tal como una composición de liberación lenta que comprende partículas, introducidas en una matriz que mantiene el péptido a lo largo de un extenso periodo de tiempo, por ejemplo, una matriz de colágeno, el uso de una bomba que infunde de forma continua el péptido a lo largo de un extenso periodo de tiempo con una tasa sustancialmente continua, o similares.

El trasplante puede implicar cualquier órgano o células, incluyendo órganos tales como corazón, riñones, pulmón, ojos, hígado, intestino, vasos sanguíneos, u otro órgano, y células, tales como células del islote \beta, células de médula ósea, u otras células, donde el órgano o células son alogénicos o xenogénicos, particularmente donde uno o más de los antígenos MHC de clase I o II son diferentes en el donante en comparación con el receptor.

Las presentes composiciones inmunoprotectoras que incluyen polipéptidos inmunoprotectores relacionados con HuHsp47 y ácidos nucleicos que los codifican, por sí mismos como conjugados o como sus combinaciones, se pueden preparar como formulaciones en medios farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, solución salina, PBS, etanol acuoso, glucosa, propilenglicol, o similares o como formulaciones sólidas en excipientes apropiados, generalmente en una dosis farmacológicamente eficaz. Las concentraciones del polipéptido HuHsp47 u otro polipéptido inmunoprotector relacionado serán determinadas empíricamente de acuerdo con procedimientos convencionales para el propósito particular. Las formulaciones pueden incluir agentes bactericidas, estabilizantes, tampones, o similares. La cantidad administrada al hospedante variará dependiendo de lo que se está administrando, del propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia, del estado del hospedante, del modo de administración, del número de administraciones y del intervalo entre administraciones, y similares. Con el fin de mejorar la semivida de las presentes composiciones, las composiciones pueden ser encapsuladas, introducidas en el lumen de liposomas, preparadas como un coloide, o se pueden emplear otras técnicas convencionales, que proporcionan una extensión del tiempo de vida de las composiciones ex vivo o in vivo. En general, se pueden envasar dosis de cantidades inmunoprotectoras en forma líquida o sólida (por ejemplo, liofilizada) en recipientes apropiados tales como viales, etc. Si es líquida, la composición está preferiblemente en un medio farmacéuticamente aceptable (vehículo). Si es sólida, se debe preparar de forma que cuando sea reformulada como un líquido (por ejemplo, con agua o un vehículo farmacéutico) se forme una composición farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos describen el efecto de brefeldin A y de los polipéptidos Hsp47 incluyendo el polipéptido AVLSAEQLR sobre la lisis, mediada por las células CIK, de cultivos de células endoteliales derivadas de muestras de cordón umbilical humano. Estos experimentos demostraron que la lisis de las células endoteliales por las CIK, es inhibida por brefeldin A y por al menos Hsp47 que se expresa tras el contacto de las células endoteliales con brefeldin A. La siguiente discusión resume los ejemplos indicados aquí así como otros resultados experimentales. Sin embargo, tales resultados son meramente ejemplos del alcance de la invención porque los métodos y composiciones de la invención se pueden utilizar para mejorar no solamente la lisis indeseable de las células endoteliales sino el daño a otras células, tejidos y órganos mediado por el sistema inmunitario. Además, el efecto de tales composiciones y métodos no se limita a las células CIK sino también a los linfocitos T citotóxicos no restringidos por el MHC I y a las células destructoras naturales en general. A este respecto, se debe observar también que mientras los métodos y composiciones de la invención inhiben los CTL no restringidos por el MHC I, otros modos de respuesta inmunitaria no están significativamente afectados. A este respecto, se realizó un experimento de BMT (trasplante de médula ósea) sobre ratones irradiados en todo el cuerpo tratados con un polipéptido Hsp47 o sin tratar. La enfermedad del injerto frente al hospedante apareció en el grupo no tratado con Hsp47. De los miembros del grupo tratado con Hsp47, ninguno desarrolló la enfermedad del injerto frente al hospedante. Además, ninguno desarrolló ninguna infección oportunista a la largo del periodo de tiempo de ensayo, lo que de otra manera se hubiera esperado si se hubiera suprimido todo el sistema inmunitario.

Los ejemplos demuestran que las CIK alogénicas y autólogas tienen una alta citotoxicidad frente a una variedad de dianas de tumores hematopoyéticos y sólidos incluyendo los tumores linfoides, mieloides, y sólidos así como frente a las EC cultivadas in vitro. Las CIK también lisan dianas adicionales de cáncer (Lopez et al., Faseb. J. 9: A1024 (1995); Lu et al., J. Immunol. 153: 1687-1696 (1994); Mehta et al., Blood 86: 3493-3499 (1995); Schmidt-Wolf et al., Ann. Hematol. 74: 51-56 (1997)). Todas las dianas estudiadas expresan niveles normales de MHC I. El Mab W6/32 anti-MHC clase I, un anticuerpo con probada capacidad para prevenir o romper las interacciones MHC I/TcR in vitro (Shields et al., Tissue Antigens 51: 567-570 (1998)) no bloquea la lisis de la diana mediada por CIK. La naturaleza del efecto GvL mediado por las CIK se demostró que era un proceso puramente autólogo, en los ensayos con liberación de ^{51}Cr utilizando CIK derivadas de la sangre del cordón y dianas endoteliales derivadas del cordón umbilical humano del mismo donante. Esto es consistente con el concepto de que las CIK representan células T citotóxicas restringidas por el MHC I no clásicas y excluye la posibilidad de que esta lisis observada representa el resultado de alo-reconocimiento.

Las CIK son notables por su fuerte efecto GvL sin causar GvHD (enfermedad del injerto frente al hospedante) medible en modelos murinos, un hallazgo confirmado también en el hombre. Este hallazgo fue documentado con el modelo para purgado de tumores in vivo, SCID/hu, en el linfoma de células B SU-DHL4 y en la leucemia mielógena crónica (Lu et al., J. Immunol. 153 1687-1696 (1994); Hoyle et al., Blood 92: 3318-3327 (1998)). En los ejemplos, se utilizó un sistema murino SCID con aloinjertos ortotópicos de piel humana de espesor total para proporcionar moléculas de adhesión a las células humanas en las paredes de los vasos sanguíneos de los injertos de piel. Esto demostró la falta de aloreconocimiento y la GvHD potencial por las CIK. Los injertos de piel establecidos no demostraron signos de infiltración de CIK, ni de inflamación ni GvHD. Solamente la neoangiogénesis de tumores sólidos, derivada, humana, llega a ser la diana selectiva de la vigilancia inmunitaria mediada por las CIK, pero no los lechos vasculares normales fisiológicos fuera de la proximidad del tumor.

Distintas diferencias en el reconocimiento de la diana por parte de las CIK aparecen claras en el análisis de las moléculas de adhesión a las células. Los presentes estudios demuestran que la interacción de ICAM-1 sobre las dianas tumorales con LFA-1 sobre las células efectoras CIK es crucial para el proceso de la lisis de las dianas tumorales mediada por las CIK. Esta interacción ICAM-1 /LFA-1 parece que no está implicada en la lisis EC mediada por CIK. Estos hallazgos son consistentes con los informes previos sobre los requerimientos de linfocitos T CD3^{+}56^{+} para la adhesión a las células diana (Lu et al., J. Immunol. 153: 1687-1696 (1994); Schmidt-Wolf, Cellular Immunology 169: 85-90 (1996)) como opuestos a su interacción con EC. Los CTL utilizan ICAM-1 y LFA-1 en su interacción con las dianas tumorales. Las células NK en ausencia de la unión MHC I/TcR lisan las dianas que no proporcionan suficientes señales de destrucción, en situaciones en que ICAM-1/LFA-1 proporciona la única señal estimulatoria identificada. El mecanismo de co-estimulación de las células T a través de la unión ICAM-l/LFA-1 se ha descubierto recientemente que implica la acumulación, mediada por la proteína motora miosina, de las moléculas de señal co-estimuladora en la interfase células T/diana tumoral, llevando a un proceso de señal amplificada y prolongada (Wulfing et al., Science 282: 2266-2269 (1998)). Este proceso puede ser capturado en tiempo real mediante micro-videografía de co-redistribución (Wulfing et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 6302-6307 (1998)). Esta interacción ICAM-1/LFA-1 es también crucial para el proceso de localizar los nódulos linfáticos en las vénulas endoteliales altas (Lawrence et al., Eur. J. Immunol. 2: 1025-1031 (1995); Oppenheimer-Marks et al., J. of Immunology 145: 140-148 (1990); Rosenman et al., J. of Leukocyte Biol. 53: 1-10 (1993)). La interacción ICAM-1/LFA-1 parece que no se requiere para su interacción con las EC no activadas, ya que se encontró que este proceso carece de recubrimiento de LFA-1 y TcR en su interacción con EC (Kozeny et al., .J. Clin. Oncol. 6: 1170-1176 (1988)). La presencia de una lisis tumoral dependiente de ICAM-1/LFA-1 y un proceso de lisis de EC independiente de ICAMl/LFA-1 da a entender la existencia de al menos dos rutas distintas de citotoxicidad mediada por las CIK.

La clonación de las células individuales de CIK demostró por primera vez que la lisis endotelial de células T destructoras restringidas por el MHC I no clásicas, activadas, con actividad anti-tumoral es una propiedad clonal de las T-células activadas. Los mecanismos de reconocimiento endotelial y tumoral citotóxico se mantienen independientemente uno de otro con los clones individuales de CIK CD3^{+}56^{+} que expresan ninguna, o una cualquiera de las dos, o ambas capacidades de reconocimiento de la diana. La gran mayoría de los clones CIK son células T \alpha/\beta, pero también se demostró que las células T \gamma/\delta pueden diferenciarse en las CIK citotóxicas.

La falta de capacidad lítica por las CIK, o del tumor o de la diana EC puede ser el resultado de al menos tres constelaciones clonales diferentes: cada clase de diana puede requerir una cascada específica de moléculas de señalización para reconocer a la misma; la falta de ciertos miembros de la cascada de señalización en un clon CIK particular puede llevar a una señalización defectuosa para una diana dada. Puede haber alternativamente una serie de rutas de señalización independientemente inhibidoras que interfieren con la ejecución de un suceso de reconocimiento citotóxico; la protección de la lisis por CIK puede resultar de la capacidad de una célula diana para expresar el ligando respectivo. Finalmente, la sensibilidad para un mecanismo particular de destrucción de CIK puede diferir entre las dianas tumorales y EC; por tanto las pautas individuales de expresión clonal y los niveles de mecanismos alternativos de ataque a la diana pueden explicar la diferencia observada en la lisis efectiva de la diana. El análisis por FACS muestra que las dianas expresan altos niveles de MHC I, y que las CIK funcionales expresan TcR \alpha/\beta, (>95%) o TcR \gamma/\delta (<5%), CD3/CD5 (>98%), CD8 (>80%) o CD4 (<15%), moléculas KIR (5-8% con tinción para DX9) y CD56 (>25% en cultivos en grandes cantidades, >98% de clones funcionales) (Lu et al., J. immunol 153: 1687-1696 (1994)). Sin embargo, no se ha podido demostrar la implicación funcional en el reconocimiento y lisis de la diana por las CIK para ninguna molécula de adhesión a las células aparte de las mencionadas anteriormente LFA-1 y ICAM-1 ni para las principales proteínas de superficie T y NK resumidas en la Tabla 2.

Se trataron las células efectoras con CMA y BFA (brefeldin A) (Kataoka et al., J. Immunol. 156: 3678-3686 (1996)) antes del ensayo de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr para estimar la contribución de la perforina/granzima frente a la citotoxicidad de las CIK basada en Fas para estas dianas. Los resultados demuestran que la lisis de EC se basa virtualmente completamente en la perforina y la granzima, mientras que las dianas tumorales se destruyen utilizando ambas rutas. La investigación previa ha demostrado que la lisis de dianas tumorales mediada por CIK es dependiente de cAMP y Ca2+ (Mehta et al., Blood 86: 3493-3499 (1995)).

Los resultados combinados del estudio de inhibición de la expresión de superficie FasL con BFA y el estudio de depleción de perforina con Concanamicina A indican que la citotoxicidad frente a las dianas tumorales está mediada por la granzima/perforina con significativa contribución de la ruta Fas/FasL. Por contraste, la lisis de EC, está mediada exclusivamente por la granzima/perforina. Este resultado confirma que existen diferencias entre la fisiología de EC y la diana tumoral que contribuyen a su sensibilidad frente a las CIK.

Es posible que las CIK sean células T auto-reactivas limitadas anérgicas (Schwartz, Curr. Opin. Immunol. 9: 351-357 (1997)). Si fuera así, representarían un conjunto de células T con un complemento CD diferenciado, heterogénico, que puede haber o no perdido su función en ese punto de tiempo (Guidos et al., .J. of Exp. Med. 172: 835-845 (1990)). Las condiciones probables de cultivo de CIK pueden llevar al rescate de las células T anérgicas proporcionando estimulación por IL-2 a altas dosis y superando de este modo la anergia (Madrenas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9736-9741 (1996)).

Dada la pluralidad de marcadores de superficie expresados en clones igualmente funcionales, la existencia de una línea específica de células T CIK y la expansión preferencial a partir de un tipo de células precursoras distintas encontrado en la sangre periférica parece improbable. Por el contrario, la presencia de marcadores de superficie sobre las células T y NK que pierden su capacidad de señalamiento efectivo cuando se ensayan funcionalmente, ha sido publicado como una característica distintiva de las células anérgicas (Fink et al., .J. Immunol. 152: 4270-4281 (1994)). El entendimiento de la biología de las células T y NK en estado anérgico es todavía limitado. Pero se ha dado a entender que altos niveles de IL-2 permiten previamente que las células T y NK anérgicas reanuden la división celular y desarrollen nuevas especificidades funcionales, no más auto-reactivas (Alters et al., Transplantation 56: 633-638 (1993), Hoglund et al, Immunological Reviews 155: 11-28 (1997); Karpus et al., Iní. Immunol 6: 721-730 (1994); Karre, Semin. Cancer Biol. 2: 295-309 (1991), Ljunggren et al., Immunol. Today 11: 237-244 (1990); Madrenas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9736-9741 (1996); Nossal, Ann N. Y. Acad. Sci. 690: 34-41 (1993); Rothenberg, Adv. Immunol. 51: 85-214 (1992)). Las altas dosis de IL-2 proporcionadas en el cultivo de CIK pueden, por tanto, rescatar un conjunto heterogéneo de células T PBMC anérgicas que en el proceso de rescate no recuperan su potencial anterior de auto-reactividad. En adición a la expresión de-novo de las moléculas efectoras implicadas en funciones antitumorales ganadas de nuevo, las CIK pueden, por tanto, mantener simplemente sus pautas previas de expresión de superficie de las células individuales de los receptores ahora no funcionales. Este modelo permite la heterogeneidad observada de los marcadores FACS presente en las CIK igualmente funcionales, así como la pérdida de función asociada con TcR/MHC I, CD4 y CD8 observada en el análisis funcional.

Percepciones adicionales sobre el proceso de la interacción de T y NK citotóxicas con las EC surgieron del hallazgo de que el BFA bloqueaba específicamente la lisis de EC en una forma de respuesta a la dosis. Este es el primer informe de un agente capaz de suprimir la lisis de EC mediante las células NK o T activadas. El BFA induce un estado resistente de las EC que persiste durante al menos seis horas después de la separación del agente.

Se ha informado que el tratamiento con BFA lleva a una serie compleja de cambios en células tratadas, por medio de la intoxicación selectiva de una proteína G responsable del transporte de proteína entre los compartimentos cis y medial del golgi. Este transporte bloquea los resultados en una marcha atrás de las proteínas dirigidas por la secreción a un sistema ER (retículo endoplásmico) extendido y lleva finalmente a la fusión de los compartimentos cis del golgi con el ER (Lippincott-Schwartz et al., Cell 56: 801-813 (1989)). El alargamiento del compartimento de ER aumenta la síntesis de las proteínas residentes del ER. Las proteínas residentes de ER se caracterizan por una señal de retención "KDEL"o "RDEL"-ER de cuatro aminoácidos en el C-terminal. Ejemplos de tales proteínas residentes de ER son Hsp47, calreticulina, Grp78 y Grp94 (Ferreira et al., Arch. Virol. 138: 273-285 (1994); Ferreira et al., J. Cell Biochem. 56: 518-526 (1994); Ferreira et al., Connect Tissue Res. 33: 265-273 (1996); Smith et al., .J. Biol. Chem. 270: 18323-18328 (1995)). Estas proteínas residentes de ER no se segregan fuera del compartimento de ER, porque están en una forma reconocida dependiente de Ca^{2+}, unidas y re-cicladas en el ER mediante los receptores KDEL/RDEL, Erd2.1 y Erd2.2. El ER sirve como un importante almacenamiento intracelular de Ca^{2+}. El alargamiento del ER por tratamiento con BFA perturba la homeostasis celular de Ca^{2+} y lleva a la inactivación del receptor KDEL/RDEL (Llewellyn et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 240: 36-40 (1997)). Las proteínas residentes en el ER, incluyendo Hsp47, llegaron así a ser libremente segregadas (Hu et al., J. Cell Biochem.: 350-367 (1995); Hu et al., Cell Biochem. 9: 214-234 (1995)). El tratamiento con BFA de EC lleva por tanto a un aumento de la producción de Hsp47 y por otra parte a la secreción libre de esta proteína residente en el ER. En condiciones fisiológicas, el transporte de Hsp47 hasta el exterior de las células está ligado a la expresión y co-transporte de los colágenos acompañantes I y IV (Yamamura et al., Biochem Biophys. Res. Comm. 2-J-: 68-74 (1998)).

Los extractos de proteína marcados con pulso y seguimiento con ^{35}S* del estado resistente de las EC inducido por BFA se compararon con los fenotipos sensibles no tratados. Entre las proteínas radio-marcadas consistentemente que aumentaron en los extractos de las EC tratadas con BFA había una proteína de 46,5 KDa, p46.5. Utilizando el reparto de fases a 0-4ºC con Triton-X-114 se pudo demostrar que la p46.5 estaba al menos parcialmente localizada en la membrana celular de las EC tratadas. La biotinilación de las proteínas de superficie de monocapas de EC intactas tratadas con BFA con el reactivo biotina-SS-NHS soluble en agua, insoluble en lípidos también demostró que la Hsp47 y una proteína asociada de 25-27 KDa habían aumentado en la superficie celular después de tratamiento con BFA. Véanse las figuras 14A y 14B. Bioquímicamente, la p46.5 se unió a la gelatina-sefarosa y pudo ser purificada con ella, eluyendo en ambos tampones, un tampón competitivo de unión al péptido RGD y un tampón de elución a bajo pH durante las preparaciones de FPLC. Todas las características bioquímicas de p46.5 concuerdan con los datos publicados para la Hsp47 de roedor (Hirayoshi et al., Mol. Cell Biol. 11: 4036-4044 (1991); Jain et al., Biochem J. 304: 61-68 (1994); Nandan et al., Biochem Cell Biol. 68: 1057-1061 (1990); Vaillancourt et al., Biochem .J. 274: 793-798 (1991)). El análisis funcional demostró que la p46.5 purificada en gelatina comparte con el tratamiento de BFA la capacidad excepcional de proteger previamente a las EC sensibles a las CIK en una forma de respuesta a la dosis. Se demostró esto a través de la pre-incubación de las EC con p46.5 antes del ensayo de citotoxicidad con ^{51}Cr. Este es el primer informe de un agente proteínico añadido externamente que protege a las EC de la citotoxicidad no restringida por el MHC I. Esta proteína p46.5 reaccionó de forma cruzada en inmuno-precipitaciones con antisueros preparados frente a las proteínas de membrana procedentes del estado resistente de las células linfoblastoides, y con el anticuerpo monoclonal N6 pan-anti proteína del shock térmico purificado.

Se identificó positivamente que la p46.5 era la Hsp47 humana, en la membrana original de la inmunoprecipitación con N6 mediante el anticuerpo monoclonal anti-Hsp47 específico, SPA-470.

La secuencia completa del hsp47 humano fue descrita en primer lugar por Clarke and Sandwal después del aislamiento basado en la PCR de fragmentos parciales, pero con solapamiento, del gen de cDNA que abarca el gen completo hsp47 humano (Clarke et al., Biochem Biophys Acta I 129: 246-248 (1992)). Fueron proporcionados por el Dr. Sanwal, dos plásmidos que corresponden al solapamiento parcial de fragmentos de cDNA hsp47 de 350 y 1300 bp, respectivamente. El fragmento más pequeño contenía también regiones 5' no traducidas que no codifican el producto génico maduro del gen hsp47. Dentro del área de solapamiento entre los fragmentos no hay sitios de la enzima de restricción compartidos. La mutagénesis dirigida al sitio basada en la PCR se utilizó tanto para amplificar como finalmente para unir los dos fragmentos de cDNA en un marco de lectura continuo que codifica la proteína Hsp47 humana. Basándose en los datos de secuencias publicadas y en la elección de los sitios de clonación, se diseñaron dos grupos de cebadores para la PCR. Se introdujo un sitio artificial BamHI que flanquea el extremo 5' de la secuencia codificadora. Se introdujo un sitio artificial EcoRI en el extremo 3' de la secuencia codificadora, así como un sitio MscI dentro de cada lado del área de solapamiento entre los dos clones para facilitar la unión de los cDNA. Después de amplificación por la PCR de los dos plásmidos, el fragmento más pequeño era MscI restringido y purificado en gel. Este fragmento más pequeño se utilizó como el cebador 5' en el fragmento de 1300 bp como modelo y de este modo se generó la primera casete génica expresable descrita del hsp47 humano. El producto de la PCR de esta reacción fue ligado entonces direccionalmente al vector de expresión de la proteína bacteriana restringida por BamHI/EcoRI, pGEX-4T1, y se
amplificó in vivo a partir de colonias individuales de células hospedantes bacterianas BL21(DE3) transformadas.

Se clonó el huhsp47 humano sin su péptido señal "MRSLLLGTLCLLAVALA". Se utilizó el sistema de expresión de la proteína bacteriana pGEX-4T para ser inducido con IPTG para sobreexpresar Hsp47 y para obtener una proteína de fusión de la Hsp47 humana y glutatión-S-transferasa (GST) marcada en N-terminal. Esta última permitió el uso de un protocolo de purificación de afinidad de una etapa sobre columnas de sustrato GST con glutatión reducido reticulado y elución por medio de la unión competitiva de este copartícipe de fusión con glutatión reducido, soluble, libre. Se ha demostrado que la GST por sí misma no es tóxica en la mayor parte de los ensayos celulares y que no aumentó ni redujo la citotoxicidad objetivo en los ensayos con liberación de ^{51}Cr. La huHsp47 recombinante purificada protege las EC en forma de respuesta a la dosis.

Se introdujo una secuencia de iniciación de Kozak y una señal de secreción funcional para la expresión eucariótica óptima mediante una combinación de PCR y clonación de la enzima de restricción, utilizando el vector de expresión de la proteína eucariota de baculovirus pMel-Bac como modelo para la secuencia de Kozak y la secuencia líder de secreción de melitina. Se hizo la selección del promotor CMV^{IE} fuerte para asegurar un alto nivel de expresión de la proteína. El tratamiento de las EC con BFA dio como resultado un marcado aumento de la Hsp47 extracelular secretada, a pesar de la presencia de una señal de retención de ER "RDEL" sobre la Hsp47. Como se ha detallado antes, el tratamiento con BFA lleva a una perturbación del flujo de Ca^{2+} del compartimento de ER que da como resultado una retención disfuncional en ER de las proteínas KDEL/RDEL, incluyendo la Hsp47. Para dirigir la Hsp47 hacia la secreción en ausencia de tratamiento con BFA, se delecionó la secuencia de Hsp47 "RVEL" en una de las construcciones. Consistente con este concepto, la transfección de esta construcción dio como resultado un aumento de la secreción de la proteína Hsp47 y un nivel de protección de las EC frente a las CIK, más alto (total) que el mediado por la mayor parte de la forma retenida en el ER que sólo llega a ser transportada a la superficie de las células mediante el co-transporte con colágeno tipo I y IV (Hughes et al., Eur. J. Biochem. 163: 57-65 (1987)). Se encontró que la expresión de Hsp47 y procolágeno I estaban fuertemente ligadas (Clarke et al., J. Cell Biol. 121: 193-199 (1993)).

La clonación adicional dirigida por la PCR de hsp47 en vectores de expresión de proteínas tanto procarióticas como eucarióticas utilizando marcas de fusión con la proteína eGFP (proteína verde fluorescente mejorada) permitió realizar el análisis de FACS con casetes génicas de hsp47 mutante de longitud completa y truncada. El análisis de FACS con proteína eGFP-Hsp47 de longitud completa tiñó un 26% del subconjunto de CIK maduras.

El análisis comparativo de la secuencia peptídica deducida del gen hsp47 humano y los datos publicados disponibles citados antes (Clarke, et al., Biochem Biophys Acta I 129: 246-248 (1992)), indican la presencia de al menos tres dominios funcionales distintos de la proteína. Se ha encontrado ahora un dominio adicional presentado en este trabajo. La Hsp47 puede ser representada por tanto en una forma simplificada como una proteína de cuatro dominios (véase la Figura 15A). Por medio de la PCR con cebadores sucesivos y subsiguiente clonación en vectores de expresión de proteína procariótica y eucariótica, se comparó la función protectora de las formas truncadas de Hsp47. Véase la Figura 15C. Se eligieron las truncaciones para delecionar fragmentos del gen hsp47 de acuerdo con su supuesta estructura de dominios. Véase la Figura 15B.

Por homología de secuencia, la Hsp47 es un inhibidor de la serina-proteasa con especificidad teórica para la lisina en el sitio activo de entrada de las serina-proteasas. Las serpinas actúan como "cebo" representando sustratos escindibles que forman un enlace estable en lugar de un enlace covalente transitorio con el centro activo de las serina-proteasas. Entonces éstas ya no se liberan más, bloqueando de este modo el sitio activo de la serina-proteasa con la que reaccionan. Por tanto, las serpinas inactivan las serina-proteasas en una relación estequiométrica de 1:1. A pesar de la relación de secuencias, hasta la fecha no se ha identificado ningún sustrato de serina-proteasa para Hsp47. Algunos autores esperan que el dominio de la serpina no sea funcional debido a que sus aminoácidos del "sitio activo" están modificados (Hirayoshi et al., Mol Cell Biol 11: 4036-4044 (1991)). Se realizó la mutagénesis de Hsp47 en análisis truncacional a través del dominio de la serpina para evaluar si había una serina-proteasa de los contenidos de los gránulos de CIK altamente específica como la granzima A, pero no se pudo demostrar una función de Hsp47 como un inhibidor irreversible de granzimas de ataque en ensayos con BLT esterasa o ensayos en gel de SDS-PAGE (no se muestran los datos). Estos datos fueron paralelos al trabajo con Hsp47 murina purificada que falló en la inhibición de las principales serina-proteasas en ensayos de BLT esterasa in vitro (Davids et al., Bioorganic Chemistry 23: 437-438 (1995)). En ensayos con liberación de ^{51}Cr, la deleción del dominio de serpina llevó a una pérdida de función de los mutantes de truncación afectados. Sin embargo, como posteriores deleciones del gen re-establecieron la función completa a los mutantes truncados de Hsp47, que expresan entonces poco más que la región de consenso H1,A-A2 discutida más adelante, se supone que la pérdida de función de la truncación en C-terminal del dominio de la serpina de Hsp47 produce un cambio conformacional en la proteína que se normaliza con una truncación posterior.

El segundo dominio es la señal corta de retención en ER en C-terminal "RDEL" que se ha discutido antes.

El tercer dominio es el dominio de unión colágeno/RGD funcionalmente evidente. Hasta ahora no ha sido localizado directamente. Se ha descrito que la truncación de los 32 aminoácidos del C-terminal o de los 34 aminoácidos del N-terminal de la Hsp47 murina reduce la actividad de unión a la gelatina de la mHsp47 (Davids et al., Bioorganic Chemistry 23: 437-438 (1995)). Sin embargo no está claro actualmente, si estos efectos son secundarios a los cambios conformacionales en los mutantes truncados de Hsp47 o si indican la localización exacta del dominio de unión de RGD funcional. Existe una significativa homología de secuencias de la mHsp47 con el colágeno cristalizado que se une al inhibidor de la proteína C humana (hPCI). Esto permitió un intento de modelar teóricamente la estructura tridimensional de Hsp47 y predecir un bucle de unión a RGD en el extremo C-terminal de la proteína (Davids et al., Bioorganic Chemistry 23: 437-438 (1995)).

El cuarto dominio contiene un tramo helicoidal alfa que se parece estrechamente a la hélice \alpha_{2} que flanquea el surco de unión al péptido del dominio a_{2} de HLA-A2 y proteínas de MHC I relacionadas. Se sintetizó este péptido de consenso HLA-A2. Este péptido es capaz de proteger el EC de la destrucción mediada por las CIK en una forma de respuesta a una dosis (Figura 12). Un dominio inmunoprotector de Hsp47 contiene por tanto un dominio peptídico relativamente pequeño que por sí mismo es capaz y suficiente de explicar la protección de las EC de la destrucción no restringida por el MHC.

Se supone que Hsp47 y el péptido deducido son mediadores en la protección de las EC a través de una señal no destructora de acuerdo con el paradigma del MHC I y la "hipótesis de pérdida de lo propio" (missing self hypothesis) (Karre, Semin Cancer Biol 2: 295-309 (1991); Karre et al., Nature 319: 675-678 (1986); Ljunggren et al., Immunol Today 11: 237-244 (1990)). Tal relación ha sido descrita para las rutas del receptor inhibidor destructor (KIR) (Höglund et al., Immunological Reviews 155: 11-28 (1997)). Parece posible que una señal no destructora sea provocada en las células CIK por medio de un contrarreceptor todavía no identificado que reconoce la presencia cualitativa y/o cuantitativa del colágeno acompañante de Hsp47 en la proximidad de deposición del colágeno. Un modelo de este tipo podría permitir una explicación mecánica de la vigilancia del tumor por las CIK y otras poblaciones de células NK activadas y células T in vivo: La Hsp47 es co-secretada como colágeno acompañante por todas las células que depositan activamente la matriz extracelular que contiene los colágenos I o IV (Brewer et al., Embo. J. 16: 7207-7216 (1997)). Esta Hsp47 secretada se puede unir a las secuencias de consenso (RGD) ubicuas de la fibronectina sobre las moléculas de fibronectina, osteonectina, heparina y colágeno en la proximidad de la superficie celular de las células secretoras (Nakai et al., Biochem Biophys Res Comm 164: 259-264 (1989)). Muy recientemente se ha publicado que la Hsp47 se une a la tetraspanina CD9 en la superficie de las células (Hebert et al., J. Cell Biochem 73: 248-258 (1999)). Las tetraspaninas son importantes moléculas que traducen la señal de la membrana implicadas en la modelación del repertorio de células T (Levy et al., Annu Rev Immunol 16: 89-109 (1998)). Se ha publicado recientemente que una tetraspanina relacionada, CD82 se une a las moléculas de MHC clase I e interfiere con las señales de no destrucción de las células NK mediadas por KIR (Lagaudriere-Gesbert et al., J. Immunol 158: 2790-2797 (1997)). La falta de niveles adecuados de expresión del MHC I lleva a la destrucción por defecto de acuerdo con la "hipótesis de pérdida de lo propio" en el contexto de la vigilancia de la diana por las NK. De una forma similar, la falta de adecuada producción de colágeno por las células metastásicas y su vasculatura que carece de la producción concurrente de la matriz extracelular (EM) a su propios tejidos de metástasis podría llevar de este modo a una falta de señal de no destrucción mediada
por Hsp47 en el contexto de la vigilancia del tumor metastásico mediada por las células CIK, NK y células T.

Similarmente, los lechos de tumores vasculares fisiológicamente aberrantes se caracterizan por membranas basales comunicadas y la falta de producción normal de EM. En los individuos sanos, solamente la red elipsoide del bazo y del hígado tienen EC con membranas basales comunicadas. Estas EC que se sujetan sobre las membranas basales fisiológicamente comunicadas se describen como poseedoras de cantidades inusualmente altas de Hsp47 (Kasai et al., Cell Tissue Res 281: 135-141 (1995)). La más alta citotoxicidad de las CIK hacia los confluentes recientes frente a las EC confluentes de 5 días in vitro puede representar la falta de una señal secundaria no destructora de Hsp47 localizada en la superficie para la membrana de base establecida incompletamente después de la siembra reciente de los frascos TC (Sauk et al., Biochem Biophys Res Comm 172: 135-142 (1990)). La teoría de una señal no destructora mediada por Hsp47 podría proporcionar un mecanismo para el cribado in vivo, mediado por CIK, de las células residentes en tejidos para la producción de la matriz extracelular y la producción de colágeno. De acuerdo con esta teoría, la detección y destrucción de las células metastásicas de un tumor sólido podrían ser el resultado de estas últimas de fallo de producción de colágeno y de Hsp47. Un soporte adicional para este concepto viene de los informes de que la Hsp47 está reducida en las células que sufren transformación oncogénica (Clarke et al., J. Cell Biol 121: 193-199 (1993); Hirayoshi et al., Mol Cell Biol 11: 403 6-4044 (1991)). En estudios in vivo, comparando un amplio intervalo de tumores sólidos, se encontró además que la Hsp47 se va expresando menos, cuando estos tumores se hacen más malignos y se sugirió el cribado de los niveles de Hsp47 para seguir clínicamente la progresión del tumor en los pacientes de cáncer (Morino et al., In vivo 8: 285-288 (1994)). Los nódulos metastásicos del tumor y de su proximidad, deficitarios de Hsp47 podrían representar dianas principales para la vigilancia celular del tumor in vivo. Las EC que revisten la membrana basal comunicada encontradas solamente en la vasculatura de tumores neo-angiogénicos representan por sí mismas una diana adicional que lleva al ataque específico y subsiguiente necrosis de la vascularización
del tumor. Los resultados de las CIK en melanoma humano en SCID, son totalmente consistentes con esta teoría.

Los anticuerpos que bloquean KiR o p40 no aumentan la destrucción del tumor ni de las dianas endoteliales. Sin embargo continúa siendo posible la implicación de otros receptores inhibidores destructores.

Estudios previos demostraron por análisis de FACS que >95% de las CIK generadas en grandes cantidades expresan CD3, TcR\alpha/\beta > TcR \gamma/\delta y CD8 > CD4 (Lu et al., J. Immunol 153: 1687-1696 (1994)). Los estudios con anticuerpos de bloqueo demuestran que ninguna de estas moléculas está funcionalmente implicada en la citotoxicidad frente a EC o frente a las dianas tumorales (Tabla 2).

TABLA 2 Estudios de bloqueo de la citotoxicidad de CIK con anticuerpos monoclonales

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Se ensayaron también los Mab NK-B1 y NKp40 de bloqueo en ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr. No ha sido demostrada la implicación funcional ni de la molécula en la citotoxicidad mediada por CIK frente al tumor ni de las EC dianas. Se ensayaron estos receptores porque la expresión de estos marcadores de NK se ha descrito que tiene lugar en células citotóxicas T restringidas por el MHC I no clásicas (D'Andrea et al., J. Immunol 155: 2306-2310 (1995); Gumperz et al., J. Exp. Med. 181: 1133-1144 (1995); Lanier et al., J. Immunol 13: 2417-2428 (1994); Lanier et al., Immunol Today 17: 86-91 (1996); Phillips et al., Immunity 5: 163-172 (1996); Raulet et al., Cell 82: 697-700 (1995); Soderstrom et al., J. Immunol 159: 1072-1075 (1997)).

Se pueden utilizar las CIK in vivo sin co-inyección de IL-2 (Lu et al., J. Immunol 153: 1687-1696 (1994)). Esta es una diferencia importante entre el tratamiento pasado y el tratamiento presente de los pacientes con células CD56+ activadas con IL-2, IL-2 sola (Yang, Cancer 76: 687-694 (1995)) o una combinación de las mismas (Phillips, Journal of Clinical Oncology: 193 3-194 (1987)). Mientras que los últimos métodos aportaron un riesgo significativo para el desarrollo del síndrome de fuga vascular (VLS) potencialmente fatal, no se observó el VLS en los modelos de purga del tumor in vivo con ratones SCID/hu. Tampoco hubo infiltrados significativos de CIK en la piel humana normal injertada.

La expansión y generación fiables de actividad anti-tumoral altamente específica es una condición ineludible para la producción de células para cualquier inmunoterapia adoptiva destinada a uso clínico. La estimulación hormonal tipo Th_{1} de altas dosis de células T \alpha/\beta con IFN-\gamma, OKT-3 y IL-2 da como resultado células CIK AI con citotoxicidad superior frente a las dianas de tumores malignos hematopoyéticos y sólidos. El uso de biorreactores agitados con turbina demuestra ser una ventaja, que da como resultado la expansión selectiva rápida, segura y mejorada del subconjunto citolítico CD3+56+. Se obtienen rutinariamente rendimientos de 10^{11} células a partir de una única fuente de capa leucocítica. Este es un número suficiente de células efectoras para programas de tratamiento con dosis altas y/o tratamiento repetido en su aplicación clínica. Las CIK se pueden generar a partir de fuentes de células T puras, se pueden mantener en cultivo a largo plazo, se pueden crio-conservar, y aplicar in vitro e in vivo sin co-administración de IL-2. Estas características hacen que la elección de CIK para la inmunoterapia adoptiva del cáncer sea superior en comparación con los derivados LAK de NK.

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Ejemplo 1 Cultivo celular in vitro Generación y mantenimiento de células CIK

La sangre venosa completa procedente de donantes sanos de la comunidad, la sangre del cordón umbilical y las capas leucocíticas obtenidas por el Stanford Blood Center sirvieron como fuente de linfocitos de la sangre periférica (PBL). Se aislaron las células PBL utilizando centrifugación por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). Se resuspendieron los PBL en RPMI 1640 (GIBCO-BRL/Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene \beta-mercaptoetanol (ME) 50 \mum, 100 IU de penicilina G ml^{-1}, 100 IU de estreptomicina ml^{-1} y 10% de FCS (todos de: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una densidad de 0,5-2 x 10^{6} células/ml. Se obtuvieron poblaciones enriquecidas de linfocitos granulares grandes (LGL) y de células T por subsiguiente exclusión de células adherentes a plástico y a lana de nilón. Se cultivaron los LGL fuente en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC. La estimulación hormonal consistió en la adición de interferón gamma recombinante humano (rhu g-IFN) (un amable presente de Genentech, South San Francisco, CA) a 1000 IU ml^{-1} al comienzo del cultivo día d0, subsiguiente estimulación el día uno (d1) con anticuerpo monoclonal soluble anti-CD3 humano, OKT-3 (derivado de los hibridomas de la American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) a 50 ng por ml e interleucina-2 recombinante humana (rhuIL-2) (un amable presente de Cetus/Chiron, Emeryville, CA) a 300-500 IU por ml. Se mantuvieron los cultivos mediante la adición de 50% de medio fresco y 300-500 IU de rhuIL-2 cada 3-4 días durante 21 a 28 días. Se verificó la actividad lítica en ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr frente a dianas tumorales y de EC el día 14. La expansión preferencial de los fenotipos de CIK doble positivos CD3+, CD56+ se vio tan precozmente como el día 10 en un cultivo en el que una media del 12%-15% de las células fueron doble positivas. Los cultivos precoces de CIK pudieron ser enriquecidos además mediante una columna de perlas magnéticas de CD56 para generar cultivos con una media del 60% de fenotipos doble positivos CD3+ CD56+ (véase la Figura 2). Para la clonación de las células CIK individuales se purificaron las células T a partir de la fuente LGL mediante clasificación por FACS en cuanto a la presencia de CD3 o CD56 y ausencia de CD16 como se describe más adelante. Se clasificaron las células a una densidad media de 0,6 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se expandieron mediante co-cultivo con CIK alimentadoras autólogas irradiadas dos veces a 0,5 x 10^{6} células por ml con idéntica estimulación hormonal que la que se ha descrito para el cultivo en grandes cantidades. Se expandieron las células hasta más de 2 x 10^{6} células cada una y después se ensayaron en cuanto a citotoxicidad clonal como se describe más adelante.

Para la producción a gran escala de CIK de un único donante, se trataron los productos de la aféresis del donante sano como antes, para aislar LGL. Se cultivaron los LGL a 37ºC con idéntica estimulación hormonal que antes, pero con una densidad de diez veces mayor de 5-10 x 10^{6} células/ml en biorreactores agitados con turbina/propulsor con una capacidad de 500 ml, 1.000 ml (Nalgene, Rochester, NY) y 15.000 ml con pO2 y pH controlado (Chemap, Volketsvil, Switzerland). El uso de biorreactores de 15 litros permitió la expansión hasta 3 x 10^{11} células procedentes de un único donante, excediendo la expansión de las células CD3^{+} CD56^{+} más de 600 veces.

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Cultivo de EC, generación y mantenimiento de las EC

Las células endoteliales del cordón umbilical humano de un único donante recientemente aisladas (HUVEC) fueron un amable presente de Drs. J. Murphy y J. Alvarnas, (Stanford University Div. Hematology. Stanford, CA). Las HUVEC de un grupo de donantes se obtuvieron comercialmente (ATCC, Rockville, MD). Se cultivaron las HUVEC en frascos de cultivo de tejidos recubiertos de gelatina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), placas de 6 y 24 pocillos (Corning, Corning, NY) en medio TC-199 o F12-K de Ham's, suplementado cada uno con 100 IU de penicilina-G por ml, 100 IU estreptomicina por ml, 5 \mug de heparina porcina por ml, 20% de FCS (todos de: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y 80 \mug de mitógeno endotelial por ml (Biomedical Technology Inc., Stoughton, MA) en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC. Después de alcanzar una confluencia de HUVEC del 90% se sometieron a pases utilizando tripsina al 0,25% y EDTA al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de Ca2+ Mg2+.

El cultivo de las EC sobre perlas microvehículo se realizó sobre citovehículos acrílicos recubiertos de colágeno esféricos de 90 \mum y 150 \mum de diámetro (Kontes, Vineland, NJ) en un medio, agitado con una barra de agitación magnética, TC-199 o F12K de Ham's, suplementado cada uno con 100 IU de penicilina-G por ml, 100 IU de estreptomicina por ml, 5 \mug de heparina porcina por ml y 20% de FCS (todos de: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y 80 \mug de mitógeno endotelial por ml (Biomedical Technology Inc., Stoughton, MA) en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC.

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Generación y mantenimiento de líneas de las células dianas de tumores

Las líneas de células de tumores hematopoyéticos SU-DHL, OCI-Ly8, K562 y líneas de células linfoblastoides AMK (un amable presente de Dr. A, Krensky, Stanford University, CA) y RDL (un amable presente de Dr. R. Lopez, Stanford University, CA) se cultivaron en medio RPMI 1640 (GIBCO-BRL/Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene \beta-mercapto-etanol (ME) 50 \mum, 100 IU de penicilina-G por ml, 100 IU de estreptomicina por ml y 10% de FCS (todos de: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una densidad de 0,5-2 x 10^{6} células por ml en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC.

Las líneas de células de melanoma WM 9 y 1205 LU (un amable presente de Dr. M. Herlyn, Wistar Institute of Anatomy and Biology, Philadelphia, PA) se mantuvieron en frascos tratados de cultivo de tejidos (Beckton Dickinson, San Jose, CA) en medio MCDB 153 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 5 \mug por ml de insulina y 2% de FCS en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC.

El componente citoplasmático luciferasa que expresa la línea de células HeLaluc del carcinoma de cuello uterino (un amable presente de C. Contag, Stanford University, Stanford, CA) se cultivó en medio DMEM (GIBCO-BRL/Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene \beta-mercapto-etanol (ME) 50 \mum, 100 IU de penicilina-G por ml, 100 IU de estreptomicina por ml y 10% de FCS (todos de: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC.

La línea AJY de células CTL y la línea AJ de células específicas dianas de CTL (linfoblastoides) fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio de A. Krensky (Stanford University, Stanford, CA).

Ejemplo 2 Clonación y expresión del gen de Hsp47

Los fragmentos parciales del gen de huHsp47 derivados por RT-PCR (un amable presente de Drs. Sanwal, Ontario, Canada) se amplificaron in vitro y se introdujeron sitios artificiales de clonación mediante la PCR. Estos fragmentos corresponden a nucleótidos en la Figura 1A. El ácido nucleico que codifica los 39 aminoácidos de Hsp47 en el amino terminal (excluyendo la secuencia señal y el primer aminoácido de la proteína madura) se amplificó con los siguientes cebadores: cebador 5' ACGTTTGGATCCAGGTGAAGA, cebador 3' GTCCTTGGCCAT. El cebador 5' se incorpora al sitio Bam HI para facilitar la clonación en vectores adicionales. El cebador 3' está incorporado a un sitio Mlu NI para facilitar la fusión de los ácidos nucleicos que codifican la porción terminal amino y carboxi de la proteína. El ácido nucleico que codifica los 360 aminoácidos del carboxi terminal se amplificó con los siguientes cebadores: el cebador 5' GCAATGGCCAAGGACCAGGCAGTGGAG, el cebador 3' ACGCTCTGCTCAATATCCTTAAGTCTA. El cebador 5' incorporado en un sitio Mlu NI para facilitar la fusión de las dos porciones del gen en un marco de lectura continuo y el cebador 3' incorporado a un sitio Eco RI para facilitar la clonación en vectores adicionales. Las condiciones estándar de la PCR generalmente conocidas por los expertos en la técnica se utilizaron para amplificar los dos fragmentos de los clones de partida (véase la Figura 8). Los productos de amplificación resultantes se digirieron con Mlu NI, se purificaron y se ligaron uno a otro. El ácido nucleico resultante fue digerido además con Bam HI y Eco RI y la casete génica de huHsp47 se clonó direccionalmente utilizando técnicas estándar de DNA recombinante en pUC 19 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) que se utilizó con fines de construcción. El plásmido resultante, pUC/huHsp47, se amplificó en la cepa hospedante bacteriana recA DH5a (Life Technologies, NY). La secuencia de la casete génica clonada se verificó mediante secuenciación fluorescente sobre un secuenciador ABI (ABI) utilizando T7 DNA polimerasa (Pharmacia, Uppsala, Sweden).

La casete génica de huHsp47 fue amplificada por la PCR utilizando un conjunto alternativo de cebadores que da como resultado una casete génica expresable en BamHI-EcoRI para la expresión de la proteína bacteriana. La casete génica expresable fue clonada en el vector pGEX 4TI (Pharmacia, Uppsala, Sweden), que produce una proteína de fusión con GST bajo el control del promotor laq^{q} inducible por IPTG, y creció en la cepa BL21(DE3) hospedante bacteriana (Stratagene, La Jolla, CA).

La expresión de la proteína de fusión con GST recombinante en células hospedantes bacterianas fue inducida con IPTG 20 mM a través del promotor de lactosa Iaq^{q} y las proteínas sobreexpresadas se purificaron por cromatografía de afinidad sobre glutatión-sefarosa 4B (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), se eluyeron a temperatura ambiente con glutatión reducido 5-20 mM en tampón de Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, se analizaron cuantitativamente mediante el ensayo de Bradford y cualitativamente mediante SDS-PAGE. El tampón de elución se intercambió con PBS a pH 7,4 via filtración en gel PD-10 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) antes del uso. Cuando se deseaba la separación del copartícipe de fusión de GST, se realizó la escisión con 10 IU de trombina (Sigma, St. Louis, MO) por \mug del resto fusionado a GST durante 10-12 horas a 37ºC utilizando un sitio de escisión por trombina presente en el enlace de aminoácidos entre GST y la proteína recombinante de interés. Rutinariamente se obtuvieron 5-10 mg de la proteína de fusión huHsp47 recombinante por 4 litros de células hospedantes BL21(DE3) transformadas por pGEX-4T-Hsp47 via FPLC de afinidad del glutatión. Se utilizó huHsp47 purificada en los ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}CR descritos antes.

Para examinar el papel que cada dominio de huHsp47 desempeña en la protección de las EC de la citotoxicidad inducida por CIK, se generaron mutantes de deleción de huHsp47 específicos del dominio por medio de la PCR con cebadores anidados basados en la secuencia descrita en la Figura 1 y en las secuencias de huHsp47 previamente publicadas. La HuHsp 47 tiene al menos cuatro dominios funcionales distintos. Empezando en el amino-terminal de la proteína hay un dominio de unión de colágeno/RGD, un dominio con homología con el dominio \alpha-2 de las moléculas HLA-A2 humanas, un dominio inhibidor de la serina-proteasa (serpina) y un dominio RDEL de la señal de retención en el ER. Se generaron tres deleciones específicas. La deleción 1 separó el dominio RDEL, la deleción 2 separó el dominio RDEL y los dominios de la serpina y la deleción 3 separó los 150 aminoácidos del carboxi-terminal incluyendo los dominios de la serpina y RDEL. El mismo cebador 5' se utilizó en las reacciones de PCR para generar los tres mutantes de deleción. La secuencia del cebador 5' es: CGGAATTCTGGCCGAGGTGAAGAAACC. El cebador 3' usado para generar el mutante de deleción de RDEL fue el mismo cebador usado para generar la proteína de fusión huHsp47-GFP y tiene la secuencia: AGTTCCCACTGTTCTACGACCTAGGGC. El cebador 3' de la deleción 2 es: AACTCAACCTGTGTCTAGACCTATGGGC. El cebador 3' de la deleción 3 es: ACGCGCTGCTCCTCCACGACC
TAGGGC (véase la Figura 14). Los cebadores 5' y 3' se incorporaron a los sitios de la enzima de restricción BamHI y EcoRI respectivamente, para facilitar las subsiguientes etapas de clonación. Los cebadores 5' y 3' individuales se mezclaron con el plásmido pUC/huHsp47 que contiene la casete génica de huHsp47 y los ácidos nucleicos que codifican cada mutante por deleción se amplificaron por la PCR en reacciones separadas. Los productos de la PCR se purificaron, se digirieron con BamHI y EcoRI y se ligaron o al vector pGEX-4T para crear las proteínas de fusión huHsp47deleción-GST para ensayos de citotoxicidad (véase más adelante) o pEGFP-Nl, que también contenían la señal de secreción mel descrita antes para crear las proteínas de fusión eGFP-Hsp47deleción para uso como sondas de FACS.

El análisis de Northern de la expresión de RNA de huHsp47 se realizó mediante el marcado por desplazamiento de mella (nick translation) de \alpha^{32}P-ATP del cDNA de huHSP47 de longitud completa purificado en gel de agarosa como sonda y cDNA de acción beta humano (un amable presente de Dr. S. N. Cohen) como sonda de control interno. Se recogió el RNA total a los puntos de tiempo de 0 horas, 2 horas y 6 horas de las EC que reciben el tratamiento con BFA. Se purificó el RNA para cada punto de tiempo, se desnaturalizó, se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa con formamida, se transfirió a nitrocelulosa, se prehibridó, se hibridó con las sondas marcadas con ^{32}P, se lavó en condiciones restrictivas y se autorradiografió sin tamices intensificadores a -80ºC utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase Sambrook et al. Molecular Clonation, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Los resultados indican que el tratamiento con BFA no afecta a la expresión de la acción beta del gen doméstico, pero que el tratamiento con BFA aumenta la expresión del gen de huHsp47 a lo largo del periodo evaluado. Véase la Figura 10. Estos datos son consistentes con el aumento observado en la proteína Hsp47 visto en las células tratadas con BFA y aislado mediante experimentos de inmunoprecipitación. Véase la Figura 5.

La producción de rhuHsp47 libre del inhibidor de la proteasa para ensayos de granzima A se realizó haciendo crecer bacterias BL21(DE3) transformadas libres de proteasa en medio selectivo amp NZCYM utilizando hidrolizado ácido de caseína en lugar de aminoácidos de caseína tríptica como fuente de péptido nutricional para la bacteria hospedante que sufre la inducción de IPTG. Para minimizar los tiempos de incubación, los extractos de proteína se incubaron sobre resina de glutatión y se realizó una separación inicial de las proteínas no GST con un método de columna giratoria modificada. El resto del protocolo no se cambió, no se utilizó trombina.

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Ejemplo 3 Ensayos de citotoxicidad Ensayo con liberación de ^{51}Cr

Las células diana se marcaron metabólicamente con ^{51}Cr (Dupont-New England Nuclear, Boston, MA) incubando 1 x 10^{6} células en 300 mCi de ^{51}Cr a 37ºC durante 1-1,5 horas. Las células marcadas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,1% de seroalbúmina bovina. Las células marcadas se distribuyeron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a una concentración de 2 x 10^{4} células/pocillo por triplicado. Se añadieron las células efectoras (CIK) en las proporciones indicadas. Se añadieron Mabs antes de la adición de las células efectoras, y se incubaron durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. El volumen final de la mezcla de ensayo en cada pocillo fue de 0,2 ml. Después de 4 horas a 37ºC, se recogieron las células por centrifugación y se contó una alícuota del sobrenadante en un contador gamma (Micromedic Systems, Horsham, PA). El porcentaje con liberación específica de ^{51}Cr se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

4

Se obtuvo la liberación espontánea incubando las células marcadas en medio completo solo y la liberación máxima mediante tratamiento de las células con NP-40 al 1%.

La actividad anti-tumoral de las células CIK adultas y de las células CIK derivadas del cordón umbilical se compararon en ensayos de citotoxicidad. Los resultados de citotoxicidad de los derivados de células CIK de ambas fuentes fueron superponibles frente a los linfomas de células B OCI-Ly8 y SU-DHL4/LAM53 y la K562 diana de la leucemia mieloide. Ambos conjuntos de células CIK presentaron citotoxicidad marginal frente a melanoma WM9 in vitro. Ambos conjuntos de células CIK fueron citotóxicos frente a HUVEC recientemente confluentes y lo fueron menos frente a monocapas de EC confluentes durante periodos de tiempo más largos (véase la Figura 3).

Las figuras 3A, 3B y 3C describen ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr de 4 horas con CIK d_{21} y diferentes dianas. Las CIK fueron derivadas de PBMC por cultivo en RPMI completo suplementado con lo siguiente: a d_{0}: IFN_{g} a 1000 u ml^{-1}, a d_{1}: 5 ng de OKT-3 soluble y 500 u de IL-2 ml^{-1}, a d_{5}, d_{9}, d_{13}, d_{17}, y d_{21}: 500 u de IL-2 ml^{-1}. Todas las células estaban en un incubador humidificado con 5% de CO_{2} a 37ºC. Las líneas de tumores hematopoyéticos K562, OCI-Ly8, y SU-DHL4 se mantuvieron en medio RPMI completo; la línea de melanoma W9 se cultivó en medio MCDB 153 suplementado con 5 \mug ml^{-1} de insulina y 2% de FCS. Se obtuvieron las HUV-EC de la ATCC. Se hicieron crecer en placas de 24 pocillos recubiertos con gelatina al 2% en medio TC-199 o medio F12-K de Ham's, cada uno suplementado con 20% de FCS, 5 \mug de heparina porcina ml^{-1} y 80 \mug de mitógeno endotelial ml^{-1}. Se realizaron pases trípticos de rutina cuando las HUVEC alcanzaron más del 80% de confluencia; se llevaron a cabo ensayos con liberación de ^{51}Cr rutinariamente en el punto de tiempo de la confluencia reciente.

La Figura 3A es un perfil de citotoxicidad de CIK d_{21} en sangre de adultos y sangre del cordón umbilical, la CIK muestra alta citotoxicidad frente a los linfomas de células B OCI-Ly8 y SU-DHL4 (azul), así como frente a la leucemia eritromieloide K562 (amarillo). Existe citotoxicidad moderada frente a la línea de melanoma nodular WM9 (rojo) y frente a las HUV-EC recientemente confluentes (verde oscuro).

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La Figura 3B muestra el efecto de la duración del cultivo de las EC después de alcanzar la confluencia sobre la sensibilidad de las EC a la lisis por CIK d_{21}: las EC recientemente confluentes (verde oscuro) se lisan mucho más fácilmente que las EC cultivadas durante 5 días adicionales después de alcanzar la confluencia (verde claro).

En la Figura 3C se generaron clones de CIK poniendo en placas una media de "0,6 células por pocillo" en una placa de 96 pocillos; después se expandieron mediante co-cultivo con células alimentadoras autólogas irradiadas dos veces, a 0,5 x 10^{6} células ml^{-1}, y con idéntica estimulación hormonal que se ha descrito antes para los cultivos en grandes cantidades. Después de que los clones individuales se expandieron hasta más de 2 x 10^{6} células cada uno, se ensayaron estos para el perfil de citotoxicidad clonal a una relación E:T de 5:1. La especificidad para la diana de CIK se determina en el nivel clonal.

Los clones de las células individuales CIK expandidas se ensayaron para determinar si las sub-poblaciones de células presentaban especificidad para la diana en los ensayos de citotoxicidad realizados como se ha descrito antes. Se observó la especificidad para la diana, era específica de la línea y estaba dirigida frente a las células tumorales solamente, frente a las células EC solamente o frente a ambas dianas, siendo la última la más común. La línea de células CIK 2D10 ensayada presentaba citotoxicidad frente a la línea de células tumorales OCI-Ly8 pero no frente a la línea de células HUVEC. La línea de células CIK 5F7 presentaba citotoxicidad frente a las células HUVEC pero no frente a las células OCI-Ly8. La línea de células CIK 2C10 era citotóxica frente a ambas, las células OCI-Ly8 y las células HUVEC.

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Tratamiento con BFA de las dianas

Para tratamiento con brefeldin A (BFA), las monocapas de HUVEC recientemente confluentes, las células diana no adherentes o las células CIK, se incubaron a 0,5-2 x 10^{6} células por ml con medio suplementado con 0,5-10 \mug de brefeldin A (Böhringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) por ml de medio y se incubaron durante 2-6 horas en un incubador humidificado con 5% de dióxido de carbono a 37ºC. Se disolvió el BFA a 100 \mug por ml en etanol al 70% y se usó reciente o se conservó hasta 4 semanas a -20ºC. Antes del ensayo de citotoxicidad se lavaron las células tres veces con PBS, y se añadió medio reciente que no contiene BFA para el resto del ensayo (Figura 4).

El tratamiento con BFA interfiere con el transporte por las vesículas intracelulares desde el retículo endoplasmático hasta los compartimentos de golgi proximal e intermedio evitando la glucosilación de proteínas dirigida para la secreción y transporte por las vesículas activas de las proteínas maduras hasta la superficie de las células (Lippincott-Schwartz et al., 1990; Lippincott-Schwartz et al., 1991; Lippincott-Schwartz et al., 1989; Orci et al., 1991; Vogel et al., 1993). El tratamiento con brefeldin de las células endoteliales lleva al aumento y secreción de un inhibidor de la proteína de 46,5 KDa actualmente identificada como Hsp47 mediante la inmunodetección con MAB SPA470. La Figura 5 muestra la inmunoprotección con Mab N6 de los extractos de HUVEC marcados con ^{35}S y biotina, después de 6 horas de inducción por BFA. Pistas: M = marcador, 1 = natural (wt), 2 = 10 \muM, 3 = BFA \muM.

La Figura 5A en una SDS-PAGE teñida con plata, gel de poliacrilamida al 10%. La detección específica de p46.5 tiene lugar solamente a una dosis protectora de BFA. Nótense las cadenas pesada y ligera de N6 Mab IgG.

La Figura 5B es una auto-radiografía de una SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 12% transferida a una membrana NC. Se presenta solamente una banda radio-marcada con ^{35}S de 46,5 KDa a BFA 10 \muM.

La Figura 5C demuestra la identificación positiva de p46.5: ella es huHsp47, inmuno-detección con Mab SPA 470 específico de Hsp47. La Hsp47 migra en esta PAGE al 12% con idéntica M_{r} de 46.500 como el péptido radio-marcado. Las bandas de proteína de p46.5 y huHsp47 son superponibles. Nótese, que debido al uso de IgG Mab N6 de ratón para el IP y la detección del Mab SPA470 primario de ratón anti-Hsp47 con Ab secundario de cabra anti peroxidasa de ratón, en este ensayo de ECL se detectaron también las cadenas pesada y ligera de N6 Mab.

El tratamiento con BFA de las dianas fue capaz de suprimir la lisis de las EC mediada por las CIK en una manera dependiente de la dosis pero no afecta a la capacidad de las células CIK para lisar las dianas tumorales (Figura 4). Tanto las células HUVEC como las células OCI-Ly8 se incubaron con BFA a concentraciones de 0, 2,5, 5, 7,5 y 10 \muM durante 6 horas como se ha descrito antes, se lavaron, se marcaron con ^{51}Cr y se utilizaron en un ensayo de citotoxicidad con células CIK d_{21} a una relación E:T de 20:1. La preincubación de las EC dianas con BFA 2,5 \muM redujo la citotoxicidad mediada por CIK en un 40%. Dosis mayores redujeron la citotoxicidad adicionalmente y la preincubación en BFA 10 \muM fue suficiente para bloquear completamente la lisis de las HUVEC mediada por CIK.

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Ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr con Mabs bloqueantes

Antes de la adición de células efectoras, se añadieron 5 \mug de anticuerpo monoclonal (Mab) purificado, libre de NaN3 por ml de medio a las células diana y se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos. Se añadieron células efectoras directamente a las dianas tratadas. El resto del ensayo se realizó como se ha detallado antes, a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2}.

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Los Mabs frente a MHC clase I (W6/32), los marcadores de las células T CD2 (LFA-2), CD4, CD8, TcR\alpha/\beta o TcRy/\delta, y los marcadores de NK CD16, CD56, NK-B1(NKTA255) y Nkp40 (DX 9) no bloquean la citotoxicidad de las células CIK frente a un tumor o frente a las EC dianas. Los Mabs frente a ICAM-1 (CD54), y LFA-1 (CD 18/11_{a}, LFA-1 cadena \beta, LFA-1 cadena \alpha) bloquean la citotoxicidad de las células CIK frente a las células tumorales pero no frente a las EC dianas. Ningún otro Mab anti-CAM ensayado (CR4 cadena \alpha, CD 34, CD 31, VAP-1 o N-caderina) bloqueó la citotoxicidad de las células CIK frente a dianas tumorales. Ninguno de los anticuerpos ensayados bloqueó la citotoxicidad de las células CIK frente a las EC dianas indicando que las células CIK interactúan de forma diferente con las dianas tumorales (véase la Tabla 2).

Ensayos de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr con adición de proteína y péptido

Subsiguiente al marcado con ^{51}Cr pero antes de la adición de células efectoras se añadieron a las dianas, por ml de medio, 10-200 \mug de proteína Hsp47 purificada por FPLC (Ejemplo 7) o péptido AVLSAEQLR (Ejemplo 8) purificado por HPLC 10 nM a 10 \muM, ambos en PBS estéril a pH 7,4 y diluidos hasta la concentración final con RPMI, y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2}. En ensayos que utilizan proteína purificada, se sometieron las dianas a subsiguientes lavados con 10 volúmenes de Ca^{2+}, Mg^{2+} y 5% de FCS que contiene PBS antes de proporcionar medio de cultivo estándar reciente a las células dianas. En los ensayos que utilizan péptido purificado, el péptido añadido estuvo presente durante todo el ensayo. El resto del ensayo se realizó como se ha detallado antes, a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2}.

La incubación de EC con 20 \mug de huHsp47 purificado por afinidad a la gelatina (descrito más adelante) por 300 \mul fue suficiente para proteger completamente la diana de la lisis mediada por las CIK (véase la Figura 7) en una forma idéntica a la protección observada con el tratamiento de BFA 10 \muM de 6 h, descrito antes (véase la Figura 7).

La adición de una cantidad tan pequeña de proteína como huHsp47-GST \etaM fue capaz de reducir la lisis de las EC en un 50%. La pre-incubación con proteína huHsp47-GST 10 \muM protege completamente a las EC de la lisis mediada por CIK (véase la Figura 9). El péptido AVLSAEQLR fue también capaz de proteger a EC de la lisis mediada por CIK en una manera dependiente de la dosis en ensayos en los que la relación E:T era de 20:1 (véase la Figura 12). El péptido a una concentración 1 \muM fue capaz de reducir la lisis de EC en un 50% y el péptido a una concentración 10 \muM fue capaz de suprimir la lisis mediada por CIK casi completamente. El péptido fue capaz de reducir la lisis objetivo específica en menos del 10% cuando se usa a 10 \muM en un ensayo de citotoxicidad con ^{51}Cr de células tumorales CIK-OCI-Ly8 con una relación E:T de 20:1.

Se analizaron también los efectos protectores de cada uno de los mutantes por deleción de huHsp47 (Fig. 15B). Véase la Fig. 15C. La proteína mutante por la deleción 1, que carece del dominio RDEL, redujo la lisis mediada por CIK en un 40% indicando que el dominio RDEL no está implicado en proteger a las EC de la citotoxicidad. La proteína mutante por la deleción 2, que carece de ambos dominios serpina y RDEL, solamente redujo la lisis mediada por CIK en un 20% dando a entender o que el dominio de la serpina está implicado en proteger las EC de la citotoxicidad o que la proteína resultante está plegada de forma aberrante dando como resultado una forma menos activa de la proteína. La proteína mutante por la deleción 3, que carece de los 150 aminoácidos del carboxi-terminal, fue tan efectiva como la proteína mutante por la deleción 1 para proteger a las EC de la lisis mediada por CIK lo que sugiere que la menor protección vista con la proteína mutante por la deleción 2 es debida a una conformación alterada de la proteína y no es debida al dominio de la serpina que participa en la protección. La proteína mutante por la deleción 3 retiene tanto el dominio de unión de colágeno/RGD como el dominio de homología \alpha2-HLA-A2 que contiene la secuencia del péptido AVLSAEQLR.

Protección de células endoteliales mediante transfección con un vector de expresión de la proteína Hsp47

Los ácidos nucleicos que codifican huHsp47 y sus fragmentos, fueron clonados en vectores de expresión eucarióticos. Un ácido nucleico que codifica un fragmento de huHsp47, en el que está delecionada la secuencia de aminoácidos RDEL del carboxi-terminal, fue amplificado por la PCR a partir del plásmido pUC/huHsp47 utilizando los siguientes cebadores: cebador 5' CGGAATTCTGGCCGAGGTGAAGAAACC, cebador 3' AGTTCCCACTGTTCTACGAC
CTAGGGC. El producto amplificado fue ligado a la señal de secreción de melitina y a las secuencias de Kozak derivadas de pMel-Bac (Invitrogen, San Diego, CA) y el fragmento resultante fue clonado en el sitio de clonación múltiple de pEGFP-Nl (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando métodos generales bien conocidos por los expertos en la técnica. El plásmido resultante, eGFP-Hsp47, fue transfectado a EC.

Los ácidos nucleicos que codifican huHsp47 de longitud completa y huHsp47\deltaRDEL fueron clonados en el pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA) y se expresaron en las EC. El vector pBK se digirió con Nhe I y EcoRI para separar el promotor Lac, la mayor parte del MCS y una porción del gen Lac Z. La señal peptídica de secreción de melitina y la secuencia de Kozak fueron amplificadas por la PCR a partir del vector pMel-Bac como se ha descrito antes y fueron ligadas al vector pBK adyacente al promotor CMV IE. Las casetes génicas que codifican o la huHsp47 de longitud completa o huHsp47\deltaRDEL fueron ligadas al vector pBK adyacente a la secuencia señal mel y se utilizaron los vectores resultantes para transformar las EC. Los vectores CMV-neo-mel-huHsp47 de longitud completa y los vectores CMV-neo-mel-huHsp47\deltaRDEL se purificaron a partir de cultivos de células hospedantes que contienen cada vector y se usaron para transfectar las EC utilizando un protocolo de transfección de lipofectamina a baja dosis (GIBCO/BRL, NY). Se analizaron entonces las EC transfectadas en ensayos de citotoxicidad de CIK.

Las EC fueron co-transfectadas también con una combinación de vectores; eGFP-Hsp47, CMV-neo-mel-huHsp47 de longitud completa y pCMV-CD20 (un vector que expresa CD-20 bajo el control del promotor CMV, un amable presente de Dr. S. vHeuvel, Massachusetts General Hospital, Boston, MA) utilizando el protocolo de transfección de lipofectamina a baja dosis. Se sometieron las células a análisis FACS 24 horas después de la co-transfección.

Se utilizaron las EC dianas en ensayos de citotoxicidad 24 horas después de la transfección mediada por lipofectamina o de CMV-neo-mel-huHsp47 de longitud completa o de CMV-neo-mel-huHsp47\deltaRDEL en las EC previamente susceptibles. Se usaron células maduras CIK d_{21} a una relación E:T de 20:1. La sobreexpresión en EC de huHsp47 de longitud completa demostró una reducción del 25% en la lisis mediada por CIK. La sobreexpresión en EC de huHsp47\deltaRDEL fue completamente resistente a la lisis mediada por CIK (véase la Figura 11). La deleción del péptido RDEL, que sirve como una señal de retención en el retículo endoplásmico (ER), a partir de huHsp47, permite que la proteína sea secretada libremente y protege las EC dianas que expresan la proteína, de la lisis mediada por CIK.

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Ejemplo 4 Clasificación y formación de imágenes de células activadas por fluorescencia

Para la clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS) se lavaron 10^{6} células efectoras o dianas dos veces con tampón PBS que contiene Ca^{2+}, Mg^{2+} y 5% de FCS, se suspendieron en 50 \mul de este tampón y se pusieron a 0-4ºC en la oscuridad. Se mezcló con las células 1 \mug de anticuerpo monoclonal marcado con FITC-, PE-, Per-CP o TriColor (Beckton Dickinson, San Jose, CA) por reacción de tinción de 10^{6} células y se incubó durante 15 a 30 minutos a 0-4ºC en la oscuridad. Se sometieron las células teñidas a tres lavados sucesivos con 10 volúmenes de PBS que contiene Ca^{2+}, Mg^{2+} y 5% de FCS y se recogieron en 500 \mul de este tampón para análisis o clasificación mediante FACScan/FACStar (Beckton Dickinson, San Jose, CA) con excitación a 488 nm y los filtros canales apropiados para detección de la emisión.

La tinción de las células para microscopía de inmunofluorescencia se realizó de una manera similar y las células teñidas se analizaron con un sistema de cámara de fluorescencia Axiophot (Zeiss, Hanau, Germany).

La proteína de fusión huHsp47\deltaRDEL-proteína verde fluorescente mejorada (eGFP), expresada bajo el control del promotor CMV IE, se aisló como se ha descrito antes y se utilizó como una sonda de FACS para buscar proteínas de la superficie celular de unión a huHsp47. El análisis FACS de CIK d_{21} maduras con rhuHsp47 marcada con eGFP como una sonda molecular se llevó a cabo tiñendo en primer lugar con PE-Mab y específicamente con PE-CD56 si se desea, suspendiendo después las CIK lavadas en 10 \mug de eGFP-huHsp47 por ml de PBS, incubando durante 15 minutos a 0-4ºC en la oscuridad, separando la proteína no ligada por centrifugación en una centrífuga Eppendorf refrigerada a 1000 rpm a 0-4ºC. Los sedimentos de células teñidas o fueron resuspendidos en 500-1000 \mul de PBS inmediatamente antes del análisis FACS o fueron suspendidos en fijadores de PBS que contienen el 3% (p/v) de formaldehído antes del análisis. Después de la tinción, se clasificaron las células utilizando el canal de FITC. El 26% de las células analizadas fueron positivas para ambas sondas eGFP-huHsp47 y PE-CD56 indicando que un subconjunto definido de las células CIK tenía receptores para huHsp47.

Las células EC co-transfectadas con eGFP-Hsp47, CMV-neo-mel-huHsp47 de longitud completa y pCMV-CD20 utilizando el protocolo de transfección de lipofectamina con bajas dosis, fueron analizadas 24 horas después de la co-transfección. Se tiñeron las células con Mab PE-CD20 y se analizaron en cuanto a la presencia tanto del antígeno CD-20 como de eGFP-Hsp47 utilizando el canal de FITC. Más del 79% de las células fueron positivas para ambas sondas indicando que había habido una eficiencia de transfección extremadamente alta.

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Ejemplo 5 Purificación y análisis de proteínas nativas Extracción de proteínas de las células diana

Antes de la recogida de las células, se cultivaron las células dianas o se trataron con BFA como se ha descrito antes, y se separaron las células muertas de las monocapas de las EC mediante lavados con PBS que contiene Ca^{2+}, Mg^{2+}, a partir de las dianas no adherentes por medio de centrifugación con gradiente de densidad. Se realizó la lisis de las células con disrupción ultrasónica de las células (Branson, New Brunswick, NJ) en tampón PBS que contiene 1% de Triton-X 100 (Tx-100, Sigma, St. Louis, MO) y un cocktail completo de inhibidor de la proteasa (Böhringer Mannheim, Mannheim, Germany).

Para el marcaje metabólico con ^{35}S metionina/cisteína se cultivaron las células durante 22 horas en medios RPMI 1640 o F12K de Ham's libres de cisteína y metionina (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) con FCS dializado, aparte de eso como se ha descrito antes, antes de la adición de 100 \muCi ml^{-1} de Translabel (PIERCE/Amersham, Amersham, Ut) ^{35}S metionina/cisteína al comienzo del tratamiento de control con BFA, y se incubaron durante los tiempos indicados. Se analizaron las proteínas marcadas con pulso y seguimiento por SDS-PAGE, análisis Western o autorradiografía y tinción con plata.

Se llevó a cabo el marcaje de las proteínas de membrana por biotinilación después de los tratamientos aplicables con BFA y subsiguiente separación restrictiva de las células muertas. Se añadieron análogos de biotina, modificados con un brazo enlace en el átomo 23, solubles en agua, insolubles en lípidos, NHS-SS-biotina y NHS-LC-biotina (PIERCE, Rockford, IL) hasta un final de 1 mg ml^{-1} de PBS y se incubaron las células monocapas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se paró la reacción por separación de la reacción de marcaje con biotina y se hicieron tres lavados con 10 volúmenes de tampón de Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM a pH 7,4 haciendo que el exceso de amina reaccione con los grupos NHS residuales.

Se llevó a cabo la purificación de las proteínas biotiniladas con NHS-SS-biotina por cromatografía de afinidad sobre una resina de estreptavidina inmovilizada con agarosa reticulada al 6% (Sigma, St. Louis, MO) bajo control UV a 260 nm (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Se liberaron las proteínas unidas de la matriz de estreptavidina escindiendo el enlace disulfuro del brazo enlace del átomo 23 de SS-biotina con \beta-mercaptoetanol 100 mM. Esto dio como resultado la elución de la proteína previamente marcada con biotina dejando el resto de biotina unido a la resina de estreptavidina. Se analizaron las proteínas específicamente eluidas por SDS-PAGE, autorradiografía y tinción con plata. Se llevó a cabo la detección de proteínas NHS-LC-biotiniladas mediante SDS-PAGE, subsiguiente transferencia a membranas de soporte sólido y reacción con estreptavidina-fosfatasa alcalina (AP). Se detectó la unión de estreptavidina-fosfatasa alcalina mediante ensayo colorimétrico de transferencia BCIP/NBT. Se llevó a cabo la subsiguiente autorradiografía con extractos marcados metabólicamente con ^{35}S metionina/cisteína.

Ejemplo 6 Generación y preparación de anticuerpos Generación y preparación de anticuerpos policlonales

Se realizó la generación de antisueros policlonales de conejo después de la recogida de presuero no inmune de tres conejos hembras de New Zealand. Se utilizó un mg de proteína total por día de inmunización y animal. Se utilizaron como antígenos preparaciones en membrana de células diana linfoblastoides de tipo natural (wt) derivadas por ultracentrifugación y tratadas con TM. Se prepararon los antígenos como emulsión en adyuvante completo de Freud (FCA, Sigma, St. Louis, MO) y se inyectaron subcutáneamente. Esto fue seguido por tres inmunizaciones de refuerzo a intervalos de seis semanas como antes, pero reemplazando el FCA por el adyuvante incompleto de Freud (FIA). El desarrollo del título fue monitorizado mediante el ensayo de mancha de antígeno de muestras de sangre de la vena de la oreja de conejo obtenida en puntos de tiempo de las inmunizaciones de refuerzo. Se separó el suero del producto celular de la muestra recogida por coagulación y subsiguiente centrifugación, se aspiró y se conservó congelado a -20ºC hasta su uso.

Preparación de anticuerpos monoclonales

Producción limitada del anticuerpo monoclonal N6 in vivo: Se inyectó el hibridoma Mab N6 de la proteína pan-anti-shock térmico (un amable presente de Dr. K Nagata, Kyoto, Japan) intraperitonealmente a seis ratones hembras Balb/c de seis semanas. Se recogió el fluido ascítico, se congeló en N2 líquido y se conservó a -20ºC hasta que se necesitó.

Purificación del anticuerpo

Se realizó por FPLC la purificación de anticuerpos policlonales y monoclonales procedentes del suero o de la ascitis después de dilución 7x en PBS y cromatografía sobre Proteína A sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Sweden) con control a UV 260 nm. Se eluyeron las fracciones de Ig unidas, con tampón de glicina 25 mM a pH 2,5 y se volvieron rápidamente a pH 7,4 por adición de base TRIZMA (Sigma, St. Louis, MO). Se determinaron las cantidades de proteína mediante el ensayo de Bradford a 595 nm en un espectrofotómetro DU-650 (Beckman, Palo Alto, CA).

Se llevó a cabo la inmunoprecipitación preparando en primer lugar complejos inmunes preformados como sigue: Se incubaron anticuerpos purificados específicos monoclonales de ratón o policlonales de conejo en relación estequiométrica con anticuerpos purificados secundarios de cabra anti-ratón o anti-conejo a una concentración de 10 \mug ml^{-1} de NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, NP40 al 1% (p/v), pH 7,8 con agitación suave durante 3 horas a 4ºC. En una reacción separada los anticuerpos control que corresponden a sus respectivos isotipos fueron acoplados a las perlas de proteína A sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Los complejos inmunes formados se recogieron por centrifugación a 13.000 rpm en una centrífuga refrigerada de Eppendorf (Eppendorf, Hamburg, Germany) durante 15 minutos a 4ºC, se lavaron dos veces con un volumen de NaCl 500 mM, Tris-HCl 50 mM, BSA al 2%, SDS al 0,25% (p/v), Tx-100 al 0,5% (p/v), pH 7,5 y se recogieron en 120 \mul de NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, NP40 al 1% (p/v) a pH 7,8. Para la extracción de proteína, se lisaron 2 x 10^{7} células por ml de tampón mediante sonicación en NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, NP40 al 1% (p/v), PMSF 1 mM, 20 \mug ml^{-1} de inhibidor de tripsina, EDTA 5 mM a pH 7,8. Se separaron los desechos celulares por centrifugación a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se aclaró el lisado con los anticuerpos control que corresponden al isotipo acoplados a las perlas de proteína A sefarosa por agitación durante 3 horas a 4ºC y subsiguiente separación de las perlas por centrifugación a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación con el anticuerpo específico añadiendo 30 \mul del extracto de proteína aclarado a 200 \mul de NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, NP40 al 1% (p/v), pH 7,8 incubando con 10 \mul de los complejos inmunes específicos preformados por reacción con agitación suave durante 3 horas a 4ºC. El precipitado inmune específico se recogió por centrifugación a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC, se lavó dos veces con Tris-HCl 10 mM a pH 6,8 y se analizó por SDS-PAGE y subsiguiente tinción con plata, transferencia a soporte sólido y detección por estreptavidina-AP y autorradiografía.

Las dianas AMK se trataron en primer lugar durante 16 horas con TM a 5 \mug por ml o se dejaron sin tratar y después se trataron concurrentemente con BFA y ^{35}S met/cys (en presencia de TM en el grupo originalmente tratado) como se ha descrito antes seguido por 2 horas de seguimiento. Los extractos celulares crudos se inmunoprecipitaron (IP) o con antisuero policlonal preparado frente a las preparaciones de membrana AMK descritas antes o con Mab N6 pan-anti shock térmico. Las autorradiografías de la SDS-PAGE separadas por IP con cualquier anticuerpo de la proteína celular total muestran la presencia de una proteína marcada con ^{35}S de 46,5 KDa en células linfoblastoides no tratadas resistentes a CIK que estaba ausente en las células tratadas con TM.

Las EC dianas se cultivaron en presencia de, nada de BFA, la dosis protectora de BFA 10 \muM, o la dosis no protectora de BFA 30 \muM concurrentemente con ^{35}S met/cys como se ha descrito antes. Se procesaron las muestras como se ha descrito para las células AMK. Las EC dianas cultivadas en presencia de BFA también contenían una proteína marcada con ^{35}S de 46,5 KDa. Esta proteína no fue detectable por IP de las EC cultivadas sin BFA o con la dosis no protectora de BFA 30 \muM (véase la Figura 5).

Esta proteína de 46,5 KDa fue identificada como Hsp47 en un análisis Western utilizando el anticuerpo Mab SPA-470. Los extractos de HUVEC marcados con ^{35}S preparados a partir de células tratadas con BFA como se ha descrito antes se inmunoprecipitaron como se ha descrito utilizando el Mab N6 pan-anti shock térmico. Los precipitados se sometieron a SDS-PAGE al 12%, se transfirieron a una membrana NC, se bloquearon y se hicieron reaccionar con el anticuerpo SPA-470 utilizando métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. La presencia del anticuerpo SPA-470 unido a la proteína de 46,5 KDa y la presencia del N6 de cadenas pesada y ligera fueron detectadas utilizando el ensayo de cabra anti-ratón de tinción de peroxidasa de rábano (ECL).

La biotinilación de las EC adherentes vivas con el análogo de biotina NHS-LC-biotina soluble agua, insoluble en lípidos realizada como se ha descrito antes seguida por IP de los extractos celulares utilizando o el anticuerpo policlonal anti-AMK o el Mab N6 y la subsiguiente SDS-PAGE, transferencia a membrana NC y detección utilizando un sistema de estreptavidina-fosfatasa alcalina demostró que la proteína Hsp47 inducida por el tratamiento con BFA y una proteína menor de 27 KDa están localizadas en la superficie celular de las EC dianas.

Ejemplo 7 Purificación y análisis de proteínas Hsp47

Se realizó la purificación de las proteínas nativa y recombinante, sometiendo los extractos crudos de proteína a una cromatografía FPLC de intercambio aniónico sobre Q-sepharose® a pH 7,4, y pH 6,8, eluyendo fracciones separadas mediante el aumento de la fuerza iónica y subsiguiente cromatografía FPLC de exclusión por tamaño sobre Superosa 12 separando las fracciones con volúmenes de elución Ve crecientes, controlado por un monitor UV-M a 214, 260 y 280 nm y registrado de modo análogo (todo el equipo y las resinas: Pharmacia, Uppsala, Sweden) (véase la Figura 6). Las cantidades de proteína se cuantificaron en línea mediante integración del área bajo el pico de absorbancia (AuP) registrado y por el ensayo de Bradford de las fracciones muestreadas. Se realizó el análisis cualitativo por SDS-PAGE y subsiguiente tinción con Coomassie y plata, así como transferencia a la membrana y transferencia Western, cuando estuvieron disponibles los anticuerpos específicos.

La Figura 6A es un perfil de UV_{260 \ nm} de la purificación de la Hsp47 nativa procedente de las EC sobre la resina de intercambio aniónico Q-sepharose ff a pH 8,9. 175 frascos de HUVEC confluentes fueron inducidos con BFA 10 \muM como se ha descrito. En la primera etapa de purificación de intercambio iónico, se separaron las proteínas con la misma resina a pH 7,4 y se reunieron las fracciones que contienen Hsp47. Subsiguientemente se diluyeron las proteínas cinco veces en tampón bajo de sal a pH 8,9 para obtener el tampón A (Tris-CI 75 mM pH 8,9, NaCl 175 mM, DTT 2 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 2 mM), y se cargaron sobre la columna de cambio iónico. Las proteínas unidas se sometieron a un gradiente de sal lineal con tampón B = A+ NaCl 100 mM. Se mejoró la separación de los picos individuales de proteína manualmente cambiando la etapa de las mesetas de concentración de la sal, basándose en la OD de extinción.

La Figura 6B es un análisis de SDS-PAGE al 12% con tinción con plata de las fracciones recogidas que contienen p46.5. Se reunieron éstas y se concentraron mediante membrana YD10 hasta 1,0 ml.

La Figura 6C es un análisis de SDS-PAGE al 12% con tinción con plata de la fracción recogida que contiene p46.5 después de cromatografía FPLC por exclusión de tamaño sobre Superosa 12. Rendimiento: 240 \mug.

Se realizó cromatografía FPLC de afinidad cargando los extractos de proteínas de las EC naturales y de las EC tratadas con BFA, sobre una matriz de gelatina-sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Sweden) con ayuda de una bomba peristáltica e incubando el extracto durante 30 minutos a 0-4ºC. Las proteínas no unidas y las unidas no específicamente se separaron lavando con 7 volúmenes de la columna de tampón alto en sal seguido por el tampón de extracción de la proteína original hasta la detección por UV 260 nm con AU 0,02 de vuelta a la línea base. Se llevó a cabo la elución a pH específico con tampón de PBS a pH 5,5, los eluyentes alternativos incluyeron ATP 100 mM en PBS y péptido RGD 100 \muM en PBS, ambos a pH 7,4.

La cromatografía FPLC de inmunoafinidad se llevó a cabo de una manera similar, con el extracto de proteína cargado sobre una columna específica de Mab: 10 mg de Mab N6 purificado se acopló, mediante un enlace covalente de tioéter con un brazo espaciador en el átomo 13, a la agarosa reticulada, activada, siguiendo el protocolo Sulfolink (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas unidas no específicamente se separaron de las columnas como antes, las proteínas inmunorreconocidas específicamente se eluyeron por elución a pH 2,5 en tampón de citrato de sodio 50 mM.

La Hsp47 se puede purificar también por afinidad con gelatina. 175 frascos de HUVEC confluentes fueron inducidos con BFA 10 \muM durante 6 h a 37ºC, 5% de CO_{2}, en medio F12K suplementado con FCS al 20% y suplementos estándar de cultivo de EC. Subsiguientemente, las EC adherentes se recogieron rascando en tampón detergente (Tris-Cl 75 mM, NaCl 175 mM, DTT 2 mM, EDTA 0,5 mM, Tx-100 al 0,5%, PMSF 2 mM), se lisaron por sonicación y se aclaró el extracto de los desechos celulares por centrifugación a 15.000 rpm en una centrífuga refrigerada de Eppendorf. El extracto aclarado se cargó sobre una columna de 5 ml de 4B Sefarosa acoplada covalentemente a gelatina mediante una bomba peristáltica a 0,5 ml min^{-1}. Se desecharon las proteínas no unidas. Se lavó entonces la columna con tampón libre de detergente (como antes, sin Tx-100), tampón bajo en sal (sin NaCl) y con tampón alto en sal (con NaCl 500 mM) bajo control a UV_{260 \ nm} hasta que se alcanzaron las lecturas de la línea base. Se consiguió la elución específica de Hsp47 bajando el pH del tampón libre de detergente hasta pH 4,8. El eluato recogido se volvió inmediatamente a pH 7,4. Se regeneró inmediatamente la columna y se lavó con tampón de pH 7,4.

La Figura 2 muestra los resultados de incubación de las EC con Hsp47 purificada por afinidad con gelatina durante 30 minutos a 21ºC, antes del ensayo de citotoxicidad de CIK con liberación de ^{51}Cr. El exceso de proteína Hsp47 no unida se separó de los pocillos mediante tres lavados antes de la adición de las células efectoras CIK. Como control, se compararon las HUVEC inducidas no tratadas con BFA con el grupo de tratamiento con la proteína. La Hsp47 humana, la proteína de 46,5 KDa purificada con elución a pH específico a partir de una matriz de gelatina, protege a las EC.

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Ejemplo 8 Péptidos Hsp47 Síntesis de los péptidos

Se sintetizó un péptido 9-mer hidrófilo de la secuencia AVLSAEQLR que corresponde a la región de homología compartida de Hsp47 con HLA-A2 por las instalaciones de Stanford PAN en un sintetizador de péptidos BioApplied®, se purificó por HPLC y se verificó por secuenciación de aminoácidos. Se liofilizó el péptido puro y se conservó a -20ºC. El péptido era soluble en solución acuosa y se utilizó en PBS y RPMI 1640 a las concentraciones indicadas.

La secuenciación de aminoácidos de p46 nativo purificado y los fragmentos proteolíticos derivados del mismo fue realizada por A. Willis (Immuno Chemistry Unit of the MRC, Oxford University, Oxford, UK).

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Ejemplo 9 Análisis in vivo Modelo de purgado de tumor con SCID/injerto de piel humana-Melanoma-CIK

Se irradiaron ratones hembras balbc/SCID de 6 semanas a 500 Rads el día anterior al injerto de piel. Se prepararon injertos de prepucio humano con todo su espesor exponiendo asépticamente sus lechos vasculares subcutáneos, y recortando sus bordes para dar un injerto de 20x30 mm. Fueron rechazados los prepucios que dan sólo injertos más pequeños o más viejos de 24 horas. Se prepararon los animales anestesiados en un entorno operativo calentado a 37ºC desnudando asépticamente áreas paralelas en sus costados. Los injertos de piel de espesor completo se colocaron con suturas absorbibles interrumpidas, se vendaron asépticamente y los animales injertados se mantuvieron en jaulas separadas hasta que fue evidente que se había completado el injerto. Después del injerto, se inyectaron intradérmicamente 1 x 10^{5} células WN9 de melanoma o 1205 células LU en PBS en un único sitio de la piel humana de espesor completo de los animales por triplicado y se hizo seguimiento del crecimiento del tumor por observación y palpación. Los animales con carga evidente de tumor nodular que excede de un diámetro de 5 mm fueron inyectados intraperitonealmente con 1 x 10^{7} células CIK (suspendidas en RPMI sin FCS ni IL-2) de probada actividad lítica el mismo día del ensayo de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr en el día de cultivo de CIK d14-21. Se sacrificaron los animales a 0, 24, 48 y 72 horas después de la inyección de CIK, se fijaron por separado los órganos internos y el injerto de piel humana/melanoma y se analizaron al microscopio las secciones de tejidos teñidas por H&E e inmuno-peroxidasa anti-humana CD3, PE-CAM humana y antígenos humanos Kir. Las células CIK inyectadas IP se infiltraron selectivamente en los lechos vasculares del tumor melanoma, lo que fue confirmado por inmunodetección histológica IPOX utilizando Mab PE-CAM anti-humano. Excluyendo un infiltrado medio en el área portal del hígado de ratón, la vasculatura y los tejidos de la piel del injerto de piel normal humano o del hospedante murino no fueron infiltrados por las CIK in vivo.

Modelo de imagen vivo de purgado de tumor SCID/hu HeLa con luciferasa/Hsp47 con secreción de CIK

Se irradiaron ratones hembras balbc/SCID de 6 semanas a 500 Rads el día anterior a la inyección intraperitoneal de 2x 10^{4} de células HeLa_{luciferasa} de carcinoma de cuello uterino capaces de producir imagen de luminiscencia in vivo. El grupo de tratamiento con CIK se inyectó con CIK a una relación 20:1 de E:T (1 x 10^{6} células) mediante inyección en la vena caudal al tiempo de la provocación de las células HeLa. Estas células HeLa_{luciferasa} fueron transformadas transitoriamente 24 horas antes de la inyección siguiendo el protocolo de lipofectamina (GIBCO/BRL, NY) con un vector que expresa constitutivamente la huHsp47 de longitud completa dirigida a la secreción bajo los vectores de control inmediato del promotor precoz de CMV control o los vectores respectivos de control irrelevante. La eficiencia de la transfección fue monitorizada a través de la co-transfección de eGFP y la construcción Hsp47 con el subsiguiente análisis por microscopía de láser de fluorescencia de las monocapas de HeLaluc transformadas con un Axiophot (Zeiss, Jena, Germany) microscopio de fluorescencia descrito antes. Se monitorizaron los animales inyectados los días 0, 2 y 7 en cuanto a la quimio-luminiscencia in vivo de las HeLa restantes después del enfrentamiento a las CIK con un procedimiento de imagen digital cuantitativo en colaboración con Dr. C. Contag (véase la Figura 13). Los animales que recibieron la inyección de CIK demostraron una dramática reducción de su vida, emitiendo una carga ligera del tumor una semana después del purgado de CIK. Los animales que no recibieron las células CIK demostraron un extenso crecimiento IP de las células HeLa. Las células CIK demostraron un alto y rápido potencial de purgado de los tumores sólidos.

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Modelo GvHD murino

Se irradiaron ratones machos Balb/c dos veces con 500 Rads antes del trasplante. Se obtuvieron células madres derivadas de la médula ósea (BM) y del bazo procedentes de ratones B10D2 (antecedentes H-2^{d}). Se reunieron 2,5 x 10^{6} células de la BM y 1 x 10^{6} células del bazo como una fuente de injerto para cada animal macho Balb/c receptor. Esta población de células madres no enriquecidas o se suspendieron en RPMI que contiene 300 \mug de proteína Hsp47-Gst en 300 \mul de volumen total, o se suspendieron en tampón que contiene 100 \mug de proteína control Gst sola. Se administraron las células y la proteína en una única inyección el día 0. No se administró ningún otro tratamiento inmunodepresor. Se monitorizaron los animales durante 4 semanas después del trasplante de la médula ósea. Los 5 animales que recibieron el tratamiento con la proteína Hsp-Gst fueron protegidos del comienzo de la GvHD, pelo encrespado, pérdida de peso y muerte. Los animales que recibieron solamente la proteína Gst presentaron todos signos de GvHD, pelo encrespado y pérdida de peso, y 4 de los 5 animales murieron (véase la Figura 15).

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Ejemplo 10 Análisis FACS

Este ejemplo describe el uso de Hsp47 modificada para identificar y separar subconjuntos de células inmunes.

Una variedad de células inmunes responden a la Hsp47 y no atacan a las células endoteliales. Con el fin de identificar tales células y enriquecer las poblaciones inmunoterapéuticas adoptivas de estas células no endoteliales reactivas en presencia de Hsp47, se puede usar la Hsp47 marcada con fluorescencia en un aparato estándar de clasificación de células para identificar y separar tales células. Este uso puede servir también como un dispositivo de diagnóstico para análisis del subconjunto de células inmunes en diferentes enfermedades. La sonda FACS de Hsp47 marcada con eGFP se generó por ingeniería genética adicional (Figura 8A). Esto posibilitó la búsqueda de ambos receptores para huHsp47 y potencial para los de subconjuntos CIK que expresan tales proteínas de unión a Hsp47. El análisis FACS de CIK d_{21} madura, con Hsp47 marcada con eGFP como sonda FACS para el canal FITC, con co-tinción con CE56-PE, se basa en las diferencias de la capacidad de unión a Hsp47 de la CIK analizada. La sonda de Hsp47 marcada con eGFP tiñó una cuarta parte de las CIK maduras (26%).

La descripción anterior detalla métodos específicos que se pueden emplear para practicar la presente invención. Teniendo tales métodos específicos detallados, los expertos en la técnica serán capaces de saber cómo idear métodos fiables alternativos para llegar a la misma información utilizando los frutos de la presente invención. De este modo, aunque lo detallado anteriormente puede aparecer en texto, no se debe considerar como limitante del alcance de la misma; al contrario el ámbito de la presente invención debe ser determinado solamente por la construcción legal de las reivindicaciones adjuntas.

<110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY

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<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA PROTEGER ÓRGANOS, TEJIDOS Y CÉLULAS DEL DAÑO MEDIADO POR EL SISTEMA INMUNITARIO

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<130> 12932-003WO1

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<140> PCT/US99/19337

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<141> 24-08-1999

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<150> US 09/382,088

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<151> 24-081999

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<150> US 60/097,640

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<151> 24-08-1998

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<160> 29

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia de consenso

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<221> VARIANTE

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<222> 2

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<223> Xaa = Val, Leu, Ala, o Thr

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<221> VARIANTE

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<222> 3

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<223> Xaa = Leu o His

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<221> VARIANTE

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<222> 4

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<223> Xaa = Ser o Val

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<221> VARIANTE

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<222> 6

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<223> Xaa = Asp o Glu

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<221> VARIANTE

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<222> 7

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<223> Xaa = Gln, Lys, o Arg

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<221> VARIANTE

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<222> (8)...(8)

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<223> Xaa = Leu o Val

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<400> 1

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\hskip1cm

5

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia de consenso

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<221> VARIANTE

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<222> 2

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<223> Xaa = Val o Ala

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<221> VARIANTE

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<222> 3

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<223> Xaa = Leu o His

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<221> VARIANTE

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<222> 4

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<223> Xaa = Ser o Val

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<400> 2

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\hskip1cm

6

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip1cm

7

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<210> 4

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<211> 1254

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 1254

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1251)

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<400> 5

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9

10

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<210> 6

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<211> 417

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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11

12

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido generado sintéticamente

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<400> 7

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\hskip1cm

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 8

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\hskip1cm

14

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<210> 9

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 9

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\hskip1cm

15

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<210> 10

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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\hskip1cm

16

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<210> 11

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Felis catus

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<400> 11

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\hskip1cm

17

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 12

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\hskip1cm

18

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia de consenso

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<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

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<223> Xaa = Asp o Glu

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<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

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<223> Xaa = Lys o Gln

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<400> 13

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\hskip1cm

19

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<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia de consenso

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<221> VARIANTE

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<222> 2

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<223> Xaa = Val, Leu, o Thr

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<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

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<223> Xaa = Gln, Lys, o Arg

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<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

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<223> Xaa = Leu o Val

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<400> 14

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\hskip1cm

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador para PCR

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<400> 15

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\hskip1cm

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 12

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador para PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\hskip1cm

22

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<210> 17

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador para PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\hskip1cm

23

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<210> 18

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador para PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\hskip1cm

24

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<210> 19

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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\hskip1cm

25

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<210> 20

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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26

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<210> 21

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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27

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<210> 22

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

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\hskip1cm

28

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<210> 23

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<211> 27

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val, Leu, Ala, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ala o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys, Gln, o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

Claims (13)

1. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido HuHsp47.

2. El uso de un polipéptido inmunoprotector relacionado con HuHsp47 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el daño a las células mediado por el sistema inmunitario.

3. El uso de un polipéptido inmunoprotector relacionado con huHsp47 según la reivindicación 2, en el que dicho daño mediado por el sistema inmunitario es causado por una enfermedad autoinmune, enfermedad del injerto frente al hospedante o enfermedad del hospedante frente al injerto.

4. Un polipéptido con actividad inmunoprotectora seleccionado de los siguientes:

a)

huHsp47

b)

la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1

c)

una secuencia de aminoácidos con actividad inmunoprotectora que tiene al menos 70% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de a) o b)

d)

una secuencia de aminoácidos con actividad inmunoprotectora codificada por un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de a) o b)

e)

un fragmento de a), b), c) o d) con actividad inmunoprotectora

f)

una variante de a), b), c) o d) con actividad inmunoprotectora.

5. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido con actividad inmunoprotectora seleccionado del grupo que consiste en:

a)

un ácido nucleico que codifica huHsp47

b)

la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Figura 1

c)

una secuencia de ácido nucleico con actividad inmunoprotectora que tiene al menos 70% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con la secuencia de aminoácidos de a)

d)

una secuencia de ácido nucleico con actividad inmunoprotectora que se hibrida con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1

e)

un fragmento de a), b), c) o d) que codifica un polipéptido con actividad inmunoprotectora

f)

una variante de a), b), c) o d) que codifica un polipéptido con actividad inmunoprotectora.

6. Un vector que comprende ácido nucleico que codifica el polipéptido humano Hsp47, operativamente ligado a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedante transformada con el vector.

7. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. Un método para reducir el daño a los tejidos, órganos o células, mediado por el sistema inmunitario, que comprende poner en contacto los tejidos, órganos o células con un polipéptido inmunoprotector relacionado con HuHsp47, en el que dicho método se realiza in vitro o ex vivo.

9. El uso de un polipéptido según la reivindicación 4, o de un ácido nucleico según la reivindicación 5, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el daño a las células mediado por el sistema inmunitario.

10. El uso de un polipéptido o de un ácido nucleico según la reivindicación 9, en el que dicho daño, mediado por el sistema inmunitario, es causado por una enfermedad autoinmune, enfermedad del injerto frente al hospedante o enfermedad del hospedante frente al injerto.

11. El uso de un polipéptido según la reivindicación 4, o de un ácido nucleico según la reivindicación 5, para la preparación de una composición para inmunoterapia adoptiva para tratar el cáncer, en el que dicha composición está diseñada para ser introducida en un paciente conjuntamente con linfocitos T obtenidos cultivando linfocitos T de un donante en condiciones en las que los subconjuntos específicos de dichos linfocitos T se expanden.

12. Un método para reducir el daño a los tejidos, órganos o células mediado por el sistema inmunitario, que comprende poner en contacto un tejido, órgano o célula con un ácido nucleico expresable que codifica un polipéptido según la reivindicación 4, o con un ácido nucleico según la reivindicación 5, en el que dicho método se realiza in vitro o ex vivo.

13. Un polipéptido inmunoprotector relacionado con HuHsp47 "fax" como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en combinación con una célula, tejido u órgano.