KR20170132789A - 단백질-매개된 o₂ 전달에 의한 종양 면역의 조정 - Google Patents

단백질-매개된 o₂ 전달에 의한 종양 면역의 조정 Download PDF

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스테판 피. 엘. 캐리
애나 크르톨리카
나타샤 르 모안
조나단 에이. 윈저
케빈 지. 레옹
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옴니옥스, 인크.
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Abstract

본 발명은 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여함으로써, 저산소-매개된 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종양 면역의 저산소 유도 인자 1 알파 (HIF-1α) 경로 및 비-HIF-1α 경로 둘 다를 표적화한다. 이러한 방법은 다양한 암의 치료에 유용하고, 단독으로 또는 다른 항암 요법과 조합하여 사용될 수 있다.

Description

단백질-매개된 O₂ 전달에 의한 종양 면역의 조정
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/134,523을 우선권으로 주장하며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로 서열 목록의 제출
하기 ASCII 텍스트 파일로 제출된 내용은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF) (파일명: 627042000940SeqList.txt, 등록일: 2016년 3월 17일, 크기: 41 KB).
기술 분야
본 출원은 단백질 O2 담체 폴리펩티드, 예를 들어 H-NOX 단백질에 의해 산소를 종양으로 전달함으로써 종양 면역을 조정하는 것에 관한 것이다.
저산소 종양 미세환경은 저산소 유도 인자 (HIF-1) 신호전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중 신호전달 경로를 조정함으로써 숙주의 면역 항종양 방어를 억제한다 (Codo et al., 2014 Oncotarget, 5(17), 7651-7662; Lee, Mace, & Repasky, 2010 Int J Hyperthermia , 26(3), 232-246; Wei et al., 2011 PLoS One, 6(1), e16195). 주요 저산소 면역조정 경로는 도 1에 요약되어 있다. 간략히, HIF-1은 a) 항종양 반응의 주요 이펙터인 헬퍼 및 킬러 T-세포 및 NK 세포의 동원 및 활성화를 억제하는 아데노신성 A2 및 PD-L1 경로를 활성화시키고 (Noman et al., 2014 J Exp Med , 211(5), 781-790; Ohta et al., 2006 Proc Natl Acad Sci U S A, 103(35), 13132-13137); b) 억제성 조절 T 세포 (Treg), 종양 연관 대식세포 (TAM) 및 다른 골수-유래 억제 세포 (MDSC)를 동원 및 활성화시키고 (Chaturvedi et al., 2014 Proc Natl Acad Sci U S A, 111(20), E2120-2129; Corzo et al., 2010 J Exp Med, 207(11), 2439-2453; Wei et al., 2011); c) 면역계가 종양 세포를 인식하는 능력을 직접적으로 억제하는 (Siemens et al., 2008 Cancer Res, 68(12), 4746-4753) 것으로 확인되었다. 또한, HIF-1-의존성 및 -비의존성 후성적 메카니즘은 항종양 면역-반응의 억제에 기여하고, 종양 성장, 혈관신생 및 전이를 증진시킨다 (Codo et al., 2014; Mimura et al., 2011 J Pharmacol Sci , 115(4), 453-458).
마우스 전이 종양 모델에서, 지속적인 보충적 산소화는 A2AR (A2A 아데노신 수용체) 아데노신성 경로의 억제를 통해 T 및 NK 세포 활성화를 유도하여 종양 성장을 억제하고 종양의 면역 회피를 예방하는 것으로 확인되었다 (Hatfield et al., 2015 Sci Transl Med , 7(277), 277ra230). 구체적으로, MCA205, B16 또는 4T1 폐 전이를 보유한 마우스를 60% 호흡 산소로 지속적으로 처리한 결과, 전이 병소의 수가 > 2배 감소하였고 생존이 증진하였다. 이들 데이터는 종양 및 림프구 저산소의 감소, 활성화된 CD8 T 세포 (CD8+ CD69+ CD44+) 종양 침윤의 증가, 면역자극 시토카인 및 케모카인의 상향조절과 상호관련이 있었고, 온전한 A2AR 신호전달에 의존적이었다. 동시에, 호흡 산소과다는 감소된 Foxp3, CD39/CD73 (A2AR 상류의 아데노신 생성 효소) 및 CTLA-4 발현으로 인해 폐 종양 미세환경 (TME)에서 Treg의 수를 감소시키고 Treg 활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 마지막으로, 폐 종양의 이중 CTLA-4/PD-1 차단에 의해 유도된 종양 퇴행은 지속적인 호흡 산소과다에 의해 증진되었다.
종양 산소화가 면역억제성 TME를 역전시키고 종양 성장을 억제하는 능력을 입증하는 확실한 임상전 증거에도 불구하고, 인간 임상 시험에서는 고압 또는 표준압 산소를 이용하는 보충적 산소화가 제한된 효과를 나타내었다 (Overgaard, 2007 J Clin Oncol , 25(26), 4066-4074). 이는 가용성 산소가 혈관으로부터 ~80 μm 넘어서까지 효과적으로 확산될 수 없어서, 저산소 종양 조직으로의 침투 깊이가 제한되었기 때문인 것으로 여겨진다. 따라서, 환자의 종양에 침투하여 정상 확산 한계를 넘어서까지 산소를 수송함으로써 면역억제 경로를 방해하도록 저잔소 미세환경을 산소화시키는 산소 전달제가 요구된다. 이는 단독으로 및 다른 면역 체크포인트 억제제 및 다른 암 면역요법 접근법과 조합한 둘 다의 경우에 항종양 면역 반응을 최대로 자극할 것이다.
H-NOX 단백질 (헴-일산화질소 및 산소 결합 도메인(Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain)에 대해 명명됨)은 헴단백질의 고도로 보존되고 잘 특성분석된 패밀리의 구성원이다 (Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem . Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr . Opin . Chem . Biol . 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg . Biochem. 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J Biol Chem. 282(2):897-907). H-NOX 단백질 이전의 헤모글로빈-기재 산소 담체와는 달리 일산화질소-중성이며, H-NOX는 순환 일산화질소 (NO)를 제거하지 않고, 따라서 고혈압 또는 신장 부작용과 연관되지 않는다. 내인성 NO에 의한 H-NOX 단백질의 불활성화 가능성이 낮고 H-NOX 단백질에 의한 내인성 NO의 제거 가능성이 낮기 때문에, 고유의 낮은 NO 반응성 (및 높은 NO 안정성)은 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질이 바람직한 혈액 대체제가 되게 한다. 중요하게는, 일부 H-NOX 단백질에서 원위 포켓 티로신의 존재는 (Pellicena, P. et al. (2004) Proc Natl . Acad Sci USA 101(35):12854-12859) 바람직하지 않은 높은 NO 반응성을 시사하여, 혈액 대체제로서의 사용이 금지된다. 예를 들어, 유사하게, 구조적으로 유사한 원위 포켓 티로신을 갖는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 헤모글로빈 단백질은 NO와 극도로 신속히 반응하여, 감염된 숙주에 의해 생성된 방어성 NO를 효율적으로 제거 및 회피하도록 마이코박테리움에 의해 사용된다 (Ouellet, H. et al. (2002) Proc . Natl . Acad . Sci .U S A 99(9):5902-5907). 그러나, 놀랍게도, H-NOX 단백질이 실제로는 헤모글로빈에 비해 훨씬 낮은 NO 반응성을 가져서 혈액 대체제로서 사용 가능하다는 것이 발견되었다.
치료 및 다른 용도를 위해 O2 및/또는 NO를 전달하는 H-NOX 단백질이 미국 특허 번호 8,404,631 및 8,404,632; WO 2007/139791, WO 2007/139767 및 WO 2014/107171; 및 미국 특허 출원 일련 번호 14/530,569에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특허 출원 및 공보를 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 종양을 가진 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 항원 프로세싱을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 수지상 세포 (DC)의 제시 역량을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 저산소 유도 인자 1α (HIF-1α) 및/또는 저산소 유도 인자 2α (HIF-2α)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 프로그래밍된 사멸 리간드-1 (PD-L1)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2A 아데노신 수용체 (A2AR)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, 종양은 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양이다.
일부 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종, 항문암 또는 편평 세포암이다.
상기 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물은 인간 (예를 들어, 인간 환자)이다. 다른 실시양태에서, 포유동물은 애완동물, 실험실 연구 동물 또는 농장 동물이다. 일부 실시양태에서, 애완동물, 연구 동물 또는 농장 동물은 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 돼지 또는 소이다.
상기 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 정맥내, 동맥내, 종양내, 방광내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여에 의해 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여를 약 4주 내지 약 8주 동안 매일 또는 1일 2회 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 약 1일 내지 약 10일의 기간 동안 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다 또는 24시간마다 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 볼루스로서 투여한다. 다른 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 주입에 의해 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간 또는 24시간 초과 동안 주입한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 면역을 조정하거나 또는 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 O2 담체 폴리펩티드를 방사선 요법과 조합하여 투여한다. 일부 실시양태에서, 방사선 요법을 개체에게 O2 담체 폴리펩티드를 투여한지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24시간 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, 방사선은 X-방사선이다. 일부 실시양태에서, X-방사선을 약 0.5 그레이 내지 약 75 그레이로 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 방사선의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, 투여를 약 2회, 3회, 4회, 5회, 10회, 15회, 20회, 25회 또는 30회 초과로 반복한다. 일부 실시양태에서, 투여를 1주, 2주, 3주 또는 4주 후에 반복한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 면역을 조정하거나 또는 암을 치료하는 방법이며, 여기서 O2 담체 폴리펩티드를 화학요법 또는 면역요법과 조합하여 투여하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 세포독소를 포함한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 화학요법의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 또는 면역 체크포인트 조절제를 표적화하는 작용제 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 면역 체크포인트 조절제 중 1종 이상을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 입양 면역 요법은 T 세포 또는 조작된 TCR-T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 종양용해 바이러스 또는 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 면역요법의 투여를 반복한다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 제약 조성물 중에 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 상기 임의의 실시양태의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 H-NOX 단백질이다.
일부 측면에서, 본 발명은 종양을 가진 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 백혈구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 항원 프로세싱을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 림프구 활성화를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 수지상 세포 (DC)의 제시 역량을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 저산소 유도 인자 1α (HIF-1α) 및/또는 저산소 유도 인자 2α (HIF-2α)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 프로그래밍된 사멸 리간드-1 (PD-L1)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2A 아데노신 수용체 (A2AR)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, 종양은 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양이다.
일부 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암이다.
상기 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물은 인간 (예를 들어, 인간 환자)이다. 다른 실시양태에서, 포유동물은 애완동물, 실험실 연구 동물 또는 농장 동물이다. 일부 실시양태에서, 애완동물, 연구 동물 또는 농장 동물은 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 돼지 또는 소이다.
상기 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질을 정맥내, 동맥내, 종양내, 방광내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여에 의해 투여한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 투여를 약 4주 내지 약 8주 동안 매일 또는 1일 2회 반복한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질을 약 1일 내지 약 10일의 기간 동안 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다, 24시간마다 또는 48시간마다 투여한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질을 볼루스로서 투여한다. 다른 실시양태에서, H-NOX 단백질을 주입에 의해 투여한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질을 개체에 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간 또는 24시간 초과 동안 주입한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 면역을 조정하거나 또는 암을 치료하는 방법이며, 여기서 H-NOX 단백질을 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방사선 요법을 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24시간 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, 방사선은 X-방사선이다. 일부 실시양태에서, X-방사선을 약 0.5 그레이 내지 약 75 그레이로 투여한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 방사선의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, 투여를 약 2회, 3회, 4회, 5회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회 또는 40회 중 어느 하나 초과로 반복한다. 일부 실시양태에서, 투여를 1주, 2주, 3주 또는 4주 이상 후에 반복한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 면역을 조정하거나 또는 암을 치료하는 방법이며, 여기서 H-NOX 단백질을 화학요법 또는 면역요법과 조합하여 투여하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 세포독소를 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 화학요법의 투여를 반복한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 또는 면역 체크포인트 조절제를 표적화하는 작용제 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 면역 체크포인트 조절제 중 1종 이상을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 입양 면역 요법은 T 세포 또는 조작된 TCR-T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체이다. 일부 실시양태에서, 면역 요법은 종양용해 바이러스 또는 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 면역요법의 투여를 반복한다.
상기 측면 및 실시양태의 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 티. 텡콘겐시스 H-NOX, 엘. 뉴모필라(L. pneumophilia) 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스(H. sapiens) β1, 알. 노르베기쿠스(R. norvegicus) β1, 씨. 루푸스(C. lupus) H-NOX, 디. 멜란가스테르(D. melangaster) β1, 디. 멜란가스테르 CG14885-PA, 씨. 엘레간스(C. elegans) GCY-35, 엔. 푼크티포르메(N. punctiforme) H-NOX, 씨. 크레센투스(C. crescentus) H-NOX, 에스. 오네이덴시스(S. oneidensis) H-NOX, 또는 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) H-NOX이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO):2에 기재된 티. 텡콘겐시스의 H-NOX 도메인에 상응하는 H-NOX 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, H-NOX는 1개 이상의 원위 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원위 포켓 돌연변이는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144에 상응하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘겐시스 H-NOX이다. 일부 실시양태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 중합체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하고, 여기서 단량체는 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 삼량체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 1개 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하고, 여기서 단량체는 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 여기서 삼량체화 도메인은 박테리오파지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시양태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴드온 도메인은 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 2 자릿수 이내이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 1,000배 더 낮다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s- 1이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s- 1이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 제약 조성물 중에 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 개체에서 종양 면역을 조정하기 위한 O2 담체 단백질의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양으로의 백혈구 침윤을 증가시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 백혈구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 내의 HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 내의 PD-L1의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 종양 내의 A2AR의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
상기 용도의 일부 실시양태에서, 종양은 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하기 위한 O2 담체 단백질의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암이다.
상기 용도의 일부 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
상기 용도의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 티. 텡콘겐시스 H-NOX, 엘. 뉴모필라 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베기쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스테르 β1, 디. 멜란가스테르 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 푼크티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부틸리쿰 H-NOX이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 서열식별번호:2에 기재된 티. 텡콘겐시스의 H-NOX 도메인에 상응하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX는 1개 이상의 원위 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원위 포켓 돌연변이는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144에 상응하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘겐시스 H-NOX이다. 일부 실시양태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 중합체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하고, 여기서 단량체는 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 삼량체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 1개 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하고, 여기서 단량체는 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 여기서 삼량체화 도메인은 박테리오파지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시양태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시양태에서, 폴드온 도메인은 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 O2 담체 단백질을 포함하는, 개체에서 종양 면역을 조정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 바이알, 용기, 앰풀, 병, 단지, 또는 가요성 포장 중 1종 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 1종 이상의 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 사용에 대한 지침서를 추가로 포함한다.
도 1A 및 1B는 저산소에 의해 촉진되는 주요 면역억제 경로 (도 1A) 및 O2 담체 폴리펩티드 처리에 의해 발휘될 수 있는 치료 개입점 (도 1B)의 모델을 도시한다.
도 2A-2C는 피모니다졸 및 HIF-1 ELISA에 의해 평가된, PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F의 단일 볼루스 투여후 종양 산소화를 도시한다. 도 2A는 경쟁적 ELISA에 의해 측정된 피모니다졸 수준을 도시한다. 도 2B는 샌드위치 ELISA에 의해 측정된 HIF-1α 수준을 도시한다. 그래프는 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F 투여후 피모니다졸 및 HIF-1α 신호의 정량화를 도시한다. 평균 값 +/- SEM. 일원 ANOVA 및 본페로니 사후 검정에 의해 *** p<0.001, ** p<0.01. 도 2C는 샌드위치 H-NOX ELISA에 의해 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F의 축적에 대한 종양의 평가를 도시하고, 결과는 종양 조직 그램에 대해 나타내었다.
도 3A-3D는 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F 투여후 종양 조직 산소화의 직접적인 측정을 도시한다. 종양을 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F (도 3A), 비-기능성 대조군 Tt H-NOX 단백질 (도 3C), pO2 = 0.44 mmHg에서 시작하는 100% 산소 (도 3B), 또는 pO2 = 5 mmHg에서 시작하는 100% 산소 (도 3D)로 처리하였다.
도 4는 H460 종양을 보유한 마우스를 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F로 처리한 후 방사선 효능의 증진을 도시한다. H460 피하 이종이식 종양 (150-300 ㎣)을 보유한 마우스를 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F로 사전 처리하거나 또는 10 Gy 단독으로 처리하고, 방사선 조사하고, 종양을 추출하고, 클론원성 검정을 위해 가공하였다. 7일 후에 각각의 종양으로부터의 3벌식 샘플에서 세포 수를 카운트하였다. 그래프 상의 각 점은 1개의 종양에 대한 평균 생존 분율을 나타낸다.
도 5A-5C는 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F가 면역억제와 관련된 HIF-1α 표적을 하향조절함을 도시한다. H460 피하 이종이식 종양 (150-300 ㎣)을 보유한 마우스를 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F로 사전 처리하거나 또는 비히클 단독으로 처리하고, qRT-PCR 분석을 위해 수확하였다. 도 5A는 VEGF 발현을 도시한다. 도 5B는 GLUT1 발현을 도시한다. 도 5C는 PD-L1 발현을 도시한다.
도 6A는 His6 태그를 포함하는, 써모아나에로박터 텡콘겐시스(Thermoanaerobacter tengcongensis) L144F H-NOX 서열의 C-말단에 융합된 박테리오파지 T4 피브리틴의 폴드온 도메인의 핵산 (서열식별번호:5) 및 아미노산 서열 (서열식별번호:6)을 도시한다. 도　6B는 His6 태그가 없는 L144F H-NOX-폴드온 단량체의 핵산 (서열식별번호:7) 및 아미노산 서열 (서열식별번호:8)을 도시한다.
도 7A-7C는 B16F10 피하 종양 (도 7A), CT26 피하 종양 (도 7B) 및 GL261 두개내 종양 (도 7C)에 대한 종양 저산소 및 T 세포 침윤의 대표적인 영상을 도시한다. 저산소 (상부 패널) 및 T 세포 침윤 (중간 패널)은 면역조직화학에 의해 도시하였다. 하부 패널은 다중 종양 박편의 정량 분석 결과를 도시한다. 상당히 적은 CD4 및 CD8 T 세포가 종양의 저산소 영역에 침투하였다.
도 8은 H-NOX 처리 (OMX) 또는 비히클 대조군 처리 (Veh) 이후 종양의 저산소 영역에서 CD8 T 세포의 정량화를 도시한다. 대표적인 영상을 도시한다. 저산소 영역은 면역조직화학 분석에 의해 피모니다졸에 의해 표지되었다. OMX 처리 이후, OMX 투여 이전에는 저산소였던 종양 영역으로 CD4 (데이터는 도시하지 않음) 및 CD8 T 세포 침윤이 증가되었다.
도 9A 및 9B는 H-NOX 처리 (OMX) 또는 비히클 대조군 처리 (Veh) 이후 종양의 정상산소 및 저산소 영역에서 T 세포의 정량화를 도시한다. CD4 및 CD8 T 세포 둘 다를 평가하였다. 평가한 종양 영역은 종양 주변 및 종양 중심의 영역을 포함하였다. 다중 박편의 정량적 영상 분석의 결과를 도 9A에 도시하고, 대표적인 영상을 도 9B에 도시하였다. 저산소 영역은 탄산 탈수효소 IX (CAIX) 발현의 면역조직화학 분석을 이용하여 표지하였다. OMX 처리 이후, OMX 투여 이전에는 저산소였던 종양 영역으로 CD4 및 CD8 T 세포 침윤이 증가되었다.
도 10은 GL261 종양 모델에서 저산소 (피모니다졸) 및 CD3 혈관에 대한 면역조직화학 결과를 도시한다.
도 11은 개 구강 흑색종 종양에서 H-NOX 종양 침투, 종양 저산소 및 CD8 T 세포 국재화의 면역조직화학 분석을 도시한다. H-NOX (OMX) 처리 이전에는 저산소였던 종양 영역에서 CD8 림프구 국재화를 평가하기 위해, 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), DNA 인터킬레이팅 염료 (DAPI), 항-H-NOX (OMX), -탄산 탈수효소 IX (CAIX) 및 -CD8 항체로 염색하였다. 영상을 통해 H-NOX (OMX) 처리 이전에는 저산소였던 종양 영역에 걸쳐 국재화된 CD8 양성 T 세포가 확인되었다 (CAIX 양성).
도 12A-12K는 피하 4T1-Luc 공통 유전자 마우스 종양에서 큰 종양 크기가 증진된 저산소 및 감소된 림프구 침윤과 상호관련있음을 도시한다. 도 12A는 이식후 제10일 및 제14일에서의 종양 부피를 도시한다. 도 12B는 생존가능한 세포 집단 내에서의 림프구 분율을 도시한다. 도 12C는 생존가능한 집단 내에서의 절대 림프구 세포 수를 도시한다. 도 12D는 종양 부피와 림프구 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12E는 종양 부피와 저산소 백분율 사이의 양의 상관관계를 도시한다. 도 12F는 저산소 백분율과 림프구 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12G는 종양 부피와 CD3-양성 T 세포 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12H는 종양 부피와 CD4-양성 T 세포 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12I는 종양 부피와 CD8-양성 T 세포 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12J는 종양 부피와 CD3-CD4-이중-양성 T 세포 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다. 도 12K는 종양 부피와 CD3-CD8-이중-양성 T 세포 백분율 사이의 음의 상관관계를 도시한다.
도 13A-13F는 피하 4T1-Luc 공통 유전자 마우스 종양에서 저산소 종양 영역이 면역억제성이고 감소된 T 세포 침윤을 나타냄을 도시한다. 피모니다졸-양성 저산소 영역 (도 13A) 및 CD8-양성 T 세포 (도 13B)에 대한 종양 영역 #1의 면역형광 염색, 핵을 강조하기 위해 DAPI로 대비염색 (도 13C). 피모니다졸-양성 저산소 영역 (도 13D) 및 CD4-양성 T 세포(도 13E)에 대한 종양 영역 #2의 면역형광 염색, 핵을 강조하기 위해 DAPI로 대비염색 (도 13F).
본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드, 예컨대 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드, 예컨대 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 저산소-매개된 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. O2 담체 폴리펩티드는 종양으로 전달되고, 여기서 종양에 대한 면역 반응을 증진시킨다. 종양에 대한 면역 반응의 증진은 종양 면역의 저산소 유도 인자 1α (HIF-1α)-매개된 경로 및/또는 종양 면역의 비-HIF-1α-매개된 경로를 표적화함으로써 매개될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 저산소 유도 인자 1α (HIF-1α)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 프로그래밍된 사멸 리간드-1 (PD-L1)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2A 아데노신 수용체 (A2AR)의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어의 의미는 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실시 또는 시험하기 위해서도 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
달리 명확하게 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 단수 용어의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 구체적으로 명시되지 않거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되지 않는다면 "및/또는"을 의미한다. 다중 종속항의 문맥에서, "또는"의 사용은 이전의 하나 초과의 독립항 또는 종속항을 인용하는 것이다.
본원에서 "약"과 관련된 값 또는 변수는 해당 값 또는 변수 자체에 관한 실시양태를 포함한다 (그리고 기재한다). 예를 들어, "약 X"에 대한 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는", 그로 "이로어진" 및 그로 "본질적으로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되고, 최소 길이에 제한되지는 않은다. 아미노산 잔기의 이러한 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 삼량체 및 중합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않은다. 전장 단백질 및 그의 단편 둘 다가 정의에 포괄된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 포함한다. 추가로, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 단백질이 목적하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 보존적으로)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해 의도될 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통해 또는 PCR 증폭으로 인한 오류로 인해 우연히 일어날 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 단백질은 공유적으로 또는 비공유적으로 회합된 2개 이상의 아단위를 포함할 수 있고, 예를 들어 단백질은 2개 이상의 회합된 단량체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산 분자", "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 뉴클레오티드의 이러한 중합체는 천연 및/또는 비-천연 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, DNA, RNA 및 PNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "핵산 서열"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 선형 서열을 지칭한다.
본원에 기재된 용어 "저산소 유도 인자" 또는 "HIF"는 세포내 환경에서 산소의 감소 또는 저산소에 반응하는 전사 인자의 패밀리를 지칭한다. 인간 HIF 패밀리의 구성원은 HIF-1α, HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF3α, HIF3β를 포함한다. HIF-1은 에너지 대사, 혈관신생, 아폽토시스와 관련된 유전자, 및 단백질 생성물이 산소 전달을 증가시키거나 저산소에 대한 대사적 적응을 촉진시키는 다른 유전자를 포함한, 여러 유전자의 전사 활성화에 의해 저산소에 대한 항상성 반응의 마스터 조절제로서 기능한다. HIF-1은 배아 혈관형성, 종양 혈관신생, 및 허혈성 질환의 병리생리학에서 소정의 역할을 한다. 인간 저산소-유도 인자 1, 알파 아단위 또는 인간 HIF-1α는 ARNTL, ARNT, CREBB, EP300, HIF-1AN, Mdm2, NR4A, p53, PSMA7, STAT3, UBC, VH 및 pVHL을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 폴리펩티드와 상호작용한다. 인간 HIF-1α는 HIF -1A 유전자에 의해 코딩된다. 인간 HIF-1α의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_001230013으로 제공되고, 인간 HIF-1α mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_001243084로 제공된다. 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_010431로 제공되고, 마우스 HIF-1α mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_034561로 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로그래밍된 사멸-리간드 1" 또는 "PD-L1"은 면역계를 억제하는 역할을 하는 면역 체크포인트 경로의 일부인 막횡단 단백질을 지칭한다. PDL1과 PD1 수용체 또는 B7.1 수용체의 상호작용은 IL-2 및 T 세포 증식의 T 세포 수용체-매개된 활성화를 억제한다. 인간 PD-L1은 CD274 유전자에 의해 코딩된다. 인간 PD-L1의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_001254635로 제공되고, 인간 PD-L1 mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_001267706으로 제공된다. 마우스 PD-L1의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_021893으로 의해 제공되고, 마우스 PD-L1 mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_068693으로 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아데노신 A2A 수용체" 또는 "A2AR"은 G 단백질-커플링된 수용체 수퍼패밀리의 수용체를 지칭한다. A2AR은 산소 소모에서 소정의 역할을 하는 아데노신의 수용체이며, cAMP에 의해 또는 그의 증가된 수준에 의해 과반응성 면역 세포를 억제하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 인간 A2AR은 ADORA2A 유전자에 의해 코딩된다. 인간 A2AR의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_000666으로 제공되고, 인간 A2AR mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_000675로 제공된다. 마우스 A2AR의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_033760으로 제공되고, 마우스 A2AR mRNA의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_09630으로 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "H-NOX 단백질"은 H-NOX 도메인 (헴-일산화질소 및 산소 결합 도메인(Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain)에 대해 명명됨)을 갖는 단백질을 의미한다. H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 이외에 1개 이상의 다른 도메인을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 예에서, H-NOX 단백질은 구아닐릴 시클라제 도메인을 포함하지 않는다. H-NOX 단백질은 중합 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합체성 H-NOX 단백질"은 2개 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 H-NOX 단백질을 의미한다. H-NOX 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 회합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "H-NOX 도메인"은 헴에 의해 일산화질소 및/또는 산소와 결합하는 단백질 전체 또는 그의 일부이다. H-NOX 도메인은 헴을 포함할 수 있거나, 또는 헴과 결합할 수 있는 아포프로단백질로서 발견될 수 있다. 일부 예에서, H-NOX 도메인은 6개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥에 이어서, 1개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥을 포함한다. 일부 예에서, H-NOX 도메인은 서열식별번호:2에 기재된 써모아나에로박터 텡콘겐시스 H-NOX의 H-NOX 도메인에 상응한다. 예를 들어, H-NOX 도메인은 서열식별번호:2에 기재된 써모아나에로박터 텡콘겐시스 H-NOX의 H-NOX 도메인과 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 서열식별번호:2에 기재된 써모아나에로박터 텡콘겐시스 H-NOX의 H-NOX 도메인과 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합 도메인"은 중합체성 구조체를 형성하기 위해 단량체성 모이어티의 회합을 촉진하는 도메인 (예를 들어, 폴리펩티드 도메인)이다. 예를 들어, 중합 도메인은 중합체성 H-NOX 단백질을 생성하기 위해 단량체성 H-NOX 도메인의 회합을 촉진할 수 있다. 예시적인 중합 도메인은 T4 박테리오파지의 폴드온 도메인이고, 이는 삼량체성 폴리펩티드의 형성을 촉진한다. 중합 도메인의 다른 예는 Arc, POZ, 이중 나선 도메인 (예컨대, GCN4, 류신 지퍼, 벨크로), 우테로글로빈, 콜라겐, 3-가닥 이중 나선 (마트릴린-1), 트롬보스포린, TRPV1-C, P53, Mnt, 아바딘, 스트렙타비딘, Bcr-Abl, COMP, 베로톡신 아단위 B, CamKII, RCK, 및 N 에틸말레이미드-민감성 융합 단백질로부터의 도메인, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, 탄저균 보호성 항원, 에어로리신, a-헤모리신, C4b-결합 단백질, Mi-CK, 아릴술파타제 A, 및 바이러스 캡시드 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 링커 서열" 또는 "아미노산 스페이서 서열"은 단백질의 2개의 도메인을 연결하기 위해 사용될 수 있는 짧은 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 아미노산 길이를 갖는다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "His6 태그"는 폴리펩티드에 부착된 6개의 His 잔기를 포함하는 펩티드를 지칭한다. His6 태그는 예를 들어 His6 태그에 대해 특이적인 크로마토그래피를 이용하여 단백질 정제를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 정제 후에 엑소펩티다제를 사용하여 His6 태그를 분할시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 둘 이상의 값들의 차이가 상기 값에 의해 측정되는 생물학적 특성 내에서 생물학적으로 및/또는 통계학적으로 거의 또는 전혀 유의하지 않은 것으로 고려할 정도로, 둘 이상의 수치 값들 사이에 충분히 큰 유사성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 둘 이상의 실질적으로 유사한 값들은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 50% 중 어느 하나 이하만큼 차이가 난다.
본원에 사용된 문구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 두 값들 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정되는 생물학적 특성 내에서 통계적으로 유의한 것으로 고려할 정도로, 두 수치 값들 사이에 충분히 큰 차이가 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 상이한 두 수치 값들은 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 어느 하나보다 크게 차이가 난다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 상이한 두 수치 값들은 약 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 중 어느 하나만큼 차이가 난다.
"천연 서열" 폴리펩티드는 천연에서 발견되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 유기체로부터의 천연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 구체적으로 폴리펩티드의 말단절단된 또는 분비된 천연 발생 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 폴리펩티드의 천연 발생 대립유전자 변이체를 포괄한다.
폴리펩티드 "변이체"는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고, 서열을 정렬시키고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는 예를 들어 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나인 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 약 80%-90%, 90%-95% 또는 95%-99% 중 어느 하나인 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이체 단백질"은 천연 발생 단백질과 비교 시 1개 이상의 돌연변이를 갖는 단백질을 의미한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 모든 천연 발생 단백질과 상이한 서열을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 천연 발생 단백질의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일하다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 천연 발생 단백질의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 적어도 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 또는 400개의 인접한 아미노산을 함유하는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 약 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 또는 300-400개의 인접한 아미노산을 함유하는 단백질 단편이다. 서열 동일성은 예를 들어 명시된 디폴트 변수를 갖는 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터)의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 소프트웨어 프로그램은 다양한 아미노산 치환, 결실 및 다른 변형에 대한 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매칭시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이"는 천연 발생의 참조 핵산 또는 아미노산 서열에서의 변경을 의미한다. 예시적인 핵산 돌연변이는 삽입, 결실, 프레임쉬프트 돌연변이, 침묵 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 돌연변이는 침묵 돌연변이가 아니다. 예시적인 단백질 돌연변이는 1개 이상의 아미노산의 삽입 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 삽입), 1개 이상의 아미노산의 결실 (예를 들어, N-말단, C-말단 및/또는 내부 잔기의 결실, 예컨대 적어도 약 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개 이상의 아미노산의 결실 또는 약 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 또는 300-400개 아미노산의 결실), 1개 이상의 아미노산의 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 치환), 또는 상기 2종 이상의 조합을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이를 지칭하기 위해 사용된 명명법은 먼저 야생형 아미노산, 이어서 잔기 번호, 마지막으로 치환 아미노산으로 식별된다. 예를 들어, Y140L은 잔기 번호 140에서 티로신이 류신으로 교체되었음을 의미한다. 마찬가지로, 변이체 H-NOX 단백질은 H-NOX 단백질의 아미노산 변이에 의해 지칭될 수 있다. 예를 들어, 티. 텡콘겐시스 Y140L H-NOX 단백질은 위치 번호 140의 티로신 잔기가 류신 잔기로 교체된 티. 텡콘겐시스 H-NOX 단백질을 지칭하고, 티. 텡콘겐시스 W9F/Y140L H-NOX 단백질은 위치 9의 트립토판 잔기가 페닐알라닌 잔기로 교체되고 위치 번호 140의 티로신 잔기가 류신 잔기로 교체된 티. 텡콘겐시스 H-NOX 단백질을 지칭한다.
"진화상 보존된 돌연변이"는 한 단백질의 아미노산이 동일한 단백질 패밀리의 또 다른 단백질에서 상응하는 위치에 있는 아미노산으로 교체된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "로부터 유래된"은 1개 이상의 돌연변이가 도입된 단백질의 공급원을 지칭한다. 예를 들어, "포유류 단백질로부터 유래된" 단백질은 야생형 (즉, 천연 발생 서열) 포유류 단백질의 서열에 1개 이상의 돌연변이를 도입하여 생성된 해당 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고, 서열을 정렬시키고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 특정한 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에서 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 정렬 측정을 위한 적절한 변수, 예컨대 비교할 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "koff"는 해리 속도, 예컨대 단백질로부터 O2 또는 NO의 방출 속도를 지칭한다. koff 수치가 낮을수록 해리 속도가 느림을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "kon"은 회합 속도, 예컨대 단백질과 O2 또는 NO의 결합 속도를 지칭한다. kon 수치가 낮을수록 회합 속도가 느림을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "해리 상수"는 "동적 해리 상수" 또는 "계산된 해리 상수"를 지칭한다. "동적 해리 상수" 또는 "KD"는 동적 오프-속도 (koff) 대 동적 온-속도 (kon)의 비, 예컨대 통상의 기술자에게 공지되고/거나 본원에 기재된 방법을 포함한 표준 방법 (예를 들어, 표준 분광법, 유동-정지 방법, 또는 섬광-광분해 방법)을 이용하여 절대 값으로서 결정된 KD 값이다. "계산된 해리 상수" 또는 "계산된 KD"는 측정된 koff를 기준으로 한 동적 해리 상수의 근사치이다. kon에 대한 값은 본원에 기재된 바와 같이 동적 KD와 koff 사이의 상관관계를 통해 유도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "산소 친화도"는 단백질의 헴 모이어티와의 산소 결합의 강도를 지칭하는 정성적 용어이다. 이 친화도는 산소에 대한 koff 및 kon 둘 다에 의해 영향을 받는다. 산소 KD 값의 수치가 낮을수록 친화도가 더 높다.
본원에 사용된 바와 같이, "NO 친화도"는 단백질과의 NO 결합 (예컨대, 헴 기와의 결합, 또는 단백질과 회합된 헴 기에 결합된 산소와의 결합)의 강도를 지칭하는 정성적 용어이다. 이 친화도는 NO에 대한 koff 및 kon 둘 다에 의해 영향을 받는다. NO KD 값의 수치가 낮을수록 친화도가 더 높다.
본원에 사용된 바와 같이, "NO 안정성"은 단백질이 산소의 존재 하에 NO에 의해 산화되는 것에 대한 안정성 또는 저항성을 지칭한다. 예를 들어, 단백질이 산소의 존재 하에 NO에 결합되었을 때 단백질이 산화되지 않는 능력은 단백질의 NO 안정성의 지표이다. 일부 실시양태에서, 20℃에서 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 또는 20시간 동안 인큐베이션한 후, H-NOX 단백질의 약 50, 40, 30, 10 또는 5% 미만이 산화된다.
본원에 사용된 바와 같이, "NO 반응성"은 헴-결합 단백질의 헴에 있는 철이 산소의 존재 하에 NO에 의해 산화되는 속도를 지칭한다. s- 1 단위인 NO 반응성에 대한 수치 값이 낮을수록 NO 반응성이 더 낮다.
본원에 사용된 바와 같이, "자가산화 속도"는 헴-결합 단백질의 헴에 있는 철이 자가산화되는 속도를 지칭한다. s- 1 단위인 자가산화 속도에 대한 수치 값이 낮을수록 자가산화 속도가 더 낮다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에 전파될 수 있는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 함유하도록 조작될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 기재하기 위해 사용된다. 벡터는 하기 요소 중 1종 이상을 포함할 수 있다: 복제 기점, 관심 폴리펩티드의 발현을 조절하는 1종 이상의 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서) 및/또는 1종 이상의 선택가능한 마커 유전자 (예를 들어, 항생제 내성 유전자 및 비색 검정에서 사용될 수 있는 유전자, 예를 들어 β-갈락토시다제). 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 벡터를 지칭한다.
"숙주 세포"는 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 수용자일 수 있거나 이었던 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유류 세포, 예컨대 영장류 또는 비-영장류 동물 세포; 진균 세포, 예컨대 효모, 식물 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 예시적인 원핵 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 전형적으로 천연에서 발견되거나 생산된 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는, 그가 생산된 세포의 성분 중 적어도 일부로부터 분리되었을 때 "단리된"으로 지칭된다. 폴리펩티드가 발현 이후에 세포에 의해 분비되었을 경우, 그를 생산한 세포로부터의 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 물리적으로 분리하는 것은, 폴리펩티드를 "단리"하는 것으로 고려된다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는, 전형적으로 천연에서 발견되는 더 큰 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 폴리뉴클레오티드의 경우에 게놈 DNA 또는 미토콘드리아 DNA)의 일부가 아닐 때 또는 예를 들어 RNA 폴리뉴클레오티드의 경우에 그가 생산된 세포의 성분 중 적어도 일부로부터 분리되었을 때 "단리된"으로 지칭된다. 따라서, 숙주 세포 내부에서 벡터에 함유된 DNA 폴리뉴클레오티드는 "단리된"으로 지칭될 수 있다.
용어 "개체" 또는 "대상체"는 본원에서 동물, 예를 들어 포유동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 포유동물, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 인간, 설치류, 원숭이, 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 포유류 실험실 동물, 포유류 농장 동물, 포유류 스포츠 동물, 및 포유류 애완동물을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, "개체" 또는 "대상체"는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 개체 또는 대상체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "질환" 또는 "장애"는 치료가 필요한 상태를 지칭한다.
용어 "암"은 비제어된 세포 증식, 비억제된 세포 성장, 및 아폽토시스를 통한 감소된 세포 사멸과 연관된 악성 증식성 장애를 지칭한다.
용어 "종양"은 본원에서 비정상적으로 높은 수준의 증식 및 성장을 나타내는 세포 집단을 지칭한다. 종양은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있고, 악성 종양 세포는 암이다. 종양 세포는 실질 종양 세포 또는 백혈병 종양 세포일 수 있다. 용어 "종양 성장"은 본원에서 종양 크기의 상응하는 증가를 초래하는, 종양을 포함하는 세포 또는 세포들에 의한 증식 또는 성장을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익한 또는 목적하는 임상적 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 인간을 포함한 포유동물에서 질환을 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포괄한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 목적하는 임상적 결과는 검출가능하건 검출불가능하건 간에 증상의 완화, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된 (예를 들어, 악화되지 않는) 상태, 질환 전파 (예를 들어, 전이)의 예방, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 진정 (부분적이건 전체적이건 간에)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료받지 않는 경우에 예상되는 생존에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다. 또한, "치료"는 증식성 질환의 병리학적 결과의 감소를 포괄한다. 본 발명의 방법은 이들 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
암과 관련하여, 용어 "치료하는"은 종양 세포 또는 암 세포의 성장 억제, 종양 세포 또는 암 세포의 복제 억제, 전반적인 종양 크기의 감소 및 질환과 연관된 1종 이상의 증상의 완화 중 임의의 것 또는 모두를 포함한다.
용어 "억제" 또는 "억제하다"는 임의의 표현형 특성의 감소 또는 중단, 또는 상기 특성의 발생, 정도 또는 가능성의 감소 또는 중단을 지칭한다. "감소시키다" 또는 "억제하다"는 참조에 비해 활성, 기능 및/또는 양을 저하시키거나, 감소시키거나 또는 저지하는 것이다. 어떤 실시양태에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 20% 이상의 전반적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 50% 이상의 전반적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 75%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 전반적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환의 진행을 지연시키는"은 질환 (예컨대, 암)의 진행을 미루고, 방해하고, 늦추고, 지체시키고, 안정화시키고, 저해하고/거나 지연시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료되는 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 기간이 달라질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 개체에서 질환이 진행되지 않는다는 점에서 충분한 또는 유의한 지연은 실제로 예방을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 진행을 지연시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "참조"는 비교의 목적을 위해 사용되는 임의의 샘플, 표준 또는 수준을 지칭한다. 참조는 건강한 및/또는 질환이 없는 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 참조는 비처리 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 참조는 대상체 개체의 질환이 없는 비처리 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 참조는 대상체 또는 환자가 아닌 1명 이상의 건강한 개체로부터 수득된다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방하는"은 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다.
작용제의 "유효량"은 필요한 용법 및 치료 기간에서 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 물질/분자, 효능제 또는 길항제가 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료적으로 유익한 효과가 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 더 큰 것이다. 치료 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 전달될 수 있다.
"예방 유효량"은 필요한 용법 및 치료 기간에서 목적하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 반드시 그런건 아니지만, 전형적으로, 예방 용량은 대상체에서 질환의 초기 단계에 또는 그 전에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
용어 "제약 제제" 및 "제약 조성물"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태를 갖고, 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용되지 않는 독성을 지닌 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균일 수 있고, 본질적으로 내독소를 함유하지 않는다.
"제약상 허용되는 담체"는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제제 보조제, 또는 대상체에게 투여하기 위해 "제약 조성물"을 함께 구성하는 치료제에 사용하기 위한 관련 기술분야에서 전형적인 담체를 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 이용되는 용법 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 제제의 다른 성분들과 상용성이다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 제제에 대해 적절하다.
"멸균" 제제는 무균성이거나, 살아있는 미생물 및 그의 포자가 본질적으로 없는 것이다.
1종 이상의 추가의 치료제와 "조합하여" 투여하는 것은 동시에 (공존하여) 투여하는 것 및 임의의 순서로 연속적 또는 순차적 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "동시에"는 투여의 적어도 일부가 시간상 겹치거나 또는 한 치료제의 투여가 다른 치료제의 투여에 비해 짧은 기간 내에 속하는 것인 2종 이상의 치료제를 투여하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 2종 이상의 치료제를 약 60분 이하, 예컨대 약 30, 15, 10, 5 또는 1분 이하의 시간 간격으로 투여한다.
용어 "순차적으로"는 본원에서 1종 이상의 작용제(들)의 투여가 1종 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 이후에 이어지는 것인 2종 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 2종 이상의 치료제를 약 15분, 예컨대 약 20, 30, 40, 50 또는 60분, 1일, 2일, 3일, 1주, 2주 또는 1개월 초과의 시간 간격으로 투여한다.
본원에 사용된 바와 같이, "병용하여"는 한 치료 방식 외에 또 다른 치료 방식을 투여하는 것을 지칭한다. 따라서, "병용하여"는 개체에게 다른 치료 방식을 투여하기 전에, 동안에 또는 후에 한 치료 방식을 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료제 제품의 사용과 관련된 지침, 용법, 용량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료제 제품의 시판 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
"제조 물품"은 적어도 1종의 시약, 예를 들어 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 치료를 위한 의약, 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하는 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 컨테이너) 또는 키트이다. 어떤 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 실시하기 위한 단위로서 홍보, 유통 또는 판매된다.
H- NOX 단백질
H- NOX 단백질 패밀리의 개요
달리 나타내지 않는다면, 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질이 본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "H-NOX 단백질"은 H-NOX 도메인 (헴-일산화질소 및 산소 결합 도메인(Heme-Nitric oxide and OXygen binding domain)에 대해 명명됨)을 갖는 단백질을 의미한다. H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 이외에 1개 이상의 다른 도메인을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. H-NOX 단백질은 헴단백질의 고도로 보존되고 잘 특성분석된 패밀리의 구성원이다 (Iyer, L. M. et al. (February 3, 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem . Biol . 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin . Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg . Biochem . 99(4):892-902). H-NOX 단백질은 또한 Pfam 07700 단백질 또는 HNOB 단백질로도 지칭된다 (Pfam - 단백질 도메인 패밀리 정렬 및 히든 마르코브(Hidden Markov) 모델의 데이터베이스, 저작권 (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL 프리 소프트웨어 파운데이션, 인크.(GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.), 미국 02111-1307 매사추세츠주 보스톤 스위트 330 템플 플레이스 59). 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 6개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥에 이어서, 1개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥을 포함하는 이차 구조를 갖거나 갖는 것으로 예측된다. H-NOX 단백질은 헴과 결합할 수 있는 아포단백질 또는 헴과 결합된 홀로단백질일 수 있다. H-NOX 단백질은 공유적으로 또는 비공유적으로 헴 기와 결합할 수 있다. 일부 H-NOX 단백질은 NO와는 결합하지만 O2와는 결합하지 않고, 다른 것은 NO 및 O2 둘 다와 결합한다. 단리된 통성 호기성균으로부터의 H-NOX 도메인은 NO와 결합하지만 O2와는 결합하지 않는다. 편성 호기성 원생생물인 씨. 엘레간스 및 디. 멜라노가스테르(D. melanogaster)로부터의 H-NOX 단백질은 NO 및 O2와 결합한다. 포유동물은 2가지 H-NOX 단백질: β1 및 β2를 갖는다. 마우스, 래트, 소 및 인간 H-NOX 서열의 정렬에 의해, 이들 종이 >99% 동일성을 공유하는 것으로 나타났다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 또는 전체 H-NOX 단백질은 천연 발생 써모아나에로박터 텡콘겐시스 H-NOX 단백질 (예를 들어, 서열식별번호:2) 또는 천연 발생 sGC 단백질 (예를 들어, 천연 발생 sGC β1 단백질)의 상응하는 영역의 것과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일하다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 또는 전체 H-NOX 단백질은 천연 발생 써모아나에로박터 텡콘겐시스 H-NOX 단백질 (예를 들어, 서열식별번호:2) 또는 천연 발생 sGC 단백질 (예를 들어, 천연 발생 sGC β1 단백질)의 상응하는 영역과 적어도 약 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99 또는 99-99.9% 동일하다. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, H-NOX 단백질은 상응하는 천연 발생 H-NOX 단백질에 비해 1개 이상의 돌연변이를 임의적으로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 외에도 1개 이상의 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, H-NOX 단백질은 또 다른 단백질로부터의 1개 이상의 도메인 또는 전체 서열을 포함한다. 예를 들어, H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 및 또 다른 단백질, 예컨대 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민)의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인만이 존재한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 구아닐릴 시클라제 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 태그, 예를 들어 His6 태그를 포함한다.
중합체성 H- NOX 단백질
일부 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 2개 이상의 H-NOX 도메인은 공유 연결되거나 또는 비공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체의 형태를 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 동종성 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 이종성 H-NOX 도메인을 포함하고, 예를 들어 H-NOX 도메인은 특정한 종의 H-NOX 도메인의 아미노산 변이체를 포함할 수 있거나 또는 상이한 종으로부터의 H-NOX 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 중 적어도 1개는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 중 적어도 1개는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 W9F/L144F 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 1종 이상의 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 삼량체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 적어도 1개의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 도메인은 3개의 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 (삼량체성 Tt H-NOX L144F)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 도메인은 3개의 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 2개 이상의 회합된 단량체를 포함한다. 단량체는 공유 연결되거나 또는 비공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 단량체성 아단위가 생성되고, 여기서 단량체성 아단위는 시험관내에서 또는 생체내에서 회합되어 중합체성 H-NOX 단백질을 형성한다. 일부 실시양태에서, 단량체는 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합 도메인은 H-NOX 도메인에 공유 연결되고, 예를 들어 H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 공유 연결된다. 다른 실시양태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 스페이서는 H-NOX 도메인과 중합 도메인 사이를 공유 연결한다. "아미노산 스페이서" 및 "아미노산 링커"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 단량체성 아단위 중 적어도 1개는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 단량체성 아단위 중 적어도 1개는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 W9F/L144F 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 삼량체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질의 단량체는 H-NOX 도메인 및 T4 박테리오파지의 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질의 단량체는 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질의 단량체는 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 아미노산 링커, 예를 들어 Gly-Ser-Gly 링커에 의해 폴드온 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 H-NOX 도메인은 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 H-NOX 도메인은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, His6 태그는 아미노산 링커, 예를 들어 Arg-Gly-Ser 링커에 의해 폴드온 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 모든 H-NOX 도메인은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체성 H-NOX 단백질은 서열식별번호:6 또는 서열식별번호:8에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
티. 텡콘겐시스로부터의 예시적인 H-NOX 도메인은 대략 26.7 kDal을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 약 50 kDal, 75 kDal, 100 kDal, 125 kDal 또는 약 150 kDal 초과의 원자 질량을 갖는다.
본 발명은 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한 후에, 단일 H-NOX 도메인을 포함하는 상응하는 단량체성 H-NOX 단백질에 비해 개체의 1종 이상의 조직에서 더 많은 축적을 나타내는 중합체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 상응하는 H-NOX 단백질은 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 중 적어도 1개를 포함하는 H-NOX 단백질의 단량체성 형태를 지칭한다. 바람직한 중합체성 H-NOX 축적 조직은 종양, 및 손상된 혈관을 갖는 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서 중합체성 H-NOX 단백질은 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한지 적어도 약 1, 2, 3, 4, 6, 12 또는 24시간 후에도 지속된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서 중합체성 H-NOX 단백질은 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한지 약 1-2, 2-3, 3-4, 4-6, 6-12 또는 12-24시간 후에도 지속된다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX의 약 10% 미만은 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한지 약 1시간, 2시간 또는 3시간 미만 내에 포유동물의 신장에 의해 제거된다.
H- NOX 단백질 및 H- NOX 도메인의 공급원
임의의 속 또는 종으로부터의 H-NOX 단백질 및 H-NOX 도메인이 본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 포유동물 (예를 들어, 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이, 고릴라, 유인원, 여우원숭이 등), 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이), 곤충, 효모 또는 박테리아로부터의 단백질 또는 도메인이거나 또는 이러한 단백질로부터 유래된다. 예시적인 포유류 H-NOX 단백질은 야생형 인간 및 래트 가용성 구아닐레이트 시클라제 (예컨대, β1 아단위)를 포함한다. H-NOX 단백질의 비제한적인 예는 야생형 포유류 H-NOX 단백질, 예를 들어 에이치. 사피엔스, 엠. 무스쿨루스(M. musculus), 씨. 파밀리아리스(C. familiaris), 비. 타우루스(B. Taurus), 씨. 루푸스 및 알. 노르베기쿠스가 포함되고, 원핵 야생형 H-NOX 단백질의 예에는 티. 텡콘겐시스, 브이. 콜레라(V. cholera), 브이. 피쉐리이(V. fischerii), 엔. 푼크티포르메, 디. 데술푸리칸스(D. desulfuricans), 엘. 뉴모필라(L. pneumophila) 1, 엘. 뉴모필라 2, 및 씨. 아세토부틸리쿰을 포함한다. NCBI 수탁 번호를 포함한 H-NOX 단백질의 예는 미국 특허 출원 번호 8,404,631 및 8,404,632, WO 2007/139791 및 WO 2007/139767에서 확인할 수 있으며, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 제약 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합할 수 있는 추가의 H-NOX 단백질, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인, 및 핵산은 표준 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 표준 서열 정렬 및/또는 구조 예측 프로그램을 이용하여, 그들의 일차 및/또는 예상된 단백질 이차 구조와 공지된 H-NOX 단백질 및 핵산과의 유사성을 기준으로 추가의 H-NOX 단백질 및 핵산을 확인할 수 있다. 예를 들어, Pfam 데이터베이스는 규정된 정렬 알고리즘 및 히든 마르코브 모델 (예컨대, Pfam 21.0)을 이용하여 단백질을 패밀리로, 예컨대 H-NOX 단백질 패밀리로 류한다 (Pfam - 단백질 도메인 패밀리 정렬 및 히든 마르코브 모델의 데이터베이스, 저작권 (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL 프리 소프트웨어 파운데이션, 인크., 미국 02111-1307 매사추세츠주 보스톤 스위트 330 템플 플레이스 59). 또한, 표준 데이터베이스, 예컨대 스위스프롯-트렘블 데이터베이스 (월드 와이드 웹 "expasy.org", 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포머틱스 스위스-프롯 그룹 씨엠유(Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU), 스위스 체하-1211 제네바 4 뤼 미쉘 세르벳 1)를 이용하여 H-NOX 단백질 패밀리의 구성원을 확인할 수 있다. H-NOX 단백질의 이차 및/또는 삼차 구조는 표준 구조 예측 프로그램의 디폴트 셋팅, 예컨대 프리딕트프로테인(PredictProtein, 미국 10032 뉴욕주 뉴욕 BB217 스트리트 168 웨스트 630)을 이용하여 예측할 수 있다. 대안적으로, H-NOX 단백질의 실제 이차 및/또는 삼차 구조는 표준 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 하기 임의의 원위 포켓 잔기와 상응하는 위치에서 동일한 아미노산을 갖는다: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 그의 아미노산 서열의 서열 정렬을 기준으로 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 Pro115 또는 Arg135에 상응하는 위치에서 각각 프롤린 또는 아르기닌을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 알. 노르베기쿠스 β1 H-NOX의 His105에 상응하는 히스티딘을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 6개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥에 이어서, 1개의 알파-나선에 이어서, 2개의 베타-가닥을 포함하는 이차 구조를 갖거나 갖는 것으로 예측된다. 이 이차 구조는 H-NOX 단백질에 대해 보고되었다.
목적되는 경우에, 새로 확인된 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을, 표준 방법을 이용하여 헴과 결합하는지 여부를 결정하기 위해 시험할 수 있다. H-NOX 도메인이 O2 담체로서 기능하는 능력은, 본원에 기재된 것과 같은 표준 방법을 이용하여 H-NOX 도메인이 O2와 결합하는지 여부를 결정함으로써 시험할 수 있다. 목적되는 경우에, 본원에 기재된 1개 이상의 돌연변이를 H-NOX 도메인에 도입하여, O2 담체로서의 그의 특성을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 돌연변이를 도입하여 그의 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자가산화 속도, NO 반응성, NO 안정성, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합을 변경시킬 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 표준 기술을 이용하여 이들 변수를 측정할 수 있다.
돌연변이체 H- NOX 단백질
본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 상응하는 야생형 단백질에 비해 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자가산화 속도, NO 반응성, NO 안정성, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합을 변경시키는 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 상응하는 야생형 단백질에 비해 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자가산화 속도, NO 반응성, NO 안정성, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합을 변경시키는 돌연변이를 함유할 수 있는 1개 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 조작된 H-NOX 도메인의 패널은, 본원에 제공된 교시내용의 관점에서 본원에 기재된 기술을 이용하여 추가로 통상의 기술자에 의해 공지된 바와 같이, 무작위 돌연변이유발에 이어서, 필요한 또는 목적하는 해리 상수, 해리 속도, NO-반응성, 안정성, 생리학적 상용성, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합에 대한 실험적 스크리닝에 의해 생성할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이유발은 특정한 영역 또는 잔기, 예컨대 H-NOX 단백질의 실험적으로 결정된 또는 예측된 삼차원 구조로부터 명백한 원위 포켓 잔기 (예를 들어, 특히 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질의 서열에 관해서는 Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59를 참조하며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함됨) 또는 서열 정렬로부터 확인된 진화상 보존된 잔기 (예를 들어, 특히 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질의 서열에 관해서는 Boon E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59를 참조하고, 이는 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 선택적으로 표적화할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 모든 천연 발생 H-NOX 단백질 또는 도메인과는 상이한 서열을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 천연 발생 H-NOX 단백질의 상응하는 영역과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일하다. 다양한 실시양태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 천연 발생 H-NOX 단백질의 상응하는 영역과 약 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99% 또는 99.5% 동일하다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 적어도 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 또는 400개 인접한 아미노산을 함유하는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 또는 300-400개 인접한 아미노산을 함유하는 단백질 단편이다. 서열 동일성은 예를 들어 명시된 디폴트 변수를 갖는 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터)의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 소프트웨어 프로그램은 다양한 아미노산 치환, 결실 및 다른 변형에 대한 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매칭시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 1개 이상의 아미노산의 삽입 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 삽입)을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 1개 이상의 아미노산의 결실 (예를 들어, N-말단, C-말단 및/또는 내부 잔기의 결실, 예컨대 적어도 약 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개 이상의 아미노산의 결실 또는 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300 또는 300-400개 아미노산의 결실)을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 1개 이상의 아미노산의 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산의 치환) 또는 상기 2종 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 단백질은 천연 발생 단백질에 비해 적어도 1개의 아미노산 변경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 핵산 서열은 천연 발생 단백질에 비해 적어도 1개의 아미노산 변경을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 발생 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 천연 발생 핵산의 중축성 형태가 아니다.
일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인에서의 돌연변이는 진화상 보존된 돌연변이 (부류 I 돌연변이로도 지칭됨)이다. 부류 I 돌연변이의 예는 하기 표 1A에 열거되어 있다. 표 1A에서, 돌연변이는 인간 β1 H-NOX의 서열에 따라 넘버링/주해되지만, 모든 H-NOX 서열에 대해 유사하다. 따라서, 임의의 다른 H-NOX 단백질에서 상응하는 위치는 지정된 잔기로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 다른 H-NOX 단백질이 이 위치에서 티로신을 갖기 때문에 인간 β1 H-NOX의 Phe4는 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 상응하는 페닐알라닌 잔기는 임의의 다른 H-NOX 단백질에서 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 진화상 보존된 잔기에 국한된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 적어도 1종의 진화상 보존된 돌연변이 및 적어도 1종의 비-진화상 보존된 돌연변이를 포함할 수 있다. 목적되는 경우에, 이들 돌연변이체 H-NOX 단백질을 본원에 기재된 교시내용의 관점에서 NO/O2 해리 상수, NO-반응성, 안정성 및 생리학적 상용성에 대해 실험적으로 스크리닝한다.
표 1A. 진화상 보존된 잔기를 표적화하는 예시적인 부류 I H- NOX 돌연변이
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 돌연변이는 원위 포켓 돌연변이, 예컨대 알파-나선 A, D, E 또는 G에 있는 잔기의 돌연변이이다 (Pellicena, P. et al. (August 31, 2004). Proc Natl . Acad Sci USA 101(35):12854-12859). 예시적인 원위 포켓 돌연변이 (부류 II 돌연변이로도 지칭됨)는 표 1B에 열거되어 있다. 표 1B에서, 돌연변이는 인간 β1 H-NOX의 서열에 따라 넘버링/주해되지만, 모든 H-NOX 서열에 대해 유사하다. 여러 치환이 각각의 인용된 잔기에서 생존가능한 돌연변이를 제공하기 때문에, 각각의 지정된 위치에 있는 잔기는 임의의 다른 천연 또는 비천연 발생 아미노산 ("X"로 지칭됨)으로 변경될 수 있다. 이러한 돌연변이는 다양한 목적하는 친화도, 안정성 및 반응성 특징을 갖는 H-NOX 단백질을 생성할 수 있다.
표 1B. 원위 포켓 잔기를 표적화하는 예시적인 부류 II H- NOX 돌연변이
Figure pct00002
특정 실시양태에서, 돌연변이는 헴 원위 포켓 돌연변이이다. 본원에서 논의된 바와 같이, H-NOX 패밀리의 NO-결합 구성원에서 O2 결합을 방지하는 중요한 분자 결정인자는 헴의 원위 포켓에 있는 H-결합 공여자의 부재이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 돌연변이는 H-NOX 도메인과 원위 포켓 내의 리간드 사이의 H-결합을 변경시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 원위 포켓의 H-결합 공여자를 방해하고/거나 상응하는 야생형 H-NOX 도메인에 비해 감소된 O2 리간드-결합을 부여한다. 예시적인 원위 포켓 잔기는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 및 Leu144, 및 임의의 다른 H-NOX 단백질에서의 상응하는 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 1개 이상의 원위 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 원위 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 원위 포켓 돌연변이는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 상응한다. 일부 실시양태에서, 원위 포켓 돌연변이는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144F 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 2개의 원위 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 W9F/ L144F 돌연변이에 상응한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 W9F/ L144F 돌연변이이다.
원위 포켓에 있지 않는 잔기 또한 헴 기의 삼차원 구조에 영향을 미칠 수 있고, 이 구조는 다시 헴 기의 철과 O2 및 NO의 결합에 영향을 미친다. 따라서, 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 원위 포켓 외부에 1개 이상의 돌연변이를 갖는다. 원위 포켓에 있지 않지만 돌연변이될 수 있는 잔기의 예는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 Pro115 및 Arg135를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 헴 철과 라이게이션하는 잔기로서 His105를 포함하는 근위 포켓에 있다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 돌연변이가 존재하고, 적어도 1개의 돌연변이는 원위 포켓에 있고, 적어도 1개의 돌연변이는 원위 포켓의 외부에 있다 (예를 들어, 근위 포켓에서의 돌연변이). 일부 실시양태에서, 모든 돌연변이가 원위 포켓에 있다.
인간 이외의 공급원으로부터 유래된 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인의 면역원성을 감소시키기 위해, H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인에 있는 아미노산을 인간 H-NOX에 있는 상응하는 아미노산으로 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 비-인간 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인의 삼차 구조의 표면 상에 있는 1개 이상의 아미노산을 인간 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인에 있는 상응하는 아미노산으로 돌연변이시킬 수 있다. 일부 변형에서, 1개 이상의 표면 아미노산의 돌연변이를 2개 이상의 원위 포켓 잔기의 돌연변이, 원위 포켓 외부에 있는 1개 이상의 잔기의 돌연변이 (예를 들어, 근위 포켓에서의 돌연변이), 또는 상기 2종 이상의 조합과 조합할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 돌연변이의 임의의 조합, 예컨대 이중, 삼중 또는 더 많은 다중 돌연변이에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이의 임의의 조합은 동일한 H-NOX 단백질에서 이루어질 수 있다. 다른 포유류 또는 비-포유류 H-NOX 단백질에 있는 동등한 위치에서의 돌연변이가 또한 본 발명에 의해 포괄됨을 주목한다. 예시적인 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 상응하는 야생형 H-NOX 도메인에 비해 변경된 O2 또는 NO 리간드-결합을 부여하는 1개 이상의 돌연변이를 포함하고, 생리학적으로 상용성인 포유류 O2 혈액 기체 담체로서 작동한다.
돌연변이에 대한 잔기 번호는 기재된 특정한 H-NOX 단백질의 서열에서의 위치를 나타낸다. 예를 들어, 티. 텡콘겐시스 I5A는 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 5번째 위치에서 이소류신이 알라닌으로 치환된 것을 나타낸다. 이소류신에서 알라닌으로의 동일한 돌연변이가 임의의 다른 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인의 상응하는 잔기에서 이루어질 수 있다 (이 잔기는 다른 H-NOX 단백질의 서열에서 5번째 잔기일 수 있거나 아닐 수 있음). 포유류 β1 H-NOX 도메인의 아미노산 서열이 많아야 2개 아미노산만큼 상이하기 때문에, 야생형 래트 β1 H-NOX 단백질에 도입할 때 원하는 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 생성하는 돌연변이는 또한, 다른 포유동물, 예컨대 인간으로부터의 야생형 β1 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인에 도입할 때 원하는 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 생성할 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 야생형 H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다.
H- NOX 단백질에 대한 변형
중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질을 치료적 또는 산업적 적용을 증진시키기 위해 표준 방법을 이용하여 변형 및/또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 특히 이종성 조작된 H-NOX 단백질에 적용된 바와 같이, 면역 감시로부터 작용제를 격리시키기 위한 다양한 방법, 예컨대 가교, PEG화, 탄수화물 장식 등 (예를 들어, 특히 단백질 변형에 관해서는 Rohlfs, R. J. et al. (May 15, 1998). J. Biol . Chem . 273(20):12128-12134; Migita, R. et al. (June 1997). J. Appl . Physiol . 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189를 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질과 인간 혈청 알부민과 같은 인간 단백질의 융합은 혈청 반감기, 점도 및 콜로이드 삼투압을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질을 그의 합성 동안 또는 후에 변형시켜 그의 면역원성을 감소시키고/거나 그의 혈장 체류 시간을 증가시킨다. H-NOX 단백질을 또한 캡슐화시킬 수 있다 (예컨대, 리포좀 또는 나노입자 내에 캡슐화).
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 예를 들어 H-NOX 단백질의 정제를 보조하기 위해 1종 이상의 태그를 포함한다. 태그의 예는 His6, FLAG, GST 및 MBP를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 1종 이상의 His6 태그를 포함한다. 1종 이상의 His6 태그는 중합체성 H-NOX 단백질을 사용하기 전에 예를 들어 엑소펩티다제 처리에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 야생형 H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체이다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자를 포함한다 (즉, PEG화됨). 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 삼량체이다 (PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F). 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘겐시스 야생형 H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 50 kDa이다. 일부 실시양태에서, PED의 분자량은 약 1 kDa 내지 50 kDa, 1 kDa 내지 40 kDa, 1 kDa 내지 30 kDa, 1 kDa 내지 25 kDa, 1 kDa 내지 20 kDa, 1 kDa 내지 15 kDa, 1 kDa 내지 10 kDa, 1 kDa 내지 5 kDa, 5 kDa 내지 50 kDa, 5 kDa 내지 40 kDa, 5 kDa 내지 30 kDa, 5 kDa 내지 25 kDa, 5 kDa 내지 20 kDa, 5 kDa 내지 15 kDa, 5 kDa 내지 10 kDa, 10 kDa 내지 50 kDa, 10 kDa 내지 40 kDa, 10 kDa 내지 30 kDa, 10 kDa 내지 25 kDa, 10 kDa 내지 20 kDa, 10 kDa 내지 15 kDa, 15 kDa 내지 50 kDa, 15 kDa 내지 40 kDa, 15 kDa 내지 35 kDa, 15 kDa 내지 30 kDa, 15 kDa 내지 25 kDa, 15 kDa 내지 20 kDa, 20 kDa 내지 50 kDa, 20 kDa 내지 40 kDa, 20 kDa 내지 30 kDa, 20 kDa 내지 25 kDa, 25 kDa 내지 50 kDa, 25 kDa 내지 40 kDa, 25 kDa 내지 30 kDa, 30 kDa 내지 50 kDa, 30 kDa 내지 40 kDa, 또는 40 kDa 내지 50 kDa이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 H-NOX 단량체당 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 이상 또는 이들 사이의 임의의 수의 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 H-NOX 단량체당 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 또는 이들 사이의 임의의 수의 PEG 분자를 포함한다.
중합 도메인
일부 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 H-NOX 도메인 및 1개 이상의 중합 도메인을 포함하는 중합체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 중합 도메인은 2개 이상의 H-NOX 도메인을 연결하여 중합체성 H-NOX 단백질을 형성하기 위해 사용된다. 1개 이상의 중합 도메인은 H-NOX 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 중합 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 T4 박테리오파지 피브리틴의 폴드온, Arc, POZ, 이중 나선 도메인 (예컨대, GCN4, 류신 지퍼, 벨크로), 우테로글로빈, 콜라겐, 3-가닥 이중 나선 (마트릴린-1), 트롬보스포린, TRPV1-C, P53, Mnt, 아바딘, 스트렙타비딘, Bcr-Abl, COMP, 베로톡신 아단위 B, CamKII, RCK, 및 N 에틸말레이미드-민감성 융합 단백질로부터의 도메인, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, 탄저균 보호성 항원, 에어로리신, a-헤모리신, C4b-결합 단백질, Mi-CK, 아릴술파타제 A, 및 바이러스 캡시드 단백질이 있다. 중합 도메인은 H-NOX 도메인에 공유 또는 비공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수개의 단량체 아단위로부터의 중합 도메인이 회합하여 중합체성 H-NOX 도메인을 형성하도록, 중합 도메인을 H-NOX 도메인에 연결하여 단량체 아단위를 형성한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다.
링커, 예를 들어 아미노산 링커를 사용하여 중합 도메인을 H-NOX 도메인에 연결할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과 중 어느 하나인 아미노산을 포함하는 링커를 중합 도메인과 H-NOX 도메인 사이에 놓을 수 있다. 예시적인 링커는 Gly-Ser-Gly 및 Arg-Gly-Ser 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리오파지 T4 피브리틴 삼량체화 도메인
예시적인 중합 도메인은 박테리오파지 T4의 폴드온 도메인이다. 박테리오파지 T4로부터의 wac 유전자는 C-말단 삼량체화 도메인 (잔기 457-483)을 갖는 486개 아미노산 단백질인 피브리틴 단백질을 코딩한다 (Efimov, V. P. et al. (1994) J Mol Biol 242:470-486). 상기 도메인은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 피브리틴을 삼량체화시킬 수 있다 (Boudko, S. P. et al. (2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V., et al., (1999) Biochemistry ( Mosc )64:817-823; Tao, Y., et al., (1997) Structure 5:789-798). 종종 "폴드온 도메인"으로도 지칭되는 단리된 27개 잔기 삼량체화 도메인은 수많은 상이한 단백질 (예컨대, HIV 피막 당단백질 (Yang, X. et al., (2002) J Virol 76:4634-4642), 아데노바이러스 부착인자 (Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J Mol Biol 342:219-227), 콜라겐 (Zhang, C., et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668), 파지 P22 gp26 (Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485), 및 광견병 바이러스 당단백질 (Sissoeff, L., et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552)에서 키메라 삼량체를 구성하기 위해 사용되었다. 폴드온 도메인의 예시적인 서열을 도 1에 도시하였고, 서열식별번호:4로 제공하였다.
단리된 폴드온 도메인은 단일 β-헤어핀 구조로 폴딩하고, 3개의 헤어핀을 포함하는 β-프로펠러 구조로 삼량체화한다 (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). 폴드온 도메인 단독의 구조는 NMR에 의해 결정되었고 (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915), 폴드온 도메인에 의해 삼량체화된 여러 단백질의 구조는 X-선 결정학에 의해 해명되었다 (Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Stetefeld, J. et al. (2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N. et al. (2010) Small 6:1873-1879). 상기 도메인이 폴딩하여 신속히 삼량체화함으로써, 중간체 또는 경로외 올리고머화 생성물의 미스폴딩 기회가 감소된다 (Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). 폴드온 도메인은 매우 안정하고, >10% SDS, 6.0M 구아니딘 히드로클로라이드, 또는 80℃에서 삼차 구조 및 올리고머화를 유지할 수 있고 (Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485; Bhardwaj, A., et al. (2007) J Mol Biol 371:374-387), 폴드온 도메인에 융합된 서열의 안정성을 개선시킬 수 있다 (Du, C. et al. (2008) Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202).
일부 실시양태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 링커를 사용하여 폴드온 도메인을 H-NOX 도메인에 연결시킨다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과 중 어느 하나인 아미노산을 포함하는 링커를 중합 도메인과 H-NOX 도메인 사이에 놓을 수 있다. 예시적인 링커는 Gly-Ser-Gly 및 Arg-Gly-Ser 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 N-말단에서부터 C-말단으로: 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커, 및 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 N-말단에서부터 C-말단으로: 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 아미노산 링커, 및 His6 태그를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인은 L144F 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인은 W9F 돌연변이 및 L144F 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인은 야생형 H-NOX 도메인이다.
단량체성 H- NOX 도메인 아단위
한 측면에서, 본 발명은 중합체성 H-NOX 단백질을 형성하도록 회합할 수 있는 재조합 단량체성 H-NOX 단백질 (즉, 중합체성 H-NOX 단백질의 단량체성 H-NOX 아단위)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 논의된 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 H-NOX 단백질을 제공한다. H-NOX 도메인 및 중합 도메인은 공유 연결 또는 비공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 구아닐릴 시클라제 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 야생형 H-NOX 도메인을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 돌연변이는 상응하는 야생형 H-NOX 도메인에 비해 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자가산화 속도, NO 반응성, NO 안정성 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합을 변경시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 원위 포켓 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 원위 포켓에 있지 않은 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 원위 포켓 돌연변이는 티. 텡콘겐시스의 L144 돌연변이 (예를 들어, L144F 돌연변이)에 상응한다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 티. 텡콘겐시스의 W9 및 L144 돌연변이에 상응하는 2개의 원위 포켓 돌연변이 (예를 들어, W9F/L144F 돌연변이)를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 삼량체성 H-NOX 단백질을 형성하도록 회합하는 재조합 단량체성 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삼량체화 도메인은 본원에서 논의된 폴드온 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 도메인은 L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 도메인은 W9F/L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, 티. 텡콘겐시스 도메인은 야생형 H-NOX 도메인이다.
일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열을 이용하여 중합 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 아미노산 길이를 갖는다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 3개의 H-NOX 도메인 및 3개의 삼량체화 서열을 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질이고, 여기서 H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열을 통해 삼량체화 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: W9F/L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 태그, 예를 들어 His6, FLAG, GST 또는 MBP 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 태그를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 태그 (예를 들어, His6 태그)는 아미노산 스페이서 서열을 이용하여 중합 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 아미노산 길이를 갖는다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 3개의 H-NOX 도메인, 3개의 삼량체화 서열, 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질이고, 여기서 H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열를 통해 삼량체화 도메인에 공유 연결되고, 삼량체화 도메인은 아미노산 링커 서열를 통해 His6 태그에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: W9F/L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체성 H-NOX 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로: 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 단량체성 H-NOX 단백질은 서열식별번호:6 또는 서열식별번호:8의 아미노산 서열을 포함한다.
야생형 및 돌연변이체 H- NOX 단백질의 특징
본 발명은 종양 저산소와 연관된 면역 억제 활성을 억제함으로써 종양 면역원성을 증진시키는데 사용하기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도를 제공한다. O2 담체 폴리펩티드의 비제한적인 예시적인 패밀리는 O2 담체 폴리펩티드의 H-NOX 패밀리이다. 본원에서 논의된 바와 같이, NO 및 O2 해리 상수, O2 koff, NO 반응성, 및 안정성의 범위를 제공하는 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 수많은 다양한 H-NOX 돌연변이체 단백질이 생성되었다. 작동성 혈액 기체 담체를 제공하기 위해, H-NOX 단백질을 사용하여 내인성 O2 담체, 예컨대 헤모글로빈을 기능적으로 교체하거나 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질, 예컨대 중합체성 H-NOX 단백질을 사용하여 방사선 요법 또는 화학요법에 대한 아주반트로서 O2를 저산소 종양 조직 (예를 들어, 교모세포종)에 전달한다. 따라서, 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 내인성 O2 담체, 예컨대 헤모글로빈과 유사한 또는 그보다 개선된 O2 회합 속도, O2 해리 속도, O2 결합에 대한 해리 상수, NO 안정성, NO 반응성, 자가산화 속도, 혈장 체류 시간, 또는 상기 2종 이상의 임의의 조합을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 중합체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질이고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질이고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질이고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질에서 O2에 대한 koff는 20℃에서 약 0.01 내지 약 200 s-1, 예컨대 약 0.1 내지 약 200 s-1, 약 0.1 내지 100 s-1, 약 1.0 내지 약 16.0 s-1, 약 1.35 내지 약 23.4 s-1, 약 1.34 내지 약 18 s-1, 약 1.35 내지 약 14.5 s-1, 약 0.21 내지 약 23.4 s-1, 약 1.35 내지 약 2.9 s-1, 약 2 내지 약 3 s-1, 약 5 내지 약 15 s-1, 또는 약 0.1 내지 약 1 s-1이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.65 s-1 이하 (예컨대, 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1)의 산소에 대한 koff를 갖는다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질에서 O2에 대한 kon은 20℃에서 약 0.14 내지 약 60 μM-1s-1, 예컨대 약 6 내지 약 60 μM-1s-1, 약 6 내지 12 μM-1s-1, 약 15 내지 약 60 μM-1s-1, 약 5 내지 약 18μM-1s-1, 또는 약 6 내지 약 15 μM-1s-1이다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질에 의한 O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 약 1 nM 내지 1 mM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시양태에서, O2 결합에 대해 계산된 KD는 20℃에서 약 2 nM 내지 약 2 μM, 약 2 μM 내지 약 1 mM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 9 μM 내지 약 50 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 약 50 nM 내지 약 10 μM, 약 2 nM 내지 약 50 μM, 약 100 nM 내지 약 1.9 μM, 약 150 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 255 nM, 약 20 nM 내지 약 2 μM, 20 nM 내지 약 75 nM, 약 1 μM 내지 약 2 μM, 약 2 μM 내지 약 10 μM, 약 2 μM 내지 약 9 μM, 또는 약 100 nM 내지 500 nM 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 20℃에서 약 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM 또는 10 nM 미만이다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질에 의한 O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 동일한 조건 하에 (예컨대, 20℃에서) 헤모글로빈의 약 0.01 내지 약 100배 이내, 예컨대 동일한 조건 하에 (예컨대, 20℃에서) 헤모글로빈의 약 0.1 내지 약 10배 또는 약 0.5 내지 약 2배이다. 다양한 실시양태에서, H-NOX 단백질에 의한 NO 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 동일한 조건 하에 (예컨대, 20℃에서) 헤모글로빈의 약 0.01 내지 약 100배, 예컨대 동일한 조건 하에 (예컨대, 20℃에서) 헤모글로빈의 약 0.1 내지 약 10배 또는 약 0.5 내지 약 2배이다.
일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질의 약 50, 40, 30, 10 또는 5% 미만이 20℃에서 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 또는 20시간 동안 인큐베이션한 후에 산화된다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만, 예컨대 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1.8 s-1, 1.5 s-1, 1.2 s-1, 1.0 s-1, 0.8 s-1, 0.7 s-1 또는 0.6 s-1 미만이다. 다양한 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 0.1 내지 약 600 s-1, 예컨대 20℃에서 약 0.5 내지 약 400 s-1, 약 0.5 내지 약 100 s-1, 약 0.5 내지 약 50 s-1, 약 0.5 내지 약 10 s-1, 약 1 내지 약 5 s-1, 또는 약 0.5 내지 약 2.1 s-1이다. 다양한 실시양태에서, H-NOX 단백질의 반응성은 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈보다 적어도 약 10, 100, 1,000 또는 10,000배 더 낮다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 1.0 h-1 미만, 예컨대 37℃에서 약 0.9 h-1, 0.8 h-1, 0.7 h-1, 0.6 h-1, 0.5 h-1, 0.4 h-1, 0.3 h-1, 0.2 h-1, 0.1 h-1 또는 0.05 h-1 미만이다. 다양한 실시양태에서, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 0.006 내지 약 5.0 h-1, 예컨대 37℃에서 약 0.006 내지 약 1.0 h-1, 0.006 내지 약 0.9 h-1 , 또는 약 0.06 내지 약 0.5 h-1이다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 돌연변이체 H-NOX 단백질은 (a) O2 또는 NO 해리 상수, 회합 속도 (O2 또는 NO에 대한 kon), 또는 해리 속도 (O2 또는 NO에 대한 koff)가 헤모글로빈의 2 자릿수 이내이거나, (b) 각각 NO 친화도가 sGC β1보다 약하거나 (예를 들어, 적어도 약 10배, 100배, 또는 1000배 약함), (c) 결합된 O2와의 NO 반응성이 헤모글로빈보다 적어도 1000배 더 낮거나, (d) 생체내 혈장 체류 시간이 헤모글로빈보다 적어도 2, 10, 100, 또는 1000배 더 높거나, 또는 (e) 상기 2종 이상의 임의의 조합을 갖는다.
예시적인 적합한 O2 담체는 해리 상수가 헤모글로빈의 2 자릿수 이내, 즉, 헤모글로빈의 약 0.01 내지 100배, 예컨대 약 0.1 내지 10배, 또는 약 0.5 내지 2배이다. 다양한 정립된 기술, 예컨대 본원에 기재된 기술 (특히 해리 상수의 측정에 관해서는 Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem . Biol . 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr . Opin . Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg . Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189를 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 뿐만 아니라 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 해리 상수를 정량화할 수 있다. 예시적인 O2 담체는 결합된 O2를 갖는 H-NOX 단백질의 낮은 또는 최소화된 NO 반응성, 예컨대 헤모글로빈보다 낮은 NO 반응성을 제공한다. 일부 실시양태에서, NO 반응성은 헤모글로빈보다 훨씬 낮으며, 예컨대 적어도 약 10, 100, 1,000 또는 10,000배 더 낮다. 다양한 정립된 기술 (NO 반응성의 측정에 관해서는 Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem . Biol . 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr . Opin . Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg . Biochem . 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1):183-189를 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨) 뿐만 아니라 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 NO 반응성을 정량화할 수 있다. 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX가 이러한 낮은 NO 반응성을 갖기 때문에, 다른 야생형 H-NOX 단백질 및 돌연변이체 H-NOX 단백질은 유사한 낮은 NO 반응성을 가질 수 있다. 예를 들어, 티. 텡콘겐시스 H-NOX Y140H는 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX와 유사한 NO 반응성을 갖는다.
또한, 적합한 O2 담체는 높은 또는 최대화된 안정성, 특히 생체내 안정성을 제공한다. 다양한 안정성 척도, 예컨대 산화 안정성 (예를 들어, NO에 의한 자가산화 또는 산화에 대한 안정성), 온도 안정성, 및 생체내 안정성을 이용할 수 있다. 다양한 정립된 기술, 예컨대 본원에 기재된 기술 (Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem . Biol . 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr . Opin . Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg . Biochem . 99(4):892-902) 뿐만 아니라 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 안정성을 정량화할 수 있다. 혈장, 혈액 또는 조직에서의 생체내 안정성의 경우, 예시적인 안정성 척도는 체류 시간, 클리어런스율 및 반감기를 포함한다. 호열성 유기체로부터의 H-NOX 단백질은 고온에서 안정할 것으로 예상된다. 다양한 실시양태에서, 혈장 체류 시간은 헤모글로빈의 적어도 약 2배, 10배, 100배 또는 1000배 더 크다 (예를 들어, Bobofchak, K. M. et al. (August 2003). Am. J. Physiol . Heart Circ . Physiol. 285(2):H549-H561). 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 혈장으로부터 세포-무함유 헤모글로빈을 제거하는 헤모글로빈에 대한 수용체의 존재로 인한 혈장으로부터의 세포-무함유 헤모글로빈의 신속한 클리어런스에 의해 헤모글로빈-기재 혈액 대체제는 제한적이다. 혈장 중에 H-NOX 단백질에 대한 수용체는 없기 때문에, 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질이 헤모글로빈에 비해 더 긴 혈장 체류 시간을 가질 것으로 예상된다. 목적되는 경우에, 표준 방법 (예컨대, 본원에 기재된 것들 및 통상의 기술자에게 공지된 것들)을 이용하여 H-NOX 단백질의 PEG화 또는 가교, 또는 H-NOX 단백질과 또 다른 단백질의 융합에 의해 혈장 체류 시간을 증가시킬 수 있다.
다양한 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 H-NOX 단백질은 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1 mM의 O2 해리 상수, 및 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈에 비해 적어도 약 10배 더 낮은 NO 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1 mM의 O2 해리 상수, 및 20℃에서 약 700 s-1 미만 (예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)의 NO 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 헤모글로빈의 2 자릿수 이내인 O2 해리 상수, 및 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈보다 적어도 약 10배 더 낮은 NO 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.01 내지 약 200 s-1의 산소에 대한 koff, 및 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈보다 적어도 약 10배 더 낮은 NO 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.65 s-1 미만 (예컨대 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.64 s- 1)인 산소에 대한 koff, 및 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈보다 적어도 약 10배 더 낮은 NO 반응성을 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 약 1 nM 내지 약 1 μM (1000 nM), 약 1 μM 내지 약 10 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 특정 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 2 nM 내지 약 50 μM, 약 50 nM 내지 약 10 μM, 약 100 nM 내지 약 1.9 μM, 약 150 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 255 nM이다. 다양한 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 80 nM 미만, 예컨대 20℃에서 약 20 nM 내지 약 75 nM이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 동일한 조건 하에, 예컨대 20℃에서 헤모글로빈보다 적어도 약 100배 더 낮거나 또는 약 1,000배 더 낮다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만, 예컨대 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1.8 s-1, 1.5 s-1, 1.2 s-1, 1.0 s-1, 0.8 s-1, 0.7 s-1, 또는 0.6 s-1 미만이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 0.01 내지 200 s-1, 예컨대 약 0.1 내지 약 200 s-1, 약 0.1 내지 100 s-1, 약 1.35 내지 약 23.4 s-1, 약 1.34 내지 약 18 s-1, 약 1.35 내지 약 14.5 s-1, 약 0.21 내지 약 23.4 s-1, 약 2 내지 약 3 s-1, 약 5 내지 약 15 s-1, 또는 약 0.1 내지 약 1 s- 1이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 100 nM 내지 약 1.9 μM이고, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s- 1이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만, 예컨대 약 0.9 h-1, 0.8 h-1, 0.7 h-1, 0.6 h-1, 0.5 h-1, 0.4 h-1, 0.3 h-1, 0.2 h-1, 또는 0.1 h-1 미만이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s-1이고, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s-1이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만 (예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만 (예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)이다.
일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질 용액을 포함한 H-NOX 단백질 용액의 점도는 1 내지 4 센티푸아즈 (cP)이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질 용액의 콜로이드 삼투압은 20 내지 50 mm Hg이다.
O 2 및/또는 NO 결합의 측정
관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 및 하기 기재된 비제한적인 예시적인 방법에 의해 중합체성 H-NOX 단백질, 예컨대 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함한 임의의 H-NOX 단백질의 산소 및 일산화질소 결합 특성을 용이하게 결정할 수 있다.
동적 K D : k off 대 k on 의 비
중합체성 H-NOS 단백질을 포함한 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질에 대한 동적 KD 값은 본질적으로 Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 (특히 O2 회합 속도, O2 해리 속도, O2 결합에 대한 해리 상수, 자가산화 속도, 및 NO 해리 속도의 측정에 관해 참조하고, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 결정한다.
k on (O 2 회합 속도)
헴에 대한 O2 회합은 20℃에서 섬광 광분해를 이용하여 측정한다. 매우 빠른 제짝 재결합 역학으로 인해 FeII-O2 복합체를 섬광 제거할 수 없기 때문에, 560 nm의 레이저 광 (휴렛-팩커드(Hewlett-Packard), 캘리포니아주 팔로 알토)에 의해 FeII-CO 복합체를 섬광 광분해하여, 5-배위 FeII 중간체를 생성한 후, 이를 다양한 파장에서 분자 O2와 결합시킨다. 단백질 샘플은 10 mM 디티오나이트를 이용하여 무산소적으로 환원시킨 후, PD-10 칼럼 (밀리포어, 인크.(Millipore, Inc.), 매사추세츠주 빌러리카) 상에서 탈염시킴으로써 제조한다. 이어서, 샘플을 100 μL 내지 1 mL의 크기 및 1-cm의 경로 길이를 갖는 제어된 분위기의 석영 큐벳에서 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 완충제 중 20 μM 헴으로 희석시킨다. CO 기체를 10분 동안 상기 큐벳의 상부 공간으로 범람시켜, FeII-CO 복합체를 형성하고, 그의 형성은 UV-가시선 분광법 (소렛(Soret) 최대 423 nm)에 의해 입증한다. 이어서, 이 샘플을 이용하여 여전히 1 기압의 CO 기체 하에서 섬광 광분해 이후 CO-재결합 역학을 측정하거나, 또는 섬광 광분해 전에 샘플을 개방하고 공기 중에서 30분 동안 교반하여 완전히 산소화시켜 O2-재결합 사건을 관찰한다. 헴으로의 O2 회합을 시간에 걸쳐 다중 파장에서 모니터링한다. 이들 기록을 이고르 프로(Igor Pro) 소프트웨어 (웨이브메트릭스, 인크.(Wavemetrics, Inc.), 오레곤주 오스웨고; 최신 2005 버전)를 이용하여 단일 지수로 대입하였다. 이 회합 속도는 관찰 파장에는 비의존적이지만, O2 농도에는 의존적이다. UV-가시선 분광법을 전체에 걸쳐 이용하여 모든 복합체 및 중간체를 확인한다 (Cary 3K, 배리언, 인크.(Varian, Inc.), 캘리포니아주 팔로 알토). 일시적인 흡수 데이터를 Dmochowski, I. J. et al. (August 31, 2000). J Inorg Biochem . 81(3):221-228 (특히 장비에 관해서 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 장비를 이용하여 수집한다. 상기 장비는 20 ns의 반응 시간을 갖고, 데이터는 200 메가샘플 s-1로 수치화된다.
k off (O 2 해리 속도)
koff를 측정하기 위해, 단백질의 FeII-O2 복합체 (5 μM 헴)을 무산소성 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 완충제에 희석하고, 다양한 농도의 디티오나이트 및/또는 포화 CO 기체를 함유하는 동등한 부피의 동일한 완충제 (무산소성)와 신속히 혼합한다. 20℃로 설정된 네슬랩(Neslab) RTE-100 항온 조를 구비한 하이테크 사이언티픽(HI-TECH Scientific) SF-61 유동-정지 분광광도계 (TGK 사이언티픽 리미티드(TGK Scientific LTD.), 영국 브래드포드 온 에이번) 상에서 데이터를 획득한다. 헴으로부터 O2의 해리는 FeII - FeII-O2 차이 스펙트럼에서의 최대치인 437 nm에서 또는 FeII - FeII-CO 차이 스펙트럼에서의 최대치인 425 nm에서 흡광도의 증가로서 모니터링한다. 최종 기록을 상기 장비의 일부인 소프트웨어를 이용하여 단일 지수로 대입한다. 각각의 실험은 최대 6회 수행하고, 생성된 해리 속도를 평균한다. 측정된 해리 속도는 디티오나이트 농도에 비의존적이고, 10 mM 디티오나이트의 존재 하 및 부재 하 둘 다의 경우에 환원된 종에 대한 트랩으로서 포화 CO에 비의존적이다.
동적 K D
동적 KD는 상기 기재된 koff 및 kon의 측정치를 이용하여 koff 대 kon의 비를 계산함으로써 결정된다.
계산된 K D
계산된 KD를 측정하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 얻어진 koff 및 동적 KD에 대한 값을 그래프화한다. koff와 동적 KD 사이의 선형 관계는 식 (y=mx+b)에 의해 정의된다. 이어서, 엑셀(Excel): MAC 2004 (마이크로소프트((Microsoft), 워싱턴주 레드몬드)를 이용하여 koff 값을 라인을 따라 보간하여 계산된 KD를 도출한다. 측정된 kon없이, 상기 보간법은 koff와 KD를 관련시키는 방식을 제공한다.
자가산화 속도
자가산화 속도를 측정하기 위해, 단백질 샘플을 무산소적으로 환원시킨 다음, 유산소성 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 완충제 중 5 μM 헴으로 희석한다. 이어서, 이들 샘플을 37℃로 설정되고 주기적으로 스캐닝하는 네슬랩 RTE-100 항온 조를 구비한 Cary 3E 분광광도계 (Cary 3E, 배리언, 인크., 캘리포니아주 팔로 알토)에서 인큐베이션한다. 시간에 대해 플롯팅되고 엑셀: MAC 2004 (마이크로소프트, 워싱턴주 레드몬드)를 이용하여 단일 지수로 대입된 FeIII - FeII 차이 스펙트럼에서의 최대치와 최소치 차이로부터 자가산화 속도를 결정한다.
NO와의 반응 속도
NO 반응성은 완충제 A 중 2 μM로 제조된 정제된 단백질 (H-NOX, 중합체성 H-NOX, 호모 사피엔스 헤모글로빈 (Hs Hb) 등) 및 완충제 A 중 200 μM로 제조된 NO를 이용하여 측정한다 (완충제 A: 50 mM Hepes, pH 7.5, 50 mM NaCl). 20℃로 설정된 네슬랩 RTE-100 항온 조를 구비한 하이테크 사이언티픽 SF-61 유동-정지 분광광도계 (TGK 사이언티픽 리미티드, 영국 브래드포드 온 에이번) 상에서 데이터를 획득한다. 상기 단백질을 0.00125 초의 적분 시간에서 NO와 1:1 비로 신속히 혼합한다. 최대 변화 파장을 분광계의 일부인 소프트웨어를 이용하여 단일 지수로 대입하여, 필수적으로 NO에 의한 산화의 속도 제한 단계를 측정한다. 상기 반응의 최종 생성물은 HNOX 단백질에 대한 제2철-NO 및 Hs Hb에 대한 제2철-아쿠오이다.
p50 측정
목적되는 경우에, 돌연변이체 또는 야생형 H-NOX 단백질에 대한 p50 값을 Guarnone, R. et al. (September/October 1995). Haematologica 80(5):426-430 (특히 p50 값의 측정에 관해 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다. p50 값은 HemOx 분석기를 이용하여 결정한다. 측정 챔버는 0% 산소에서 시작하여 100% 산소를 향해 천천히 점증적으로 증가한다. 상기 챔버 내의 산소 프로브가 산소 포화도 %를 측정한다. 제2 프로브 (UV-Vis 광)는 헴단백질 (예를 들어, 헴과 복합체화된 H-NOX와 같은 단백질)의 UV-Vis 스펙트럼의 알파 및 베타 피크로 튜닝된 두 가지 흡수 파장을 측정한다. 이들 흡수 피크는 헴단백질이 산소와 결합함에 따라 선형적으로 증가한다. 이어서, 비결합에서 100% 결합으로의 퍼센트 변화를 % 산소 값에 대해 플롯팅하여 곡선을 생성한다. p50은 헴단백질의 50%가 산소와 결합하였을 때 곡선상에서의 점이다.
구체적으로, Hemox-분석기 (TCS 사이언티픽 코포레이션(TCS Scientific Corporation), 펜실베니아주 뉴 호프)는 50 μL의 혈액 또는 헴단백질을 증가하는 분압의 산소에 노출시키고 이를 질소 기체에 의해 탈산소화시킴으로써 옥시헴단백질 해리 곡선 (ODC)을 결정한다. 클라크(Clark) 산소 전극은 산소 분압에서의 변화를 검출하고, 이를 x-y 기록계의 x-축에 기록한다. 생성된 옥시헴단백질 분획의 증가를 560 nm 및 576 nm에서 이중-파장 분광광도계에 의해 동시에 모니터링하고, y-축에 표시한다. 혈액 샘플을 내횡선 정맥으로부터 채취하고, 헤파린으로 항응고화시키고, 검정할 때까지 4℃에서 젖은 얼음 상에 둔다. 용액의 pH를 7.4±0.01 값으로 유지시키는 제조자가 제공한 완충제인 5 μL의 Hemox-용액에 50 μL의 전혈을 희석한다. 상기 샘플-완충제를 Hemox-분석기의 일부인 큐벳에 넣고, 혼합물의 온도를 평형화시켜 37℃가 되게 한 다음, 샘플을 공기에 의해 100%로 산소화시킨다. pO2 값을 조정한 후, 샘플을 질소에 의해 탈산소화시키고, 탈산소화 과정 동안에 그래프 용지 상에 곡선을 기록한다. P50 값을 Hemox-분석기의 일부인 소프트웨어를 이용하여 O2 포화도가 50%일 때의 점으로서 x-축에 외삽한다. 완전한 기록에 필요한 시간은 대략 30분이다.
H- NOX 핵산
본 발명은 또한 본원에서 논의된 바와 같이 임의의 돌연변이체 H-NOX 단백질, 중합체성 H-NOX, 또는 재조합 단량체 H-NOX 단백질 아단위를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 핵산은 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 코딩하는 임의의 핵산의 절편 또는 전체 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 H-NOX 핵산으로부터의 적어도 약 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하고, 그가 유래된 H-NOX 핵산에 비해 1개 이상의 돌연변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 돌연변이)를 함유한다. 다양한 실시양태에서, 돌연변이체 H-NOX 핵산은 그가 유래된 H-NOX 핵산에 비해 약 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 돌연변이를 함유한다. 본 발명은 또한 돌연변이체 H-NOX 단백질을 코딩하는 임의의 핵산의 중축성 변이체를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 2개 이상의 H-NOX 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 핵산은 중합체성 H-NOX 단백질이 상기 핵산으로부터 발현되도록 연결된다. 추가의 실시양태에서, 핵산은 1개 이상의 중합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 H-NOX 도메인 및 1개 이상의 중합 도메인을 포함하는 핵산은 중합체성 H-NOX 단백질이 상기 핵산으로부터 발현되도록 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 중합 도메인을 코딩하는 임의의 핵산의 절편 또는 전체 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인을 코딩하는 핵산 및 중합 도메인을 코딩하는 핵산은, 생성된 폴리펩티드가 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 융합 단백질이도록 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 1종 이상의 His6 태그를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 H-NOX 도메인, 중합 도메인 및/또는 His6 태그를 코딩하는 핵산들 사이에 위치한 링커 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터(T. thermoanaerobacter) H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 야생형 티. 써모아나에로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터 L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터 W9F/L144F H-NOX 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: W9F/L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: W9F/L144F 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로: 야생형 티. 텡콘겐시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열, 및 His6 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:7에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 돌연변이체 H-NOX 단백질을 코딩하는 적어도 1종의 핵산을 함유하는 세포 또는 세포 집단을 포함한다. 예시적인 세포는 곤충, 식물, 효모, 박테리아 및 포유류 세포를 포함한다. 이들 세포는 본원에 기재된 것과 같은 표준 방법을 이용하여 돌연변이체 H-NOX 단백질을 생성하는데 유용하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 야생형 티. 써모아나에로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터 L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모아나에로박터 W9F/L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:7에 기재된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
H- NOX 단백질의 제제
본 발명은 예를 들어 종양 저산소와 연관된 면역 억제 활성을 억제함으로써 종양 면역원성을 증진시키는데 사용하기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 제제를 제공한다. O2 담체 폴리펩티드의 비제한적인 예시적인 패밀리는 O2 담체 폴리펩티드의 H-NOX 패밀리이다. 본원에 기재된 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질은 제약 또는 비-제약 조성물의 제제를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는, 단량체성 H-NOX 단백질이 시험관내에서 또는 생체내에서 회합하여 중합체성 H-NOX 단백질을 생성하도록, H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 단량체성 H-NOX 단백질을 포함한다. 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 이들 제제는 다양한 치료 및 산업 적용에 유용하다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 중합체성 H-NOX 단백질을 포함한 본원에 기재된 1종 이상의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 임의의 표준 제약 담체 또는 부형제, 예컨대 포스페이트 완충된 염수 용액, 물, 유화제, 예컨대 유/수 유화제, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 예시적인 희석제는 포스페이트 완충된 염수 또는 생리식염수 (0.9%)이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 전형적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 특히 제제에 관해서는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington , The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]을 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 제제는 멸균성이다. 일부 실시양태에서, 제제는 본질적으로 내독소를 함유하지 않는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 본 발명의 제약 조성물에 사용할 수 있지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 임의의 적절한 투여 방식을 위해, 예컨대 정맥내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여를 위해 제제화될 수 있다. 비경구 투여, 예컨대 피하 주사의 경우, 담체는 예를 들어 물, 염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 임의의 담체 또는 고체 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 활석, 셀롤로스, 글루코스, 수크로스 또는 탄산마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 미소구체 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트) 또한 담체로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 또는 비-제약 조성물은 완충제 (예를 들어, 중성 완충된 염수, 포스페이트 완충된 염수 등), 탄수화물 (예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란 등), 항산화제, 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA, 글루타티온 등), 보존제, 산소의 결합 및/또는 수송에 유용한 또 다른 화합물, 비활성 성분 (예를 들어, 안정화제, 충전제 등), 또는 상기 2종 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 동결건조물로 제제화된다. H-NOX 단백질은 또한 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 또는 나노입자 내에 캡슐화될 수 있다. H-NOX 단백질을 위해 사용될 수 있는 다른 예시적인 제제는 예를 들어 미국 특허 번호 6,974,795 및 6,432,918 (특히 단백질의 제제에 관해 참조하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에 기재된 조성물은 서방형 제제 (예를 들어, 투여후 화합물의 느린 방출을 제공하는 제제, 예컨대 캡슐 또는 스폰지)의 일부로서 투여될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 널리 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있고, 예를 들어 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 목적하는 표적 부위에서의 이식에 의해 투여될 수 있다. 서방형 제제는 담체 매트릭스에 분산되고/거나 속도 조절 막으로 둘러싸인 저장소 내에 함유된 H-NOX 단백질을 함유할 수 있다. 이러한 제제 내에서 사용되는 담체는 생체적합성이고, 또한 생분해성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 비교적 일정한 수준의 H-NOX 단백질 방출을 제공한다. 서방형 제제 내에 함유된 H-NOX 단백질의 양은 이식 부위, 방출 속도, 예상 방출 시간, 및 치료 또는 예방될 상태의 성질에 따라 좌우된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 유효량의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 2개 이상의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체성 H-NOX 단백질의 유효량을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에서 논의된 바와 같은 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 단량체성 H-NOX 단백질의 유효량을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제제는 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 3종의 단량체를 포함하는 PEG화 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 종양 면역을 조정하는데 (예를 들어, 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는데) 유효한 양의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간에게 투여하기 위한 H-NOX 단백질의 유효량은 수 그램 내지 약 350 그램이다. H-NOX 단백질의 다른 예시적인 용량은 적절한 주입 속도, 예컨대 약 0.5 ml/분에서 약 4.4, 5, 10 또는 13 G/DL (여기서, G/DL은 순환계에 주입하기 전에 H-NOX 단백질 용액의 농도임)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Winslow, R. Chapter 12 In Blood Substitutes] 참조). 필요한 유효량이 다수회 투여를 합한 효과에 의해 도달할 수 있기 때문에, 각각의 투여 형태의 개별 용량에 함유된 활성 성분의 단위 함량이 그 자체로 유효량을 구성할 필요가 없음을 이해할 것이다. 제약 조성물에 포함되는 H-NOX 단백질의 양에 대한 선택은 사용되는 투여 형태, 치료되는 상태, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 결정에 따라 달성되는 특정한 목적에 따라 좌우된다.
예시적인 조성물은 종합적으로 상응하는 야생형 H-NOX 단백질에 비해 변경된 O2 또는 NO 리간드-결합을 부여하는 1개 이상의 돌연변이를 포함하는, 단리되거나 정제될 수 있고 생리학적으로 상용성인 포유류 혈액 기체 담체로서 작동할 수 있는, 유전자 조작된 재조합 H-NOX 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이체 H-NOX 단백질. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 중합체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 본원에서 논의된 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 단량체성 H-NOX 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 W9F/L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 3종의 단량체를 포함하는 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 3종의 단량체를 포함하는 PEG화 삼량체성 H-NOX 단백질을 포함하고, 각각의 단량체는 티. 텡콘겐시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
제약 조성물이 투여되는 인간 대상체에서 면역 반응을 감소 또는 예방하기 위해, 인간 H-NOX 단백질 또는 도메인 (1개 이상의 돌연변이가 도입된 야생형 인간 단백질 또는 인간 단백질) 또는 다른 비-항원성 H-NOX 단백질 또는 도메인 (예를 들어, 포유류 H-NOX 단백질)을 사용할 수 있다. 인간 이와의 다른 공급원으로부터 유래된 H-NOX 단백질의 면역원성을 감소 또는 제거하기 위해, H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인에 있는 아미노산을 인간 H-NOX에 있는 상응하는 아미노산으로 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 비-인간 H-NOX 단백질의 삼차 구조의 표면 상에 있는 1개 이상의 아미노산을 인간 H-NOX 단백질에 있는 상응하는 아미노산으로 돌연변이시킬 수 있다.
종양 면역을 조정하는 방법
일부 측면에서, 본 발명은 종양 면역을 조정하는 방법을 제공하며, 따라서 항암 치료에 사용될 수 있다. 저산소 종양 미세환경은 저산소 유도 인자 (HIF-1) 신호전달 (Codo et al., 2014 Oncotarget, 5(17), 7651-7662; Lee, Mace, & Repasky, 2010 Int J Hyperthermia, 26(3), 232-246; Wei et al., 2011 PLoS One, 6(1), e16195), 항종양 T 세포의 miRNA 후성적 조절, 종양 세포 상에서 MHC1 발현, 및 종양 연관 대식세포 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 동원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중 신호전달 경로 (도 1)를 조정함으로써 숙주의 면역 항종양 방어를 억제한다. HIF-1 경로의 저산소 활성화는 아데노신성 A2 및 PD-L1 경로를 활성화시키고, 이는 다시 헬퍼 및 킬러 T-세포 및 NK 세포의 동원 및 활성화를 억제함이 확인되었다 (Noman et al., 2014 J Exp Med , 211(5), 781-790; Ohta et al., 2006 Proc Natl Acad Sci U S A, 103(35), 13132-13137). HIF-1 경로의 저산소 활성화는 또한 억제성 조절 T 세포 (Treg), 종양 연관 대식세포 (TAM) 및 다른 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 동원 및 활성화를 초래할 수 있다 (Chaturvedi et al., 2014 Proc Natl Acad Sci U S A, 111(20), E2120-2129; Corzo et al., 2010 J Exp Med , 207(11), 2439-2453; Wei et al., 2011). HIF-1 경로 활성화는 또한 MHC1 수용체의 종양 차단을 증가시킴으로써 면역계가 종양 세포를 인식하는 능력을 직접적으로 억제할 수 있다 (Siemens et al., 2008 Cancer Res, 68(12), 4746-4753).
일부 측면에서, 본 발명은 종양을 가진 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역의 조정은 종양에 대한 면역 반응의 증진을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 백혈구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 항원 프로세싱을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 지상 세포 (DC)의 제시 역량을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 것, 항원 프로세싱을 증가시키는 것, 또는 DC의 제시 역량을 증가시키는 것 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 림프구 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 면역을 조정하는 것은 시토카인 분비를 포함한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반한다. 일부 실시양태에서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가는 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 HIF-1α의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 HIF-1α의 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, HIF-1α 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 HIF-1α 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, HIF-1α 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 때의 HIF-1α 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 HIF-1α의 발현을 감소시키는 방법아며, 여기서 HIF-1α 발현의 감소는 혈관 상피 세포 성장 인자 (VEGF) 발현의 감소로서 측정되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 VEGF 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, VEGF 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 VEGF 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, VEGF 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 때의 VEGF 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 HIF-1α의 발현을 감소시키는 방법이며, 여기서 HIF-1α 발현의 감소는 글루코스 수송자 유형 1 (Glut1) 발현의 감소로서 측정되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 Glut1 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, Glut1 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 Glut1 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, Glut1 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 때의 Glut1 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 PD-L1의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 PD-L1 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 PD-L1 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 PD-L1과 PD-1의 상호작용이 감소된다. 일부 실시양태에서, PD-L1과 PD1의 상호작용은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 PD-L1과 PD1의 상호작용에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 때의 PD-L1 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2AR의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 A2AR 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, A2AR 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 A2AR 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 A2AR과 아데노신의 상호작용이 감소된다. 일부 실시양태에서, A2AR과 아데노신의 상호작용은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 A2AR과 아데노신의 상호작용에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, A2AR 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 대의 A2AR 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 HIF-2α의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 HIF-2α 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, HIF-2α 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 HIF-2α 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 투여하면 HIF-2α 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, HIF-2α 발현은 O2 담체 폴리펩티드로 처리하지 않았을 때의 HIF-2α 발현에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, HIF-2α 발현은 O2 담체 단백질로 처리하지 않았을 때의 HIF-2α 발현에 비해 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 초과 동안 감소된다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법 (예를 들어, 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법)을 제공한다. 종양의 예는 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법 (예를 들어, 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법)을 제공함으로써, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 포유동물, 예를 들어 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 애완동물, 실험실 연구 동물 또는 농장 동물이다. 애완동물, 연구 동물 또는 농장 동물의 비제한적인 예는 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 돼지 및 소를 포함한다.
O2 담체 폴리펩티드는 정맥내, 동맥내, 종양내, 방광내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 종양으로 산소의 지속적인 전달이 저산소-매개된 종양 면역을 억제하고 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는데 바람직하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)의 투여를 반복한다. O2 담체 폴리펩티드의 투여는 종양에 대한 강력한 면역 반응이 수립될 때까지 반복할 수 있다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여는 적어도 약 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 20회, 30회, 40회, 50회 또는 100회 중 어느 하나의 횟수로 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여는 약 2회 내지 약 20회 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여는 약 20회 내지 약 40회 중 어느 하나, 약 40회 내지 약 60회 중 어느 하나, 약 60회 내지 약 80회 중 어느 하나, 약 80회 및 약 100회 중 어느 하나, 또는 이들 사이의 임의의 횟수로 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드의 투여는 약 42 내지 약 84 투여 동안 매일 또는 1일 2회 반복한다.
예시적인 투여 빈도는 적어도 1주 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 7회 (즉, 매일)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 적어도 1일 2회, 3회, 4회 또는 6회 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다, 24시간마다, 48시간마다 또는 1주 2회 또는 1주 3회 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 4시간, 4시간 내지 8시간, 8시간 내지 12시간, 또는 12시간 내지 24시간 중 어느 하나의 시간으로 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 약 1일 내지 약 10일의 기간 동안 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다 또는 24시간마다 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 예를 들어 수일 또는 수주의 기간에 걸쳐 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 보다 긴 기간, 예컨대 수개월 또는 수년 동안 투여한다. 조성물의 투여 빈도는 투여 의사의 판단을 기준으로 치료 경과에 따라 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 볼루스로서 투여한다. 일부 실시양태에서, 볼루스의 부피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL, 75 mL 또는 100 mL 초과이다. 일부 실시양태에서, 볼루스 용량의 투여를 상기와 같이 반복한다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 주입에 의해 투여한다. 일부 실시양태에서, 약 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간 또는 24시간 초과 동안 주입한다. 일부 실시양태에서, 약 15분 내지 30분, 30분 내지 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 7시간, 7시간 내지 8시간, 8시간 내지 9시간, 9시간 내지 10시간, 10시간 내지 12시간, 12시간 내지 16시간, 16시간 내지 20시간, 또는 20시간 내지 24시간 동안 주입한다. 일부 실시양태에서, 주입 속도는 약 1 mL/hr, 2 mL/hr, 3 mL/hr, 4 mL/hr, 5 mL/hr, 6 mL/hr, 7 mL/hr, 8 mL/hr, 9 mL/hr, 10 mL/hr, 20 mL/hr, 30 mL/hr, 40 mL/hr, 50 mL/hr, 60 mL/hr, 70 mL/hr, 80 mL/hr, 90 mL/hr, 100 mL/hr, 200 mL/hr, 300 mL/hr, 400 mL/hr, 500 mL/hr, 600 mL/hr, 700 mL/hr, 800 mL/hr, 900 mL/hr, 1000 mL/hr, 2000 mL/hr, 3000 mL/hr, 4000 mL/hr, 5000 mL/hr, 6000 mL/hr, 7000 mL/hr, 8000 mL/hr, 9000 mL/hr, 10,000 mL/hr 초과이거나 또는 이들 사이의 임의의 속도이다. 일부 실시양태에서, 주입을 상기와 같이 반복한다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 약 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg 초과의 용량 또는 이들 사이의 임의의 용량으로 투여한다. 일부 실시양태에서, 용량은 1회 이상의 볼루스 투여로 제공된다. 일부 실시양태에서, 용량은 1회 이상의 주입으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 용량은 1회 초과의 투여로 제공된다 (예를 들어, 100 mg/kg의 용량을 50 mg/kg의 2회 용량으로 제공할 수 있음).
본 발명의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 방사선 요법과 조합하여 사용한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 방사선을 투여하기 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 전에 투여한다. 일부 실시양태에서, 방사선은 X 방사선이다. 일부 실시양태에서, X 방사선의 용량은 약 0.5 Gy 내지 약 75 Gy이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및 방사선 투여의 주기를 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 중 어느 하나의 횟수로 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및 방사선 투여의 주기를 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 중 어느 하나 이후에 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 및 방사선 요법의 투여를 또 다른 요법, 예를 들어 화학요법 및/또는 면역요법과 병용하여 이용한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 화학요법과 조합하여 사용한다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 세포독소이다. 세포독소를 포함한 화학요법제는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포독소는 알킬화제이다. 일부 실시양태에서, 세포독소는 시클로포스파미드 또는 테모졸로미드이다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 화학요법의 투여 전에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 화학요법의 투여와 함께 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드는 화학요법의 투여 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 화학요법을 투여하기 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 전에 투여하거나 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 매일 또는 1일 2회 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 화학요법을 투여한지 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 또는 24시간 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및/또는 화학요법 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 10회 초과 중 어느 하나의 횟수로 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및/또는 화학요법 투여는 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 이후 중 어느 하나 이후에 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 및 화학요법의 투여는 동일한 투여 주기를 갖는다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 및 화학요법의 투여는 상이한 투여 주기를 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 및 방사선 요법의 투여를 또 다른 요법, 예를 들어 방사선 요법 및/또는 면역요법과 병용하여 이용한다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)를 면역요법 이전에 및/또는 병용하여 암 환자에게 투여한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 면역 체크포인트 조절제를 표적화하는 작용제, 종양용해 바이러스 또는 BiTE 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 면역요법 표적은 CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 면역 체크포인트 조절제 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 이중 PD1/CTLA-4 차단 요법이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 PDL1+ 종양을 가진 환자에 대한 PDL-1 처리, 또는 이중 PD1/PD-L1 차단이다. 비제한적인 예는 PD-1 및 PDL-1 길항제, 예컨대 항체 (예를 들어, 니볼루맙)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 CTLA4 길항제, 예컨대 항체 (예를 들어, 이필루무맙)이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 입양 T 세포 요법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 키메라 항원 수용체 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포) 또는 조작된 TCR-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 항-림프구 활성화 유전자3 (LAG-3) 요법, 항-T 세포 이뮤노글로빈 뮤신-3 (TIM-3) 요법, 항-킬러 이뮤노글로빈-유사 수용체 (KIR) 요법, 항-4-1BB (CD137) 효능작용/자극 요법, 또는 글루코코르티코이드-유도된 TNFR 패밀리 관련 유전자 (GITR) 효능작용/자극 요법 중 1종 이상을 포함한다 (각각 단독으로 또는 서로 조합하여 및/또는 PD1, PDL-1, CTLA-4 또는 다른 요법 중 1종 이상과 조합하여).
PD-1/PDL-1 및 CTLA4 음성 조절제 이외의 체크포인트 단백질을 표적화하는 요법의 비제한적인 예는 면역 반응의 양성 및 음성 (체크포인트 억제제) 조절제 둘 다를 포함하고, 항체 또는 소분자, 예컨대 IDO (인돌아민-2.3 디옥시게나제) 경로 억제제, 예컨대 직접적인 IDO 효소 활성 억제제 (예를 들어, NLG919), IDO 이펙터 경로 억제제 (예를 들어, D-1-메틸-트립토판, 인독시모드, NLG8189), TDO (트립토판 2,3-디옥시게나제) 억제제, 또는 IDO-TDO 이중 억제제; 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3, CD223) 항체 길항제 (예를 들어, IMP321, BMS-986016); 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR) 길항제, 예컨대 항체 (예를 들어, 릴릴루맙, IPH2101); T 세포 이뮤노글로불린 뮤신-3 (TIM-3) 길항제, 예컨대 항체; B- 및 T 세포 감쇠자 (BTLA, CD272) 길항제, 예컨대 항체; OX40 (CD134) 효능제, 예컨대 활성화/자극 항체; 4-1BB (CD137) 효능제, 예컨대 자극 항체 (예를 들어, BMS-663513); 글루코코르티코이드-유도된 TNFR 패밀리 관련 유전자 (GITR) 효능제, 예컨대 자극 항체 (예를 들어, TRX518); 및 종양용해 바이러스일 수 있다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 면역요법의 투여 전에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 면역요법의 투여와 함께 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 면역요법의 투여 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 면역요법을 투여하기 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 또는 48시간 전에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 면역요법을 투여하기 적어도 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 전에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 면역요법을 투여한지 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 또는 48시간 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에게 면역요법을 투여한지 적어도 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 후에 투여한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및/또는 면역요법 투여를 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 10회 초과 중 어느 하나의 횟수로 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 투여 및/또는 면역요법 투여를 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 중 어느 하나 이후에 반복한다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 및 면역요법의 투여는 동일한 투여 주기를 갖는다. 일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 및 면역요법의 투여는 상이한 투여 주기를 갖는다. 일부 실시양태에서, H-NOX 및 방사선 요법의 투여는 또 다른 요법, 예를 들어 방사선 요법 및/또는 화학요법과 병용하여 이용한다.
일부 실시양태에서, O2 담체 폴리펩티드 (예를 들어, H-NOX 단백질)의 투여 효과, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 종양 저산소, 저산소-연관 종양 억제제 및/또는 활성화제의 발현, 종양-연관 면역 세포 및/또는 종양 세포에 대해 지정된 면역 세포의 존재 및/또는 국소 (종양 생검, 림프절 생검) 또는 전신 (예를 들어, 말초 혈액) 시토카인 및 면역 세포 프로파일을 모니터링한다. 종양 저산소 수준을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예는 18F-플루오로미소니다졸 (FMISO) 종양 흡수, 피미다졸 흡수, 18F-플루오로아조마이신 아라비노시드 (FAZA) 흡수, 니트로이미다졸 흡수, 구리(II)-디아세틸-비스(N4-메틸티오세미카르바존 (Cu-ATSM) 흡수, 19F 자기 공명 영상에 의한 헥사플루오로벤젠 (C6F6) 흡수, 1H MRI에 의한 핵사메틸디실록산 흡수, 종양 HIF-1α 발현, 종양 HIF-2α 발현, 종양 HIF-3α 발현, 종양 Glut-1 발현, 종양 pH (pH-칭량 MRI) qBOLD, OE-MRI, MOBILE MRI 종양 LDHA 발현, 종양 탄산 탈수효소 IX (CA-9) 발현, VEGF 발현, 또는 락테이트 및/또는 피루베이트 수준의 측정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 기재된 요법의 모니터링, 치료 및 최적화 방법의 일부 실시양태에서, 종양 저산소는 18F-FMISO 흡수에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 18F-FMISO 흡수는 양전자 방사 단층촬영 (PET) 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔 또는 컴퓨터 축 단층촬영 (CAT) 스캔에 의해 측정된다. HIF-1α, PD-L1 및 A2AR과 같은 유전자의 발현을 검출하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 면역검정, 면역조직화학, 정량적 PCR, 혼성화 (예를 들어, 유전자 칩 상에서) 등이 있다.
H- NOX 단백질을 가진 키트
개체에서 종양 면역을 조정하기 위한 제조 물품 및 키트 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 제조 물품 또는 키트는 본원에 기재된 임의의 H-NOX 단백질을 포함한 임의의 O2 담체 폴리펩티드, 예컨대 중합체성 H-NOX 단백질 및 PEG화 중합체성 H-NOX 단백질, 및 적합한 포장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) H-NOX 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 본원에서 논의된 그의 제제) 및 (ii) 개체에게 O2를 전달하기 위한 키트의 사용에 대한 지침서를 가진 키트를 포함한다.
본원에 기재된 조성물에 적합한 포장은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 바이알 (예를 들어, 밀봉된 바이알), 용기, 앰풀, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등이 포함된다. 이들 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다. 본원에 기재된 조성물을 포함하는 단위 투여 형태 또한 제공된다. 이들 단위 투여 형태는 단일 또는 다중 단위 용량으로 적합한 포장에 보관될 수 있고, 또한 추가로 멸균 및 밀봉될 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침서는 통상적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서 (예를 들어, 키트에 포함된 인쇄지)이지만, 기계 판독형 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 담긴 지침서) 또한 허용된다. H-NOX 단백질의 사용에 대한 지침서는 일반적으로 의도된 치료 또는 산업 용도에 대한 용법, 투여 스케쥴 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다.
컨테이너는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 예를 들어, 연장된 기간, 예컨대 약 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월 이상 동안 개체에게 효과적인 치료를 제공하기에 충분한 용량의 본원에 기재된 H-NOX 단백질을 함유하는 키트가 또한 제공될 수 있다. 키트는 H-NOX 단백질의 다중 단위 용량, 및 사용에 대한 지침서를 또한 포함할 수 있고, 약국, 예를 들어 병원 약국 및 조제 약국에서의 보관 및 사용에 충분한 양으로 포장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 일반적으로 H-NOX 단백질의 안정한 수성 현탁액을 형성하기 위해 재구성, 재현탁 또는 재수화될 수 있는 건조된 (예를 들어, 동결건조된) 조성물을 포함한다.
H- NOX 단백질의 제조에 대한 예시적인 방법
상기 기재된 바와 같이, 여러 야생형 H-NOX 단백질 및 핵산의 서열은 공지되어 있고, 이를 이용하여 본 발명의 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 핵산을 생성할 수 있다. 재조합 H-NOX 단백질의 돌연변이, 발현 및 정제에 대한 기술은 예를 들어 Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 및 Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211, 미국 특허 번호 8,404,631 및 8,404,632, WO 2007/139791, 및 WO 2007/139767 (특히 재조합 H-NOX 단백질의 돌연변이, 발현 및 정제에 대해 참조하며, 이들의 전문은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 이들 기술 또는 다른 표준 기술을 이용하여 임의의 돌연변이체 H-NOX 단백질을 생성할 수 있다.
돌연변이체 H-NOX 핵산을 표준 기술을 이용하여 벡터, 예컨대 발현 벡터에 도입할 수 있다. 예를 들어, 제한 효소를 이용하여 돌연변이체 H-NOX 핵산 및 벡터를 분할할 수 있다. 이어서, 분할된 돌연변이체 H-NOX 핵산 및 분할된 벡터의 상용성 말단을 라이게이션시킬 수 있다. 생성된 벡터를 코딩된 H-NOX 단백질의 발현을 위해 표준 기술 (예를 들어, 전기천공)을 이용하여 세포 (예를 들어, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포)에 삽입할 수 있다.
특히, 이종성 단백질은 수많은 생물학적 발현계, 예컨대 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포에서 발현되었다. 따라서, 임의의 적합한 생물학적 단백질 발현계를 이용하여 다량의 재조합 H-NOX 단백질을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, H-NOX 단백질 (예를 들어, 돌연변이체 또는 야생형 H-NOX 단백질)은 단리된 단백질이다.
목적되는 경우에, H-NOX 단백질을 표준 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질의 적어도 약 60 중량%는 단백질이 생산될 때 존재하는 다른 성분들을 함유하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 단백질은 적어도 약 75 중량%, 90 중량% 또는 99 중량%의 순도를 갖는다. 정제된 단백질은 천연 공급원, 재조합 발현계, 또는 화학적 합성을 위한 반응 혼합물로부터 예를 들어 정제 (예를 들어, 추출)에 의해 수득될 수 있다. 예시적인 정제 방법은 면역침전, 칼럼 크로마토그래피, 예컨대 면역친화성 크로마토그래피, 자성 비드 면역친화성 정제, 및 플레이트-결합된 항체에 의한 패닝, 뿐만 아니라 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술을 포함한다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제된 단백질을 본 발명의 제약 조성물에 도입하거나 본 발명의 방법에서 사용한다. 본 발명의 제약 조성물은 첨가제, 담체, 또는 정제된 단백질 이외의 다른 성분들을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체성 H-NOX 단백질은 1종 이상의 His6 태그를 포함한다. 적어도 1종의 His6 태그를 포함하는 H-NOX 단백질은 크로마토그래피, 예를 들어 Ni2 +-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 정제한 후, His6 태그를 예를 들어 엑소펩티다제를 이용하여 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 중합체성 H-NOX 단백질을 제공하며, 여기서 중합체성 H-NOX 단백질은 His6 태그의 사용을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, 정제된 H-NOX 단백질을 엑소펩티다제로 처리하여 His6 태그를 제거한다.
일부 실시양태에서, H-NOX 단백질은 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함한다 (즉, PEG화). PEG화 단백질을 제공하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
실시예
실시예는 전적으로 본 발명을 예시하기 위한 의도이고, 따라서 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 고려되지 않으며, 상기에서 논의된 본 발명의 구체적인 측면 및 실시양태를 또한 설명한다. 실시예는 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험인 것으로 의도되지 않는다. 달리 명시하지 않는다면, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1. H- NOX는 저산소 종양 미세환경의 유효한 산소화를 가능하게 한다.
원위 포켓에 L144F 치환을 보유한 PEG화 삼량체성 써모아나에로박터 텡콘겐시스 (Tt.) H-NOX (도 6B)를 종양 미세환경을 산소화시키고 방사선 감수성을 증가시키는 능력에 대해 평가하였다. PEG화 삼량체성 Tt H-NOX L144F를 저산소 종양을 보유한 마우스에게 투여하여, 외부 저산소 마커, 피모니다졸, 저산소 유도성 전사 인자 1 알파, HIF-1-α, 및 옥시라이트 산소-감지 나노섬유에 의해 직접적으로 측정하면서 종양의 신속하고 지속적인 산소화를 유도하였다 (각각 도 2 및 3).
종양 부피가 ~300-350 ㎣에 도달하였을 때 (종양 세포 피하 이식후 ~10-14일), H460 피하 이종이식 종양을 보유한 마우스에게 PEG화 삼량체 H-NOX (L144F)를 650 mg/kg으로 정맥내 주사하였다. 안락사시키기 전에, 마우스에게 외인성 저산소 마커 피모니다졸을 60 mg/kg으로 주사하고, 종양을 수확하였다. 피모니다졸 (도 2A) (하이폭시프로브-1) 및 HIF-1α (도 2B) 수준을 각각 경쟁적 (피모니다졸) 및 샌드위치 (HIF-1α, 압캠(Abcam)) ELISA에 의해 측정하였다. 그래프는 PEG화 H-NOX (L144F) 투여후 피모니다졸 및 HIF-1α 신호의 정량화를 나타낸다. 비히클, 1h 및 4h: n=22, 7h: n=18, 12h: n=16, 24h: n=6. 4회의 독립적인 실험으로부터의 결과. 평균 값 +/- SEM. 일원 ANOVA 및 본페로니 사후 검정에 의해 **** p<0.0001, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05. 주사후 1, 4, 7, 16 및 24시간에 샌드위치 H-NOX ELISA에 의해 PEG화 H-NOX (L144F)의 축적에 대해 종양을 평가하였고, 결과를 종양 조직 그램에 대해 나타내었다 (도 2C). 7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스에게 3 × 106개의 H460 인간 폐암 세포를 피하 이식하고, 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 (종양 세포 이식후 10-14일) 모니터링하였다. 200-350 ㎣ 이종이식 종양을 보유한 마우스에게 볼루스 비히클 (제제 완충제: 50 mM 숙시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 10 mM 환원된 글루타티온, pH 7) 또는 650 mg/kg의 PEG화 삼량체 H-NOX (L144F)를 함유하는 제제 완충제를 정맥내 주사하였다. 종양 저산소를 측정하기 위해, 안락사시키기 전에, 마우스에게 외인성 저산소 마커 피모니다졸을 60 mg/kg으로 주사하였다. 종양을 수확하고, 항-프로테아제로 보충된 추출 완충제 (압캠 키트 # ab117996) 중에서 균질화하였다. 단백질 농도는 각각의 종양에서 브래드포드(Bradford) 검정을 이용하여 정량화하였다. 샘플을 옴니옥스(Omniox)에 의해 개발된 경쟁적 ELISA 검정에 의해 피모니다졸 (하이폭시프로브-1) 양에 대해 검정하고, 압캠 ELISA 키트 (ab117996)를 이용하여 HIF-1α에 대해 검정하였다.
H460 폐 암종 마우스 모델에서 4시간 내지 8시간 사이에 최대 산소화가 달성되었고, 이는 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 H-NOX (L144F) 종양 축적의 피크와 상호관련이 있다 (도 2C).
H-NOX (L144F) 종양 축적의 평가를 위해, 종양을 주사후 상이한 시점에서 수확하였다. 종양을 항-프로테아제로 보충된 추출 완충제 (압캠 키트 # ab117996) 중에서 균질화하고, 단백질 농도를 각각의 종양에서 브래드포드 검정을 이용하여 정량화하였다. PEG화 H-NOX (L144F) 농도를 H-NOX에 대해 옴니옥스에 의해 개발된 샌드위치 ELISA에 의해 정량화하고, 종양 중량에 대해 정규화하였다.
5-10 mmHg 산소 농도에서 동물의 보충적 산소화는 마우스 종양 조직의 산소화를 성공적으로 증가시킨 반면에, 낮은 산소 수준 (<5 mmHg)을 갖는 영역에 대해서는 효과가 없었다. 대조적으로, PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F는 심지어 매우 저산소인 종양 조직 (<5 mmHg)에서도 산소화를 증가시킬 수 있었다. 이는 산소 구배 확산 한계 넘어에 있는 영역으로 산소 전달을 가능하게 하는 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F의 우수한 조직 침투 때문일 것이다. 더욱이, 마우스 종양의 최대 보충적 산소화는 95%-100%의 호흡 산소 [정상 조직에 대해 산소과다성 염증성 손상의 위험이 증가됨 (Kallet & Matthay, 2013 Respir Care, 58(1):123-141; Thiel et al., 2005 PLoS Biol, 3(6), e174)]에 계속해서 노출시킨 동물에서 달성된 반면에, PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F의 단일 볼루스 정맥내 투여는 정상 조직에서는 산소 수준을 증가시키지 않으면서 7시간 넘게 조직 산소화를 유지할 수 있었다. 대조군 Tt H-NOX 단백질 (야생형 변이체, 저산소 조직에 존재하는 산소 농도에서 산소를 방출시킬 수 없음)은 종양 산소화에 대해 어떠한 효과도 없었다 (도 3C).
7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스에게 3 × 106개의 H460 인간 폐암 세포를 피하 이식하고, 종양이 ~500 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 (종양 세포 이식후 10-18일) 모니터링하였다. H460 종양을 보유한 마우스를 20%의 산소에 혼합된 이소플루란으로 마취시키고, 현미조작장치를 이용하여 옥시라이트(OxyLite™) 프로브 (옥스포드 옵트로닉스(Oxford Optronix), 영국)를 H460 피하 이종이식 종양에 이식하였다. 옥시라이트™는 팁에서 230 μm 직경의 중합체 매트릭스에 포함된 염화루테늄 염료로 구성된다. ~20-30분 동안 평형화시킨 후, 4채널 유닛에 부착된 광학 형광 감지기를 이용하여 pO2를 측정하였다. 낮을 출발 pO2는 이웃 혈관으로부터 저산소 조직으로의 진입을 확고히 하였다 (~0.2 mmHg; 예외적으로 도 3D에서는 5 mmHg). 프로브 이식후, pO2 측정이 안정화되도록 프로브를 ~20-30분 동안 두고, 마우스를 100% O2에서 호흡시키거나 (도 3B, 도 3D) 또는 PEG화 H-NOX를 주사하고 (도 3A에서는 L144F, 도 3C에서는 wt), 형광 켄칭을 기록하였다.
산소과다 기체의 투여에 비해 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F가 저산소 종양 영역으로 산소를 전달하는 우수한 능력은 더욱 효율적인 방사선 종양 세포 사멸에 의해 추가로 입증되었다 (도 4).
H460 피하 이종이식 종양 (200-350 ㎣)을 보유한 마우스를 10 Gy 단독으로, 또는 방사선 조사 7시간 전에 정맥내 주사된 650 mg/kg의 PEG화 삼량체 H-NOX (L144F)와 조합하여 처리하였다. 방사선 조사후 종양을 추출하고, 클론원성 검정을 위해 가공하였다. 10-14일 후에 각각의 종양으로부터의 3벌식 샘플에서 세포 수를 카운트하였다. 그래프 상의 각 점은 한 종양에 대한 평균 생존 분율을 나타낸다. 평균 값 +/- SEM (실험당 n=3). 7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스에게 3 × 106개의 H460 인간 폐암 세포를 피하 이식하고, 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달할 때가지 (종양 세포 이식후 10-14일) 모니터링하였다. 200-350 ㎣ 이종이식 종양을 보유한 마우스에게 10 Gy 단독으로, 또는 볼루스 비히클 (제제 완충제: 50 mM 숙시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 10 mM 환원된 글루타티온, pH 7) 또는 650 mg/kg의 PEG화 H-NOX (L144F)를 함유하는 제제 완충제의 정맥내 전달과 조합하여 방사선 조사하였다. 방사선 조사후 마우스를 희생시키고, 종양을 수확하고, 생체외 클론원성 검정을 위해 가공하였다. 간략히, 메스를 이용하여 종양 세포를 미세 조각으로 잘게 썰고, 콜라게나제 (200 U/ml), 히알루로니다제 (200 U/ml) 및 DNAse (10 ml 칵테일/g 종양)의 혼합물을 함유하는 효소 칵테일에 의해 ~30분 동안 소화시켰다. 이어서, 추출된 세포를 카운트하고, 비처리 샘플의 경우에 웰당 500/125/25개 세포로 및 방사선 조사된 종양 샘플의 경우에 웰당 2000/500/100개 세포로 6웰 플레이트에 2벌식으로 시딩하였다. 10-12일 후에, 세포 콜로니를 PFA로 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 클론의 수 (50개가 넘는 세포)를 카운트하고, 플레이팅 효율을 비처리된 샘플에서 계산하였다 (웰에서 카운트된 세포의 수 ÷ 플레이팅된 세포의 수 × 100). 생존 분율은 모든 샘플에서 계산하였다 (카운트된 세포의 수 ÷ 플레이팅 효율 × 100).
PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F 투여후, 종양 세포의 생존 분율이 10 Gy 처리 단독 군에서는 30%부터 H-NOX (L144F)-전처리된 종양에서는 <2%까지 감소되어, 모든 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F-처리된 종양에서 방사선 처리 효능이 >15배 증가하였다. 동일한 실험에서, 종양을 보유한 마우스를 100% 산소로 처리하였을 때, 아마도 종양간에 균등하지 않은 혈관 밀도로 인한 개별 종양들간의 불균일한 종양 산소화 때문에 방사선 증진의 가변적인 증가 (~3배)가 나타났다.
실시예 2. H- NOX는 숙주 항종양 반응을 증진시키는 면역활성화제로서 작용한다.
PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F-유도된 산소화는 HIF-1α 경로 (도 2B)를 억제하고, HIF-1α-의존성 및 HIF-1α-비의존적인 종양 면역억제를 완화시킨다. H460 피하 이종이식 종양 (200-350 ㎣)을 보유한 마우스를 비히클 단독으로 또는 PEG화 삼량체 H-NOX (L144F)로 처리하고, qRT-PCR 분석을 위해 주사후 7, 16 또는 24시간에 수확하였다. 평균 값 +/- SEM. 군당 N=5-6, t-시험에 의해 * p<0.05. 단일 용량의 H-NOX의 처리는 HIF-1α 및 그의 이펙터, 예컨대 숙주의 면역 반응의 직접적인 및 간접적인 조절제: PD/PDL-1 및 VEGF 신호전달, 대사 및 성장 인자 조정제의 유의한 하향조절을 나타내었다 (도 5).
7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스에게 3 × 106개의 H460 인간 폐암 세포를 피하 이식하고, 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 (종양 세포 이식후 10-14일) 모니터링하였다. 200-350 ㎣ 이종이식 종양을 보유한 마우스에게 볼루스 비히클 (제제 완충제: 50 mM 숙시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 10 mM 환원된 글루타티온, pH 7) 또는 650 mg/kg의 PEG화 삼량체 H-NOX (L144F)를 함유하는 제제 완충제를 주사하였다. qRT-PCR 분석용 샘플을 제조하기 위해, 마우스를 희생시키고, 종양을 절제하였다. RNeasy 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 이용하여 제조업체의 지침서에 따라 종양 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. 스텝원플러스(StepOnePlus™) 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서의 역방향 전사 및 실시간 PCR (RT-PCR)을 기재된 바와 같이 수행하였다. 2 μL의 cDNA 주형, 12.5 μL의 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 1 μL의 하기 센스 및 안티센스 프라이머: VEGF: 정방향, 5'-CAATCGAGACCCTGGTGGA-3' (서열식별번호:23); 역방향, 5'-GCACACACTCCAGGCCCT-3' (서열식별번호:24); Glut1: 정방향, 5'-CAACCAGACATGGGTCCAC-3' (서열식별번호:25); 역방향, 5'-GTTAACGAAAAGGCCCACAGA-3' (서열식별번호:26); PDL1: 정방향, 5'-GTTGTGGATCCAGTCACCTCT-3' (서열식별번호:27); 역방향, 5'-GATTCTCAGTGTGCTGGTCAC-3'(서열식별번호:28); L7: 정방향, 5'-CAAGGAGGAAGCTTATCTATGAA-3'(서열식별번호:29); 역방향, 5'-ATTTGACGAAGGCGAAGAAGCT-3' (서열식별번호:30)을 이용하여 25 μL의 반응물을 제조하였다. 열순환 조건은 다음과 같았다: 초기 단계는 95℃에서 10분이었고, 이어서 95℃에서 15초 변성의 40 주기, 이어서 1분 어닐링 및 60℃에서 신장이었다. 결과는 비교 CT 방법을 이용하는 스텝원(StepOne) 소프트웨어 v2.0에 의해 분석하였다. 관심 유전자의 전사체를 마우스 리보좀 단백질 L7 하우스키핑 유전자의 전사체에 대해 정규화하고, L7 전사체 함량에 대한 배수 변화를 제시하였다.
예를 들어, HIF-1α 및 A2AR 아데노신성 신호전달의 PEG화 삼량체 Tt H-NOX L144F-매개된 하향조절은 이펙터 T 세포를 종양 조직으로 활성화 및 동원하여 림프구 종양 침윤의 증가, 전이성 종양 성장의 감소 및 종양 퇴행을 유도할 수 있다. 추가로, 종양의 H-NOX-유도된 산소화는, 다중 저산소-의존성 메카니즘, 예컨대 종양 세포 표면 상에서 MHC1의 하향조절 및 PDL-1 발현의 상향조절, 및 면역 이펙터 세포를 직접적으로 억제할 뿐만 아니라 혈관신생 및 전이를 촉진시키는 TAM과 같은 골수-유래 억제 세포 (MDSC)의 활성화 및 동원을 억제시킴으로써, 종양 세포의 면역기피를 감소시킬 수 있다 (도 1B 참조). H-NOX 처리는 VEGF, CSF1 및 다른 HIF-1-의존성 시토카인 신호전달을 하향조절함으로써 TME로 대식세포의 동원 (Chaturvedi et al., 2014 Proc Natl Acad Sci USA, 111(20):E2120-2129; Lewis & Hughes, 2007 Breast Cancer Res, 9(3):209) 뿐만 아니라 HIF-1- 및 HIF-2-매개된 대식세포 활성화 (Fang et al., 2009 Blood, 114(4):844-859; Takeda et al., 2010 Genes Dev, 24(5):491-501)를 억제할 수 있다.
마지막으로, 숙주의 항종양 면역 반응을 자극하는데 있어서, H-NOX는 다른 표적화된 암 면역요법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 항-PD1 (프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1), 항-PDL-1 (프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1), 항-CTLA-4, 또는 다른 면역 체크포인트의 조절제를 표적화하는 요법, 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 또는 이들의 조합을 증진시키는 공동-활성화제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, H-NOX를 이중 PD1/CTLA-4 차단 요법 이전에 또는 그와 병용하여, 또는 PDL1+ 종양을 가진 환자에서 PDL-1 처리와 조합하여 암 환자에게 투여할 수 있다. 이는 다른 암 치료, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 화학요법, 방사선 요법, 또는 활성 항종양 면역 방어로부터 이익을 얻을 수 있는 다른 비-면역 표적화된 또는 세포-기재 요법에 대한 아주반트로도 작용할 수 있다. 실제로, H-NOX는 손상된 종양 조직으로부터 방사선 노출된 종양-특이적 항원에 대한 항종양 면역 반응 (Demaria et al., 2005 Int J Radiat Oncol Biol Phys, 63(3), 655-666) 및 산소-의존성 종양 세포 사멸 (Brown, 2010 Int J Radiat Biol, 86(11), 907-917)을 동시에 자극함으로써 방사선 요법과 함께 상승효과를 나타낼 수 있다. 방사선 요법 동안에, H-NOX는 방사선-유도된 혈관 손상으로 인한 저산소를 경감시킴으로써 정상 조직 방사선 보호제로서도 작용할 수 있다.
실시예 3. B16F10 및 CT26 피하 종양 및 두개내 GL261- 루시페라제 종양에서 저산소 및 T 세포의 측정.
B16F10 및 CT26 피하 종양 및 두개내 GL261- 루시페라제 종양의 생성. 6 내지 8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 B16F10 마우스 흑색종 암 세포를 피하 이식하였다 (도 7A). 6 내지 8주령의 BALB/c 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 CT26 콜론 종양 세포를 피하 이식하였다 (도 7B). 20g 체중의 수컷 C57BL/6J의 우측 미상핵 (+0.5 mm A/P, +2.3 mm M/L 및 -3.2 mm D/V)에 3 × 105개의 GL261-luc 세포를 두개내 주사하였다 (도 7C). 희생시키기 전 21일 동안 두개내 종양을 성장시켰다. 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 주3회 측정하고, 종양 크기를 식: (길이 × 너비2) ÷ 0.5를 기준으로 계산하였다. 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달하였을 때 (종양 세포 이식후 10-14일), 처리를 시작하였다.
처리. 희생시키기 1-8시간 전에 200-400 ㎣ 피하 종양 또는 제21일 두개내 종양을 보유한 마우스에게 외인성 저산소 마커 피모니다졸 ip. (60 mg/kg, 하이폭시프로브, 매사추사츠주 벌링턴)을 주사하였다.
면역조직화학. 설치류를 안락사시키고, 면역조직화학 (IHC) 검정을 위해 종양을 절제하였다. 종양을 OCT 중에서 동결시키고, IHC 프로세싱을 위해 12 μM로 박편화하였다. 박편을 4℃에서 15분 동안 4% PFA로 고정시킨 다음, 실온에서 1-2시간 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청, 및 0.1% Tween 20에 의해 차단 및 침투화시켰다. 이어서, 박편을 토끼 항-피모니다졸 (하이폭시프로브, 1:100) (도 7A, 7B, 7C, 상부 패널) 및 래트 항-CD3, 래트 항-CD4 (바이오레전드(Biolegend), 1:50) 또는 래트 항-CD8 (바이오레전드, 1:50) 항체 (도 7A, 7B, 7C, 중간 패널)와 함께 4℃에서 밤새, 이어서 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체 (1:1000, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 박편을 슬로우페이드(SlowFade) DAPI (인비트로젠(Invitrogen))에 탑재하였다. CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저 자이스(AxioImager Zeiss) 현미경으로 박편을 영상화하였다. 정량화. 각각의 동물에서, 피모니다졸-양성 및 피모니다졸-음성 영역 중 CD3+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 수를 1-1.5 mm의 종양 두께에 걸쳐 5개의 종양 박편에서 박편당 2-4개 사진으로 카운트하였다. 각각의 영역에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 합계를 피모니다졸-양성 및 피모니다졸-음성 영역의 합계로 나누어, 종양 조직 ㎟당 T 세포의 총 수를 수득하였다 (도 7A, 7B, 및 7C, 하부 패널). 종양의 저산소 영역 (H)은 정상산소 영역 (N)에 비해 T 세포가 2.5배 내지 10배 넘게 적었다.
실시예 4. 저산소 종양의 H- NOX 처리.
B16F10 피하 종양의 생성. 6 내지 8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 B16F10 마우스 흑색종 암 세포를 피하 이식하였다. 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 주3회 측정하고, 종양 크기를 식: (길이 × 너비2) ÷ 0.5를 기준으로 계산하였다. 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달하였을 때 (종양 세포 이식후 10-14일), 처리를 시작하였다.
처리. 200-400 ㎣ 종양을 보유한 마우스를 종양 크기를 기준으로 각각의 처리군으로 무작위화하고, 비히클 (제제 완충제: 50 mM 숙시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 10 mM 환원된 글루타티온, pH 7) 또는 2 mg의 PEG화 H-NOX (L144F)를 함유하는 100 μL의 제제 완충제를 종양내로 주사하였다. 비히클 또는 H-NOX 처리 1시간 전에, 마우스에게 외인성 저산소 마커 피모니다졸 ip. (60 mg/kg, 하이폭시프로브, 매사추사츠주 벌링턴)을 주사하였다.
면역조직화학. H-NOX 주사 6시간 후에, 설치류를 안락사시키고, 면역조직화학 (IHC) 검정을 위해 종양을 절제하였다. 종양을 OCT 중에서 동결시키고, IHC 프로세싱을 위해 12 μM로 박편화하였다. 박편을 4℃에서 15분 동안 4% PFA로 고정시킨 다음, 실온에서 1-2시간 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청, 및 0.1% Tween 20에 의해 차단 및 침투화시켰다. 이어서, 박편을 토끼 항-피모니다졸 (하이폭시프로브, 1:100) 또는 토끼 항-탄산 탈수효소 IX (CAIX, 노부스 바이올로지칼(Novus Biological) 1:1000) 및 래트 항-CD4 (바이오레전드, 1:50) 또는 래트 항-CD8 (바이오레전드, 1:50) 항체와 함께 4℃에서 밤새, 이어서 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체 (1:1000, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 박편을 슬로우페이드 DAPI (인비트로젠)에 탑재하였다. CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저 자이스 현미경으로 박편을 영상화하였다 (도 8 및 9B).
정량화. 각각의 동물에서, 피모니다졸-양성, 피모니다졸-음성, CAIX-양성 및 CAIX-음성 영역 중 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 1-1.5 mm의 종양 두께에 걸쳐 5개의 종양 박편에서 박편당 4개의 사진으로 카운트하였다. 각각의 영역에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 합계를 피모니다졸-양성, 피모니다졸-음성, CAIX-양성 및 CAIX-음성 영역의 합계로 나누어, 종양 조직 ㎟당 T 세포의 총 수를 수득하였다. 도 8 및 9A에 도시한 결과는, 이전에 피모니다졸-음성 (도 8) 또는 CAIX-음성 (도 9B) 표지된 종양 저산소 영역에서 비히클 대조군 (제제 완충제)에 비해 OMX 처리가 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 축적을 증진시킴을 입증한다.
실시예 5. 종양 저산소 및 종양 혈관의 측정.
H460, B16F10 및 CT26 피하 종양 및 두개내 GL261- 루시페라제 종양의 생성. 7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스의 뒷다리에 3 × 106개의 H460 인간 폐암 세포를 피하 이식하였다. 6 내지 8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 B16F10 마우스 흑색종 암 세포를 피하 이식하였다. 6 내지 8주령의 BALB/c 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 CT26 콜론 종양 세포를 피하 이식하였다. 20g 체중의 수컷 C57BL/6J의 우측 미상핵 (+0.5 mm A/P, +2.3 mm M/L 및 -3.2 mm D/V)에 3 × 105개의 GL261-luc 세포를 두개내 주사하였다. 희생시키기 전 21일 동안 두개내 종양을 성장시켰다. 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 주3회 측정하고, 종양 크기를 식: (길이 × 너비2) ÷ 0.5를 기준으로 계산하였다. 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달하였을 때 (종양 세포 이식후 10-14일), 처리를 시작하였다. 처리. 희생시키기 1-8시간 전에 200-400 ㎣ 피하 종양 또는 제21일 두개내 종양을 보유한 마우스에게 외인성 저산소 마커 피모니다졸 ip. (60 mg/kg, 하이폭시프로브, 매사추사츠주 벌링턴)을 주사하였다.
면역조직화학 및 ELISA. 설치류를 안락사시키고, 면역조직화학 (IHC) 및 ELISA 검정을 위해 종양을 절제하였다. ELISA를 위해, B16F10, CT26 및 H460 종양을 항-프로테아제로 보충된 추출 완충제 (압캠 키트 # ab117996) 중에서 균질화하였다. 브래드포드 검정을 이용하여 각각의 종양에서 단백질 농도를 정량화하고, 경쟁적 피모니다졸 (하이폭시프로브-1, 하이폭시프로브, 매사추사츠주 벌링턴) ELISA 검정을 이용하여 저산소 수준에 대해 샘플을 검정하였다. IHC를 위해, GL261 종양을 OCT 중에서 동결시키고, IHC 프로세싱을 위해 12 μM로 박편화하였다. 박편을 -20℃에서 20분 동안 100% 만니톨로 고정시킨 다음, 실온에서 1-2시간 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청, 및 0.1% Tween 20에 의해 차단 및 침투화시켰다. 이어서, 박편을 토끼 항-피모니다졸 (하이폭시프로브, 1:100) 및 래트 항-CD31 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience), 1:50) 항체와 함께 4℃에서 밤새, 이어서 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체 (1:1000, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 박편을 슬로우페이드 DAPI (인비트로젠)에 탑재하였다. CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저 자이스 현미경으로 박편을 영상화하였다 (도 10).
정량화. 피모니다졸 ELISA를 위해, IC50 값 ("Kd")의 정량화를 표준 곡선의 5-변수 대입에 의해 수행하였고, 각각의 샘플에서 단백질 농도에 따라 값을 정규화하였다. GL261 IHC의 경우, 각각의 동물에서 종양 조직 내의 피모니다졸+ 영역의 퍼센트를 이미지제이(ImageJ)를 이용하여 결정하였다 (1 mm의 종양 두께에 걸쳐 5개의 종양 박편에서 박편당 1-2개의 사진) (도 10). 이들 데이터는, 개별 동물들간에 및 종양 유형간에 저산소 수준의 차이가 있지만, 그의 존재는 시험한 크기의 대부분의 종양에서 유의하였음을 보여준다.
실시예 6. 종양에서 H- NOX 축적의 측정.
B16F10 및 CT26 피하 종양 및 두개내 GL261- 루시페라제 종양의 생성. 6 내지 8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 B16F10 마우스 흑색종 암 세포를 피하 이식하였다. 6 내지 8주령의 BALB/c 암컷 마우스의 옆구리 상에 1 × 106개의 CT26 콜론 종양 세포를 피하 이식하였다. 20g 체중의 수컷 C57BL/6J의 우측 미상핵 (+0.5 mm A/P, +2.3 mm M/L 및 -3.2 mm D/V)에 3 × 105개의 GL261-luc 세포를 두개내 주사하였다. 희생시키기 전 21일 동안 두개내 종양을 성장시켰다. 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 주3회 측정하고, 종양 크기를 식: (길이 × 너비2) ÷ 0.5를 기준으로 계산하였다. 종양이 ~300 ㎣의 평균 크기에 도달하였을 때 (종양 세포 이식후 10-14일), 처리를 시작하였다.
처리. 200-400 ㎣ 피하 종양을 보유한 마우스를 종양 크기를 기준으로 각각의 처리군으로 무작위화하고, 비히클 (제제 완충제: 50 mM 숙시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 10 mM 환원된 글루타티온, pH 7) 또는 PEG화 H-NOX (L144F)를 함유하는 제제 완충제를 정맥내 (650 mg/kg), 피하 (650 mg/kg) 또는 종양내 (2 mg, 100 μL) 주사하였다. 제21일 두개내 종양을 보유한 마우스를 제노겐(Xenogen) IVIS 스펙트럼에 의해 측정된 생물발광 신호를 기준으로 각각의 처리군으로 무작위화하고, 제제 완충제 단독 또는 750 mg/kg의 H-NOX (L144F)를 함유하는 제제를 정맥내 주사하였다.
피하 종양 조직에서 PEG화 H- NOX ( L144F ) 축적의 측정. H-NOX 또는 비히클 주사 6시간 후에 (B16F10) 또는 8시간 후에 (CT26) 종양을 수확하였다. 종양을 항-프로테아제로 보충된 추출 완충제 (압캠 키트 # ab117996) 중에서 균질화하고, 단백질 농도를 각각의 종양에서 브래드포드 검정을 이용하여 정량화하였다. PEG화 H-NOX (L144F) 농도를 H-NOX에 대한 샌드위치 ELISA ELISA (1 ng/ml에서의 검출 감도)에 의해 정량화하고, 종양 중량에 대해 정규화하여, H-NOX 양을 ㎍/g 종양 조직으로 나타내었다. 종양 용해물 중 H-NOX 수준의 정량화는 표준 곡선의 5-변수 대입에 의해 결정하였다.
IHC에 의한 GL261 중 H- NOX ( L144F )의 생체분포 . H-NOX 주사 2시간 후에, 설치류를 안락사시키고, 면역조직화학 (IHC) 검정을 위해 종양을 절제하였다. 종양을 OCT 중에서 동결시키고, IHC 프로세싱을 위해 12 μM로 박편화하였다. 박편을 -20℃에서 20분 동안 100% 만니톨로 고정시킨 다음, 실온에서 1-2시간 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청, 및 0.1% Tween 20에 의해 차단 및 침투화시켰다. 이어서, 박편을 토끼 항-H-NOX (1:500, 아나스펙 인크(AnaSpec Inc, 캘리포니아주 프레몬트)에 의해 생산된 주문 제작한 토끼 폴리클로날) 및 래트 항-CD31 (비디 바이오사이언스, 1:50) 항체와 함께 4℃에서 밤새, 이어서 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체 (1:1000, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 박편을 슬로우페이드 DAPI (인비트로젠)에 탑재하였다. CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저 자이스 현미경으로 박편을 영상화하였다. 각각의 동물에서, 종양 조직 내에서 H-NOX-양성 영역의 퍼센트를 이미지제이 (1 mm의 종양 두께에 걸쳐 5개의 종양 박편에서 박편당 1-2개의 사진)를 이용하여 결정하였다.
실시예 7. 개 구강 흑색종 종양에서 저산소 및 T 세포의 측정.
개 구강 흑색종. 구강 흑색종 종양을 가진 애완견을 주인의 동의 하에 모집하여, 수술 4시간 전에 PEG화 H-NOX (L144F)를 정맥내 주사 (천천히 주입)하였다. 수술에 의해 추출한 조직을 IHC에 의해 분석하였다.
면역조직화학. H-NOX 주사 4시간 후에, 종양을 절제하고, OCT 중에서 동결시키고, IHC 프로세싱을 위해 12 μM로 박편화하였다. 박편을 4℃에서 15분 동안 4% PFA로 고정시킨 다음, 실온에서 1-2시간 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청, 및 0.1% Tween 20에 의해 차단 및 침투화시켰다. 이어서, 박편을 토끼 항-탄산 탈수효소 IX (CAIX, 노부스 바이올로지칼 1:1000) 또는 토끼 항-H-NOX (1:500, 아나스펙 인크 (캘리포니아주 프레몬트)에 의해 생산된 주문 제작한 토끼 폴리클로날) 및 래트 항-CD4 (애브드 세로테크(Abd Serotech), 1:50) 또는 래트 항-CD8 (애브드 세로테크, 1:50) 항체와 함께 4℃에서 밤새, 이어서 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체 (1:1000, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 박편을 슬로우페이드 DAPI (인비트로젠)에 탑재하였다. CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저 자이스 현미경으로 박편을 영상화하였다 (도 11). 영상은 OMX 투여 전의 저산소 상태의 지표인 저산소 마커 CAIX를 발현한 종양 영역에서 높은 림프구 수의 존재를 나타내었으며, 이는 OMX 처리가 면역억제 미세환경을 완화시키고, 림프구 침윤을 허용함을 시사한다.
실시예 8. 종양 부피, 종양 저산소 및 감소된 T 세포 침윤의 상관관계.
4T1-Luc 종양 모델. 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 찰스 리버 랩스(Charles River Labs)로부터 구입하였다. 루시페라제-발현 4T1 마우스 유방 종양 세포 (4T1-Fluc-Neo; 이마니스 라이프 사이언시즈(Imanis Life Sciences))를 10% 태아 소 혈청, 1× 페니실린/스트렙토마이신, 및 0.7 mg/ml G-418 (인비보젠(InvivoGen))로 보충된 RPMI 배지에서 성장시켰다. 세포를 트립신으로 처리하고, 배지:마트리겔(Matrigel) (코닝(Corning))의 50:50 혼합물에 재현탁시키고, 100 μL 부피 중 2 × 105개의 세포를 마우스에게 피하 주사하였다. 이식후 제10일 및 제14일에, 종양을 측정하여 부피를 계산하고 (길이 × 너비 × 높이 × 0.523), 마우스에게 120 mg/kg 피모니다졸 i.p. (PIMO, 하이폭시프로브) 및 30 mg/kg EF5 i.v. (하이폭시아 이미징 센터(Hypoxia Imaging Center))를 동시에 주사하고, PIMO/EF5 주사 90분 후에 희생시키고, 종양을 수확하였다. 수확한 종양을 면역염색을 위해 OCT 중에서 동결시키고, 젠틀맥스(gentleMACS) 분해기를 이용하여 단일 세포로 분해한 후, 0.75 mg/ml 콜라게나제/디스파제 (로쉐(Roche))와 함께 진탕시키면서 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 분해된 세포를 70 μm 필터에 통과시켰다.
유세포 분석. 고정되지 않은 분해된 세포를 T 세포에 대해 항체 (햄스터 항-마우스 CD3-알렉사플루오르(AlexaFluor) 488, 클론 145-2C11, 이바이오사이언스(eBioscience); 래트 항-마우스 CD4-APC, 클론 RM4-5, 비디 바이오사이언시즈; 래트 항-마우스 CD8-PE, 클론 53-6.7, 비디 바이오사이언시즈)로 염색하고, 페이스캘리버(FACSCalibur)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 통문의 목적을 위해 T 세포 양성 대조군으로서 비장을 사용하였다. 또한, 분해된 세포를 70 μm 필터를 통해 여과한 후, 세포를 생존 염료 570 (비디 바이오사이언시즈)으로 염색하고, 포르말린 및 만니톨로 고정하고, 저산소 마커에 대해 항체 (토끼 항-피모니다졸, 하이폭시프로브, 이어서 당나귀 항-토끼 알렉사플루오르 647; 알렉사플루오르 488에 접합된 마우스 항-EF5, 하이폭시아 이미징 센터)로 염색하고, 페이스캘리버 상에서 분석하였다. 유세포 분석 데이터를 플로우조(FlowJo)에 의해 분석하였다.
면역형광 염색. 동결된 박편을 10 μm로 절단하고, 4% PFA로 고정하고, 일차 항체 (래트 항-마우스 CD4, 래트 항-마우스 CD8, 토끼 항-PIMO), 이어서 이차 항체 (당나귀 항-래트 알렉사플루오르 594, 당나귀 항-PIMO 알렉사플루오르 488)로 염색하고, DAPI에 의해 대비염색하였다.
도 13A-13K에 도시된 바와 같이, 큰 종양 크기는 피하 4T1-Luc 공통 유전자 종양에서 증진된 저산소 및 감소된 림프구 침윤과 상호관련있었다. 도 12A는 이식후 제10일 및 제14일의 종양 부피를 도시한다. 도 12B는 생존가능한 세포 집단 내에서 림프구 분율을 도시하고, 도 12C는 생존가능한 집단 내에서 절대 림프구 세포 수를 도시한다. 종양 부피와 림프구 백분율 사이에 음의 상관관계 (도 12D) 및 저산소 백분율과 림프구 백분율 사이에 음의 상관관계 (도 12F)가 입증된 반면에, 종양 부피와 저산소 백분율 사이의 관계는 양의 상관관계 (도 12E)를 나타내었다. 음의 상관관계는 또한 종양 부피와 CD3-양성 T 세포 백분율 사이에서 (도 12G), 종양 부피와 CD4-양성 T 세포 백분율 사이에서 (도 12H), 종양 부피와 CD8-양성 T 세포 백분율 사이에서 (도 12I), 종양 부피와 CD3-CD4-이중-양성 T 세포 백분율 사이에서 (도 12J), 및 종양 부피와 CD3-CD8-이중-양성 T 세포 백분율 사이에서 (도 12K) 나타났다.
도 13A-13F는 저산소 종양 영역이 피하 4T1-Luc 공통 유전자 마우스 종양에서 면역억제성이고 감소된 T 세포 침윤을 나타냄을 도시한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> CARY, Stephen P. L. KRTOLICA, Ana LE MOAN, Natacha WINGER, Jonathan A. LEONG, Kevin G. <120> MODULATION OF TUMOR IMMUNITY BY PROTEIN-MEDIATED O2 DELIVERY <130> 627042000940 <140> Not Yet Assigned <141> Concurently Herewith <150> 62/134,523 <151> 2015-03-17 <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 1 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggc ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtga 555 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 2 Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu 20 25 30 Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn 50 55 60 Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met 85 90 95 Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu 115 120 125 Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Leu 130 135 140 Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile 165 170 175 Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu 180 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 3 ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg caagcttacg ttcgtaaaga tggcgaatgg 60 gtattacttt ctaccttttt a 81 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 4 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 5 <211> 690 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 5 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtataagaa aaatctcgag ggcagcggcg gttatattcc tgaagctcca 600 agagatgggc aggcttacgt tcgtaaagat ggcgaatggg tattactttc taccttttta 660 aggggtagtc accatcacca tcaccattga 690 <210> 6 <211> 225 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 6 Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu 20 25 30 Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn 50 55 60 Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met 85 90 95 Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu 115 120 125 Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Phe 130 135 140 Ile Glu Gly Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Glu Glu Val Glu Arg Gly 145 150 155 160 Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile Lys Phe Lys Asn 165 170 175 Pro Val Phe Glu Tyr Lys Lys Asn Leu Glu Gly Ser Gly Gly Tyr Ile 180 185 190 Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu 195 200 205 Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Arg Gly Ser His His His His His 210 215 220 His 225 <210> 7 <211> 663 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 7 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtataagaa aaatctcgag ggcagcggcg gttatattcc tgaagctcca 600 agagatgggc aggcttacgt tcgtaaagat ggcgaatggg tattactttc taccttttta 660 tga 663 <210> 8 <211> 167 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 8 Met Lys Gly Thr Ile Gly Thr Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu Gly Asn 1 5 10 15 Asp Asp Glu Leu Lys Gly Glu Asp Arg Ile Thr Leu Glu Asp Ile Asp 20 25 30 Asp Asp Glu Arg Arg Ile Phe Ala Lys Glu Lys Thr Gly Lys Asn Asn 35 40 45 Glu Ile Arg Glu Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Glu Phe Phe Ala 50 55 60 Gly Arg Arg Leu Asn Phe Leu Met Met Met Asp Glu His Leu Gln Leu 65 70 75 80 Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala Thr Arg Leu Ile Ala Lys Ala Lys Asp 85 90 95 Ala Ile Glu Met Glu Lys Arg Lys Met Asp Phe Leu Gly Phe Ile Glu 100 105 110 Gly Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Glu Glu Glu Arg Gly Glu Lys Asp 115 120 125 Gly Phe Arg Leu Lys Arg Ile Lys Phe Lys Asn Phe Glu Lys Lys Asn 130 135 140 Leu Glu Gly Gly Gly Ile Glu Ala Arg Asp Gly Gln Ala Arg Lys Asp 145 150 155 160 Gly Glu Leu Leu Thr Phe Leu 165 <210> 9 <211> 564 <212> DNA <213> Legionella pneumophila <400> 9 atgatgtcta tgaaaggaat catattcaac gaatttctca attttgtaga aaaaagtgaa 60 tcctacaccc tggtagatca aattattatg gatagtcatt tgaagtccca tggtgcctac 120 acgtctatcg gtacatactc tcccaaagaa ttatttcaat tggttaaagc gcttgctatg 180 aaaaatggca aaccaacatc agtgatttta caagaatatg gtgagtattt gtttgaggtt 240 tttgcaaaaa aatatcctca atttttcagg gaaaaaaagt cggtgtttca atttttggaa 300 gcgcttgaaa cacatattca tttcgaagtg aaaaaattgt atgactatac tgaactaccc 360 cattttgaat gccaatatca cagtcaaaat caaatggaaa tgatttacac ttcttcgcgt 420 cctttggccg attttgcgga aggtttaata aaaggttgta ttaaatatca taaagaaaac 480 atgactattg ttcgtgaaaa tctgcctgca aaaacaggct ttaaggtaag atttgtatta 540 acaaaaggcg atcctgatga gtga 564 <210> 10 <211> 187 <212> PRT <213> Legionella pneumophila <400> 10 Met Met Ser Met Lys Gly Ile Ile Phe Asn Glu Phe Leu Asn Phe Val 1 5 10 15 Glu Lys Ser Glu Ser Tyr Thr Leu Val Asp Gln Ile Ile Met Asp Ser 20 25 30 His Leu Lys Ser His Gly Ala Tyr Thr Ser Ile Gly Thr Tyr Ser Pro 35 40 45 Lys Glu Leu Phe Gln Leu Val Lys Ala Leu Ala Met Lys Asn Gly Lys 50 55 60 Pro Thr Ser Val Ile Leu Gln Glu Tyr Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Val 65 70 75 80 Phe Ala Lys Lys Tyr Pro Gln Phe Phe Arg Glu Lys Lys Ser Val Phe 85 90 95 Gln Phe Leu Glu Ala Leu Glu Thr His Ile His Phe Glu Val Lys Lys 100 105 110 Leu Tyr Asp Tyr Thr Glu Leu Pro His Phe Glu Cys Gln Tyr His Ser 115 120 125 Gln Asn Gln Met Glu Met Ile Tyr Thr Ser Ser Arg Pro Leu Ala Asp 130 135 140 Phe Ala Glu Gly Leu Ile Lys Gly Cys Ile Lys Tyr His Lys Glu Asn 145 150 155 160 Met Thr Ile Val Arg Glu Asn Leu Pro Ala Lys Thr Gly Phe Lys Val 165 170 175 Arg Phe Val Leu Thr Lys Gly Asp Pro Asp Glu 180 185 <210> 11 <211> 543 <212> DNA <213> Legionella pneumophila <400> 11 atgaaaggta tcgtttttac ctccttaaat gacatgatta tagaacaatt tggcatagaa 60 acctgggacc aactcgtatc ctcactagac cttccaagtg gtggaagtta tacagcaggc 120 ggcacttact cggatacaga atttcagcaa ttgattaagg ccattgcgaa gaggaccaat 180 cagcacgctt ctgttttttt agaggccttt ggtgaataca 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aagagtcaaa agaagaggat ttttatgaag atcttgacag atttgaagaa 600 aatggtaccc aggaatcacg catcagccca tatacattct gcaaagcttt tccttttcat 660 ataatatttg accgggacct agtggtcact cagtgtggca atgctatata cagagttctc 720 ccccagctcc agcctgggaa ttgcagcctt ctgtctgtct tctcgctggt tcgtcctcat 780 attgatatta gtttccatgg gatcctttct cacatcaata ctgtttttgt attgagaagc 840 aaggaaggat tgttggatgt ggagaaatta gaatgtgagg atgaactgac tgggactgag 900 atcagctgct tacgtctcaa gggtcaaatg atctacttac ctgaagcaga tagcatactt 960 tttctatgtt caccaagtgt catgaacctg gacgatttga caaggagagg gctgtatcta 1020 agtgacatcc ctctgcatga tgccacgcgc gatcttgttc ttttgggaga acaatttaga 1080 gaggaataca aactcaccca agaactggaa atcctcactg acaggctaca gctcacgtta 1140 agagccctgg aagattga 1158 <210> 14 <211> 385 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp 20 25 30 Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr 35 40 45 Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly 50 55 60 Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu 65 70 75 80 Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu 85 90 95 Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr 100 105 110 Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly 115 120 125 Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp 130 135 140 Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr 145 150 155 160 Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Asn Glu Glu Cys Asp His 165 170 175 Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr 180 185 190 Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Glu Ser Arg Ile 195 200 205 Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp 210 215 220 Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu 225 230 235 240 Pro Gln Leu Gln Pro Gly Asn Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu 245 250 255 Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile 260 265 270 Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu 275 280 285 Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Thr Glu Ile Ser Cys Leu 290 295 300 Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu 305 310 315 320 Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu 340 345 350 Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu 355 360 365 Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu 370 375 380 Asp 385 <210> 15 <211> 651 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgtatggat tcatcaacac ctgcctgcag tctcttgtga cagagaaatt tggtgaggag 60 acatgggaga agctgaaggc tcctgcagaa gtgcaagatg tcttcatgac ctacaccgtg 120 tatgatgaca tcatcaccat taagctcatc caagaagcct gcaaggttct ggatgtgtcc 180 atggaagcca ttctgaagct ctttggcgaa tacttcttta agttctgtaa gatgtctggc 240 tatgacagga tgctgcggac acttggagga aatctcaccg agtttattga aaacctagat 300 gcactccaca gttacctggc actgtcctat caggaaatga acgcaccatc ctttcgagtg 360 gaggaaggag ctgacggggc gatgcttctc cactactact cagacagaca tggtctgtgt 420 cacattgtac caggtatcat tgaagctgtg gccaaggact tctttgacac tgatgtggcc 480 atgagtatcc tggatatgaa cgaagaggtg gaaaggacag ggaagaaaga acatgttgtg 540 tttctggtcg tgcagaaggc tcacagacag ataagaggag caaaggcaag ccggccacaa 600 ggcagtgagg acagccaggc agaccaggag gctctccagg gaacactcct t 651 <210> 16 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Tyr Gly Phe Ile Asn Thr Cys Leu Gln Ser Leu Val Thr Glu Lys 1 5 10 15 Phe Gly Glu Glu Thr Trp Glu Lys Leu Lys Ala Pro Ala Glu Val Gln 20 25 30 Asp Val Phe Met Thr Tyr Thr Val Tyr Asp Asp Ile Ile Thr Ile Lys 35 40 45 Leu Ile Gln Glu Ala Cys Lys Val Leu Asp Val Ser Met Glu Ala Ile 50 55 60 Leu Lys Leu Phe Gly Glu Tyr Phe Phe Lys Phe Cys Lys Met Ser Gly 65 70 75 80 Tyr Asp Arg Met Leu Arg Thr Leu Gly Gly Asn Leu Thr Glu Phe Ile 85 90 95 Glu Asn Leu Asp Ala Leu His Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Gln Glu 100 105 110 Met Asn Ala Pro Ser Phe Arg Val Glu Glu Gly Ala Asp Gly Ala Met 115 120 125 Leu Leu His Tyr Tyr Ser Asp Arg His Gly Leu Cys His Ile Val Pro 130 135 140 Gly Ile Ile Glu Ala Val Ala Lys Asp Phe Phe Asp Thr Asp Val Ala 145 150 155 160 Met Ser Ile Leu Asp Met Asn Glu Glu Val Glu Arg Thr Gly Lys Lys 165 170 175 Glu His Val Val Phe Leu Val Val Gln Lys Ala His Arg Gln Ile Arg 180 185 190 Gly Ala Lys Ala Ser Arg Pro Gln Gly Ser Glu Asp Ser Gln Ala Asp 195 200 205 Gln Glu Ala Leu Gln Gly Thr Leu Leu 210 215 <210> 17 <211> 1158 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 17 atgtacggtt ttgtgaacca tgccctggag ctgctggtga tccgcaatta cggtcccgag 60 gtgtgggaag acatcaaaaa agaggcgcag ctggatgaag aaggccagtt tcttgtgaga 120 ataatctacg atgattccaa aacctatgac ttggtggctg ctgcgagcaa agtcctcaac 180 ctcaatgctg gtgaaatcct gcagatgttt gggaagatgt ttttcgtctt ctgtcaagag 240 tctggctatg ataccatctt gcgtgtcctg ggatctaatg tcagggagtt tttgcagaac 300 ctcgacgccc tgcacgacca cctcgccacc atctacccag ggatgcgcgc accttccttc 360 cggtgcaccg atgcagaaaa aggcaaaggg ctcattctgc actactactc ggaaagagag 420 gggcttcagg acattgtgat cgggattatc aagactgtag ctcaacagat ccatggcact 480 gagatagaca tgaaggttat tcagcaaaga agtgaagaat gtgatcatac ccaattttta 540 attgaagaaa aagaatcaaa agaagaggat ttttatgaag atctggacag gtttgaagag 600 aacggtaccc aggactcccg tatcagcccg tacaccttct gcaaagcgtt tccttttcac 660 atcatatttg accgggacct agtagtcacg cagtgtggaa atgctatcta cagagtgctc 720 ccccagctcc agcctgggaa gtgcagcctt ctgtctgtct tctctctggt ccgccctcat 780 attgacatca gtttccacgg gattctttca cacatcaata ccgtctttgt actgagaagc 840 aaggaagggt tgctggatgt tgagaaactt gaatgtgagg atgaactgac tggggcagag 900 attagctgcc tccgtctcaa aggccaaatg atctatttac cggaagcaga tagcatcctc 960 ttcctctgtt caccaagtgt gatgaacttg gatgacctaa caagaagagg cctgtacctg 1020 agtgacatcc ctctccatga tgctacacga gacctggtcc ttttgggaga acagttccgg 1080 gaggagtaca aactgacaca agagctggaa atcctcacag acaggctgca gctcacactg 1140 agggctttgg aggattga 1158 <210> 18 <211> 385 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 18 Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp 20 25 30 Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr 35 40 45 Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly 50 55 60 Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu 65 70 75 80 Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu 85 90 95 Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr 100 105 110 Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly 115 120 125 Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp 130 135 140 Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr 145 150 155 160 Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Ser Glu Glu Cys Asp His 165 170 175 Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr 180 185 190 Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Asp Ser Arg Ile 195 200 205 Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp 210 215 220 Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu 225 230 235 240 Pro Gln Leu Gln Pro Gly Lys Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu 245 250 255 Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile 260 265 270 Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu 275 280 285 Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Ala Glu Ile Ser Cys Leu 290 295 300 Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu 305 310 315 320 Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu 340 345 350 Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu 355 360 365 Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu 370 375 380 Asp 385 <210> 19 <211> 1158 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 19 atgtacggtt ttgtgaacca tgccctggag ctgctggtga tccgcaatta cggtcccgag 60 gtgtgggaag acatcaaaaa agaggcgcag ctggatgaag aaggccagtt tcttgtgaga 120 ataatctacg atgattccaa aacctatgac ttggtggctg ctgcgagcaa agtcctcaac 180 ctcaatgctg gtgaaatcct gcagatgttt gggaagatgt ttttcgtctt ctgtcaagag 240 tctggctatg ataccatctt gcgtgtcctg ggatctaatg tcagggagtt tttgcagaac 300 ctcgacgccc tgcacgacca cctcgccacc atctacccag ggatgcgcgc accttccttc 360 cggtgcaccg atgcagaaaa aggcaaaggg ctcattctgc actactactc ggaaagagag 420 gggcttcagg acattgtgat cgggattatc aagactgtag ctcaacagat ccatggcact 480 gagatagaca tgaaggttat tcagcaaaga agtgaagaat gtgatcatac ccaattttta 540 attgaagaaa aagaatcaaa agaagaggat ttttatgaag atctggacag gtttgaagag 600 aacggtaccc aggactcccg tatcagcccg tacaccttct gcaaagcgtt tccttttcac 660 atcatatttg accgggacct agtagtcacg cagtgtggaa atgctatcta cagagtgctc 720 ccccagctcc agcctgggaa gtgcagcctt ctgtctgtct tctctctggt ccgccctcat 780 attgacatca gtttccacgg gattctttca cacatcaata ccgtctttgt actgagaagc 840 aaggaagggt tgctggatgt tgagaaactt gaatgtgagg atgaactgac tggggcagag 900 attagctgcc tccgtctcaa aggccaaatg atctatttac cggaagcaga tagcatcctc 960 ttcctctgtt caccaagtgt gatgaacttg gatgacctaa caagaagagg cctgtacctg 1020 agtgacatcc ctctccatga tgctacacga gacctggtcc ttttgggaga acagttccgg 1080 gaggagtaca aactgacaca agagctggaa atcctcacag acaggctgca gctcacactg 1140 agggctttgg aggattga 1158 <210> 20 <211> 385 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 20 Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp 20 25 30 Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr 35 40 45 Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly 50 55 60 Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu 65 70 75 80 Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu 85 90 95 Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr 100 105 110 Pro Gly Met Arg Ala Pro Ser Phe Arg Cys Thr Asp Ala Glu Lys Gly 115 120 125 Lys Gly Leu Ile Leu His Tyr Tyr Ser Glu Arg Glu Gly Leu Gln Asp 130 135 140 Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr 145 150 155 160 Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Ser Glu Glu Cys Asp His 165 170 175 Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr 180 185 190 Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Asp Ser Arg Ile 195 200 205 Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp 210 215 220 Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu 225 230 235 240 Pro Gln Leu Gln Pro Gly Lys Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu 245 250 255 Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile 260 265 270 Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu 275 280 285 Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Ala Glu Ile Ser Cys Leu 290 295 300 Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu 305 310 315 320 Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu 340 345 350 Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu 355 360 365 Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu 370 375 380 Asp 385 <210> 21 <211> 2229 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 21 atgtatggat tcatcaacac ctgcctgcag tctcttgtga cagagaaatt tggtgaggag 60 acatgggaga agctgaaggc tcctgcagaa gtgcaagatg tcttcatgac ctacaccgtg 120 tatgatgaca tcatcaccat taagctcatc caagaagcct gcaaggttct ggatgtgtcc 180 atggaagcca ttctgaagct ctttggcgaa tacttcttta agttctgtaa gatgtctggc 240 tatgacagga tgctgcggac acttggagga aatctcaccg agtttattga aaacctagat 300 gcactccaca gttacctggc actgtcctat caggaaatga acgcaccatc ctttcgagtg 360 gaggaaggag ctgacggggc gatgcttctc cactactact cagacagaca tggtctgtgt 420 cacattgtac caggtatcat tgaagctgtg gccaaggact tctttgacac tgatgtggcc 480 atgagtatcc tggatatgaa cgaagaggtg gaaaggacag ggaagaaaga acatgttgtg 540 tttctggtcg tgcagaaggc tcacagacag ataagaggag caaaggcaag ccggccacaa 600 ggcagtgagg acagccaggc agaccaggag gctctccagg gaacactcct tcggatgaag 660 gagagatatt taaacatccc tgtttgccct ggggagaaat ctcactcaac tgctgtgagg 720 gcatcggtcc tttttggaaa agggcccctc agggacacct tccagcccgt ctatcctgag 780 agactatggg tcgaagagga ggtgttctgt gatgcttttc ctttccacat tgtctttgat 840 gaagcactaa gggtcaagca agctggagtg aatattcaga agtatgtccc tggaatctta 900 acccagaagt ttgcactaga tgagtatttt tccatcatcc accctcaagt tactttcaac 960 atctccagca tctgcaagtt cattaacagt cagtttgtct tgaagacaag aaaagaaatg 1020 atgcccaaag caaggaagag ccagccgatg ctcaaactcc ggggtcagat gatctggatg 1080 gagtctctga ggtgcatgat cttcatgtgt tccccaaacg tccgcagcct gcaagagctg 1140 gaagagagca agatgcatct ttctgatatc gctccgcacg acacgaccag ggatctcatc 1200 ctcctcaacc agcagaggct ggcagagatg gagctgtcct gccaactgga aaagaagaag 1260 gaggagttgc gtgtcctttc caatcacctg gccatcgaga agaagaagac agagaccttg 1320 ctgtatgcca tgctgcctga acatgtggcc aaccaactca aggagggcag aaaggtggct 1380 gcaggagaat ttgaaacatg tacaatcctt ttcagcgatg ttgtgacatt taccaacatc 1440 tgtgcagcct gtgaacctat ccaaatcgtg aacatgctga attcaatgta ctccaagttt 1500 gacaggttaa ccagtgtcca tgatgtctac aaagtagaaa caatagggga tgcttacatg 1560 gtggtgggtg gagtaccagt acccgttgaa agccatgctc aaagagtcgc caattttgct 1620 ctggggatga gaatttctgc aaaagaagtg atgaatcctg tcactgggga acctatccag 1680 atcagagtgg gaatccacac tggaccagtc ttagcaggtg ttgtgggaga caagatgcct 1740 cggtactgct tgtttggtga cactgtaaac acagcctcta ggatggaaag tcacgggctt 1800 cccagcaaag tgcatctgag ccccacagcc cacagagccc tgaaaaacaa agggtttgaa 1860 attgtcagga gaggcgagat cgaagtgaag gggaaaggaa agatgaccac atactttctg 1920 atccagaacc tgaatgccac cgaggatgag ataatggggc gaccttcagc ccccgctgat 1980 gggaaggaag tatgtactcc cggaaaccaa gtcaggaagt cccctgctgt cccgaggaac 2040 acagaccatc agcaacaagt ctacaaagga gacccagcag acgcttctaa tgaagtcaca 2100 cttgctggga gcccagtggc agggcgaaac tccacagatg cagtcaataa ccagccatca 2160 ccagatgaga ccaagacaag tgtcgttgct agtggccctg tgctgtctgc tttctgtgtt 2220 gtgctgtga 2229 <210> 22 <211> 742 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 22 Met Tyr Gly Phe Ile Asn Thr Cys Leu Gln Ser Leu Val Thr Glu Lys 1 5 10 15 Phe Gly Glu Glu Thr Trp Glu Lys Leu Lys Ala Pro Ala Glu Val Gln 20 25 30 Asp Val Phe Met Thr Tyr Thr Val Tyr Asp Asp Ile Ile Thr Ile Lys 35 40 45 Leu Ile Gln Glu Ala Cys Lys Val Leu Asp Val Ser Met Glu Ala Ile 50 55 60 Leu Lys Leu Phe Gly Glu Tyr Phe Phe Lys Phe Cys Lys Met Ser Gly 65 70 75 80 Tyr Asp Arg Met Leu Arg Thr Leu Gly Gly Asn Leu Thr Glu Phe Ile 85 90 95 Glu Asn Leu Asp Ala Leu His Ser Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Gln Glu 100 105 110 Met Asn Ala Pro Ser Phe Arg Val Glu Glu Gly Ala Asp Gly Ala Met 115 120 125 Leu Leu His Tyr Tyr Ser Asp Arg His Gly Leu Cys His Ile Val Pro 130 135 140 Gly Ile Ile Glu Ala Val Ala Lys Asp Phe Phe Asp Thr Asp Val Ala 145 150 155 160 Met Ser Ile Leu Asp Met Asn Glu Glu Val Glu Arg Thr Gly Lys Lys 165 170 175 Glu His Val Val Phe Leu Val Val Gln Lys Ala His Arg Gln Ile Arg 180 185 190 Gly Ala Lys Ala Ser Arg Pro Gln Gly Ser Glu Asp Ser Gln Ala Asp 195 200 205 Gln Glu Ala Leu Gln Gly Thr Leu Leu Arg Met Lys Glu Arg Tyr Leu 210 215 220 Asn Ile Pro Val Cys Pro Gly Glu Lys Ser His Ser 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Claims (141)

  1. 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 암이 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암인 방법.
  3. 종양을 가진 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 종양 면역을 조정하는 것이 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반하는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반하는 것인 방법.
  9. 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 저산소 유도 인자 1α (HIF-1α) 및/또는 2α (HIF-2α)의 발현을 감소시키는 방법.
  10. 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 프로그래밍된 사멸 리간드-1 (PD-L1)의 발현을 감소시키는 방법.
  11. 개체에게 유효량의 O2 담체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2A 아데노신 수용체 (A2AR)의 발현을 감소시키는 방법.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 포유동물인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 포유동물이 애완동물, 실험실 연구 동물 또는 농장 동물인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 애완동물, 연구 동물 또는 농장 동물이 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 돼지 또는 소인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 정맥내, 동맥내, 종양내, 방광내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여에 의해 투여하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드의 투여를 반복하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드의 투여를 약 4주 내지 약 8주 동안 매일, 1일 2회 또는 1주 약 1-4회 반복하는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 약 1일 내지 약 10일의 기간 동안 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다 또는 24시간마다 투여하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 볼루스로서 투여하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 주입에 의해 투여하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 개체에 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간 또는 약 24시간 동안 주입하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 방사선 요법을 개체에게 O2 담체 폴리펩티드를 투여한지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24시간 후에 투여하는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 방사선이 X-방사선인 방법.
  27. 제26항에 있어서, X-방사선을 약 0.5 그레이 내지 약 75 그레이로 투여하는 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 방사선의 투여를 반복하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 투여를 약 2회 내지 약 40회 또는 그 초과 중 임의의 횟수로 반복하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 투여를 1주, 2주, 3주 또는 4주 또는 그 초과 후에 반복하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드를 화학요법 또는 면역요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 화학요법이 세포독소를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 화학요법의 투여를 반복하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 면역요법이 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 또는 면역 체크포인트 조절제를 표적화하는 작용제 중 1종 이상인 방법.
  35. 제31항 또는 제34항에 있어서, 면역요법이 CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 면역 체크포인트 조절제 중 1종 이상을 표적화하는 것인 방법.
  36. 제31항 또는 제34항에 있어서, 입양 면역 요법이 T 세포 또는 조작된 TCR-T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체인 방법.
  37. 제31항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드의 투여 및/또는 면역요법의 투여를 반복하는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드가 제약 조성물 중에 있는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제약 조성물이 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드가 H-NOX 단백질인 방법.
  41. 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 암이 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암인 방법.
  43. 종양을 가진 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 종양 면역을 조정하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 종양 면역을 조정하는 것이 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  45. 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반하는 것인 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반하는 것인 방법.
  49. 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 발현을 감소시키는 방법.
  50. 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 PD-L1의 발현을 감소시키는 방법.
  51. 개체에게 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 내의 A2AR의 발현을 감소시키는 방법.
  52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양인 방법.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 포유동물인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  55. 제52항에 있어서, 포유동물이 애완동물, 실험실 연구 동물 또는 농장 동물인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 애완동물, 연구 동물 또는 농장 동물이 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 돼지 또는 소인 방법.
  57. 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질을 정맥내, 동맥내, 종양내, 방광내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 경점막, 안내, 척수강내 또는 경피 투여에 의해 투여하는 것인 방법.
  58. 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 투여를 반복하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, H-NOX 단백질의 투여를 약 4주 내지 약 8주 동안 매일 또는 1일 2회 반복하는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, H-NOX 단백질을 약 1일 내지 약 10일의 기간 동안 4시간마다, 8시간마다, 12시간마다 또는 24시간마다 투여하는 것인 방법.
  61. 제41항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질을 볼루스로서 투여하는 것인 방법.
  62. 제41항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질을 주입에 의해 투여하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, H-NOX 단백질을 개체에 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간 또는 약 24시간 동안 주입하는 것인 방법.
  64. 제41항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질을 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 방사선 요법을 개체에게 H-NOX 단백질을 투여한지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 후에 투여하는 것인 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 방사선이 X-방사선인 방법.
  67. 제66항에 있어서, X-방사선을 약 0.5 그레이 내지 약 75 그레이로 투여하는 것인 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 방사선의 투여를 반복하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 투여를 약 2회 내지 약 40회 또는 그 초과 중 임의의 횟수로 반복하는 것인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 투여를 1주, 2주, 3주 또는 4주 또는 그 초과 후에 반복하는 것인 방법.
  71. 제41항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질을 화학요법 또는 면역요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 화학요법이 세포독소를 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 화학요법의 투여를 반복하는 것인 방법.
  74. 제71항에 있어서, 면역요법이 항암 백신, 입양 면역 세포 요법, 또는 면역 체크포인트 조절제를 표적화하는 작용제 중 1종 이상인 방법.
  75. 제71항 또는 제74항에 있어서, 면역요법이 CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 면역 체크포인트 조절제 중 1종 이상을 표적화하는 것인 방법.
  76. 제71항, 제74항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 입양 면역 요법이 T 세포 또는 조작된 TCR-T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체인 방법.
  77. 제71항 및 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 투여 및/또는 면역요법의 투여를 반복하는 것인 방법.
  78. 제41항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 티. 텡콘겐시스(T. tengcongensis) H-NOX, 엘. 뉴모필라(L. pneumophilia) 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스(H. sapiens) β1, 알. 노르베기쿠스(R. norvegicus) β1, 씨. 루푸스(C. lupus) H-NOX, 디. 멜란가스테르(D. melangaster) β1, 디. 멜란가스테르 CG14885-PA, 씨. 엘레간스(C. elegans) GCY-35, 엔. 푼크티포르메(N. punctiforme) H-NOX, 씨. 크레센투스(C. crescentus) H-NOX, 에스. 오네이덴시스(S. oneidensis) H-NOX, 또는 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) H-NOX인 방법.
  79. 제41항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 서열식별번호:2에 기재된 티. 텡콘겐시스의 H-NOX 도메인에 상응하는 H-NOX 도메인을 포함하는 것인 방법.
  80. 제41항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX가 1개 이상의 원위 포켓 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 원위 포켓 돌연변이가 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144에 상응하는 부위에서의 아미노산 치환인 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, H-NOX가 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘겐시스 H-NOX인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 위치 144에서의 아미노산 치환이 L144F 치환인 방법.
  84. 제41항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 중합체성 H-NOX 단백질인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 중합체성 H-NOX 단백질이 단량체를 포함하고, 여기서 단량체가 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, H-NOX 도메인이 중합 도메인에 공유 연결된 것인 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 H-NOX 단백질이 삼량체성 H-NOX 단백질인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 삼량체성 H-NOX 단백질이 1개 이상의 삼량체화 도메인을 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 삼량체성 H-NOX 단백질이 3종의 단량체를 포함하고, 여기서 단량체가 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 여기서 삼량체화 도메인이 박테리오파지 T4 삼량체화 도메인인 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 삼량체화 도메인이 폴드온 도메인인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 폴드온 도메인이 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  92. 제41항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 이뮤노글로불린의 Fc 도메인에 융합된 것인 방법.
  93. 제41항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것인 방법.
  94. 제41항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 2 자릿수 이내이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 것인 방법.
  95. 제41항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM인 방법.
  96. 제41항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
  97. 제41항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM인 방법.
  98. 제41항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 20℃에서 약 700 s-1 미만인 방법.
  99. 제41항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 100배 더 낮은 것인 방법.
  100. 제99항에 있어서, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 1,000배 더 낮은 것인 방법.
  101. 제41항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.65 s-1 이하인 방법.
  102. 제41항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1인 방법.
  103. 제41항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1인 방법.
  104. 제41항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질의 헴 자가산화 속도가 37℃에서 약 1 h-1 미만인 방법.
  105. 제41항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 제약 조성물 중에 있는 것인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 제약 조성물이 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
  107. 개체에서 암을 치료하기 위한 O2 담체 단백질의 용도.
  108. 제107항에 있어서, 암이 뇌암, 교모세포종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 폐암, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 항문암, 간암, 간세포 암종, 위암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 장암, 갑상선암, 부신암, 방광암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 육종 또는 편평 세포암인 용도.
  109. 개체에서 종양 면역을 조정하기 위한 O2 담체 단백질의 용도.
  110. 제109항에 있어서, 종양 면역을 조정하는 것이 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 것인 용도.
  111. 개체에서 종양으로의 림프구 침윤을 증가시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도.
  112. 제111항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 CD4 세포, CD8 세포 또는 NK 세포 중 1종 이상의 침윤의 증가를 포함하는 것인 용도.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양에서 Treg 세포, 종양 연관 대식세포 또는 골수 유래 억제 세포 중 1종 이상의 억제를 동반하는 것인 용도.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 종양으로의 림프구 침윤의 증가가 종양 세포 상에서 MHC1 발현의 증가를 동반하는 것인 용도.
  115. 개체에서 종양 내의 HIF-1α 및/또는 HIF-2α의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도.
  116. 개체에서 종양 내의 PD-L1의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도.
  117. 개체에서 종양 내의 A2AR의 발현을 감소시키기 위한 O2 담체 폴리펩티드의 용도.
  118. 제109항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 뇌 종양, 교모세포종, 골 종양, 췌장 종양, 피부 종양, 두경부 종양, 흑색종, 폐 종양, 자궁 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 항문 종양, 간 종양, 간세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 자궁내막 종양, 자궁경부 종양, 질 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 식도 종양, 장 종양, 갑상선 종양, 부신 종양, 방광 종양, 신장 종양, 유방 종양, 다발성 골수종 종양, 육종 또는 편평 세포 종양인 용도.
  119. 제107항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 포유동물인 용도.
  120. 제119항에 있어서, 포유동물이 인간인 용도.
  121. 제107항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, O2 담체 폴리펩티드가 H-NOX 단백질인 용도.
  122. 제121항에 있어서, H-NOX 단백질이 티. 텡콘겐시스 H-NOX, 엘. 뉴모필라 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베기쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX 도메인, 디. 멜란가스테르 β1, 디. 멜란가스테르 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 푼크티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부틸리쿰 H-NOX인 용도.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, H-NOX 단백질이 서열식별번호:2에 기재된 티. 텡콘겐시스의 H-NOX 도메인에 상응하는 H-NOX 도메인을 포함하는 것인 용도.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX가 1개 이상의 원위 포켓 돌연변이를 포함하는 것인 용도.
  125. 제124항에 있어서, 원위 포켓 돌연변이가 티. 텡콘겐시스 H-NOX의 L144에 상응하는 부위에서의 아미노산 치환인 용도.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, H-NOX가 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘겐시스 H-NOX인 용도.
  127. 제126항에 있어서, 위치 144에서의 아미노산 치환이 L144F 치환인 용도.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 중합체성 H-NOX 단백질인 용도.
  129. 제128항에 있어서, 중합체성 H-NOX 단백질이 단량체를 포함하고, 여기서 단량체가 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 것인 용도.
  130. 제129항에 있어서, H-NOX 도메인이 중합 도메인에 공유 연결된 것인 용도.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 H-NOX 단백질이 삼량체성 H-NOX 단백질인 용도.
  132. 제131항에 있어서, 삼량체성 H-NOX 단백질이 1개 이상의 삼량체화 도메인을 포함하는 것인 용도.
  133. 제132항에 있어서, 삼량체성 H-NOX 단백질이 3종의 단량체를 포함하고, 여기서 단량체가 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 여기서 삼량체화 도메인이 박테리오파지 T4 삼량체화 도메인인 용도.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 삼량체화 도메인이 폴드온 도메인인 용도.
  135. 제134항에 있어서, 폴드온 도메인이 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
  136. 제131항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 이뮤노글로불린의 Fc 도메인에 융합된 것인 용도.
  137. 제121항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, H-NOX 단백질이 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것인 용도.
  138. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 O2 담체 단백질을 포함하는, 개체에서 종양 면역을 조정하기 위한 키트.
  139. 제138항에 있어서, 바이알, 용기, 앰풀, 병, 단지 또는 가요성 포장 중 1종 이상을 추가로 포함하는 키트.
  140. 제138항 또는 제139항에 있어서, 1종 이상의 완충제를 추가로 포함하는 키트.
  141. 제138항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 사용에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
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