ES2305837T3 - Procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular en una celula gracias a unas proteinas marcadoras fluorescentes. - Google Patents

Procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular en una celula gracias a unas proteinas marcadoras fluorescentes. Download PDF

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Abstract

Procedimiento de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular en una célula, caracterizado porque: - se detecta: o bien la presencia de una proteína marcadora "solubilizada", es decir en forma de proteína libre en el citosol celular, siendo dicha proteína, que es un marcador directo o indirecto de la aparición del acontecimiento molecular particular, inicialmente "fijada" por anclaje subcelular o por compartimentación a nivel subcelular, o bien la presencia de una proteína marcadora "fijada", siendo dicha proteína marcadora inicialmente "solubilizada", - proteína marcadora que está presente en la célula antes de la detección anterior, - siendo la célula, antes de la detección, sometida a una permeabilización de la membrana plasmática que libera la proteína solubilizada en el medio extracelular, - siendo la presencia de la proteína marcadora detectada entonces en la célula o el medio extracelular mediante cualquier medio apropiado, lo que permite determinar si la solubilización, respectivamente la fijación, han tenido lugar y por lo tanto el acontecimiento molecular correspondiente.

Description

Procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular en una célula gracias a unas proteínas marcadoras fluorescentes.
La presente invención se refiere a un procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular particular tal como la apoptosis en una célula viva.
La puesta en evidencia de un acontecimiento molecular particular tal como la apoptosis en una célula viva utiliza habitualmente un cierto número de técnicas tales como la detección por "Western blot" o inmunofluorescencia de proteínas marcadoras tal como la proteína Bax o las caspasas activadas que están implicadas en los fenómenos de apoptosis.
Por ejemplo, en el caso de las caspasas, los procedimientos para medir la activación de estas proteínas en las células son esencialmente bastante complejos y largos de poner en práctica.
Así, en el procedimiento "Western Blot", que es el procedimiento habitual de observación de la activación de las caspasas, se utilizan los anticuerpos dirigidos contra las proteínas que son sustratos de las caspasas (Parp, la propia caspasa), y se detecta la aparición de las bandas de peso molecular correspondiente al producto de proteolisis correspondiente.
La técnica es laboriosa, implica numerosas etapas preparatorias y solo permite medir la activación de las caspasas sobre una población celular y no sobre las células individuales.
La técnica de inmunofluorescencia emplea unos anticuerpos que reconocen de forma específica la forma activa de la caspasa y que pueden ser utilizados para detectarla a nivel unicelular sobre unas células fijadas. Esta técnica permite la detección sobre células individuales pero es laboriosa e implica numerosas etapas preparatorias.
También se utilizan unas técnicas que emplean unas sondas fluorescentes químicas. En el comercio existen diferentes tipos, en general se trata de los productos químicos que tienen una gran afinidad por el sitio activo de la proteasa y que emiten una señal fluorescente una vez fijados a la caspasa. Estas sondas son capaces de penetrar en las células y pueden permitir la medición de la actividad de las caspasas por microscopía de fluorescencia y/o por citometría. Sin embargo, su límite está asociado con el protocolo de carga y con el coste que impide su utilización en ensayos a medio o a gran caudal.
Por último, las sondas recombinantes basadas en la tecnología FRET, que utilizan unas sondas obtenidas por ingeniería genética que se pueden introducir en las células por transfección transitoria o estable. Estas sondas están constituidas por unas proteínas fluorescentes (que son unos mutantes espectrales de la GFP) y la señal detectada es producida por el fenómeno de transferencia de energía de fluorescencia. El principio es que dos GFP mutantes fusionados en tándem y separados por un enlace que contiene la secuencia de escisión de la sonda produce una señal de transferencia fluorescente (emisión de la molécula receptora mediante la excitación de la molécula donante puesto que éstas interactúan entre sí). Si la caspasa corta el enlace, las dos proteínas se alejan y la señal desaparece.
Estas sondas han sido el objeto de algunas publicaciones recientes pero la dificultad es detectar la señal Fret (la necesidad de utilizar unos filtros adaptados en microscopía y en citometría limita su uso).
El documento Wolter et al. (J.Cell Biol.. 1 dic. 1997; 139 (5): 1281-92.) describe que en las células en curso de apoptosis, se modifica la localización intracelular de la proteína Bax. Se muestra que la proteína Bax fusionada con una proteína fluorescente (GFP-Bax) normalmente es soluble y se encuentra difusa en el conjunto del citosol. Después de la inducción de la apoptosis, se produce una redistribución puntual de GFP-Bax, mitocondrial.
El documento Abdulkarim et al. (Oncogene 17 abr. 2003 22 (15): 2260-71.) describe que el tratamiento combinado de Cidofovir y radiación ionizante en los ratones "nude" provoca una remisión tumoral completa sin aumentar la toxicidad en dos xenoinjertos cancerosos relacionados con el EBV humano (Raji y C15). Las células Raji (BL) y C15 (NPC) contienen la proteína Bax proapotótica.
El documento Ayukawa et al. (J Biol Chem. 3 nov. 2000; 275 (44): 34465-70) describe que el autoantígeno La es escindido a nivel de su señal de localización nuclear COOH-terminal durante la apoptosis. La pérdida de esta señal de localización nuclear provoca la redistribución de la proteína La del núcleo hacia el citoplasma.
Ninguno de estos documentos describe ni sugiere el procedimiento según la presente invención de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular. Asimismo ninguno de estos documentos describe ni sugiere la proteína marcador según la presente invención, útil en la realización del procedimiento.
El procedimiento según la presente invención tiene por objeto la detección de acontecimientos moleculares particulares en una célula sin utilizar las tecnologías anteriores pero pudiendo utilizar la microscopía y la citometría sin que sean necesarias unas preparaciones largas o la utilización de reactivos particularmente costosos.
En efecto, como se constatará, el procedimiento según la presente invención no necesita ninguna preparación complicada de la muestra.
El coste es muy bajo puesto que la sonda puede ser fabricada por la misma célula y se puede realizar la medición sobre la célula única por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
Es posible fabricar unos animales transgénicos con este tipo de tecnología y existe la posibilidad de realizar unas transferencias de este ensayo sobre unas microplacas con el fin de crear unas plataformas de gran caudal.
El procedimiento de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular en una célula según la presente invención se caracteriza porque:
-
se detecta:
o bien la presencia de una proteína marcadora "solubilizada", es decir en forma de proteína libre en el citosol celular, siendo dicha proteína, que es un marcador directo o indirecto de la aparición del acontecimiento molecular particular, "fijada" inicialmente por anclado subcelular o por compartimentación a nivel subcelular,
o bien la presencia de una proteína marcadora "fijada", estando inicialmente dicha proteína marcador "solubilizada"
-
proteína marcador que está presente en la célula antes de la detección anterior,
-
siendo la célula, antes de la detección, sometida a una permeabilización de la membrana plásmatica que libera la proteína solubilizada en el medio extracelular,
-
siendo entonces detectada la presencia de la proteína marcadora en la célula o el medio extracelular mediante cualquier medio apropiado, lo que permite determinar si la solubilización, respectivamente la fijación, han tenido lugar y por lo tanto ha tenido lugar el acontecimiento molecular correspondiente.
La proteína marcadora está constituida casi siempre por un componente sensible que será sometido a solubilización (o fijación) y por un componente indicador que permite la detección. Como se verá, de trata a menudo de una proteína fluorescente.
El componente sensible puede ser una proteína que está asociada directamente con el acontecimiento molecular que se desea observar, es decir que es precisamente su solubilización o su fijación lo que constituye el acontecimiento molecular que se desea medir, o bien puede ser una proteína asociada indirectamente al acontecimiento molecular a medir y susceptible de ser sometida a una solubilización o una fijación a consecuencia de la inducción de este acontecimiento molecular; este es el caso, por ejemplo, de la proteolisis inducida por las caspasas durante la
apoptosis
En cualquier caso, la proteína componente sensible debe de ser sometida a una solubilización, respectivamente a una fijación, cuando se produce el acontecimiento molecular.
Se entiende, en la presente descripción, designar por "fijación" de una proteína, el anclaje subcelular, por ejemplo membranario, nuclear, a nivel del espacio mitocondrial intermembranario, etc..., y preferentemente membranario, o la compartimentación a nivel subcelular de dicha proteína de tal forma que la proteína no se pueda difundir en el medio extracelular durante la permeabilización de la célula. Asimismo, por "solubilización" celular de la proteína se entiende designar la presencia de la proteína marcadora en forma de proteína libre en el citosol celular, de tal manera que la proteína pueda ser difundida en el medio exterior durante la permeabilización de la célula.
Cuando se realiza la permeabilización selectiva de la membrana plásmatica, si se fija la proteína marcadora, es decir si está anclada a nivel subcelular, en particular sobre una membrana compartimentada, va a permanecer fijada en la célula y no va a pasar al medio extracelular; por el contrario, si la proteína es soluble, es decir está presente en el citosol, va a emigrar al medio extracelular. En estas condiciones, se observará en el primer caso una célula marcada, y en el segundo caso una célula no marcada.
Siendo preferentemente el marcado de la célula un marcado por fluorescencia, entonces es fácil detectar por microscopía de fluorescencia o por citometría las células marcadas y no marcadas. Esto no precisa ninguna preparación de la muestra, a excepción de la permeabilización.
Teóricamente es posible utilizar otros tipos de marcado que permitirían distinguir la presencia de la proteína marcadora en la célula o, por el contrario, su ausencia, pero lo cierto es que, teniendo en cuenta el desarrollo de las técnicas de fluorescencia, esta técnica será la preferida.
La permeabilización selectiva de la membrana plasmática desemboca por lo tanto, en una población celular que expresa de forma homogénea el marcado, en la discriminación de las células en las que el acontecimiento molecular ha tenido lugar puesto que se mantendrá la señal fluorescente (o se perderá respectivamente) específicamente en esta subpoblación celular.
El análisis por citometría de flujo permite evaluar de forma cuantitativa el porcentaje de la población celular en la que el acontecimiento molecular medido ha tenido lugar y proporciona un ensayo simple para evaluar el efecto activador o inhibidor de las drogas que interactúan con dicho acontecimiento molecular.
El enfoque descrito en este caso sólo necesita una manipulación experimental muy reducida (ni fraccionamiento, ni procedimientos de fijación y de incubación con anticuerpos, ni electroforesis, ni microscopía). El tiempo acumulado de recuperación de las células, de permeabilización, y de análisis es inferior a 30 minutos (varias horas incluso días para las otras técnicas).
Esta técnica permite la medición del parámetro de interés en el seno de la célula sin inducir artefactos relacionados con el fraccionamiento (WB) o con la fijación y con la utilización de detergentes a dosis elevadas (inmunofluorescencia).
Por último, esta técnica presenta un coste experimental mínimo (ni reactivos, ni anticuerpos).
Se puede producir la proteína marcadora de forma transitoria en la célula gracias a un vector de expresión de dicha proteína, pero también es posible prever la expresión constitutiva de esta proteína marcadora en las descendencias celulares o los animales transgénicos que podrán así volverse unas herramientas de detección del acontecimiento molecular. Por ejemplo en el caso de la apoptosis, estas herramientas permitirán ensayar los productos que tienen unas propiedades pro o antiapoptóticas sin tener que realizar las transfecciones mediante unos vectores apropiados para cada ensayo.
La técnica que permite la expresión de una proteína marcadora es conocida en la técnica anterior, los plásmidos o vectores que se pueden utilizar dependerán, evidentemente, de la célula, así como los promotores y los diferentes elementos de regulación de la expresión.
Asimismo, se conocen las técnicas que permiten la expresión constitutiva de una proteína marcadora, consisten en introducir en uno de los cromosomas de la célula un sistema de expresión estable o inducible de la proteína marcadora mediante, por ejemplo, unos procedimientos de tipo recombinatorio.
En un modo de realización preferido del procedimiento de la invención, la proteína marcadora está constituida por una proteína de fusión que comprende:
-
una proteína sensible propiamente dicha que es sometida a una solubilización, respectivamente a una fijación, durante la aparición del acontecimiento molecular,
-
un fragmento fluorescente, en particular una proteína fluorescente: "green fluorescent protein", "red fluorescent protein" o cualquier molécula de la que se deriva o que posee unas propiedades similares de fluorescencia.
En los ejemplos, se han utilizado las proteínas EGFP, DsRed2, HcRed y copGFP, pero se pueden utilizar otras proteínas como los mutantes espectrales de las proteínas anteriores.
Se puede, de forma general, considerar que las proteínas marcadoras serán de dos tipos, un primer tipo en el que el componente sensible está constituido por el elemento proteico que es sometido a la solubilización o a la fijación, siendo este acontecimiento molecular lo que se quiere medir directamente. Este es el caso, por ejemplo, de Bax, como se describirá de forma más completa a continuación. En el otro tipo de proteína marcadora, el componente sensible puede ser un fragmento proteico que es solubilizado o fijado como consecuencia de la interacción con la proteína que sufre el acontecimiento molecular que se desea medir. Este es el caso, por ejemplo, de la activación de las caspasas: la proteína marcadora será una proteína de fusión que comprende el lugar de escisión de la proteasa y, a ambos lados de este lugar de escisión, un lugar de anclaje a la membrana y una proteína fluorescente. Así, durante la activación de la proteasa, el componente indicador, es decir la proteína fluorescente, será solubilizado por
escisión.
En este último caso, se podrá seleccionar en particular la proteína de anclaje de entre los dominios transmembranarios conocidos, podrá tratarse en particular de un dominio transmembranario exógeno fusionado con el extremo de la proteína fluorescente por medio de un enlace que comprenderá el lugar de escisión de la proteasa.
En lo que sigue y en los ejemplos, el dominio transmembranario que ha sido ensayado es un campo corto C-terminal presente en la clase de proteínas denominada "TA proteína" (Tail Anchored proteins). Se ha conferido a esta porción transmembranaria una especificidad mitocondrial por mutación pero es posible utilizar otras casetes proteicas de anclaje en la membrana, por ejemplo el dominio transmembranario con la N-terminal, por ejemplo secuencia de miristilación o de palmitoilación, o dirigido a otras membranas (membrana plasmática, membrana del retículo endotelial, por ejemplo Golgi), siempre que la parte fluorescente permanezca expuesta en el citosol.
Se puede aplicar la técnica a unas proteínas provistas naturalmente de esta propiedad o a unas proteínas construidas artificialmente para estos fines.
La presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular, y esto, utilizando una proteína marcadora.
Como se describe en los ejemplos siguientes, se puede realizar el procedimiento objeto de la invención acoplando la puesta en evidencia de la aparición del acontecimiento molecular a la medición del ciclo celular, en particular la medición de la distribución de la población celular en las diferentes fases del ciclo celular.
En particular, se puede realizar un acoplamiento de este tipo cuando el acontecimiento molecular a detectar es la activación de Bax (véase el ejemplo 6a siguiente), o la activación de una caspasa del tipo caspasa 3 (véase el ejemplo 6a).
Pero la presente invención se refiere asimismo:
-
a las proteínas marcadoras útiles en la realización de este procedimiento y que comprenden una componente sensible que será sometida a la solubilización (la fijación) y una componente indicadora que permitirá la detección, caracterizadas porque la secuencia de la componente sensible es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13; y/o la secuencia de la componente sensible comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.
Se tratará preferentemente de una proteína de fusión en la que la componente indicadora es una proteína fluorescente, como se ha mencionado anteriormente.
La invención se refiere asimismo a:
-
los vectores que expresan, en un entorno celular apropiado, una de las proteínas marcadoras mencionadas, es decir cuya secuencia de la componente sensible es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº1 a 14,
-
las células transformadas que expresan una de las proteínas marcadoras mencionadas de forma estable o transitoria, pudiendo ser dichas células unas células tumorales, preferentemente unas células tumorales humanas.
La invención se refiere a unos animales transgénicos no humanos de los que al menos un cierto tipo de células expresa una de las proteínas marcadoras mencionadas.
La invención se refiere asimismo a un kit de realización del procedimiento según uno de los modos de realización anteriores, que comprende:
-
unas células transformadas mencionadas anteriormente: y/o
-
un vector mencionado anteriormente; y/o
-
un animal transgénico mencionado anteriormente
tal como los mencionados anteriormente.
La invención tiene además por objeto un procedimiento para evaluar la actividad de un compuesto anticanceroso candidato.
Un procedimiento de este tipo comprende la realización de un procedimiento de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular en una célula tumoral, preferentemente de origen humano, transformada que expresa una proteína marcadora.
En el marco de la invención, un "compuesto" es definido como cualquier tipo de molécula, biológica o química, natural, recombinante o sintética. Por ejemplo, un compuesto puede ser un ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido), una proteína, un ácido graso, un anticuerpo, un polisacárido, un esteroide, una purina, una pirimidina, una molécula orgánica, un radical químico, etc... El término "compuesto" abarca también los fragmentos, derivados, análogos estructurales o combinaciones de estos compuestos.
Una célula eucariota explota diferentes estrategias para activar de forma apropiada las vías de transducción de la señal en respuesta a los stimuli específicos. Además del control del tipo transcripcional (la molécula activa es sintetizada de novo) o postraduccional (la molécula señal ya presente es sometida a una modificación que la vuelve activa (por ejemplo una proteolisis o una fosforilación) o por interacción proteína-proteína, la célula en ciertos casos pone en práctica una estrategia de compartimentalización: la molécula activa está ya expresada en la célula, pero está capturada en un compartimento subcelular en donde no puede ejercer su actividad (por ejemplo liberación de los factores proapoptósicos de la matriz mitocondrial, recogida de factor en la membrana plasmática).
En ciertos casos, este tipo de estrategia comprende no solamente un cambio de distribución intracelular sino también un cambio de solubilidad de la proteína que puede estar en forma citosólica soluble en su forma inactiva y membranaria en su forma activa, o viceversa (por ejemplo proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2, factores de transcripción activados por el retículo endoplasmático). Este tipo de acontecimiento puede ser por lo tanto puesto en evidencia por microscopía y por citometría de flujo gracias a la construcción de una proteína de fusión con una proteína fluorescente (véase el ejemplo siguiente: sonda para medir la activación de Bax).
De la misma manera, es posible aplicar este tipo de enfoque a la utilización de proteínas marcadoras a las que se ha dado artificialmente la propiedad de cambiar de fase respecto a la señal a medir. En particular, se pueden construir unas proteínas marcadoras recombinantes para medir la actividad de las proteasas intracelulares. En estas proteínas marcadoras, la proteína fluorescente es enganchada a una membrana intracelular por fusión con un dominio transmembranario mediante una secuencia enlace que contiene el lugar de escisión de la proteasa de la que se quiere medir la actividad. Se ha considerado este tipo de enfoque con la sonda de caspasa 3 descrita en los ejemplos.
La etapa de permeabilización no es teóricamente indispensable, en efecto es posible, por ejemplo, por microscopía de fluorescencia detectar la presencia de la fluorescencia, o bien en el citosol, o bien sobre las membranas o en los compartimentos en los que está fijada, sin embargo la permeabilización de las células permite una automatización del proceso y constituye el modo de realización preferido de la presente invención.
Con el fin de permitir una liberación en forma soluble en el medio extracelular de la proteína marcadora fluorescente, se pueden utilizar todas las tecnologías apropiadas y conocidas por el experto en la materia. Se preferirá utilizar en particular la permeabilización con digitonina a unas concentraciones comprendidas entre 1 y 100 \muM/ml y preferentemente entre 5 y 50 \muM/ml, pero también es posible utilizar otros detergentes tal como las saponinas a muy bajas dosis por ejemplo 0,5 a 10 \muM/ml, preferentemente del orden de 1 \muM., la streptolisina 0 (20-500 ng/ml) o unos ciclos de congelación/descongelación.
Esto permite realizar una detección, por ejemplo por citometría de flujo que es evidentemente mucho más sensible y automatizable que las otras técnicas, aunque estas últimas también se puedan utilizar, por ejemplo un lector de microplacas, un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal.
Los procedimientos según la presente invención son interesantes en la puesta en evidencia de un gran número de fenómenos moleculares pero, en particular, en el estudio de las propiedades antiapoptóticas o proapotóticas de moléculas destinadas a ser utilizadas como medicamentos.
La apoptosis es un proceso de muerte celular muy conservado y regulado, constituido por una cascada de acontecimientos moleculares que llevan la célula a la degradación y a la muerte (1). Los disfuncionamientos de la apoptosis están en el origen de numerosos cánceres (falta de apoptosis) y están implicados en la patogenia de los procesos neurodegenerativos (exceso de apoptosis) (1).
La fase final de la apoptosis está constituida por la degradación de las estructuras celulares, por una parte por efecto de la activación de una clase específica de "cisteína proteasas", las caspasas, y por otra parte por la activación de endonucleasas que degradan la cromatina nuclear (1).
Una célula que es sometida al procedimiento de muerte celular programada se caracteriza por numerosas señales morfológicas y bioquímicas más o menos específicas. Ciertas modificaciones morfológicas poco específicas son fácilmente detectables por simple observación por microscopía óptica tales como la condensación celular, la formación de "blebs" sobre la membrana plasmática, o la aparición de una permeabilidad de esta última al yoduro de propidio. Ciertos colorantes nucleares (Hoechst, Dapi) que revelan la morfología del núcleo, permiten visualizar la degradación/condensación de la cromatina. Este último parámetro también es detectable por electroforesis del material genómico de una población celular con aparición del aspecto típico en "barras de escalera de mano" (DNA ladder), y a nivel unicelular por microscopía y citometría de flujo gracias al principio del TUNEL, marcado colorimétrico o fluorescente que titula la cantidad de extremos libres de ADN producidos por la acción de las endonucleasas apoptóticas. Entre las otras señales medidas generalmente, se cuentan: la activación de las caspasas (Western Blot, citometría de flujo), la proteolisis de los sustratos de las caspasas activadas (Western Blot), y la exposición de la fosfatidilserina sobre la hoja externa de la membrana plasmática (citometría de flujo).
Corriente arriba de los procedimientos descritos anteriormente, existen diferentes vías de señalización intracelular que empujan la célula a entrar en un proceso de autodestrucción (es la iniciación de la apoptosis): estos stimuli de inducción apoptótica son diversos, y las cascadas de señalización intracelular que les corresponden pueden variar según el estímulo inductor y/o el modelo celular.
Algunos de estos acontecimientos moleculares precoces representan unas etapas clave proapotóticas, y la posibilidad de detectarlos específicamente con una buena sensibilidad abre por ejemplo la vía al sccreening de compuestos activo anti- o proapoptóticos.
La relocalización de la proteína Bax del citosol en la membrana de las mitocondrias es un acontecimiento precoz y genérico durante la señalización de la apoptosis (2). La relocalización de Bax, seguida de una homo-oligomerización, es la causa de la liberación del citocromo c que provoca sin posibilidad de retorno la muerte de la célula provocando la activación de la caspasa 9, y después la de la caspasa 3 (2). Bax es una proteína citosólica globular cuya estructura primaria le permite ser clasificada en la familia de las Bcl-2. Los trabajos de Youle (2) han contribuido ampliamente a la compresión de la función desempeñada por los diferentes dominios de Bax en su relocalización y su redistribución, aunque su estructura secundaria era desconocida hasta el estudio de Tjandra que ha permitido su esclarecimiento por resonancia magnética nuclear (RMN) (2). La confirmación del dominio C-terminal de Bax, constituido por la hélice \alpha9 que comprende 22 residuos se ha revelado de una importancia capital. En la forma soluble citosólica de la proteína, esta hélice descansa en una cavidad hidrófoba y la relocalización depende de un cambio de la conformación de Bax que expone la hélice fuera de la bolsa hidrófoba: el dominio C-terminal de Bax "expuesto" posee entonces un tropismo para la membrana mitocondrial. Este es el cambio de conformación que puede ser puesto en evidencia por el procedimiento según la invención, como se describirá en los ejemplos.
Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la lectura de los siguientes ejemplos y haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
- la figura 1 representa una microscopía de fluorescencia de un clon celular humano (clon 10) obtenido a partir de una descendencia HeLa que expresa de forma estable la proteína quimérica GFP-Bax en T= 0 y T= 300 s sin permeabilización y con permeabilización a la digitonina y las curvas correspondientes a los puntos a, b y c;
- las figuras 2, A, B y C, muestran unos perfiles de fluorescencia de la población de clon 10 en diversas condiciones (véanse los ejemplos);
- las figuras 3, A y b, representan la variación de activación de Bax en diversas condiciones (véanse los ejemplos);
- la figura 4 representa un histograma de la activación de Bax en diversas condiciones (véanse los ejemplos);
- la figura 5 representa el plásmido pEGFP-Bax;
- la figura 6 representa la cuantificación de la caspasa 3;
- la figura 7 ilustra la puesta a punto de una sonda de caspasa 3 anclada en la cara interna de la membrana plasmática.
a)
Representación esquemática de la proteína de fusión GFP-DEVD-SNAP(80-136), y
b)
del control no escindible (misma proteína de fusión sin lugar consensus para la proteasa).
c)
liberación de la proteína fluorescente en el citosol como consecuencia de su escisión observada por microscopía confocal en dos células de neuroblastoma humano SH-SY5Y transfectadas de manera transitoria y tratadas con estaurosporina.
d)
medición por citometría de flujo, del porcentaje de células que presentan una caspasa 3 activada en una población de células humanas HeLa transfectadas transitoriamente con la proteína GFP-DEVD-SNAP (80-136),
- la figura 8 ilustra la puesta a punto de una sonda de caspasa 3 anclada en la cara externa de la membrana mitocondrial interna.
a)
Representación esquemática de la proteína de fusión GFP-DEVD-ANT2 y
b)
del control no escindible (misma proteína de fusión sin lugar consensus para la proteasa).
c)
Localización mitocondrial de la proteína de fusión (GFP-DEVD-ANT) en unas células de simio COS-7 cotransfectadas con un marcador mitocondrial específico (mt-dsRed2).
d)
Detección por citometría de flujo de la escisión de la proteína de fusión GFP-DEVD-ANT2 comparada con el control no escindible y con la proteína GFP-DEVD-cb5TMRR en unas células HeLa transfectadas transitoriamente y en las que la apoptosis ha sido inducida mediante diferentes stimuli (Estaurosporina 1 \muM o UV 200 mJ/cm^{2}).
e)
Liberación de la proteína fluorescente en el citosol como consecuencia de su escisión observada por microscopía confocal en dos células humanas HeLa cotransfectadas de manera transitoria con GFP-DEVD-ANT y HcRed-DEVD-Cb5RR y tratadas con estaurosporina. Se realiza la cuantificación de la escisión y de la difusión de la señal fluorescente en el citosol midiendo el aumento de la señal fluorescente respectivamente verde y rojo en una región del núcleo.
- la figura 9 ilustra la puesta a punto de una sonda de caspasa 3 con anclaje nuclear.
a)
Representación esquemática de la proteína de fusión H2B-DEVD-GFP y
b)
del control no escindible (misma proteína de fusión sin lugar consensus para la proteasa).
c)
Distribución de la proteína fluorescente en unas células humanas HeLa transfectadas de forma transitoria: a la izquierda células no tratadas (distribución nuclear), a la derecha células tratadas con estaurosporina (distribución citosólica).
d)
Liberación de la proteína fluorescente en el citosol como consecuencia de su escisión, observada por microscopía confocal en una célula HeLa cotransfectada de forma transitoria con H2B-DEVD-GFP y HcRed-DEVD-Cb5RR (sonda de caspasa 3 anclada en la membrana mitocondrial externa) y tratadas con la estaurosporina. Se realiza la cuantificación de la escisión y de la difusión de la señal fluorescente respectivamente del núcleo al citosol para la proteína H2B-DEVD-GFP y del citosol al núcleo para la proteína HcRed-DEVD-cb5 midiendo el aumento de la señal fluorescente respectivamente, verde en una región citosólica de la célula, y roja en una región del núcleo.
e)
Evaluación por citometría de flujo de la funcionalidad de la sonda por cuantificación del porcentaje de retención de la fluorescencia después de la permeabilización en una población de células HeLa transfectadas transitoriamente con la proteína H2B-DEVD-GFP y su control no escindible.
- la figura 10 ilustra la puesta a punto de sondas para medir la actividad de las caspasas 8 y 2.
a)
Representación esquemática de la proteína de fusión GFP-IETD-cb5-TMD-RR y
b)
GFP-IETD-SNAP (80-136).
c)
Evaluación por citometría de flujo de la funcionalidad de la sonda por cuantificación del porcentaje de retención de la fluorescencia en una población de células HeLa transfectadas transitoriamente con la proteína GFP-IETD-cb5-TMD-RR y GFP-IETD-SNAP(10-136) y tratadas con TNFalfa.
d)
Representación esquemática de la proteína de fusión GFP-IETD-H2B.
e)
Distribución de la proteína fluorescente en unas células HeLA transfectadas de forma transitoria: a la izquierda células no tratadas (distribución nuclear), a la derecha, las mismas células tratadas 3 horas con la estaurosporina (distribución citosólica).
- la figura 11 representa la medición acoplada de la activación de Bax y del ciclo celular.
Las células del clon 10 que expresan de forma estable la proteína de fusión GFP-Bax son tratadas con diferentes drogas que actúan como agentes proapoptóticos y/o agentes citoestáticos. La medición de la activación de Bax se realiza como se ha descrito anteriormente mediante la evaluación de la retención de la fluorescencia después de la permeabilización con digitonina. Se ha añadido de nuevo, en el tampón de permeabilización, ioduro de propidio (0,4-0,8 mg/ml) y las células son incubadas durante 30 minutos a 4ºC. La distribución de las células en las diferentes fases del ciclo celular se lee sobre la base de su intensidad de fluorescencia en el rojo (PI). La figura muestra cómo la lectura simultánea en los canales FL1 (GFP) y FL3 (ADN) permite evaluar al mismo tiempo el efecto proapoptótico de la activación de Bax y el efecto sobre el ciclo celular (modificación de la distribución en las fases G1, S, G2/M). Además, permite evaluar si la activación de Bax tiene lugar en una fase preferente del ciclo celular. Arriba, células control no tratadas (C) y células tratadas con la estaurosporina (ST 0.1) (sin efecto sobre el ciclo e inducción de la activación de Bax en todas las fases del ciclo).
Abajo, tratamiento con camptotecina (CAM) (bloqueo en fase S, activación de Bax preferentemente en fase G1); tratamiento con colcemida (COLC) (acumulación en fase G2, activación de Bax en todas las fases del ciclo); tratamiento con daunorubicina (DNR) (acumulación en fase G2, activación de Bax en fase S).
- la figura 12 representa la xenoinjerto de descendencias que expresan un biosensor fluorescente.
a)
Imagen en microscopía confocal (10X) de una sección de un tumor sólido generado por xenoinjerto subcutáneo de las células clon 10 (que expresan de forma estable GFP-Bax) en unos ratones "nude". Marcado de los núcleos (Hoechst) y células con Bax activado (GFP-Bax). A la derecha, detalle de una célula con GFP-Bax relocalizado en las mitocondrias (GFP-Bax) y marcado nuclear correspondiente (Hoechst).
b)
Imagen por microscopía confocal (10X) de una sección de un tumor sólido generado por xenoinjerto subcutáneo de las células clon 23 (que expresan de forma estable la proteína copGFP-DEVD-cb5TMD-RR) en ratones "nude". Marcado de los núcleos (Hoechst) y distribución del biosensor (sonda de caspasa 3). A la derecha, el detalle de la distribución mitocondrial de la sonda recombinante con un mayor aumento.
c)
En un tumor clon 23 xenoinjertado, que procede de un ratón tratado con etopósido (40 mg/kg/día durante 4 días), aparición de células que han activado la caspasa 3 (flechas) (distribución citosólica de la fluorescencia).
Ejemplo 1 Activación de la proteína Bax
El ejemplo siguiente describe un ensayo simple que permite detectar los cambios de conformación de la proteína Bax durante la inducción de la apoptosis.
Como se ha indicado anteriormente, en una célula normal Bax esta plegada de tal forma que su extremo C-terminal muy hidrófobo está protegido por el resto de la molécula (2). Durante la inducción de la apoptosis, la proteína sufre un cambio de conformación que modifica sus propiedades, induciendo la exposición de su extremo C-terminal una relocalización mitocondrial de Bax. En esta forma Bax se comporta como una proteína membranaria insertada de forma estable en la membrana externa mitocondrial.
La utilización de una proteína quimérica obtenida mediante la fusión de la GFP con el extremo N-terminal de Bax proporciona una sonda recombinante fluorescente que indica la localización de Bax.
La proteína quimérica mantiene las mismas propiedades que la proteína nativa y en particular la capacidad de ser sometida a la modificación de su conformación y a una relocalización de la mitocondria durante la inducción de la apoptosis.
El modelo empleado utiliza un clon denominado "clon 10".
Se trata de células HeLa (tumor del cuello del útero humano) que han sido transfectadas mediante la técnica del calcio fosfato con un plásmido pEGFP-Bax que codifica para la proteína quimérica de fusión GFP-Bax bajo el control del promotor viral CMV y que confiere una resistencia a la geneticina.
El vector de base utilizado es un vector comercial PEGFP-C3 (Figura 5) de la sociedad Clontech en la que se inserta, bajo el control del promotor CMV, el ADNc de Bax fusionado en fase por su extremo 5' con el ADNc de la GFP privado de su codón stop.
Cuatro días después de la transfección, las células son expuestas a una concentración de 1 mg/ml de geneticina G418 que es progresivamente reducida a 0,1 mg/ml durante la semana siguiente. Después de 2 semanas, se aísla un cierto número de clones resistentes a la geneticina que son seleccionados mediante microscopio de fluorescencia.
El clon 10 contiene un porcentaje elevado de células uniformemente fluorescentes a nivel citosólico y este marcado es estable en el tiempo, (aproximadamente 10 pasadas). Las células son mantenidas en cultivo en DMEM 10% FCS, 0,1 mg/ml de geneticina.
El ensayo se basa entonces en la observación, con microscopio de fluorescencia o mediante la citometría de flujo, de las células en las que Bax no ha sido activada y está por lo tanto repartida uniformemente en el citosol y de las células en las que Bax habiendo sido activada como consecuencia de una inducción de apoptosis la señal fluorescente es agregada alrededor de las mitocondrias, siendo entonces la proteína Bax denominada "fijada".
Para poner en evidencia la fijación o la solubilización de Bax, se trata la población control y la población tratada con el agente apoptótico con tripsina con el fin de separarlas de su caja de cultivo. Las células son resuspendidas seguidamente en una disolución salina intracelular en presencia de 50 \muM de digitonina, las células son analizadas a continuación por citometría de flujo y la fluorescencia de la GFP es medida en el canal FL1.
Se han representado en la figura 1 células tratadas de esta forma y muestran que se observa una caída muy fuerte de la intensidad de fluorescencia en las células para las que Bax no ha sido activada, siendo inicialmente la imagen uniformemente fluorescente, y después dicha fluorescencia casi ha desaparecido al cabo de 300 segundos.
Por el contrario, cuando Bax ha sido activada, se constata que la fluorescencia es redistribuida en las mitocondrias y resiste la permeabilización, como se desprende de las mediciones cuantitativas realizadas en las curvas correspondientes.
La figura 2 muestra diferentes perfiles de fluorescencia en FL1 de la población clon 10 con o sin permeabilización y en presencia de diferentes agentes pro-apotósicos.
"A" muestra el perfil de fluorescencia de la población clon 10 control con o sin permeabilización. Como indica el desplazamiento del pico de distribución hacia la izquierda, la señal fluorescente es sensible al tratamiento con digitonina.
\newpage
"B" muestra el perfil citométrico en FL1 de una población tratada con un agente pro-apotósico (selenita 20 \muM, 6 h) que activa Bax. Comparando los perfiles obtenidos con o sin inductor y después de la permeabilización, se puede observar que bajo un inductor apoptótico la señal fluorescente se vuelve resistente al tratamiento de permeabilización.
En "C" se observa la misma diferencia bajo la inducción de la apoptosis con estaurosporina (1 \muM, 6 h) o TNF\alpha (10 ng/ml, 6 h + CHX 10 \muM).
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Ejemplo 2 Cuantificación de la relocalización de Bax en la mitocondria bajo inducción apoptótica
La técnica permite evaluar la inducción de Bax midiendo el porcentaje de células en las que ha tenido lugar la relocalización de Bax en la mitocondria.
Con este enfoque, es posible:
-
analizar si la expresión de un gen induce o no la activación de Bax y
-
evaluar de forma cuantitativa el poder proapoptótico o citoprotector de una droga.
Para evaluar el poder de activación de Bax de un gen exógeno, el clon 10 es transfectado con el ADNc de la proteína de interés en asociación con otro ADNc que codifica para un marcador fluorescente diferenciable espectralmente de la GFP y que tiene una localización subcelular, membranaria o compartimentada (que resiste a la permeabilización), por ejemplo la DsRed dirigida a la matriz mitocondrial (mtDsRed). En este último caso, después de la permeabilización, la intensidad de fluorescencia registrada en el canal FL1 (GFP) suministra siempre la indicación del nivel de activación de Bax, mientras que la intensidad de la señal en FL3 (DsRed) indica si la célula sobreexpresa o no la proteína de interés.
Practicando una medición biparamétrica sobre el clon 10, es posible por lo tanto correlacionar la activación de Bax con la sobreexpression de una proteína de interés.
Los resultados indicados en las figuras 3A y 3B ponen en evidencia el porcentaje de una población celular que ha sido sometida a la relocalización de Bax en la mitocondria como consecuencia de un tratamiento farmacológico.
La figura 3A representa la evolución en el tiempo de una población celular tratada con 20 \muM de selenita en ausencia (curva D) y en presencia (curva E) de un inhibidor y con 40 nM de estaurosporina en ausencia y en presencia del mismo inihibidor B.
Gracias a esta técnica, se observa que la cinética de activación de Bax no es modificada por el inhibidor durante el tratamiento con selenita, mientras que por el contrario este inhibidor es activo sobre la estaurosporina.
Asimismo, el histograma de la figura 4 representa el porcentaje de las células en las que Bax ha sido activada después del tratamiento de 24 h con 40 nM de estaurosporina, 50 \muM de ceramida o TNF 0,1 ng/ml en presencia de clicloheximida, bajo la influencia de radiaciones U.V.
Por lo tanto esta técnica permite distinguir las propiedades proapotóticas de diferentes agentes.
Presenta numerosas ventajas respecto a las técnicas disponibles en la actualidad para evaluar la activación de Bax y su relocalización en la mitocondria que se basa en unos fraccionamientos subcelulares y unas cuantificaciones por Western Blot de la cantidad de proteínas Bax presentes en las diferentes fracciones o por inmunofluorescencia con unos anticuerpos que reconocen específicamente la proteína que ha sido sometida al cambio de la conformación de la activación.
Con respecto a estas técnicas, el enfoque descrito anteriormente necesita únicamente una manipulación experimental muy reducida (el tiempo acumulado es inferior a 30 min con respecto a 24 h para las otras técnicas) y permite medir el parámetro de interés en el seno mismo de la célula sin inducir artefactos asociados al fraccionamiento o a la fijación y a la utilización de detergentes a dosis elevadas (inmunofluorescencia) y presenta un coste experimental mínimo.
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Ejemplo 3 Medición de la actividad de la caspasa 3 durante la apoptosis
Los principales efectores de la apoptosis son las caspasas, cisteinas proteasas caracterizadas por una especificidad absoluta para un aspartato en posición P1 en su lugar de escisión. Estas enzimas contienen todas una secuencia pentapeptídica idéntica en su sitio activo y participan, con otras proteasas como la calpaína, en los numerosos acontecimientos proteolíticos que tienen lugar en una célula en apoptosis, lo que desemboca en la escisión de sustratos proteicos que desempeñan una función clave en las funciones celulares normales (proteínas del citoesqueleto, proteínas nucleares o enzimas de reparación del ADN).
La activación de las caspasas puede tomar dos grandes vías. La primera es la vía "mitocondrial", en la que la proteína Apaf-1 interactúa con la procaspasa-9, en presencia de dATP y de citocromo c, liberado a partir del espacio intermembranario de las mitocondrias, para formar el "apoptosoma", que permite así la activación de la caspasa-9 (escisión autocatalítica de la procaspasa-9) y después de la caspasa-3. La otra vía es la de los receptores de la superfamilia de los receptores del TNF sobre la membrana plasmática. La interacción del TNFR1 o de Fas (CD95 o APO-1) con su ligando natural o un anticuerpo monoclonal agonista permite el ensamblaje de un complejo multiproteico citoplasmático denominado DISC (death-inducing signaling complex) y el arranque de la cascada apoptótica por activación de la procaspasa-8.
En la actualidad existe un número limitado de procedimientos que ya han sido mencionados con anterioridad y de los que ninguno es perfectamente satisfactorio para medir la activación de las caspasas.
En el marco de la presente invención, se utiliza una nueva sonda recombinante que se puede utilizar en microscopía y en citometría para medir la actividad de las caspasas en las células apoptóticas.
Esta nueva sonda está constituida por una proteína de fusión en la que cualquier proteína fluorescente, DsRed2 o EFGP, está unida por un enlace corto que contiene el lugar de consenso de la caspasa 3 con una secuencia transmembranaria que asegura el anclaje específico de la sonda en la membrana externa mitocondrial.
La secuencia correspondiente está descrita en la SEC ID nº 1.
La parte subrayada corresponde al enlace sintético que contiene la secuencia de escisión para la caspasa 3, y a continuación el dominio transmembranario del citocromo b5 mutado al que se la ha conferido una especificidad de direccionado mitocondrial.
Durante la inducción de la apoptosis, la caspasa 3 activada escinde la secuencia DEVD contenida en el enlace que ha sido interpuesto entre la proteína fluorescente y la secuencia transmembranaria. La GFP fijada con anterioridad se convierte en una proteína soluble en el citosol de la célula.
La señal fijada en las células en las que la caspasa 3 no está activada se convierte en soluble en las células en las que la caspasa está activada.
Las células son cultivadas sobre unas láminas de cristal y transfectadas con el vector descrito anteriormente, son montadas sobre una cámara de incubación en un medio salino y observadas con el microscopio de fluorescencia. Antes o durante la observación, son tratadas con el agente proapoptótico. La activación de la caspasa 3 y su cinética pueden ser puestas en evidencia por simple observación de la modificación de la distribución intracelular de la señal fluorescente que, de mitocondrial, se convierte rápidamente en citosólica una vez activada la caspasa.
Pero es más cómodo medir la activación de la caspasa por citometría de flujo.
La población control y la población tratada con el agente apoptótico son separadas de sus cajas de cultivo mediante tratamiento con tripsina, las células son resuspendidas a continuación en una solución salina intracelular en presencia de 50 \muM de digitonina, las células son analizadas a continuación por citometría de flujo y la fluorescencia de la GFP es medida en canal FL1.
La técnica presentada permite evaluar la activación de la caspasa 3 midiendo el porcentaje de células en las que la escisión del sensor fluorescente ha tenido lugar.
Con este enfoque, es posible por lo tanto:
-
analizar si la expresión de un gen induce o no la activación de la caspasa 3, y
-
evaluar de forma cuantitativa el poder proapoptótico o citoprotector de una droga.
Así, la figura 6 representa la cuantificación de la acción de la caspasa 3 en una población de células HeLa tratadas con diferentes inductores apoptóticos:
irradiación UV (200 mJ/cm^{2}), TNF\alpha 100 \mug/ml, estaurosporina 1 \muM durante 6 h y estaurosporina 1 \muM en presencia de un inihibidor de caspasas (ZVAD 50 \muM).
En paralelo está representada la cuantificación de otro parámetro apoptótico (la despolarización mitocondrial que en este modelo de inducción de la apoptosis depende de la activación de las caspasas).
\newpage
Evidentemente, este procedimiento es directamente generalizable al conjunto de las caspasas y otras proteasas que pueden ser introducidas en unos sistemas diferentes y para las que el experto en la materia sabrá realizar el vector correspondiente.
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Ejemplo 4 Otras estrategias de anclaje subcelular de la sonda
La sonda de caspasa 3 descrita supra se basa en un anclaje membranario constituido por un corto dominio transmembranario que se encaja en la membrana mitocondrial externa (segmento C-terminal del citocromo b5 mutado). Este dominio proteico confiere por lo tanto a la proteína de fusión una distribución mitocondrial y la propiedad de ser resistente frente a una permeabilización selectiva de la membrana plasmática. Se ha mostrado en este ejemplo que el principio del ensayo es extensible a otras estrategias de anclaje subcelular que implican una resistencia de la señal fluorescente a la permeabilización de la membrana plasmática. El tipo de anclaje puede no estar necesariamente representado por un dominio transmembranario propiamente dicho sino simplemente por un dominio proteico que, por sus interacciones moleculares o sus modificaciones postraduccionales, confiere a la proteína fluorescente a la que está fusionado un estado "anclado" pero potencialmente difundible en el citosol o en el ambiente extracelular después de la escisión por la proteasa de interés. Además, la localización subcelular específica (membrana plasmática, núcleo, espacio mitocondrial intermembranario) puede proporcionar unas informaciones suplementarias sobre la accesibilidad de los sustratos a las proteasas y, por lo tanto, sobre la localización intracelular de las actividades proteolíticas.
Ejemplo 4a
Sonda de caspasa 3 anclada en la cara interna de la membrana plasmática
En esta proteína de fusión, el campo de anclaje intracelular está constituido por una porción de la proteína murina SNAP-25. La SNAP-25 es una proteína implicada en el proceso de fusión de vesículas secretoras y ésta se localiza sobre la cara citosólica de la membrana plasmática por palmitoilación de tres residuos de cisteína.
Se ha aislado el dominio mínimo de palmitoilación de SNAP-25, que está constituido por unos aminoácidos 80-136 (SEC ID nº 4), y se le ha fusionado a la proteína fluorescente a través del enlace que contiene el lugar de escisión de la caspasa 3.
Esta proteína de fusión se localiza por lo tanto en la membrana plasmática y su señal fluorescente es resistente a la permeabilización por la digitonina. La actividad proteolítica de la caspasa 3 escinde el enlace, provoca una redistribución de la fluorescencia en el citosol y la señal se pierde después de la permeabilización. (Fig. 7). En citometría de flujo, esta sonda proporciona unos resultados completamente comparables con la sonda anclada en la membrana mitocondrial externa descrita anteriormente.
Ejemplo 4b
Sonda de caspasa 3 anclada a la cara externa de la membrana mitocondrial interna
En un segundo ejemplo, el dominio proteico utilizado para anclar la sonda está representado por la secuencia entera del translocador adenílico mitocondrial (ANT2) (SEC ID nº 8). Se trata de una proteína integral de la membrana interna mitocondrial fluorescente cuyo extremo N-Ter está expuesto en el espacio intermembranario. La proteína fluorescente con su enlace escindible ha sido por lo tanto fusionada con este extremo.
Así se ha demostrado que: (i) esta proteína de fusión se localiza correctamente en la mitocondria; (ii) la proteína fluorescente es escindida por la caspasa 3; y (iii) la señal de fluorescencia se vuelve sensible a la permeabilización después de la escisión de la caspasa 3 (Fig.8).
Esta proteína de fusión se comporta por lo tanto como una sonda para la medición de la actividad de la caspasa 3, según el principio de medición descrito en la presente solicitud.
Este ejemplo demuestra asimismo que el procedimiento según la invención permite obtener unas informaciones suplementarias sobre la distribución espacial de la actividad proteolítica estudiada: en este caso, aunque capturada en el espacio intramembranario, la sonda puede ser escindida por la caspasa 3, lo que demuestra que este espacio intracelular se vuelve accesible durante la apoptosis a unas proteínas citosólicas tal como la caspasa 3.
Ejemplo 4c
Sonda de caspasa 3 con anclaje nuclear
Este tercer ejemplo demuestra que se puede obtener el anclaje intracelular por efecto de interacciones proteína-proteína y proteína-ácido nucleico muy estables.
Se ha obtenido una sonda de caspasa 3 con localización nuclear fusionando la proteína fluorescente a la proteína histona 2b a través del enlace escindible por la caspasa 3. La proteína de fusión H2B-GFP control (sin secuencia específica para la caspasa 3) se localiza en el núcleo de forma muy estable: gracias a su interacción con la cromatina (ADN) en el seno de los nucleosomas (complejos multiprotéicos) no se difunde, como lo demuestra la resistencia de la señal fluorescente durante la permeabilización de la membrana plasmática. Durante la apoptosis, incluso en las fases tardías que comprenden la degradación del ADN provocada por la escisión internucleosomal de la cromatina por las endonucleasas específicas de la apoptosis, la proteína fluorescente permanece atrapada en los nucleosomas y su distribución sigue la distribución de la cromatina dando la imagen de los núcleos picnóticos característicos de la apoptosis.
La proteína H2B-DEVD-GFP, en la que la secuencia de escisión por la caspasa 3 ha sido insertada en el enlace entre la histona (SEC ID nº 10) y la GFP, se comporta de la misma forma que la sonda de control en las células no tratadas. Por el contrario, en las células tratadas por un inductor apoptótico, la fluorescencia de la GFP se difunde fuera del núcleo durante la activación de la caspasa 3 y se distribuye de forma uniforme en el citoplasma. Esta fluorescencia se vuelve sensible a la permeabilización de la membrana plasmática. Los experimentos de permeabilización muestran que esta proteína se comporta bien como una sonda que permite la medición de la actividad de la caspasa 3 en el núcleo celular.(Fig.9).
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Ejemplo 5 Aplicación del principio del procedimiento según la invención a unas sondas que miden otras actividades proteolíticas
El enfoque de medición puesto a punto para la caspasa 3 ha sido extendido a otras dos proteasas implicadas en la muerte celular programada.
Se han construido unas proteínas de fusión GFP-cb5TMRR y GFP-SNAP (80-136) que llevan, en el enlace que une la proteína fluorescente y el segmento de anclaje, el lugar consenso sensible a la caspasa 8 (IETD) que es la principal caspasa "iniciadora" propaoptósica. De la misma forma, se ha construido una proteína de fusión GFP-H2B que contiene, en la secuencia enlace, la secuencia consenso sensible a la caspasa 2 (VDVAD), proteasa de localización nuclear. Los componentes sensibles así utilizados tienen por secuencias SEC ID nº 6 y 14 (para la caspasa 8), y SEC ID nº 12 (para la caspasa 2). Estas proteínas son escindibles y se puede realizar la cuantificación de la actividad proteolítica por citometría como se ha mostrado para la caspasa 3 (Fig. 10).
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Ejemplo 6 Ejemplos de aplicación del ensayo en citometría de flujo y en unos modelos tumorales experimentales in vivo
En este ejemplo, se muestran otras dos aplicaciones de las sondas y del procedimiento objeto de la invención: la primera se refiere a la puesta a punto de un ensayo asociado biparamétrico en citometría de flujo, la segunda describe la aplicación de los biosensores en la evaluación de la actividad de los anticancerosos en unos modelos
animales.
Ejemplo 6a
Medición asociada a la del ciclo celular
Es posible aplicar la técnica en unos ensayos dobles en los que la medición del acontecimiento molecular revelado por la sonda específica está asociada a la medición de otro parámetro celular tal como el ciclo celular. Se puede realizar la medición del ciclo celular de forma clásica añadiendo a la suspensión celular permeabilizada una concentración suficiente de yoduro de propidio (0,4-0,8 mg/ml). Las células son incubadas durante 30 minutos para dejar el tiempo al PI para intercalarse en el ADN genómico, y analizadas a continuación por citometría de flujo midiendo a la vez la fluorescencia "verde" (FL1= señal del biosensor recombinante basado en GFP u otra proteína fluorescente que emite en el verde) y la fluorescencia en el "rojo" (FL3= intensidad del PI correspondiente al contenido en cromatina de cada célula, que permite la lectura del ciclo celular).
Por lo tanto la técnica permite seguir de forma simultánea la distribución de la población celular en las diferentes fases del ciclo y la aparición del acontecimiento molecular detectado específicamente por la sonda. En particular, esta técnica ofrece dos ventajas principales:
-
permite detectar una eventual relación entre la activación del proceso molecular estudiado y una fase determinada del ciclo celular;
-
utilizada en el cribado de moléculas candidatos anticancerosos, permite identificar al mismo tiempo los compuestos que tienen una actividad citostática simple, los compuestos que tienen una actividad proapoptótica simple, y los compuestos a la vez citoestáticos y proapoptóticos.
La figura 11 muestra el efecto de algunas drogas proapoptóticas utilizadas como agente anticanceroso en el ensayo asociado "activación de Bax/ciclo celular" (véase la leyenda). De la misma forma, se ha realizado con éxito el ensayo asociado "activación de la caspasa 3/ciclo celular" (no se muestra).
Ejemplo 6b
Aplicación de los biosensores en la evaluación de la actividad de los anticancerosos in vivo en el ratón portador de un xenoinjerto tumoral
El xenoinjerto subcutáneo de las descendencias celulares tumorales humanas en unos ratones "nude" (desprovistos de inmunidad celular) representa un modelo preclínico clásico para la evaluación de la eficacia in vivo de las nuevas moléculas con potencial anticanceroso. Sin embargo, esta evaluación se basa generalmente en la simple medición del tamaño y del crecimiento de los tumores implantados, y por lo tanto no permite asociar el efecto "macroscópico" de la molécula ensayada con un efecto molecular preciso.
El presente ejemplo muestra que el enfoque xenoinjerto es aplicable a las descendencias celulares que expresan de forma estable los biosensores recombinantes para la medición de la activación de Bax y de la caspasa 3.
Estas descendencias (denominadas respectivamente clon 10 y clon 23), inyectadas subcutáneamente en unos ratones "nude" forman, al cabo de unos días, unos tumores sólidos fluorescentes.
Estas últimas representan un modelo de un nuevo género para la evaluación in vivo de la eficacia de nuevas moléculas con potencial anticanceroso puesto que informan de la actividad molecular específica del producto ensayado a nivel del tejido tumoral (Fig. 12) permitiendo al mismo tiempo las mediciones morfométricas macroscópicas clásicas, lo que hace posible por lo tanto la correlación "efecto molecular/efecto sobre el crecimiento tumoral " in vivo.
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<160> 14
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 195
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(174)
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<400> 1
1 
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<210> 2
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<211> 58
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda
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<400> 2
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2 
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<210> 3
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<211> 294
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 3 DEVD-SNAP-25(80-136)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(291)
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3 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 3 DEVD-SNAP-25(80-136)
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<400> 4
4 
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<210> 5
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<211> 294
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 8 IETD SMAP-25(80-136)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(291)
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5 
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<210> 6
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<211> 97
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 8 IETD SNAP-25(80-136)
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<400> 6
6 
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<210> 7
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<211> 960
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 3 DEVD-ANT-2
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<221> CDS
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<222> (1)..(957)
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<400> 7
7
8 
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<210> 8
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<211> 319
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 3 DEVD-ANT-2
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<400> 8
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9 
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<210> 9
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<211> 411
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 3 H2B-DEVD
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<221> CDS
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<222> (1)..(411)
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<400> 9
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10 
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<210> 10
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<211> 137
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 3 H2B-DEVD
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<400> 10
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11
12 
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<210> 11
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<211> 414
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 2 H2B-VDVAD
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(414)
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<400> 11
13 
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<210> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 2 H2B-VDVAD
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sonda de Caspasa 8 IETD-cbSRR
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<221> CDS
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<222> (1)..(174)
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<220>
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<223> Sonda de Caspasa 8 IETD-cb5RR
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<400> 14
16

Claims (21)

1. Procedimiento de puesta en evidencia de la aparición de un acontecimiento molecular particular en una célula, caracterizado porque:
-
se detecta:
o bien la presencia de una proteína marcadora "solubilizada", es decir en forma de proteína libre en el citosol celular, siendo dicha proteína, que es un marcador directo o indirecto de la aparición del acontecimiento molecular particular, inicialmente "fijada" por anclaje subcelular o por compartimentación a nivel subcelular,
o bien la presencia de una proteína marcadora "fijada", siendo dicha proteína marcadora inicialmente "solubilizada",
-
proteína marcadora que está presente en la célula antes de la detección anterior,
-
siendo la célula, antes de la detección, sometida a una permeabilización de la membrana plasmática que libera la proteína solubilizada en el medio extracelular,
-
siendo la presencia de la proteína marcadora detectada entonces en la célula o el medio extracelular mediante cualquier medio apropiado, lo que permite determinar si la solubilización, respectivamente la fijación, han tenido lugar y por lo tanto el acontecimiento molecular correspondiente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína marcadora es una proteína de fusión que comprende un fragmento fluorescente.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína marcadora es producida en la célula por un vector de expresión.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína marcadora es producida de forma constitutiva por la célula.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la solubilización, respectivamente fijación, de la proteína fluorescente, son detectadas por citometría de flujo o microscopía de fluorescencia sobre las células después de la permeabilización de la membrana.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la aparición del acontecimiento molecular provoca la escisión o la reorganización de la proteína marcadora y la solubiliza.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la aparición del acontecimiento molecular provoca la aparición de un fragmento de anclaje subcelular, preferentemente membranario, de la proteína marcadora y su fijación, o la compartimentación de la proteína marcadora.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el acontecimiento molecular a detectar es la activación de Bax, porque la proteína marcadora es una proteína de fusión Bax-proteína fluorescente, siendo fusionada la proteína fluorescente con el extremo N-terminal de Bax, y porque, en caso de activación de Bax, se fija la proteína Bax.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el acontecimiento molecular a detectar es la activación de una proteasa, porque la proteína marcadora es una proteína de fusión que comprende el lugar de escisión de la proteasa y, a ambos lados, un lugar de anclaje subcelular, preferentemente membranario, y una proteína fluorescente y porque, durante la expresión de la proteasa, la proteína marcadora es solubilizada por escisión y liberación de la proteína fluorescente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la proteasa es una caspasa.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la puesta en evidencia de la aparición del acontecimiento molecular está asociada a la medición del ciclo celular, en particular la medición de la distribución de la población celular en las diferentes fases del ciclo celular.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el acontecimiento molecular es la activación del Bax o la activación de una caspasa.
13. Proteína marcadora útil en la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende un componente sensible que será sometido a solubilización (la fijación) y un componente indicador que permite la detección, y porque:
-
la secuencia de dicho componente sensible está codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 ; y/o
-
la secuencia de dicho componente sensible comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.
14. Proteína según la reivindicación 13, caracterizada porque se trata de una proteína de fusión cuyo componente indicador es una proteína fluorescente.
15. Vector que expresa, en un entorno celular, una proteína marcadora según una de las reivindicaciones 13 y 14.
16. Célula transformada que expresa una proteína marcadora según una de las reivindicaciones 13 y 14.
17. Célula según la reivindicación 16, caracterizada porque la expresión de la proteína marcadora es estable.
18. Célula según la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque es una célula tumoral, preferentemente una célula tumoral humana.
19. Animal transgénico no humano del que al menos un cierto tipo de células expresa una proteína marcadora según una de las reivindicaciones 13 y 14.
20. Kit de realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende al menos:
-
unas células transformadas según una de las reivindicaciones 16 a 18; y/o
-
un vector según la reivindicación 15; y/o
-
un animal transgénico según la reivindicación 19.
21. Procedimiento para evaluar la actividad de un compuesto anticanceroso candidato, caracterizado porque comprende la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12 en una célula según la reivindicación 18.
ES04767522T 2003-07-04 2004-06-30 Procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular en una celula gracias a unas proteinas marcadoras fluorescentes. Active ES2305837T3 (es)

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FR0308186 2003-07-04
FR0308186A FR2857098B1 (fr) 2003-07-04 2003-07-04 Procede de mise en evidence d'un evenement moleculaire dans une cellule grace a des proteines marqueurs fluorescentes.

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ID=33522767

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ES04767522T Active ES2305837T3 (es) 2003-07-04 2004-06-30 Procedimiento de puesta en evidencia de un acontecimiento molecular en una celula gracias a unas proteinas marcadoras fluorescentes.

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