CN109251492B - 生物墨水及其制备方法和应用 - Google Patents

生物墨水及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109251492B
CN109251492B CN201710571668.5A CN201710571668A CN109251492B CN 109251492 B CN109251492 B CN 109251492B CN 201710571668 A CN201710571668 A CN 201710571668A CN 109251492 B CN109251492 B CN 109251492B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
ink
bio
printing
scaffold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710571668.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109251492A (zh
Inventor
敬霖志
王丹丹
姚御风
黄德建
孙捷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Singapore Suzhou Research Institute, National University of
Suzhou Haode Biotechnology Co ltd
National University of Singapore
Original Assignee
Singapore Suzhou Research Institute, National University of
Suzhou Haode Biotechnology Co ltd
National University of Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Singapore Suzhou Research Institute, National University of, Suzhou Haode Biotechnology Co ltd, National University of Singapore filed Critical Singapore Suzhou Research Institute, National University of
Priority to CN201710571668.5A priority Critical patent/CN109251492B/zh
Priority to SG10201806004VA priority patent/SG10201806004VA/en
Publication of CN109251492A publication Critical patent/CN109251492A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109251492B publication Critical patent/CN109251492B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L67/00—Compositions of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L67/04—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids, e.g. lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2201/00—Properties
    • C08L2201/06—Biodegradable
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2205/00—Polymer mixtures characterised by other features
    • C08L2205/02—Polymer mixtures characterised by other features containing two or more polymers of the same C08L -group
    • C08L2205/025—Polymer mixtures characterised by other features containing two or more polymers of the same C08L -group containing two or more polymers of the same hierarchy C08L, and differing only in parameters such as density, comonomer content, molecular weight, structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2205/00—Polymer mixtures characterised by other features
    • C08L2205/03—Polymer mixtures characterised by other features containing three or more polymers in a blend

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种生物墨水，其组分包括人工合成可降解聚合物，天然高分子和溶剂。本发明的生物墨水还可以包含荧光改性天然高分子。本发明还提供该生物墨水打印而成的组织工程支架。本发明通过共混的方式形成的复合生物墨水，从而兼具合成高分子和天然高分子的优点，由此墨水3D打印成型的支架具有足够机械强度，可控的细胞亲和性和可降解性；具有荧光特性的支架的荧光强度变化还可用于实时性评估支架降解程度。本发明还提供了一种用于制备荧光标记蛋白的方法，以及包含根据该方法制得的荧光标记蛋白的生物墨水。

Description

生物墨水及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物墨水，尤其是涉及一种用于3D打印的生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术
目前，3D打印技术(又称快速成型和增材制造技术)的快速发展和应用正在为许多传统领域例如建筑工程，模具加工，工业设计，教育和医疗等带来一场技术革新。该技术主要依据计算机辅助设计(CAD)生成打印物的3D模型，再将其断层为不同的二维平面，然后依据“逐层打印，层层叠加”的原理快速形成三维实体。其打印过程不受几何形状的限制，打印速度可调，且可根据不同的打印材料选用不同成型方式。这种可个性化定制的特性使其在生物医疗领域如手术模型，药物筛选，组织工程和再生医学引起了广泛的关注，派生出新兴的3D生物打印技术。然而，由于生物组织结构的复杂性和敏感性，利用3D生物打印技术制造可植入性器官和组织还面临着巨大的挑战，其中，研发适用于3D打印的生物材料是该技术的关键。
首先，3D生物打印材料需要满足打印技术对材料物化性能的要求，具有良好的生物相容性和可降解性，合适的机械性能，并且降解产物无明显的毒副作用，可被代谢后排出。目前，可作为生物打印的材料主要分为两类：人工合成的生物高分子材料如可降解的聚乳酸(PLA)，聚己内酯(PCL)，聚乙醇酸(PGA)聚乙二醇(PEG)及其共聚物等。这类合成高分子分子量可控，加工性能良好，机械性能可调，可被生物体降解，但是由于与生物体组成结构上的差异，其生物亲和性有待提高，且降解产物有一定的毒副作用。另一类生物打印材料主要是一些天然高分子材料如胶原蛋白，纤维蛋白，蚕丝蛋白，和海藻酸盐，壳聚糖，透明质酸等。这类蛋白和多糖材料往往具有良好的生物亲和性，可降解性和细胞附着性，其降解产物可被生物体吸收利用，然而由于其组成结构相对固定，理化性质不易控，可加工性差，且提取分离较为繁琐，增加了其使用成本，限制了其大规模应用。
其次，目前的3D生物打印技术主要使用基于挤出固化成型的熔融沉积(FDM)和直写(Direct writing)式3D打印术及基于溶液喷墨固化的喷墨打印(inkjet printing)技术。熔融沉积技术使用加热的方式将热塑性树脂加热至流体状，然后通过挤出，固化沉积的方式成型。其不适用于对热敏感的蛋白等材料，且其分辨率较低，无法达到组织工程支架要求精度。直喷打印利用溶液挤出固化方式成型，要求低黏度聚合物溶液，故成型物机械强度差，无法满足组织工程支架强度要求。喷墨打印在二维方向上可实现高精度打印，但其无法实现三维方向上悬空，多孔结构的制造。因此，开发新型的3D打印成型技术和打印设备是3D生物打印发展的另一方向。近电场电流体喷射(EHD-jet)成型是一种新兴的可以用制造组织工程支架的3D打印技术，其结合了静电纺丝技术和3D打印原理，使用高黏度聚合物溶液作为“墨水”，在电场力作用下使其固化形成纤维，逐层打印，层层叠加，形成具有高精度，高强度的三维组织工程支架。但是，目前能够应用于此技术的生物墨水十分匮乏，成为其发展和应用的瓶颈。
发明内容
针对现有技术的不足和生物墨水的缺失，本发明目的之一旨在提供一种新型生物墨水，该墨水通过共混的方式形成复合生物墨水，同时具有合成高分子和天然高分子的优点。
鉴于此，本发明的第一方面中，提供一种生物墨水，以质量百分比计，包含如下成分：
合成可降解聚合物：1％～70％；
天然高分子：1％～70％；和
溶剂：28％～98％；
其中所述溶剂为水、有机溶剂或其任意组合。
在本发明中，可以使用任何合成可降解聚合物，只要其具有可生物降解性质，即可以用于此目的，例如包括但不限于各类聚酯和聚酰胺。在该生物墨水的其中一个实施例中，所述合成可降解聚合物优选为聚酯高分子，其适合用于此用途的优点在于：在有机溶剂里溶解度好，与天然高分子混合度高，且分子量可控，具有令所打印的支架形状多样化的技术效果。符合此目的的聚酯高分子包括但不限于：聚乳酸(Poly Lactic Acid；PLA)、聚己內酯(Poly-ε-caprolactone；PCL)、聚酐(Polyanhydride)、聚原酸酯(Polyorthoester)、聚D,L-丙交酯(PDLLA)、聚乙酸醇(PGA)，聚(对环氧己酮)(Poly(p-dioxanone))中的任意一种或任意几种的组合。优选的聚酯高分子为聚己内酯(例如重均分子量范围为10kDa至20kDa，熔点为30至100℃)，但不限于此。聚己内酯特别优选的原因在于，其在有机溶剂里溶解度高，并有理想的粘度和电导性，从而达到理想的3D打印效果。
在其中一些实施例中，所述合成可降解聚合物的质量百分比优选为10～60％，更优选为20～50％，且更优选为30～40％。
在该生物墨水的其中一个实施例中，所述天然高分子为植物源性蛋白质，即植物蛋白。任何植物源性蛋白质只要在有机溶剂中有一定溶解度即可以用于此目的,包括但不限于：蔬菜蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、坚果蛋白、核桃蛋白、杏仁蛋白、莲子蛋白、白芸豆蛋白、玉米蛋白、大麦蛋白、小麦蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、花生蛋白中的任意一种或任意几种的组合。在一个优选的实施例中，所述植物蛋白为玉米蛋白。
优选地，所述植物源性蛋白质为植物醇溶蛋白，其用于此用途的优点在于：在有机溶剂里溶解度高，溶液粘度和调导电率可控，且机械性能强，使用植物醇溶蛋白能够获得的3D打印材料机械性能好，生物亲合度和可生物可降解性好，并且可调等技术效果。符合此目的的植物醇溶蛋白包括但不限于：豆类醇溶蛋白、谷物醇溶蛋白、蔬菜醇溶蛋白、赖草属植物醇溶蛋白、椰子醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大豆醇溶蛋白、花生醇溶蛋白、豌豆醇溶蛋白、土豆醇溶蛋白、大米醇溶蛋白、燕麦醇溶蛋白中的任意一种或任意几种的组合。优选的植物醇溶蛋白为小麦醇溶蛋白，玉米醇溶蛋白等，其特别优选的原因在于具有理想的分子量、电导性、粘度、生物亲和度、生物可降解度，从而使所配制的墨水适合于打印出理想的3D生物支架。特别优选为玉米醇溶蛋白(例如分子量为21-26kDa的α-玉米醇溶蛋白)与小麦醇溶蛋白，但不限于此。
在其中一些实施例中，所述天然高分子的质量百分比优选为2～70％，更优选为5～60％、更优选为5～50％,更优选为5～40％，更优选为5～30％，更优选为10～20％”
任何溶剂，只要满足能够溶解蛋白质和合成高分子溶质的条件，即可用于本发明目的。符合此目的的溶剂包括但不限于水、甲醇、酒精、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、二乙二醇双甲醚、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、丙三醇、丙酮、丁酮、戊酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、N，N-二甲基乙酰胺、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙醚、丁醚，四氢呋喃、二噁烷、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、乙氰，邻二氯苯、氟苯及其任意组合，优选为乙酸，特别是纯度>99.5％的乙酸，但不限于此。乙酸特别优选的原因在于具有强的溶解蛋白质和合成高分子的性质，由其所配成的生物墨水有理想的粘度，并能打印出所需的3D生物支架。
在其中一些实施例中，所述溶剂的质量百分比优选为30～80％,更优选为40～70％，且更优选为50～60％。
在该生物墨水的一个特定实施例中，所述生物墨水还包括以质量百分比计0.0001％至5％的荧光标记分子。
在一些实施例中，所述荧光标记分子为荧光标记的天然高分子。在一些实施例中，所述荧光标记分子可以来源于对本发明的生物墨水中的部分天然高分子组分进行荧光改性，由此可以打印得到具有荧光特性的产物。
在其中一些实施例中，所述荧光标记分子为荧光标记蛋白。在其中一些实施例中，所述荧光标记蛋白为植物源性蛋白质。用于标记的荧光分子只要满足一定的荧光强度即可，符合此目的的荧光发光团包括但不限于：选自香豆素(蓝色荧光)、荧光素、罗丹明、芘、尼罗红(红色荧光)、氟硼荧(绿色荧光)、IR-780(近红外荧光)中的任意一种，及其衍生物，或任意几种的组合。特别优选为香豆素(最大发射波长为435nm)，例如6,7-二甲氧基香豆素，其特别优选的原因在于具有强的荧光强度。
在其中一些实施例中，所述荧光标记分子的质量百分比优选为0.001％～5％,更优选为0.01％～5％，且更优选为0.1～3％，最优选为0.5～2％。
本发明还提供了用于制备上述任一种生物墨水的方法，包括以下步骤：
首先，根据所述的质量百分比称取所述天然高分子，或称取所述天然高分子及所述荧光标记分子，完全溶解于所述溶剂中，得到澄清溶液；其中，根据所选用的材料，该步骤可在例如常温下进行，且可利用超声等方法促进溶解，但时间不宜过长，以防止蛋白形成凝胶；
其次，根据所述的质量百分比称取所述合成可降解聚合物，使其完全溶解在所述澄清溶液中并混合均匀，得到颜色均一的溶液，即为所述生物墨水；其中，根据所选用的材料，可以利用例如40至60℃水浴及超声促进溶解，并适当搅拌，例如每隔10–20分钟搅拌一次，从而混合均匀。
在其中一个实施例中，根据需要，还可以进一步地将所得颜色均一的溶液(生物墨水)在20～40℃温度下(例如在30℃保温箱中)恒温静置一段时间，例如30分钟或以上，以除去气泡，以进一步优化墨水质量。
上述制备方法，利用植物醇溶蛋白和合成聚酯高分子独特的溶解特性，利用加热、超声、和搅拌的方式，使各组分在溶液中完成共混改性，形成均一稳定的3D打印生物墨水。
本发明还提供使用上述任一种生物墨水所制得的支架，例如组织工程支架。
在其中一些实施例中，所述支架使用上述任一种生物墨水经3D打印技术打印而成。
本发明还提供上述生物支架用于体外细胞生长的用途。
本发明还提供使用上述任一种生物墨水用于3D打印的用途。
在其中一些实施例中，使用上述任一种生物墨水进行3D打印，采用基于电流体喷射的3D打印装置。
在使用电流体喷射3D打印装置的一些实施例中，通过调节其打印过程中的打印参数，可形成孔径大小可变，图案形式多样，具有良好机械强度，和细胞亲和性的用于体外细胞生长的三维支架。
本发明还提供了使用上述任一种生物墨水以电流体喷射3D打印装置进行3D打印的方法。基于电流体喷射(EHD-jet)技术的3D打印装置/系统主要包括注射泵、连接软管、喷嘴、高压直流电源、打印底板、三维运动平台、软件及控制系统。在使用本发明的生物墨水时，其通过打印参数的调节，可以控制固化成型后的纤维的直径，及打印过程的速率和稳定性。成型支架的孔径大小和空隙率可由程序预设打印路径及叠加方式进行控制。例如，其打印参数可设置为：墨水供给速率：0.1–100μL/min；直流电压：1-3kV；喷嘴至底板距离：1-10mm；平台移动速率：1–300mm/s；温度：20-90℃。墨水供给速率优选为0.1–50μL/min，或更优选为0.2-10μL/min，或最优选为0.5–5μL/min。平台移动速率优选为5–300mm/s，更优选为10–300mm/s。温度优选为10-60℃，更优选为15-50℃，最优选为20-40℃。
本发明的第一方面的有益效果在于：提供了一种通过共混的方式形成的复合生物墨水，使用无毒性的溶剂作为共混载体，使合成高分子和天然高分子在溶液中进行分子层面的共混，从而兼具合成高分子和天然高分子的优点。经共混后形成的生物墨水均一稳定，其经电流体喷射技术3D打印成型后可形成孔径大小可控的三维组织工程支架。所述支架可降解，且通过调节生物墨水中各组分比例，可改变其降解速率。因此，本发明克服了现有3D打印墨水溶液成分结构单一、生物降解性不可控、很难兼顾细胞相容性、降解性和力学性能等缺点，提供了一种具有良好生物亲和性、可快速固化成型的生物墨水，由此墨水3D打印成型的支架具有足够机械强度，可控的细胞亲和性和可降解性。
在一些实施例中，本发明的生物墨水还可以包含荧光标记分子，使用该生物墨水经3D打印成型后的三维支架具有荧光特性，其在降解时荧光强度的变化可用于定量描述降解程度，由此可在进行细胞培养的同时监测支架降解程度，为材料可降解性的准确评估提供了一种新型的方法。
本发明的第二方面中，提供了一种用于制备荧光标记蛋白的方法，包括以下步骤：
将荧光分子衍生物和蛋白同时溶解于有机溶剂中；
加入碱，在20℃至150℃条件下搅拌反应1-24小时，所述温度优选为20℃至100℃，更优选为20℃至90℃，最优选为20至80℃；
反应液冷却后倒入饱和盐溶液(例如至少20倍体积)中析出蛋白，过滤、洗涤后即得所述荧光标记蛋白；在其中一些实施例中，饱和盐溶液为饱和硫酸铵水溶液。
在其中一些实施例中，本发明的上述方法还进一步包括纯化和干燥步骤：将得到的所述荧光标记蛋白重新溶解于乙醇水溶液中，过滤后旋蒸除去溶剂，并真空干燥；在其中一些实施例中，所述乙醇水溶液为70％乙醇水溶液。
在其中一些实施例中，用于上述方法中的所述荧光分子衍生物为荧光分子的卤代衍生物，例如溴代、氯代或碘代衍生物。用于标记的荧光分子只要满足一定的荧光强度即可，符合此目的的荧光发光团包括但不限于：所述荧光分子的溴代或氯代衍生物为4-溴甲基-6,7-二甲氧基香豆素(1)、卞溴取代的尼罗红(2)、卞氯取代的氟硼荧(3)和IR-780碘化物(4)(其结构式如下)中的任意一种或任意几种的组合，但不限于此。优选为4-溴甲基-6,7-二甲氧基香豆素，其特别优选的原因在于容易与蛋白质发生反应而得到带荧光生色团的蛋白质衍生物。
Figure BDA0001349833900000071
在其中一些实施例中，所述荧光分子衍生物的添加摩尔量为所述蛋白平均摩尔量的0.0001–10倍。
在其中一些实施例中，用于上述方法中的所述蛋白为植物源性蛋白质，即植物蛋白。任何植物源性蛋白质只要满足溶解度条件即可以用于此目的,包括但不限于：蔬菜蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、坚果蛋白、核桃蛋白、杏仁白、莲子蛋白、白芸豆蛋白、玉米蛋白、大麦蛋白，小麦蛋白、大豆蛋白，大米蛋白、花生蛋白中的任意一种或任意几种的组合。在一个优选的实施例中，所述植物蛋白为玉米蛋白。优选地，所述植物源性蛋白质为植物醇溶蛋白，包括但不限于：豆类醇溶蛋白、谷物醇溶蛋白、蔬菜醇溶蛋白、赖草属植物醇溶蛋白、椰子醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大豆醇溶蛋白、花生醇溶蛋白、豌豆醇溶蛋白、土豆醇溶蛋白、燕麦醇溶蛋白中的任意一种或任意几种的组合。优选的植物醇溶蛋白为小麦醇溶蛋白，玉米醇溶蛋白等。
在其中一些实施例中，上述方法所制备的荧光标记蛋白用于3D打印的生物墨水中。植物蛋白用于此用途的优点在于：在有机溶剂里溶解度高，溶液粘度和调导电率可控，且机械性能强。优选地，所述植物蛋白为植物醇溶蛋白，其用于此用途的优点在于能够获得的3D打印材料机械性能好，生物亲合度和可生物可降解性好，并且可调等技术效果。符合此目的的植物醇溶蛋白，其特别优选的原因在于具有理想的分子量、电导性、粘度、生物亲和度、生物可降解度，从而使所配制的墨水适合于打印出理想的3D生物支架。特别优选为玉米醇溶蛋白(例如分子量为21-26kDa的α-玉米醇溶蛋白)与小麦醇溶蛋白，但不限于此。
任何有机溶剂，只要能够满足可溶解上述荧光分子和蛋白质的条件，即可用于本发明的该方面的目的。符合此目的的溶剂包括但不限于：甲醇、酒精、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、二乙二醇双甲醚、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、丙三醇、丙酮、丁酮、戊酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、N，N-二甲基乙酰胺、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙醚、丁醚，四氢呋喃、二噁烷、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、乙氰，邻二氯苯、氟苯及其任意组合二甲亚砜(DMSO)中的任意一种或其组合，但不限于此。所述溶剂优选为乙酸,其优选的原因在于对高聚物的溶解能力强。
在其中一些实施例中，用于上述方法中的所述碱只要能满足能中和反应生成的酸即可。符合此目的的碱包括但不限于碳酸钠、碳酸钾、三乙胺、二异丙基甲基胺中的任意一种或任意几种的组合，但不限于此。所述碱优选为三乙基胺，其优选的原因在于其沸点适中，容易去除。
在其中一些实施例中，所述碱添加的摩尔量为荧光分子衍生物摩尔量的0.1至50倍，优选为1至10倍，更优选为3-5倍。
本发明还提供根据上述方法制得的荧光标记蛋白。
本发明还提供根据上述方法制得的荧光标记蛋白在制作用于3D打印的生物墨水中的用途。
本发明还提供一种包含根据上述方法所制备的荧光标记蛋白的生物墨水，该生物墨水包含按质量百分比计的如下组分：
1％～70％的合成可降解聚合物；
1％～70％的天然高分子；
0.0001％～5％的荧光标记分子；和
28％～98％的溶剂；
其中所述溶剂为水、有机溶剂或其任意组合，且所述荧光标记分子为根据上述方法制备的荧光标记蛋白。
在其中一些实施例中，所述合成可降解聚合物的质量百分比优选为10～60％,更优选为20～50％，且更优选为30～40％。
在其中一些实施例中，所述天然高分子的质量百分比优选为2～70％，更优选为5-60％、更优选为5-50％,更优选为5-40％，更优选为5-30％，更优选为10～20％。
在其中一些实施例中，所述溶剂的质量百分比优选为30～80％,更优选为40～70％，且更优选为50～60％。
在其中一些实施例中，所述荧光标记分子的质量百分比优选为0.001％至5％，更优选为0.01％～5％，更优选为0.1～3％，且最优选为0.5～2％。
在本发明的该方面中，可以使用任何合成可降解聚合物，只要其具有可生物降解性质，即可以用于此目的，例如包括但不限于各类聚酯和聚酰胺。在该生物墨水的其中一个实施例中，所述合成可降解聚合物优选为聚酯高分子，其适合用于此用途的优点在于：在有机溶剂里溶解度好，与天然高分子混合度高，且分子量可控，具有令所打印的支架形状多样化的技术效果。符合此目的的聚酯高分子包括但不限于：聚乳酸(Poly Lactic Acid；PLA)、聚己內酯(Poly-ε-caprolactone；PCL)、聚酐(Polyanhydride)、聚原酸酯(Polyorthoester)、聚D,L-丙交酯(PDLLA)、聚乙酸醇(PGA)，聚(对环氧己酮)(Poly(p-dioxanone))中的任意一种或任意几种的组合。优选的聚酯高分子为聚己内酯(例如重均分子量范围为10kDa至20kDa，熔点为30至100℃)，但不限于此。聚己内酯特别优选的原因在于，其在有机溶剂里溶解度高，并有理想的粘度和电导性，从而达到理想的3D打印效果。
在该生物墨水的其中一个实施例中，上述生物墨水中所述的天然高分子为植物源性蛋白质，即植物蛋白。任何植物源性蛋白质只要满足在有机溶剂里有足够的溶解度即可以用于此目的,包括但不限于：蔬菜蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、坚果蛋白、核桃蛋白、杏仁蛋白、莲子蛋白、白芸豆蛋白、玉米蛋白、大麦蛋白，小麦蛋白、大豆蛋白，花生蛋白中的任意一种或任意几种的组合。在一个优选的实施例中，所述植物蛋白为玉米蛋白。
优选地，所述植物源性蛋白质为植物醇溶蛋白，其用于此用途的优点在于：在有机溶剂里溶解度高，溶液粘度和调导电率可控，且机械性能强，使用植物醇溶蛋白能够获得的3D打印材料机械性能好，生物亲合度和可生物可降解性好，并且可调等技术效果。符合此目的的植物醇溶蛋白包括但不限于：豆类醇溶蛋白、谷物醇溶蛋白、蔬菜醇溶蛋白、赖草属植物醇溶蛋白、椰子醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大豆醇溶蛋白、花生醇溶蛋白、豌豆醇溶蛋白、土豆醇溶蛋白、燕麦醇溶蛋白中的任意一种或任意几种的组合。优选的植物醇溶蛋白为小麦醇溶蛋白，玉米醇溶蛋白等，其特别优选的原因在于具有理想的分子量、电导性、粘度、生物亲和度、生物可降解度，从而使所配制的墨水适合于打印出理想的3D生物支架。特别优选为玉米醇溶蛋白(例如分子量为21-26kDa的α-玉米醇溶蛋白)与小麦醇溶蛋白，但不限于此。
任何溶剂，只要满足能够溶解蛋白质和合成高分子溶质的条件，即可用于本发明目的。符合此目的的溶剂包括但不限于水、甲醇、酒精、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、二乙二醇、二乙二醇单甲醚、二乙二醇双甲醚、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、丙三醇、丙酮、丁酮、戊酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、N，N-二甲基乙酰胺、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙醚、丁醚，四氢呋喃、二噁烷、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、乙氰，邻二氯苯、氟苯及其任意组合，优选为乙酸，特别是纯度>99.5％的乙酸，但不限于此。乙酸特别优选的原因在于具有强的溶解蛋白质和合成高分子的性质，由其所配成的生物墨水有理想的粘度，并能打印出所需的3D生物支架。
本发明第二方面所提供的用于制备荧光标记蛋白的方法的有益效果在于：在现有方法中，大多数荧光标记染料的标记位点为蛋白质中赖氨酸侧链上的氨基、半胱氨酸侧链上的巯基，但是该方法很难用于标记几乎不含赖氨酸、半胱氨酸或其含量很低的蛋白，例如植物源性醇溶蛋白；本发明第二方面的技术方案提供了一种简单、高效的荧光标记蛋白，特别是植物源性醇溶蛋白的方法，其标记位点主要为蛋白中含有游离羟基、羧基的氨基酸，且标记效率高，产物稳定，弥补了现有标记方法的不足。
此外，使用根据本发明第二方面的方法所制备的荧光标记蛋白，可制成具有特殊荧光的生物墨水，该生物墨水可用于制得(例如通过3D打印)具有荧光特性的组织工程支架，其荧光强度变化可用于实时性评估支架降解程度。目前，对于可降解材料降解性能的评价主要采用重量法和扫描电镜观测法，其中利用酸、碱和酶来催化降解反应，加快降解速率，然后通过称量材料重量变化或观测表面形态的变化来评估材料降解性。这些方法无法真实反应材料在生物体内环境内的真实降解情况，且操作步骤繁琐，准确性差。而本发明中具有荧光特性的生物墨水及其制成的组织工程支架，利用荧光的灵敏性，通过检测降解过程中材料荧光强度的变化，来表征材料降解性，且其可在成型支架进行三维细胞培养的同时监测其降解情况，为可降解材料降解性能的评估提供新的思路和方法。
附图说明
图1为本发明实施例1-3和5-6中生物墨水3D打印过程中喷头移动路线(单层)和固化后支架的三维立体示意图。
图2为本发明实施例中制备的生物墨水经3D打印成型后形成的支架的光学显微镜照片，其中图2a、2b、2c分别展示了实施例1、2、3中打印所得的支架(分别为PCL支架、PCL-Zein(6-1)支架、PCL-Zein(5-2)支架)。
图3为本发明实施例2中生物墨水3D打印成型后形成的支架的正面、背面及截面的扫描电镜(SEM)照片。
图4为本发明实施例4中生物墨水3D打印成型后形成的支架的4a)光学显微镜成像照片和4b)其置于空气中3小时后从打印底板上剥离的实物照片。
图5为本发明实施例6中制备的生物墨水在正常光线下的照片(左)和其荧光照片(右；紫外激发，波长365nm)。
图6为本发明实施例6中制备的生物墨水经3D打印成型后形成的支架的激光共聚焦显微照片(左：俯视图；右：三维立体侧视图)。
图7为本发明实施例1、2、3中制备的生物墨水经3D打印成型后的支架，在实施例8的细胞培养实验第一天和第四天的共聚焦显微镜照片，图中PCL、PCL-Zein(6-1)、PCL-Zein(5-2)分别展示了实施例1、2、3中打印所得的支架。
图8为本发明实施例1、2、3中制备的生物墨水经3D打印成型后的支架，在实施例8的细胞培养实验第一天和第四天的细胞粘附数量的统计图，图中PCL、PCL-Zein(6-1)、PCL-Zein(5-2)分别展示了实施例1、2、3中打印所得的支架。
图9为本发明实施例1、2、3中制备的生物墨水经3D打印成型后的支架，在实施例9的体外酶加速降解实验中重量损失随时间变化的曲线，图中PCL、PCL-Zein(6-1)、PCL-Zein(5-2)分别展示了实施例1、2、3中打印所得的支架。
图10为本发明实施例1、2、3中制备的生物墨水经3D打印成型后的支架，在实施例9的支架降解实验中，降解前和蛋白酶降解12天后纤维表面的扫描电子显微镜(SEM)照片，图中PCL、PCL-Zein(6-1)、PCL-Zein(5-2)分别展示了实施例1、2、3中打印所得的支架。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施例作详细说明。这些实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例，具体保护范围见权利要求。
实施例1
本实施例是作为对照组的生物墨水(以下称为70％PCL对照材料)的制备实施例。
本实施例的生物墨水由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：70％；
冰乙酸(纯度>99.5％):30％。
本实施例的70％PCL对照材料的制备方法如下所述：在常温下，向5ml冰乙酸中加入聚己内酯颗粒(3.500g)，在50℃水浴中超声溶解，每隔15分钟搅拌一次，使其完全溶解并混合均匀，得到颜色均一的溶液，即为生物墨水。将该生物墨水溶液在30℃保温箱中静置半小时，除去气泡后备用。
本实施例的70％PCL对照材料的打印过程及参数设置如下所述：将上述生物墨水转移至5ml注射器中，放置于微量注射泵中，连接上软管和喷嘴，固定喷嘴位置垂直于打印底板。
调节注射泵的注射速率为5μL/min、喷嘴与打印底板间的垂直距离为6mm、平台移动速率为100mm/s、电压稳定在1kV、打印温度为室温。设置打印程序，使打印路径如图1所示，孔径大小为400mm、打印层数为24层。待墨水挤出速率稳定后，打印底板接高压电源，按预设路径完成打印。
70％PCL对照材料打印成型后的支架(以下简称为70％PCL支架)的光学显微镜成像照片如图2a所示，据估算，其平均直径为24.8μm，平均孔径大小为374μm。
实施例2
本实施例所述的是制备本发明用于3D打印的生物墨水，将其用于打印支架的一个示例，其中分别以聚己内酯、玉米醇溶蛋白和冰乙酸作为合成可降解聚合物、植物源性蛋白质和溶剂的示例，但并不限于此。
本实施例的生物墨水由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：60％；
玉米醇溶蛋白粉末(纯度>98％):10％；
冰乙酸(纯度>99.5％):30％。
本实施例的生物墨水的制备方法如下所述：首先，在常温下，称取玉米醇溶蛋白(0.500g)，加入5ml冰乙酸，水浴超声使其完全溶解，得到黄色澄清溶液；其次，向该溶液中加入聚己内酯颗粒(3.000g)，在50℃水浴中超声溶解，每隔15分钟搅拌一次，使其完全溶解并混合均匀，得到颜色均一的溶液，即为生物墨水。最后，将该溶液在30℃保温箱中静置半小时，除去气泡后备用。
本实施例的生物墨水的打印程序设置同实施例1，且参数设置如下所述：调节注射泵的注射速率为1μL/min，喷嘴与打印底板间的垂直距离为3mm，控制温度为26℃。在实践中，可以根据需要调整上述打印程序和参数的设置。
本实施例的生物墨水打印成型后，所得支架的光学显微镜成像照片如图2b所示。经过测量，其平均直径为25.0μm，平均孔径大小为384μm。支架立体结构见图3扫描式电子显微镜(SEM)照片所示。
实施例3
本实施例所述的是制备本发明用于3D打印的生物墨水，将其用于打印支架的又一个示例，其中分别以聚己内酯、玉米醇溶蛋白和冰乙酸作为合成可降解聚合物、植物源性蛋白质和溶剂的示例，但并不限于此。
本实施例的生物墨水由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：50％；
玉米醇溶蛋白粉末(纯度>98％):20％；
冰乙酸(纯度>99.5％):30％。
其制备方法同实施例2，但所用的玉米醇溶蛋白为1.000g，聚己内酯颗粒为2.500g。
此生物墨水的打印程序设置同实施例1，且参数设置如下所述：调节注射泵的注射速率为1μL/min，喷嘴与打印底板间的垂直距离为3mm，平台移动速率为150mm/s，电压稳定在2.8kV，打印温度为27℃。
本实施例的生物墨水打印成型后，所得支架的光学显微镜成像照片如图2c所示。据估算，其平均直径为28.5μm，平均孔径大小为380μm。支架立体结构与实施例1中扫描式电子显微镜照片所示类似。
实施例4
本实施例所述的是制备本发明用于3D打印的生物墨水，将其用于打印支架的一个示例，其中分别以聚己内酯、小麦蛋白和冰乙酸作为合成可降解聚合物、植物源性蛋白质和溶剂的示例，但并不限于此。
本实施例的生物墨水由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：60％；
冻干小麦蛋白粉:10％；
冰乙酸:30％。
本实施例的生物墨水的制备方法如下所述：首先，称取小麦蛋白(0.500克)，加入5毫升乙酸，水浴超声使其完全溶解，得到溶液。其次，向该溶液中加入聚己内酯(3.000克)，在水浴中超声溶解，每隔30分钟搅拌一次，使其完全溶解并混合均匀，得到颜色均一的溶液，即为生物墨水。最后，将该溶液在30℃保温箱中静置1小时，待气泡消失后备用。
本实施例的生物墨水的打印程序设置同实施例1，且参数设置如下所述：调节注射泵的注射速率为0.1-40μL/min、喷嘴与打印底板间的垂直距离为1-10mm，平台移动速率为10-2000mm/s，电压稳定在0.5-5.0kV。在实践中，可以根据需要调整上述打印程序和参数的设置。
本实施例的生物墨水打印成型后，所得支架的光学显微镜成像照片如图4a所示。经过测量，其平均直径为73.0μm，平均孔径大小为330μm。本实施例的生物墨水打印成型后置于空气中3小时后，易于从打印底板上剥离，如图4b所示。
实施例5
本实施例所述的是本发明用于制备荧光标记蛋白的方法的一个示例，其中分别以香豆素染料、玉米醇溶蛋白作为标记用荧光分子和醇溶蛋白的示例，但不限于此。
制备方法如下所述：
称取4-溴甲基-6,7-二甲氧基香豆素(30mg)和玉米醇溶蛋白(1g)，同时溶解到反应瓶中的N,N-二甲基甲酰胺(15ml)；
向反应瓶中加入碳酸钾粉末(120mg)，在65℃下搅拌反应12小时；
反应液冷却后，将其倒入400ml的饱和硫酸铵溶液中，析出的蛋白进行减压过滤，所得固体先用去离子水(3×100ml)进行冲洗，然后依次用乙酸乙酯(3×50ml)、二氯甲烷(3×50ml)、丙酮(3×50ml)洗涤，最后再用去离子水(3×100ml)进行淋洗；
将过滤、洗涤后的固体重新溶解于70％乙醇水溶液中，过滤除去不溶杂质，旋蒸除去溶剂，真空干燥后即得到香豆素荧光分子标记的玉米醇溶蛋白。
实施例6
本实施例所述的是制备本发明用于3D打印的生物墨水，并将其用于打印支架的又一个示例，其中分别以聚己内酯、玉米醇溶蛋白、6,7-二甲氧基香豆素和冰乙酸作为合成可降解聚合物、植物源性蛋白质、荧光标记分子和溶剂的示例，但并不限于此。
本实施例所述的用于3D打印的生物墨水，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：60％；
玉米醇溶蛋白粉末(纯度>98％):9％；
6,7-二甲氧基香豆素标记玉米醇溶蛋白粉末：1％；
冰乙酸(纯度>99.5％):30％。
其制备方法同实施例2，但所用的玉米醇溶蛋白为0.450g，聚己内酯颗粒为3.000g，6,7-二甲氧基香豆素标记玉米醇溶蛋白粉末0.050g。
其中，在制备上述生物墨水前，可先根据实施例4所述方法制备香豆素染料标记玉米醇溶蛋白。
本实施例制备得到的用于3D打印的生物墨水，在365nm光激发下显示出明显的蓝色荧光，如图5所示。使用此生物墨水按照实施例2中的打印参数打印支架，成型后的支架可由激光共聚焦显微镜三维荧光成像(激光激发波长为405nm)，如图6所示。
实施例7
本实施例所述的是制备本发明用于3D打印的生物墨水的又一个示例，其中分别以聚己内酯、玉米醇溶蛋白、6,7-二甲氧基香豆素和冰乙酸作为合成可降解聚合物、植物源性蛋白质、荧光标记分子和溶剂的示例，但并不限于此。
本实施例所述的用于3D打印的生物墨水，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：
聚己内酯颗粒(平均分子量80kDa)：50％；
玉米醇溶蛋白粉末(纯度>98％):18％；
6,7-二甲氧基香豆素标记玉米醇溶蛋白粉末：2％；
冰乙酸(纯度>99.5％):30％。
其中，可以使用如实施例4所述的方法来制备如上所用的香豆素标记玉米醇溶蛋白。
本实施例的生物墨水的制备方法同实施例2，但所用的玉米醇溶蛋白为0.900g，聚己内酯颗粒为2.500g，6,7-二甲氧基香豆素标记玉米醇溶蛋白粉末0.100g。
本实施例制备得到的用于3D打印的生物墨水，其荧光特性和打印成型的支架，与实施例5相仿。
实施例8
本实施例所述的是由实施例1、2、3中的生物墨水经3D打印而成的复合材料支架进行细胞培养对比实验示例。
实验方法：
1)细胞培养对比实验步骤如下：
将实施例1、2、3中的支架剪为大小为(1cm*1cm)的方块样品。此支架样品经灭菌后进行细胞培养实验，接种细胞为H1299人体肺癌细胞(非小细胞性肺癌)，接种细胞密度为4*106/ml，细胞培养液为RPMI-1640(含10％初生胎牛血清和1％的抗生素)，培养容器为24孔超低吸附细胞培养皿(Corning)。细胞初始接种密度为4*106/ml，接种体积为15μl，接种后于细胞培养箱中静置1.5小时，然后加入985μl RPMI-1640培养液进行培养(37℃,5.1％CO2)，每两天更换新的细胞培养液。
2)为了观察细胞的粘附、增殖状况，按如下步骤进行染色：
将预处理支架转移至新的细胞培养皿中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，加入1ml Hoechst 33342(10μg/ml in RPMI-1640)染色15分钟。染色结束后用PBS洗涤3遍。然后加入1ml DiI(10μM in RPMI-1640)染色15分钟。染色结束后用PBS洗涤3遍。之后用激光共聚焦显微镜进行成像。
3)为了定量表示细胞粘附数量，按照如下步骤，将细胞解吸附后使用流式细胞仪进行计数：
将细胞培养后的支架转移至新的培养皿中，加入1ml胰蛋白酶(0.25％inPBS)处理5-10分钟，并在显微镜下观察，使细胞处于预解离状态。轻轻吸走蛋白酶溶液，加入1ml经过滤的PBS溶液(0.22μm过滤)，使用移液枪头吹散粘附于支架上的细胞，使其孤立的分散于溶液中，将此悬浊液定量转移至离心管中，并加入1ml经过滤的PBS清洗剩余细胞，合并悬浊液进行细胞计数。
实验结果：
细胞的粘附、增殖状况的激光共聚焦显微镜成像结果如图7所示，细胞解吸附后使用流式细胞仪进行计数的结果如图8所示。
实施例1、2、3中的支架，细胞在第一天和第四天的粘附、增殖状况如图7的激光共聚焦显微镜照片所示，其中细胞分别经DiI细胞膜染料和Hoechst 33342细胞核染料进行染色。由图7可知，与实施例1中所制备的PCL支架相比较，培养第一天时，实施例2、3中的PCL-Zein支架的细胞黏附的数量明显多于纯PCL支架。在培养至第五天后，实施例2、3中的PCL-Zein支架细胞增殖数量仍旧明显多于PCL支架。由此可知，经玉米蛋白改性后的生物墨水所打印的支架更利于细胞粘附和增殖，其细胞亲和性明显提升。
实施例1、2、3中的支架，在细胞培养第一天和第四天的细胞计数情况如图8所示。细胞粘附、增殖的定量结果与激光共聚焦显微镜照片的定性结果一致，经玉米蛋白改性的支架展现出更好的细胞亲和性。
实施例9
本实施例所述的是由实施例1、2、3中的生物墨水经3D打印而成的复合材料支架进行降解性对比实验示例。
实验方法：
1)体外(In-vitro)酶加速降解实验评估支架降解性：实施例1、2、3中打印成型的支架首先在真空烘箱(40℃)中干燥至恒重，称量得到支架初始质量(Wi)。在培养皿中加入5mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4，含100UI/mL青霉素和100μg/mL链霉素)和25μl蛋白酶k(Proteinase k,20mg/ml,PCR grade)，使得溶液中蛋白酶的最终浓度为0.1mg/ml。支架经灭菌后加入培养皿中，并放入生物培养箱中(37℃,5.1％CO2)，每隔两天取出支架，用去离子水洗涤3遍后，放入真空烘箱中(40℃)干燥至恒重，记录j天后支架的重量(Wj)。之后更换新的磷酸缓冲液和蛋白酶，继续降解实验。
2)支架降解情况：由支架重量损失(Weight Loss％)和降解时间(Day)曲线表示，其中支架重量损失由以下公式进行计算：
Weight loss(％)＝(Wi–Wf)/Wi*100％。
3)支架降解前后的纤维表面结构：可由扫描电子显微镜(SEM)图片显示，所测试有样品均进行表面溅射镀铂(Pt)。
实验结果：
实施例1、2、3中的支架降解情况的实验结果如图9所示，支架降解前后的纤维表面结构如图10所示。
由此实施例中的对比可得，经玉米醇溶蛋白改性的后的支架在体外蛋白酶加速实验中表现出更好的降解性能，且通过调节材料中蛋白与聚内酯的比例可以调控支架整体的降解速率。由SEM图可知，含有蛋白的支架降解后形成纳米尺度的多孔支架，极大地增加了支架的比表面积。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种用于电流体喷射成型的生物墨水，以质量百分比计，由如下成分组成：
40％～70％的合成可降解聚合物；
1％～30％的天然高分子；和
28％～50％的溶剂；
其中所述溶剂为水、有机溶剂或其任意组合，
所述天然高分子为植物源性蛋白质，所述合成可降解聚合物为聚酯高分子。
2.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述生物墨水还包括以质量百分比计0.0001％～5％的荧光标记分子。
3.用于制备根据权利要求1-2中任一项所述的生物墨水的方法，包括以下步骤：
根据所述的质量百分比称取所述天然高分子，或称取所述天然高分子及所述荧光标记分子，溶解于所述溶剂中，得到澄清溶液；
根据所述的质量百分比称取所述合成可降解聚合物，溶解在所述澄清溶液中并混合均匀，得到颜色均一的溶液，即为所述生物墨水。
4.一种组织工程支架，其用权利要求1-2中任一项所述的生物墨水或权利要求3所述的方法制得的生物墨水经3D打印制得。
CN201710571668.5A 2017-07-13 2017-07-13 生物墨水及其制备方法和应用 Active CN109251492B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710571668.5A CN109251492B (zh) 2017-07-13 2017-07-13 生物墨水及其制备方法和应用
SG10201806004VA SG10201806004VA (en) 2017-07-13 2018-07-12 Bio-ink and preparation method and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710571668.5A CN109251492B (zh) 2017-07-13 2017-07-13 生物墨水及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109251492A CN109251492A (zh) 2019-01-22
CN109251492B true CN109251492B (zh) 2022-10-28

Family

ID=65050581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710571668.5A Active CN109251492B (zh) 2017-07-13 2017-07-13 生物墨水及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109251492B (zh)
SG (1) SG10201806004VA (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110330797A (zh) * 2019-07-10 2019-10-15 东华大学 一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水及其制备方法和应用
CN112275034B (zh) * 2020-09-27 2021-08-10 华南理工大学 一种基于电流体印刷银滤芯及其制备方法与应用
CN112873838B (zh) * 2021-02-02 2022-04-05 中山大学 一种生物墨水打印条件筛选平台及筛选方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2857098B1 (fr) * 2003-07-04 2006-05-05 Inst Nat Sante Rech Med Procede de mise en evidence d'un evenement moleculaire dans une cellule grace a des proteines marqueurs fluorescentes.
US20150037385A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 Northwestern University Ceramic-containing bioactive inks and printing methods for tissue engineering applications

Also Published As

Publication number Publication date
CN109251492A (zh) 2019-01-22
SG10201806004VA (en) 2019-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mobaraki et al. Bioinks and bioprinting: A focused review
Aljohani et al. Bioprinting and its applications in tissue engineering and regenerative medicine
Unagolla et al. Hydrogel-based 3D bioprinting: A comprehensive review on cell-laden hydrogels, bioink formulations, and future perspectives
Samadian et al. Natural polymers-based light-induced hydrogels: Promising biomaterials for biomedical applications
Na et al. Effect of solution viscosity on retardation of cell sedimentation in DLP 3D printing of gelatin methacrylate/silk fibroin bioink
McCarthy et al. The use of bacterial polysaccharides in bioprinting
Tohamy et al. Novel alginate/hydroxyethyl cellulose/hydroxyapatite composite scaffold for bone regeneration: In vitro cell viability and proliferation of human mesenchymal stem cells
Kim et al. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing
Fu et al. Responsive biomaterials for 3D bioprinting: A review
Hospodiuk et al. The bioink: A comprehensive review on bioprintable materials
Wu et al. Processing and properties of chitosan inks for 3D printing of hydrogel microstructures
CN109251492B (zh) 生物墨水及其制备方法和应用
Adhikari et al. Development of hydroxyapatite reinforced alginate–chitosan based printable biomaterial-ink
Hoch et al. Chemical tailoring of gelatin to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting
Khan et al. Fabrication of polymeric biomaterials: a strategy for tissue engineering and medical devices
Jing et al. Zein increases the cytoaffinity and biodegradability of scaffolds 3D-printed with zein and poly (ε-caprolactone) composite ink
Unal et al. Glioblastoma cell adhesion properties through bacterial cellulose nanocrystals in polycaprolactone/gelatin electrospun nanofibers
CN103948967B (zh) 一种负载信号分子的三维组织工程纳米纤维支架及其制备方法
Li et al. Preparation and characterization of photocurable composite extracellular matrix-methacrylated hyaluronic acid bioink
Taneja et al. Hydrogel based 3D printing: Bio ink for tissue engineering
Jing et al. Using plant proteins to develop composite scaffolds for cell culture applications
Xie 3D printing of biopolymer-based hydrogels
Guo et al. A natural biomineral for enhancing the biomineralization and cell response of 3D printed polylactic acid bone scaffolds
Patel et al. Self‐assembly of multiscale anisotropic hydrogels through interfacial polyionic complexation
Santoni et al. Preliminary tests on PEG-based thermoresponsive polymers for the production of 3D bioprinted constructs

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant