CN111272518B - 一种荧光探针及其在细胞染色中的应用 - Google Patents

一种荧光探针及其在细胞染色中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种荧光探针及其在细胞染色中的应用。该荧光探针的结构式如式(I)所示。本发明的化合物可用于细胞染色质致密程度分析，而且具有易于制备、荧光强度高、水溶性好、低荧光背景等特点；本发明的化合物可用于临床肿瘤病理组织切片的一步法快速荧光染色，无需水洗，并可辅助判断切片上的肿瘤细胞区域与正常组织细胞区域。

Description

一种荧光探针及其在细胞染色中的应用
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，特别是涉及一种荧光探针及其在细胞染色中的应用，具体是一种荧光探针及其在细胞染色质致密程度分析中的临床应用。
背景技术
染色质致密程度是染色质在不同细胞周期或不同细胞状态下的疏松或紧密程度，在细胞的静息与激活、分裂与增殖、肥大以及凋亡等生物学过程中，染色质的致密程度发生着动态变化。目前常用的染色质致密程度分析方法主要包括高分辨率显微镜成像法和高通量染色体构象捕获法(high-throughput chromosome conformation capture,Hi-C)，但操作复杂、耗时长，且检测费用昂贵。荧光探针作为荧光成像技术的核心，需具备生物相容性好、灵敏度高、操作简便等特点，但现有的荧光探针无法用于对染色质的致密程度进行分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有荧光染料的缺陷和不足，迫切需要开发一种可以快速、便捷、经济地对染色质致密程度进行判断的荧光探针，本发明提供一种荧光探针及其制备与应用，克服传统荧光材料的聚集猝灭发光的缺陷，具备良好的光稳定性、高荧光强度、高灵敏度等优点，并可完成长时荧光成像。
本发明的荧光探针用作初步判断细胞染色质致密或疏松的荧光成像剂，利用该探针实现对肿瘤细胞核仁区域的红色荧光成像及对人外周血白细胞细胞核染色质区域的红色荧光成像。利用该探针实现对临床肿瘤病理组织切片的快速荧光染色，并可依据荧光信号在细胞核内的分布差异对肿瘤细胞与正常组织细胞进行区分。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种荧光探针，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002380882470000011
所述式(I)中，Ar1为芳香环；Ar2为氮杂芳香环；n≥1且为整数；R1、R2为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链；R3、R4、R5为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链；X1、X2为相同或不同的阴离子。
可选地，Ar1选自以下化学结构式(1)～(20)中的任意一种；Ar2选自以下化学结构式(21)～(27)中的任意一种；
X1、X2选自以下化学结构式(28)～(34)中的任意一种；
Figure BDA0002380882470000021
其中，Ar1上的R’为氢，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，一个或多个碳原子任选地被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代；Ar2上的R”为氢，或者，R”为取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，R”上的一个或多个碳原子任选地被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代；
其中，*表示取代位置。
可选地，所述荧光探针的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002380882470000031
本发明还提供一种含有上述荧光探针的染色剂或细胞培养基。
可选地，所述染色剂或细胞培养基还含有缓冲液，缓冲液能保持组织细胞需要的pH范围，其中所含的盐浓度与体内环境的相似，对细胞也无毒害。
可选地，所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(即PBS缓冲液)，一方面，PBS缓冲液能保持组织细胞需要的pH范围，另一方面，其中所含的盐浓度与体内环境的相似，对组织细胞没有毒性作用，用PBS缓冲液清洗细胞时，只会去掉培养基及其中所含的影响实验结果的成分，PBS缓冲液对试验结果没有影响，对细胞也无毒害。
可选地，所述染色剂中荧光探针的浓度为0.01μmol·L-1-10000μmol·L-1，包括但不限于0.01μmol·L-1、0.03μmol·L-1、0.04μmol·L-1、0.05μmol·L-1、0.06μmol·L-1、0.08μmol·L-1、0.10μmol·L-1、0.15μmol·L-1、0.20μmol·L-1、0.25μmol·L-1、0.30μmol·L-1、0.40μmol·L-1、0.50μmol·L-1、0.60μmol·L-1、0.70μmol·L-1、0.80μmol·L-1、0.90μmol·L-1、1μmol·L-1、5μmol·L-1、8μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、50μmol·L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1、500μmol·L-1、800μmol·L-1、1000μmol·L-1、2000μmol·L-1、3000μmol·L-1、4000μmol·L-1、5000μmol·L-1、6000μmol·L-1、7000μmol·L-1、8000μmol·L-1、9000μmol·L-1、10000μmol·L-1，染色剂中荧光探针的浓度不受上述限制，也可以是其他浓度，能够使样品被成功染色即可。
上述分子可结合流式细胞仪、荧光显微镜，用于血液、体液等标本的肿瘤细胞、幼稚细胞筛查。
本发明还提供上述荧光探针在制备细胞染色剂中的应用。
可选地，所述细胞包括但不限于肿瘤细胞、白细胞。
可选地，所述细胞染色剂用于分析细胞染色质的致密程度。
可选地，所述细胞染色剂用于分析提取的细胞DNA的致密程度。
可选地，所述细胞染色剂用于分析细胞周期。
可选地，所述细胞染色剂用于肿瘤细胞核仁区域荧光染色成像。
可选地，所述细胞染色剂用于白细胞细胞核染色质区域染色成像。
可选地，所述白细胞包括但不限于巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、枯否细胞。
可选地，所述细胞染色剂用于临床肿瘤病理组织切片染色。
可选地，所述细胞染色剂用于区分肿瘤细胞与正常组织细胞。
可选地，所述肿瘤细胞包括但不限于肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、骨肉瘤细胞、脑癌细胞、肾癌细胞、甲状腺癌细胞、淋巴癌细胞、胆管癌细胞、子宫癌细胞、前列腺癌细胞、大肠癌细胞等，上述细胞仅仅是部分列举，本发明适用于所有恶性细胞的检测。
可选地，所述细胞染色剂用于检测白血病细胞和/或体液肿瘤细胞。
本发明还提供上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：将醛基取代的化合物和具有活泼α-氢原子的化合物溶于溶剂中，用弱碱进行催化，在保护气体的保护下回流反应，制得所述荧光探针。
可选地，所述醛基取代的化合物选自如下结构中的至少一种。
Figure BDA0002380882470000041
其中，Ar1为芳香环，选自化学结构式(1)～(20)中的任意一种；R1、R2为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链。
可选地，所述具有活泼α-氢原子的化合物选自如下结构中的至少一种。
Figure BDA0002380882470000042
其中，Ar2为氮杂芳香环，选自化学结构式(21)～(27)中的任意一种；n≥1且为整数；R3、R4、R5为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链；X1、X2为相同或不同的阴离子，选自以下化学结构式(28)～(34)中的任意一种；
Figure BDA0002380882470000043
Figure BDA0002380882470000051
可选地，所述溶剂选自无水乙醇、甲醇、乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种。
可选地，所述弱碱选自胺、吡啶、哌啶、吗啉中的至少一种。
可选地，所述保护气体选自氮气、氩气中的至少一种。
可选地，回流反应结束后，将反应液冷却至室温，旋转蒸发去除溶剂，所得粗产物进一步用中性氧化铝柱进行过柱提纯，再经真空干燥得到如式(I)所示的最终产物。
可选地，所示中性氧化铝柱以二氯甲烷、甲醇混合液为洗脱剂。
荧光探针的合成方法不受上述限制，也可以是其他可行的合成方法。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的化合物可用于细胞染色质致密程度分析，而且具有易于制备、荧光强度高、水溶性好、低荧光背景等特点。
2、本发明的化合物可用于临床肿瘤病理组织切片的一步法快速荧光染色，无需水洗，并可辅助判断切片上的肿瘤细胞区域与正常组织细胞区域。
附图说明
图1-1为实施例1的化合物MASPB核磁氢谱图，图1-2为实施例1的核磁碳谱图，图1-3为实施例1的高分辨率质谱图；
图2(A)为实施例1的化合物MASPB在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱(MASPB的浓度为1×10-5mol·L-1)；图2(B)为实施例1的化合物MASPB在二甲基亚砜中的荧光发射光谱图(1×10-5mol·L-1)；
图3(A)为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为1×10-5mol·L-1)在水和四氢呋喃混合溶液中不断增加四氢呋喃含量的荧光发射光谱图；图3(B)为实施例1(MASPB的浓度为1×10-5mol·L-1)在不同水/四氢呋喃混合溶剂中(I)与在水中(I0)的荧光强度之比(I/I0)；
图4为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1)在水相中的粒径分布图；
图5为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1)与商用RNA染料SYTO RNASelect Green的光稳定性比较，所用细胞为A549细胞；
图6为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1)与商用RNA染料SYTO RNASelect Green共染A549细胞内核仁区域共定位情况的荧光图像；(A)实施例1染色后的荧光图像，(B)SYTO RNASelect Green染色后的荧光图像；(C)实施例1和SYTORNASelect Green染色后的合并荧光图像；
图7为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染不同肿瘤细胞系(MDA-MB-231细胞、A549细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞、SMMC-7721细胞)的荧光图像；(A-E)实施例1染色后的荧光图像；(F-J)DAPI染色后的荧光图像；(K-O)实施例1和DAPI染色后的合并荧光图像；
图8为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染人外周血白细胞的荧光图像；(A)实施例1的化合物MASPB染色后的荧光图像；(B)商用DNA染料DAPI染色后的荧光图像；(C)明场图像；(D)实施例1的化合物MASPB和商用DNA染料DAPI染色后以及明场的合并荧光图像；
图9为HeLa细胞经过DNase和RNase处理后用实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染的荧光图像；(A-D)HeLa细胞未经DNase和RNase处理时的荧光图像；(E-H)HeLa细胞经DNase处理后的荧光图像；(I-L)HeLa细胞经RNase处理后的荧光图像；其中，(A,E,I)为实施例1的化合物MASPB染色后的荧光图像，(B,F,J)为DAPI染色后的荧光图像，(C,G,K)为明场图像，(D,H,L)为相应实施例1、DAPI和明场染色后的合并荧光图像；
图10为人外周血白细胞经过DNase和RNase处理后用实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染的荧光图像；(A-D)白细胞未经DNase和RNase处理时的荧光图像；(E-H)白细胞经DNase处理后的荧光图像，(I-L)白细胞经RNase处理后的荧光图像；其中，(A,E，I)为实施例1的化合物MASPB染色后的荧光图像，(B,F,J)为DAPI染色后的荧光图像，(C,G,K)为明场图像，(D,H,L)为相应实施例1、DAPI和明场染色后的合并荧光图像；
图11(A)为HeLa细胞透射电镜图像；(B)人外周血白细胞透射电镜图像；(C)HeLa细胞核染色质、人外周血白细胞核染色质以及HeLa细胞核仁的平均灰度值分析；
图12显示为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1mol·L-1)染色下人外周血淋巴细胞不同细胞周期染色质(体)的荧光图像；(A)分裂间期；(B)分裂前期；(C)分裂中期；(D)成熟期；
图13(A)显示为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1mol·L-1)在含有不同肿瘤细胞及人外周血白细胞的相同浓度DNA(100ng/μL)溶液中的荧光光谱图以及(B)在608nm处的发射光平均荧光强度分析；
图14显示为肺腺癌病理组织切片的染色图像；(A)HE染色下的肺腺癌病理组织切片的普通光学显微镜图像；(B)实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L- 1mol·L-1)和DAPI共染后的肺腺癌病理组织切片的荧光图像；
图15显示为实施例1的化合物MASPB(MASPB的浓度为2×10-5mol·L-1mol·L-1)用于肺腺癌病理组织切片染色的荧光图像；(A)实施例1的化合物MASPB染色后的荧光图像，(B)DAPI染色后的荧光图像；(C)实施例1的化合物MASPB、DAPI染色后的合并荧光图像；白色三角形所指为纤维细胞细胞核，白色箭头所指为肺腺癌细胞细胞核。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例提供一种荧光探针，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002380882470000071
式I中，Ar1为芳香环；Ar2为氮杂芳香环；n为大于等于1的整数；R1、R2为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链；R3、R4、R5为相同或者不同的，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链；X1、X2为相同或不同的阴离子。
其中，Ar1选自以下化学结构式1～20中的任意一种；Ar2选自以下化学结构式21～27中的任意一种；X1、X2选自以下化学结构式28～34中的任意一种；
Figure BDA0002380882470000081
其中，Ar1上的R’为氢，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，一个或多个碳原子任选地被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代；Ar2上的R”为氢，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，一个或多个碳原子任选地被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代。
其中，*表示取代位置。
式(I)中化合物的制备采用经典的Knoevenagel缩合反应，合成简单，原料便宜易得。主要制备方法包括以下步骤：将醛基取代的化合物(1eq)和具有活泼α-氢原子的化合物(1eq)溶于无水乙醇液中，用弱碱(如胺、吡啶、哌啶、吗啉等)进行催化，于氮气氛围中回流反应过夜；反应完毕之后将反应液冷却至室温，采用旋转蒸发仪除去溶剂，所得粗产物进一步用中性氧化铝柱进行过柱提纯(以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，再经真空干燥，得到如式(I)所述的最终产物。
上述荧光探针用于初步判断细胞染色质致密或疏松的荧光成像剂，利用该探针实现对肿瘤细胞核仁区域的红色荧光成像及对人外周血白细胞细胞核染色质区域的红色荧光成像。
上述荧光探针可依据其荧光信号在细胞核内的分布差异对临床肿瘤病理组织切片中的肿瘤细胞和正常组织细胞进行区分，前述临床肿瘤病理组织切片可取材于肺腺癌组织。
式(I)化合物的荧光探针对肿瘤细胞核仁区域的红色荧光成像，通过与商用RNA染料SYTO RNASelect Green进行共染得到了证实。“商用”是指从市场购买得到。
式(I)化合物的荧光探针对人外周血白细胞细胞核染色质区域的红色荧光成像，通过与商用DNA染料DAPI进行共染得到了证实。
式(I)化合物的荧光探针具有良好的水溶性，具有低荧光背景的优点。
本发明实施例制备的式(I)化合物具有聚集诱导发光的性质，光稳定性好，荧光强度高，并可完成长时荧光成像。
需强调的是，在现有的技术中，未有文献报道过本发明实施例的式Ⅰ化合物应用于细胞染色质致密程度分析。
以下实施例中，MDA-MB-231细胞、A549细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞、SMMC-7721细胞、HeLa细胞均购于中国医学科学院肿瘤医院。
以下实施例中，PBS缓冲液(规格：500mL)均购自Gibco公司，PBS缓冲液货号：C10010500BT，pH为7.4。
以下实施例中，Ribonuclease A(RNase A)、Recombinant DNaseⅠ(RNase-free)购于TaKaRa公司。Recombinant DNaseⅠ(RNase-free)的货号：2270A。
以下实施例中，染料SYTO RNASelect Green Fluorescent Cell Stain购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：S32703。
以下实施例中，细胞凋亡-DAPI染色试剂盒购于上海BestBio贝博生物有限公司，货号BB-4133。
以下实施例中，MASPB/PBS溶液表示化合物MASPB与PBS缓冲液混合而成的溶液。
以下实施例及附图中，化合物I即为化合物MASPB。
以下实施例中，浓度为10μg·mL-1的DAPI染色液是指细胞凋亡-DAPI染色试剂盒与PBS缓冲液的混合液，混合液中DAPI的浓度为10μg·mL-1。
以下实施例中，MASPB浓度为20μM的MASPB/PBS溶液是指MASPB与PBS缓冲液的混合液，混合液中MASPB的浓度为20μM，即2×10-5mol·L-1。
实施例1
化合物MASPB的制备按照如下反应式进行：
Figure BDA0002380882470000091
其中，化合物35、36、38是从TCI公司(东京化成工业株式会社)购买得到；化合物37根据文献(Ping Yan,Aifang Xie,Meide Wei,and Leslie M.Loew.Amino(oligo)thiophene-Based Environmentally SensitiveBiomembraneChromophores.J.Org.Chem.2008,73,6587–6594；具体合成方法见该文献的“Results andDiscussion,synthesis”部分)合成。
其中，化合物MASPB的制备包括以下步骤：取化合物37(1.06g,3mmol)和化合物38(0.45g,3mmol)溶于5mL无水乙醇液中，并加入几滴哌啶混匀，哌啶为弱碱，主要起催化作用。将上述溶液在氮气保护下回流反应过夜后，冷却至室温，采用旋转蒸发仪除去溶剂，将所得红棕色粗产物进一步用中性氧化铝柱进行提纯，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂，再经真空干燥得到红棕色粉末状产物MASPB(0.80g),产率55％。
采用的质谱仪为超高分辨三合一质谱仪Orbitrap Fusion Tribrid，Thermo，USA，化合物MASPB的结构表征数据如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.85(d,J＝6.6Hz,2H),8.12(d,J＝6.9Hz,2H),7.98(d,J＝16.0Hz,1H),7.62(d,J＝8.9Hz,2H),7.21(d,J＝16.1Hz,1H),6.80(d,J＝9.0Hz,2H),4.52(t,J＝7.3Hz,2H),3.41(t,J＝8.1Hz,2H),3.10(s,9H),3.03(s,6H),2.43–2.41(m,2H)(图1-1)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ154.6,152.5,144.1,143.0,130.8,122.90,122.88,117.5,112.5,62.3,56.5,52.9,40.5,24.5(图1-2)；HRMS(ESI,m/z):calcd for C21H31BrN3[M–Br]+:404.16959,found:404.16974(图1-3)。
实施例2
化合物MASPB的光物理性质表征：
1、以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，配制终浓度为1.0×10-5mol·L-1的化合物MASPB溶液，置于比色皿中，用UV-VIS光谱仪检测其紫外-吸收光谱，并用荧光光谱仪检测其荧光发射光谱。其中，图2(A)为化合物MASPB在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱图；图2(B)为化合物MASPB在二甲基亚砜中的荧光发射光谱图。可以看出，紫外可见光吸收光谱显示化合物MASPB在DMSO中的最大吸收峰位于483nm，荧光发射光谱显示化合物MASPB在DMSO中的最大发射峰位于608nm。
2、将四氢呋喃和水按不同比例(四氢呋喃在水溶液中的体积百分比：0,20％,40％,60％,80％,90％,95％,99％)混合，以上述混合液为溶剂配制终浓度为1×10-5mol·L-1的化合物MASPB溶液，用荧光光谱仪检测其荧光发射光谱。图3(A)为化合物MASPB(1×10-5mol·L-1)在水和四氢呋喃混合溶液中不断增加四氢呋喃含量的荧光发射光谱图；图3(B)为化合物MASPB(1×10-5mol·L-1)在不同水/四氢呋喃混合溶剂中(I)与在水中(I0)的荧光强度之比(I/I0)；可见，随着四氢呋喃比例的升高，水/四氢呋喃混合溶液在483nm激发光下逐渐发出红色荧光，并随着四氢呋喃比例的升高，荧光强度显著增强。这是由于化合物MASPB随着溶解度逐渐下降，分子间聚集，导致分子内运动受限而激活了聚集诱导发光效应。
3、由于PBS缓冲液中存在金属离子和酸根离子，粒径分布图中无法准确反应出化合物MASPB的粒径分布情况，所以我们选择纯水作为溶剂，检测化合物MASPB在纯水中的粒径分布情况，图4为化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)在水相中的粒径分布图，从图4可以发现，纳米颗粒跟踪分析仪未检测出任何粒子，说明化合物MASPB具有良好的水溶性。因此，我们可以推测，当化合物MASPB在pH为7.4的PBS缓冲液中浓度高达2×10-5mol·L-1时，同样具有良好的水溶性。
4、图5为化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)与现有的RNA染料SYTO RNASelect Green的光稳定性比较，化合物I即为化合物MASPB，化合物MASPB、现有的RNA染料SYTO RNASelectGreen分别溶于PBS缓冲液中，化合物MASPB、现有的RNA染料SYTO RNASelect Green在各自溶液中的浓度均为2×10-5mol·L-1。
细胞培养基购于Gibco公司。
从图5可知，经化合物MASPB标记的A549细胞在经历了50次连续激光扫描后仍然保持着明显的高荧光强度，定量分析显示其荧光强度只下降了约25％。然而，SYTO RNASelectGreen标记的A549细胞在相同的激光扫描条件下荧光信号明显减弱，定量分析显示其荧光强度下降了约45％，表明化合物MASPB具更优的光稳定性。
实施例3
化合物MASPB的细胞成像实验：
1、化合物MASPB可对肿瘤细胞核仁区域进行荧光成像。
SYTO RNASelect Green与MASPB共定位实验中，取生长状态良好的用20mm激光共聚焦培养皿培养的HeLa细胞，弃去培养基，用PBS冲洗3遍，加入1mL-20℃预冷的甲醇，置于-20℃冰箱固定细胞10min。弃去甲醇，PBS冲洗3遍，加入1mL浓度为5μM的SYTO RNASelectGreen染色液，室温避光染色20min，弃去染色液，PBS洗3遍，置于倒置激光共聚焦显微镜下，用488nm激发光激发后观察。再加入1mL浓度为20μM的MASPB溶液，室温避光染色1min，561nm激发光激发，相同视野下观察并拍照。
从图6可知，化合物MASPB的红色荧光区域(图6A)与SYTO RNASelect Green的绿色荧光区域(图6B)基本完全重合(图6C)。结合肿瘤细胞形态学及以上荧光成像特点，表明化合物MASPB可对肿瘤细胞细胞核内的核仁进行荧光成像。图6中，化合物I即为化合物MASPB。
2、化合物MASPB可对多种不同肿瘤细胞系核仁区域进行荧光成像。
肿瘤细胞成像实验中，取生长状态良好的用20mm激光共聚焦培养皿培养的MDA-MB-231细胞、A549细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞和SMMC-7721细胞，弃去培养基，用PBS冲洗3遍，加入1mL-20℃预冷的甲醇，置于-20℃冰箱固定细胞10min。弃去甲醇，PBS冲洗3遍，加入1mL浓度为10μg·mL-1的DAPI染色液(即DAPI浓度为10μg·mL-1的PBS缓冲液)，室温避光染色5min，弃去染色液，PBS冲洗3遍。再加入1mL MASPB浓度为20μM的MASPB/PBS溶液，室温避光染色1min。先后置于倒置激光共聚焦显微镜和超分辨率显微镜下，分别用405nm和561nm激发光激发后观察。
图7为化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染不同肿瘤细胞系(MDA-MB-231细胞、A549细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞、SMMC-7721细胞)的荧光图像。
3、化合物MASPB可对白细胞的细胞核进行荧光成像。
全血进行红细胞裂解：
按照1:9的体积比用灭菌去离子水将10×红细胞裂解液稀释配置成1×红细胞裂解工作液，于南方医科大学南方医院检验科收集健康志愿者血常规全血标本1mL，按照1:10的体积比向15mL离心管内加入全血标本1mL和1×红细胞裂解工作液10mL，上下颠倒混匀，室温避光裂解8-10min。10×红细胞裂解液(以1L为例，用灭菌去离子水配制)配方如表1所示。
表1
组分 重量
NH<sub>4</sub>Cl 82.9g
KHCO<sub>3</sub> 10.0g
EDTA-2Na g
(2)2000rpm离心10min，弃去上清液，加入1×红细胞裂解工作液1mL重悬沉淀，室温避光裂解3-5min；
(3)2000rpm离心10min，弃去上清液，加入1mL甲醇，重悬沉淀即为裂解红细胞后得到的白细胞悬液，即可用于后续实验。
白细胞成像实验中，在1.5mL EP管中用1mL-20℃预冷的甲醇重悬制备好的人外周血白细胞沉淀，置于-20℃冰箱固定细胞10min。5000rpm离心8min，弃去甲醇，加入1mL PBS重悬白细胞沉淀，5000rpm离心8min，共用PBS洗3遍。加入1mLPBS重悬白细胞沉淀，将悬液加至20mm激光共聚焦培养皿，室温静置10min，待多数白细胞已粘附于20mm细胞培养皿皿底时，加入DAPI染色液(DAPI终浓度为10μg·mL-1)，室温避光染色5min，弃去染色液，加入1mLPBS，轻轻冲洗3遍。再加入1mL MASPB浓度为20μM的MASPB/PBS溶液，室温避光染色1min。先后置于倒置激光共聚焦显微镜和超分辨率显微镜下，分别用405nm和561nm激发光激发后观察。
图8为化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染人外周血白细胞的荧光图像。结果显示，化合物MASPB的红色荧光区域(图8A)与DAPI的蓝色荧光区域(图8B)基本完全重合(图8(D))。同时通过明场图像(图8C)加以佐证，表明化合物MASPB主要靶向白细胞的球形、杆状和分叶状的细胞核。
图7和图8的结果表明，化合物MASPB在肿瘤细胞和在核染色质高度致密的正常成熟细胞中的分布并不相同。在肿瘤细胞中，化合物MASPB主要对核仁区域进行成像，核仁以外的核染色质基本无荧光信号，而对于白细胞，化合物MASPB则可对其细胞核进行成像。这是由于聚集诱导发光的原理——分子内运动受限所导致的。肿瘤细胞由于细胞周期失控，可进行持续的分裂和增殖，细胞核内DNA的复制、转录过程效率增高，核染色质常疏松成网状或细颗粒状从而有利于DNA聚合酶、RNA聚合酶、转录因子等成分的插入与结合，而白细胞作为一种成熟细胞，其核染色质处于高度致密的状态。正是由于肿瘤细胞核染色质相对疏松，化合物MASPB无法引起分子内运动受限而未激发出聚集诱导发光现象，因此肿瘤细胞细胞核内染色质的荧光信号十分微弱。而对于大多数正常的成熟细胞来说，核染色质相对致密，引起化合物MASPB分子聚集导致分子内运动受限从而激发出聚集诱导发光现象，发出明显的荧光信号。
实施例4
细胞内DNase/RNase实验：
利用Triton分别对HeLa细胞和白细胞进行细胞膜穿膜处理，然后各取一皿分别加入Recombinant DNaseⅠ(RNase-free)和Ribonuclease A(RNase A)在37℃下反应3h，随后用DAPI染色液(DAPI终浓度为10μg·mL-1的PBS缓冲液)和化合物MASPB/PBS溶液(即化合物MASPB浓度为2×10-5mol·L-1的PBS缓冲液)对细胞进行标记，并置于倒置激光共聚焦显微镜下观察。
图9为HeLa细胞经过DNase和RNase处理后用化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染的荧光图像。从图9可见，经过DNase处理后的HeLa细胞的DAPI蓝色荧光信号基本完全消失，而化合物MASPB仍可对核仁标记并发出清晰的红色荧光信号，而经过RNase处理后的HeLa细胞的DAPI蓝色荧光信号几乎不受影响，而化合物MASPB的红色荧光信号则明显骤减至十分微弱。
图10为人外周血白细胞经过DNase和RNase处理后用化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)与商用DNA染料DAPI共染的荧光图像。从图10可见，经过DNase处理后的白细胞的DAPI蓝色荧光信号和化合物MASPB红色荧光信号都基本完全消失，而经过RNase处理后的白细胞的DAPI蓝色荧光信号和化合物MASPB红色荧光信号都几乎不受影响。
通过此实施例可见，化合物MASPB在肿瘤细胞和白细胞中的靶向部位不同：在肿瘤细胞细胞核内，化合物MASPB主要标记的是核仁中的RNA，而非核染色质中的DNA，而在白细胞中却可以标记其核染色质中的DNA，说明化合物MASPB并不是单纯的DNA或RNA依赖性发光。这种成像部位的差异是由于肿瘤细胞和正常成熟细胞核染色质的致密程度不同导致的，肿瘤细胞核染色质结构相对疏松，化合物MASPB无法引起分子聚集导致分子内运动受限而未激发出聚集诱导发光效应，因此无荧光“turn-on”。而白细胞核染色质相对致密，引起化合物MASPB分子聚集并由于分子内运动受限而激发出聚集诱导发光现象，实现荧光“turn-on”。化合物MASPB的这种特性有利于帮助我们通过荧光的分布及荧光强度的大小来对细胞染色质的致密程度进行快速分析。
实施例5
利用透射电子显微镜分别对HeLa细胞和白细胞进行染色质致密程度分析：
1、仪器：超薄切片机EM UC7，Leica,Germany；透射电子显微镜Tecnai G220 TWIN，FEI,USA。
2、材料：如无特别说明，本实施例的材料均购于广东光华科技股份有限公司。
3、透射电镜常温超薄切片制备
1)取材与固定：HeLa细胞弃去培养液，加入2.5％戊二醛1mL，4℃固定15min，用细胞刮板刮下细胞，转入1.5mL EP管中，2000rpm离心5min，用移液器枪头拨散细胞团，于4℃保存。对于白细胞，经离心收集于1.5mL EP管内，要求细胞团至少半个绿豆大小，弃去上清液，加入2.5％戊二醛1mL，用移液器枪头拨散细胞团，于4℃保存；
2)锇酸固定：将用戊二醛固定的细胞经0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)漂洗3次，每次15min；然后用1％锇酸室温固定2h，再经0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次，每次15min；
3)脱水：样品经30％、50％、70％、80％、85％、90％、95％、100％(两次)酒精梯度进行脱水处理，每次15-20min；
4)渗透：渗透剂依次为丙酮：环氧树脂(体积比为2:1)、丙酮：环氧树脂(体积比为1:1)、环氧树脂，置于37℃CO2培养箱中，每次渗透8-12h；
5)包埋：将渗透好的样品放入包埋板中，加入包埋剂环氧树脂，在60℃恒温箱中聚合48h；
6)超薄切片：利用超薄切片机EM UC7进行切片，切片厚度：80-100nm；
7)双染色：铀铅双染色(2％醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，室温干燥过夜；
8)透射电子显微镜观察：每个样品在5000×和17000×(物镜)视野下各拍摄15张照片。
图11中，(A)HeLa细胞透射电镜图像；(B)人外周血白细胞透射电镜图像；(C)HeLa细胞核染色质、人外周血白细胞核染色质以及HeLa细胞核仁的平均灰度值分析。透射电子显微镜以电子束为光源，把经过加速的电子投射到超薄切片上，电子与样品中的原子碰撞后方向发生改变，产生散射角。散射角的大小与样品的厚度、密度相关，样品上厚度、密度越大的区域对电子的散射角也越大，通过的电子较少，因此成像亮度较暗，而厚度、密度较小的区域的散射角较小，通过的电子较多，因此成像亮度较亮。结果显示，直观地从透射电子显微镜图像来看，白细胞的细胞核与HeLa细胞相比亮度明显更暗(图11A、图11B)。利用Image J图像处理软件分别对HeLa细胞核染色质、白细胞细胞核染色质及HeLa细胞核仁进行灰度分析，从而实现对染色质致密程度的半定量分析，结果表明，HeLa细胞核染色质、白细胞核染色质、HeLa细胞核仁的平均灰度值逐渐增加，白细胞核染色质的平均灰度值约为HeLa细胞核染色质的2.8倍(图11C)。以上结果表明，白细胞细胞核染色质较HeLa细胞核染色质密度更大、结构更为致密。结合实施例3、实施例4的结果，进一步表明化合物MASPB是由于细胞染色质致密程度不同而影响其能否引起分子内运动受限并激发出聚集诱导发光效应，从而产生不同的染色结果。
实施例6
化合物MASPB对不同细胞周期染色质(体)的荧光成像效果分析：
图12为化合物MASPB(具体为化合物MASPB浓度为2×10-5mol·L-1的PBS缓冲液)染色下人外周血淋巴细胞不同细胞周期染色质(体)的荧光图像。细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全部过程，包括分裂间期和分裂期两个阶段。不同细胞周期伴随着染色质在形态、致密程度、分布与排列的改变。在细胞分裂间期主要进行DNA的复制和相关蛋白质的合成，遗传物质以染色质丝的状态存在，空间结构较为分散、疏松，呈低螺旋化。进入分裂前期后，染色质丝不断折叠聚缩，形成高度螺旋化的染色体，分裂中期时进一步聚缩形成短棒状的染色体，形态最为典型、清晰，数目相对固定，是观察染色体的最佳时期。进入细胞分裂末期时，染色体再度解聚为染色质丝，形成一个连续的动态变化过程。从图12可见，经过化合物MASPB标记后，成熟的淋巴细胞或中性粒细胞的细胞核核染色质最为致密、聚缩，荧光信号强，染色分布均匀，分裂间期的核染色质最为疏松、分散，荧光信号弱，从分裂间期到成熟期的核染色质的致密程度逐渐增强，荧光信号也随之增强。化合物MASPB的荧光信号强弱可以很好地与染色质的致密程度相对应，且具有高效、稳定、便捷、经济等优势，赋予了它在探索染色质高级空间构象、揭示染色质结构与基因表达调控关系等重要生物学问题上以巨大的应用潜能。
实施例7
化合物MASPB用于提取后的细胞DNA致密程度分析：
参照文献“如何优化肝细胞DNA提取实验教学的研究与探讨”(佛山科学技术学院口腔医学院，谢丽霞，张小惠，龙雅怡，郭娇娟，翁闪凡，国际医药卫生导报2019年第25卷第1期IMHGN，January 2019，Vol.25No.1)中的提取方法，分别提取MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、HeLa细胞、A549细胞、HepG2细胞和白细胞(简称WBC)的DNA，配置成含有相同DNA浓度(100ng/μL)的DNA溶液，而后加入1mL含有化合物MASPB的PBS缓冲液(MASPB的浓度为2×10- 5mol·L-1的PBS缓冲液)，避光染色1min，利用荧光光谱仪LS55检测483nm激发光下各管DNA溶液的荧光信号强度，得到荧光发射光谱图。结果如图13所示，白细胞DNA与化合物MASPB结合后在483nm激发光下发出的荧光信号明显强于其余5种肿瘤细胞DNA的荧光信号(图13A)，白细胞DNA的荧光信号约为其余5种肿瘤细胞的3-4倍(图13B)。由此可见，化合物MASPB可以对提取后的细胞DNA的致密程度进行分析判断，通过化合物MASPB染色后的荧光强弱不同，间接反映细胞染色质结构的致密或疏松程度。
实施例8
化合物MASPB可对肿瘤病理组织切片进行荧光染色：
1、主要试剂与耗材
(1)磷酸盐缓冲液(PBS)购于Gibco公司；
(2)1.5mL、2.0mL EP管，10μL、200μL移液枪头购于Axygen公司，1mL移液枪头、1mL加长移液枪头购于Kirgen公司；
(3)普通载玻片、24mm×24mm、24mm×50mm盖玻片购于江苏世泰实验器材有限公司，5片装载玻片染色缸购于上海碧云天生物技术有限公司；
(4)甲醇、无水乙醇、二甲苯、石炭酸购于广东光华科技股份有限公司和广州捷威斯生物科技有限公司；
(5)指甲油购于广东赛曼投资有限公司；
(6)DAPI购于上海BestBio贝博生物有限公司；
(7)苏木素-伊红染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；
(8)中性树胶购于上海恪敏生物科技有限公司。
2、临床标本
肿瘤病理组织切片取自南方医科大学南方医院病理科。
3、主要仪器
(1)正置激光共聚焦显微镜(LSM 880)，Carl Zeiss,Germany；
(2)普通光学显微镜，Olympus，Japan；
(3)各式移液器，Eppendorf，Germany；
(4)电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A型)，上海一恒科学仪器有限公司。
3、方法
3.1肿瘤病理组织切片常规HE染色，按如下步骤进行：
(1)石蜡组织切片脱蜡水化：
将石蜡组织切片置于电热恒温鼓风干燥箱，65℃烘烤3h；二甲苯(Ⅰ)中脱蜡5-10min；换用新鲜的二甲苯(Ⅱ)，脱蜡5-10min；再换用新鲜的二甲苯(Ⅲ)，脱蜡5-10min；于无水乙醇、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中逐次各浸泡1-2min；自来水冲洗2min。
(2)苏木素染液染色5-20min，自来水冲洗1min。
(3)分化液分化30s，分化液是由浓盐酸与75％乙醇按1:99的体积比配制而成。
(4)自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。
(5)伊红染液染色1-2min(具体时间根据染色结果调整)，自来水冲洗1min。
(6)自来水浸泡1-2min。
(7)脱水，透明，封片：
95％乙醇中浸泡1min，重复一次；
无水乙醇中浸泡1min，重复一次；
二甲苯石炭酸(3：1)中浸泡1min；
二甲苯中浸泡1min，重复一次；
在载玻片中央滴2-3滴中性树胶(滴在一起，避免产生气泡)，然后将24mm×24mm盖玻片慢慢放至中性树胶上表面，轻轻挤压，中性树胶会慢慢扩散至整个盖玻片下方，通风干燥3h后用棉签蘸取二甲苯将载玻片边缘多余的中性树胶擦洗干净，常温保存。置于普通光学显微镜40×高倍镜、100×油镜下观察。
3.2肿瘤病理组织切片荧光染色
肿瘤病理组织石蜡切片经脱蜡水化处理后，在玻片上滴加数滴浓度为10μg·mL-1的DAPI染色液，使染色液覆盖整个玻片，室温避光染色5min后，用流水从玻片的一侧冲去DAPI染色液。再滴加数滴浓度为20μM的MASPB/PBS溶液，使染色液覆盖整个玻片，室温避光染色1min，把24mm×50mm盖玻片盖于玻片上，用棉签擦掉载玻片边缘多余的染色液，然后将指甲油涂于盖玻片四周进行封片，通风干燥3min。置于正置激光共聚焦显微镜下，分别用405nm、561nm激发光激发后观察。
图14为肺腺癌病理组织切片的染色图像；(A)HE染色下的肺腺癌病理组织切片的普通光学显微镜图像；(B)化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)和DAPI共染后的肺腺癌病理组织切片的荧光图像。结果显示，与传统HE染色相比，化合物MASPB同样可以实现对病理组织切片进行染色，且成像清晰，组织结构清楚，肺腺癌肿瘤组织区域细胞排列紊乱，细胞异型性明显，失去肺组织正常结构。HE染色操作相对繁琐，耗时较长，染色效果易受温度、染液的酸碱度、染色时间等因素影响。利用化合物MASPB对临床肿瘤病理组织切片进行荧光染色，最大的优势在于全部染色过程仅需一步操作，无需水洗，1min即可完成荧光标记。在保证染色质量的同时，明显缩短了染色时间，简化了染色步骤，十分有利于临床大样本量的常规操作。
实施例9
化合物MASPB可辅助鉴别肿瘤病理组织切片中的肿瘤细胞与正常组织细胞：
图15为化合物MASPB(2×10-5mol·L-1)用于肺腺癌病理组织切片染色的荧光图像；(A)化合物MASPB染色后的荧光图像，(B)DAPI染色后的荧光图像；(C)化合物MASPB、DAPI染色后的合并荧光图像；白色三角形所指为纤维细胞细胞核，白色箭头所指为肺腺癌细胞细胞核。从图15可见，在肿瘤细胞中，化合物MASPB可以靶向核仁并清晰成像，核仁以外的细胞核染色质区域则基本无特异性荧光信号。而对于分布在肿瘤组织旁边的纤维细胞而言，化合物MASPB则可对卵圆形的纤维细胞细胞核进行标记，并与DAPI达到高度共定位效果，通过化合物MASPB荧光信号在细胞核内分布的差异可以将正常组织细胞和肿瘤细胞进行区分，同时一步法“免洗”式荧光成像的方式可明显简化染色步骤，揭示化合物MASPB有望成为一种新型的临床肿瘤病理组织切片的辅助诊断工具，化合物MASPB染色法是一种快速荧光染色新方法。
综上所述，本发明实施例的化合物可用于细胞染色质致密程度分析，而且具有易于制备、荧光强度高、水溶性好、低荧光背景等特点；本发明的化合物可用于临床肿瘤病理组织切片的一步法快速荧光染色，无需水洗，并可辅助判断切片上的肿瘤细胞区域与正常组织细胞区域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种荧光探针在制备用于分析细胞染色质的致密程度的细胞染色剂中的应用，其特征在于，荧光探针结构式如式(II)所示：
Figure 183693DEST_PATH_IMAGE001
；
细胞为肿瘤细胞或白细胞；
细胞染色剂用于肿瘤细胞核仁区域荧光染色成像或用于白细胞细胞核染色质区域染色成像。
2.根据权利要求1所述的应用，所述细胞染色剂还含有缓冲液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞染色剂用于临床肿瘤病理组织切片染色。
4.根据权利要求1所述的应用，所述荧光探针的合成按照如下反应式进行：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
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