ES2303083T3 - Determinacion de la secuencia de un polinucleotido. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para identificar la secuencia de un polinucleótido diana, que comprende: (i) poner en contacto el polinucleótido diana con una enzima polimerasa y uno de los nucleótidos A, T (U), G y C en condiciones adecuadas para que avance la reacción de la polimerasa; (ii) medir el tiempo que tarda la polimerasa en unirse a y posteriormente disociarse del polinucleótido diana, para determinar así si la polimerasa ha incorporado el nucleótido en el polinucleótido diana; (iii) opcionalmente repetir las etapas (i) y (ii) con otros nucleótidos, para identificar así la secuencia del polinucleótido diana.
Description
Determinación de la secuencia de un
polinucleótido.
La presente invención se refiere a
procedimientos para determinar la secuencia de un polinucleótido o
para detectar variaciones entre secuencias de polinucleótidos.
La capacidad para determinar la secuencia de un
polinucleótido es de gran importancia científica, tal como se
demuestra por el Proyecto Genoma Humano, que ha determinado ahora la
secuencia completa de los tres billones de bases del genoma humano.
Sin embargo, esta información de secuencia representa un ser humano
medio y existe una considerable necesidad de entender las
diferencias entre individuos a nivel genético.
El procedimiento principal de uso general para
la secuenciación de ADN a gran escala es el procedimiento de
terminación de cadena. Este procedimiento se desarrolló por primera
vez por Sanger y Coulson (Sanger et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1977; 74: 5463-5467), y se basa en el uso
de derivados de didesoxi de los cuatro nucleósidos trifosfato que se
incorporan en la cadena de polinucleótido naciente en una reacción
en cadena de la polimerasa. Con la incorporación, los derivados de
didesoxi terminan la reacción de la polimerasa y entonces se separan
los productos mediante electroforesis en gel y se analizan para
revelar la posición en la que se incorporó el derivado de didesoxi
particular en la cadena.
Aunque este procedimiento se usa comúnmente y
produce resultados fiables, se reconoce que es lento, requiere mucha
mano de obra y es caro. Además, no es un procedimiento eficaz para
detectar las diferencias entre dos secuencias, que a menudo pueden
estar constituidas por un cambio de una sola base (conocido como un
polimorfismo de un solo nucleótido o SNP).
Las matrices de ácido nucleico se han convertido
recientemente en un procedimiento preferido de determinación de
secuencias de polinucleótido y SNP, normalmente según el contexto de
acontecimientos de hibridación (Mirzabekov, Trends in Biotechnology
(1994) 12:27-32). Un gran número de procedimientos
de secuenciación basados en matrices utilizan nucleótidos marcados
con el fin de obtener la identidad de las bases añadidas
(hibridadas). Estas matrices se basan en la identificación
progresiva de bases marcadas de manera adecuada, a lo que se hace
referencia en el documento
US-A-5634413 como procedimientos de
secuenciación "de una sola base". Tales procedimientos "de
una sola base" utilizan dos tipos de marcador; el radiomarcador y
el marcador fluorescente. El radiomarcado de nucleótidos tiene las
ventajas de alta sensibilidad y bajo fondo. Sin embargo, el
radiomarcado presenta una escasa resolución.
Los nucleótidos marcados de manera fluorescente
se usan ahora ampliamente en muchas técnicas. Tales nucleótidos
pueden incorporarse en la cadena de polinucleótido naciente de
manera progresiva mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Cada uno de los diferentes nucleótidos (A, T, G y C) incorpora un
único fluoróforo en la posición 3' que puede detectarse usando un
detector fluorescente sensible, por ejemplo un detector de carga
acoplada (CCD). El fluoróforo a menudo también actúa como un
"grupo de bloqueo", que elimina la capacidad del nucleótido
incorporado para servir como sustrato para otra adición de
nucleótidos y, por tanto, evita la polimerización incontrolada. A
menudo, se usa un "grupo de bloqueo eliminable", que puede
eliminarse mediante un tratamiento específico que da como resultado
la rotura del enlace covalente entre un nucleótido y el grupo de
bloqueo, dejando que continúe la reacción de secuenciación.
Los grupos de bloqueo eliminables se basan en
varias estrategias posibles para el tratamiento de eliminación, por
ejemplo, un tratamiento fotoquímico, químico o enzimático. Sin
embargo, éstos han demostrado ser difíciles de controlar y aplicar.
Las diferencias en entornos locales, por ejemplo dentro de una
matriz, pueden dar como resultado la eliminación de un nucleótido
completo, o incluso de varios nucleótidos, en lugar de sólo el
marcador pretendido. Tales casos tienen serias consecuencias para la
fidelidad del procedimiento de secuenciación, ya que la eliminación
incontrolada de nucleótidos da como resultado que los datos de
secuenciación se vuelvan desfasados y los datos de secuencia se
vuelvan corruptos o inservibles.
Otra desventaja adicional de ambos
procedimientos de marcado es que las secuencias de repetición pueden
conducir a ambigüedad de los resultados. Este problema se reconoce
en Automation Technologies for Genome Characterisation,
Wiley-Interscience (1997), ed. T.J. Beugelsdijk,
capítulo 10:205-225.
Por tanto, existe la necesidad de un
procedimiento mejorado para identificar la secuencia de un
polinucleótido, en particular para detectar variaciones dentro de
una secuencia de polinucleótido, por ejemplo para detectar SNP, que
combina la alta sensibilidad y bajo fondo de los nucleótidos
radiomarcados con la alta resolución de los marcadores marcados de
manera fluorescente. Además, el procedimiento podría llevarse a cabo
mediante procedimientos automatizados de alto rendimiento,
reduciendo el coste asociado con los procedimientos existentes.
La presente invención se basa en la comprensión
de que la identificación de una secuencia de polinucleótido puede
llevarse a cabo midiendo el tiempo durante el cual una polimerasa se
une a un polinucleótido diana durante una reacción de la polimerasa.
En general, una polimerasa pasará menos tiempo unida al
polinucleótido diana cuando no existe ningún nucleótido disponible
para la incorporación. Por tanto, si el único nucleótido disponible
no es complementario, la polimerasa se unirá al polinucleótido
durante un periodo abreviado, y éste puede determinarse para revelar
la identidad de la secuencia complementaria del polinucleótido
diana.
Según un primer aspecto de la presente
invención, un procedimiento de identificación de la secuencia de un
polinucleótido comprende:
- (i)
- poner en contacto el polinucleótido diana con una enzima polimerasa y uno de los nucleótidos A, T(U), G y C en condiciones adecuadas para que avance la reacción de la polimerasa;
- (ii)
- medir el tiempo que tarda la polimerasa en unirse a y posteriormente disociarse del polinucleótido diana, para determinar así si la polimerasa ha incorporado el nucleótido en el polinucleótido diana; y
- (iii)
- opcionalmente repetir las etapas (i) y (ii) con otros nucleótidos, para identificar así la secuencia del polinucleótido diana.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, un procedimiento para la identificación de una mutación
en un polinucleótido diana, comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el polinucleótido diana con una enzima polimerasa y uno de los nucleótidos A, T (U), G y C en condiciones adecuadas para que avance la reacción de la polimerasa; y
- (ii)
- medir el tiempo que tarda la polimerasa en unirse a y posteriormente disociarse del polinucleótido diana, para identificar así si la polimerasa ha incorporado el nucleótido en el polinucleótido diana, y con referencia a la secuencia nativa de la diana, determinar si existe una mutación.
El término "polinucleótido" o
"polinucleótido diana" tal como se usa en el presente documento
ha de interpretarse ampliamente, e incluye ADN y ARN, incluyendo ADN
y ARN modificados, así como otras moléculas de tipo ácido nucleico
de hibridación, por ejemplo, ácido nucleico peptídico (PNA). El
polinucleótido diana puede ser bicatenario o monocatenario.
Preferiblemente, el polinucleótido diana es al menos parcialmente
monocatenario y más preferiblemente tiene una secuencia de cebador
unida a él, de tal manera que la enzima polimerasa puede fijarse al
polinucleótido diana, tal como apreciará un experto en la
técnica.
La enzima es una enzima polimerasa, que
interacciona con el polinucleótido diana en el procedimiento de
extender una cadena complementaria, y puede ser de cualquier tipo
conocido. Por ejemplo, la polimerasa puede ser cualquier ADN
polimerasa dependiente de ADN. Si el polinucleótido diana es una
molécula de ARN, entonces la polimerasa puede ser una ADN polimerasa
dependiente de ARN, es decir transcriptasa inversa, o a ARN
polimerasa dependiente de ARN, es decir ARN replicasa. Las enzimas
primasa también están incluidas dentro de la defini-
ción.
ción.
El polinucleótido diana se ubica preferiblemente
en un sitio específico sobre un material de soporte.
Preferiblemente, el polinucleótido se ubica mediante inmovilización
sobre un soporte sólido. Soportes adecuados para su uso en la
inmovilización del polinucleótido serán evidentes para el experto,
por ejemplo pueden usarse materiales de silicio, vidrio o cerámica.
La inmovilización puede llevarse a cabo mediante medios covalentes o
no covalentes. Por ejemplo, pueden usarse moléculas conectoras
covalentes. En una realización preferida, se inmoviliza un cebador
sobre el material de soporte y se hibrida con él el polinucleótido
diana. Como alternativa, la hibridación del polinucleótido diana y
el cebador puede tener lugar en disolución y el cebador o bien el
polinucleótido diana se fija posterior, o simultáneamente, a un
material de soporte.
Pueden inmovilizarse uno o más polinucleótidos
diana sobre el material de soporte sólido. En una realización
preferida, se fijan al soporte una pluralidad de polinucleótidos
diana. Estas "matrices" de polinucleótidos diana pueden ser de
cualquier densidad conocida, incluyendo matrices de alta densidad de
múltiples moléculas así como matrices "de una sola molécula" en
las que pueden resolverse las ubicaciones del polinucleótido
individual, es decir, es posible controlar que la reacción de la
polimerasa se produzca en un solo polinucleótido.
Como una primera etapa en el procedimiento de
secuenciación, puede ponerse en contacto el polinucleótido diana con
un cebador apropiado en un tampón de hibridación/polimerización.
Normalmente, el tampón estará a una temperatura suficientemente alta
para romper (o fundir) cualquier estructura secundaria que exista en
el polinucleótido diana. Con enfriamiento, el cebador se reasociará
con su complemento en la diana. Entonces ésta se pone en contacto
con la polimerasa, para formar el complejo de polinucleótido
diana/polimerasa.
En una realización de la invención, se controla
la adición de los nucleótidos de modo que se añadan secuencialmente
los diferentes nucleótidos al complejo polimerasa/diana. Por
ejemplo, puede añadirse dGTP y dejarlo fluir sobre el complejo de
polimerasa/polinucleótido; entonces se determina el tiempo durante
el cual la polimerasa se compleja al polinucleótido. El dGTP no
unido fluye fuera del sitio de reacción y se introduce otro
nucleótido. De esta manera, puede correlacionarse el tiempo durante
el cual se forma el complejo con el nucleótido particular presente
durante ese tiempo y, por tanto, puede determinarse la secuencia del
polinucleótido.
También pueden iniciarse la reacción mediante la
adición de la polimerasa a una mezcla de reacción que comprende el
polinucleótido diana y el nucleótido. Tras controlar el tiempo que
tarda la polimerasa en asociarse con y disociarse del polinucleótido
diana, pueden eliminarse los nucleótidos no unidos e introducir el
siguiente nucleótido para llevar a cabo otras etapas de
secuenciación.
La incorporación de un nucleótido en la diana
requiere que la polimerasa se asocie con la diana durante un periodo
más largo que el que tarda cuando no es posible ninguna
incorporación. Por tanto, la medición de la asociación entre la
polimerasa y la diana revela que si se ha producido un
acontecimiento de incorporación para las regiones en la diana que
tienen nucleótidos secuenciales del mismo tipo, aumentará
proporcionalmente el tiempo de asociación. Por tanto el
procedimiento puede usarse para identificar nucleótidos consecutivos
del mismo tipo.
Puede llevarse a cabo la detección de la
interacción entre la enzima polimerasa y el polinucleótido diana
midiendo los cambios en la radiación aplicada. La medición de los
cambios en la radiación que se produce en la interacción entre la
polimerasa y el polinucleótido diana puede llevarse a cabo usando
aparatos convencionales.
En una realización, la interacción de la
polimerasa con el polinucleótido diana se mide usando a sistema no
lineal de obtención de imágenes.
Los sistemas no lineales de obtención de
imágenes se conocen en la técnica. En general, la polarización no
lineal para un material puede expresarse como:
P =
X^{(2)}E^{1} + X^{(2)}E^{2} + X^{(2)}E^{3} +
...
en la que P es la polarización
inducida, X^{(n)} es la susceptibilidad no lineal de orden n y E
es el vector de campo eléctrico. El primer término describe la
absorción normal y la reflexión de la luz; el segundo describe la
generación del segundo armónico (SHG), generación de la frecuencia
suma y diferencia; y el tercero describe la dispersión de la luz,
procedimientos Raman estimulados, la generación del tercer armónico
(TGH) y tanto la absorción de dos como de tres
fotones.
Un sistema de obtención de imágenes preferido de
la presente invención se basa en la detección de la señal que surge
a partir de la generación del segundo o tercer armónico.
La resolución de una sola molécula usando la
generación del segundo o tercer armónico (denominado como SHG a
continuación en el presente documento) se conoce en la técnica
(Peleg et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA,
1999;95:6700-6704 y Peleg et al., Bioimaging,
1996; 4: 215-224). Se describen sistemas adecuados
en el documento WO-A-02/095070.
En una realización, se lleva a cabo la detección
en fase de disolución (es decir, no se inmovilizan la polimerasa y
el polinucleótido diana) usando dispersión Raman y/o técnicas
LSPR.
Cuando se dirige luz sobre una molécula, la gran
mayoría de los fotones incidentes se dispersan de manera elástica
sin un cambio en la frecuencia. Esto se denomina dispersión de
Rayleigh. Sin embargo, la energía de algunos de los fotones
incidentes (aproximadamente 1 de cada 10^{7} fotones) se acopla en
distintos modos de vibración de los enlaces de la molécula. Tal
acoplamiento produce que parte de la luz incidente se disperse de
manera inelástica por la molécula con un intervalo de frecuencias
que difieren del intervalo de la luz incidente. Esto se denomina
efecto Raman. Representando gráficamente la frecuencia de tal luz
dispersada de manera inelástica frente a la intensidad, se obtiene
el espectro Raman único de la molécula en investigación. El análisis
del espectro Raman de una muestra desconocida puede proporcionar
información sobre la composición molecular de las muestras.
El efecto Raman puede intensificarse
significativamente acercando (<50 \ring{A}) la(s)
molécula(s) activas en Raman a una superficie metálica
estructurada, este campo disminuye exponencialmente al alejarse de
la superficie. La puesta en proximidad de las moléculas a las
superficies metálicas se logra normalmente a través de la adsorción
de la molécula activa en Raman sobre oro hecho rugoso de manera
adecuada, cobre plateado u otros metales con electrones libres. La
intensificación superficial de la actividad Raman se observa con
partículas coloidales metálicas, películas metálicas sobre sustratos
dieléctricos y con matrices de partículas metálicas. El mecanismo
mediante el cual tiene lugar esta dispersión Raman intensificada por
superficies no se entiende bien, pero se cree que resulta de una
combinación de (i) resonancias de plasmón superficial en el metal
que intensifican la intensidad local de la luz, y; (ii) la formación
y posteriores transiciones de complejos de transferencia de carga
entre la superficie metálica y la molécula activa en Raman.
El efecto Raman puede utilizarse para medir el
tiempo de asociación entre la polimerasa y el polinucleótido diana.
Se prefiere que la diana esté inmovilizada sobre una superficie
metálica, para mejorar la señal Raman.
En una realización preferida de la presente
invención, se emplea la dispersión Raman intensificada por
superficies (SERS) mediante el uso de una nanopartícula coloidal
metálica unida a la polimerasa, por ejemplo, una nanopartícula de
oro o plata. Una nanopartícula metálica con intensificación Raman
que tiene asociada o unida a ella una(s)
molécu-
la(s) activa(s) en Raman puede tener utilidad como un marcador óptico. Este concepto general se explica resumidamente en la patente estadounidense número 6.514.767, cuyo contenido se incorpora al presente documento por referencia. En una realización, pueden detectarse el polinucleótido diana y una polimerasa buscando el espectro Raman único de la molécula activa en Raman. Ya que un espectro Raman individual (desde 100-3500 cm-1) puede detectar muchas moléculas activas en Raman diferentes, pueden usarse las nanopartículas activas en SERS unidas a o asociadas con la polimerasa en el contexto de la presente invención dentro de formatos de ensayo multiplexados.
la(s) activa(s) en Raman puede tener utilidad como un marcador óptico. Este concepto general se explica resumidamente en la patente estadounidense número 6.514.767, cuyo contenido se incorpora al presente documento por referencia. En una realización, pueden detectarse el polinucleótido diana y una polimerasa buscando el espectro Raman único de la molécula activa en Raman. Ya que un espectro Raman individual (desde 100-3500 cm-1) puede detectar muchas moléculas activas en Raman diferentes, pueden usarse las nanopartículas activas en SERS unidas a o asociadas con la polimerasa en el contexto de la presente invención dentro de formatos de ensayo multiplexados.
En una realización separada, se controlan los
cambios en la radiación utilizando tecnología de onda
electromagnética superficial.
Los biosensores que incorporan la tecnología de
onda electromagnética superficial (y, en particular, sensores de
resonancia de plasmón superficial, SPR) se basan en la sensibilidad
de las ondas electromagnéticas superficiales (SEW) al índice de
refracción de la capa fina adyacente a la superficie en la que se
propaga la SEW. En el biosensor, la polimerasa y el/los
nucleótido(s) se dejan fluir a través de la superficie que
contiene el polinucleótido diana inmovilizado. Mientras se produce
la unión, la acumulación o redistribución de masa sobre la
superficie cambia el índice de refracción local que puede
controlarse en tiempo real mediante el sensor.
Se han propuestos varios procedimientos que
utilizan la tecnología SPR y se ha realizado en biosensores. Los
procedimientos más populares se basan en la configuración
Kretschmann-Raether en la que se controla la
intensidad de la luz reflejada desde el sensor. Esta técnica, que se
considera una de las más sensibles, se describe en J. Homola et
al, Sensors and Actuators B 54, págs. 3-15
(1999) y tiene un límite de detección de 5 x 10^{-7} unidades de
índice de refracción. La medición de los cambios de fase de SPR
puede aumentar además la sensibilidad del sensor en uno o dos
órdenes de magnitud. Esto se describe en Nelson et al,
Sensors and Actuators B 35-36, pág. 187 (1996) y en
Kabashkin et al, Optics Communications 150, pág. 5 (1998).
Los dispositivos interferométricos de la técnica anterior tales como
un dispositivo Mach-Zehnder se han configurado para
medir variaciones en el índice de refracción en la superficie del
sensor mediante desplazamientos de fase. Esto se describe en la
publicación internacional de patente
WO-A-0120295. La configuración
requiere cuatro componentes independientes y es sensible a
sustituciones relativas de sublongitud de onda de estos componentes
y, por tanto, a perturbaciones mecánicas y ambientales muy pequeñas.
Un diseño interferométrico monolítico más robusto mecánicamente se
explica resumidamente en el documento
WO-A-03014715.
En una realización preferida, se usa un sistema
de sensor de onda electromagnética superficial (SEW) que puede
compensar cambios en el índice de refracción aparente de un tampón o
que permite que se separe la contribución del índice de refracción
aparente con respecto a un patrón de interferencia de la
contribución de un analito absorbido sobre la superficie del sensor.
Por tanto, el biosensor comprende:
- una fuente de radiación coherente para producir una onda incidente;
- una superficie portadora para soportar el polinucleótido inmovilizado, la superficie de portadora montada sobre un sustrato y que puede soportar ondas electromagnéticas superficiales (SEW);
- medios para dividir la onda incidente en una SEW y una primera onda dispersada, en los que la SEW se propaga a lo largo de la superficie portadora e interacciona con el polinucleótido inmovilizado;
- medios para generar una segunda onda dispersada a partir de la SEW; y
- un detector para controlar la interferencia entre la primera onda dispersada y la segunda onda disper-sada.
En esta realización, se enfoca un haz óptico
coherente generado por un láser monocromático usando una lente,
sobre el borde de una película metálica que puede soportar ondas
electromagnéticas superficiales (SEW). El haz óptico pasa a través
de un prisma de vidrio sobre el que se monta la película metálica.
Se usa un láser de infrarrojo cercano como la fuente de iluminación.
El uso de una fuente de infrarrojo cercano tiene la ventaja de una
longitud de propagación larga para plasmones superficiales en oro y
plata, mientras que todavía pueden usarse los componentes ópticos
convencionales para la obtención de imágenes y la iluminación. Sin
embargo, son adecuadas y pueden usarse otras fuentes
monocromáticas.
Este sistema se describe en el documento
WO-A-04/020985, cuyo contenido se
incorpora en el presente documento por referencia.
En una realización preferida, se marca la
polimerasa.
El término "marcador" tal como se usa en el
presente documento puede interpretarse ampliamente. Serán evidentes
para el experto los marcadores adecuados. En una realización
preferida, el marcador es un fluoróforo. En una realización
particular, la polimerasa se prepara como una fusión recombinante
con GFP (proteína verde fluorescente). Ésta puede ser GFP de tipo
natural o bien mutantes desplazados espectralmente de la misma
(Tsien, Ann. Rev. Biochem., 1998; 67:509, documentos US 5.777.079 y
US 5.625.048). La GFP puede ubicarse en el extremo N- o
C-terminal de la enzima (el extremo
C-terminal puede ser deseable si va a usarse una
polimerasa conjuntamente con una "abrazadera deslizante").
Como alternativa, la molécula de GFP puede ubicarse en cualquier
sitio dentro de la enzima, siempre que se conserve la actividad
enzimática. Pueden usarse marcadores alternativos. Se han notificado
varias estrategias para marcar moléculas, tales como microesferas
(Anal. Chem. (2000) 72, 15:3678-3681),
nanopartículas de oro (J. Am. Chem. Soc. (2000) 122,
15:3795-3796), partículas coloidales de plata (PNAS,
(2000) 97, 3:996-1001) y puntos cuánticos. Puede
utilizarse cualquier técnica de marcado que permita la resolución
inequívoca de la interacción de la polimerasa con el polinucleótido
diana y el nucleótido dentro del contexto de la presente invención.
Preferiblemente, se usa un marcador que permite la resolución
temporal de la unión y/o desunión de la enzima del complejo de
polinucleótido diana:nucleótido.
Preferiblemente, se produce una matriz de
polinucleótidos diana inmovilizados y se hace fluir la enzima
polimerasa sobre la matriz en condiciones suficientes para la
actividad de la enzima, junto con al menos uno de los cuatro
nucleótidos. Más preferiblemente, esto tiene lugar dentro de una
célula de flujo. Entonces, se obtienen imágenes de cada "ubicación
de matriz" dentro de la matriz, que contiene un solo
polinucleótido diana inmovilizado o una pluralidad de
polinucleótidos diana idénticos, a una resolución temporal que
permite la resolución de la unión de la enzima al complejo de
polinucleótido diana/nucleótido, preferiblemente, desde 1 hasta al
menos varios miles de
hercios.
hercios.
En otra realización preferida, la enzima
polimerasa se marca con un par de transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET). Este sistema se describe en el
documento WO-A-01/25480. Tal como
apreciará un experto en la técnica, un par FRET requiere un
fluoróforo y una segunda molécula que puede interaccionar con el
fluoróforo, actuando como un dador o aceptor de energía. La
interacción entre el par altera el espectro de emisión del/de los
fluoróforo(s), que se detecta. La segunda molécula puede ser
otro fluoróforo, o cualquier otra molécula adecuada, tal como una
partícula metálica. Preferiblemente se usa un par FRET clásico, en
el que ambos marcadores son fluoróforos, elegidos de modo que la
longitud de onda de emisión de un fluoróforo corresponda a la
longitud de onda de excitación del otro. Las ubicaciones de
inmovilización sobre la enzima se eligen de tal manera que los
fluoróforos se muevan uno con relación al otro cuando se une la
enzima al polinucleótido formando el complejo ternario. Este
movimiento relativo entre el par FRET dará como resultado un
desplazamiento espectral de la emisión a partir del par, dependiendo
de la manera en la que se haya designado el par FRET. Entonces se
acopla más o menos energía en el aceptor procedente del dador, lo
que conduce a la excitación o atenuación de la fluorescencia del
dador. Esto se controla con alta resolución temporal, para obtener
la información deseada. Preferiblemente, el dispositivo usado para
obtener imágenes del grado de fluorescencia es un dispositivo de
carga acoplada (CCD), con tiempo de lectura rápido y componentes
ópticos apropiados para una alta resolución espacial.
El sistema de resolución requerido para
controlar la interacción entre la polimerasa y la diana puede
modificarse para tener en cuenta la necesidad de "barrer" la
muestra en estudio. Tal barrido es especialmente probable en
sistemas de alta resolución, tales como sistemas de una sola
molécula. A los altos niveles de resolución espacial requeridos para
experimentos con una sola molécula, el área de observación eficaz se
reduce en consecuencia. Ya que el análisis "cinético"
normalmente requiere control en "tiempo real" continuo en una
sola área definida, el barrido introduce el problema del control
discontinuo. Tal control discontinuo es incompatible con el análisis
cinético ya que pueden perderse acontecimientos de interacción. En
un aspecto preferido de la presente invención, por tanto, se emplean
nucleótidos marcados en el extremo 5 prima; actuando el marcador
como un grupo de bloqueo eliminable. Por tanto, en situaciones en
las que se emplea alta resolución espacial (tales como matrices de
una sola molécula en las que la región de observación normalmente es
sólo de 100 \mum por 100 \mum y el chip normalmente es al menos
100 veces mayor), la región de observación se "mueve" a una
nueva ubicación y esa región se ilumina con radiación (por ejemplo,
UV) adecuada para eliminar el grupo de bloqueo. Esta estrategia
garantiza que los acontecimientos de asociación/cinéticos sólo se
produzcan en una región "observada". Entonces la región
"observada" puede moverse alrededor del chip y exponiendo sólo
la región en observación a radiación suficiente para desbloquear el
nucleótido, sólo tienen lugar interacciones selectivas en esta
región.
En otra realización preferida separada, se
confinan las áreas de obtención de imágenes en células de flujo
individuales, es decir en el caso en el que el área de observación
está limitada a 100 um por 100 \mum, la célula de flujo se
restringe aproximadamente a estas dimensiones relativas. Por tanto,
en esta realización, los nucleótidos sólo se inyectan en células de
flujo de las que se están obteniendo imágenes activamente. Por
tanto, el material de soporte sobre el que se disponen en matrices
los polinucleótidos puede estar constituido por una "matriz" de
células de flujo direccionables individualmente. Como el área de
obtención de imágenes se mueve alrededor del chip, así se inyectan
los nucleótidos sólo en la(s) célula(s) de flujo en el
área de obtención de imágenes.
En otra realización, se detecta la unión de la
polimerasa mediante una transferencia de energía por resonancia
entre una molécula intercalante y un colorante/agente extintor en la
polimerasa. El colorante intercalante (por ejemplo, CYBRGreen,
sondas moleculares) sólo fluorescerá cuando se une al complejo de
molde-cebador bicatenario. Entonces puede usarse
esta señal para identificar la ubicación del polinucleótido diana.
La polimerasa se modifica con un colorante que es una molécula
"aceptora" que puede absorber y volver a emitir la energía
procedente del colorante intercalante. Como alternativa, el
"marcador" puede ser un agente extintor. Por tanto, puede
controlarse el acontecimiento de unión/interacción observando el
cambio en la señal debido a la transferencia de energía.
Puede usarse el procedimiento de la invención
para identificar la secuencia completa del polinucleótido diana o
puede usarse para identificar la secuencia de una parte del
polinucleótido. El procedimiento es adecuado para determinar la
presencia de mutaciones dentro de la diana, por ejemplo determinar
si se ha producido una sustitución, deleción o adición, en
comparación con una secuencia de referencia o control.
En una realización preferida, puede usarse el
procedimiento para identificar un polimorfismo de un solo nucleótido
en una muestra genética. El término "polimorfismo" tal como se
usa en el presente documento se refiere a la aparición de dos o más
secuencias genómicas o alelos alternativos entre o sobre distintos
genomas o sujetos. Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es un
cambio de un solo par de bases. Normalmente, un SNP es la
sustitución de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio
polimórfico. La deleción de un solo nucleótido, o la inserción de un
solo nucleótido, también da origen a polimorfismos de un solo
nucleótido.
Se usa el procedimiento para determinar la
identidad del/de los nucleótido(s) en el supuesto sitio de
mutación y entonces puede compararse la información con una
secuencia de referencia para revelar si está presente una
mutación.
El siguiente ejemplo ilustra la invención.
En este experimento, se produjo una proteína de
fusión de proteína verde fluorescente (GFP) y una polimerasa
mediante técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica.
Se recubrieron por centrifugación pastillas de
cuarzo (14 mm de diámetro, 0,3 mm espesor) con una capa de dextrano
plano modificado con estreptavidina inmovilizada (Xantec, Alemania).
Un microscopio vertical (135TV, Zeiss) equipado con iluminación por
reflexión interna total (TIR) sirvió como plataforma para el
experimento. Se polarizó circularmente un haz láser de valor máximo
a 488 nm (Melles Griot) con una potencia de 100 mW mediante placas
de cuarto de onda para someterse a TIR en un prisma hecho a medida.
El prisma se acopló ópticamente a la pastilla mediante gel de
adaptación del índice. Entonces se ensambló una célula de flujo con
una junta tórica y un eje óptico transparente sobre el prisma y la
pastilla de cuarzo. Un objetivo recogió la señal de fluorescencia a
través de la superficie superior transparente de la célula de flujo.
Las imágenes se desplazaron mediante un filtro de paso de banda en
un dispositivo de carga acoplada con adelgazamiento posterior (Andor
technologies).
Se sintetizaron dos oligonucleótidos usando la
química de la fosforamidita convencional. El oligonucleótido
definido como SEQ ID NO. se usó como el polinucleótido diana, y el
oligonucleótido definido como SEQ ID NO.2 se biotiniló y se usó como
cebador. Se depositaron los cebadores biotinilados (SEQ ID No.2)
sobre la pastilla recubierta con estreptavidina mediante inyección
en la célula de flujo de 10 pM de SEQ ID NO.2 en tampón Tris que
contenía MgCl_{2} 100 mM y se dejó incubar durante 10 minutos.
Se purgó con tampón de flujo la célula de flujo
a una velocidad de 500 \mul/min. Entonces se inyectó la secuencia
complementaria, SEQ ID NO.1 en la célula de flujo a una
concentración de 1 \muM, a una velocidad de flujo de 5 \mul/min.
Durante esta inyección, se calentó la célula hasta 70ºC durante
varios minutos mediante un electrodo de calentamiento de platino
dentro de la célula de flujo y se dejó enfriar hasta 25ºC. Entonce
se continuó con la inyección durante otros diez minutos. Una vez que
se completó la inyección, se purgó con el tampón de flujo de manera
continua a través del sistema a una velocidad de flujo de 500
\mul/min. Tras 10 minutos, se inició la reacción de secuenciación
mediante la inyección de dATP 0,4 mM (8 \mul) en el tampón a una
velocidad de flujo de 500 \mul/min. Un segundo tras el comienzo de
la inyección, se registraron una serie de imágenes CCD a la
velocidad de trama máxima (30 tramas por segundo) y se guardó la
imagen que contenía la mayor intensidad de señal. Entonces se
inyectó el nucleótido complementario dCTP a 0,4 mM en las otras
imágenes CCD guardadas un segundo tras la inyección.
El nucleótido complementario proporcionó una
señal intensa (figura 1a) en comparación con el nucleótido no
complementario (figura 1b) cuando se obtuvieron imágenes de una
manera "con resolución temporal".
Claims (13)
1. Un procedimiento para identificar la
secuencia de un polinucleótido diana, que comprende:
- (i)
- poner en contacto el polinucleótido diana con una enzima polimerasa y uno de los nucleótidos A, T (U), G y C en condiciones adecuadas para que avance la reacción de la polimerasa;
- (ii)
- medir el tiempo que tarda la polimerasa en unirse a y posteriormente disociarse del polinucleótido diana, para determinar así si la polimerasa ha incorporado el nucleótido en el polinucleótido diana;
- (iii)
- opcionalmente repetir las etapas (i) y (ii) con otros nucleótidos, para identificar así la secuencia del polinucleótido diana.
2. Un procedimiento para la identificación de
una mutación en un polinucleótido diana, que comprende las etapas
de:
- (i)
- poner en contacto el polinucleótido diana con una enzima polimerasa y uno de los nucleótidos A, T (U), G y C en condiciones adecuadas para que avance la reacción de la polimerasa;
- (ii)
- medir el tiempo que tarda la polimerasa en unirse a y posteriormente disociarse del polinucleótido diana, para identificar así si la polimerasa ha incorporado el nucleótido en el polinucleótido diana, y con referencia a la secuencia nativa de la diana, determinar si existe una mutación.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que las etapas (i)-(ii) se llevan a cabo
con cada uno de los diferentes nucleótidos sucesivamente, hasta que
se detecta la incorporación.
4. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que el polinucleótido diana está
inmovilizado sobre un material de soporte.
5. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que una pluralidad de polinucleótidos
diana están inmovilizados sobre un material de soporte.
6. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa ii) se lleva a cabo
midiendo la radiación aplicada.
7. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo
midiendo la dispersión Raman.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo
aplicando una onda electromagnética superficial.
9. Un procedimiento según cualquier
reivindicación 8, en el que la onda electromagnética superficial es
una onda de plasmón superficial.
10. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la detección se lleva a cabo
mediante la medición de una onda electromagnética superficial.
11. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la polimerasa comprende un
marcador detectable fijado a la misma.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el marcador es un fluoróforo.
13. Un procedimiento según la reivindicación 11
cuando depende de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el
que la polimerasa comprende además un marcador dador de energía o un
marcador aceptor de energía, y en el que la etapa (ii) se lleva a
cabo midiendo la transferencia de energía entre el fluoróforo y el
dador o aceptor de energía.
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