KR20060052863A

KR20060052863A - 폴리뉴클레오티드 서열의 결정방법

Info

Publication number: KR20060052863A
Application number: KR1020067001539A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 헨리 덴샴
Original assignee: 메디칼 바이오시스템스 리미티드
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2006-05-19
Also published as: ES2303083T3; EP1649051A2; CN1852991A; US8592183B2; PT1649051E; DK1649051T3; CA2780958C; PL1649051T3; RU2006105626A; CA2533579A1; AU2004259893A1; WO2005010210A2; EP1649051B1; MXPA06000962A; CA2533579C; IL173314A0; US7604963B2; SI1649051T1; GB0317343D0; BRPI0412813A

Abstract

표적 폴리뉴클레오티드 서열은 (i) 표적 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 효소와 뉴클레오티드 A, T (U), G 및 C 중 하나와 폴리머라제 반응이 진행되기에 적합한 조건 하에 접촉시키고; (ⅱ) 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 연이어 그로부터 해리되는데 걸리는 시간을 측정함에 의해 상기 폴리머라제가 상기 표적 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 병합시키는 가를 결정하고; (ⅲ) 임의로 단계 (i) 및 (ⅱ)를 추가 뉴클레오티드로 반복함에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인함에 결정될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열 확인방법, 라만효과, 방사선 라벨화

Description

폴리뉴클레오티드 서열의 결정방법{DETERMINING THE SEQUENCE OF POLYNUCLEOTIDE}

본 발명은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간의 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

인간 게놈의 30억 개의 염기 전체 서열을 측정한 인간 게놈 프로젝트에 의해 증명되듯이, 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 능력은 과학적으로 아주 중요하다. 하지만, 이 서열 정보는 평균적인 인간을 나타내고 유전자 수준에서의 개인들 간의 차이를 이해해야 하는 상당한 필요성이 있다.

대규모 DNA 염기서열분석을 위한 일반적인 용도에서의 주요한 방법은 사슬 형성 종료법이다. 이 방법은 Sanger와 Coulson(Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977; 74; 5463-5467)에 의해 최초로 개발되었고, 폴리머라제 연쇄 반응에서 신생 뉴클레오시드 사슬로 도입되는 4개의 삼인산 뉴클레오시드의 디데옥시 유도체의 사용에 의존한다. 도입시에, 디데옥시 유도체는 폴리머라제 반응을 종결시키고 그 후에 생성물이 겔 전기영동법에 의해 분리되며 특정 디데옥시 유도체가 사슬에 도입된 위치를 나타내도록 분석된다.

이 방법은 폭넓게 사용되고 신뢰성 있는 결과를 생성하지만, 그것은 느리고 노동-집약적이며 값비싸다는 것이 인정된다. 더욱이, 그것은 종종 단일 염기 변화(단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 SNP로써 알려짐)로 이루어질 수 있는 두 서열 간의 차이를 검출하기 위한 효과적인 방법이 아니다.

일반적으로 혼성화 사상(Mirzabekov, Trends in Biotechnology(1994) 12:27-32)과 관련하여, 최근에 핵산 배열이 폴리뉴클레오티드 서열 및 SNP를 측정하는 바람직한 방법이 되었다. 많은 배열-기초 서열분석 절차들이 첨가된(혼성화된) 염기의 동질성을 얻기 위해 라벨이 붙여진 뉴클레오티드들을 이용한다. US-A-5634413에 "단일 염기" 서열분석 방법에 나타나듯이, 이러한 배열은 적절하게 라벨이 붙여진 염기의 동질성에 순차적으로 의존한다. 이러한 "단일 염기" 절차는 두 유형의 라벨을 이용한다; 방사 라벨 및 형광 라벨. 뉴클레오티드의 방사선 라벨화는 높은 민감도와 낮은 백그라운드의 장점을 가진다. 하지만, 방사선 라벨화는 해상도가 빈약하다.

형광-라벨화된 뉴클레오티드는 지금은 많은 기술에서 폭넓게 사용된다. 그러한 뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄반응에 의해 순차적 방식으로 신생 폴리뉴클레오티드 사슬로 도입된다. 다른 뉴클레오티드들(A, T, G 및 C) 각각은 예를 들면, 전하-결합 검출기(CCD)와 같은 민감한 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있는 3' 위치에 독특한 형광단(fluorophore)을 도입한다. 형광단은 종종 또한 도입된 뉴클레오티드의 추가적인 뉴클레오티드 첨가를 위한 기질로써 작용하는 능력을 제거하고 그럼으로써 비조절된 중합반응을 방지하는 "차단기"로써 작용한다. 종종, "제거가능한 차단기"가 사용된다. 뉴클레오티드와 차단기 간의 공유 결합의 분할로 끝나 는 특정 처리에 의해 제거될 수 있는 "이동가능한 차단기"가 사용된다.

이동가능한 차단기는 예를 들면, 광화학, 화학 또는 효소 처리같은 많은 가능한 제거 처리 전략에 의존한다. 하지만, 이것들은 조절하고 적용하기가 어렵다는 것이 보여졌다. 예를 들면 배열 내에서와 같은 국소 환경에서의 차이는, 바로 그 의도된 라벨 대신에, 완전히 하나의 뉴클레오티드 또는 심지어는 여러 뉴클레오티드를 제거시킬 수 있다. 그러한 사례들은 서열분석 방법의 충실에 대해 중대한 결과를 가진다. 뉴클레오티드의 비조절된 제거는 위상이 달라지는 서열분석 데이터 및 믿을 수 없거나 쓸모없게 되는 서열분석 데이터를 가져온다.

두 라벨화 방법의 추가적인 단점은 반복 서열이 결과의 모호성을 이끌 수 있다는 것이다. 이 문제는 Automation Technologies for Genome Characterization , Wiley-Interscience (1997), ed. T.J. Beugelsdijk, Chapter 10:205-225에서 인식된다.

그러므로 폴리뉴클레오티드의 서열을 식별하기 위한, 특히 예를 들면, SNPs를 검출하기 위한 것과 같이, 폴리뉴클레오티드 서열 내에 변화를 검출하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 있고, 그것은 방사선라벨이 붙여진 뉴클레오티드의 높은 민감도와 낮은 백그라운드를 높은 해상도의 형광-라벨이 붙여진 라벨과 조합시킨다.

발명의 요약

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열의 식별은 폴리머라제가 폴리머라제 반응 중에 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되는 시간을 측정함으로써 수행될 수 있다는 것을 이해하는 것을 기초로 한다. 일반적으로, 폴리머라제는 도입 동안에 이용가능한 뉴클레오티드가 없을 때에 표적 뉴클레오티드에 결합되는 시간을 덜 소비할 것이다. 그러므로, 이용가능한 바로 그 뉴클레오티드가 비-상보성이라면, 폴리머라제는 단축된 기간 동안 폴리뉴클레오티드에 결합할 것이고, 이것은 표적 폴리뉴클레오티드의 상보성 서열의 동질성을 나타내기 위해 측정될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 양상에 따라, 폴리뉴클레오티드의 서열을 식별하는 방법은 하기 단계를 포함한다:

(i) 표적 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 효소와 뉴클레오티드 A, T (U), G 및 C 중 하나와 폴리머라제 반응이 진행되기에 적합한 조건 하에 접촉시키는 단계;

(ⅱ) 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 연이어 그로부터 해리되는데 걸리는 시간을 측정함에 의해 상기 폴리머라제가 상기 표적 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 병합시키는 가를 결정하는 단계,

(ⅲ) 임의로 단계 (i) 및 (ⅱ)를 추가 뉴클레오티드로 반복함에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하는 단계.

본 발명의 두 번째 양상에 따라, 표적 폴리뉴클레오티드의 돌연변이의 식별을 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:

(ⅱ) 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 연이어 그로부터 해리되는데 걸리는 시간을 측정함에 의해 상기 폴리머라제가 상기 표적 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 병합시키는 가를 결정하고, 그리고 표적의 천연 서열에 대하여, 돌연변이가 존재하는가를 측정하는 단계.

발명의 설명

여기서 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "표적 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 폭넓게 해석되야 하고, 예를 들면 펩티드 핵산(PNA)와 같은 다른 혼성화된 핵산-유사 분자뿐만 아니라 변형된 DNA 및 RNA를 포함하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 당업자에게는 인식되듯이, 표적 폴리뉴클레오티드는 최소한 부분적으로 단일가닥이고 더 바람직하게는 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있도록 그것에 부착된 프라이머 서열을 가진다.

효소는 상보적 가닥을 연장하는 처리 시에 표적 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 폴리머라제 효소이고, 어느 알려진 유형일 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제는 어느 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA 분자라면, 그 후에 폴리머라제는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제, 즉, 역전사효소, 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제, 즉, RNA 복제효소일 수 있다. 프리마제(primase) 효소도 또한 정의 내에 포함된다.

표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 지지물질 상의 특정 위치에 국한된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체 상의 고정화에 의해 국한된다. 폴리뉴클레오티드를 고정화하는 용도로 적절한 지지체는 당업자에게는 분명할 것이다. 예를 들면, 실리콘, 유리 또는 세라믹 물질이 사용될 수 있다. 고정화는 공유 또는 비공유 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 공유 링커 분자가 사용될 수 있다. 바람직한 구현예로, 프라이머는 지지물질 상에 고정화되고 표적 폴리뉴클레오티드는 그것에 잡종화된다. 대안으로, 표적 폴리뉴클레오티드 및 프라이머의 혼성화는 용액 중에서 일어날 수 있고 프라이머 또는 표적 폴리뉴클레오티드는 그 다음에, 또는 동시에 지지물질에 부착된다.

고체 지지물질에 고정화된 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드가 있을 수 있다. 바람직한 구현예로, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드가 지지체에 부착된다. 표적 폴리뉴클레오티드의 이러한 "배열"은 개개의 폴리뉴클레오티드 위치가 결정될 수 있는 "단일-분자" 배열뿐만 아니라 다중-분자, 고-밀도 배열을 포함하는 어떤 알려진 밀도일 수 있다. 즉, 단일 폴리뉴클레오티드에서 일어나는 폴리머라제 반응을 모니터하는 것이 가능하다.

서열분석 방법의 첫 번째 단계로써, 표적 폴리뉴클레오티드는 혼성화/중합반응 완충용액에서 적절한 프라이머와의 접촉될 수 있다. 전형적으로, 완충용액은 표적 폴리뉴클레오티드 상에 존재하는 어떤 이차 구조를 붕괴(또는 용해)하기에 충분히 높은 온도일 것이다. 냉각 시에, 프라이머는 표적상에서 그것의 보체로 어닐링될 것이다. 그 후에 이것은 표적 폴리뉴클레오티드/폴리머라제 복합체를 형성하도록 폴리머라제와 접촉된다.

본 발명의 하나의 구현예로, 뉴클레오티드의 첨가는 다른 뉴클레오티드가 폴리머라제/표적 복합체에 순차적으로 첨가되도록 조절된다. 예를 들면, dGTP가 첨가될 수 있고 폴리머라제/폴리뉴클레오티드 복합체 상으로 흐르도록 허용될 수 있다; 폴리머라제가 폴리뉴클레오티드에 복합되는 시간이 그 후에 측정된다. 비부착된 dGTP는 반응 위치 밖으로 흐르고 추가 뉴클레오티드가 도입된다. 이러한 방식으로, 형성된 복합체가 그 시간 중에 존재하는 특정 뉴클레오티드와 상호관련될 수 있는 시간 및 폴리뉴클레오티드 서열이 그러므로 측정될 수 있다.

반응은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물에 폴리머라제를 첨가함으로써 시작될 수 있다. 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되고 해리되는데 걸리는 시간을 모니터한 후에, 미부착된 뉴클레오티드는 제거될 수 있고, 다음 뉴클레오티드가 추가 서열분석 단계를 수행하도록 도입될 수 있다.

표적 상으로의 뉴클레오티드의 도입은 어떠한 도입도 가능하지 않을 때 걸리는 것보다 더 긴 기간동안 폴리머라제가 표적과 결합하는 것을 필요로 한다. 폴리머라제와 그것의 표적 간의 결합의 측정은 도입 이벤트가 동일한 유형의 서열 뉴클레오티드를 가진 표적 상의 위치에 대해 일어나는지를 나타낸다. 결합 시간은 비례적으로 증가할 것이다. 그러므로 상기 방법은 동일한 유형의 일련의 뉴클레오티드를 식별하는데 사용될 수 있다.

폴리머라제와 표적 폴리뉴클레오티드 간의 상호작용의 검출은 적용된 방사선의 변화를 측정함으로써 수행될 수 있다. 폴리머라제와 표적 폴리뉴클레오티드 간에 상호작용에 대해 일어나는 방사선 변화를 측정하는 것은 편리한 기구를 사용하여 수행될 수 있다.

한 구현예에서, 폴리머라제와 표적 폴리뉴클레오티드의 상호작용은 비선형 영상시스템을 사용하여 측정된다.

비선형 영상 시스템은 본 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 재료의 비-선형 극성화(polarisation)은 다음과 같이 표현될 수 있다.:

P=X⁽²⁾E¹+X⁽²⁾E²+X⁽³⁾E³+ -----

여기서, P는 유도 극성화이고, X(n)은 n-차 비-선형 자화율이고, E는 전기장 벡터이다. 첫번째 항은 빛의 정상 흡수 및 반사를 나타내고; 두번째 항은 제2 조화파발생(SHG), 합과 차 주파수 생성을 나타내고; 및 세번째 항은 광산란, 유도라만공정, 제3 조화파 발생(TGH), 및 2- 및 3-광자 흡수를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 영상 시스템은 제2 또는 제3 조화파 발생으로부터 발생하는 신호의 검출에 의지한다.

제2 또는 제3 조화파 발생(이하, SHG로 함)을 사용한 단일-분자의 해상(resolution)는 본 분야에 잘 알려져 있다(Peleg et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1999;95:6700-6704 및 Peleg et al., Bioimaging, 1996;4:215-224). 알맞은 시스템은 WO-A-02/095070에 기재되어 있다.

한 구현예에서, 검출은 용액상(즉, 폴리머라제 및 표적 뉴클레오티드가 고정화되지 않음)에서, 라만 산란 및/또는 LSPR 기술을 사용하여, 실시된다.

빛이 분자를 향할 때 입사광자의 거의 대부분은 주파수의 변화없이 탄성적으로 분산된다. 이것은 레일리 산란이라 한다. 그러나, 입사광자의 몇몇의 에너지(약 매 10⁷ 광자 당 1)는 분자의 결합의 별개의 진동 모드와 결합한다. 이와 같은 커플링은 몇몇의 입사광을 입사광의 범위와 다른 주파수 범위를 갖는 분자에 의해 비탄성적으로 산란되도록 한다. 이것을 라만효과라 한다. 이와 같은 비탄성적으로 산란된 빛의 주파수를 강도에 대하여 플롯화시킴에 의해, 조사되는 분자의 독특한 라만 스펙트럼의 분석은 샘플 분자 조성물에 관한 정보를 가져올 수 있다.

라만효과는 구조화된 금속 표면에 라만 활성분자(들)을 근접하게(≤50Å) 가져옴으로써 상당히 강화되어질 수 있고, 이 장은 표면으로부터 대수적으로 멀어짐으로써 붕괴된다. 분자를 금속표면에 근접하게 가져오는 것은 통상적으로 적당히 거친 금, 은, 구리 또는 다른 유리-전자 금속상에 라만-활성 분자의 흡착을 통해 달성된다. 라만활성의 표면 강화는 금속 콜로이드성 입자, 절연기질상의 금속필름, 및 금속 입자 배열에서 발견된다. 이 표면-강화 라만 산란이 일어나는 메카니즘은 잘 이해되지 않지만, 이것은 (ⅰ)빛의 국소적 강도를 강화하는 금속에서의 표면 플라즈몬 공명, 및 (ⅱ)금속 표면과 라만-활성 분자 간의 전하-전이 복합체의 형성 및 이후의 전이의 결합에 의한 것으로 생각되어진다.

라만효과는 폴리머라제와 표적 폴리뉴클레오티드 간의 결합시간을 측정하는데 사용될 수 있다. 라만 신호를 강화하기 위해서는, 표적이 금속 표면에서 고정적인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 표면강화 라만 산란(SERS)은 예를 들면, 금 또는 은 나노입자와 같은 폴리머라제에 결합된 금속 콜로이드성 나노입자의 사용을 통해 적용된다. 연합 또는 결합된 라만 강화 금속 나노입자, 라만-활성분자(들)은 광학 태그로서 유용성을 갖는다. 이러한 일반적인 개념은 미국특허 제6,514,767에 개략되어 있고, 이것의 내용은 본 명세서에 참조로서 병합되어 있다. 한 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드와 폴리머라제는 라만 활성분자의 독특한 라만 스펙트럼을 조사함으로서 검출될 수 있다. 단일 라만 스펙트럼(100~3500/cm)은 많은 다른 라만-활성 분자를 검출할 수 있기 때문에, 폴리머라제와 결합된 또는 연합된 SERS-활성 나노입자는 다중시험 포맷 내에서 본 발명과 관련하여 사용될 것이다.

개별적인 구현예에서, 방사에서의 변화는 표면 전자기파 기술을 사용하여 모니터될 수 있다.

표면 전자기파 기술(및 특히, 표면 플라즈몬 공명-SPR-센서)와 병합된 바이오센서는 표면전자기파(SEW)가 전파되는 표면 근처의 박막의 굴절 인덱스에 대한 SEW의 민감성을 기준으로 한다. 바이오센서에서, 폴리머라제와 뉴클레오티드는 고정된 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 표면을 가로질러 흐르는 것을 허용한다. 결합이 생김에 따라, 표면의 매스의 축적 또는 재분배는 센서에 의해 실시간으로 모니터될 수 있는 국소적 굴절 인덱스를 변화시킨다.

SPR 기술을 사용하는 여러 방법이 제안되어져 왔고 바이오센서를 현실화 해왔다. 가장 인기있는 방법은 센서로부터 반사된 광의 강도가 모니터 되어지는 Kretsmann-Raether 배열을 기초로 한다. 이 기술은 가장 민감한 방법 중 하나로 간주되며, J.Homola et al, Sensors and Actuators B 54, p.3-15(1999)에 기재되어 있고, 5×10^-7굴절 인덱스 단위의 검출한계를 갖는다. SPR 상 변화의 측정은 1 또는 2 차수 크기에 의해 센서의 민감도를 추가로 증가시킨다. 이것은 Nelson et al, Sensor and Acuators B 35-36, p.187(1996) 및 Kabashkin et al, Optics Communications 150, p5(1998)에 기재되어 있다. 마치 젠더장비(Mach Zehnder device)와 같은 선행기술의 간섭장비는 상전이를 통한 센서 표면에서 굴절 인덱스의 변화를 측정하기 위해 배치되어졌다. 이것은 국제특허공보 WO-A-0120295에 개시된다. 배치는 4개의 독립적인 성분들을 필요로 하고 이들 성분들의 서브-파장 상대적 변환 및 따라서 매우 작은 기계적 및 환경 섭동에 민감하다. 기계적으로 더욱 강한 일체식 간섭계의 고안은 WO-A-03014715에 개략적으로 설명되어 있다.

바람직한 구현예에서, 표면 전자기파(SEW) 센서 시스템은 완충액의 벌크 굴절 인덱스에서의 변화를 보충할 수 있거나 센서 표면상에 흡수된 분석물로부터 분리되어질 간섭 패턴에 대한 벌크 굴절 인덱스의 기여를 허용한다. 그러므로 바이오센서는,

입사파를 발생할 수 있는 간섭성(coherent) 방사원;

고정된 폴리뉴클레오티드를 지지하기 위한 담체 표면, 상기 담체 표면은 기질 상에 장착되어 있고 표면 전자기파(SEW)를 지지할 수 있고;

입사파를 SEW 및 제1 분산파로 분열시키기 위한 수단, 여기서 SEW는 담체 표면을 따라 전진하고 고정된 뉴클레오티드와 상호작용하고;

SEW로부터 제2 분산파를 발생시키기 위한 수단; 및

제1 분산파와 제2 분산파 사이의 간섭을 모니터하기 위한 검출기를 포함한다.

이 구현예에서, 단색광 레이저에 의해 발생된 고유 광학빔은 렌즈를 사용하여 표면 전자기파(SEW)를 지지할 수 있는 금속필름의 가장자리로 모아진다. 광학빔은 금속 필름이 장착된 유리 프리즘을 통해 통과한다. 근적외선 레이저가 조명원으로 사용된다. 근적외선 원을 사용하는 것은 금과 은에서 표면 플라즈몬에 대한 긴 진행길이의 이점을 갖고, 반면 종래의 광학기는 영상 및 조명을 위해 여전히 사용될 수 있다.

이 시스템은 WO-A-04/020985에 기재되어 있고, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 병합되어 있다.

바람직한 구현예에서, 폴리머라제는 라벨화 되어진다.

본 명세서에 사용되는 용어 "라벨"은 넓게 해석될 수 있다. 적절한 라벨은 당업자에게 명확할 것이다. 바람직한 구현예에서, 라벨은 형광단이다. 특별한 구현예에서, 폴리머라제는 바람직하기는 GFP(Green Fluorescent Protein)과의 재조합 융해물로서 제조된다. 이것은 야생형 GFP 또는 스펙트럼적으로 이동된 그들의 돌연변이일 수 있다(Tsien Ann, Rev. Biochem., 1998; 67:509, US5,777,079 및 US 5,625,048) GFP는 효소의 N- 또는 C- 말단에 위치할 수 있다(C-말단은, 폴리머라제가 '슬라이딩 클램프'와 함께 사용될 수 있으므로 더욱 바람직하다). 선택적으로, GFP 분자는, 효소의 활성이 유지되는 한, 효소 내의 어디에도 위치될 수 있다. 다른 라벨이 사용될 수 있다. 마이크로스피어(Anal. Chem.(2000) 72, 15:3678-3681), 금 나노입자(J. Am.Chem.Soc (2000) 122, 15:3795-3796), 은(silver) 콜로이드 입자(PNAS, (2000) 97, 3:996-1001) 및 양자 화소(quantum dots)와 같은, 분자를 라벨링하기 위한 수많은 계획이 보고되었다. 폴리머라제와 표적 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드의 상호작용의 명확한 해석을 허용하는 어느 라벨화 기술은 본 발명의 범위내에서 사용될 수 있다. 바람직하기는, 표적 폴리뉴클레오티드:뉴클레오티드 복합체로부터 결합 및/또는 해방되는 효소의 일시적 분석을 허용하는 라벨이 사용된다.

바람직하기는, 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 배열이 생성되고 폴리머라제 효소가, 4개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나와 함께, 효소활성에 충분한 조건에서 배열에 걸쳐 흐른다. 더욱 바람직하기는, 이것은 유동세포 내에서 일어난다. 단일 고정된 표적 폴리뉴클레오티드 또는 다수의 동일한 표적 뉴클레오티드를 함유하는 배열 내의 각 "배열 위치"는 동시에 분석을 영상화하여, 바람직하기는 1 내지 적어도 수천 헤르츠의 표적 폴리뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체에 효소의 결합의 분석을 허용한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리머라제 효소는 형광공명에너지전이(FRET) 쌍으로 라벨화된다. 이 시스템은 WO-A-01/25480에 기재되어 있다. 본 분야의 당업자에의해 이해되는 바와 같이, FRET 쌍은 형광단(fluorophore) 및 형광단과 상호작용가능한, 에너지 공여체 또는 수여체로 작용하는 제2 분자를 필요로 한다. 쌍 간의 상호작용은 형광단의 방출 스펙트럼을 변경시키고, 이것은 검출된다. 제 1분자는 또 다른 형광단 일 수 있거나 또는 다른 금속입자와 같은 다른 알맞는 분자일 수 있다. 바람직하기는, 고전적인 FRET가 사용되고, 여기서 두개의 라벨은 모두 형광단이고, 하나의 형광단의 방사 파장이 다른 것의 여기 파장에 해당되도록 선택된다. 효소 상의 고정 위치는 효소가 3성분 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드와 결합될 때 형광단이 또 다른 것에 관하여 이동하도록 선택된다. 이러한 FRET 쌍 간의 상대적 이동은, FRET 쌍이 고안된 방법에 따라, 쌍으로부터의 방사의 특정 이동을 가져올 것이다. 그리고 나서 어느 정도의 에너지가 공여체로부터 수여체로 결합되고, 공여체 형광단의 여기 또는 감쇄를 가져온다. 이것은 원하는 정보를 얻기 위해 높은 순간 해상도로 모니터된다. 바람직하기는 원하는 정보를 얻기 위해 형광단의 범위를 영상화하기 위해 사용되는 장비는, 신속한 정보판독시간 및 높은 공간 해상을 위해 적절한 광학적 특성을 갖는 전하-결합 장비(CCD)이다.

폴리머라제와 표적 사이에 상호작용을 모니터에 요구되는 해상 시스템이 연구의 샘플을 "스캔"할 필요를 고려하기 위해 모니터될 수 있다. 그러한 스캔은 단일 분자 시스템와 같은 고 해상 시스템에서 특히 그럴 것이다. 단일 분자 실험에 요구되는 고 수준의 공간 해상으로, 효과적인 관찰 영역은 대응하여 감소된다. "역학" 분석은 보통 단일의 한정된 영역에서 연속 "실-시간" 모니터를 요구하기 때문에, 스캔은 비연속 모니터의 문제를 가져온다. 그러한 비연속 모니터는, 상호작용 이벤트가 누락될 수 있기 때문에, 역학 분석과 상용되지 않는다. 그러므로 본 발명의 바람직한 면에서, 5 프라임에 라벨된 뉴클레오티드가 채용된다: 제거가능한 블로킹 기로서 작용하는 라벨. 그래서 고 공간 해상이 채용되는 경우에 (관찰 지역이 통상 단지 100㎛씩이고 칩이 일반적으로 적어도 100배 더 큰, 단일 분자 배열과 같이), 관찰 지역은 새로운 위치로 "이동"되고, 그 지역은 블로킹기를 제거하기에 적절한 방사선(예를들면, UV)로 조사된다. 이 전략은 연관(assosiation)/역학 이벤트가 "관찰된" 지역에서만 일어남을 보장한다. 그리고 나서 "관찰된" 지역은 칩 주위로 이동될 수 있고, 뉴클레오티드를 블로킹하지 않기에 충분한 방사선에 관찰 하의 지역을 단지 노출함에 의해, 선택적인 상호작용이 이 지역에서만 일어난다.

추가의 다른 바람직한 구현예에서, 영상화 영역은 개개의 유동 세포로 한정된다, 즉 관찰 영역이 100㎛ 씩으로 제한되는 경우에, 유동 세포는 거의 이들 관련 규모로 제한된다. 따라서 이 구현예에서, 뉴클레오티드는 활성적으로 영상화되는 유동 세포로 단지 주입된다. 그러므로 폴리뉴클레오티드가 배열되는 지지 재료는 개별적으로 어드레스할 수 있는 유동 세포의 "배열"로 구성될 수 있다. 영상화 영역은 칩 주위로 이동되기 때문에, 뉴클레오티드들은 영상화 영역에서만 유동 세포(들)로 주입된다.

추가의 구현예에서, 폴리머라제의 결합은 층간삽입 분자와 폴리머라제 상의 염료/캔처(quencher) 사이의 공명 에너지 전달을 통해 검출된다. 층간삽입 염료 (예를들면 CYBRGreen, 분자 프로브)는 이중 가닥 프라이머-주형 복합체에 결합시에만 형광일 것이다. 그리고 나서 이 신호는 표적 폴리뉴클레오티드의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 폴리머라제는, 층간삽입 염료로부터 에너지를 흡수하고 재-발산할 수 있는 "수용체" 분자인, 염료로 변형된다. 선택적으로, "라벨"은 캔처일 수 있다. 따라서 결합/상호작용 이벤트는 에너지 전달에 기인한 신호의 변화를 관찰함에 의해 모니터될 수 있다.

본 발명의 방법은 완전한 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드의 부분의 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 표적 내에 돌연변이의 존재를 결정하기에, 예를 들면, 대조 또는 참조 서열과 비교하여 치환, 결실 또는 첨가가 일어나는가를 결정하기에 적합하다.

바람직한 구현예에서, 본 방법은 유전학적 샘플에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 여기서 사용될 때, 용어 "다형성"은 2 이상의 선택적인 게놈 서열 또는 다른 게놈 또는 개체 사이의 대립유전자의 발생을 이른다. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 단일 염기쌍 변화이다. 전형적으로 SNP는 다형성의 부위에서 다른 뉴클레오티드에 의해 하나의 뉴클레오티드의 대체이다. 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 단일 뉴클레오티드의 삽입은, 또한 단일 뉴클레오티드 다형성을 발생한다.

본 방법은 돌연변이의 추정 부위에서 뉴클레오티드의 확인을 결정하기 위해 사용되고, 그 정보는 돌연변이가 존재하는가를 찾아내기 위해 참조 서열과 비교될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 상보적 뉴클레오티드를 시간-분석형방식으로 영상화 한 신호를 나타내는 도면이다.

도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 비-상보적 뉴클레오티드를 시간-분석형방식으로 영상화 한 신호를 나타내는 도면이다.

다음 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예

이 실험에서, 그린 형광 단백질(GFP)과 폴리머라제의 융합단백질은 당해 기술에서 잘 알려진 재조합 기술을 통해 만들어졌다.

석영 칩(직경 14mm, 두께 0.3mm)을 고정화된 스트렙타비딘 (Xantec, Germany)으로 변형된 평면 덱스트란의 층으로 스핀-코팅되었다. 총 내부 반사(TIR) 조명을 갖춘 직립현미경 (135TV, Zeiss)이 실험을 위한 플랫폼으로서의 역활을 했다. 100mW의 동력을 갖는 488nm 피크 레이저 빔(Melles Griot)이 쿼터-파 플레이트에 의해 순환적으로 편광하게 되어서 맞춤 프리즘에서 TIR을 겪게 되었다. 프리즘은 인덱스 매칭 겔을 통하여 칩에 광학적으로 커플되었다. 그리고 나서 유동 세포는 O-링 실(seal) 및 투명 광학 축으로 프리즘 및 석영 칩에 걸쳐 조립된다. 대물렌즈는 유동 세포의 투명한 상부 표면을 통하여 형광 신호를 수집했다. 영상은 밴드-통과 필터를 통하여 백-씬드 (back-thinned) 전하-결합 장치(Andor technologies)로 전해졌다.

두 개의 올리고뉴클레오티드가 표준 포스포아미디트 화학을 사용하여 합성되었다. SEQ ID NO.1에 정의된 올리고뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드로서 사용하였고, SEQ ID NO.2에 정의된 올리고뉴클레오티드를 비오틴화하여 프라이머로 사용하였다. 비오틴화된 프라이머 (SEQ ID NO.2)는 스트렙타비딘 코팅된 칩 상으로, 100mM MgCl₂를 함유하는 트리스 버퍼 중의 SEQ ID NO.2 10pM을 유동 세포로 주 입함에 의해 침착시키고, 10분동안 인큐베이트 했다.

SEQ ID NO. 1

CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG

SEQ ID NO. 2

비오틴-CTCTCCCTTCTCTCGTC

유동 버퍼는 유동세포로 500㎕/분의 속도로 흘려 내려 보냈다(flush). 그리고 나서 상보적 서열, SEQ ID NO.1은 1μM의 농도, 5㎕/분의 흐름 속도로 유동 세포로 주입되었다. 이 주입 동안, 세포는 유동 세포 내에 백금 가열 전극을 통하여 몇 분 동안 70℃로 가열되었고, 25℃로 냉각되었다. 그리고 나서 추가 10분 동안 주입을 계속하였다. 일단 주입이 완료되었을 때, 유동 버퍼를 500㎕/분의 흐름 속도로 시스템을 통하여 연속적으로 흘려 내려 보냈다. 10분 후에, 서열 반응은, 0.4mM dATP(8㎕)를 버퍼로 500㎕/분의 흐름 속도로 주입함에 의해, 개시되었다. 주입 시작 1초 후, 일련의 CCD 영상은 최대 프레임 속도 (초당 30 프레임)로 기록되었고 최대 신호 강도를 함유하는 영상이 저장되었다. 그리고 나서 상보적인 뉴클레오티드 dCTP를 주입 1초 후 저장된 추가의 CCD 영상에 0.4mM로 주입되었다.

상보적인 뉴클레오티드는 "시간-분석형(time-resolved)" 방식으로 영상화될 때 비-상보적인 뉴클레오티드 (도 1b)과 비교하여 강한 신호(도 1a)를 주었다.

Claims

표적 폴리뉴클레오티드 서열의 확인 방법으로,

(i) 표적 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 효소와 뉴클레오티드 A, T (U), G 및 C 중 하나와 폴리머라제 반응이 진행되기에 적합한 조건 하에 접촉시키고;

(ⅱ) 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 연이어 그로부터 해리되는데 걸리는 시간을 측정함에 의해 상기 폴리머라제가 상기 표적 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 병합시키는 가를 결정하고,

(ⅲ) 임의로 단계 (i) 및 (ⅱ)를 추가 뉴클레오티드로 반복함에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하는 것을 포함하는 방법.
표적 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이의 확인 방법으로,

(i) 표적 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 효소와 뉴클레오티드 A, T (U), G 및 C 중 하나와 폴리머라제 반응이 진행되기에 적합한 조건 하에 접촉시키고;

(ⅱ) 폴리머라제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고 연이어 그로부터 해리되는데 걸리는 시간을 측정함에 의해 상기 폴리머라제가 상기 표적 폴리뉴클레오티드로 뉴클레오티드를 병합시키는 가를 결정하고, 그리고 표적의 천연 서열에 대하여, 돌연변이가 존재하는 가를 측정하는 것을 포함하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (i)-(ⅱ)는, 병합이 검출될 때까지, 다 른 뉴클레오티드 각각으로 번갈아 수행되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 지지 재료상에 고정화되어 있는 것인 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 표적 폴리뉴클레오티드가 지지 재료상에 고정화되어 있는 것인 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)는 적용된 방사선을 측정함에 의해 수행되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)는 라만 산란을 측정함에 의해 수행되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)는 표면 전자기파 적용에 의해 수행되는 것인 방법.
제 8항에 있어서, 표면 전자기파는 표면 플라즈몬 파인 것인 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 결정은 표면 전자기파의 측정 에 의해 수행되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제는 그 상에 부착된 검출가능한 라벨을 포함하는 것인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 라벨은 형광단인 것인 방법.
제 11항에 있어서, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 미결일 때, 폴리머라제는 추가로 에너지 공여체 라벨 또는 에너지 수용체 라벨을 포함하고, 그리고 단계 (ⅱ)는 형광단과 에너지 공여체 또는 수용체 사이의 에너지 전달을 측정함에 의해 수행되는 것인 방법.