ES2300315T3 - Proceso de fermentacion mejorado. - Google Patents

Abstract

Una suspensión acuosa que comprende agua, por lo menos un ácido dicarboxílico y un material graso de partículas de ácido dicarboxílico en forma sustancialmente de disco, en forma sustancialmente parcialmente esférica o en forma sustancialmente esférica, en donde el diámetro de las partículas de ácido dicarboxílico es mayor de 15 µm y en donde el material graso está presente en una cantidad que varía desde 10 partes por millón a 5% con base en la masa del ácido dicarboxílico.

Description

Proceso de fermentación mejorado.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona con un medio y proceso de fermentación mejorado para elaborar un ácido policarboxílico alifático utilizando dicho medio.

Los ácidos alfa, omega dicarboxílicos de cadena larga, es decir, aquellos que tienen un número de carbonos de 9 o mayor, se utilizan como materias primas en la síntesis de una variedad de polímeros y productos químicos.

Los diácidos con números de carbono mayores de cuatro son habitualmente producidos casi exclusivamente mediante procesos de conversión no biológicos. Estos tipos de procesos químicos para la producción de diácidos tienen un número de limitaciones y desventajas. Cada proceso está restringido a la producción de diácidos de longitudes de cadena de carbono específica, con base en el material de partida utilizado. Por ejemplo, el proceso de ácido dodecanodióico inicia con butadieno, por lo tanto los productos de este proceso de reacción están limitados a ácidos con longitudes de cadena en múltiplos de cuatro. Además, los procesos se basan en materias primas petroquímicas no renovables, y el proceso de conversión multi-reacción produce subproductos no deseados que dan como resultado pérdidas de rendimiento, desperdicios de metal pesado y óxidos de nitrógeno que se deben destruir en un horno de reducción.

Los procesos de conversión biológica para la producción de diácidos tienen un número de ventajas potenciales con relación a los procesos de conversión no biológicos existentes. Principales entre éstos es el uso de materias primas renovables como materiales de partida y la capacidad de producir el diácido sin la generación de subproductos químicos riesgosos que necesitan procesos de desecho de desperdicios costosos.

Otra ventaja importante lograda al utilizar un proceso biológico es que tal proceso puede ser fácilmente adaptado para producir una amplia variedad de diácidos utilizando los mismos biocatalizadores y el mismo equipo. En razón a que las síntesis químicas orgánicas habituales son adecuadas para la producción de solamente un diácido único. La síntesis de varios diácidos diferentes requeriría el desarrollo de un nuevo esquema sintético para cada diácido. De otra parte, un biocatalizador de levadura se puede utilizar para producir diácidos de longitudes varias utilizando el mismo equipo, medios y protocolos simplemente al suministrar un sustrato diferente a la levadura.

La Patente U.S. No. 6.004.784, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia, describe un medio de fermentación semi-sintético que emplea licores de maíz empapado y extractos de levadura para elaboración de cervezas con el fin de reducir el costo del medio de fermentación convencional que contiene extractos de levadura costosos, altamente estandarizados y bases de nitrógeno de levadura.

El problema asociado con el uso de tales sustitutos no costosos es múltiple. Ellos dan como resultado un caldo de fermentación que tiene emisiones de olor significativas cuando se mezclan con el aire. La materia en partícula, especialmente combinada con altos niveles de bacterias, contenidas en licores de maíz empapado y los extractos de levadura crudos los hacen difíciles de esterilizar y contribuir a la biocarga sobre el equipo de esterilización medio. Estos sustitutos también contienen muchos componentes no metabolizables que contribuyen al color y a los problemas de estabilidad del color que necesitan ser atendidos para utilizar las etapas de purificación adicionales con sus pérdidas de producto correspondientes. La selección de estos sustitutos, aunque disminuyen el costo medio, agregan costos de proceso adicional. Consecuentemente, subsiste la necesidad de un medio de biofermentación de bajo costo que suministre nutrientes para soportar el crecimiento de los biocatalizadores de levadura que permita la productividad específica alta de los ácidos policarboxílicos, polioles, y ácidos polihidróxi.

Aunque los ácidos dicarboxílicos de cadena larga tienen solubilidad limitada en el agua y su forma de sal no disociada o parcial, existen muchos casos donde es necesario manejarlos en un medio acuoso. Ejemplos incluyen la fermentación y los procesos de recuperación utilizados para producir los ácidos dicarboxílicos, las reacciones de polimerización interfacial, las reacciones de polimerización de emulsión y las reacciones enzimáticas.

Las suspensiones acuosas de ácidos dicarboxílicos de cadena larga tienden a ser altamente viscosas y son por lo tanto difíciles de manejar. Los temas operacionales principales en las reacciones de fermentación utilizadas para preparar los ácidos dicarboxílicos incluyen transferencia de oxígeno, transferencia de calor, soporte de gas en el caldo de fermentación, y soporte del caldo en el gas existente (espumación) estando cada una afectada por las características reológicas del caldo. De manera similar, en los procesos de filtración utilizados para recuperar los ácidos dicarboxílicos provenientes del caldo de fermentación, la alta viscosidad conduce a tasas de filtración imprácticas. En las reacciones de polimerización y de enzima, los efectos de la viscosidad sobre la transferencia de masa serían el tema principal en razón a que es deseable tener un contacto rápido, predecible de los reactivos.

En la DE 29 09 420 A1, Watanabe, et al., describe un método para tratar suspensiones de ácidos dicarboxílicos de cadena larga en un caldo de fermentación libre de células para mejorar las tasas de filtración y la pureza de los diácidos recuperados. Él demostró que al calentar la suspensión de ácido dicarboxílico acuosa a pH 4 o por debajo o por encima de 50ºC durante 1 hora o más, él podría controlar la distribución del tamaño de partícula y la morfología de la partícula. Él describe que al hacer crecer las partículas a un tamaño de partícula promedio de 40 - 50 \mum él podría obtener tasas de filtración mejoradas, humedad de torta de filtro inferior, y pureza de ácido dicarboxílico superior en la torta de filtro. Desafortunadamente, este método tiene utilidad limitada para muchas aplicaciones donde las suspensiones acuosas para los ácidos dicarboxílicos de cadena larga se encuentran.

Muchas reacciones de fermentación y de enzima ocurren sobre un amplio rango de pH y por debajo de 50ºC. En muchos casos, la enzima y la actividad microbiana se reduciría o destruiría bajo las condiciones descritas en Watanabe, et al. Las reacciones de polimerización interfacial y de emulsión que involucran suspensiones de ácido dicarboxílico acuosas podrían solamente estar limitadas a los reactivos térmicamente estables. Existe por lo tanto necesidad de métodos alternativos para controlar propiedades reológicas de suspensiones acuosas de ácidos dicarboxílicos de cadena larga.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención está dirigida a un medio y proceso de fermentación para elaborar ácidos policarboxílicos, polioles y ácidos polihidroxi utilizando dicho medio. El medio de fermentación contiene:

(a)

una fuente de carbono metabolizable y energía;

(b)

una fuente de nitrógeno inorgánico;

(c)

una fuente de fosfato;

(d)

por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de metales alcalinos, metales alcalino térreos, metales de transición, y mezclas de éstos; y

(e)

una fuente de biotina, sustancialmente libre de materia en partícula y bacterias.

Un proceso para elaborar los ácidos policarboxílicos, polioles y ácidos polihidroxi involucra:

(a)

suministrar un organismo capaz de producir un ácido policarboxílico, un poliol o un ácido polihidroxi;

(b)

suministrar un sustrato capaz de ser convertido en un ácido policarboxílico, un poliol o un ácido polihidroxi por el organismo;

(c)

suministrar un medio de fermentación que contiene:

(i)

una fuente de carbono metabolizable y energía;

(ii)

una fuente de nitrógeno inorgánica;

(iii)

una fuente de fosfato;

(iv)

por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de metales alcalinos, metales alcalino térreos, metales de transición, y mezclas de éstos; y

(v)

una fuente de biotina, sustancialmente libre de materia en partícula y bacterias; y

(d)

fermentar el organismo en el medio de fermentación.

La presente invención también se relaciona con una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico que también incluye agua, y un material graso en una cantidad efectiva para originar la formación de partículas de ácido dicarboxílico sustancialmente en forma de disco, sustancialmente en forma parcialmente esférica o sustancialmente en forma esférica.

La presente invención también se relaciona con un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico e incluye agregar una forma de partícula de ácido dicarboxílico efectiva que forma la cantidad de material graso a la suspensión para generar la formación de las partículas de ácido dicarboxílico conformadas, en donde las formas se seleccionan del grupo que consiste de sustancialmente en forma de disco, sustancialmente en forma parcialmente esférica y sustancialmente en forma esférica.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 es una descripción gráfica de la viscosidad Brookfield de unas suspensiones de caldo de fermentación acuosa al 7% de ácidos dicarboxílicos que utilizan un material graso para modificar las propiedades reológicas del caldo.

Descripción de la invención

Todos los números que expresan cantidades de ingredientes y/o condiciones de reacción se deben entender por ser modificados en todos los casos por el término "aproximado".

A través de la selección juiciosa de los nutrientes alternativos que sostienen el crecimiento microbiano, la invención suministra un medio que permite que materiales polifuncionales importantes se produzcan comercialmente, en una gran cantidad, utilizando procesos de conversión biológica. La invención suministra una alternativa de bajo costo a los medios de la técnica anterior y a los métodos para su uso que es fácilmente preparado y esterilizado, tiene un bajo grado de olor, suministra una contribución más baja de impurezas que se cargan en procesos corriente abajo posteriores, que da como resultado aún la producción de un producto en por lo menos un rendimiento tan alto como los métodos convencionales de la técnica anterior. Es sorprendente que la miríada de componentes no definidos que comprenden licores de maíz empapado y el extracto de levadura se puedan reemplazar por relativamente pocos componentes sin sacrificar la calidad del crecimiento microbiano y la productividad de los compuestos polifuncionales.

Así, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se suministra un medio de fermentación económico capaz de facilitar la bioconversión de varios tipos de sustratos orgánicos. El medio de fermentación contiene los siguientes componentes necesarios: (i) una fuente de carbono metabolizable y energía; (ii) una fuente de nitrógeno inorgánica; (iii) una fuente de fosfato; (iv) por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de metales alcalinos, metales alcalino térreos, y mezclas de éstos, y (v) una fuente de biotina, sustancialmente libre de materia en partículas y bacterias. Estos materiales solos satisfacen los requisitos nutricionales básicos para hacer crecer el microorganismo produciendo aún biomasa en suficiente cantidad y calidad para conducir la bioconversión.

Las fuentes adecuadas de carbono metabolizable y energía incluyen pero no están limitadas a glucosa, fructosa, maltosa, glicerol, acetato de sodio, metanol, alcoholes de cadena corta, y mezclas de éstos. La fuente preferida de carbono metabolizable y energía es glucosa, preferiblemente un jarabe de glucosa líquido, por ejemplo, un jarabe equivalente a dextrosa al 95%, o aun jarabes equivalentes a dextrosa inferiores. Tales materiales contienen pequeñas cantidades de disacáridos, trisacáridos, y polisacáridos que se pueden hidrolizar durante la fermentación mediante la adición de una enzima amilasa tal como amilasa, glucoamilasa y celulasa. Así, la glucosa se puede suministrar in situ en una reacción simultánea con la biooxidación.

Las fuentes inorgánicas de nitrógeno incluyen pero no están limitadas a nitratos de metal alcalino tales como nitrato de sodio o potasio, sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y acetato de amonio. Una fuente de nitrógeno inorgánico preferida es el amonio o el hidróxido de amonio.

Otro componente necesario para el medio de fermentación de la presente invención es una fuente de fosfato que incluye cualquiera de los compuestos que contienen fosfato. Ejemplos de éstos incluyen, pero no están limitados a, fosfato de potasio, fosfato de sodio, y fosfato de amonio. Una fuente de fosfato particularmente preferida para uso en la presente invención es fosfato de potasio.

Los metales adecuados para uso en el medio de fermentación incluyen metales alcalinos, metales alcalinotérreos, metales de transición, y mezclas de éstos. Los metales particularmente preferidos incluyen potasio, calcio, y magnesio, en combinación.

El último componente crítico del medio de fermentación es la biotina que está sustancialmente libre de materia en partícula y bacterias.

Cualquiera de los componentes del medio se pueden agregar como una parte de la carga del medio estéril inicial, esterilizada como soluciones acuosas concentradas para la posterior adición al medio de fermentación, o se pueden incluir en grandes excesos en el inóculo fermentador para llevarlo al fermentador de producción.

Con el fin de evitar problemas asociados con la emisión de olor, inestabilidad de color, y contaminación, es imperativo que la biotina esté libre de material en partícula y bacterias que promuevan tales problemas y requieran etapas de purificación de proceso adicional. La cantidad de biotina requerida será de varios órdenes de magnitud más pequeña que las fuentes de nitrógeno orgánico que éste reemplaza en el medio de la técnica anterior.

El medio de fermentación de la presente invención contiene una solución acuosa: (a) desde aproximadamente 10 g/l a aproximadamente 60 g/l, preferiblemente desde aproximadamente 20 g/l a aproximadamente 40 g/l de una fuente de carbono metabolizable y energía, preferiblemente glucosa; (b) desde aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 2000 ppm, preferiblemente desde aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 250 ppm, y más preferiblemente desde aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 250 ppm, de nitrógeno suministrado mediante la inclusión de una fuente de nitrógeno inorgánico; (c) desde aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 10 g/l, preferiblemente desde aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 7 g/l, de una fuente de fosfato, preferiblemente fosfato de potasio; (d) desde aproximadamente 0,01 g/l a aproximadamente 2 g/l, preferiblemente desde aproximadamente 0,01 g/l a aproximadamente 1 g/l de por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de metales alcalinos, metales alcalino térreos, y mezclas de éstos, preferiblemente una mezcla de calcio y magnesio; y (e) desde aproximadamente 1 \mug/l a aproximadamente 2000 \mug/l, preferiblemente desde aproximadamente 4 \mug/l a aproximadamente 200 \mug/l, y más preferiblemente desde aproximadamente 4 \mug/l a aproximadamente 20 \mug/l de biotina, en donde la biotina está sustancialmente libre de material en partícula deletéreo y bacterias.

El agua presente en el medio de fermentación puede ser un agua de proceso purificada mediante destilación, desionización, o suavizamiento. Las fuentes preferidas de agua incluyen aquellas provenientes del sistema de distribución de aguas municipales, una corriente de reciclamiento de proceso, o un pozo de agua en donde los ajustes en el contenido de minerales pueden necesitar ser tenidos en cuenta para los minerales ya contenidos en estas fuentes de agua. Por ejemplo, el agua junto con otros ingredientes requeridos ya puede contener suficientes componentes minerales para suministrar todos o sustancialmente todos los minerales requeridos para el crecimiento del organismo.

El medio de fermentación de la presente invención satisface los requisitos de nutrientes básicos para el crecimiento del microorganismo, aunque minimizando la adición de los componentes orgánicos e inorgánicos que requieren la separación del producto para desecho como desperdicio y contribuir al proceso de emisiones de olor. Como contraste a las composiciones de medio de fermentación conocidas en la técnica, el medio de la presente invención no contiene materia en partícula, es particularmente adecuado para esterilización continua en un proceso de preparación de medio automatizado, y no es poco costoso. A pesar de las composiciones de medio nutricionalmente apoyadas suministradas por la presente invención, existe una amplia flexibilidad en formular el medio aunque logrando altas productividades de ácidos policarboxílicos, polioles, y ácidos polihidroxi.

Varios tipos de componentes auxiliares también se pueden emplear en el medio de fermentación de la presente invención con el fin de mejorara adicionalmente el proceso de biofermentación. Ejemplos de éstos incluyen, pero no están limitados a, varios tipos de metales en traza, agentes quelantes, agentes anti-espumantes, y similares.

El medio de fermentación de la presente invención se puede utilizar con cualquier levadura productora de ácido policarboxílico, levadura productora de poliol y levadura productora de ácido polihidroxi, y una amplia variedad de sustratos. Por ejemplo, en el evento de que el producto deseado sea un ácido policarboxílico, tal como un diácido, cualquier tipo de ácido graso, éster de ácido graso, o sustrato alcalino se puede utilizar. Ejemplos de sustratos adecuados para la producción de diácidos incluyen, pero no están limitados a, ácido láurico, ácidos mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido palmitoléico y metil éteres de éstos, y mezclas de éstos. Ejemplos de alcanos incluyen dodecano, dodeceno, tridecano, tetradeance, octadecano, y similares.

Así, se suministra un proceso para elaborar un ácido policarboxílico, un poliol, o un ácido polihidroxi. Para propósitos solo de ejemplo, el proceso de la presente invención se describirá con referencia a la elaboración de ácidos policarboxílicos, y específicamente diácidos, como el producto final deseado.

El proceso se puede operar sobre cualquier rango de pH donde el microorganismo pueda crecer y catalizar la reacción de conversión deseada. Un rango de pH preferido y especialmente ventajoso está en el régimen ácido, es decir, un pH de aproximadamente 7 o menos. Aunque la mejora en el pH bajo se puede aplicar a cualquier proceso de fermentación, es especialmente ventajoso cuando se aplica a un proceso de fermentación que produce ácidos policarboxílicos. Los reactivos de control de pH adecuados son amonio, solución de hidróxido de amonio, hidróxido de potasio o sodio concentrados.

El sustrato orgánico puede ser cualquier compuesto que sea bioxidable a un ácido mono o policarboxílico. Tal compuesto puede ser cualquier compuesto alifático saturado o insaturado o cualquier compuesto aromático carboxílico o heterocíclico que tiene por lo menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que es oxidable a un grupo carboxilo mediante biooxidación. Un grupo funcional terminal que es un derivado de un grupo carboxilo puede estar presente en la molécula del sustrato y se puede convertir a un grupo carboxilo mediante una reacción diferente de biooxidación. Por ejemplo, una enzima de lipasa, por ejemplo, se puede agregar durante la etapa de fermentación al liberar los ácidos grasos libres de un éster de otra manera no metabolizable.

Los alcanos son un tipo de sustrato orgánico saturado que son útiles para practicar el proceso de acuerdo con la invención. Los alcanos pueden ser lineales o cíclicos, de cadena recta o ramificada, sustituidos o no sustituidos. Los alcanos particularmente preferidos son aquellos que tienen desde aproximadamente 4 a aproximadamente 25 átomos de carbono, ejemplos de los cuales incluyen pero no están limitados a butano, hexano, octano, nonato, decano, tridecano, tetradecano, octadecano y similares.

Ejemplos de sustratos orgánicos insaturados que se pueden utilizar en el proceso de acuerdo con la invención incluyen pero no están limitados a olefinas internas tales como 2-penteno, 2-hexeno, 3-hexeno, 9-octadeceno y similares; los ácidos carboxílicos insaturados tales como ácido 2-hexenóico y ésteres de éstos, ácido oleíco y ésteres de éstos incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido oleico relativamente alto, ácido erucico y ésteres de éstos que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido erucico relativamente alto, ácido ricinoleico y ésteres de éstos que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen contenido de ácido ricinoleico relativamente alto, ácido linoleico y ésteres de éstos que incluyen ésteres de triglicerilo que tienen un contenido de ácido oleico relativamente alto; alcoholes insaturados tales como 3-hexen-1-ol, 9-octadecen-1-ol y similares; aldehídos insaturados tales como 3-hexen-1-1l, 9-octadecen-1-al y similares. Además de los anteriores, el sustrato orgánico que se puede utilizar en el proceso de acuerdo con la invención incluye compuestos alicíclicos que tienen por lo menos un doble enlace carbono-carbono interno y por lo menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal que es oxidable a un grupo carboxilo mediante biooxidación. Ejemplos de tales compuestos incluyen pero no están limitados a 3,6-dimetil-1,4-ciclohexadieno; 3-metilciclohexeno; 3-metil-1,4-ciclohexadieno y similares.

Ejemplos de los compuestos aromáticos que se pueden utilizar en el proceso de acuerdo con la invención incluyen pero no están limitados a arenos tales como o-, m-, p-xileno; ácido o-, m-, p-metil benzoico; dimetil piridina, y similares. El sustrato orgánico también puede contener otros grupos funcionales que son biooxidables a grupos carboxilo tales como un aldehído o un grupo alcohol. El sustrato orgánico también puede contener otros grupos funcionales que no son biooxidables a grupos carboxilo y no interfieren con la biooxidación tales como halógenos, éteres, y similares.

Un co-sustrato se puede suministrar al cultivo durante la etapa de fermentación cuando el cultivo está activamente oxidando el sustrato a los productos. Esto es especialmente cierto si no se puede recuperar el carbono o la energía utilizables de la reacción del sustrato mismo, entonces este carbono y energía se suministra mediante el co-sustrato.

El co-sustrato es un carbohidrato fermentable tal como glucosa, fructosa, o maltosa; u otro compuesto orgánico fermentable, por ejemplo, glicerol, acetato de sodio, metanol, o alcoholes de cadena corta; o mezclas de éstos. El co-sustrato preferido es glucosa, preferiblemente un jarabe de glucosa líquido, por ejemplo, un jarabe equivalente a 95% de dextrosa, o aun jarabes inferiores equivalentes a dextrosa. Tales materiales contienen pequeñas cantidades de disacáridos, trisacáridos, y polisacáridos que se pueden hidrolizar durante la fermentación mediante la adición de una enzima amilasa tal como \alpha-amilasa, glicoamilasa y celulasa. Así la glucosa se puede suministrar in situ en una reacción simultánea con la biooxidación.

Esto es conveniente, pero no absolutamente necesario, si el carbono y la fuente de energía utilizados para hacer crecer la biomasa es la misma que el co-sustrato utilizado para manejar la reacción de conversión oxidativa. El beneficio práctico es que más pocas materias primas necesitan ser manejadas y las varias etapas de la fermentación se pueden integrar bien. Así una esterilización de co-sustrato simple y el sistema de suministro se pueden utilizar para suministrar tanto la fuente de carbono como de energía para hacer crecer la biomasa y el co-sustrato para manejar la reacción de oxidación.

El microorganismo se puede utilizar en el proceso de acuerdo con la invención en cualquier microorganismo capaz de biooxidar el sustrato como se definió aquí. El microorganismo puede ser cualquier microorganismo en el cual la beta oxidación sea parcial o completamente bloqueada por irrupción, inactivación o supresión de uno o más genes de acil CoA oxidasa; cualquier levadura en la cual la oxidación beta sea parcial o completamente afectada por la inactivación o supresión de uno o más de los genes acil CoA oxidasa; cualquier cepa de Candida donde la oxidación beta sea parcial o completamente afectada por la inactivación o supresión de uno o más de él o de los genes acil CoA oxidasa. Cuando el proceso de fermentación involucra la biooxidación de un sustrato a un ácido carboxílico, el microorganismo normalmente será una levadura. Tal microorganismo es capaz de oxidar el sustrato de tal forma que los ácidos mono y/o dicarboxílicos formados no son adicionalmente oxidados mediante la degradación que conduce al acortamiento de la cadena. Sin embargo, el proceso de acuerdo con la invención corresponde al uso de cualquier microorganismo.

Las cepas de levadura conocidas por excretar ácidos alfa, omega dicarboxílicos como un subproducto cuando se cultivan sobre alcanos o ácidos grasos como la fuente de carbonos se establecen en la patente U.S. 5.254.466, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia. Estas cepas son cepas parcial o completamente bloqueadas por oxidación; esto es, ellas son genéticamente modificadas de tal forma que los genes POX4A, POX4B y ambos POX5 cromosomales han sido afectados. El flujo de sustrato en esta cepa es redirigido a la senda de oxidación omega como resultado de la inactivación funcional de la senda de \beta-oxidación competente por la irrupción del gen POX. Una cepa bloqueada de oxidación completa es la cepa de C. Tropicales, la cepa H5343 (ATCC 20962), que se describe en la patente U.S. 5.254.466.

Otra cepa adecuada es aquella en la cual uno o más genes reductasa se amplifican dando como resultado un incremento en la cantidad de hidrolasa omega con limite de proporción a través de una amplificación del gen P450 y un incremento en la tasa del flujo de sustrato a través de una senda de oxidación omega. Las cepas que incrementan selectivamente la cantidad de enzimas conocidas por ser importantes para la oxidación de los ácidos grasos también son las preferidas. Tales cepas contienen copias incrementadas de genes CYP y CPR. Estos genes se han identificado como aquellos que se relacionan con la producción del complejo de hidrolasa omega que cataliza la primera etapa de la senda de oxidación. La cepa HDC1 es un ejemplo de una cepa que contiene múltiples copias del gen CYP 52A2A integrado en el genoma de la cepa H5343. Esta cepa y cepas similares se describen en la solicitud copendiente serie número 60/083,798, presentada en el 05/01/98, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia. Otras cepas que se pueden utilizar en los métodos de la invención son las cepas de C. tropicalis HDC1, HDC5, HDC10, HDC15, HDC20, HDC23, HDC23-1, HDC23-2, y HDC233-3 como se describió en la PCT/US99/20797, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia.

Las fuentes adecuadas de nitrógeno inorgánico incluyen cualquier compuesto que contenga amonio. Ejemplos de éstos incluyen, pero no están limitados a, nitratos de metal alcalino o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y acetato de amonio. Las fuentes de nitrógeno preferidas son sales de amonio o compuestos que generan amonio a través de la acción metabólica del organismo como urea. Una fuente particularmente preferida de nitrógeno inorgánico para uso en la presente invención es amonio.

El proceso de fermentación se puede modificar al utilizar una grasa o aceite de triglicérido como la fuente tanto del sustrato como del co-sustrato orgánico. Una lipasa, formulada con el caldo de fermentación, hidroliza o divide la grasa o el aceite en ácidos grasos y glicerina. El consumo de glicerina por el organismo sirve para manejar la reacción de división hasta completarla aunque suministrando la energía necesaria para convertir los ácidos grasos libres a sus correspondientes ácidos dibásicos. Las lipasas que son oleo específicas son particularmente preferidas. Las lipasas oleo específicas exhiben una alta selectividad para un triglicérido que tiene un contenido de ácido oleico alto y cataliza selectivamente la hidrólisis de los grupos éster oleato. Ejemplos de tales lipasas oleo específicas incluyen pero no están limitadas a lipasas producidas por Pseudomonas sp, Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum, y Pseudomonas (Burkholderia). Una lipasa particularmente preferida es la UNLipasa de Geotrichum candidum ATCC No. 74170 descrita en la patente U.S. 5.470.741, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como
referencia.

La etapa de fermentación se lleva a cabo preferiblemente en tres etapas, la fase de crecimiento, la fase de inducción, y la fase de conversión. Cada fase se puede operar en las mismas o diferentes condiciones de temperatura del fermentador, pH, aireación, etc. La fase de crecimiento se inicia cuando el cultivo de la célula se introduce en el fermentador y se sigue una fase rápida de crecimiento. El crecimiento puede ser exponencial o sub-exponencial dependiendo de la composición del medio empleado. Esto continúa hasta que el cultivo alcanza un crecimiento lineal medido al disminuir el consumo de oxígeno. El crecimiento lineal ocurre cuando el crecimiento se limita a la tasa de adición de un nutriente clave al medio; el crecimiento así se vuelve proporcional a la tasa en la cual se suministra el nutriente limitante. Usualmente, en el proceso de esta invención, el nutriente clave será el co-sustrato. La segunda fase es la fase de inducción. En la fase de inducción actividades metabólicas clave se inician las cuales comienzan la conversión deseada del sustrato al producto. El cultivo se puede mantener en una fase de crecimiento lineal durante un período de tiempo antes de inducir el cultivo. El agente de inducción usualmente será el sustrato mismo, pero para los compuestos que no inician su propia conversión, se puede utilizar otro agente de inducción en concierto con el sustrato. La fase de inducción se puede utilizar para la transición de la fase de crecimiento rápida a la fase de conversión. La fermentación se mueve hacia la siguiente fase, la fase de conversión, cuando el sustrato es convertido al
producto.

Durante la fase de conversión, el caldo de fermentación está en un rango de pH ácido de entre 2 y 7. El rango de pH operativo preferido va de aproximadamente 3,5 a 7,0, un rango aún más preferido es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5. El pH se puede controlar mediante la titulación automática utilizando una base fuerte, ejemplos de los cuales están, la solución de hidróxido de sodio, la solución de hidróxido de potasio, la solución de hidróxido de amonio, o el gas de amonio. Nótese que al operar la fermentación en este régimen de pH comparado con los métodos de la técnica anterior en que el amonio se puede utilizar para el control del pH en razón a que éste reaccionará para formar el ión de amonio acuoso no volátil. Los métodos de la técnica anterior para elaborar el ácido dicarboxílico cuando opera en un régimen de pH alcalino no haría efectivamente el ión de amonio acuoso originando así emisiones indeseables de vapor de amonio en el gas de escape y la acumulación de amonio tóxica en el caldo. La fermentación se puede llevar a cabo a una temperatura de desde aproximadamente 26ºC a aproximadamente
40ºC.

En la primera etapa, el medio de cultivo se inocula con un cultivo activo de microorganismos bloqueados con beta oxidación tales como la cepa de C. tropicalis bloqueada con beta oxidación donde ocurre un período de crecimiento exponencial rápido. El pH del medio de cultivo se controla por medio de la adición de base, ejemplos incluyen pero no están limitados a hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio o gas de amonio. La adición del co-sustrato para el fermentador es preferiblemente una adición de alimentación en tanda durante la fase de conversión. El final de la fase de crecimiento exponencial se marca mediante un vaciamiento de glucosa, un incremento rápido en el oxígeno disuelto, y, más sensiblemente, mediante un incremento rápido en el oxígeno de gas de escape y la disminución del CO_{2} de escape. En la ausencia de un sustrato de inducción, la biomasa continuará acumulándose a una tasa proporcional a la tasa de alimentación de glucosa (es decir, un crecimiento lineal). Es deseable iniciar la fase de conversión al final del crecimiento exponencial o en el punto cuando el nivel de biomasa deseado se ha logrado. Si las características de transferencia de oxígeno del recipiente de producción son tales que el nivel de biomasa deseado no se puede alcanzar al mantener el cultivo en crecimiento exponencial, entonces una combinación del crecimiento exponencial seguida por la fase de crecimiento limitada por glucosa lineal (fase de inducción) se puede utilizar para lograr un nivel de biomasa dado.

Para mantener el cultivo en un estado saludable durante la transición a un crecimiento lineal limitado de glucosa, puede ser deseable iniciar una alimentación de glucosa durante el crecimiento de tal forma que la glucosa estará siempre disponible para el cultivo. El nivel de glucosa en la carga del medio inicial se selecciona con base en la glucosa total deseada para hacer crecer el microorganismo menor de la cantidad que los que serían alimentados durante el crecimiento. La alimentación de glucosa se puede hincar en cualquier momento desde el inicio del crecimiento. Sin embargo en razón a que existe alguna variación en la calidad del inóculo y la fase "lag" después de inocular el recipiente de producción, se prefiere iniciar la alimentación de glucosa durante la fase de crecimiento exponencial en una concentración de biomasa predeterminada, como se juzga por las mediciones de biomasa directa, o los métodos indirectos como la densidad óptica, la tasa de evolución de dióxido de carbono, o la tasa de toma de oxígeno. La glucosa puede ser un jarabe de maíz refinado o no refinado. La glucosa se puede alimentar desde la parte de arriba del recipiente a través del espacio del vapor como una corriente continua o como una serie continua de pulsos o impulsos. La alimentación de glucosa también se puede alimentar hacia el recipiente bajo la superficie especialmente hacia una región de alto corte cerca al agitador para lograr una distribución rápida en todo el recipiente. En recipientes grandes puede haber múltiples puntos de alimentación de glucosa dentro del mismo recipiente.

La fase de conversión donde el sustrato se oxida se inicia al agregar un inductor y el sustrato que contiene el grupo metilo oxidable. En el caso de los alcanos, los ácidos grasos, los metil ésteres de ácido graso y las sales de ácido graso; estas sustancias y combinaciones de éstas inducen su propia oxidación a ácido dicarboxílicos y puede ser útil para inducir la oxidación de otras sustancias. El sustrato se puede agregar en forma de tandas o como una alimentación continua o como una serie de pulsos o impulsos continuos. El sustrato se puede agregar desde la parte superior del recipiente de un espacio de vapor o bajo la superficie especialmente hacia una región de alto corte. En recipientes grandes puede haber puntos de alimentación de sustrato múltiples. La oxidación se conduce a un pH ácido de menos de 7 y preferible cercano o por debajo del pKa del grupo carboxilo que se forma por la oxidación o está presente en el sustrato.

Se prefiere disminuir progresivamente la tasa de alimentación de glucosa al fermentador en la medida en que la conversión tiene lugar para evitar la acumulación de biomasa y ésteres de triacilglicerol. Con la conversión de ácido oleico comercial, la acumulación de vacuolas de almacenamiento intracelular es un indicador útil de la tasa de alimentación de glucosa que se necesita para el ajuste. Los ajustes se hacen al disminuir la tasa de alimentación en aproximadamente 5% a 25% y usualmente aproximadamente 10% por cada 24 horas de la fase de conversión. Otros indicadores también se podrían utilizar tales como la tasa de utilización base, la tasa de evolución de CO_{2}, o el cociente respiratorio.

Un problema a menudo encontrado en el proceso de fermentación es la formación de jabones de ácido carboxílico y el espumado como resultado del trabajo en el rango de pH alcalino tradicional. En un ambiente alcalino, los ácidos carboxílicos forman jabones que conducen a una espumación no deseada del caldo de fermentación. El resultado de la formación de jabón es una disminución en el pH del caldo que se ajusta al agregar una base tal como cáustica al caldo para mantener el pH del caldo en el valor deseado. También, la adición de glucosa al ambiente básico da como resultado la formación de carbonatos que afectan el pH del caldo de fermentación. Para compensar por los efectos sobre el pH del jabón y la formación de carbonato, se deben agregar grandes cantidades de base para mantener el pH del caldo al nivel deseado.

Se ha encontrado sorprendentemente que al llevar a cabo el proceso de fermentación en un rango de pH ácido desde 2 a 7, preferiblemente desde 3 a 7 y aún más preferiblemente desde 5 a 6,5, en lugar de un rango de pH cáustico, la espumación se reduce sustancialmente y la formación de carbonato proveniente de dióxido de carbono producido durante el metabolismo de la glucosa se reduce sustancialmente de esta manera reduciendo la cantidad de materia prima necesaria para controlar el pH del caldo de fermentación. Al llevar a cabo los procesos de fermentación a un pH ácido, estos problemas se reducen sustancialmente dando como resultado cantidades decrecientes de base utilizada durante el proceso de fermentación. Existe un consumo neto de equivalentes de catión sobre los equivalentes de anión durante la reacción de crecimiento que contribuye a la depresión del pH del medio de cultivo. Es deseable controlar el pH del medio dentro del rango de 2-7, y preferiblemente desde aproximadamente 3-6,5 durante el crecimiento por la adición de la base sobre el control de pH. Entre las bases útiles para este propósito están el hidróxido de amonio, el amonio, el hidróxido de sodio, y el hidróxido de potasio. Es deseable seleccionar una composición base que suministre uno o más de los principales nutrientes consumidos durante el crecimiento tales como hidróxido de amonio, amonio, o hidróxido de potasio. La formulación del medio de crecimiento se ajusta para tomar en cuenta la adición del reactivo de control de pH. Utilizando NH_{4}OH o un gas de amonio para el control de pH se reduce el número de materias primas necesarias para hacer crecer los microorganismos al combinar el agente de control de pH y la fuente de nitrógeno en la materia prima agregada al fermentador.

Con respecto al uso de fuentes de nitrógeno tales como amonio o hidróxido de amonio es necesario tener solamente 250 ppm o menos de fuente de nitrógeno presente en el medio para iniciar el crecimiento y el consumo de estos reactivos de control de pH. La concentración de amonio se mantendrá por lo tanto cercanamente constante durante el crecimiento del cultivo. Así la concentración de amonio deseada en el medio al momento de la inducción puede ser convenientemente preseleccionada al agregar amonio o sales de amonio a la carga media inicial. Las fuentes útiles de nitrógeno amoniacal para la carga del fermentador inicial incluyen fosfato de amonio, sulfato de amonio, nitrato de amonio, amonio, urea, e hidróxido de amonio.

Otro aspecto es una formulación de un medio de fermentación útil para propagar Candida tropicalis y da una alta productividad para convertir sustratos que tienen grupos metilo oxidables a ácidos carboxílicos. Al ajustar las tasas de alimentación de materiales en el caldo de fermentación, el crecimiento del microorganismo se puede controlar. Los nutrientes principales consumidos durante el crecimiento del microorganismo sobre glucosa son nitrógeno amoniacal, potasio, magnesio, fosfato y sulfato. El sodio y el calcio no se consumen, sin embargo, el calcio debe estar presente a una concentración de aproximadamente 5-50 ppm o más para obtener el crecimiento normal dependiendo de la formulación del medio de inóculo. Trazas de minerales y biotina también se incluyen en el medio. La biotina puede ser grado relativamente puro o suministrada como un grado más crudo tal como en levadura de biotina, extractos de levadura, o licores de maíz empapado.

Las fuentes útiles de fosfato son fosfato de amonio, fosfato de potasio mono, di y tribásico, fosfato de sodio, mono, di y tribásico, y ácido fosfórico. Las fuentes útiles de potasio son sulfato de potasio, fosfato de potasio, mono, di y tribásico, y potasa cáustica.

Una ayuda de fermentación se puede utilizar en la oxidación de alcanos y/o la oxidación de ácidos grasos. La ayuda de fermentación preferida es un éster de ácido graso, una ayuda de fermentación particularmente preferida es un éster de metilo. Un beneficio principal del uso de tal agente de control de fermentación está en el control de la espuma y controlar las características de fluido del caldo de fermentación. Si la distribución de la longitud de cadena del producto es importante en el desempeño del producto final, es deseable seleccionar una longitud de cadena del metil éster que se semeje al alcano o al ácido graso en razón a que el metil éster también se convertirá en producto. El éster se puede agregar a manera de tandas o mezclado en una alimentación. Si se mezcla la alimentación, ésta puede comprender aproximadamente 10% o menos y preferiblemente 1% o menos de la alimentación. Algunos ácidos grasos comerciales contienen naturalmente algunos metil ésteres y se pueden utilizar directamente como sustratos para la producción de ácido dicarboxílico. Por ejemplo, EMERSOL®267 (Cognis Corporation) es un ácido oleico comercial que contiene aproximadamente 1% o menos de metil ésteres y se ha encontrado que es un buen sustrato en esta invención. Un grado técnico típico de ácido oleico, EMERSOL®267, que se utiliza en el proceso tiene la composición aproximada de 0,3% C12, 2,4% C14, 0,6% C14:1, 4,7% C16, 4,6% C16:1, 0,2% C17, 0,8% C18, 69,9% C18:1, 10,5% C18:2, 0,3% C18:3.

En el caso de las oxidaciones de alcano a ácidos dicarboxílicos, se ha encontrado además útil utilizar un ácido graso o una sal de ácido graso como una ayuda de fermentación. Esto da como resultado una mejor distribución del alcano a través del caldo de fermentación. El ácido graso se puede agregar en forma de tandas o se puede formular en la alimentación de alcano. Si se formula en la alimentación, el ácido graso o la sal de ácido graso puede comprender típicamente aproximadamente 10% o menos y preferiblemente aproximadamente 5% o menos de la alimentación. Aquí también, si la distribución de la longitud de la cadena del producto es importante en el desempeño del producto final, es deseable seleccionar la distribución de longitud de cadena del ácido graso que semeje el alcano en razón a que el ácido graso también se convertirá a producto.

Se ha encontrado de manera sorprendente que combinaciones particulares de materiales grasos, por ejemplo ácidos grasos y ésteres grasos, originan suspensiones acuosas finas de ácidos dicarboxílicos de cadena larga para formar partículas altamente definidas a temperaturas por debajo de 50ºC. Otros materiales grasos también se podrían utilizar separadamente o en combinación, incluyendo alcoholes grasos, ésteres grasos, etc., y se consideran como una parte de esta invención. Las suspensiones resultantes tienen características de corte-grosor deseables que facilitan su manejo y aplicación práctica. Es deseable que las partículas así formadas en la suspensión tengan tamaños dentro de una distribución de tamaño estrecha. Este aspecto de la invención es bien adecuado para la aplicación en equipo de producción a gran escala. De hecho, el desempeño superior ocurrido en tal equipo comparado con el equipo a escala de laboratorio. Esto sugiere que los efectos de pared pueden jugar un papel en el crecimiento de partícula.

Los materiales grasos útiles incluyen ácidos grasos saturados e insaturados C10 - C20 y sus ésteres que incluyen, pero no están limitados a, ácidos grasos de girasol, metil ésteres de ácido graso de girasol, ácidos grasos de cebo, y metil ésteres de ácido graso de cebo. Ejemplos de composiciones comerciales típicas de estos materiales se muestran en la Tabla 1.

Cada composición listada adelante está comercialmente disponible de Cognis Corp., Cincinnati, OH.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

Los ácidos dicarboxílicos preparados en los caldos de fermentación existen típicamente como cristales en forma de aguja desde 1-10 \mum de longitud. La composición de los diácidos refleja la longitud de cadena del sustrato que se está oxidando. Tal caldo de fermentación puede ser altamente viscoso al punto de ser sólido. Cuando un material graso como se describió aquí se aplica a tal fermentación, es posible hacer crecer partículas de ácido dicarboxílico, in situ, sustancialmente en forma de disco, sustancialmente en forma esférica parcial (por ejemplo, en forma de copa) y/o sustancialmente en forma esférica aproximadamente 15 - 40 \mum o más de diámetro y aproximadamente 1 - 5 \mum de grosor a temperaturas por debajo de aproximadamente 50ºC. En una modalidad de la presente invención, las partículas sustancialmente esféricas se generaron tendiendo un diámetro de aproximadamente 1 cm. Así, se contempla que las partículas de ácido dicarboxílico producidas de acuerdo con la presente invención pueden variar desde aproximadamente 1 \mum a aproximadamente 1 cm o más de diámetro y/o grosor. Cuando los materiales grasos descritos aquí se aplican a fermentaciones que generan o que contienen ácidos dicarboxílicos, el caldo resultante tiene una viscosidad aparente baja que le permite al manejo del caldo de fermentación continuar hasta condiciones óptimas. Por conveniencia, el término "en forma de disco" se puede utilizar aquí para referirse también a partículas sustancialmente parcialmente esféricas. "Sustancialmente" se utiliza aquí para significar tanto aproximadamente como precisamente.

En el caso de los ácidos dicarboxílicos que generan la reacción de fermentación, un beneficio deseable de utilizar tales materiales grasos es que estos aditivos reactivos también se pueden potencialmente convertir a ácidos dicarboxílicos. Esto simplifica la recuperación de los ácidos dicarboxílicos del caldo de tal forma que no es necesario procesamiento adicional para remover el aditivo.

Ciertas preparaciones de ácido graso disponibles comercialmente se pueden utilizar directamente para originar la formación de partículas en forma de disco, porque, en su proceso de elaboración, los derivados grasos se dejan detrás porque causan el crecimiento de partícula deseado y la distribución de tamaño en la fermentación. Ejemplos de estos incluyen ácido oleico Emersol ® 267 (comercialmente disponible de Cognis Corp., Cincinnati, Ohio), que contiene bajos niveles de metil éster, y ácidos grasos parcialmente hidrolizados, que contienen bajos niveles de mono, di, y triglicéridos. En el caso de una fermentación de ácido dicarboxílico, uno puede por lo tanto hacer una selección juiciosa del sustrato de sustratos comercialmente disponibles que se han informado de los métodos de esta invención.

Se contempla que los materiales grasos se pueden utilizar en varios medios de fermentación descritos aquí junto con una variedad de antiespumas tales como aquellas de silicona y tipos de propilenglicol sin el efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la partícula.

El material graso se puede agregar a la suspensión acuosa de los ácidos dicarboxílicos en forma de tanda o de alimentación en tanda. En general los niveles de los materiales grasos utilizados pueden variar desde aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 5% o más, pero preferiblemente aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 1%, con base en la masa del ácido dicarboxílico. El crecimiento de la partícula ocurre en tanto el nivel mínimo de aditivos esté presente. Se cree que los aditivos de ácido graso ayudan al crecimiento de la partícula del ácido dicarboxílico mientras que los ésteres de ácido graso y otros derivados grasos ayudan a suministrar una distribución estrecha de tamaños de partícula.

En el caso de la fermentación generar ácidos dicarboxílicos de hidrocarburos es deseable para agregar una combinación de derivados grasos que incluyen ácidos grasos y metil ésteres de ácidos grasos. Es más conveniente mezclar estos materiales en la alimentación de hidrocarburo con el fin de simplificar la preparación, esterilización, y alimentación de los aditivos a la fermentación.

De manera similar, en el caso de una fermentación que genera ácidos dicarboxílicos provenientes de un ácido graso, es deseable agregar un metil éster correspondiente similar. Así el aditivo no alterará la distribución de longitud de cadena del producto de ácido dicarboxílico.

Muchas combinaciones y aplicaciones son posibles para practicar esta invención habiendo descrito estos métodos para hacer crecer partículas de disco de ácido dicarboxílico y describir los beneficios y las propiedades reológicas de la suspensión.

Se ha encontrado sorprendentemente que al mantener niveles de concentración de oxígeno disuelto por debajo de aproximadamente 25% y preferiblemente por debajo de 20%, relativo a la saturación con aire, que es una reducción en la cantidad del co-sustrato necesario durante la fase de conversión. Cuando la concentración de oxígeno disuelto está por debajo de estos niveles, la glucosa es más eficientemente utilizada para suministrar energía para oxidación. Las consecuencias de agregar demasiada glucosa incluye la acumulación adicional de biomasa y ésteres de triglicerol con producción disminuida de ácido carboxílico durante la fase de conversión.

La formación de éster de triacilglicerol, en levaduras oleaginosas, se puede controlar o minimizar en parte al ajustar la concentración de magnesio o la proporción de magnesio a fosfato en la carga media inicial. La concentración de magnesio preferida es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 gm/L y más preferiblemente aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,8 gm/L de concentración en el inóculo de fermentación. El fosfato preferido: la proporción de magnesio es 20:1 a aproximadamente 2:1, preferiblemente 15:1 a aproximadamente 3:1.

Se ha encontrado de manera sorprendente que el caldo de fermentación durante la fase de conversión acumula una actividad similar a catalasa lábil con calor que consume H2O2. Esto puede interferir con los ensayos de concentración de glucosa que miden el H2O2 producido de la glucosa oxidasa.

Una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención es la preparación de ácido 9-octadecenodióico mediante la biooxidación de ácido oleico. Aunque cualquier grado de ácido oleico se puede utilizar como el sustrato, un grado técnico típico de ácido oleico consiste de los siguientes ácidos carboxílicos: 0,42% C_{12}; 2,7% C_{14}; 0,86% C_{14:1}; 6,3% C_{16}; 4,6% C_{16:1}; 0,93% C_{17}; 2,8 C_{18}; 71,8% C_{18:1}, 8,3% C_{18:2}; 0,58% C_{18:3}. El ácido oleico también puede ser un grado de ácido oleico alto obtenido de un aceite graso de especies de Helianthus annuus (aceite de semilla de girasol) descrito, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4.627.192, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia. Otras variedades de ácido oleico alta de semillas de aceite también se pueden utilizar en este proceso. Tales aceites son muy ricos en ácido oleico y contienen por lo menos 70-80% en peso de ácido oleico.

La presente invención se entenderá mejora de los ejemplos que siguen, todos los cuales se pretenden para propósitos sólo ilustrativos, y no pretenden limitar de manera indebida el alcance de la invención de ninguna manera. En todos los ejemplos, las concentraciones de componente se muestran en sus formas anhídras. Los hidratos comercialmente disponibles de los compuestos listados se pueden utilizar si la concentración se ajusta apropiadamente para incluir líquidos de hidratación.

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Ejemplo 1

El medio de fermentación de acuerdo con la presente invención se preparó, cuyos componentes se listan en las Tablas 2 y 3, adelante.

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TABLA 2 Componentes de Concentración Media de Producción Sintética (g/L)

2

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3

Los componentes medios de la Tabla 2 se esterilizaron con calor de manera adecuada para evitar cualquier reacción de precipitación, combinados luego en un recipiente fermentador estéril hasta enfriamiento. El medio inoculado completo se encontró que es completamente claro con un color paja claro y sin olores fuertes. La adición de antiespuma produjo una turbidez ligera. Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 creció bajo condiciones estériles sobre el medio listado en la Tabla 2 y un fermentador agitado, aireado con un volumen líquido inicial de 12 L. El medio de cultivo estéril se inoculó con un 5% de inóculo de Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 y creció a 35ºC, pH 5,8 durante aproximadamente 10 horas con agitación y tasas de aireación suficientes para mantener el oxígeno disuelto por encima del 20%. Cuando el cultivo detuvo su crecimiento exponencialmente y el oxígeno disuelto comenzó a elevarse, la fase de conversión comenzó al iniciar una corriente de alimentación continua de Exxon Developmental Fluid 137 (un hidrocarburo que contiene aproximadamente 94,4% de Tridecano, siendo el balance principalmente dodecano) mezclado con ayudas de fermentación 1,25% Emersol ®267 (un grado técnico de ácido oleico) y 1,25% de Emery® 2203 (un grado técnico de metil cebacato) a una tasa de 0,7 g/L/hr. Simultáneamente, la temperatura en el fermentador se redujo desde 35ºC a 30ºC, la tasa de aireación se redujo de 0,4 vvm, y 0,4 bar de retro-presión se aplicó al recipiente. El pH se mantuvo entre 5,8 - 5,9 durante el crecimiento y la fase de conversión con KOH 6N. Una corriente de alimentación de glucosa continua se inició al fermentador a una tasa de 1,58 g/Uhr de glucosa cuando la concentración de biomasa alcanzó aproximadamente 10 g/L. La tasa de alimentación de glucosa durante la conversión se redujo entre 0 - 15% sobre una base diaria con base en la observación microscópica y la evaluación de la acumulación de vacuolas de almacenamiento en la célula de levadura. Se agregó 7 ml de antiespuma PPG (polipropilenglicol) al fermentador durante la conversión para controlar la espumación media. Después de 50 horas de la fase de conversión, el caldo completo en el fermentador contenía 41,5 g/Kg de 1,13-ácido tridecanodióico.

Ejemplo 2

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TABLA 3 Concentración Media de Producción Sintética (g/L)

4

5

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Los componentes medios de la Tabla 3 se esterilizaron de una manera adecuada para evitar cualquier reacción de precipitación y se combinaron en un recipiente fermentador estéril. El medio no inoculado completo se encontró que era completamente claro con un color paja ligero y sin olores fuertes. Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 creció bajo condiciones estériles sobre el medio listado en la Tabla 3 en un fermentador aireado, agitado con un volumen líquido inicial de 12 L. El medio de cultivo estéril se inoculó con un 3% de inóculo de Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 y creció a 35ºC durante aproximadamente 12 horas con agitación y tasas de aireación suficientes para mantener el oxígeno disuelto por encima del 20%. El pH se ajustó y se mantuvo entre 5,8 - 5,9 durante la fase de crecimiento con adición de NH_{4}OH 6N que también fue la fuente de nitrógeno inorgánico en el medio. Cuando el cultivo detuvo su crecimiento exponencialmente y el oxígeno disuelto comenzó a elevarse, la fase de conversión se comenzó al agregar una carga de inducción e iniciar una corriente de alimentación continua de Ácidos Grasos de Girasol Oleico Alto (que contienen 84,4% de ácido oleico, 5,2% de ácido linoleico, 4,7% de ácido esteárico, 3,9% de ácido palmítico, con el balance que comprende cantidades pequeñas de ácido eicosanóico (20:0), ácido eicosaenóico (20:1), ácido pentadecanóico, ácido laurico, y ácido mirístico) a una tasa de 2,0 g/Uhr. Simultáneamente, la temperatura en el fermentador se redujo desde 35ºC a 30ºC, la tasa de aireación se redujo a 0,4 vvm, y el reactivo de control de pH se cambió de NH_{4}OH a NaOH. El pH se mantuvo entre 5,8 - 5,9 durante la fase de conversión con NaOH 6N. Una corriente de alimentación de glucosa continua se inició al fermentador a una tasa de 1,22 g/Uhr de glucosa cuando la concentración de biomasa alcanzó aproximadamente 10 g/L. La tasa de alimentación de glucosa durante la conversión se redujo entre 0 - 45% sobre una base diaria con base en la observación microscópica y la evaluación de acumular vacuolas en almacenamiento dentro de la célula de levadura. No se utilizó antiespuma adicional durante la fase de conversión. Después de 50 horas de la fase de conversión, el caldo completo en el fermentador contenía 71 g/Kg total de ácidos dicarboxílicos.

Ejemplo 3

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TABLA 4 Formulación Media Sintética

6

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7

Los componentes medios de la Tabla 4 se esterilizaron de una manera adecuada para evitar cualquier reacción de precipitación luego se combinaron en un recipiente fermentador estéril. El medio se encontró que era completamente claro con un color ligero y poco olor. La adición de la antiespuma produjo una turbidez ligera. El pH del medio se ajustó inicialmente a pH 5,8 utilizando solución de hidróxido de amonio 6N. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) creció en este medio en un fermentador agitado y aireado utilizando un 4% de inóculo preparado en un medio que tiene composición similar. El crecimiento exponencial inició luego de una breve fase lag. Una alimentación de glucosa se inició a una tasa de 1,25 g/Uhr con base en el volumen medio inicial cuando el cultivo contenía aproximadamente 5 g/L de peso seco de biomasa juzgado por las mediciones de densidad óptica. El crecimiento exponencial continuó durante aproximadamente nueve horas cuando la glucosa comenzó a crecer limitando con solamente una ligera disminución en la tasa de crecimiento exponencial durante el período.

Al final de este período de crecimiento rápido, el reactivo de control de pH se cambió a una solución de hidróxido de potasio 6N y la alimentación de glucosa se mantuvo constante durante las siguientes 110 horas. Durante este período, el amonio, cuya concentración permaneció constante a través del crecimiento exponencial, se vació del medio y la concentración del fosfato cayó a niveles bajos. La biomasa continua acumulándose en el medio a una tasa lineal constante a pesar del consumo de estos nutrientes clave. Los conteos de célula viable también se incrementaron linealmente hasta que el amonio se vació del medio, después de lo cual permaneció constante. Finalmente, la fermentación produjo 71,5 g/L de peso seco de biomasa.

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Ejemplo Comparativo 1

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100

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101

Los componentes del medio del Ejemplo Comparativo 1 se esterilizaron de una manera adecuada para evitar cualquier reacción de precipitación y se combinaron en un recipiente fermentador estéril. El medio inoculado completo se encontró que era muy oscuro con características de olor fuerte de licores de maíz empapado. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) creció bajo condiciones estériles en el medio listado en la Tabla 4 en un fermentador agitado, aireado con un volumen de líquido inicial de 10 L. El medio de cultivo estéril se inoculó con un 6% de inóculo de Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) y creció a 35ºC durante aproximadamente 9,5 horas con tasas de agitación y aireación suficientes para mantener el oxígeno disuelto por encima del 20%. Se agregaron 5 ml de antiespuma SAG 471 al fermentador durante el crecimiento para controlar la espumación en el cultivo. El pH se mantuvo entre 5,8 - 5,9 durante la fase de crecimiento con la adición de NH_{4}OH 6N. Cuando el cultivo detuvo su crecimiento exponencialmente y el oxígeno disuelto comenzó a crecer, la fase de conversión comenzó al iniciar una corriente de alimentación continua de Emersol®267 (un grado comercial de ácido Oleico, que contiene 71,8% de ácido oleico, 8,3% de ácido linoleico, 6,3% ácido palmítico, 4,6% de ácido palmitoléico, 2,8% de ácido esteárico, 2,7% de ácido mirístico, 0,93% C17:0 de ácido, 0,86% de ácido miristoléico, 0,58% de ácido linolénico y 0,42% de ácido laurico) a una tasa de 2,0 g/Uhr. Simultáneamente, la temperatura en el fermentador se redujo desde 35ºC a 30ºC, la tasa de aireación se redujo de 1,2 vvm, y el reactivo de control de pH se cambió de NH_{4}OH a KOH. El pH se mantuvo en o por encima de 5,8 durante la fase de conversión con KOH 6N. Una corriente de alimentación de glucosa continua se inició en el fermentador a una tasa de 1,8 g/Uhr de glucosa al final del crecimiento exponencial precediendo inmediatamente el inicio de la fase de conversión. Esta misma tasa de alimentación de glucosa se mantuvo en el fermentador a través de la fase de conversión. Se agregaron 17 ml de antiespuma SAG 471 al fermentador durante las primeras 3 horas de la fase de conversión para controlar espumación muy pesada. Después de 50 horas de la fase de conversión, el caldo completo en el fermentador contenía 64 g/Kg de ácidos dicarboxílicos totales.

Ejemplo 4 Modificación de la Suspensión Acuosa de Ácido dodecanóico

Una suspensión acuosa finamente dividida de 25 g/l de ácido dicarboxílico de cadena larga se preparó al primero, disolver 12,5 gramos de ácido dodecanodióico, 99%, un producto Dupont (Aldrich Chemical Company) (DDDA), en agua utilizando exceso de KOH para formar un dicarboxilato soluble en agua. La solución se tituló entonces rápidamente a pH 6 utilizando H_{2}SO4 para precipitar el diácido.

Veinte mililitros de esta suspensión se distribuyeron a cada uno de los ocho frascos con tapa rosca inferior plana equipados con una barra de agitación. Así cada frasco contenía 0,5 gramos de ácido dodecanodióico finamente dividido suspendido en agua. Estos se colocaron en un baño de agua a 30ºC sobre un agitador magnético y a la suspensión se le permitió equilibrarse con agitación durante toda la noche.

El efecto de varios aditivos en el comportamiento de la suspensión se probó al agregar en tanda las sustancias de prueba en varias concentraciones en los frascos equilibrados. Las composiciones de las sustancias de prueba comerciales se muestran en la Tabla 1.

Las formulaciones netas en cada uno de los frascos se muestran en la Tabla 5.

8

La aparición y el comportamiento de las suspensiones se observó 4 horas. 24 horas, o más después de agregar los aditivos de prueba y comparar con el control (Frasco 7). El control apareció como una suspensión con algún asocio de partículas individuales visto bajo el microscopio de contraste de fase.

Ambos aditivos de metil éster a ambas concentraciones dieron mejor asociación del DDDA en partículas discretas de tamaño similar (Frascos 3-6). Esto fue evidente cuando los frascos se removieron de agitación y se les permitió asentarse. Las suspensiones con aditivos de metil éster se sentó mucho más rápidamente que el control. La fase acuosa restante fue clara comparada con el control, el cual permaneció turbio con las partículas DDDA más pequeñas permaneciendo en suspensión.

Los resultados más sorprendentes se obtuvieron en suspensiones con los aditivos de ácido oleico donde en 4 horas, las partículas iniciaron a asociarse en masas grandes. A las veinte horas, el Frasco 1 tenía masas densas grandes de DDDA cerca al fondo y algunas masas más pequeñas en la parte de arriba del frasco. A las veinte horas, el Frasco 2 contenía una esfera única de DDDA aproximadamente 1 cm de diámetro y la fase acuosa era clara.

Como los frascos 1 y 2 continuaron incubándose más allá de 20 horas, las piezas de masas mayores se habían despedazado. Estas piezas se unieron luego a la barra de agitación misma. Finalmente todos los DDDA crecieron sobre la barra de agitación de tal forma que el frasco contenía un pedazo de DDDA, en agua clara.

Este ejemplo demuestra como la adición de ácidos grasos y derivados de ácido graso se pueden utilizar para hacer las suspensiones acuosas de ácidos dicarboxílicos más adecuadas para las separaciones mediante procesos que utilizan filtración, sedimentación, o clasificación de tamaño.

Ejemplo 5 Viscosidad de Suspensiones de Ácido Dicarboxílico Acuoso: Efecto de la Morfología de Partícula

Una suspensión acuosa de aproximadamente veinte por ciento (117,0 g/kg) de ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados principalmente C16 - C18 se preparó en un caldo de fermentación de aceite de girasol de ácido oleico alto utilizando un microorganismo a 30ºC. Durante la fermentación, se agregó metil oleato en tanda de alimentación al caldo de fermentación a una tasa para suministrar aproximadamente una proporción de 1% de metil oleato a los ácidos dicarboxílicos. Se recolectó una muestra del caldo para observación microscópica de contraste de fase y las mediciones de viscosidad como se muestran en la Tabla 6.

Para comparación, la muestra se calentó entonces a 70ºC y se enfrió rápidamente a temperatura ambiente para afectar las estructuras de disco que se habían formado en el caldo original. Éste se sometió entonces a análisis similar y también se muestra en la Tabla 6.

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Una serie de experimentos similares se condujeron a niveles de concentración diferentes de ácido dicarboxílico en suspensión el cual confirmó los resultados anteriores en razón a que se comportó de manera sustancialmente similar. Las concentraciones fueron como sigue: 27,6 g/kg, 57,3 g/kg, 83,2 g/kg, 95,8 g/kg, 100,9 g/kg, 117,0 g/kg, y 117,0 g/kg para una muestra eliminada con calor.

Estos resultados demuestran el efecto de golpe que los derivados de ácido graso tienen sobre la morfología de ácido dicarboxílico y la viscosidad en el caldo de fermentación.

Ejemplo 6 Efectos de Varios Derivados de Ácido Graso y Concentraciones sobre la Morfología del Precipitado Diácido

Varios niveles y tipos de derivados de ácido graso se probaron en fermentaciones similares como en el Ejemplo 5 y las muestras se examinaron microscópicamente para determinar el efecto sobre el crecimiento de partícula de ácido dicarboxílico. La Tabla 7 muestra varias combinaciones de sustratos utilizadas para la producción de ácido dicarboxílico, combinaciones de derivados de ácido graso aditivo, y que resultan en la aparición bajo un microscopio de contraste de fase de ácido dicarboxílicos en suspensión.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 7 Viscosidad de Suspensiones de Ácido Dicarboxílico Acusoso: Características Grosor de Corte

Las características de Grosor de Corte de 70,3 g/kg (#7%) suspensión acuosa de ácido dicarboxílico saturado C11- C15 se preparó en un caldo de fermentación utilizando 1,25% de cada metil oleato y ácido oleico. El examen microscópico de contraste de fase del caldo mostró que la suspensión diácido contiene partículas de ácido dicarboxílico en forma de disco de 15 \mum de diámetro. La Figura 1 muestra unas características de grosor de corte de esta suspensión acuosa. Una serie de experimentos similares se condujeron a diferentes niveles de concentración de ácido dicarboxílico en suspensión lo que confirmó los resultados anteriores en razón a que se comportaron en forma sustancialmente similar. Tales concentraciones fuero 17,8 g/kg, 26,4 g/kg y 59,9 g/kg.

Claims (23)

1. Una suspensión acuosa que comprende agua, por lo menos un ácido dicarboxílico y un material graso de partículas de ácido dicarboxílico en forma sustancialmente de disco, en forma sustancialmente parcialmente esférica o en forma sustancialmente esférica, en donde el diámetro de las partículas de ácido dicarboxílico es mayor de 15 \mum y en donde el material graso está presente en una cantidad que varía desde10 partes por millón a 5% con base en la masa del ácido dicarboxílico.

2. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el diámetro de las partículas de ácido dicarboxílico varía desde 15 \mum a 1 cm.

3. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el grosor de las partículas de ácido dicarboxílico en forma sustancialmente de disco o sustancialmente parcialmente esférica varía de 1 \mum a 5 \mum.

4. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde la temperatura de la suspensión se mantiene por debajo de 50ºC.

5. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el material graso es un ácido graso.

6. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el material graso es un éster de ácido graso.

7. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 6 en donde el éster de ácido graso es un metil éster.

8. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el material graso está presente en una cantidad que varía desde 50 partes por millón a 1% con base en la masa de ácido dicarboxílico.

9. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el material graso comprende una combinación de ácido graso y éster de ácido graso.

10. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 9 en donde el éster de ácido graso es un metil éster.

11. Una suspensión acuosa que contiene por lo menos un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 1 en donde la suspensión acuosa es un medio de fermentación que comprende

(a)

una fuente de carbono metabolizable y energía;

(b)

una fuente de nitrógeno inorgánico;

(c)

una fuente de fosfato;

(d)

por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de metal alcalino, un metal alcalino terreo, metales de transición y mezclas de éstos; y

(e)

una fuente de biotina, sustancialmente libre de material en partícula y bacterias.

12. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene ácido dicarboxílico que comprende agregar una forma de partícula de ácido dicarboxílico efectiva que forma la cantidad de material graso a la suspensión para generar la formación de partículas de ácido dicarboxílico conformadas, en donde la forma se selecciona del grupo que consiste de forma sustancialmente de disco, forma sustancialmente parcialmente esférica y forma sustancialmente esférica y en donde las partículas que tienen un diámetro mayor de 15 \mum y en donde el material graso está presente en una cantidad que varía de 10 partes por millón a 5% con base en la masa del ácido dicarboxílico.

13. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde el diámetro de las partículas de ácido dicarboxílico varía de 15 \mum a 1 cm.

14. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde el grosor de las partículas de ácido dicarboxílico en forma sustancialmente de disco o en forma sustancialmente parcialmente esférica varía desde 1 \mum a 5 \mum.

15. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 que comprende además mantener la temperatura de la suspensión por debajo de 50ºC.

16. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde el material graso es un ácido graso.

17. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde el material graso es un éster de ácido graso.

18. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 17 en donde el éster de ácido graso es un metil éster.

19. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde la cantidad varía desde 50 partes por millón a 1% con base en la masa del ácido dicarboxílico.

20. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde el material graso es una combinación de ácido graso y éster de ácido graso.

21. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 20 en donde el éster de ácido graso es un metil éster.

22. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 12 en donde la suspensión acuosa comprende un medio de fermentación.

23. Un método para modificar las propiedades reológicas de una suspensión acuosa que contiene un ácido dicarboxílico de acuerdo a la reivindicación 22 en donde el medio de fermentación incluye

(a)

una fuente de carbón metabolizable y energía;

(b)

una fuente de nitrógeno inorgánico;

(c)

una fuente de fosfato;

(d)

por lo menos un metal seleccionado del grupo que consiste de un metal alcalino, un metal alcalino térreo, metales de transición, y mezclas de éstos; y

(e)

una fuente de biotina, sustancialmente libre de material en partícula y bacterias.