ES2294788T3 - Metodo para la produccion de trombina. - Google Patents
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Abstract
UN METODO PARA LA PRODUCCION DE TROMBINA A PARTIR DE UN MATERIAL CONTENIENDO PROTROMBINA SE CARACTERIZA EN QUE EL MATERIAL CONTENIENDO PROTROMBINA ES UNA FRACCION DE CONCENTRADO DE COMPLEJO DE PROTROMBINA ACTIVADO (ACTPCC), QUE SE PONE EN CONTACTO CON CATIONES DIVALENTES PARA CONVERTIR LA PROTROMBINA EN TROMBINA.
Description
Método para la producción de trombina.
Esta invención se refiere a la preparación de la
trombina por la activación de la protrombina. La trombina preparada
de acuerdo con esta invención puede ser usada en un kit de adhesión
de la fibrina, por derecho propio como agente tópico para su uso
terapéutico en humanos, o como un reactivo de diagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
La trombina es una proteasa de la serina que
representa la forma activa del factor de coagulación, la
protrombina. Su papel más estudiado es la habilidad que tiene para
convertir el fibrinógeno soluble en un coágulo de fibrina
insoluble, deteniendo así el flujo de la sangre de un vaso sanguíneo
herido. La trombina también divide y activa el factor XIII al
factor XIIIa que sirve para estabilizar aún más el coágulo de
fibrina formada (Furie 1991).
La conversión de la protrombina en la trombina
puede ser efectuada de muchas formas diferentes. De acuerdo con la
descripción clásica de la coagulación, la protrombina se convierte
en trombina por coagulación del factor Xa en presencia de
cofactores factor Va, fosfolípidos y cloruro de calcio (Esmon,
1974). Varios venenos de serpiente también dividen la protrombina
para formar trombina, siendo ejemplos el veneno de las serpientes
Taipan Oxyuranus scutellus (Owen y Jackson, 1973), la
serpiente Tigre Notechis scutatus (Jobin y Esnouf, 1966) y
el de la víbora de escama serrada Echis carinatus (Franza,
1975). Sin embargo, ninguno de éstos ha sido usado comercialmente
en la producción de trombina para aplicaciones clínicas.
El factor Xa, requerido para la activación
clásica de la protrombina, puede ser generado de muchas formas. La
Ruta Vía Intrínseca de Coagulación sugiere que el factor X se
convierte en factor Xa cuando se incuba con el factor IXa en
presencia de los cofactores del factor VIIIa, fosfolípido y cloruro
de calcio. La Vía Extrínseca de Coagulación se inicia por la
exposición del factor del tejido (que contiene la tromboplastina) al
factor VII en presencia del cloruro de calcio. Esto sirve para
activar el factor VII a factor VIIa que a su vez convierte el
factor X en factor Xa. Ambas formas de factor Xa activan luego la
protrombina como se ha descrito anteriormente (Furie, 1991). No
existen informes de preparaciones comerciales de la trombina que
exploten las características de la Ruta Intrínseca para la
generación del factor Xa, sin embargo existen un número de informes
que conciernen al aprovechamiento de la Ruta Extrínseca para
generar suficiente factor Xa como para activar posteriormente en
consecuencia la protrombina por la adición de tromboplastina al
material de inicio que contiene la protrombina (ver por ejemplo las
publicaciones de la Patente Japonesa Nos 63290829 y 2019400 bajo el
nombre de Corporación Cruz Verde y la publicación de la Patente
Europea No. 443724 bajo el nombre de Baxter Internacional Inc.). El
factor Xa también puede ser formado por incubación del factor X con
el veneno Viper de Russell (RW) Russell's Viper venom en presencia
de cloruro de calcio (Kisiel, 1976). Esta aproximación ha sido
utilizada comercialmente (Bio - Products Laboratories) para la
preparación de trombina como reactivo de diagnóstico. Sin embargo,
la necesidad de demostrar la ausencia de RW soluble en el producto
final puede suponer dificultades en su registro como agente
terapéutico.
Una preparación de la trombina en bruto ha sido
obtenida por el presente aplicante usando fracciones de descarte
del trombogénico a partir del proceso de fabricación del Concentrado
del Complejo de Protrombina (PCC), en el cual la protrombina se ha
convertido en trombina por incubación del material inicial con
tromboplastina derivada de placenta humana en presencia de cloruro
de calcio. Un límite de este método ha sido controlar el control de
calidad de la tromboplastina placental. Como un producto de
diagnóstico, esto no ha supuesto un problema tal, sin embargo; para
su uso clínico, los registros clínicos requieren estrictas
salvaguardas que no han sido prácticas de
introducir.
introducir.
Las preparaciones comerciales de trombina son de
un valor particular como agentes terapéuticos así como en
aplicaciones de diagnóstico. En particular, la trombina puede ser
usada para promover la coagulación como un agente tópico (ya sea en
forma de líquido o en polvo) o incorporada en apósitos de heridas.
Adicionalmente la trombina puede ser usada como componente del kit
de adhesión de la fibrina en el cual, en uso, la trombina y el
fibrinógeno/factor XIII se combinan para aplicación en incisiones
quirúrgicas y otras heridas recientes para reemplazar el uso de
suturas particularmente durante la cirugía de tejidos delicados.
En el trabajo que conduce a la presente
invención, los presentes inventores han desarrollado un método de
activación de la protrombina a la trombina que no requiere el uso de
la tromboplastina, ya sea en humanos o en otras especies.
Adicionalmente, el método de la presente invención se caracteriza
por el uso de una fracción del Concentrado del Complejo de
Protrombina (PCC) preparado por el método de Middleton et al,
publicado en 1973 que normalmente ha sido descartado. Como
resultado, la presente invención proporciona un producto de la
trombina que puede ser producido a nivel económico en escala
comercial.
\newpage
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para la preparación de la trombina a partir
de un material que contiene protrombina, que se caracteriza porque
el material que contiene la protrombina es una fracción del
Concentrado del Complejo de la Protrombina Activada (ActPCC)
obtenida como el material ascendente o del pre-pico
ascendente sobre la elución del Concentrado del Complejo de
Protrombina (PCC) de una columna y dicha fracción ActPCC se pone en
contacto con cationes divalentes con el fin de convertir la
protrombina en dicha fracción a trombina. Como se ha mencionado
previamente, se ha encontrado que cuando la trombina se prepara a
partir de la fracción del ActPCC de acuerdo con esta invención, no
se requiere la presencia de tromboplas-
tina.
tina.
La "fracción de ActPCC" que se usa como
material inicial que contiene la protrombina de acuerdo con la
invención comprende fracciones trombogénicas en el material
ascendente o de pre-pico producido durante la
preparación del Concentrado del Complejo de Protrombina (PCC), por
elución de las proteínas ligadas del sobrenadante de la fracción I
de Cohn a partir de la resina de la celulosa DEAE. Detalles
adicionales de la fracción ActPCC y de su producción se dan en la
descripción detallada y en los ejemplos que se presentan más
adelante.
Preferiblemente, los cationes divalentes
utilizados en el método de esta invención son los iones Ca2^{+} y
convenientemente el CaCl_{2} se utiliza en la activación de la
fracción del ActPCC.
En otro aspecto preferido, se ha encontrado que
la concentración óptima de los iones de Ca2^{+} para la
producción de trombina de acuerdo con esta invención se sitúa en el
rango de 25 a 50 mM, más preferiblemente de 35 a 50 mM y lo más
preferiblemente a una concentración de 40 mM aproximadamente.
Adicionalmente, se ha encontrado que aunque la producción de la
trombina puede ser efectuada a temperaturas que se sitúan en el
rango de 4ºC a 37ºC, la temperatura óptima sí varía con la
concentración de Ca2^{+}. En particular, la óptima y por ello la
temperatura preferida se sitúa en el rango de 22ºC a 25ºC.
En una modalidad particularmente preferida de
esta invención, la fracción de ActPCC se trata con 40 \pm 5 mM de
CaCl_{2} a 22-25ºC por un período de
4-5 horas.
Desde luego, después del tratamiento de acuerdo
con esta invención para convertir la protrombina en trombina, la
trombina se recupera y se purifica por métodos que son bien
conocidos en el oficio con el fin de producir un concentrado
comercial que puede, por ejemplo, ser > 90% de trombina pura.
Preferiblemente, las etapas de procesamiento
adicionales incluyen una etapa de inactivación del virus, tal como
un tratamiento con un solvente/detergente (por ejemplo incubando el
producto con 0.3% TNBP/_1% Tween 80 durante 8-12
horas a 24ºC - 26ºC), con el fin de producir un concentrado de
trombina inactivo, seguro ante virus. El producto inactivado de
virus puede ser luego tratado adicionalmente para la recuperación
de la trombina por cromatografía, por ejemplo con Heparina- agarosa
(tal como Heparina - Sefarosa) a un pH en el rango de
6-8 (preferiblemente pH 7.5), con la elución de la
trombina por NaCl, preferiblemente a una concentración de NaCl
superior a
350 mM.
350 mM.
En toda esta especificación, a menos que el
contexto exija lo contrario, la palabra "comprender" o sus
variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se
entenderá para implicar la inclusión de un número entero o grupo de
números enteros puestos de manifiesto pero no la exclusión de ningún
otro número entero o grupo de números
enteros.
enteros.
Un resumen de un método completo de producción
de trombina de acuerdo con los aspectos preferidos de la presente
invención se muestra en la Tabla 1.
En términos generales, en este método preferido
un Concentrado del Complejo de Protrombina (PCC) se prepara de
acuerdo con el método como ha sido descrito originalmente por
Middleton et al, 1973. El sobrenadante de la fracción I de
Cohn diluida se mezcla en lotes con la resina de celulosa DEAE, se
centrifuga y la resina se transfiere a una columna cromatográfica.
Las proteínas no ligadas se lavan a través de la resina con
proteínas ligadas (que incluyen la protrombina) eluidas con una
solución reguladora salina mayor. Las proteínas que eluyen de la
columna se rastrean por el índice de refracción sometidas a
monitoreo con el material del pico ascendente recolectado como el
material inicial para la activación de protrombina de acuerdo con la
presente invención. Estas fracciones (ActPCC) contienen factores de
coagulación activados y son normalmente descartados cuando se
prepara un Concentrado del Complejo de Protrombina; sin embargo,
como se ha descrito anteriormente, se ha encontrado que esta
fracción es una fuente ideal de protrombina para la generación de
trombina. El pico descendente se recolecta y se usa para fabricar
un Concentrado del Complejo de Protrombina (PCC). La elución de las
fracciones de ActPCC y PCC se muestra en la Figura 1.
Preferiblemente, la fracción de ActPCC se incuba luego con un nivel
óptimo de cloruro de calcio a un rango de temperatura óptima entre
22 - 25ºC. El método de esta invención se ha basado en el ensayo de
trombogenicidad in vitro como se describió originalmente por
Sas et al, 1975 y Farrugia et al, 1989, que se utiliza
para detectar la trombogenicidad (grado de activación del sistema
de coagulación), agregando 37 mM de cloruro de calcio a 37ºC y
midiendo el grado de generación de trombina.
Las características adicionales de la presente
invención están descritas más ampliamente en los siguientes
ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que esta detallada
descripción se incluye únicamente para fines de ejemplificar la
presente invención y no debe entenderse de ninguna forma como una
restricción sobre la amplia descripción de la invención como se ha
señalado arriba.
Ejemplo
1
Este ejemplo describe un método específico de la
activación de la protrombina para generar trombina de acuerdo con
esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante de la Fracción I a partir del
proceso de fraccionamiento Cohn se diluye para disminuir la fuerza
iónica de la mezcla. Esto se mezcla luego con la resina de celulosa
DEAE para adsorber el factor IX. El procedimiento es el
siguiente:
(i) Al sobrenadante de la Fracción I, la
suspensión de la resina esterilizada se agrega en una cantidad
(medida en términos de resina DEAE húmeda) de 20 a 40 gramos por
litro del sobrenadante de la Fracción I.
(ii) Se agrega luego agua suficiente para
ajustar la temperatura del sobrenadante de la Fracción I/mezcla de
resina a 2 \pm 2ºC hasta diluir la mezcla a un volumen final de
entre 1.3 y 1.4 veces el volumen original del sobrenadante de la
Fracción I.
(iii) La mezcla de la resina se agita por no más
de dos horas a 2 \pm 2ºC.
(iv) la resina cargada se separa por
centrifugación a 2 \pm 2ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se remueven las proteínas no ligadas de la
resina DEAE lavándolas con una solución reguladora W (ver tabla 2).
Menos de 1.2 litros de solución reguladora por kilogramo de resina
se utilizan para la suspensión y el lavado. Esta y las etapas
subsiguientes se llevan a cabo a temperatura ambiente sin exceder
los 30ºC.
La protrombina que contiene la fracción (ActPCC)
se eluye de la resina por aplicación de la solución reguladora E
(ver tabla 2) al lecho de la resina.
Las proteínas de elución se monitorean usando un
medidor de índice de refracción. El pico ascendente (ActPCC) se
recolecta y se usa como una fuente de protrombina ya que contiene
factores activados de coagulación inapropiados para la fabricación
del Concentrado del Complejo de Protrombina pero ideales como fuente
de generación de trombina. El pico y fracciones descendentes (PCC)
también se combinan y se usan para la producción del Concentrado
del Complejo de Protrombina.
Las fracciones eluidas del
pre-pico (ActPCC) pueden ser o congeladas y/o
clarificadas como se describe abajo.
El eluato del pre-pico se
congela rápidamente hasta por debajo de -30ºC y se almacena a esa
temperatura por un tiempo no mayor a 6 meses hasta que se necesite
para su procesamiento adicional. Inmediatamente antes del uso se
deja calentar el eluato hasta temperatura ambiente (por debajo de
30ºC). El propósito de esta etapa opcional es permitir que el
proceso de fabricación se interrumpa y proporcionar la opción de
bulking dos o más lotes de eluato para la preparación de la
trombina.
El volumen requerido de ActPCC tiene cloruro de
calcio que se agrega a una concentración final de 40 \pm 5 mM
mientras se mezcla de forma óptima a 22ºC - 25ºC hasta por un tiempo
de 5 horas. Al final de este periodo, la solución de trombina cruda
se clarifica por filtración/centrifugación, virus inactivados y
además procesados en un concentrado de trombina como se señala en
la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El ejemplo describe la temperatura óptima de la
generación de trombina midiendo la relación y grado de la formación
de trombina a través del tiempo a tres diferentes temperaturas: 4ºC,
22-25ºC y 37ºC.
1. Solución reguladora:
- 3.3 g/l Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, pH 6.6
- 3.2 g/l NaH_{2}PO_{4}.12H_{2}O
- 8.8 g/l Na_{3}citrato.2H_{2}O
2. Condiciones: Se incubaron las fracciones
descartadas de Protrombinex (PTX) a 4ºC (cuadrados abiertos),
22-25ºC (círculos cerrados) y 37ºC (triángulos
cerrados) en presencia de 35 mM, 40 mM y 37 mM de cloruro de calcio
respectivamente. Las tres diferentes concentraciones de cloruro de
calcio corresponden a las concentraciones óptimas requeridas para
la generación de trombina a las temperaturas respectivas. Las
submuestras se removieron a través del tiempo, se evaluaron para la
actividad de la trombina (cromogénico) y se estandarizaron contra
la Norma Internacional para la Trombina (70/157).
3. Conclusión: Los resultados mostrados en la
figura 2 demuestran que la trombina puede ser generada dentro de un
rango de temperatura de 4ºC a 37ºC; sin embargo, para una formación
óptima de trombina tendría que utilizarse una temperatura entre 22
- 25ºC.
\newpage
Ejemplo
3
Este ejemplo describe la determinación de la
concentración óptima de cloruro de calcio óptima para la activación
de la fracción de descarte de PTX de protrombina a trombina.
1. Solución reguladora:
- 3.3 g/l Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, pH 6.6
- 3.2 g/l NaH_{2}PO4.12H_{2}O
- 8.8 g/l Na_{3}citrato.2H_{2}O
2. Condiciones: Las fracciones de descarte de
PTX se incubaron en presencia de concentraciones crecientes de
cloruro de calcio (25-50 mM f.c.) por 4 horas a
22-25ºC. Al final de este periodo, las muestras se
evaluaron para la generación de trombina y los resultados se
expresaron como Unidades Internacionales /ml.
3. Conclusión: Los resultados mostrados en la
figura 3 demuestran que la trombina puede ser generada en presencia
de cloruro de calcio en una concentración final en el rango de 25 a
50 mM; sin embargo, para una formación de trombina óptima debería
usarse una concentración final de 40 mM.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
aplicante se da únicamente para conveniencia del lector y no forma
parte del documento de Patente Europeo. Aunque se ha tenido un gran
cuidado en recopilar las referencias, no pueden descartarse errores
u omisiones y la EPO desconocerá cualquier responsabilidad en este
sentido.
\bullet JP 63290829 B
\bullet JP 2019400 A
\bullet EP 443724 A.
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vitro spontaneous thrombin generation in human factor IX
concentrates. Br. J. Haemotol., 1975, vol. 31,
25-35.
Claims (8)
1. Un método para la preparación de la trombina
a partir de un material que contiene protrombina, que se
caracteriza porque el material que contiene la protrombina
es una fracción del concentrado del complejo de protrombina
activada (Act PCC) obtenida como material ascendente o de
pre-pico en la elución del concentrado del complejo
de protrombina (PCC) en una columna, y dicha fracción Act PCC se
pone en contacto con cationes divalentes para convertir en dicha
fracción la protrombina en trombina.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual dicha fracción ActPCC comprende al menos algunas de las
fracciones trombogénicas en el material ascendente o de
pre-pico que se producen durante la preparación del
concentrado del complejo de protrombina (PCC) por elución de las
proteínas ligadas a partir del sobrenadante de la fracción I de
Cohn de la resina de celulosa- DEAE.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual los cationes divalentes son iones de Ca2^{+}.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en donde la concentración de iones de Ca2^{+} se sitúa en el
rango de 25 a 50 mM, más preferiblemente entre 35 a 50 mM.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3
o la reivindicación 4, en el cual dicha fracción ActPCC se pone en
contacto con iones de Ca2^{+} a una temperatura que se sitúa en el
rango de 4ºC a 37ºC, más preferiblemente entre 22 a 25ºC.
6. Un método de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 3 a 5, en el cual dicha fracción ActPCC se trata
con 40 \pm 5 mM de CaCl2 a 22-25ºC por un periodo
de 4-5 horas.
7. Un método de acuerdo con algunas de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente una etapa de
inactivación de virus, preferiblemente una etapa de tratamiento con
solvente/detergente.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente las etapas de
recuperación y purificación de la trombina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPN4369A AUPN436995A0 (en) | 1995-07-24 | 1995-07-24 | Method for the production of thrombin |
| AUPN4369 | 1995-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2294788T3 true ES2294788T3 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=3788704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96923783T Expired - Lifetime ES2294788T3 (es) | 1995-07-24 | 1996-07-22 | Metodo para la produccion de trombina. |
Country Status (14)
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