ES2289079T3

ES2289079T3 - Liposomas anfotericos y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2289079T3
Application number: ES02701290T
Authority: ES
Inventors: Steffen Panzner; Stefan Fankhanel; Frank Essler; Cornelia Panzner; Dr. Gerold Endert Herr
Original assignee: Novosom AG
Current assignee: Novosom AG
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: EP1363601B1; US20070269504A1; JP2011021026A; JP5480764B2; CN1492756A; US7780983B2; AU2002234643B2; CA2438116A1; US20070252295A1; US7371404B2; US20030099697A1; ATE363893T1; BR0207775A; JP2014031383A; DE10109897A1; JP2004525898A; DE50210271D1; EP1363601A2; BRPI0207775B1; JP2014218520A

Abstract

Liposomas anfotéricos, caracterizados por el hecho de que los liposomas comprenden al menos un portador de carga positivo y al menos un portador de carga negativo diferente, donde los liposomas tienen un punto isoeléctrico entre 4 y 8 y los liposomas comprenden un lípido neutro, seleccionado del grupo constituidos por la fosfatidilcolina, la fosfatdiletanolamina, el colesterol, los tetraeterlípidos, la ceramida, los esfingolípidos y/o el diacilglicerol.

Description

Liposomas anfotéricos y su utilización.

La invención se refiere a liposomas anfotéricos que comprenden simultáneamente portadores de carga positivos y negativos vinculados a membranas o que forman membranas así como la utilización de estos liposomas.

Bajo el concepto de lípidos se resumen tres clases de sustancias naturales que pueden ser aislados de membranas biológicas: fosfolípidos, esfingolípidos y colesterol con sus derivados. A los mismos pertenecen sin embargo también sustancias preparadas sintéticamente con características similares. Aquí se deben nombrar el diacilglicerol, dialquilglicerol, éster o éter de 3-amino-1,2-propandiol o también las N,N-dialquilaminas en su sustitución.

Estas sustancias son de interés técnico en la preparación de liposomas. Estos liposomas se pueden usar entre otras cosas como contenedores para sustancias activas con preparaciones farmacéuticas. Para ello es al mismo tiempo deseable un embalaje eficiente y estable de la carga, compatible con los fluidos corporales y de liberación controlable y eventualmente específica del lugar del contenido.

Ambos requisitos desventajosamente son difíciles de reunir: Cuanto más estable y estanco sea el embalaje, más difícilmente libera la sustancia activa encerrada. Por este motivo se desarrollaron los liposomas que cambian sus características como reacción a estímulos externos.

Son conocidos los liposomas termosensibles y sensibles al pH. Los liposomas sensibles al pH son de particular interés, puesto que este parámetro puede cambiar también bajo circunstancias fisiológicas, por ejemplo durante la absorción endocitótica de un liposoma en las células o durante su paso por el tracto gastrointestinal. Según el estado de la técnica, los liposomas sensibles al pH comprenden especialmente hemisuccinato de colesterol (CHEMS).

El hemisuccinato de colesterol es utilizado mezclado con fosfatidiletanolamina para preparar liposomas sensibles al pH (Tachibana et al. 1998); BBRC 251: 538-544, US4891208). Dichos liposomas pueden ser endocitados por células y son aptos para transportar por este camino las moléculas de carga al interior de las células sin perjudicar la integridad de la membrana celular.

Una desventaja esencial del CHEMS es su carácter aniónico. Los liposomas preparados con el mismo poseen una carga total negativa y sólo son absorbidos por las células con escasa eficiencia. A pesar del mecanismo de transferencia arriba descrito éstos apenas sirven por lo tanto para transportar macromoléculas a las células.

Para la introducción de agentes activos en las células (transfección) se usan profesionalmente los liposomas catiónicos que disponen de una carga de superficie a ser posible alta y constante. La carga total positiva de dichas partículas conduce a una adherencia electroestática a las células y en consecuencia a una introducción eficiente. La utilización de estos compuestos y los liposomas preparados con los mismos sin embargo queda limitada a aplicaciones in vitro o ex vivo, puesto que dichos liposomas cargados positivamente con componentes de suero forman agregados descontrolados.

El BIOPHYSICAL JOURNAL (2000); 79(3), pp. 1438-1446, divulga liposomas sensibles al pH consistentes en una combinación de lípidos aniónicos y catiónicos, p. ej. CHEMS y DODAC o sea DOPA y DC-Chol, sin la adición de lípidos neutros.

En la WO 97 39019 A se describen liposomas que p. ej. se preparan a partir de DOPE y DC-Chol. Los liposomas divulgados en la WO 97 39019 A poseen un punto isoeléctrico, que es superior a 8, puesto que DOPE hasta pH 8 está presente sin cargar y el DC-Chol está cargado hasta aprox. pH 9.

La WO 00 59474 A divulga liposomas que son preparados a partir de una combinación de lípidos convencionales, como p. ej. DOPE y un nuevo lípido, que presenta un portador de carga positivo y negativo, donde el portador de carga negativo de un enlace de disulfuro, que sirve como "conmutador" químico, es ligado con el resto de la molécula. Los liposomas descritos en ese caso no pueden invalidar la recarga debido a su "conmutador" químico irreversible.

BIOCHEMISTRY, vol. 26, Nº. 12, 1987; pp. 3267-3276, describe liposomas de un fosfolípido, p. ej. DOPE y un lípido ligeramente aniónico.

Lo desventajoso en los liposomas sensibles al pH disponibles en el estado de la técnica es la limitación a muy pocos valores pK, en general los del grupo carboxílico en el hemisuccinato de colesterol (aprox. 4,5). Otra desventaja de los compuestos es la limitación a portadores de carga negativos. Estos no sirven para el enlace eficiente de ácidos nucleicos y a menudo tampoco para proteínas.

Los liposomas catiónicos muestran un enlace bueno de ácidos nucleicos y proteínas y son capaces de introducir estas sustancias activas en las células. Desventajosamente no son utilizables para aplicaciones in vivo.

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Por lo tanto existía el objetivo de establecer estructuras liposomales, que:

i): permitan una inclusión eficiente de agentes activos,

ii): puedan introducir estas sustancias activas en células biológicas,

iii): sean compatibles con la utilización bajo condiciones in vivo

iv): sean fáciles y económicas de fabricar.

La tarea según la invención se soluciona mediante liposomas anfotéricos según las reivindicaciones 1 y 3. Los liposomas anfotéricos comprenden al menos un portador de carga positivo y al menos un portador de carga negativo diferente, donde el punto isoeléctrico de los liposomas se encuentra entre 4 y 8, por lo cual los liposomas son preparados con una carga alternativa en función del pH.

Las estructuras liposomales con las características deseadas surgen por ejemplo, cuando en caso de un valor bajo en pH predomina la cantidad de portadores de carga catiónicos que forman las membranas o que están vinculados a la membrana de los portadores de carga aniónicos y en caso de un valor más alto en pH sin embargo se invierten estas condiciones. Este es siempre el caso, cuando los componentes ionizables tienen un valor pKa en el rango de entre 4 y 9. Cuando el pH del medio desciende todos los portadores de carga catiónicos se cargan más y todos los portadores de carga aniónicos pierden su carga.

En relación con la invención deben utilizarse las siguientes abreviaturas:

CHEMS: Hemisuccinato de colesterol

PC: Fosfatidilcolina

PE: Fosfatidiletanolamina

PS: Fosfatidilserina

PG: Fosfatidilglicerol

Hist-Chol: Hemisuccinato de histidinilcolesterol

Los portadores de carga formadores de membranas o vinculados a membranas tienen la siguiente estructura general de un anfifilo:

Grupo de carga - ancla de membrana

Como ancla de membranas entran en consideración los sistemas conocidos de la naturaleza o sus formas técnicamente modificadas. A los mismos pertenecen especialmente el diacilglicerol, diacilfosfoglicerol (fosfolípidos) y esteroles, pero también el dialquilglicerol, los dialquil o diacil-1-amino-2,3-propandioles, alquilos o acilo de cadena larga con 8 a 25 átomos de C, los esfingolípidos, ceramidas y otros más. Estas anclas de membrana son conocidas profesionalmente y en el estado de la técnica.

Los grupos de carga que pueden combinarse con estas anclas pueden ser subdivididos en los siguientes 6 grupos:

Carga neta positiva fuertemente catiónica, pKa>9: Según su naturaleza química son por ejemplo los grupos de amonio, de amidinio, de guanidinio o de piridina o funciones aminicas primarias, secundarias o terciarias.

Ligeramente catiónica, pKa<9, carga neta positiva: Según su naturaleza química, estas son especialmente bases de nitrógeno, como por ejemplo piperacinas, imidazol y morfolina, purina o pirimidinas. Preferiblemente aquellos fragmentos de molécula, como se presentan en sistemas biológicos, son por lo tanto por ejemplo 4-Imidazol (histamina); de 2, 6- o 9-purina (adenina, guanina, adenosina o guanosina), 1-, 2- o 4-pirimidina (uracilo, timina, citosina, uridina, timidina, citidina) o también ácidos piridino-3-carboxílicos (ésteres o amidas de ácido nicotínico).

Las bases de nitrógeno con valores pKa preferidos surgen también por sustitución simple o múltiple del átomo de nitrógeno con hidroxileno bajo en alcano, a saber los grupos hidroximetílicos o hidroxietílicos. Las bases orgánicas adecuadas de este grupo son por ejemplo el aminopropandiol, la trietanolamina, Tris-(hidroximetil)metilamina, Bis-(hidroximetil)metilamina, Tris-(hidroxietil)metilamina), Bis-(hidroxietil)metilamina o las etilaminas correspondientemente sustituidas.

Neutro o en el rango de pH entre 4 y 9 zwitteriónico: Según su naturaleza química, estos son grupos neutros como hidroxilos, amidas, tioles o zwitteriones de un grupo fuerte catiónico y de un grupo fuerte aniónico como por ejemplo la fosfocolina o ácidos aminocarbónicos, ácidos aminosulfónicos, betaínas u otras estructuras.

Ligeramente aniónico, pKa>4, carga neta negativa: Según su naturaleza química, estos son especialmente los ácidos carboxílicos. A los mismos pertenecen los ácidos mono-, di- o tricarboxílicos alifáticos de cadena linear o ramificada con hasta 12 átomos de C y 0, 1 o 2 enlaces insaturados con etileno. Los ácidos carboxílicos con un comportamiento adecuado se encuentran también como sustitutos de sistemas aromáticos.

Otros grupos aniónicos son hidroxilos o tioles disociables, como se presentan en el ácido ascórbico, en el aloxano N-sustituido, el ácido barbitúrico N-sustituido, en el veronal, en el fenol o como grupo tiol.

Fuertemente catiónico, pKa<4, carga neta negativa: según su naturaleza química, estos son grupos funcionales como por ejemplo los ésteres de ácido sulfónico o los ésteres de ácido fosfórico.

Los portadores de carga anfotéricos, pl entre 4,5 y 8,5; carga neta positiva por debajo del pl, carga neta negativa por encima del pl: Según su naturaleza química, estos portadores de carga están compuestos de dos o varios fragmentos de los grupos arriba citados. Para la realización de la invención no es de momento esencial que los grupos cargados se encuentren sobre una misma ancla de membrana o que estos grupos se encuentren sobre diferentes anclas. Especialmente preferidos para la forma de realización de la invención son los portadores de carga anfotéricos con un pl de entre 5 y 7.

Los compuestos fuertemente catiónicos son por ejemplo:

DC-Chol: 3-\beta-[N-(N',N'-dimetiletano)carbamoil]colesterol

TC-Chol: 3-\beta-[N-(N',N', N'-trimetilaminoetano) carbamoil] colesterol

BGSC: Bis-guanidinio- espermidina-colesterol

BGTC: Bis-guanidinio-tren-colesterol,

DOTAP: (1,2-dioleoil-oxipropil)-N,N,N-trimetilamoniocloruro

DOSPER: (1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida)

DOTMA: (1 ,2-dioleiloxipropil)-N,N,N-trimetilamoniocloruro) (Lipofectin®)

DORIE: (1,2-dioleiloxipropil)-3 dimetilhidroxietilamoniobromuro)

DOSC: (1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerilcolinester)

DOGSDSO: (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-succinil-2-hidroxietildisulfidornitina),

DDAB: dimetildioctadecilamoniobromuro

DOGS: ((C18)_{2} GlySper3^{+}) N,N-dioctadecilamido-glicil-espermina (Transfectam®) (C18)_{2}Gly^{+} N,N-dioctadecilamido-glicina

CTAB: Cetil-trimetilamoniobromuro

CPyC: Cetil-piridiniocloruro

DOEPC: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina u otra o-alquilfosfatidilcolina o alquil-etanolaminas,

Amidas de lisina, arginina u ornitina y fosfatidiletanolamina

Los ejemplos para los compuestos ligeramente catiónicos son:

His-Chol Histaminil-colesterol-hemisuccinato, Mo-Chol Morfolina-N-etilamino-colesterolhemisuccinato o histidinil PE.

Los ejemplos para compuestos neutros son: Colesterol, ceramidas, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, tetraéterlípidos o diacilgliceroles.

Los ejemplos de compuestos ligeramente aniónicos son: CHEMS hemisuccinato de colesterol, ácidos alquilcarboxílicos con 8 a 25 átomos de C o diacilglicerol hemisuccinato. Otros compuestos ligeramente aniónicos son las amidas de ácido aspártico, o ácido glutamínico y PE así como el PS y sus amidas con glicina, alanina, glutamina, asparagina, serina, cisteína, treonina, tirosina, ácido glutamínico, ácido aspártico o ácidos amino-dicarboxílicos u otros aminoácidos. Según el mismo principio, también los ésteres de ácidos hidroxicarboxílicos o hidroxidicarboxílicos y PS son compuestos ligeramente aniónicos.

Compuestos fuertemente aniónicos son por ejemplo: SDS Dodecilsulfato de sodio, sulfato de colesterol, fosfato de colesterol, colesterilfosfocolina, fosfatidilgliceroles, ácidos fosfatídicos, fosfitidilinositol, fosfato de diacilglicerol, sulfato de diacilglicerol, cetilfosfato o lisofosfolípidos. Los compuestos anfotéricos son p. ej.:

Hist-Chol N\alpha-Histidinil-colesterolhemisuccinato, EDTA-Chol Esteres de colesterol de ácido etilendiaminotetraacético, Hist-PS N\alpha-Histidinil-fosfatidilserina o N-alquilcarnosina.

Los liposomas según la invención contienen proporciones variables de dichos anfifilos que forman membrana o que están vinculados a membranas, de modo que obtengan un carácter anfotérico. Esto quiere decir que los liposomas pueden cambiar completamente su signo de carga. La cantidad de portadores de carga existentes con un valor pH dado del medio de un liposoma puede calcularse según la siguiente fórmula:

z = \sum ni * ((qi-1)+(10^{(pK-pH)}/(1+10^{(pK-pH)})))

qi Carga absoluta del grupo iónico individual por debajo de su pK (Ejemplo Carboxilo = 0, base simple de nitrógeno = 1, grupo de fosfato de la segunda fase de disociación = -1 etc.) ni Número de estos grupos en el liposoma.

En el punto isoeléctrico la carga neta del liposoma es 0. Mezclando partes aniónicas y catiónicas pueden generarse estructuras con un punto isoeléctrico en gran parte seleccionable.

Las estructuras pueden entonces ser reconstruidas particularmente, de manera que con la caída del valor de pH se ocasione un cambio de carga real de la molécula total de negativo a positivo. Dicho cambio de carga es especialmente ventajoso, cuando los liposomas preparados con las estructuras deben ser empleados en vínculos fisiológicos. Sólo los liposomas con una carga total negativa son tolerables con componentes de sangre y de suero. Una carga positiva conduce a agregaciones. Los liposomas con carga positiva sin embargo son muy fusógenos y pueden introducir sustancias activas en las células. Un cambio de carga en función del pH permite por lo tanto la construcción de compuestos compatibles con suero, puesto que aquellos cargados negativamente cambian de carga después de una absorción endocitótica y por consiguiente se vuelven fusógenos sólo cuanto están en la célula.

En una variante de realización preferida de la invención, los liposomas anfotéricos presentan un punto isoeléctrico entre 5 y 7.

La invención se refiere también a liposomas anfotéricos, que comprenden al menos un portador de carga anfotérico, por lo cual el portador de carga anfotérico presenta un punto isoeléctrico entre 4 y 8.

En una variante de realización preferida, el portador de carga anfotérico de los liposomas presenta un punto isoeléctrico entre 5 y 7.

La invención se refiere también a liposomas anfotéricos, por lo cual los liposomas comprenden al menos un portador de carga anfotérico y un portador de carga aniónico y/o catiónico.

Es conveniente que en una variante de realización preferida, los liposomas anfotéricos presenten un punto isoeléctrico entre 5 y 7.

En una variante de realización particular de la invención, los liposomas según la invención comprenden fosfatidilcolina, fosfatodiletanolamina, diacilglicerol, colesterol, tetraeterlípidos, ceramidas, esfingolípidos y/o diacilglicerol. La preparación de los liposomas sin embargo puede realizarse naturalmente con muchas combinaciones de lípidos conforme a la teoría según la invención. De esta manera pueden producirse por ejemplo liposomas utilizando una alta cantidad de CHEMS (aprox. un 40%) y una cantidad inferior de DOTAP (aprox. un 30%). En el valor pK de los grupos carboxílicos del CHEM, la carga negativa de estos componentes es rechazada de tal manera que el portador de carga positivo predomina en la suma. Una formulación alternativa es la mezcla de CHEMS con HisChol, actuando aquí de manera sinérgica la carga más fuerte del portador de carga positivo HisChol con la descarga del CHEMS
negativo.

En caso de incorporarse por sí mismo el enlace anfotérico Hist-Chol en una membrana neutra, por ejemplo en una fosfatidilcolina, se obtiene entonces igualmente un liposoma anfotérico con un punto isoeléctrico, que corresponde en gran parte al del Hist-Chol.

El experto en la materia sabe cómo han de adaptarse los parámetros importantes haciendo diversas variaciones de la teoría según la invención:

i): la densidad de carga de los liposomas en los puntos finales de los cambios de carga por la cantidad y los valores pKa de los portadores de carga utilizados,

ii): la pendiente de la curva de transferencia de carga por la relación de los dos portadores de carga, por sus cantidades absolutas y por un eventual efecto sinérgico de dos lípidos complementarios sensibles al pH y

iii): el paso por cero del potencial zeta por la relación de los dos portadores de carga así como también por la posición del valor pK o de los valores pK.

En otra variante de realización de la invención, los liposomas presentan un tamaño medio entre 50 y 1000 nm, preferiblemente entre 70 y 250 nm, de especial preferencia entre 60 y 130 nm. La preparación de los liposomas anfotéricos ocurre según los métodos conocidos en el estado de la técnica, es decir por ejemplo por inyección de etanol de una solución de lípidos en tampones acuosos, por hidratación de capas finas de lípidos secos o por la diálisis de detergentes. El tamaño de los liposomas generalmente puede variar entre 50 nm y 10000 nm. Las poblaciones homogéneas pueden producirse por homogeneización de alta presión o por extrusión.

En una variante de realización preferida de la invención, los liposomas comprenden una sustancia activa.

Resulta oportuno, en una variante de realización preferida, que la sustancia activa sea una proteína, un péptido, un ADN, un ARN, un nucleótido antisentido y/o un nucleótido decoy.

En otra variante de realización preferida de la invención, al menos un 80% del agente se encuentra en el interior del liposoma.

La invención se refiere también a un procedimiento para cargar con sustancia activa los liposomas, donde se utiliza un valor pH definido para el encapsulamiento y se ajusta un segundo valor pH para la separación del material ligado.

Además, la invención se refiere también a un procedimiento para cargar con sustancia activa los liposomas, por lo cual los liposomas son permeabilizados y cerrados a un valor pH definido.

La invención se refiere también a la utilización de los liposomas para preparar nanocápsulas por separación de polímeros o polielectrolitos sobre la capa de lípidos. Entonces puede tener lugar una separación simple o múltiple de dichas sustancias sobre la superficie. En una separación múltiple, que es realizada eventualmente bajo presencia de reticulantes, se obtienen nanocápsulas liposomales, según vienen descritas en la WO 00/28972 o en la WO01/64330. En caso de utilizar las sustancias descritas, en el presente caso es ventajoso que la interacción electroestática con el polielectrolito pueda ser interrumpida. Es conocido que la interacción de un polielectrolito con portadores de carga de la membrana liposomal puede conducir a la segregación de partes de membrana y a la formación de grupos de lípidos. En muchos casos, la segregación actúa con una permeabilización del liposoma. Las sustancias según la invención permiten una desconexión de esta interacción según el procedimiento de revestimiento. Si aumenta el valor del pH en ese momento, los liposomas sólo son incluidos de manera estérica en las nanocápsulas, no existiendo entonces una interacción de la membrana con los polielectrolitos. La formación de grupos de lípidos y la permeabilización de la membrana pueden ser eludidas de esta manera.

La invención se refiere también a la utilización de los liposomas según la invención para el envase y la liberación de agentes activos. En esta variante de realización, los liposomas sirven especialmente para envasar eficientemente agentes activos, por ejemplo ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos son incubados con los lípidos indicados particularmente en caso de un valor bajo en pH (aprox. 3 a 6). Una vez formados los liposomas, los ácidos nucleicos adheridos externamente pueden ser lavados por cambio a un valor alto de pH (aprox. 7...9). Se puede elegir un procedimiento análogo para envasar proteínas. Aquí se ajusta ventajosamente un pH en el medio, que se sitúa entre el pl del liposoma y el de la proteína. Se ha probado especialmente ventajoso que los dos valores pl estén separados en más de una unidad.

En otra variante de realización de la invención se utilizan los liposomas para establecer sistemas de liberación en diagnósticos.

En otra variante de realización preferida de la invención, los liposomas son utilizados como sistema de transfección, es decir para introducir agentes activos en las células.

En otra variante de realización de la invención los liposomas son utilizados para la liberación controlada de su contenido por fusión o permeabilización de la membrana. De esta manera, los liposomas que no forman membranas por sí solos pueden ser estabilizados a partir de un lípido, es decir PE, por incorporación de portadores de carga. En el caso de que el portador de carga sea transferido a un estado neutro no cargado o estado zwitteriónico, aumenta la permeabilidad de la membrana. Los liposomas conocidos según el estado de la técnica (PE/CHEMS, Tachibana et al.) permiten dicha permeabilización en caso de bajos valores pH, que sólo se alcanzan bajo condiciones fisiológicas en el interior de endosomas o en caso de pasaje por el estómago. Los liposomas anfotéricos pueden producirse según las medidas arriba indicadas, de manera que su punto neutro se sitúe en cualquier valor de pH deseado entre 4 y 9. Bajo estas condiciones, los liposomas son permeables y pueden emitir una carga en el medio.

Las formulaciones liposomales sin embargo pueden producirse, procesarse y almacenarse bajo condiciones de menor permeabilidad. En una forma de realización preferida de la invención, los liposomas son preparados de tal manera que liberen su carga bajo las condiciones de un valor pH fisiológico, incluyendo sin embargo su carga de manera segura en caso de un valor bajo del pH. Dichos liposomas sirven especialmente para establecer formulaciones con una cinética lenta de liberación, por lo cual la liberación se inicia únicamente por contacto con líquidos corporales pero no con el almacenamiento o con el transporte.

Una forma de realización preferida de la teoría según la invención consiste por lo tanto en la utilización de dichos liposomas para fines terapéuticos, especialmente para aquellas aplicaciones que utilizan una administración dirigida de los liposomas a las de células. El escaso enlace no específico en el presente caso es condición para un transporte de los liposomas hasta el lugar meta. Un alto enlace no específico impediría por el contrario el transporte de los liposomas a su lugar meta. Se puede lograr un enlace específico por otras medidas según el estado la técnica, es decir por una selección de tamaños de liposomas o también el enlace de ligantes con la superficie liposomal, que liga a un receptor meta de la superficie celular. Los ligantes por ejemplo pueden ser anticuerpos o sus fragmentos, azúcares, hormonas, vitaminas, péptidos como p. ej. el Arg-Gly-Asp (RGD), factores de crecimiento, bilirrubina u otros componentes.

Una variante de realización preferida de la teoría según la invención se refiere a la utilización de los liposomas para aplicaciones terapéuticas o diagnosticas bajo condiciones in vivo. Se prefieren aquellos liposomas que muestran un escaso enlace no específico y por ello la tendencia a la fusión bajo condiciones fisiológicas, sin embargo presentan un enlace fuerte y una alta competencia de fusión bajo condiciones modificadas. Aquellos liposomas son liposomas anfotéricos, que poseen una carga total aniónica de la partícula bajo condiciones fisiológicas, que presentan sin embargo una carga creciente catiónica en caso de un pH<6,5. Dichos valores de pH se presentan en la endocitosis de los liposomas en células. Dichos valores de pH se presentan también en el interior de tumores. Estos valores pH se encuentran también en las capas exteriores de la piel. Los valores bajos de pH pueden ser ajustados también ex vivo durante la perfusión de un órgano por cierto período. En consecuencia, la alta fuerza de enlace y competencia de fusión está limitada a aquellos liposomas que ya han sido absorbidos por células o tejidos especiales. La fuerza de enlace y competencia de fusión creciente ayudan a la fusión de la membrana liposomal con la membrana celular. Este acontecimiento conduce a una liberación directa de la carga en el interior de la célula, sin liberar componentes líticos del endosoma y amenazar por ello la carga o los componentes celulares.

Además es oportuna la utilización de los liposomas como formulación de depósito y/o como depósito circulante. Ventajosamente los liposomas pueden ser utilizados también en una administración endovenosa o peritoneal. En una variante de realización especialmente preferida de la invención, los liposomas son utilizados como vector para la transfección de células in vivo, in vitro y ex vivo.

Los liposomas según la invención presentan varias ventajas. Los liposomas cargables de manera catiónica a partir de 40% Chol y PC ligan también ácidos nucleicos bajo condiciones de un valor de pH neutro, como p.ej. el ADN en su membrana. Sorprendentemente se suprime completamente este enlace cuando los liposomas arriba indicados son producidos utilizando adicionalmente 5% PG teniendo entonces características anfotéricas. El enlace de ácidos nucléicos en la membrana puede reestablecerse sin embargo reduciendo el valor de pH. Los liposomas según la teoría de la invención son por lo tanto muy apropiados para el enlace de ácidos nucleicos en función del pH.

Además se descubrió sorprendentemente que también una serie de proteínas se comportan de la manera descrita para los ácidos nucleicos. Así los anticuerpos no ligan en caso de un valor de pH neutro, pero probablemente si efectivamente bajo condiciones ligeramente ácidas con la membrana de los liposomas según la invención. Dicho comportamiento no puede observarse en liposomas sensibles al pH a partir de un lípido neutro y CHEMS ni en aquellos de un lípido neutro y HisChol. Esa es por lo tanto una característica particular de los liposomas anfotéricos. Se descubrió sorprendentemente también que los liposomas según la presente invención son compatibles con sueros contrariamente a los liposomas constitutivamente catiónicos. Una realización oportuna de la teoría según la invención consiste por lo tanto en la utilización de dichos liposomas para fines terapéuticos. Una ventaja de los liposomas es que presentan un enlace no específico con las células esencialmente más insignificante que en los liposomas constitutivamente catiónicos conocidos.

Lo sorprendente es también que la competencia de fusión de los liposomas según la invención depende del valor de pH del fluido. La competencia de fusión con respecto a las membranas biológicas de las células se determina por la elección del lípido, pero también por la recarga de los liposomas. Previamente a la fusión en si habitualmente se prevé una etapa de enlace. Sin embargo no siempre es deseable un fuerte enlace de los liposomas con membranas celulares, sino que debe efectuarse sólo bajo condiciones controladas según se describe arriba en determinados tejidos o células.

Los liposomas pueden por lo tanto aprovecharse para la construcción de vectores liposomales para el transporte de agentes activos a las células. Se consideran sustancias activas todas las sustancias que no formen micelas. Las sustancias activas especialmente adecuadas son sustancias hidrosolubles. Estas son muchas proteínas y péptidos, especialmente anticuerpos o enzimas o antígenos, todos los ácidos nucleicos, independientemente de su peso molecular y su procedencia de ARN o ADN. Estas sin embargo son también otras macromoléculas biológicas como por ejemplo azúcares complejos, sustancias naturales y otros compuestos. Estas son igualmente sustancias activas de bajo peso molecular de origen sintético o natural, que de lo contrario no pueden penetrar la membrana celular como barrera. Dichas sustancias pueden ser transportadas entonces con ayuda de vectores al interior de las células y pueden producir efectos que serían imposibles sin este transporte.

Por consiguiente, con ayuda de la teoría inventiva se pueden preparar liposomas, cuyas características de fusión y enlace se distinguen con diferentes valores de pH. Pueden producirse por lo tanto liposomas compatibles con suero por esta vía, que son cargados con una cantidad grande de agentes activos transportándolos al interior de las células. El experto en la materia puede combinar elementos de la teoría según la invención y producir con ellos los liposomas que sean óptimamente adecuados para un fin determinado.

La invención será descrita detalladamente a continuación por medio de ejemplos, sin limitar la invención a estos ejemplos.

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Ejemplo 1 Preparación y características de carga de liposomas anfotéricos con portadores de carga que pueden ser cargados positivamente y están constantemente cargados negativamente

5 mg de His-Chol y 7,8 mg de POPC y 2 mg de DPPG son disueltos en 4 mL de cloroformo/metanol (1:1 por volumen) y secados completamente en el evaporador rotatorio. La película de lípido es hidratada con 4,3 mL del tapón correspondiente (10 mM KAc, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5 en una concentración de lípidos de 5 mM por un tratamiento con ultrasonido de 5 min. La suspensión es finalmente congelada y tras la descongelación varias veces extrusionada (Avestin LiposoFast, filtro de policarbonato con un ancho de poro de 200 nm). Para la medición del potencial zeta se ajusta una concentración final de los liposomas de 0,2 mm. Para la dilución se utiliza el sistema de tampón arriba mencionado con un pH de 7,5 o 4,2. Los potenciales electrocinéticos medidos se sitúan en -18 mV (pH7.5) o en +35 mV (pH4.2).

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Ejemplo 2 Preparación y características de carga de liposomas anfotéricos con portadores de carga constantemente positivos y variablemente negativos

Los POPC, DOTAP y CHEMS son diluidos en las condiciones molares indicadas abajo en 4 mL de cloroformo/metanol (1:1 por volumen) y completamente secados en el evaporador rotatorio. La película de lípidos es hidratada con 4,3 mL del tampón correspondiente (10 mM KAc; 10 mM HEPES; 150 mM NaCl, pH 7,5) en una concentración total de lípidos de 5 mM por un tratamiento con ultrasonido de 5 min. La suspensión es finalmente congelada y tras la descongelación extrusionada varias veces (Avestin LiposoFast, filtro de policarbonato con un ancho de poro de 200 nm). La tabla indicada abajo muestra los potenciales zeta en función del pH.

Composición de los liposomas en % molar

100

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TABLA 1 Potenciales zeta en Mv

1

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Ejemplo 3 Preparación y características de carga de liposomas anfotéricos con total conmutabilidad en un compuesto

5 mg de Hist-Chol y 9,8 mg de POPC son disueltos en 4 mL de cloroformo/metanol (1:1 por volumen) y completamente secados en el evaporador rotatorio. La película de lípidos es hidratada con 4,3 mL del tapón correspondiente (10 mM Kac; 10 mM HEPES; 150 mM NaCl, pH 7,5 en una concentración de lípidos de 5 mM por un tratamiento con ultrasonido de 5 min. La suspensión es finalmente congelada y extrusionada varias veces después de la descongelación (Avestin LiposoFast, filtros de policarbonato con un ancho de poro de 200 nm). En la tabla abajo (tabla 2) se muestra el curso del potencial zeta con diferentes valores de pH e intensidades de iones.

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TABLA 2

2

Ejemplo 4 Agregado de suero

Las películas de lípidos se preparan según el ejemplo 1. Como muestra de comparación sirve una mezcla de lípidos que no contiene ningún DPPG. Las películas de lípidos son hidratadas en tampones (10 mM de fosfato; 150 mM NaCl, pH7,4) y son extrusionadas según se ha indicado arriba. El suero humano es diluido con la misma cantidad de tampón (10 mM de fosfato; 150 mM NaCl, pH 7,4), eliminando los componentes particulares y grasa por centrifugado (20 min; 13.00 rpm; 4ºC), el suero claro es filtrado con un filtro con un ancho de poros de 0,2 \mum hasta su
esterilización.

Los liposomas arriba preparados son añadidos al suero en una concentración de 1 mM e incubados a 37ºC durante 15 min. Después de la incubación, la suspensión de los liposomas con contenido en DPPG es uniformemente turbia, sin que se pueda observar una floculación. El diámetro de los liposomas es determinado mediante difusión de luz dinámica y se ha modificado en menos de un 10% con respecto a la muestra de salida. La suspensión de los liposomas libres de DPPG muestra claramente una floculación.

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Ejemplo 5 Estabilidad en el suero de la membrana

Además de la agregación de suero se examinó también la salida de un agente (carboxifluoresceína, CF) en presencia de suero humano. Para ello se produjeron liposomas POPC/DOTAP/CHEMS de diferente composición según el ejemplo 2:

POPC 100% (como control), POPC/DOTAP/CHEMS 60:30:10, 60:20:20 y 60:10:30 (indicaciones en % molar). Cualquier CF, no encerrada, fue separada por filtración de gel. Para la medición, los liposomas fueron diluidos a 0,1 mM en suero e incubados a 37ºC. En determinados momentos se tomó una prueba de 30 \mul que fue diluida con 100 mM de tampón TRIS, pH 8,2 a 300 \mul y se midió la fluorescencia. Los valores de 100% se obtuvieron por dilución de los liposomas con 10 \mul de Triton X-100 (10% en agua). En la siguiente tabla se representa la CF encerrada en función del tiempo.

Los liposomas sólo pierden poca CF en suero a lo largo del período medido de 4 h. Los POPC/DOTAP/CHEMS 60:30:10 y 60:20:20 poseen tras 4 h aún aproximadamente un 75%, los POPC y POPC/DOTAP/CHEMS 60: 10:30 incluso sobre el 100% de su contenido en CF originario (véase tabla 3).

TABLA 3

3

Ejemplo 6 Enlace de ADN

Los liposomas con los siguientes compuestos son preparados según el ejemplo 1: (todas las indicaciones en % molar)

101

Los liposomas son suspendidos en una concentración de 0,2 mM en un tampón (10 mM de acetato de potasio; 10 mM de HEPES, pH 4,2 o 7,5). 45 \mul de una solución de ADN (1 mg ADN (esperma de arenque, SIGMA D3159) en 1 ml de agua) son añadidos cada vez a 1 ml de las diferentes muestras de liposomas y son rápidamente mezclados. Después de una incubación durante 15 min., la muestra es recargada con 6 ml del correspondiente tampón y se mide el potencial zeta de los liposomas (tabla 4).

TABLA 4

4

Bajo las condiciones de un excedente de cargas catiónicas (pH 4,2) tiene lugar una fuerte recarga de las partículas. En caso del pH neutro de 7,5, el CHEMS puede sobrecompensar la carga del HisChol en una alta concentración (liposoma C), las partículas tienen un potencial zeta negativo. Dichas partículas enlazan sólo pequeñas cantidades de ADN.

Ejemplo 7 Enlace y separación del ADN

Los liposomas de las composiciones POPC/DOTAP/CHEMS 60:15:25 y POPC/DCChol/CHEMS 60:15:25 (todas las indicaciones en % molar) fueron producidos según el ejemplo 2. El enlace del ADN fue realizado según el ejemplo arriba citado con un pH 4,2 y se determinó el potencial zeta. A continuación, las muestras fueron ajustadas a un pH de 7,5 midiendo a su vez el potencial zeta.

102

En presencia de ADN se mide un potencial zeta negativo con bajo pH, las partículas originarias sin embargo estaban positivamente cargadas. Tras el cambio al pH neutro se reduce esta carga debido al ADN. Los potenciales zeta se aproximan a los liposomas no tratados (-11 mV en caso de un pH 7,5)

Ejemplo 8 Inclusión del ADN y separación del material no encapsulado

Dos formulaciones de liposomas de la composición POPC60/DOTAPI5/CHEMS25 o POPC85/DOTAP15 fueron preparadas como películas de lípidos secas según se ha descrito arriba. La cantidad total del lípido ascendía respectivamente a 4 \muMol. Para la hidratación, el ADN de arenque fue diluido en 10 mM Kac; 10 mM de HEPES y 100 mM de NaCl pH 4. Se añadió 0,4 mg de ADN directamente a las películas de lípidos. Los liposomas preparados fueron congelados y descongelados múltiples veces y extrusionados por un filtro de 200 nm. Cada vez 500 \mul de partículas fueron mezcladas con una solución de sucrosa de 2,5 ml (0,8M de sucrosa en tampón según se ha indicado arriba, valor del pH 4,0 o 7,5) y recubiertos con 1,5 ml de una solución de sucrosa así como 0,5 ml del tapón. Los liposomas entonces fueron separados por flotación del ADN no ligado. Los liposomas fueron retirados, después de la flotación, de la superficie límite tampón/0,5M de sucrosa. La determinación de la cantidad de ADN ligada se realiza por intercalación de yoduro de propidio, para la determinación de la cantidad de lípidos se utilizó el Stewart-Assay. En el Stewart-Assay reacciona sólo el PC utilizado, los demás lípidos fueron calculados por medio de este valor. Los resultados están representados en la tabla abajo (tabla 5).

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TABLA 5

5

Con los liposomas anfotéricos sólo flota hacia arriba aproximadamente la mitad de ADN ligado después de cambiar el pH a 7,5. Este material es el material incluido realmente. Se obtuvieron resultados análogos durante la digestión con ADNse. De los liposomas constitutivos catiónicos no se puede separar el ADN cambiando el pH ni tampoco aumentando adicionalmente la fuerza de iones y permanece siempre en el exterior.

Ejemplo 9 Características de fusión

Los liposomas con las siguientes composiciones son preparados según el ejemplo 1 (todas las indicaciones en % molar):

103

Los liposomas facultativos catiónicos A o B son incubados con los liposomas neutros X o los liposomas aniónicos Y en el tampón (10 mM HEPES; 10 mM de acetato de potasio, pH 4,2 o 7,5). La eventual fusión de liposomas es analizada midiendo las magnitudes por difusión de luz dinámica (tabla 6).

TABLA 6

6

Los tamaños iniciales de los liposomas eran de 161,8 nm con pH 4,2 y 165,9 nm con pH 7,5

A): 183,2 nm

X): 199,2 nm

Y): 183,2 nm

El tamaño de pares complementariamente cargados (YA y YB) se distingue claramente del tamaño de las suspensiones mixtas con el liposoma neutro X. La medida de la interacción viene determinada por la medida de la carga de los liposomas facultativamente catiónicos. Una fusión a mayores unidades no depende del lípido fusógeno PE.

Ejemplo 10 Permeabilidad respecto a las macromoléculas

13,75 \mumol de DOPE, 2,5 \mumol de CHEMS y 10 \mumol de HisChol son disueltos en isopropanol y el solvente es separado al vacío. A la película de lípido secado se añade 2,5 ml de una solución de proteinasa K en tampón (1 mg/ml de proteinasa K; 10 mM de acetato de potasio; 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 4,2). Después de la hidratación de la película, los liposomas formados son extrusionados por una membrana de 400 nm. La proteinasa no encerrada es separada de los liposomas por flotación en los gradientes sucrosos. Los liposomas preparados de esta manera son incubados con 7,5 ml de tampón con un pH 4,2 y pH 7,2 (tampón según se ha indicado arriba, pH inicial 4,2 y 8,0). Después de la incubación, la proteinasa K liberada es separada por ultrafiltración con una membrana de 0,1 \mum. Los liposomas que quedan en el filtro son entonces tratados con 7,5 ml de una solución de Triton X-100 en tampón (según se ha indicado arriba, pH 8,0).

Todo producto filtrado es probado sobre la presencia de proteinasa K. Para ello se utiliza una solución de azocaseína (6 mg/ml azocaseína en 1 M de urea; 200 mM de Tris-sulfato, pH 8,5). 500 \mul de esta solución son mezclados con 100 \mul de producto filtrado o tampón e incubados durante 30 min. a 37ºC. La reacción es detenida añadiendo 10% de ácido tricloroacético. Las proteínas precipitadas son separadas por centrifugado. La coloración en el sobrante es medida en 390 nm (tabla 7).

TABLA 7

7

En caso de realizarse la incubación de los liposomas con un valor de pH de 4,2, no se libera o sólo se libera muy poca proteinasa K. Sólo con la dilución de los liposomas con Triton X100 se logra la liberación de la enzima. Cuando los liposomas son incubados con un valor de pH de 7,2, entonces se libera gran parte de la enzima sin adición de Triton y se encuentra en el primer producto filtrado. Con la adición de Triton apenas se puede eliminar otra enzima de los liposomas.

Ejemplo 11 Enlace de proteínas

Los liposomas de la composición POPC50/DOTAP10/CHEMS40 (todos los datos en % molar) son producidos según los ejemplos anteriores. Para la hidratación de las películas de lípidos se utiliza una solución de 0,26 mg/ml de lisozima en tampón (10 mM MES pH 5,0 o pH 6,0 o 10 mM de HEPES pH 7,0 o pH 8,0). Todas las pruebas son congeladas y descongeladas múltiples veces después de la hidratación. Los liposomas son homogeneizados a continuación mediante ultrasonido y extrusionados por un filtro de 200 nm.

La suspensión de liposomas preparada de esta manera es ajustada a un valor pH de 4,0 por adición de ácido acético. A continuación, los liposomas son separados por flotación de la proteína no incorporada. En la tabla mencionada abajo viene reflejada la proporción de la proteína encerrada (tabla 8).

TABLA 8

8

Los liposomas de la composición utilizada muestran un pl de 5; la lisozima es una proteína básica con un pl de 11,35. En el rango de pH entre 6 y 8, ambas parejas por lo tanto son cargadas contrariamente. Por la atracción electroestática se provoca una inclusión eficiente en los liposomas. La proteína no encapsulada fue eliminada a un pH de 4. Con este pH, la interacción entre las parejas es cancelada.

Ejemplo 12 Transfección en células

Las células de HeLa o células CHO (3*10^5) fueron fueron colocadas en los pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos y cultivadas durante tres días. Los liposomas (POPC/DOTAP/CHEMS 60/30/10) fueron producidos en presencia de un dextrano marcado por fluorescencia (dextrano TRITC; 10 mg/ml en el tampón de hidratación). El dextrano TRITC no encerrado fue eliminado por filtración de gel. Los liposomas producidos de esta manera fueron añadidos a las células e incubados durante 6 h a 37ºC. A continuación las células fueron lavadas dos veces con tampón. La absorción del dextrano fue seguida en la imagen microscópica. Los resultados están representados en la figura 1.

Ejemplo 13 Enlace de ligantes y transfección

Los liposomas de la composición POPC/DOTAP/Chems/N-glutaril-DPPE (50:10:30:10 (% molar) son preparados según el ejemplo 2, al mismo tiempo son hidratados con una solución de 3 mg/ml de dextrano TRITC (Peso mol. aprox. 4400) en Hepes 10 mm; 150 mM NaCl, pH 7,5. El dextrano TRITC no encerrado es separado por filtración de gel por medio de una columna Sephadex G-75. El enlace del péptido cíclico RCDRGDDCFC con la superficie liposomal se logró por activación del N-glutaril-DPPEs con EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil carbodiimida (3.5 mg EDC a 400 \mul de suspensión de liposomas) y a continuación agitación a oscuras durante 5 h. Luego se añadió el péptido RGD (250 \mug en 150 \mul de tampón) y se agitó durante la noche. Los liposomas fueron separados por filtración de gel del péptido no ligado. Las células endoteliales humanas (HUVEC) fueron cultivas en fluido especial. Los liposomas modificados con ligantes y liposomas de control sin ligante RGD son aplicados como suspensión de 0,5 mm sobre las células. Tras 2 horas, los liposomas son separados y las cámaras celulares fueron lavadas 3 veces con tampón PBS y contempladas bajo el microscopio de fluorescencia. Las células que fueron tratadas con liposomas RGD mostraron una fluorescencia roja de TRITC considerablemente más alta que los liposomas de control.

Ejemplo 14 Farmacocinética (nivel en sangre y distribución en los órganos) de liposomas conmutables por el pH

Cada vez 500 \muL de liposomas de POPC/Chol (60:40), POPC/Hist-Chol/Chol (60:20:20) y POPC/DOTAP/CHEMS (60:10:30) fueron administrados a ratas Wistar machos por inyección en la vena de la cola.

50 mM de suspensiones de liposomas fueron preparadas por hidratación de una película de lípidos de la formulación correspondiente (adición de 0,03% molar [14]C-DPPC) con 2 mL de una solución de 1 mg [3]H-inulina en HEPES 10 mm, NaCL 150 mm, pH 7.5). Después de 3 ciclos de congelación/descongelación, las suspensiones fueron extrusionadas múltiples veces por una membrana de 400 nm (LiposoFast, Avestin). La eliminación de [3]H-inulina no encerrada se realizó por filtración de gel por medio de una columna Sephadex G-75 y por concentración sucesiva mediante unidades de centrifugado CENTRIPREP (Millipore). A 4 animales de experimentación por cada formulación se les administró 0,5 mL de una suspensión de liposomas y se les tomó muestras de sangre, pasados unos 5 min., 15 min., 60 min., 3 h, 12 h, 24 h. La radioactividad de la fracción de membrana y de la carga soluble fueron medidas por centelleo y resultaron los siguientes valores:

Tiempos en valor medio de eliminación de la sangre:

POPC/Chol: superior a 120 min

POPC/DOTAP/CHEMS: superior a 120 min

POPC/Hist-Chol: superior a 120 min

Con su tiempo de valor medio relativamente largo en la sangre, los liposomas según la invención satisfacen las condiciones básicas para un sistema de vectores. No son tóxicos agudos y no son absorbidos inmediatamente por el sistema reticuloendotelial. La proporción de la radioactividad 3[H] y de la radioactividad 14[C] de las muestras de sangre fue constante hasta el final del experimento. No tiene lugar por lo tanto en ningún caso una liberación de la carga por tisis complementaria.

Claims

1. Liposomas anfotéricos, caracterizados por el hecho de que los liposomas comprenden al menos un portador de carga positivo y al menos un portador de carga negativo diferente, donde los liposomas tienen un punto isoeléctrico entre 4 y 8 y los liposomas comprenden un lípido neutro, seleccionado del grupo constituidos por la fosfatidilcolina, la fosfatdiletanolamina, el colesterol, los tetraeterlípidos, la ceramida, los esfingolípidos y/o el diacilglicerol.

2. Liposomas anfotéricos según la reivindicación 1, caracterizados por el hecho de que los liposomas presentan un punto isoeléctrico comprendido entre 5 y 7.

3. Liposomas anfotéricos, caracterizados por el hecho de que los liposomas comprenden al menos un portador de carga anfotérico, donde el portador de carga anfotérico presenta un punto isoeléctrico comprendido entre 4 y 8 y los liposomas comprenden un lípido neutro seleccionado del grupo constituido por la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el colesterol, los tetraéterlípidos, la ceramida, los esfingolípidos y/o el diacilglicerol.

4. Liposomas anfotéricos según la reivindicación precedente, caracterizados por el hecho de que el portador de carga anfotérico presenta un punto isoeléctrico comprendido entre 5 y 7.

5. Liposomas anfotéricos, caracterizados por el hecho de que los liposomas comprenden al menos un portador de carga anfotérico con un punto isoeléctrico entre 4 y 8 y un portador de carga aniónico y/o catiónico, donde los liposomas comprenden un lípido neutro seleccionado del grupo constituido por la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el colesterol, los tetraeterlípidos, la ceramida, los esfingolípidos y/o el diacilglicerol.

6. Liposomas anfotéricos según la reivindicación 5, caracterizados por el hecho de que los liposomas presentan un punto isoeléctrico comprendido entre 5 y 7.

7. Liposomas anfotéricos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizados por el hecho de que los liposomas presentan un tamaño medio entre 50 y 1000 nm, preferiblemente entre 70 y 250 nm, de especial preferencia entre 60 y 130 nm.

8. Liposomas anfotéricos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizados por el hecho de que los liposomas comprenden una sustancia activa.

9. Liposomas anfotéricos según la reivindicación precedente, caracterizados por el hecho de que la sustancia activa es una proteína, un péptido, un ADN, un ARN, un nucleótido y/o un nucleótido Decoy.

10. Liposomas anfotéricos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizados por el hecho de que al menos el 80% del agente se encuentra en el interior del liposoma.

11. Procedimiento para la carga de sustancia activa de liposomas según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que se utiliza un valor de pH definido para el encapsulamiento y se ajusta un segundo valor de pH para la separación del material no ligado.

12. Procedimiento para la carga de sustancia activa de liposomas según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que los liposomas son permeabilizados y cerrados a un valor de pH definido.

13. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para preparar nanocápsulas.

14. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para preparar sistemas de liberación para el diagnóstico.

15. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de preparados farmacéuticos destinados al transporte y/o a la liberación de agentes activos.

16. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de preparados farmacéuticos como formulación de retardo y/o como retardo circulante.

17. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de un preparado farmacéutico destinado a la administración por vía intravenosa o peritoneal.

18. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de preparados farmacéuticos como vector de transfección de células in vivo y ex vivo.

19. Utilización de liposomas según una de las reivindicaciones 1 a 10 para preparar vectores de transfección de células in vitro.