ES2284891T3 - Procedimiento de screening con pim1-quinasa o pim3-quinasa. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para descubrir sustancias reguladoras del dolor, es decir, sustancias que influyen directa o indirectamente en la percepción del dolor, que incluye los siguientes pasos: (a) incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con una célula y/o con un preparado celular que ha sintetizado la proteína PIM-1-quinasa o la PIM-3-quinasa, y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o a sus polinucleótidos antisentido; (b) medida de la unión de la sustancia de ensayo a la proteína sintetizada por la célula, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo a la proteína, midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular a través de la medida de la modificación de la expresión genética, el medio de iones, el pH o el potencial de membrana, mediante modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o mediante la medida de la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada.

Description

Procedimiento de screening con PIM1-quinasa o PIM3-quinasa.
La invención se refiere a un procedimiento para descubrir sustancias relevantes para el dolor utilizando la PIM1-quinasa o la PIM3-quinasa.
Existen diferentes medicamentos para la terapia del dolor, por ejemplo ácido acetilsalicílico, paracetamol, dipirona, tramadol, morfina y fentanilo, pero también se utilizan sustancias como amitriptilina y cetamina para tratar a pacientes con dolor. Sin embargo, a pesar de que los esquemas terapéuticos son cada vez más refinados, con frecuencia no se puede lograr una mejoría duradera para los pacientes, sobre todo en caso de estados de dolor crónicos. Una de las causas de ello, entre otras, se basa en las modificaciones permanentes de las neuronas afectadas que se producen en caso de dolor crónico.
En los últimos años, la investigación del dolor ha aportado el conocimiento básico de que, precisamente tras el desarrollo de estados de dolor crónicos, subyacen modificaciones plásticas del sistema nervioso, en particular en las neuronas nociceptivas de los ganglios de la raíz dorsal y en las neuronas de la zona de las astas dorsales de la médula espinal (como sinopsis véase: Coderre y col. 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). La plasticidad neuronal va acompañada de modificaciones en la expresión de determinados genes y conduce a una modificación persistente del fenotipo de las neuronas afectadas. Hasta ahora, el concepto de plasticidad neuronal se había utilizado principalmente en procesos de desarrollo, aprendizaje y regeneración, pero los nuevos hallazgos de la investigación del dolor demuestran que este concepto también es aplicable en caso de procesos fisiopatológicos (Tölle, 1997).
La cronificación del dolor ya se ha caracterizado relativamente bien a nivel fenomenológico en la experimentación animal. La inducción de estados de dolor crónicos conduce a las siguientes modificaciones:
\bullet
Aumento de la sensibilidad y disminución del umbral de estimulación de los nociceptores periféricos.
\bullet
Activación de los denominados nociceptores silenciosos.
\bullet
Reorganización de campos de receptores.
\bullet
Aumento de la excitabilidad en la médula espinal.
Estas modificaciones plásticas han sido descritas tanto en el caso de las fibras nerviosas aferentes primarias que se encuentran en los ganglios como en el caso de las neuronas posteriores localizadas en la médula espinal, y se presume que también se producen en áreas supraespinales, por ejemplo en el tálamo. De forma análoga a los mecanismos descritos para los procesos de aprendizaje y memoria, es de suponer que en las células afectadas se desarrolla un programa genético específico que incluye la regulación coordinada de genes relevantes cuya expresión contribuye después, de forma decisiva, a la manifestación fisiopatológica de dolores crónicos.
Por ello, el punto de partida de la invención consistía en la identificación de este tipo de genes regulados por el dolor, cuya expresión se modifica bajo condiciones de dolor y, por consiguiente, probablemente intervienen en la generación y el procesamiento principalmente de dolores crónicos, a través de sus relaciones de regulación.
Ya se ha demostrado una regulación en diferentes modelos de dolor para una serie de genes conocidos (véase la Tabla 1), por ejemplo para neurotransmisores (sustancia P, CGRP), receptores (sustancia p-receptor, receptores opiáceos \mu, \kappa, \delta, receptor NMDA) y factores de transcripción (cJun, JunB, cFos o Krox24). El hecho de que dichos receptores ya sean utilizados como objetivos moleculares para el desarrollo de nuevos analgésicos (Dickenson, 1995) constituye una indicación clara de que la identificación de nuevos genes regulados por el dolor también tiene un gran interés para el desarrollo de analgésicos, en particular para los procedimientos de screening correspondientes. La idea central consiste en interrumpir el desarrollo o la persistencia de dolor, principalmente de tipo crónico, influyendo en la función de aquellas proteínas cuya formación aumenta o disminuye en estados de dolor.
TABLA 1 Regulación de genes/productos genéticos conocidos en modelos de dolor animales
1
2 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} ME = médula espinal; DRG = Dorsal
Root Ganglia (ganglios de la raíz dorsal); CFA = Complete Freund
Adjuvans (adyuvante completo de Freund); NGF = Nerve Growth Factor
(factor de crecimiento
nervioso).\end{minipage} \cr}
Además, el documento US 6,143,540 describe polipéptidos HKID-1, proteínas y moléculas de ácido nucleico codificadoras de éstos. Estos polipéptidos HKID-1 y proteínas presentan una similitud de un 77% con respecto al PIM-1 de Xenopus laevis. Si bien el documento US 6,143,540 también da a conocer procedimientos diagnósticos, de screening y procedimientos terapéuticos en los que se utilizan las composiciones mencionadas en el mismo, no describe ninguna relación con el dolor o con sustancias reguladoras del dolor.
El documento WO 00/75667 da a conocer procedimientos para estudiar compuestos que modulan la fosforilación, en particular de una fosfatasa o de una proteína quinasa, en una mezcla de reacción. Sin embargo, el documento WO 00/75667 no describe PIM-1-quinasas o PIM-3-quinasas ni procedimientos para la identificación de sustancias reguladoras del dolor.
El documento EP-A-0 911 391 da a conocer polipéptidos HWHHJ20 y procedimientos para la producción de dichos polipéptidos mediante procedimientos recombinantes. El documento EP-A-0 911 391 también da a conocer procedimientos para la utilización de estos polipéptidos, y también polinucleótidos que los codifican, en terapias y en ensayos diagnósticos. Sin embargo, el documento EP-A-0 911 391 tampoco describe PIM-1-quinasas o PIM-3-quinasas ni procedimientos para la identificación de sustancias reguladoras del dolor.
Por consiguiente, el objetivo principal de la invención consistía en desarrollar un procedimiento de screening para identificar sustancias relevantes para el dolor, en particular sustancias reguladoras del dolor. En consecuencia, la invención se refiere a un procedimiento para descubrir sustancias reguladoras del dolor, que incluye los siguientes pasos:
(a)
incubación de una sustancia a ensayar, bajo condiciones adecuadas, con una célula y/o con un preparado celular que ha sintetizado la proteína PIM-1-quinasa o PIM-3-quinasa y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o a sus polinucleótidos antisentido;
(b)
medida de la unión de la sustancia de ensayo a la proteína sintetizada por la célula, o medición de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo a la proteína, a través de la medida de la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular a través de la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o
mediante la medida de la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada.
Este nuevo procedimiento de screening se basa en la posibilidad de hallar la potencial eficacia contra el dolor de una sustancia a través de su interacción con una estructura de proteína regulada por el dolor, en particular PIM1-quinasa o estructuras derivadas, o a través de una estructura de proteína con una distribución en el SNC relevante para el dolor, en particular PIM3-quinasa o estructuras derivadas.
En este contexto, el concepto "regulador del dolor" se refiere a una influencia reguladora potencial en el dolor fisiológico, en particular a un efecto analgésico. El término "sustancia" incluye cualquier compuesto adecuado como principio activo medicamentoso, es decir, sobre todo principios activos de bajo peso molecular, pero también otros tales como ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas como anticuerpos.
Por "incubación bajo condiciones adecuadas" se ha de entender que la sustancia a examinar puede reaccionar con la célula o con el preparado correspondiente en un medio acuoso durante un tiempo determinado antes de la medida. La temperatura del medio acuoso se puede regular, por ejemplo entre 4ºC y 40ºC, preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo de incubación puede variar entre unos segundos y varias horas, dependiendo de la interacción de la sustancia con la proteína. No obstante, son preferentes tiempos de incubación de 1 minuto a 60 minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o sistemas tampón adecuados, de modo que durante la incubación en el medio impere un valor pH entre 6 y 8, preferentemente un pH 7,0-7,5. También se pueden añadir al medio otras sustancias adecuadas tales como coenzimas, nutrientes, etc. Los especialistas pueden determinar fácilmente las condiciones adecuadas en función de la interacción examinada de la sustancia con la proteína basándose en su experiencia, en la literatura o en algunos ensayos preliminares sencillos, con el fin de obtener el valor de medida más claro posible en el procedimiento.
Una célula que ha sintetizado una proteína determinada es una célula que ya ha expresado esta proteína de forma endógena o una célula que ha sido modificada por ingeniería genética de tal modo que expresa esta proteína y, correspondientemente, contiene la proteína antes del comienzo del procedimiento según la invención. Las células pueden ser células de líneas celulares, dado el caso inmortalizadas, o células nativas procedentes de tejidos y aisladas de éstos, estando la agrupación celular disuelta en la mayoría de los casos. El preparado de estas células incluye principalmente materiales celulares homogeneizados, el citosol, una fracción de membrana de las células con fragmentos de membrana, una suspensión de organelas celulares aisladas, etc.
Las proteínas aquí citadas han sido identificadas en el marco de esta invención como proteínas reguladas por el dolor o distribuidas de forma relevante para el dolor mediante el método consistente en provocar dolor en un animal y, después de un tiempo adecuado, a través de cortes en la médula espinal, comparar el patrón de expresión del animal con el de un animal control no sometido a medidas de provocación de dolor. Las proteínas expresadas de forma modificada halladas mediante este procedimiento son la PIM-1-quinasa y, principalmente en relación con la distribución relevante para el dolor, la PIM-3-quinasa.
La especie de procedencia de estas proteínas carece de importancia para la función del procedimiento, pero es preferible utilizar la variante humana, de ratón o de rata. De la PIM1-quinasa es conocida la secuencia de DNA codificadora y la secuencia de aminoácidos, y también se ha descrito su función general. Esto también es aplicable en parte a la PIM3-quinasa, pero en este caso en el marco de esta invención se ha clarificado la secuencia de DNA codificadora y la secuencia de aminoácidos en ratones y humanos, que hasta ahora eran desconocidas. Sin embargo, hasta ahora, en el estado actual de la técnica ninguna de estas quinasas había sido relacionada con el dolor y en particular con la regulación del dolor. Como la identificación de las proteínas se ha realizado a través de una modificación de la expresión o de la distribución de la expresión en un modelo de dolor in vivo, para los futuros medicamentos producidos con estas proteínas, el procedimiento de screening según la invención derivado de ellas tiene la notable ventaja de no estar basado exclusivamente en razonamientos teóricos, sino que probablemente posee una gran relevancia in vivo. Dado que este procedimiento permite la interacción de sustancias con proteínas y péptidos no utilizados hasta la fecha en el campo del dolor como escala para la localización de sustancias reguladoras del dolor, con este procedimiento probablemente se puedan encontrar ahora sustancias relevantes para el dolor que habrían pasado inadvertidas con los procedimientos conocidos hasta ahora en el estado actual de la técnica, con otros péptidos o proteínas. Ésta es otra ventaja considerable del nuevo procedimiento según la invención.
La escala a través de la cual el procedimiento permite hallar sustancias de interés consiste bien en la unión a la proteína, que se puede comprobar, por ejemplo, por desplazamiento de un ligando conocido o por la magnitud de la sustancia unida, bien en la modificación de un parámetro funcional a través de la interacción de la sustancia con la proteína. Esta interacción puede consistir principalmente en una regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, y los parámetros funcionales modificados pueden ser por ejemplo la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, o la variación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero.
A continuación, para aclarar la invención, además de las explicaciones de conceptos dadas en el texto general, se indican otras definiciones, con el fin de establecer claramente cómo se han de entender e interpretar en el sentido de esta invención determinados conceptos utilizados principalmente en las reivindicaciones.
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Sustancia: Este término hace referencia a un compuesto químico. Aquí se trata más concretamente de compuestos que pueden desarrollar potencialmente un efecto en el cuerpo, principios activos de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas, en este caso sobre todo principios activos de bajo peso molecular.
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Regulador del dolor: En el sentido de la invención, "regulador del dolor" significa que la sustancia influye directa o indirectamente en la percepción del dolor, en particular que actúa como analgésico de forma natural.
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Incubación: Por "incubación" se entiende que un objeto de estudio biológico, por ejemplo una célula o una proteína, se introduce y se deja en un medio a temperatura regulada, por ejemplo en una estufa incubadora o sobre un baño de agua. En este contexto, por el concepto "condiciones adecuadas" se entiende una incubación bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo 37ºC, pH 7,2) o bajo condiciones que permiten una medida óptima en el procedimiento.
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Célula: La célula es un sistema autorregulado, abierto, que se encuentra en equilibrio dinámico con su entorno mediante el intercambio permanente de materiales, con metabolismo propio y capacidad de reproducción. La célula se puede cultivar por separado o formar parte de un tejido, en particular de un órgano, y encontrarse en éste aislada o todavía en la agrupación celular.
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Preparado celular: Por este concepto se entienden preparados producidos mediante métodos químicos, biológicos, mecánicos o físicos con modificación de la estructura celular, por ejemplo fragmentos de membrana, compartimentos celulares aislados, citosol aislado o material homogeneizado obtenido de tejido.
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Péptido: Compuesto de aminoácidos unidos en cadenas a través de enlaces peptídicos. Un oligopéptido consiste en 2 a 9 aminoácidos, un péptido consiste en 10 a 100 aminoácidos.
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Proteína: Compuesto de más de 100 aminoácidos unidos en cadenas a través de enlaces peptídicos, eventualmente con una estructura espacial definida.
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PIM1-quinasa; PIM3-quinasa: Un proto-oncogén y una serina-treonina-quinasa.
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Polinucleótido: El nucleótido que sirve de base es un componente básico de los ácidos nucleicos que consiste fundamentalmente en una base de nucleína, pentosa y ácido fosfórico. Corresponde a un polinucleótido de alto peso molecular formado por varios nucleótidos unidos entre sí a través de esterificación de la ácido fosfórico-pentosa. No obstante, en esta invención dicho concepto también incluye polinucleótidos modificados que, si bien conservan la sucesión de bases, disponen de un esqueleto modificado en lugar de la ácido fosfórico-pentosa.
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Similar en como mínimo un 90(95,97)%: Este concepto significa que la sucesión de bases de la región codificadora de los polinucleótidos incluidos es idéntica a la de referencia (figura, etc.) en como mínimo un 90% (95%, 97%), y que la sucesión de los aminoácidos de la estructura primaria de los péptidos y proteínas incluidos es idéntica a la referencia en como mínimo un 90% (95%, 97%).
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Gen: Con el término "gen" se designa una sección de genoma con una secuencia de nucleótidos definida que incluye la información para la síntesis de un mRNA o pre-mRNA o de un RNA de otro tipo (por ejemplo tRNA, rRNA, snRNA, etc.). Consiste en secciones codificadoras y no codificadoras.
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Fragmento génico: Sección de ácido nucleico que incluye en su sucesión de bases una región parcial de un gen.
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Unión al péptido o proteína: Interacción entre la sustancia y el péptido o proteína que conduce a la fijación.
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Parámetros funcionales: Por este concepto se entienden magnitudes de medida de un experimento que están en correlación con la función de una proteína (canal de iones, receptor, enzima).
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Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.
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Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.
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Proteína G: Abreviatura internacional habitual para una proteína que se une a guanosin-trifosfato (GTP), que se activa como proteína de señal a través de receptores acoplados por proteína G.
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Gen indicador: Designación general para genes cuyos productos genéticos se pueden comprobar fácilmente con ayuda de sencillos métodos bioquímicos o métodos histoquímicos, tales como por luciferasa, fosfatasa alcalina o Green Fluorescent Protein (GFP) (proteína fluorescente verde).
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Constructo de DNA (recombinante): Designación general para todo tipo de moléculas de DNA formadas por ligadura in vitro de moléculas de DNA.
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Vector de clonación: Designación general para moléculas de ácido nucleico que durante la clonación actúan como portadores de genes extraños o de partes de estos genes.
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Vector de expresión: Designación para vectores de clonación especialmente construidos que, después de introducirlos en una célula huésped adecuada, permiten la transcripción y traducción del gen extraño incorporado por clonación en el vector.
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Secuencia LTR: Abreviatura de long terminal repeat. Designación general para regiones de secuencia más largas que se encuentran en ambos extremos de un genoma lineal. Estas regiones de secuencia se encuentran por ejemplo en los genomas de retrovirus y en los extremos de transposones eucarióticos.
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Cola poli-A: Los restos adenilo (aproximadamente 20-250) fijados mediante poliadenilación en el extremo 3' de los RNA mensajeros.
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Secuencia promotora: Designación para una región de secuencia de DNA a partir de la cual se controla la transcripción de un gen, es decir, la síntesis de mRNA.
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Secuencia ORI: Abreviatura de origin of replication. La secuencia ORI permite que una molécula de DNA se reproduzca como unidad autónoma en la célula.
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Secuencia intensificadora: Designación para elementos genéticos relativamente cortos que se presentan, en parte, en forma de repeticiones y que, en general, refuerzan la expresión de algunos genes en diferente medida.
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Factor de transcripción: Designación para una proteína que influye en la transcripción de un gen a través de su unión a secuencias de DNA específicas.
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Cultivar: Mantener células o tejidos bajo condiciones de cultivo adecuadas.
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Condiciones que permiten una expresión: Por este concepto se entiende la selección y aplicación de condiciones de cultivo que permiten una expresión de la proteína de interés, entre las que se encuentran la modificación de la temperatura, el cambio de medio, la adición de sustancias inductoras, la supresión de sustancias inhibidoras.
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Tiempo de incubación: Tiempo durante el cual las células o tejidos son incubados, es decir, sometidos a una temperatura determinada.
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Presión de selección: Aplicación de condiciones de cultivo que proporcionan una ventaja de crecimiento a las células con un producto genético determinado, el denominado marcador de selección.
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Célula de anfibio: Célula de un animal de la clase de los Amphibia.
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Célula bacteriana: Célula asignable al dominio de las eubacterias o arqueobacterias, o procedente del mismo.
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Célula de levadura: Célula asignable al orden de los endomicetales, o procedente del mismo.
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Célula de insecto: Célula asignable al orden de los Hexapoda, o procedente del mismo.
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Célula de mamífero nativa: Célula procedente de un mamífero, cuyas características relevantes corresponden a las de la célula que se encuentra en el organismo.
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Célula de mamífero inmortalizada: Célula que, mediante las condiciones de cultivo aplicadas o mediante manipulación por ingeniería genética, ha adquirido la propiedad de dividirse en el cultivo más allá de la frecuencia de división habitual normal (aproximadamente 100).
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Marcado: Hecho accesible mediante modificación o derivación correspondiente para una reacción de comprobación. Por ejemplo, radiactivo, fluorescente o luminiscente.
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Ligando: Sustancia que se une a una molécula que se encuentra en el cuerpo o en una célula, especialmente un receptor.
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Desplazamiento: Separación total o parcial de un ligando de su sitio de unión.
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Actividad relacionada: Valor de medida registrado bioquímica o físicamente que está en correlación con la cantidad de ligando unida a un receptor.
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Regulación: La inhibición o activación de un proceso como parte de un proceso de regulación.
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Inhibición: Como caso especial de la regulación, el impedimento/reducción de un proceso.
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Activación: Como caso especial de la regulación, la intensificación de un proceso.
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Receptores: En el sentido más amplio, todas las moléculas procarióticas o eucarióticas presentes en el organismo a las que se puede unir un principio activo. Más concretamente, proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana que provocan una modificación en la célula mediante la unión de un principio activo.
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Canales de iones: Proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana a través de los cuales la membrana puede ser atravesada por cationes o aniones.
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Enzimas: Designación para proteínas o complejos de un componente activador no albuminoide con una proteína que poseen propiedades catalíticas.
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Expresión genética (expresar/expresable): La traducción de la información genética de un gen en RNA (expresión de RNA) o en una proteína (expresión de proteína).
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Medio de iones: Concentración de uno o más iones en un compartimento determinado.
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Potencial de membrana: Diferencia de tensión a través de una membrana a causa de un exceso de cationes en un lado de la membrana y de aniones en el otro lado.
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Modificación de la actividad enzimática: Inhibición o inducción de la actividad catalítica de una enzima.
\newpage
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2º mensajero: Molécula pequeña que se forma en el citosol o penetra en el mismo como respuesta a una señal extracelular y que ayuda a transmitir la información al interior de la célula, por ejemplo cAMP, IP_{3}.
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Sonda (genética): Designación para todo tipo de ácidos nucleicos con cuya ayuda se puede detectar un gen buscado o una secuencia de DNA determinada. Además, mediante derivación de la sonda genética (por ejemplo biotina, perlas magnéticas, digoxinina) se pueden extraer moléculas de DNA de una mezcla. Como sondas se utilizan genes clonados, fragmentos génicos, oligonucleótidos sintetizados químicamente y también RNA, que en la mayoría de los casos está marcado de forma radiactiva.
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DNA: Designación internacional para el ácido desoxirribonucleico.
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DNA genómico: Designación general para el DNA procedente del núcleo de una célula en organismos eucarióticos.
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cDNA: Abreviatura de complementary DNA. Designación para la copia de DNA de cadena simple o doble de una molécula de RNA.
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Banco/librería de cDNA: Designación para una colección de fragmentos de cDNA clonados de forma arbitraria que, en conjunto, representan la totalidad de RNAs sintetizados de una célula o un tejido.
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Clon de cDNA: Designación para una población de células genéticamente uniformes que se derivan de una única célula, de tal modo que esta célula contiene un fragmento de cDNA incorporado de forma artificial.
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Hibridación: Formación de una molécula de ácido nucleico de cadena doble a partir de dos cadenas simples independientes mediante emparejamiento de bases.
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Condiciones estrictas: Condiciones bajo las que sólo se forman cadenas de ácido nucleico con un emparejamiento de bases perfecto que permanecen estables.
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Aislar: Localizar y separar de una mezcla una molécula buscada.
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Secuenciación de DNA: Determinación de la sucesión de bases en una molécula de DNA.
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Secuencia de ácido nucleico: Designación para la estructura primaria de una molécula de DNA; es decir, la sucesión de las bases individuales de las que está compuesto un DNA.
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Cebador de oligonucleótido específico de gen: Ácidos oligonucleicos, es decir, fragmentos de ácido nucleico con una longitud de 10-40 bases, que permiten en su composición de bases una hibridación estricta en el gen o el cDNA buscado.
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Descubrimiento de cebadores de oligonucleótido: La búsqueda manual o asistida por ordenador de oligonucleótidos para una secuencia de DNA predeterminada, que sean óptimamente adecuados para una hibridación y/o una reacción en cadena de polimerasa.
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PCR: Abreviatura de reacción en cadena de polimerasa. Procedimiento in vitro para el enriquecimiento selectivo de regiones de ácido nucleico de longitud y secuencia definidas de una mezcla de moléculas de ácido nucleico.
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DNA-molde: Molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas de ácido nucleico a partir de las cuales se multiplica una sección de DNA con ayuda de una PCR (véase más arriba).
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RNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos.
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mRNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos mensajeros que intervienen en la transferencia de la información genética del núcleo en la célula y que contienen la información para la síntesis de un polipéptido o una proteína.
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Polinucleótido antisentido: Molécula consistente en varios ácidos nucleicos naturales o modificados cuya sucesión de bases es complementaria a la sucesión de bases de una región parcial de un RNA presente en la naturaleza.
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PNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos nucleicos peptídicos. En este contexto, los aminoácidos enlazados peptídicamente forman una cadena, portando los aminoácidos como cadena lateral una base apta para la hibridación con DNA o RNA.
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Secuencia: Sucesión de nucleótidos o aminoácidos. En el sentido específico de esta invención, con este término se hace referencia a la secuencia de ácidos nucleicos.
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Ribozima: Designación para un ácido ribonucleico catalíticamente activo (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
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DNA-enzima: Designación para una molécula de DNA que posee actividad catalítica (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
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RNA/DNA catalítico: Designación general para ribozimas o DNA-enzimas (véase más arriba).
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Adenovirus: Virus citopatógenos presentes en los vertebrados.
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Virus adenoasociado (AAV): Forma parte de la familia de los parvovirus. Para lograr una reproducción eficaz del AAV es necesaria una coinfección de las células huésped con virus auxiliares (por ejemplo herpesvirus, virus de vaccinia o adenovirus). La propiedad del AAV de integrarse de forma estable en el genoma huésped lo hace especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos.
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Herpesvirus: Patógeno viral de la infección herpes.
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Modificación postraduccional: Modificación en proteínas o polipéptidos realizada después de la traducción, por ejemplo fosforilación, glicosilación, amidación, acetilación o proteolisis.
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Glicosilar: Designación para la acción de añadir moléculas de azúcar individuales o cadenas de azúcar completas a proteínas.
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Fosforilar: Designación para la acción de añadir uno o más grupos fosfato a una proteína, preferentemente a los grupos OH de los aminoácidos serina, treonina o tirosina.
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Amidar: Designación para la acción de transformar una función carboxilo en una función amida, por ejemplo en la parte del aminoácido carboxi-terminal de un péptido o proteína.
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Proveer de anclaje de membrana: Modificación postraduccional de una proteína o de otra molécula orgánica de tal modo que ésta se une a la membrana de capa doble lipídica de las células mediante la adición de una molécula hidrófoba, convenientemente un ácido graso o un derivado del mismo.
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Segmentar: En este caso específico, la segmentación de un péptido o proteína en varias subsecuencias.
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Acortar: Acortar en una o varias partes una molécula consistente en varias partes individuales.
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Anticuerpos: Proteínas solubles o unidas a membranas celulares, designadas como inmunoglobulinas, con un sitio de unión específico para antígenos.
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Anticuerpos monoclonales: Anticuerpos con una selectividad extremadamente alta dirigidos contra un único determinante antigénico de un antígeno.
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Anticuerpos policlonales: Mezcla de anticuerpos dirigidos contra varios determinantes de un antígeno.
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Transgénico: Modificado genéticamente.
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Mamífero no humano: La totalidad de los mamíferos (clase de los Mammalia) excepto la especie humana.
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Célula germinal: Célula con genoma haploide que permite la formación de un nuevo organismo mediante fusión con una segunda célula germinal.
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Célula somática: Célula diploide como componente de un organismo.
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Introducción cromosómica: Intervención en la secuencia de nucleótidos a nivel cromosómico.
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Genoma: Definición general de la totalidad de los genes de un organismo.
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Ascendiente del animal: Un animal (el ascendiente) que, por transmisión de su material genético de forma natural o artificial, está emparentado en línea directa con otro animal (el descendiente).
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Expresable: Una molécula de ácido nucleico es expresable cuando incluye la información para la síntesis de una proteína o de un polipéptido y está provista de las secuencias reguladoras correspondientes que permiten la síntesis de esta proteína o polipéptido in vitro o in vivo. Cuando ya no se dan estas condiciones, por ejemplo por intervención en la secuencia codificadora, la molécula de ácido nucleico ya no es expresable.
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Roedor: Animal del orden de los Rodentia, por ejemplo la rata o el ratón.
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Identificable como sustancia reguladora del dolor: Sustancia que al ser incorporada en un organismo vivo produce un cambio de comportamiento que los especialistas designan como inhibidor del dolor (antinociceptivo, antihiperalgésico o antialodínico). En el caso del procedimiento de screening, este concepto se refiere a que la sustancia, durante el rastreo, debido a una mayor unión o provocación de una variación de un parámetro funcional, supera claramente, por ejemplo en un 100%, a la unión o la interacción de la media de las sustancias ensayadas.
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Compuesto: Otro nombre para una molécula consistente en varios átomos. En este caso una molécula identificable mediante el procedimiento según la invención.
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Principio activo: Un compuesto que al ser administrado a un organismo provoca un cambio en dicho organismo. Por este concepto se entienden principalmente moléculas sintetizadas de forma orgánica-química que tienen un efecto curativo en el organismo. En este caso particular se trata de moléculas que se unen a las proteínas y péptidos utilizados según la invención.
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De bajo peso molecular: Molécula con un peso molecular < 2kDa.
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Medicamento: Una sustancia correspondiente a la definición del Artículo 1 &sect;2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos.
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Diagnóstico: Compuesto o procedimiento a utilizar para diagnosticar una enfermedad.
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Tratamiento del dolor: Procedimiento destinado a mitigar o eliminar dolores, o para inhibir la aparición esperable de dolores (analgesia preventiva).
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Dolor crónico: Una sensación de dolor de duración prolongada, frecuentemente caracterizada porque va más allá del momento y el lugar del estímulo inicial y aumenta la sensibilidad del cuerpo al dolor.
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Terapia genética: Por "terapia genética" se entienden todos los procedimientos que tienen el objetivo de tratar de forma causal enfermedades genéticas mediante modificaciones adecuadas del genoma.
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Terapia genética in vivo : Introducción de material genético en el organismo vivo con objeto de una terapia genética. Se puede distinguir entre intervención somática e intervención en la línea germinal, que tienen lugar en un caso en células diploides y en el otro en células haploides.
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Terapia genética in vitro : Introducción de material genético en células fuera del cuerpo humano con el fin de usar éstas posteriormente para la terapia genética introduciéndolas de nuevo en el cuerpo humano.
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Diagnosis: Procedimiento para identificar una enfermedad.
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Análisis de eficacia: Análisis para examinar la eficacia de un compuesto después de su actuación en un organismo vivo.
En una forma de realización preferente del procedimiento, la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso (a). En este proceso se introduce material genético en la célula, en particular una o más secuencias de polinucleótidos. En otra variante preferente de esta forma de realización, la manipulación por ingeniería genética permite medir como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo. En esta forma de realización, mediante manipulación por ingeniería genética se crean condiciones que permiten medir o mejorar la medida de la variación de un parámetro funcional. En este contexto es especialmente preferente que, mediante la manipulación por ingeniería genética, se exprese una proteína G no expresada de forma endógena o se introduzca un gen indicador. Por este concepto se ha de entender la introducción por ingeniería genética en la célula de una proteína G no se presente de forma endógena o no expresada fisiológicamente (proteína de unión a GTP) , por ejemplo la introducción de una proteína G quimérica, que permite una modificación de la vía de señales, o de una proteína G promiscua, que tiene mucha facilidad de unión. La introducción de un gen indicador a su vez permite medir una expresión inducida (provocada de forma extracelular) del producto genético.
En otra forma de realización preferente, la célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contenga como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%. De este modo se puede lograr por ejemplo que la célula sintetice una proteína que no es expresada de forma endógena en la célula o en el preparado utilizado en el procedimiento. En este contexto es especialmente preferente que el polinucleótido esté contenido en un constructo de DNA recombinante. Por el concepto "constructo de DNA (recombinante)" se entiende una molécula de DNA producida in vitro.
Cuando en el procedimiento la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso a), es preferible cultivar la célula después de la manipulación por ingeniería genética y antes del paso (a) bajo condiciones que permitan una expresión, dado el caso bajo presión de selección. Por "cultivar" se entiende mantener células o tejidos en condiciones que aseguran la supervivencia de las células o de su siguiente generación. Las condiciones deberían elegirse de tal modo que permitan una expresión del material introducido mediante manipulación por ingeniería genética. Para ello, el pH, el contenido de oxígeno y la temperatura se deberían mantener en niveles fisiológicos y se deberían añadir los nutrientes suficientes y los cofactores necesarios. La presión de selección permite cultivar únicamente aquellas células en las que la manipulación por ingeniería genética ha tenido éxito como mínimo en parte. En este concepto entra, por ejemplo, la incorporación de una resistencia a los antibióticos a través del constructo de DNA.
En el procedimiento según la invención es especialmente preferente que la célula utilizada sea una célula de anfibio, bacteriana, de levadura, de insecto o una célula de mamífero inmortalizada o nativa. Como ejemplos se mencionan: para las células de anfibio, oocitos de Xenopus; para las células bacterianas, células de E. coli; para las células de levadura, Saccharomyces cerevisiae; para células de insecto, células Sf9; para células de mamífero inmortalizadas, células HeLa; y para células de mamífero nativas, la célula CHO (Chinese Hamster Ovary - ovario de hámster chino).
En un primer método de medida utilizado según la invención para determinar la unión de la sustancia a una proteína en el procedimiento según la invención, la medida de la unión se realiza a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada. El ligando es una molécula que se une con alta especificidad a la proteína y que es desplazada del sitio de unión por una sustancia a ensayar que también se une a la proteína. Por "marcado" se ha de entender una modificación artificial en la molécula que facilita la detección. Los marcados son por ejemplo radiactivos, fluorescentes o luminiscentes.
En un segundo método de medida utilizado según la invención para determinar la modificación de los parámetros funcionales provocada por la unión de la sustancia a la proteína en el procedimiento según la invención, la medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo se lleva a cabo midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular midiendo la modificación de la expresión genética, del medio de iones, del pH o del potencial de membrana, a través de la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero. De este modo, por una parte se registra directamente la medida del efecto de la sustancia según su influencia en los receptores, canales de iones y/o enzimas, y, por otra parte, como ejemplos a medir de forma preferente, parámetros variables como la expresión genética, el medio de iones, el pH, el potencial de membrana, la actividad enzimática o la concentración del 2º mensajero. En este contexto, por "medio de iones" se entiende principalmente la concentración de uno o más iones en un compartimento celular, en particular en el citosol; por "potencial de membrana" se entiende la diferencia de carga entre los dos lados de una biomembrana; y por "2º mensajero" se entienden mensajeros de la vía de señales intracelular, por ejemplo AMP cíclico (cAMP), trifosfato de inositol (IP3) o diacilglicerol (DAG).
En una variante preferente del procedimiento, en los pasos (a) y (b) la proteína se selecciona entre:
-
PIM-1-quinasa;
-
una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 1b), 1d) o 1f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e), o a su polinucleótido antisentido.
En el procedimiento según la invención, aquí también está incluida la utilización de proteínas de secuencia y función conocidas, sin que en el estado actual de la técnica se conociera una función de los mismos en el campo del dolor.
De acuerdo con la invención también se utiliza un polinucleótido que se corresponde en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular en como mínimo 97%, a una de las secuencias de nucleótidos representadas en las Figuras 2a) y 2e). Aquí están incluidos los propios fragmentos de gen representados y también un polinucleótido que corresponda a la totalidad o como mínimo a partes de la secuencia codificadora del gen correspondiente al fragmento. Con ello también se quieren indicar los polinucleótidos cuya secuencia de bases presente una coincidencia de como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular de como mínimo un 97%, con la secuencia codificadora de los polinucleótidos representados o con la secuencia codificadora del gen.
Preferentemente, el polinucleótido consiste en RNA o en DNA de cadena simple o doble, en particular mRNA o cDNA.
El polinucleótido también consiste preferentemente en un polinucleótido antisentido o PNA que presenta una secuencia que se puede unir específicamente a un polinucleótido según la invención. PNA significa "peptidic nucleic acid" (ácido nucleico peptídico), que porta pares de bases pero cuyo esqueleto está unido peptídicamente. Un polinucleótido antisentido presenta la sucesión de bases complementaria como mínimo a una parte de las bases de un ácido nucleico. También es preferente que el polinucleótido forme parte de una ribozima o de otra DNA-enzima o de un RNA o DNA catalítico. Por "ribozima" se ha de entender un ácido ribonucleico catalíticamente activo y por "DNA-enzima" se ha de entender un ácido desoxirribonucleico correspondiente, es decir RNA o DNA catalítico.
En el sentido de esta invención también es posible la modificación postraduccional de la proteína utilizada, en particular que ésta haya sido glicosilada, fosforilada, amidada, metilada, acetilada, ADP-ribosilada, hidroxilada, provista de un anclaje de membrana, segmentada o acortada. Por ejemplo, Voet/Voet, Biochemistry, 1ª edición, 1990, pp. 935-938, da a conocer modificaciones postraduccionales.
Un compuesto identificable mediante un procedimiento según la invención es preferentemente una sustancia reguladora del dolor. En este contexto, el término "compuesto" se refiere sobre todo a principios activos de bajo peso molecular, pero también a péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. El término "identificable" significa que el compuesto presenta la característica consistente en que, en lo que respecta a la unión en el procedimiento de screening según la invención, se une de forma claramente más intensa, preferentemente con el doble de intensidad, que la media de las sustancias de ensayo, o que, en lo que respecta a la variación de los parámetros funcionales, se desvía claramente de la media de las sustancias de ensayo.
En una forma de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, en una parte del procedimiento, la proteína de los pasos (a) y (b) se selecciona entre:
-
PIM-1-quinasa;
-
una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 1b), 1d) o 1f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e), o a su polinucleótido antisentido;
Y, en otra parte del procedimiento, la proteína de los pasos (a) y (b) se selecciona entre:
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PIM-2-quinasa,
o
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PIM-3-quinasa;
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una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 2d) o 2f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e), o a su polinucleótido antisentido;
y, acto seguido, en la mayoría de los casos, los resultados del paso b) de las dos partes de procedimiento se someten a comparación diferencial.
En suma, un importante fundamento de la invención consiste en la identificación de genes y fragmentos de gen reguladores del dolor. El procedimiento de screening se basa en ello. A continuación se explican otros ejemplos de realización.
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1. Terapia del dolor crónico
Se examinó la expresión del mRNA de las quinasas mediante hibridación in situ en tejido de la médula espinal. En la médula espinal, las neuronas sensoriales primarias se proyectan en neuronas del sistema nervioso central posteriores; además de los procesos supraespinales, se trata de la sinapsis central para la información nociceptiva. Numerosos experimentos han demostrado que tras el desarrollo de estados de dolor crónicos subyacen modificaciones plásticas del sistema nervioso (para una idea general, véase Corderre y col., 1993; Zimmermann y Herdegen, 1996). En particular, se han descrito modificaciones plásticas en las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal y de la médula espinal que van acompañadas de la regulación de genes relevantes para el dolor. Por ejemplo, se ha descrito una regulación génica en la médula espinal en relación con una serie de neurotransmisores-receptores importantes para la terapia del dolor (véase la Tabla 1). En base a esto, las secuencias de cDNA reguladas por el dolor encontradas se podrían utilizar para la terapia (terapia genética, antisentido, ribozima) y la diagnosis de estados de dolor crónicos.
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1.1. Estrategias antisentido
En este caso se elaboran constructos que pueden reducir el mRNA o la concentración de proteínas y que se derivan de la secuencia de ácido nucleico de cDNA completo o de regiones parciales. Estos constructos pueden consistir, por ejemplo, en oligonucleótidos antisentido (DNA o RNA) que, dado el caso utilizando componentes de nucleótido modificados (por ejemplo O-alilribosa), presentan una alta estabilidad frente a las nucleasas. También es concebible la utilización de ribozimas que, como moléculas de RNA enzimáticamente activas, catalicen una segmentación específica de RNA. Además, se podrían utilizar vectores que expresen las secuencias utilizadas según la invención de dichas secuencias de nucleótidos bajo el control de un promotor adecuado y que, en consecuencia, sean adecuados para una terapia in vivo o ex vivo. Adicionalmente también son posibles constructos antisentido que, mediante sustitución del esqueleto fosfato de secuencias de nucleótidos (por ejemplo PNA, es decir, ácidos nucleicos peptídicos) o mediante utilización de bases no tradicionales como inosina, queosina o wybutosina y también formas acetil-, metil-, tio- modificadas de adenina, citidina, guanosina o timidina y uridina y similares, no puedan ser descompuestos por nucleasas endógenas o sólo puedan serlo en escasa medida.
1.2. Antagonistas/agonistas o inhibidores/activadores de los productos genéticos utilizados según la invención en el procedimiento de screening
Aquí están incluidas sustancias que cuando se unen al producto genético modifican la función del mismo. Éstas pueden ser:
1.2.1. Moléculas organico-químicas halladas en el marco de un screening de principios activos utilizando los productos genéticos de los cDNA utilizados según la invención como pareja de unión.
1.2.2. Anticuerpos, ya sean policlonales, quiméricos, de cadena simple, fragmentos de F_{ab} o fragmentos de bancos de fago, que influyen específicamente en la función de los productos genéticos preferentemente como anticuerpos neutralizantes a través de una unión.
1.2.3. Aptámeros, es decir, ácidos nucleicos o derivados de ácidos nucleicos con propiedades de unión a proteínas. También pertenecen a este grupo los llamados "especulómeros", que representan oligonucleótidos inversos y, por consiguiente, estables, obtenidos mediante evolución especular, que se pueden unir con alta afinidad y alta especificidad a una molécula diana (Klussmann y col., 1996).
1.3. Terapia genética
Las secuencias descritas se pueden utilizar para la terapia de enfermedades neurológicas, en particular de estados de dolor crónicos, empleándolas, después de una clonación en vectores adecuados (por ejemplo vectores de adenovirus o vectores de virus adenoasociados), para la terapia in vivo o ex vivo, con el fin de contrarrestar una sobreexpresión o subexpresión del producto genético endógeno, corregir la secuencia del producto genético defectuoso (por ejemplo mediante transegmentación con el constructo exógeno) o de poner a disposición un producto genético
funcional.
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2. Diagnosis
Algunas secuencias de polinucleótidos (oligonucleótidos, moléculas de DNA y RNA antisentido, PNA) derivadas de las secuencias de nucleótidos utilizadas en procedimientos de screening, etc. se podrían utilizar para la diagnosis de estados o enfermedades asociados con la expresión de dichas secuencias genéticas. Ejemplos de estos estados o enfermedades comprenden enfermedades neurológicas que incluyen dolores crónicos o neuropáticos (provocadas por ejemplo por diabetes, cáncer o SIDA), o enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, corea de Huntington, Creutzfeld-Jacob, esclerosis lateral amiotrófica y demencias. Las secuencias de nucleótidos pueden emplearse de múltiples modos (Northern Blot, Southern Blot, análisis FISH, análisis PRINS, PCR), bien para identificar los productos genéticos o productos genéticos anormales relevantes para la diagnosis, bien para cuantificar el producto genético. Además del diagnóstico por ácidos nucleicos, para el diagnóstico también se pueden emplear anticuerpos o aptámeros contra la proteína codificada por los ácidos nucleicos utilizados según la invención (por ejemplo mediante ELISA, RIA, procedimientos inmunocitoquímicos o inmunohistoquímicos), con el fin de identificar la proteína o sus formas anormales y de cuantificarla.
En lo que respecta a un diagnóstico genético, se podrían emplear sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias de nucleótidos utilizadas según la invención para determinar el locus del gen (por ejemplo mediante FISH, FACS, cromosomas artificiales como YAC, BAC o constructos P1).
Los siguientes ejemplos y figuras explican más detalladamente la invención sin limitarla a los mismos.
Figuras y Ejemplos Figuras
Figura 1a) Secuencia de cDNA de PIM1-quinasa, humano; AN: NM_002648.
Figura 1b) Secuencia de aminoácidos de PIM1-quinasa, humano; AN: NP_002639.
Figura 1c) Secuencia de cDNA de PIM1-quinasa, rata; AN: NM_017034.
Figura 1d) Secuencia de aminoácidos de PIM1-quinasa, rata; AN: NP_058730.
Figura 1e) Secuencia de cDNA de PIM1-quinasa, ratón; AN: NM_008842.
Figura 1f) Secuencia de aminoácidos de PIM1-quinasa, ratón; AN: NP_032868.
Figura 2a) Secuencia de mRNA similar a la PIM3-quinasa, humano; AN: BC017083.
Figura 2c) Secuencia de cDNA de PIM3-quinasa, rata; AN: NM_022602.
Figura 2d) Secuencia de aminoácidos de PIM3-quinasa, rata; AN: NM_072124.
Figura 2e) Secuencia de cDNA de PIM3-quinasa, ratón; AN: BC017621.
Figura 2f) Secuencia de aminoácidos de PIM3-quinasa, ratón; AN: BC017621.
Figura 3) Expresión de mRNA de las PIM-quinasas en la médula lumbar de ratas adultas; véase el Ejemplo 1a).
Figura 4) Variaciones de la expresión genética de PIM-1 en la médula espinal (L5) después de ligadura del ciático (Bennett); véase el Ejemplo 1b).
Figura 5) Nivel de mRNA de PIM-1 en la médula lumbar (L5) después de ligadura de Bennett.
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Evaluación cuantitativa de los resultados de hibridación in situ.
Figura 6) Patrón de expresión de mRNA de las PIM-quinasas en el asta dorsal de la médula espinal.
Figura 7) Expresión de mRNA de las PIM-quinasas en el ganglio espinal.
Figura 8) Localización de la expresión genética de PIM-1 en el ganglio espinal (L6) de la rata con hibridación in situ.
Figura 9) Variaciones del nivel de mRNA de PIM-1, PIM-2 y PIM-3 en el ganglio espinal L6 después de artritis CFA bilateral.
Análisis densitométrico de las bandas teñidas con bromuro de etidio para PIM-1, PIM-2, PIM-3 y GAPDH después de separación electroforética de los productos de PCR (25 ciclos).
Representación de los valores de medida como el cociente entre PIM-1 y GAPDH, o PIM-2/GAPDH, o PIM-3/GAPDH.
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Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de genes regulados por el dolor
Se eligió el siguiente procedimiento:
Como punto de partida para el aislamiento de genes reguladores del dolor se eligió el llamado modelo de formalina en ratas, en el que se inyecta formalina en la pata de la rata. El tejido diana en el que se demostró la expresión regulada por dolor de los genes utilizados según la invención consistía en la parte dorsal de la médula espinal de la rata en los segmentos L3-L6.
Modelo animal: La prueba de formalina representa un modelo adecuado para el campo del dolor inflamatorio/persistente (Duibisson y col., 1997). Aquí se inyectaron 50 \mul de solución de formalina al 5% unilateralmente en la pata trasera de ratas Wistar adultas y los animales fueron sacrificados 24 horas después de la inyección para la toma de muestras de tejido. Paralelamente, en la pata trasera de los animales control se inyectó una solución isotónica de sal común.
Toma de muestras de tejido: Se decapitan los animales, se extrae la columna vertebral, se preparan secciones de la médula espinal y éstas se hibridan con anticuerpos marcados específicos contra las PIM-quinasas.
Ejemplo 1a) con respecto a la Figura 3)
Autorradiogramas de película radiográfica digitalizados de secciones congeladas a través de la médula espinal (plano L5) después de hibridación in situ con sondas de RNA marcadas con ^{35}S específicas. El tiempo de exposición de las películas radiográficas fue de 72 horas. La expresión de PIM-1 bajo condiciones normales es relativamente baja (A). En comparación, la PIM-2 muestra una expresión constitutiva fuerte (B) con una dominancia clara en la sustancia gris (sobre todo en el asta dorsal superficial y en las neuronas motoras del asta delantera). El mRNA de PIM-3 está distribuido a lo largo de toda la sección (C), con señales más fuertes sobre las áreas neuronales y señales débiles sobre la sustancia blanca.
Ejemplo 1b) con respecto a la Figura 4
Expresión genética de PIM-1 intensificada en la médula espinal después de ligadura del ciático. Las secciones congeladas digitalizadas a través de la médula lumbar de animales 7 días después de la ligadura de Bennett (B) muestran, después de hibridación con una sonda de PIM-1 marcada de forma radiactiva, un claro aumento del nivel de mRNA de PIM-1 en la mitad de la médula espinal ipsilateral a la ligadura (flecha), tanto en el asta dorsal como en la delantera. En los animales sometidos a operación Sham (A) no se observa este aumento.
Ejemplo 1c) con respecto a la Figura 5
Análisis semicuantitativo del nivel de mRNA de PIM-1 en las diferentes regiones de la médula espinal de animales sometidos a operación Sham y de animales 7 días después de la ligadura de Bennett.
Después de digitalizar las secciones congeladas sometidas a hibridación con una sonda específica de PIM-1 (sistema de análisis de imágenes MCID, Imaging Research, Canadá), se registran por densitometría las señales de hibridación radiactivas. Los valores de medida se transforman en nCi/g tejido después de establecer una curva estándar.
Para establecer una curva estándar, unos portaobjetos con tiras de plástico ^{14}C con contenido radiactivo definido (American Radiolabaled Chemical Inc.) junto con las secciones sometidas a hibridación se exponen a película radiográfica durante períodos de tiempo iguales.
En cada caso se analizaron las regiones contralaterales e ipsilaterales del asta dorsal y del asta delantera.
Para el grupo de los animales sometidos a operación Sham se realizaron 9 medidas por región. Para el grupo examinado después de la ligadura de Bennett se realizaron 17 medidas.
Ejemplo 1d) con respecto a la Figura 6
Fotografías de campo oscuro de alta definición del asta dorsal superficial ipsilateral a la ligadura del ciático después de hibridación con sondas específicas de PIM (A, C, E) y tinción de contraste con violeta de cresilo (B, D, F). Las secciones sometidas a hibridación con PIM-1 muestran una expresión específica "layer" de PIM-1 en las láminas 2 y 3 (A, B). Las transcripciones de PIM-2 están expresadas con una intensidad relativa sobre todo en la lámina 1 y la lámina y en todo el asta dorsal (D, E). En cambio, la expresión de PIM-3 no es tan intensa en el asta dorsal superficial, sino que se produce en la lámina 3 y en las secciones más profundas (E, F).
Ejemplo 1e) con respecto a la Figura 7
Autorradiogramas de película radiográfica digitalizados de secciones congeladas a través de un ganglio espinal lumbar (L6) después de hibridación in situ con sondas de RNA marcadas con ^{35}S específicas. El tiempo de exposición de las películas radiográficas fue de 72 horas.
Bajo condiciones normales, en el ganglio espinal se expresan las tres PIM-quinasas (A, C, D). Las sondas en orientación sentido, mostradas en este caso en el ejemplo para PIM-1 (B), no producen ninguna señal de hibridación específica. En comparación, la expresión de PIM-3 es más intensa (D).
Para los análisis RT-PCR se extirparon los ganglios espinales (L6) de ambos lados de 5 animales de control y se reunieron para la extracción del RNA total. Para la extracción de RNA se utilizó Trizol (Gibco-BRL). Antes de la realización de la transcripción inversa se llevó a cabo un tratamiento con DNAsa I.
Para la transcripción inversa con Supersript II (Gibco-BRL) se utilizaron 2,5 \mug del RNA total aislado en una reacción de 50 \mul.
La amplificación por PCR se llevó a cabo en un Thermocycler 9700 (Perkin Elmer) de acuerdo con el siguiente programa:
1 ciclo a 95ºC, 3 minutos; 40 ciclos (94ºC, 45 segundos; 60ºC, 45 segundos; 72ºC, 60 segundos); 1 ciclo a 72ºC, 7 minutos.
Como matriz se utilizaron, en cada caso, 7,5 \mul del cDNA (50 ng/\mul).
Los amplicones específicos para PIM-2 (518 pb) y PIM-3 (612 pb) tenían los tamaños esperados; GAPDH. Como controles negativos se llevaron a cabo reacciones RT suprimiendo la transcriptasa inversa.
Ejemplo 1f) con respecto a la Figura 8
La hibridación de secciones congeladas con sondas específicas de PIM-1 muestra señales de hibridación específicas a través de regiones del ganglio espinal ricas en células (fotografía de campo oscuro en A). La alta resolución microscópica en el campo claro confirma que las señales en las secciones con tinción de contraste de violeta de cresilo se localizan principalmente a través de las células neuronales (B).
Ejemplo 1g) con respecto a la Figura 9
Se extirparon los ganglios espinales (L6) de ambos lados de 5 animales y se reunieron para la extracción del RNA total.
Para la extracción de RNA se utilizó Trizol (Gibco-BRL). Antes de la realización de la transcripción inversa se llevó a cabo un tratamiento con DNAsa I.
Para la transcripción inversa con Supersript II (Gibco-BRL) se utilizaron 2,5 \mug del RNA total aislado en una reacción de 50 \mul.
La amplificación por PCR se llevó a cabo en un Thermocycler 9700 (Perkin Elmer) de acuerdo con el siguiente programa:
1 ciclo a 95ºC, 3 minutos; 40 ciclos (94ºC, 45 segundos; 60ºC, 45 segundos; 72ºC, 60 segundos); 1 ciclo a 72ºC, 7 minutos.
Como matriz se utilizaron en cada caso 7,5 \mul del cDNA (50 ng/\mul).
Después de 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 ciclos se tomó, en cada caso, una muestra de 10 \mul de la reacción de PCR y se separó mediante electroforesis en gel para determinar el campo lineal de la amplificación. Los geles teñidos con bromuro de etidio se digitalizaron y las bandas de PCR se midieron por densitometría.
Los amplicones específicos para ello tenían los tamaños esperados (PIM-1, 550 pb; PIM-2, 518 pb; PIM-3, 612 pb; GAPDH, 227 pb).
Para registrar la variación de la expresión de PIM después de CFA se calcularon los cocientes entre los amplicones específicos (PIM-1, PIM-2, PIM-3) y el GAPDH no regulado de cada grupo de ensayo.
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Análisis de expresión completo de los tres miembros de la familia de las Pim-quinasas: PIM1, PIM2 y PIM3
A continuación se muestra en forma de tabla el análisis de expresión completo de los tres miembros de la familia de las Pim-quinasas: PIM1, PIM2 y PIM3.
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3 
\newpage
Los resultados de ISH muestran los siguientes patrones de expresión para las PIM-quinasas:
\bullet
Una localización neuronal de mRNA de PIM-1, PIM-2 y PIM-3 en la médula espinal (ISH, RT-PCR).
\bullet
Una expresión neuronal de mRNA de PIM-1, PIM-2 y PIM-3 en los DRG de la rata. Parece que también se encuentran PIM-2 y PIM-3 en células no neuronales. Los datos inmunohistoquímicos muestran la proteína PIM-1 en neuronas de los DRG y la proteína PIM-2 en neuronas de los DRG y en células de la glía.
En el caso del PIM-1 se pudo detectar una mayor expresión de mRNA en varios modelos de dolor:
\bullet
Aumento del nivel del mRNA de PIM-1 en extractos de DRG en el modelo CFA.
\bullet
Aumento del nivel de mRNA de PIM-1 en el asta dorsal después de ligadura del ciático de la rata. También se observa un aumento del nivel en áreas de neuronas motoras del asta delantera.
\bullet
Aumento del nivel de PIM1 en dolor neuropático en microglía (C1q) y en neuronas.
\bullet
A diferencia del PIM-1, el PIM-2 ya presenta una expresión constitutiva bastante intensa en el asta dorsal, y el pequeño aumento de nivel observado en el modelo de Bennett después de la evaluación estadística no era significativo.
\bullet
Aumento de la inmunorreactividad de PIM-1 neuronal en el asta dorsal en el modelo de Chung.
\bullet
El mRNA de PIM-3 se expresa en el asta dorsal profundo y en el asta delantera tanto en neuronas como en la glía, pero no se regula después de lesión.
Ejemplo 2 Realización del procedimiento de screening con medida de la Unión a través del desplazamiento de un ligando marcado de forma radiactiva
Una sección de ácido nucleico codificadora de la PIM1-quinasa se clona en un vector de expresión que permite una expresión constitutiva (por ejemplo promotor CMV) o una expresión inducible en células eucarióticas. El DNA se introduce en células eucarióticas (por ejemplo células CHO, células HEK293 o células NIH-3T3) con procedimientos de transfección adecuados, por ejemplo con lipofectamina (firma Roche Diagnostics). Las células se cultivan en presencia de un reactivo de selección (por ejemplo zeocina, higromicina o neomicina) de modo que sólo sobreviven las células que han absorbido el constructo de DNA y, en caso de una selección más duradera, también lo han incorporado en el genoma.
A partir de estas células se obtienen fracciones de membrana que contienen una mayor cantidad de PIM1-quinasa y que pueden ser utilizadas para un ensayo de unión. Éste consiste en 1.) membranas que contienen la PIM-quinasa; 2.) un ligando marcado de forma radiactiva; 3.) un tampón de unión (por ejemplo 50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA) y el ligando analizado en cuanto a la unión. Después de la incubación de las mezclas de reacción arriba mencionadas (por ejemplo durante 30-60 minutos) a una temperatura adecuada (en la mayoría de los casos temperatura ambiente), las moléculas de ligando radiactivas no unidas se separan por filtración. La cantidad restante de ligando unido se mide en un \beta-counter (por ejemplo Trilux, firma Wallac) después de añadir un cóctel de escintilación. Si la sustancia de ensayo presenta una unión con la PIM1-quinasa, ésta se detecta como incorporación radiactiva reducida. Este procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para realizarlo mediante un robot en el denominado procedimiento "hightroughput screening" (HTS) (screening de alto rendimiento).
Ejemplo 3 Realización del procedimiento de screening con medida de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia
Una sección de ácido nucleico que codifica la proteína quinasa PIM-1 se clona en un vector de expresión que permite una expresión inducible en procariotas, por ejemplo en E. coli. La sección de ácido nucleico se modifica de tal modo que es expresada como proteína de fusión con una secuencia de aminoácidos N-terminal o C-terminal adicional. Esta secuencia debería permitir, sin modificación de la función de la quinasa PIM-1, una purificación a través de un procedimiento específico, por ejemplo fragmento de glutatión S-transferasa, que posibilita el aislamiento a partir de la mezcla de proteínas mediante unión al glutatión. Después de transfección de las bacterias, inducción del gen (por ejemplo con IPTG en el promotor lac) y desintegración de las bacterias, las proteínas de fusión se purifican y se utilizan en un experimento de quinasa in vitro. Para ello, 5 \mug de proteína se tratan a 30ºC durante 30 minutos en 50 \mul de tampón quinasa (20 mM PIPES, pH 7,0, 5 mM MnCl_{2}, 7 mM \beta-mercaptoetanol, 0,4 mM espermina, 10 mM rATP) completados con 10 \muCi [\gamma^{32}P]-ATP. Como sustrato se añade proteína histona H1 purificada (firma Sigma) o proteína de fusión GST-NFATc1 expresada de forma bacteriana. Después del tiempo de incubación, el [\gamma-^{32}P]-ATP no incorporado se separa por filtración y la cantidad de ^{32}fosfato incorporado se determina por escintilación \beta (Trilux, firma Wallac). En un experimento para descubrir nuevos inhibidores de la quinasa PIM-1, las sustancias de ensayo se incuban junto con esta carga y se utiliza la disminución de la incorporación de ^{32}P como indicador de inhibición. Este procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para realizarlo mediante un robot en el denominado procedimiento "hightroughput screening" (HTS).
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Ejemplo 4 Ejemplo de medicamento que contiene un compuesto. Formulación en pastillas
Las pastillas se pueden producir mediante compresión directa de una mezcla del compuesto identificado de acuerdo con un procedimiento según la invención con los materiales auxiliares correspondientes o mediante la compresión de granulados que contienen el compuesto (en caso dado con otros materiales auxiliares). Los granulados se pueden obtener bien por granulación en húmedo, por ejemplo con líquidos de granulación acuosos, y secado subsiguiente de los granulados, bien por granulación en seco, por ejemplo mediante compactación.
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4 
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Se prepara una mezcla homogénea del principio activo con los materiales auxiliares y ésta se comprime en una prensa para obtener pastillas con un ø; de 10 mm.
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5 
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Se prepara una mezcla homogénea del compuesto con la celulosa microcristalina y la I-HPC y se compacta. Después de tamizar los productos de compresión, el granulado formado se mezcla con estearato de magnesio y dióxido de silicio y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un ø de 9 mm.
6
Se prepara una mezcla homogénea del principio activo con la celulosa microcristalina y la crospovidona y se granula en un granulador con una solución acuosa de povidona. A continuación, el granulado húmedo se vuelve a someter a granulación y después de secado se somete a un secado adicional en un armario de secado (50ºC) durante 10 horas. El granulado seco se tamiza junto con el estearato de magnesio, se somete a mezcla final y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un ø de 8 mm.
Ejemplo 5 Ejemplo de medicamento que contiene un compuesto identificado de acuerdo con un procedimiento según la invención. Solución parenteral
1 g de un compuesto identificado de acuerdo con un procedimiento según la invención se disuelve a temperatura ambiente en 1 l de agua para inyección y a continuación se ajusta a condiciones isotónicas mediante adición de NaCl (cloruro de sodio).
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<120> Procedimiento de screening con PIM1-quinasa o PIM3-quinasa
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<130> GRA 3064-PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP02/05234
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<141> 2002-05-13
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<150> DE 101 23 055.9
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<151> 2001-05-11
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<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2623
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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7
8 
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<210> 2
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<211> 313
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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9
10 
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<210> 3
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<211> 1302
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
\newpage
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<400> 3
11 
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<210> 4
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<211> 313
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 4
12
13 
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<210> 5
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<211> 942
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<212> DNA
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<213> Mus musculus 
\newpage
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<400> 5
14 
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<210> 6
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<211> 313
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 6
15
16 
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<210> 7
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<211> 2133
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 7
17
18 
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<210> 8
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<211> 326
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 8
19
20
21 
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<210> 9
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<211> 1176
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 9
22 
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<210> 10
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<211> 2447
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<212> DNA
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<213> Mus musculus 
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<400> 10
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24 
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<210> 11
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<211> 326
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
\newpage
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<400> 11
25
27

Claims (10)

1. Procedimiento para descubrir sustancias reguladoras del dolor, es decir, sustancias que influyen directa o indirectamente en la percepción del dolor, que incluye los siguientes pasos:
(a)
incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con una célula y/o con un preparado celular que ha sintetizado la proteína PIM-1-quinasa o la PIM-3-quinasa, y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o a sus polinucleótidos antisentido;
(b)
medida de la unión de la sustancia de ensayo a la proteína sintetizada por la célula, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo a la proteína, midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular a través de la medida de la modificación de la expresión genética, el medio de iones, el pH o el potencial de membrana, mediante modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o
mediante la medida de la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso (a).
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la manipulación por ingeniería genética permite la medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque mediante la manipulación por ingeniería genética se expresa una proteína G no expresada de forma endógena o se introduce un gen indicador.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contiene como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el polinucleótido está contenido en un constructo de DNA recombinante.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque, después de la manipulación por ingeniería genética según la reivindicación 2 y antes del paso (a) según la reivindicación 1, la célula se cultiva bajo condiciones que permiten una expresión, dado el caso bajo presión de selección.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula es una célula de anfibio, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero inmortalizada o nativa.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque en los pasos (a) y (b) la proteína se selecciona entre:
-
la PIM-1-quinasa;
-
una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 1b), 1d) o 1f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e), o a su polinucleótido antisentido.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, en una parte del procedimiento, la proteína de los pasos (a) y (b) se selecciona entre:
-
la PIM-1-quinasa;
-
una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 1b), 1d) o 1f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c) o 1e), o a su polinucleótido antisentido;
y en otra parte del procedimiento la proteína de los pasos (a) y (b) se selecciona entre:
-
la PIM-2-quinasa,
o
-
la PIM-3-quinasa;
-
una proteína codificada por un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%;
-
una proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 2d) o 2f), o una proteína similar a éstas en como mínimo un 90%, preferentemente un 95%, en particular un 97%; y/o
-
una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las figuras 2a), 2c) o 2e), o a su polinucleótido antisentido;
y los resultados del paso b) de las dos partes de procedimiento se someten a comparación diferencial.
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