ES2279278T3 - Procedimiento de screening para diversas aplicaciones que utiliza dnpi. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la localización de sustancias farmacéuticamente relevantes con eficacia en las indicaciones o para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de las neuronas motoras espinales, atrofias musculares, distrofias musculares o esclerosis múltiple, con los siguientes pasos de procedimiento: (a) incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre: la proteína DNPI y/o una proteína según una de las Figuras 2b), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos como mínimo en un 90 %, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o a su polinucleótido antisentido, y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetizacomo mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, (b) medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o con un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular midiendo la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o midiendo la unión por el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula y/o proteína y/o por la actividad de una sustancia de ensayo marcada unida con ésta.

Description

Procedimiento de screening para diversas aplicaciones que utiliza DNPI.

La invención se refiere a un procedimiento para encontrar sustancias farmacéuticamente relevantes utilizando DNPI o biomoléculas derivadas de éste.

La localización de los lugares de ataque de los principios activos farmacéuticos, denominados "dianas" (targets), es una de las más importantes misiones de la investigación farmacéutica moderna. Mediante la afinidad con estas dianas o también mediante los efectos fisiológicos provocados por la interacción con tales dianas, gracias a los denominados "procedimientos de screening" (rastreo), de entre las numerosas sustancias conocidas se pueden concretar, por ejemplo a partir de bibliotecas de sustancias de investigación farmacéutica, sustancias o tipos de sustancias interesantes que, muy probablemente, serán eficaces en las indicaciones asociadas con la diana correspondiente. Entre los ejemplos más importantes de estas dianas se encuentran proteínas, en general receptores, en particular los receptores acoplados con la proteína G, y proteínas de transporte. Sin embargo, en parte, la localización de estas dianas es muy difícil ya que la selección potencial es muy grande. Por una parte, para la orientación e identificación se emplean estudios basados en la función (fisiológica) con su posición (potencial) en cascadas de señales y rutas metabólicas, pero, por otra parte, también se emplea la localización y el grado de expresión en los diferentes tejidos. En el marco de esta invención se presta una atención especial al sistema nervioso central, donde no sólo es importante una localización general, sino también una distribución muy específica y precisa en las diferentes regiones.

Si bien en el estado actual de la técnica se discuten procedimientos para la localización de dianas, en ningún caso se ha descrito una relación entre el DNPI, los principios activos derivados de éste y determinadas indicaciones. Por ejemplo, el documento WO 01/64835 A da a conocer secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos obtenidas en base a proyectos de secuenciación y también, de forma general e indeterminada, un procedimiento para la identificación de principios activos que se unen a los polipéptidos publicados. El procedimiento de screening mostrado en el documento WO 01/64835 A utiliza cualquiera de las más de 27.000 secuencias mencionadas potenciales, pero no establece ninguna relación entre éstas, en particular entre el DNPI, y una indicación determinada, ni describe principios activos identificados a través de estos procedimientos de screening (rastreo).

La publicación US-A-5 985 604 da a conocer la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de los cotransportadores de fosfato dependientes del sodio humanos, "human sodium-dependent phosphate cotransporters", NAPTR. El documento US-A-5 985 604 también describe procedimientos para la preparación de este polipéptido y para su detección a partir de una muestra. Sin embargo, dicho documento no describe ningún procedimiento para la identificación de principios activos que se unen con NAPTR ni tampoco describe ninguna relación con indicaciones determinadas. El documento US-A-5 985 604 tampoco describe ningún procedimiento para la identificación de principios activos mediante la utilización de DNPI.

El documento WO 01/57190 A describe la proteína epidérmica-1 humana, "human epidermal protein-1", aislada de cérvix adulta y procedimientos para la detección de polinucleótidos o polipéptidos de "epidermal protein-1" humana en una muestra. El documento WO 01/57190 A no describe el DNPI ni establece ninguna relación entre el DNPI e indicaciones determinadas.

Por consiguiente, el objetivo de la invención consistía en la localización e identificación de una o más dianas de este tipo, en particular localizadas y eficaces en el sistema nervioso central, y en el desarrollo del procedimiento de screening (rastreo) correspondiente. En consecuencia, la invención se refiere a un procedimiento para la localización de sustancias farmacéuticamente relevantes con eficacia en las indicaciones o para el tratamiento de

la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de la neuronas motoras espinales, atrofias musculares, distrofias musculares o esclerosis múltiple,

con los siguientes pasos de procedimiento:

(a)

incubación de la sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre:

la proteína DNPI y/o una proteína según una de las Figuras 2b), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éste en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o a su polinucleótido antisentido,

y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,

(b)

medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,

midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular mediante la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, midiendo la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero,

o

midiendo la unión por el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula y/o proteína y/o mediante la actividad de una sustancia de ensayo marcada unida con ésta.

Este nuevo procedimiento de screening (rastreo) se basa en que se puede encontrar la eficacia medicinal potencial de una sustancia a través de su interacción con como mínimo una estructura proteínica o peptídica fisiológicamente relevante, una diana, DNPI o estructuras relacionadas. El DNPI se denomina VGLUT2 en la literatura y en parte también en esta invención. Por consiguiente, estos términos se han de considerar como completamente equivalentes, en especial en el marco de esta invención. En el marco de esta invención, como dianas interesantes se identificaron el DNPI o las proteínas o los péptidos derivados de éste aquí enumerados, o ácidos nucleicos que codifican los mismos. El DNPI se encontraba en una localización de las áreas del SNC más diversas, pero sorprendentemente, a pesar de una cercanía estrechísima en parte, también presentaba siempre una localización separada de forma estricta, indicando claramente esta separación estricta que a través del DNPI se controlan importantes procesos fisiológicos. El mRNA de DNPI (VGLUT2) se encuentra sobre todo en neuronas medianas y pequeñas positivas a la sustancia P. La localización de VGLUT2 (DNPI) es totalmente independiente de la localización de los transportadores VGLUT1 y VGLUT3 afines. Dado que el DNPI está localizado en áreas del SNC muy interesantes desde el punto de vista terapéutico y que, en consecuencia, es interesante para una multitud de indicaciones correspondientes, el DNPI constituye por ello una diana importante con la que se pueden llevar a cabo procedimientos de screening (rastreo) de compuestos farmacológicamente eficaces. En consecuencia, en un procedimiento de screening (rastreo) también es preferible utilizar DNPI o una de las biomoléculas derivadas de éste, como proteínas o péptidos o ácidos nucleicos que codifican las mismas, o el resultado de dos procedimientos de screening (rastreo) independientes llevados a cabo con DNPI, o con una de las biomoléculas derivadas de éste aquí citadas, como una proteína o un péptido o un ácido nucleico que codifica las mismas, e identificar en ambos casos, mediante comparación diferencial de los datos, sustancias con una eficacia farmacológica optimizada, que en ese caso son altamente específicas.

Los conceptos "farmacéuticamente relevante" o "farmacológicamente eficaz" se refieren a una influencia potencialmente curativa o paliativa de la sustancia sobre determinados cuadros clínicos. El término "sustancia" incluye cualquier compuesto adecuado como principio activo medicamentoso, principalmente principios activos de bajo peso molecular, pero también otros como ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas, por ejemplo
anticuerpos.

Por "incubación bajo condiciones adecuadas" se ha de entender que la sustancia a examinar puede reaccionar con la biomolécula o con la célula o con el preparado correspondiente en medio acuoso durante un tiempo determinado antes de la medida. La temperatura del medio acuoso se puede regular, por ejemplo entre 4ºC y 40ºC, preferentemente entre temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo de incubación puede variar entre unos segundos y varias horas, dependiendo de la interacción de la sustancia con la biomolécula o con la proteína. No obstante, son preferentes tiempos de incubación de 1 minuto a 60 minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o sistemas tampón adecuados, de modo que durante la incubación en el medio reine un pH entre, por ejemplo, 6 y 8, preferentemente un pH 7,0-7,5. También se pueden añadir al medio otras sustancias adecuadas como coenzimas, nutrientes, etc. Los especialistas pueden determinar fácilmente las condiciones adecuadas en función de la interacción examinada de la sustancia con la proteína basándose en su experiencia, en la literatura o en algunos ensayos preliminares sencillos, con el fin de obtener el valor de medida más claro posible en el procedimiento.

Una célula que sintetiza una proteína o una biomolécula determinada es una célula que ya ha expresado esta proteína de forma endógena o una célula que ha sido modificada por ingeniería genética de tal modo que expresa esta proteína o biomolécula y, correspondientemente, contiene la proteína antes del comienzo del procedimiento según la invención. Las células pueden ser células de líneas celulares dado el caso inmortalizadas o células nativas procedentes de tejidos y aisladas de éstos, estando la agrupación celular disuelta en la mayoría de los casos. El preparado de estas células incluye principalmente materiales homogeneizados celulares, el citosol, una fracción de membrana de las células con fragmentos de membrana, una suspensión de orgánulos celulares aislados, etc.

La especie de procedencia de estas proteínas o biomoléculas carece de importancia para la función del procedimiento, pero es preferible utilizar la variante humana, de ratón o de rata. El DNPI es conocido en cuanto a la secuencia de DNA codificadora y la secuencia de aminoácidos y también se ha descrito su función general. El DNPI, "differentiation-associated Na^{+} dependent inorganic phosphate cotransporter" (cotransportador de fosfato inorgánico dependiente de Na^{+} asociado por diferenciación), ha sido descrito por Aihara y col. (2000) en J. Neurochem. 74, 2622-2625.

La forma mediante la cual el procedimiento permite hallar sustancias de interés consiste o bien en la unión con la biomolécula o la proteína, que se puede comprobar mediante el desplazamiento de un ligando conocido o por la magnitud de la sustancia unida, o bien en la modificación de un parámetro funcional debido a la interacción de la sustancia con la proteína o la biomolécula. Esta interacción consiste principalmente en una regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, y los parámetros funcionales modificados pueden ser, por ejemplo, la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, o la variación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero.

A continuación, para aclarar la invención, además de las explicaciones e los conceptos dadas en el texto general, se muestran otras definiciones con el fin de establecer claramente cómo se han de entender e interpretar, en el sentido de esta invención, determinados conceptos utilizados principalmente en las reivindicaciones.

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Sustancia: Este término hace referencia a un compuesto químico. Más concretamente, se trata aquí de compuestos que pueden en potencia desarrollar un efecto en el cuerpo, principios activos de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas, en este caso sobre todo principios activos de bajo peso molecular.

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Sustancia farmacéuticamente relevante: En el sentido de la invención, una sustancia farmacéuticamente relevante es una sustancia que, a través de la unión a las biomoléculas de los grupos I a III, podría ser eficaz en como mínimo una de las indicaciones mencionadas y que, teóricamente, tiene potencial para influir fisiológicamente de forma directa o indirecta en los síntomas, en particular que parece que se puede utilizar terapéuticamente, por ejemplo en un medicamento.

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Regulador del dolor: En el sentido de la invención, "regulador del dolor" significa que la sustancia influye directa o indirectamente en la percepción del dolor, en particular que actúa como analgésico de forma natural.

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Dolor: En el sentido de la invención, "dolor" significa principalmente una sensación de dolor, más concretamente dolor agudo, crónico, neuropático e inflamatorio, incluyendo migraña, en particular un dolor perteneciente a los siguientes tipos:

dolor crónico, en particular dolor musculoesquelético; dolor neuropático, en particular dolor alodínico, hiperalgesia mecánica o neuropatía diabética; dolor visceral, dolor cerebral, dolor periférico o dolor condicionado por inflamación, en particular dolor inflamatorio periférico; y también migraña, cefalea agrupada o dolor en caso de neuralgia del trigémino.

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Incubación: Por "incubación" se entiende que un objeto de estudio biológico, por ejemplo una célula o una proteína, se introduce y se deja en un medio a temperatura regulada, por ejemplo en una estufa incubadora o sobre un baño de agua. En este contexto, por el concepto "condiciones adecuadas" se entiende una incubación bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo 37ºC, pH 7,2) o bajo aquellas condiciones que permiten una medida óptima en el procedimiento.

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Célula: La célula es un sistema autorregulado, abierto, que se encuentra en equilibrio dinámico con su entorno mediante el intercambio permanente de materiales, con metabolismo propio y capacidad de reproducción. La célula se puede cultivar por separado o puede formar parte de un tejido, en particular de un órgano, y encontrarse en éste de forma aislada o todavía como agrupación celular.

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Preparado celular: Por este concepto se entienden preparados producidos mediante métodos químicos, biológicos, mecánicos o físicos con modificación de la estructura celular, por ejemplo fragmentos de membrana, compartimentos celulares aislados, citosol aislado o material homogeneizado obtenido de tejidos.

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Péptido: Compuesto de aminoácidos unidos en cadenas a través de enlaces peptídicos. Un oligopéptido consiste en 2 a 9 aminoácidos, un péptido consiste en 10 a 100 aminoácidos.

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Proteína: Compuesto de más de 100 aminoácidos unidos en cadenas a través de enlaces peptídicos, eventualmente con una estructura espacial definida.

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PIM1-quinasa; PIM3-quinasa: un protooncogén y una serina-treonina-quinasa.

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Polinucleótido: El nucleótido que sirve de base es un componente básico de los ácidos nucleicos que consiste fundamentalmente en una base de nucleína, pentosa y ácido fosfórico. Corresponde a un polinucleótido de alto peso molecular de varios nucleótidos unidos entre sí mediante la esterificación ácido fosfórico-pentosa. Pero en esta invención se utilizan también polinucleótidos modificados que, si bien conservan la sucesión de bases, disponen de un esqueleto modificado en lugar de ácido fosfórico-pento- sa.

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Similar en como mínimo un 90 (95,97)%: Este concepto significa que la sucesión de bases de la región codificadora de los polinucleótidos incluidos es idéntica a la de referencia (figura, etc.) en como mínimo un 90% (95%,97%), y que la sucesión de los aminoácidos de la estructura primaria de los péptidos y proteínas incluidos es idéntica a la de referencia en como mínimo un 90% (95%, 97%).

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Gen: Con el término "gen" se designa una sección de genoma con una secuencia de nucleótidos definida que incluye la información para la síntesis de un mRNA o pre-mRNA o de un RNA de otro tipo (por ejemplo tRNA, rRNA, snRNA, etc.). Consiste en secciones codificadoras y no codificadoras.

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Fragmento de gen: Sección de ácido nucleico que incluyen en su sucesión de bases, una región parcial de un gen.

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Biomolécula: Término general para ácidos nucleicos o poliaminoácidos, en particular también DNA, RNA, péptidos y proteínas, pudiendo estas moléculas también estar modificadas de forma artificial. En el sentido de esta invención, el término se refiere preferentemente a péptidos y proteínas.

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Unión al péptido o a la proteína: Interacción entre la sustancia y el péptido o la proteína que conduce a la fijación.

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Parámetros funcionales: Por este concepto se entienden magnitudes de medida de un experimento que están relacionadas con la función de una proteína (canal de iones, receptor, enzima).

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Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.

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Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.

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Proteína G: Abreviatura internacional habitual para una proteína que se une a guanosintrifosfato (GTP), que se activa como proteína de señal a través de receptores acoplados con proteína G.

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Gen indicador: Designación general para genes cuyos productos genéticos se pueden comprobar fácilmente con ayuda de sencillos métodos bioquímicos o histoquímicos, por ejemplo luciferasa, fosfatasa alcalina o Green Fluorescent Protein (GFP) (proteína fluorescente verde).

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Constructo de DNA (recombinante): Designación general para todo tipo de moléculas de DNA formadas por ligadura in vitro de moléculas de DNA.

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Vector de clonación: Designación general para moléculas de ácido nucleico que durante la clonación actúan como portadores de genes extraños o de partes de estos genes.

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Vector de expresión: Designación para vectores de clonación construidos especialmente que, después de introducirlos en una célula huésped adecuada, permiten la transcripción y traducción del gen extraño incorporado por clonación en el vector.

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Secuencia LTR: Abreviatura de long terminal repeat. Designación general para regiones de secuencia más largas que se encuentran en ambos extremos de un genoma lineal. Estas regiones de secuencia se encuentran por ejemplo en los genomas de retrovirus y en los extremos de transposones eucarióticos.

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Cola poli-A: Los restos adenilo (aproximadamente 20-250) fijados en el extremo 3' de los RNA mensajeros mediante poliadenilación.

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Secuencia promotora: Designación para una región de secuencia de DNA a partir de la cual se controla la transcripción de un gen, es decir, la síntesis de mRNA.

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Secuencia ORI: Abreviatura de origin of replication (origen de replicación). La secuencia ORI permite que una molécula de DNA se reproduzca como unidad autónoma en la célula.

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Secuencia intensificadora: Designación para elementos genéticos relativamente cortos que se presentan en parte en forma de repeticiones y que en general refuerzan la expresión de algunos genes en diferente medida.

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Factor de transcripción: Designación para una proteína que influye en la transcripción de un gen a través de la unión con secuencias de DNA específicas.

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Cultivar: Mantener células o tejidos bajo condiciones de cultivo adecuadas.

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Condiciones que permiten la expresión: Por este concepto se entiende la selección y aplicación de condiciones de cultivo que permiten la expresión de la proteína de interés, entre las que se encuentran la modificación de la temperatura, el cambio de medio, la adición de sustancias inductoras, la supresión de sustancias inhibidoras.

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Tiempo de incubación: Tiempo durante el cual las células o tejidos son incubados, es decir, sometidos a una temperatura determinada.

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Presión de selección: Aplicación de condiciones de cultivo que proporcionan una ventaja de crecimiento a las células con un producto genético determinado, el denominado marcador de selección.

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Célula de anfibio: Célula de un animal de la clase de los Amphibia.

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Célula bacteriana: Célula perteneciente al dominio de las eubacterias o arqueobacterias, o procedente del mismo.

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Célula de levadura: Célula asignable al orden de los Endomycetales, o procedente del mismo.

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Célula de insecto: Célula asignable al orden de los Hexapoda, o procedente del mismo.

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Célula de mamífero nativa: Célula procedente de un mamífero, cuyas características relevantes corresponden a las de la célula que se encuentra en el organismo.

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Célula de mamífero inmortalizada: Célula que, mediante las condiciones de cultivo aplicadas o por manipulación por ingeniería genética, ha adquirido la propiedad de dividirse en el cultivo más allá de la frecuencia de división habitual (aproximadamente 100).

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Marcado: Hecho accesible mediante modificación o derivación correspondiente para una reacción de comprobación. Por ejemplo, radiactivo, fluorescente o luminiscente.

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Ligando: Sustancia que se une a una molécula que se encuentra en el cuerpo o en una célula, especialmente un receptor.

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Desplazamiento: Separación total o parcial de un ligando de su sitio de unión.

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Actividad relacionada: Valor de medida registrado bioquímica o físicamente, que está relacionado con la cantidad de ligando unida a un receptor.

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Regulación: La inhibición o activación de un proceso como parte de un proceso de regulación.

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Inhibición: Como caso especial de regulación, el impedimento/reducción de un proceso.

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Activación: Como caso especial de regulación, la intensificación de un proceso.

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Receptores: En el sentido más amplio, todas las moléculas presentes en el organismo procariota o eucariota a las que se puede unir un principio activo. Más concretamente, proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana que provocan una modificación en la célula mediante la unión de un principio activo.

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Canales de iones: Proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana a través de los cuales la membrana puede ser atravesada por cationes o aniones.

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Enzimas: Designación para proteínas o complejos de un componente activador no albuminoide con una proteína que poseen propiedades catalíticas.

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Expresión genética (expresar/expresable): La traducción de la información genética de un gen en RNA (expresión de RNA) o en una proteína (expresión de proteína).

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Medio iónico: Concentración de uno o más iones en un compartimento determinado.

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Potencial de membrana: Diferencia de tensión a través de una membrana a causa de un exceso de cationes en un lado de la membrana y de aniones en el otro.

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Modificación de la actividad enzimática: Inhibición o inducción de la actividad catalítica de una enzima.

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2º mensajero: Molécula pequeña que se forma o penetra en el citosol como respuesta a una señal extracelular y ayuda a transmitir la información al interior de la célula, por ejemplo cAMP, IP_{3}.

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Sonda (genética): Designación para todo tipo de ácidos nucleicos con cuya ayuda se puede detectar un gen buscado o una secuencia de DNA determinada. Además, mediante derivación de la sonda genética (por ejemplo biotina, perlas magnéticas, digoxinina) se pueden extraer moléculas de DNA de una mezcla. Como sondas se utilizan genes clonados, fragmentos de genes, oligonucleótidos sintetizados químicamente y también RNA, que en la mayoría de los casos está marcado de forma radiactiva.

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DNA: Designación internacional para el ácido desoxirribonucleico.

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DNA genómico: Designación general para el DNA procedente del núcleo de una célula en organismos eucariotas.

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cDNA: Abreviatura de complementary DNA (DNA complementario). Designación para la copia de DNA de cadena simple o doble de una molécula de RNA.

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Banco/librería de cDNA: Designación para una colección de fragmentos de cDNA clonados de forma arbitraria que, en conjunto, representan la totalidad de los RNA sintetizados de una célula o tejido.

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Clon de cDNA: Designación para una población de células genéticamente uniformes que se derivan de una única célula, conteniendo esta célula un fragmento de cDNA incorporado de forma artificial.

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Hibridación: Formación de una molécula de ácido nucleico de cadena doble a partir de dos cadenas simples independientes mediante emparejamiento de bases.

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Condiciones estrictas: Condiciones bajo las que sólo se forman cadenas de ácido nucleico con un emparejamiento de bases perfecto que permanecen estables.

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Aislar: Localizar y separar de una mezcla una molécula buscada.

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Secuenciación de DNA: Determinación de la sucesión de bases de una molécula de DNA.

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Secuencia de ácido nucleico: Designación para la estructura primaria de una molécula de DNA, es decir, la sucesión de las bases individuales de las que está compuesto un DNA.

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Cebador de oligonucleótido específico de gen: Ácidos oligonucleicos, es decir, fragmentos de ácidos nucleicos con una longitud de 10-40 bases, que permiten, en su composición de bases, una hibridación estricta en el gen o el cDNA buscado.

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Descubrimiento de cebadores de oligonucleótido: La búsqueda manual o asistida por ordenador de oligonucleótidos para una secuencia de DNA predeterminada que sean óptimamente adecuados para una hibridación y/o una reacción en cadena de polimerasa.

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PCR: Abreviatura de reacción en cadena de polimerasa. Procedimiento in vitro para el enriquecimiento selectivo de regiones de ácido nucleico de longitud y secuencia definidas de una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos.

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DNA-molde: Molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas de ácido nucleico a partir de las cuales se multiplica una sección de DNA con ayuda de la PCR (véase más arriba).

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RNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos.

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mRNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos mensajeros, que intervienen en la transferencia de la información genética del núcleo a la célula y contienen la información para la síntesis de un polipéptido o de una proteína.

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Polinucleótido antisentido: Molécula consistente en varios ácidos nucleicos naturales o modificados, cuya sucesión de bases es complementaria a la sucesión de bases de una región parcial de un RNA presente en la naturaleza.

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PNA: Abreviatura internacional usual de peptidic nucleic acids (ácidos nucleicos peptídicos). En este contexto, los aminoácidos enlazados peptídicamente forman una cadena, portando los aminoácidos como cadena lateral una base apta para la hibridación con DNA o RNA.

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Secuencia: Sucesión de nucleótidos o aminoácidos. En el sentido específico de esta invención, con este término se hace referencia a la secuencia de ácidos nucleicos.

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Ribozima: Designación para un ácido ribonucleico catalíticamente activo (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).

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DNA-enzima: Designación para una molécula de DNA que posee actividad catalítica (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).

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RNA/DNA catalítico: Designación general para ribozimas o DNA-enzimas (véase más arriba).

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Adenovirus: Virus citopatógenos presentes en los vertebrados.

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Virus adenoasociado (AAV): Forma parte de la familia de los parvovirus. Para lograr una reproducción eficaz del AAV es necesaria una coinfección de las células huésped con virus auxiliares (por ejemplo herpesvirus, virus de la vaccinia o adenovirus). La propiedad del AAV de integrarse de forma estable en el genoma huésped lo hace especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos.

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Herpesvirus: Patógeno viral de la infección herpes.

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Modificación postraduccional: Modificación en proteínas o polipéptidos realizada después de la traducción, por ejemplo fosforilación, glicosilación, amidación, acetilación o proteolisis.

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Glicosilar: Designación para la acción de añadir moléculas de azúcar individuales o cadenas de azúcares completas a proteínas.

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Fosforilar: Designación para la acción de añadir uno o más restos fosfato a una proteína, preferentemente a los grupos OH de los aminoácidos serina, treonina o tirosina.

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Amidar: Designación para la acción de transformar una función carboxilo en una función amida, por ejemplo en el resto aminoácido carboxi-terminal de un péptido o proteína.

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Proveer de anclaje de membrana: Modificación postraduccional de una proteína o de otra molécula orgánica de modo que ésta se une a la membrana de capa doble lipídica de las células mediante la adición de una molécula hidrófoba, convenientemente un ácido graso o un derivado del mismo.

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Segmentar: En este caso específico, la segmentación de un péptido o proteína en varias subsecuencias.

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Acortar: Acortar en una o varias partes una molécula consistente en varias partes individuales.

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Anticuerpos: Proteínas solubles o unidas a membranas celulares, designadas como inmunoglobulinas, con un sitio de unión específico para antígenos.

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Anticuerpos monoclonales: Anticuerpos con una selectividad extremadamente alta dirigidos contra un único determinante antigénico de un antígeno.

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Anticuerpos policlonales: Mezcla de anticuerpos dirigidos contra varios determinantes de un antígeno.

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Transgénico: Modificado genéticamente.

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Mamífero no humano: La totalidad de los mamíferos (clase de los Mammalia) excepto la especie humana.

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Célula germinal: Célula con genoma haploide que permite la formación de un nuevo organismo mediante fusión con una segunda célula germinal.

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Célula somática: Célula diploide como componente de un organismo.

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Introducción cromosómica: Intervención en la secuencia de nucleótidos a nivel cromosómico.

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Genoma: Definición general del conjunto de todos los genes de un organismo.

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Ascendiente del animal: Un animal (el ascendiente) que, por transmisión de su material genético de forma natural o artificial, está emparentado en línea directa con otro (el descendiente).

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Expresable: Una molécula de ácido nucleico es expresable cuando incluye información para la síntesis de una proteína o polipéptido y está provista de las secuencias reguladoras correspondientes que permiten la síntesis de esta proteína o polipéptido in vitro o in vivo. Cuando ya no se dan estas condiciones, por ejemplo por intervención en la secuencia codificadora, la molécula de ácido nucleico ya no es expresable.

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Roedor: Animal del orden de los Rodentia, por ejemplo la rata o el ratón.

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Identificable como sustancia reguladora del dolor: Sustancia que al ser incorporada en un organismo vivo produce un cambio de comportamiento que los especialistas designan como inhibidor del dolor (antinociceptivo, antihiperalgésico o antialodínico). En el caso del procedimiento de screening (rastreo), este concepto se refiere a que la sustancia, durante el rastreo, debido a una mayor unión o provocando una variación en un parámetro funcional, supera claramente, por ejemplo en un 100%, a la unión o la interacción de la media de las sustancias ensayadas.

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Compuesto: Otro nombre para una molécula consistente en varios átomos. En este caso una molécula identificable mediante el procedimiento según la invención.

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Principio activo: Un compuesto que al ser administrado a un organismo provoca un cambio en dicho organismo. Por este concepto se entienden principalmente moléculas sintetizadas de forma orgánico-química que tienen un efecto curativo en el organismo. En este caso se trata, en particular, de moléculas que se unen a las proteínas y péptidos según la invención.

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De bajo peso molecular: Molécula con un peso molecular < 2 kDa.

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Medicamento: Sustancia correspondiente a la definición dada en el Artículo 1 § 2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos.

-

Diagnóstico: Compuesto o procedimiento utilizable para diagnosticar una enfermedad.

-

Tratamiento del dolor: Procedimiento destinado a mitigar o eliminar el dolor o para inhibir la aparición esperable de dolor (analgesia preventiva).

-

Dolor crónico: Sensación de dolor de duración prolongada, frecuentemente caracterizada porque va más allá del momento y del lugar del estímulo inicial y aumenta la sensibilidad del cuerpo al dolor.

-

Terapia genética: Por "terapia genética" se entienden todos los procedimientos que tienen el objetivo de tratar de forma causal enfermedades genéticas mediante modificaciones adecuadas del genoma.

-

Terapia genética in vivo : Introducción de material genético en el organismo vivo con el objetivo de la terapia genética. Se puede distinguir entre intervención somática e intervención en la línea germinal, que tienen lugar en un caso en células diploides y en otro caso en células haploides.

-

Terapia genética in vitro : Introducción de material genético en células fuera del cuerpo humano con el fin de usar éstas posteriormente para la terapia genética introduciéndolas de nuevo en el cuerpo humano.

-

Diagnosis: Procedimiento para identificar una enfermedad.

-

Análisis de eficacia: Análisis para examinar la eficacia de un compuesto después de su actuación en un organismo vivo.

En una forma de realización preferente del procedimiento, la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso (a). En este proceso se introduce material genético en la célula, en particular una o más secuencias de polinucleótidos. En otra variante preferente de esta forma de realización, la manipulación por ingeniería genética permite medir como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo. En esta forma de realización, mediante manipulación por ingeniería genética se crean condiciones que permiten medir o mejorar la medida de la variación de un parámetro funcional. En este contexto es especialmente preferente que mediante la manipulación por ingeniería genética se exprese una proteína G no expresada de forma endógena en la célula o se introduzca un gen indicador. Por este concepto se ha de entender principalmente la introducción por ingeniería genética de una proteína G no presente de forma endógena o no expresada fisiológicamente (proteína de unión a GTP) en la célula, por ejemplo la introducción de una proteína G quimérica, que permite una modificación de la vía de señales, o de una proteína G promiscua, que tiene mucha facilidad de unión. La introducción de un gen indicador permite, a su vez, medir la expresión inducida (provocada de forma extracelular) del producto genético.

En otra forma de realización preferente, la célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contenga como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente en como mínimo un 95%, en particular en como mínimo un 97%. De este modo se puede lograr, por ejemplo, que la célula sintetice una proteína que no es expresada de forma endógena en la célula o en el preparado utilizados en el procedimiento. En este contexto es especialmente preferente que el polinucleótido esté contenido en un constructo de DNA recombinante. Por el concepto "constructo de DNA (recombinante)" se entiende una molécula de DNA producida in vitro.

Si en el procedimiento la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso a), es preferible cultivar la célula después de la manipulación genética y antes del paso (a) bajo condiciones que permitan una expresión, dado el caso bajo presión de selección. Por "cultivar" se entiende mantener las células o los tejidos en condiciones que aseguran la supervivencia de las células o de su siguiente generación. Las condiciones deberían elegirse de tal modo que permitan una expresión del material introducido mediante manipulación por ingeniería genética. Para ello, el pH, el contenido de oxígeno y la temperatura se deberían mantener en niveles fisiológicos y se deberían añadir los suficientes nutrientes y los cofactores necesarios. La presión de selección permite cultivar únicamente aquellas células en las que la manipulación por ingeniería genética ha tenido éxito como mínimo en parte. Dentro de este concepto se encuentra, por ejemplo, la incorporación de resistencia a los antibióticos a través del constructo de
DNA.

En el procedimiento según la invención es especialmente preferente que la célula utilizada se una célula de anfibio, bacteriana, de levadura, de insecto o una célula de mamífero inmortalizada o nativa. Como ejemplos se mencionan: para las células de anfibio, oocitos de Xenopus; para las células bacterianas, células de E. coli; para las células de levadura, Saccharomyces cerevisiae; para células de insecto, células de Sf9; para células de mamífero inmortalizadas, células de HeLa; y para células de mamífero nativas, la célula de CHO (Chinese Hamster Ovary - ovario de hámster chino).

En un método de medida utilizado para determinar la unión de la sustancia a la biomolécula o a la proteína en el procedimiento según la invención, la medida de la unión se realiza a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula o de la proteína y/o por la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada. El ligando es una molécula que se une con alta especificidad a la proteína y que es desplazada del sitio de unión por una sustancia a ensayar que también se une a la proteína. Por "marcado" se ha de entender una modificación artificial en la molécula que facilita su detección. Por ejemplo, los marcados pueden ser radiactivos, fluorescentes o luminiscentes.

En otro método de medida utilizado para determinar la modificación de los parámetros funcionales provocada por la unión de la sustancia a la proteína en el procedimiento según la invención, la medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo se lleva a cabo midiendo la regulación, inhibición y/o la activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular por la medida de la modificación de la expresión genética, del medio iónico, del pH o del potencial de membrana, a través de la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero. De este modo, por una parte se registra directamente la medida del efecto de la sustancia a través de la influencia de receptores, canales de iones y/o enzimas, y por otra parte, como ejemplos a medir de forma preferente, parámetros variables como la expresión genética, el medio iónico, el pH, el potencial de membrana, la actividad enzimática o la concentración del 2º mensajero. En este contexto, por "medio iónico" se entiende principalmente la concentración de uno o más iones en un compartimento celular, en particular en el citosol; por "potencial de membrana" se entiende la diferencia de carga entre los dos lados de una biomembrana; y por "2º mensajero" se entienden mensajeros de la vía de señales intracelular, por ejemplo AMP cíclico (cAMP), inositoltrifosfato (IP3) o diacilglicerol (DAG).

Un objeto especialmente preferente de la invención consiste en un procedimiento según la invención, en el que un primer procedimiento según la invención se acopla a un segundo procedimiento según la invención de tal modo que los valores de medida y los resultados del primer procedimiento con respecto a la sustancia a medir se comparan con los valores de medida y los resultados del segundo procedimiento con respecto a la sustancia a medir, caracterizado porque en el paso (a) de uno de los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento principal, la sustancia a ensayar

se incuba con una biomolécula seleccionada de entre el grupo III:

la proteína DNPI y/o una proteína según una de las Figuras 2b), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o a su polinucleótido antisentido,

y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo III anteriormente mencionadas,

y

porque en el paso (a) del otro de los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento secundario, la sustancia a ensayar se incuba con una biomolécula del grupo I o con una biomolécula del grupo III, no eligiéndose la biomolécula con la que ha sido incubada la sustancia en el procedimiento principal.

Bajo esta forma de realización especialmente preferente se ha de entender, en especial, la combinación de la medida de la unión a DNPI y biomoléculas derivadas de éste o de la medida de la modificación de parámetros celulares que ello provoca, dado que precisamente una comparación en vista de la distribución completamente independiente pero estrechamente cercana de los dos canales en el tejido puede proporcionar una información importante sobre las funciones fisiológicas. De este modo, la comparación diferencial de los datos permite identificar aquellas sustancias con una eficacia farmacéutica o medicinal óptima.

Mediante un procedimiento de screening (rastreo) según la invención se puede identificar un compuesto como sustancia farmacéuticamente relevante y eficaz en como mínimo una de las indicaciones anteriormente mencionadas. En este contexto, el término "compuesto" se refiere sobre todo a principios activos de bajo peso molecular, pero también a péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. El término "identificable" significa que el compuesto presenta la característica consistente de que, en lo que respecta a la unión en el procedimiento de screening (rastreo) según la invención, se une de forma claramente más intensa, preferentemente con el doble de intensidad, que la media de las sustancias de ensayo, o que, en lo que respecta a la variación de los parámetros funcionales, se desvía claramente de la media de las sustancias de ensayo. Resulta especialmente ventajoso que el compuesto identificado por un procedimiento según la invención sea un compuesto de bajo peso molecular.

Junto con el polinucleótido utilizado en el procedimiento según la invención también están incluidos los propios fragmentos de gen representados, y también un polinucleótido que se corresponde totalmente o como mínimo en parte con la secuencia codificadora del gen correspondiente al fragmento. Con ello también se incluyen polinucleótidos que presentan una coincidencia de como mínimo un 90%, preferentemente un 95% y en particular de como mínimo un 97%, en la sucesión de bases con la secuencia codificadora de los polinucleótidos representados o de la secuencia codificadora del gen. Además es preferible que el polinucleótido consista en RNA o en DNA de cadena simple o doble, en particular mRNA o cDNA. También es preferible que el polinucleótido consista en un polinucleótido antisentido o en un PNA que presente una secuencia que se pueda unir específicamente a un polinucleótido según la invención. PNA significa "peptidic nucleic acid" (ácido nucleico peptídico) que, si bien porta los pares de bases, su esqueleto está unido peptídicamente. Un polinucleótido antisentido presenta la sucesión de bases complementaria a como mínimo una parte de un ácido nucleico base. También es preferible que el polinucleótido sea una parte de un ribozima o de otra enzima de DNA o un RNA o DNA catalítico. Por ribozima se ha de entender un ácido ribonucleico catalíticamente activo, y por enzima de DNA el ácido desoxirribonucleico correspondiente, es decir RNA o DNA catalítico.

También se puede utilizar un polinucleótido o un oligonucleótido en el que como mínimo uno de los nucleótidos y en particular varios de los nucleótidos son "locked nucleic acids" ("LNA") (ácidos nucleicos bloqueados), o como mínimo uno de los nucleótidos y en particular todos los nucleótidos son fosfotioatos, preferentemente uno donde que varios de los nucleótidos son "locked nucleic acids" ("LNA"). Los "locked nucleic acids" ("LNA") son ribonucleótidos que contienen un puente metileno que une el oxígeno 2' de la ribosa con el carbono 4' (véase la Figura 27). Braasch D.A. y Corey, D.R. (2001) presentan una vista general de los LNA en "Locked nucleic acids (LNA); fine-tuning the recognition of DNA and RNA", Chem. Biol, 8, 1-7. Se pueden adquirir LNA por ejemplo de la firma Proligo, Boulder, CO, EE.UU. Los fosfotioatos también son conocidos por los especialistas y se pueden encargar por ejemplo a MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania.

Cuando se emplea una proteína en el procedimiento según la invención, es preferible que ésta haya sido sometida a una modificación postraduccional, en particular que haya sido glicosilada, fosforilada, amidada, metilada, acetilada, ADP-ribosilada, hidroxilada, provista de un anclaje de membrana, segmentada o acortada. Estas modificaciones postraduccionales se describen, por ejemplo, en Voet/Voet, Biochemistry, 1ª edición, 1990, páginas 935-938.

El polinucleótido utilizado (dado el caso según el punto a) y/o el punto b)) puede ser un RNA o un DNA de cadena simple o doble, en particular mRNA o cDNA.

El polinucleótido utilizado (dado el caso según el punto b)) puede ser una parte de un ribozima u otra DNA-enzima o un RNA o DNA catalítico.

Los siguientes ejemplos y figuras explican más detalladamente la invención sin limitarla a los mismos.

Figuras y ejemplos Figuras

Figura 1a)

Secuencia de cDNA de BNPI, humano; AN: NM_020309.

Figura 1b)

Secuencia de aminoácidos de BNPI, humano; AN: NM_020309.

Figura 1c)

Secuencia de cDNA de BNPI, humano; Nº: AAT42064 de WO96/34288.

Figura 1d)

Secuencia de aminoácidos de BNPI, humano; Nº: AAT42064 de WO96/34288.

Figura 1e)

Secuencia de cDNA de BNPI, rata; AN: U07609.

Figura 1f)

Secuencia de aminoácidos de BNPI, rata; AN: U07609.

Figura 1g)

Secuencia de cDNA de BNPI, ratón; AN: XM_133432.

Figura 1h)

Secuencia de aminoácidos de BNPI, ratón; AN: XM_133432.

Figura 2a)

Secuencia de cDNA de DNPI, humano; AN: AB032435.

Figura 2b)

Secuencia de aminoácidos de DNPI, humano; AN: AB032435.

Figura 2c)

Secuencia de cDNA de DNPI, rata; AN: AF271235.

Figura 2d)

Secuencia de aminoácidos de DNPI, rata; AN: AF271235.

Figura 2e)

Secuencia de cDNA de DNPI, ratón; AN: NM_080853.

Figura 2f)

Secuencia de amioácidos de DNPI, ratón; AN: NM_080853.

Figura 3)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en sinapsis y áreas motoras de la médula espinal lumbar de la rata (véase el Ejemplo 2a).

Figura 4)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en sinapsis de las áreas del asta dorsal de la médula espinal lumbar de la rata (véase el Ejemplo 2b).

Figura 5)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en sinapsis de la médula espinal sacra de la rata (véase el Ejemplo 2c).

Figura 6)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en sinapsis del conducto médula-cervicoespinal del nervio trigémino de la rata (véase el Ejemplo 2d).

Figura 7)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2e).

Figura 8)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2f).

Figura 9)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2g).

Figura 10)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2h).

Figura 11)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2i).

Figura 12)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2j).

Figura 13)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2k).

Figura 14)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2l).

Figura 15)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2m).

Figura 16)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2n).

Figura 17)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2o).

Figura 18)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2p).

Figura 19)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata (véase el Ejemplo 2q).

Figura 20)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata. AS significa antisentido y se refiere a la tinción.

Figura 21)

Expresión diferencial de DNPI y BNPI en regiones cerebrales de la rata. AS significa antisentido y se refiere a la tinción.

Ejemplos Ejemplo 1 Observación diferencial de la expresión entre DNPI y BNPI mediante tinción inmunocitoquímica

Para la tinción inmunohistoquímica se utilizaron antisueros de conejo policlonales contra la proteína de fusión de DNPI o BNPI recombinante. En general, se aplicaron secciones de diferentes regiones del SNC y se comparó la expresión de DNPI con la de BNPI. El proceso se correspondía, en cuanto a las secciones y a la tinción, con el procedimiento descrito por Persson S., Schäfer MK-H, Nohr D., Ekström G., Post C., Nyberg F. y Weihe E. (1994), Neuroscience 63; 313-326 o por Nohr D., Schäfer MK-H., Romeo H., Persson S., Nyberg F. Post C. y Weihe E. (1999), Neuroscience 93; 759-773. La revelación, descripción o enseñanza técnica de estos artículos se incorpora expresamente como parte de la revelación, descripción o enseñanza técnica de la invención aquí presentada.

Ejemplo 2a

Con referencia a la Figura 3)

Se puede ver la distribución diferencial de la inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal lumbar de la rata. Las secciones A a D desparafinadas adyacentes están teñidas de la siguiente manera:

A = anti-DNPI;

B = anti-DNPI preadsorbido con proteína de fusión de DNPI;

C = anti-BNPI;

D = anti-BNPI preadsorbido con proteína de fusión de BNPI.

Los inmunocolorantes DNPI-(A) y BNPI-(C) eran completamente preadsorbibles con proteína de fusión de BNPI-(D) y BNPI-(B) recombinante homóloga, lo que demuestra la especificidad de la reacción inmune.

Resulta notable el patrón de distribución mutuamente excluyente de la inmunotinción de DNPI y BNPI en el asta dorsal exterior y profunda (A;C). La inmunotinción punteada de DNPI se encuentra en los extremos sinápticos del asta dorsal exterior (lámina 1 y sustancia gelatinosa) (flecha en A), mientras que la inmunorreactividad de BNPI falta por completo (flechas en B). En el asta dorsal profunda se encuentra una acumulación de inmunotinción de BNPI punteada positiva intensa, mientras que la tinción de DNPI es relativamente baja. El DNPI está presente en el núcleo espinal lateral (LSN en A), mientras que el BNPI falta por completo (LSN en C). El DNPI es abundante en la lámina X alrededor del canal central, mientras que el BNPI es escaso. La inmunotinción de BNPI es débil en el asta ventral lateral y débil o ausente en el asta ventral medial. La tinción de DNPI punteada es abundante en todo el asta ventral, algo menos en la lateral que en la ventral medial. Hay una débil tinción de BNPI y DNPI en algunos cuerpos celulares de las neuronas motoras dispuestas en el asta ventral, pero no había sido preadsorbida por las proteínas de fusión del transportador homólogo y, en consecuencia, se había clasificado como no específica.

Ejemplo 2b

Con referencia a la Figura 4)

Se puede ver la distribución diferencial de la inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal lumbar dorsal superficial lateral izquierda (left lateral superficial dorsal lumbar spinal cord) de la rata. A y B teñidas respectivamente para BNPI (A) y DNPI (B) muestran muchas tinciones punteadas para DNPI, que están concentradas en la lámina I y en la sustancia gelatinosa, donde el BNPI falta prácticamente por completo. También se pueden ver complejos densos de puntos positivos de DNPI en el núcleo espinal lateral, donde el BNPI falta prácticamente por completo. También se pueden encontrar puntos positivos de DNPI finos en el asta dorsal profunda, aunque con menor densidad.

Ejemplo 2c

Con referencia a la Figura 5)

Se puede ver la distribución diferencial de la inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal sacral de la rata. Las secciones adyacentes A y B teñidas respectivamente para BNPI (A) y DNPI (B) muestran zonas de exclusión mutua de inmunotinción de DNPI y BNPI punteada en el asta dorsal. El DNPI está presente en toda la sustancia gris y se concentra en las capas más externas del asta dorsal, donde forma una banda estrecha en el límite con la sustancia blanca. El DNPI es abundante en el núcleo espinal lateral y en la lámina X, al igual que en la lámina V/VI y en todo el asta ventral. El BNPI es abundante en el asta dorsal profunda y escaso en la ventral.

Ejemplo 2d

Con referencia a la Figura 6)

Se puede ver la distribución diferencial de la inmunorreactividad de BNPI y DNPI en el bulbo raquídeo inferior en la transición a la médula espinal cervical. Las secciones adyacentes A y B teñidas respectivamente para BNPI (A) y DNPI (B) muestran una acumulación preferente de la tinción de BNPI en la parte medial del núcleo trigeminal espinal y en la parte central e inferior de la médula dorsal. En la médula ventral sólo se observa una tinción muy débil con BNPI. El DNPI es abundante en la sustancia gris de la médula. La tinción de DNPI se solapa con la tinción de BNPI en el núcleo espinal interior V. Se ha de observar que el BNPI también se encuentra en el núcleo trigeminal espinal superior, que es igual a la sustancia gelatinosa espinal. La tinción de DNPI es más débil en las regiones con presencia de BNPI que en las regiones en las que la presencia de BNPI es baja o nula. En la región de motor gris ventral se pueden ver unos pocos puntos de BNPI.

Ejemplo 2e

Con referencia a la Figura 7)

Distribución diferencial complementaria de la inmunorreactividad de DNPI y BNPI en 2 secciones progresivas del cerebro de rata en regiones cerebrales relevantes para el dolor como el córtex parietal sensitivo, el córtex cingular, el tálamo, el cuerpo amigdalino y también el hipotálamo. El DNPI se concentra en la corteza en las capas sensitivas granulares, en particular en la lámina IV; el BNPI es abundante en el córtex, pero más débil en la lámina IV que en las otras láminas. En el córtex cingular (C vs D como ampliación alta), la distribución de DNPI y BNPI es alternativamente excluyente de forma complementaria o recíproca en la densidad de las sinapsis correspondientes. El DNPI predomina en el tálamo claramente sobre el BNPI. En el hipotálamo, el BNPI es escaso y el DNPI abundante. En el hipocampo, el abundante BNPI predomina sobre el escaso DNPI con una distribución alternativa complementaria.

Tálamo = Th

Cuerpo amigdalino = Amyg.

Hipocampo = Hip

Córtex cingular = Cg

Hipotálamo = Hy

Córtex parietal = PC

Ejemplo 2f

Con referencia a la Figura 8)

Distribución diferencial complementaria de inmunorreactividad de DNPI y BNPI en regiones cerebrales relevantes para el dolor como el córtex cingular (Cg) y el tectum, y también la sustancia gris periacueductal dorsal. Dominancia de DNPI en el tectum y la sustancia gris dorsal. Secciones progresivas de un cerebro de rata a través del mesencéfalo superior.

Ejemplo 2g

Con referencia a la Figura 9)

Distribución diferencial complementaria de inmunorreactividad de DNPI y BNPI en regiones cerebrales relevantes para el dolor como el tectum (T) y también la sustancia gris periacueductal (PAG). Dominancia de DNPI en el tectum y la sustancia gris dorsal. Se observa una distribución diferencial de DNPI y BNPI en el cuerpo geniculado medial (cgm) de la vía auditiva. Secciones progresivas de un cerebro de rata a través del mesencéfalo superior; plano del colículo superior.

Ejemplo 2h

Con referencia a la Figura 10)

Abundancia de DNPI y BNPI en las habénulas (Hb). El DNPI está presente en todo el complejo habenular (ampliación baja, figura superior; ampliación alta, figura central). El BNPI sólo se encuentra en el núcleo habenular medial (mHb figura inferior, sección progresiva con respecto a la figura central).

En los siguientes Ejemplos 2i a 2q y las Figuras correspondientes 11 - 19 se utilizan los términos VGLUT1 para BNPI y VGLUT2 para DNPI. Estos conceptos son completamente sinónimos en cada caso, exactamente iguales en cuanto a su contenido y se refieren al mismo objeto, es decir: VGLUT1 = BNPI y VGLUT2 = DNPI. El término "preabs" significa preabsorción con proteína de fusión de VGLUT1 o VGLUT2 antes de la inmunotinción.

Ejemplo 2i

Con referencia a la Figura 11)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución y la especificidad en la médula espinal lumbar a través de la inmunorreactividad.

Las secciones adyacentes A-D están teñidas alternativamente con anti-VGLUT2 (A), anti-VGLUT2, prebsorbido con proteína de fusión de VGLUT2 (B), anti-VGLUT1 (C) y anti-VGLUT1, preabsorbido con proteína de fusión de VGLUT1 (D). Las inmunorreacciones en (A) y (C) son preabsorbidas por completo con proteína de fusión recombinante homóloga (B) y (D), lo que demuestra la especificidad de la reacción inmune. Se observa el patrón de distribución diferencial en el asta dorsal superficial y profunda (A;C). Se puede reconocer una inmunotinción punteada para VGLUT2 en el asta dorsal superficial (las flechas en A identifican la lámina 1 y la sustancia gelatinosa), donde la inmunorreactividad con VGLUT1 es mínima (flechas en C). También se puede observar la acumulación de VGLUT1 punteado muy positivo en el asta dorsal profunda, donde el VGLT2 es relativamente débil. El VGLUT2 está presente en el núcleo espinal lateral (LSN; flechas en A), donde el VGLUT1 tiene una escasa presencia (flechas en C). El VGLUT2 está muy presente en la lámina X alrededor del canal central, donde el VGLUT1 es escaso. La inmunotinción de VGLUT1 tiene una intensidad de débil a mediana en el asta ventral lateral y muy floja en el asta ventral medial. En el asta ventral (VH) hay una tinción punteada fina de VGLUT2 densa y abundante.

Ejemplo 2j

Con referencia a la Figura 12)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el prosencéfalo (1).

Los pares de micrografías de baja y alta potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A-D, I, K, M) y VGLUT1 (E-H, J, L, N). Esto muestra la clara diferencia y la exclusividad parcialmente mutua de la distribución, densidad e intensidad de la inmunorreactividad ("ir") de VGLUT1 y VGLUT2 en las regiones corticales, hipotalámicas, diencefálicas y límbicas seleccionadas.

Hipotálamo y tálamo (A,E): La VGLUT2-ir punteada es relativamente fuerte en todo el hipotálamo y tálamo, donde el VGLUT-2 presenta una distribución limitada en el núcleo premamilar ventral (PMV) del hipotálamo y en partes del núcleo del tálamo, incluyendo el núcleo talámico posterior lateral (LP), el núcleo genicular lateral dorsal (DLG) y el núcleo talámico posteromedial ventral (VPM). Núcleo pretectal olivar (OPT); núcleo pretectal anterior dorsal (APTD); núcleo precomisural (PrC).

Corteza (A;E;I;J;K;L;M;N): La tinción de VGLUT2 es moderada en una banda de la neocorteza que contiene lámina IV. Es débil en una banda neocortical que contiene lámina VI y mínima en las otras capas neocorticales. Una VGLUT1-ir punteada intensa es muy fuerte en toda la corteza, incluyendo la corteza piriforme (Pir), y es algo más débil en la banda neocortical de la lámina VI, donde se acumula una tinción de VGLUT2 moderada. Se puede observar la exclusión mutua de la tinción VGLUT1 y VGLUT2 en las capas de la corteza granular retroespinal (RSG en A y E), que se muestran con una mayor ampliación en (I) y (J). Las grandes ampliaciones M y N de la lámina IV en K y L muestran diferentes densidades de VGLUT1-ir y VGLUT2-ir punteada en la comparación entre cuerpos y procesos celulares neuronales inmunonegativos.

Hipocampo (A,E;B-D,F-H): Los puntos de VGLUT2-ir finos están limitados normalmente a las capas granulares (g) del giro dentado (DG) y la capa piramidal (p) de los campos CA1, CA2 y CA3 del hipocampo. Los puntos de VGLUT1-ir densos tienen una presencia muy fuerte en todo el hipocampo a excepción de las capas celulares granuladas (g) y piramidales (p). Las secciones identificadas con rectángulos en A y secciones correspondientes con secciones adyacentes en E se muestran con una gran ampliación en B-D y F-H, respectivamente. Se puede observar la distribución y densidad diferencial de la VGLUT1-ir y la VGLUT2-ir en la capa oriens (o), la capa piramidal (p), en el estrato radiado (r) y el estrato lacunoso molecular (I) de CA1 (B,F) y CA3 (C,G) y en la capa molecular (m), granular (g) y polimorfa (p) del giro dentado (DG) (D,H).

Complejo amigdalino: En este caso se constata un determinado solapamiento, pero se puede ver claramente la densidad e intensidad diferencial de la inmunotinción de puntos de VGLUT1-ir y VGLUT2-ir en el núcleo amigdalino basomedial posterior (BMP), el núcleo amigdalino lateral (La) y el núcleo amigdalino cortical (Co.), y también en el núcleo endopiriforme dorsal (DEn) adyacente.

También se puede comprobar que la "sustancia blanca" y tractos fibrosos son negativos con respecto a VGLUT1 y VGLUT2 (comisura posterior (pc), fórnix (f), fascículo retroflejo (fr), tracto mamilotalámico (mt).

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Ejemplo 2k

Con referencia a la Figura 13)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el prosencéfalo (2).

Los pares de micrografías de baja y alta potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A-B,E,G) y VGLUT1 (C-D,F,H). Esto muestra la clara diferencia y la exclusividad mutua parcial de la distribución, densidad e intensidad de la inmunorreactividad ("ir") de VGLUT1 y VGLUT2 en la neocorteza (lámina IV, VI) caudado putamen (CPu), globo pálido (GP), córtex piriforme (Pir), núcleo accumbens centro (AcC), núcleo accumbens borde (AcSh), pálido ventral (VP), tubérculo olfatorio (Tu), islas de Calleja (ICj), la banda diagonal ventral (VDB) y el septum lateral (LS). En el CPu, el VGLUT1 tiene una presencia algo más débil que el VGLUT2. El VGLUT2 está presente (B) en el globo pálido (GP), donde el VGLUT1 falta prácticamente por completo (D). En el córtex piriforme (Pir) y las islas de Calleja (ICj), la VGLUT1-ir punteada es más fuerte y densa que la VGLUT2-ir. En (E) se puede observar una acumulación de VGLUT1-ir entre débil y moderada en las capas celulares piramidales, donde la VGLUT2-ir falta prácticamente por completo (F). Además se puede observar un solapamiento y reciprocidad determinados en la tinción de VGLUT1 y VGLUT2 en las ICj (G, H), y también la ausencia de VGLUT1-ir y VGLUT2-ir en el tracto fibroso comisural/cuerpo calloso (cc), comisura anterior
(ac).

Barras en A, C = 1 mm, en B, D = 500 \mum; en E-H = 200 \mum.

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Ejemplo 2l

Con referencia a la Figura 14)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el núcleo talámico e hipotalámico.

Las secciones frontales (A, B) adyacentes del diencéfalo muestran la fuerte presencia diferencial específica de núcleo de VGLUT2 (A) y VGLUT1 (B) en el tálamo y el hipotálamo. Se observa la muy fuerte presencia de VGLUT2-ir (A) en el núcleo talámico paraventricular (PVA), núcleo talámico reuniente (Re), núcleo talámico reticular (Rt), núcleo talámico paracentral (PC) y núcleo talámico anterodorsal (AD). Aquí falta prácticamente por completo la VGLUT1-ir (B) o sólo está presente en una baja concentración. El VGLUT1 (B) está presente de forma moderada en el núcleo talámico posterior (PT), donde el VGLUT2 (A) es escaso. El VGLUT1 falta prácticamente por completo en la estría medular (sm), donde la VGLUT2-ir es escasa.

Las secciones frontales adyacentes C,D del diencéfalo muestran la frecuencia de VGLUT2 (C) en el núcleo hipotalámico anterior (AH), pero escasez en el núcleo paraventricular (PVN) y escasez extrema de VGLUT1-ir en el núcleo hipotalámico anterior (AH) y ausencia total en el PVN. También se observa la presencia de VGLUT1 (D) y la ausencia de VGLUT2 (C) en el núcleo talámico ventromedial (VM) y el núcleo talámico reuniente (Re).

Las secciones frontales adyacentes del hipotálamo (E,F) muestran la frecuencia de VGLUT2 en LH, en el núcleo talámico ventromedial (VHM) y el núcleo talámico dorsomedial (DM), y la escasez de VGLUT1 en el núcleo de VMH, pero su presencia moderada en su borde. Se puede observar la tinción débil de VGLUT2 en la eminencia mediana (ME). El VGLUT1 y el VGLUT2 faltan en los tractos fibrosos del fórnix (f) y del tracto mamilotalámico (mt). Tercer ventrículo (3V); barra = 500 \mum (para A-F).

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Ejemplo 2m

Con referencia a la Figura 15)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el epitálamo.

Las micrografías de alta potencia de secciones adyacentes, que están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A) y VGLUT1 (B), muestran la abundancia de VGLUT2 tanto en el núcleo habenular medial (MHb) como en el núcleo habenular lateral (LHb). Se puede observar que la VGLUT1-ir en el MHb es menos densa que la VGLUT2-ir. El VGLUT1 falta prácticamente por completo en el LHb.

Barras = 100 \mum (para A,B).

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Ejemplo 2n

Con referencia a la Figura 16)

Se trata de una comparación entre VGLUT1, tirosina-hidroxilasa y VGLUT2 con respecto a la distribución en el mesencéfalo y el metatálamo.

Las micrografías de baja potencia (A,C,E) y alta potencia (B,D,F) de tres secciones adyacentes están teñidas alternativamente para tirosina-hidroxilasa (TH), VGLUT2 y VGLUT1 y muestran la distribución diferencial, densidad e intensidad de la inmunotinción para VGLUT1 y VGLUT2 en comparación con la TH. Los puntos de VGLUT2-ir están concentrados en el tectum, encontrándose las mayores cantidades en la capa "gris" superficial del colículo superior (SuG) y cantidades menores en la capa "gris" intermedia del colículo superior (InG), mientras que son escasas en la capa de núcleo óptico del colículo superior (Op). Los puntos de VGLUT2-ir se encuentran en todo el tegmento, incluyendo el núcleo rojo (R) y la parte compacta de la sustancia negra (SNC) positiva con respecto a TH, y se acumulan especialmente en la sustancia gris periacueductal dorsal (PAG), en particular en el núcleo terminal medial del tracto de acceso óptico (accessory optic tract)(MT), y también en la parte mediocaudal del núcleo posterior lateral (LPMC), en el núcleo talámico intralaminar posterior (PIL), en el núcleo peripeduncular (PP) y en el núcleo talámico suprageniculado (SG). La VGLUT1-ir es mínima aquí. La tinción de VGLUT1 se observa en cantidades moderadas en el núcleo geniculado medial ventral (MGV), donde las cantidades de VLGUT2 son mínimas. El VGLUT1 sólo está presente de forma mínima en todo el tectum, la sustancia gris periacueductal y el tegmento, y falta casi por completo en la parte compacta (SNC) y la parte reticulada (SNR) de la sustancia negra. En los pericariones y puntos neuronales de la SNR hay una débil presencia de tinción de VGLUT2 (D, micrografía de alta potencia de la indicada en (C) con un rectángulo, donde el VGLUT1 falta prácticamente por completo (correspondiente en F)). Acueducto mesencefálico (Aq).

Barras en A, C, E = 1 mm; en B, D, F = 200 \mum.

Ejemplo 2o

Con referencia a la Figura 17)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el tronco encefálico pontomedular.

Las micrografías de baja y alta potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A-D) y VGLUT1 (E-H). Éstas muestran una gran cantidad de inmunorreactividad ("ir") de VGLUT2 punteado (B,D) en la oliva superior medial (MSO), donde VGLUT1-ir es baja (F,H). La VGLUT2-ir es relativamente débil en el núcleo del cuerpo trapezoide (TZ) (B-C), donde hay mayor presencia de VGLUT1-ir (F-G). Se puede observar que grandes puntos confluentes claramente positivos con respecto a VGLUT1 rodean cuerpos celulares neuronales inmunonegativos en el TZ (G). En el núcleo sensitivo central del nervio trigémino (Pr5) hay fuertes puntos de VGLUT1-ir, donde VGLUT2-ir es muy baja. En el núcleo trigeminal motor (Mo5) hay puntos moderadamente positivos con respecto a VGLUT1, donde la VGLUT2-ir es baja. La VGLUT1-ir y la VGLUT2-ir están presentes en menor cantidad en el núcleo parabraquial medial lateral (LPB, MPB). El locus coerulus (LC) presenta una acumulación moderada de VGLUT2-ir, donde la VGLUT1-ir es muy baja. La VGLUT1-ir y la VGLUT2-ir faltan en el tracto piramidal (pyr). Sectores adyacentes (I, J), teñidos alternativamente para VGLUT2 (I) y VGLUT1 (J), presentan una gran cantidad de inmunorreactividad ("ir") de VGLUT1 punteada en el núcleo coclear ventral anterior (VCA), donde, en principio, el VGLUT2 falta por completo. Una micrografía de alta potencia (K) de J muestra puntos de VGLUT-ir muy positivos, que encierran cuerpos celulares y procesos neuronales inmunonegativos. En el núcleo coclear dorsal (DC) hay una mayor cantidad de puntos de VGLUT1-ir que de puntos positivos de
VGLUT2-ir.

Barras en A,E = 500 \mum; en B, F, I, J = 200 \mum; en C, D, G, H, K = 25 \mum.

Ejemplo 2p

Con referencia a la Figura 18)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el tronco encefálico inferior.

Las micrografías de baja y alta potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A,C,E,G) y VGLUT1 (B,D,F,H), y muestran una cantidad moderada de inmunorreactividad ("ir") de VGLUT2 punteada pequeña en el núcleo trigeminal espinal superficial (Sp5), lo que está marcado con las flechas (A,G), donde, en principio, la VGLUT1-ir falta por completo (flechas en B,H). El VLGUT2 está presente de forma moderada en el núcleo motor dorsal del vago (10), el núcleo hipogloso (12), la formación reticular (Rt) y la parte ventral del tracto solitario (SolV) (A,C,E), donde, en principio, el VGLUT1 falta por completo (B,D,F). La VGLUT2-ir es muy baja en el tracto solitario dorsal (SolD). Se puede observar la preponderancia del VGLUT1 en el Sp5 profundo (B,F,H), el cuneato (Cu) y el núcleo grácil (GR), donde la VGLUT2-ir es muy baja. Las estrellas marcan el canal central.

Barras en A, B = 500 \mum; C, D = 200 \mum, E, F = 100 \mum; G, H = 100 \mum.

Ejemplo 2q

Con referencia a la Figura 19)

Se trata de una comparación entre VGLUT1 y VGLUT2 con respecto a la distribución en el cerebelo.

Las micrografías de baja y alta potencia de dos secciones frontales adyacentes, teñidas alternativamente para VGLUT2 (A, B) y VGLUT1 (C,D), muestran una densidad extrema de puntos positivos con respecto a VLGUT1 con una tinción intensa en la capa molecular (m), muy pocos puntos de VLGUT1 alrededor de cuerpos de la célula de Purkinje en la capa celular de Purkinje (p), y una acumulación densa de tipo glomerular de puntos de VGLUT1 confluentes con una fuerte tinción en la capa granular (g). Los puntos de VGLUT2-ir son mucho menos densos en la capa molecular, donde están dispuestos a modo de banda. Los puntos de VGLUT2-ir, que forman estructuras de tipo glomerular en la capa glomerular (g), son menos densos que los correspondientes a la tinción de VGLUT1.

Barras en A, C = 500 \mum; en B, D = 100 \mum.

Discusión y análisis con respecto al Ejemplo 2 general

La distribución diferencial de BNPI y DNPI en la sinapsis del sistema aferente primario, trigeminal espinal y supraespinal es una fuerte evidencia de la posibilidad de influir selectivamente en las funciones sensitivas mediante la modulación selectiva del transporte de glutamato por medio de DNPI o BNPI.

La presencia de BNPI y DNPI en el DRG indica la posibilidad de influir selectivamente en inflamaciones neurogénicas periféricas mediante la intervención selectiva en la diana de DNPI o BNPI. La presencia en el DRG también indica una función inmunomoduladora y la correspondiente determinación de dianas. Una presencia de BNPI y DNPI en el vago sensitivo o en el ganglio glosofaríngeo indica la diana para la baroaferencia, quimioaferencia, función cardiovascular o cardiorrespiratoria, incluyendo asma, hipertonía, etc., y también para emesis. También es interesante la distribución para el eje intestino-cerebro, es decir la regulación de la saciedad, de la "inflammatory bowel disease" (trastorno intestinal inflamatorio) o enfermedad de Crohn, y también para la autoinmunidad en el sistema nervioso central o periférico, diabetes autoinmune, neuropatía alcohólica, pancreatitis crónica inducida por alcohol con neuroproliferación (Fink y col. con Weihe; Neuroscience). Ya sólo la distribución en el SNC y el SNP hace que estas dianas sean objetos interesantes en el resto de las indicaciones arriba citadas.

No obstante, otro punto decisivo consistía en que se pudo detectar BNPI y DNPI en las regiones aferentes de las zonas sensitivas del ojo y el oído, lo que, en combinación con los otros conocimientos, sugiere una función importante en caso de trastornos de la vista, retinitis pigmentosa, degeneración del óptico, cataratas, desprendimiento de retina, degeneración de retina, glaucoma o nistagmo, o trastornos auditivos, tinnitus, M. Menière, pérdida repentina del oído, enfermedades del órgano auditivo y/o el órgano del equilibrio o enfermedades de la vía auditiva o vestibular.

También es decisivo que la distribución de VGLUT2 (=DNPI) en la mayoría de las regiones del cerebro y la médula espinal sea complementaria y mutuamente excluyente con respecto a la expresión de VGLUT1 (=BNPI). Los dos transportadores de glutamato juntos podrían ser responsables de la absorción del glutamato por las vesículas sinápticas de todas las neuronas glutamatérgicas centrales.

Aquí se ha comprobado que los centros talámicos y de transmisión del tronco encefálico de la vía visual y estatoacústica se activan mediante señales diferenciales controladas por VGLUT1 y VGLUT2. Los centros de transmisión talámicos y mesenfálicos del sistema visual, como el colículo superior y el núcleo geniculado dorsolateral y el núcleo terminal medial del "accessory optic tracts" del sistema óptico están controlados específicamente por el VGLUT2, lo que sugiere que las células ganglionares de la retina, que representan la tercera neurona del sentido óptico, están recubiertas como mínimo parcialmente con VGLUT2. En cambio, los centros de transmisión coclear del tronco encefálico, trapezoide olivar y geniculado medial metatalámico de la vía auditiva reciben una fuerte entrada (input) de sinapsis glutamatérgicas recubiertas de VGLUT1.

Diferentes núcleos del sistema visual del tronco encefálico reciben una fuerte entrada (input) a través de puntos sinápticos de VGLUT2. Por consiguiente, parece que el tronco encefálico del sistema óptico es abastecido exclusivamente por sinapsis glutamatérgicas de VGLUT2.

De las investigaciones se desprenden los siguientes resultados y conclusiones:

El DNPI es un marcador para vesículas sinápticas glutamatérgicas, habiendo 2 tipos diferentes de neuronas o sinapsis. El VGLUT1 y el VGLUT2 presentan un patrón de distribución diferencial.

En conjunto, la distribución del BNPI y DNPI en el SNC y el SNP indican que desempeñan una función en las diferentes indicaciones arriba mencionadas, para las que se buscan compuestos medicinales eficaces para dichas dianas con el procedimiento según la invención.

Ejemplo 3 Realización del procedimiento de screening (rastreo) midiendo la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado radiactivo

Una sección de ácido nucleico que codifica BNPI se clona en un vector de expresión que permite una expresión constitutiva (por ejemplo promotor CMV) o una expresión inducible en células eucariotas. El DNA se introduce en células eucariotas (por ejemplo células CHO, células HEK293 o células NIH-3T3) con procedimientos de transfección adecuados, por ejemplo con lipofectamina (firma Roche Diagnostics). Las células se cultivan en presencia de un reactivo de selección (por ejemplo zeocina, higromicina o neomicina) de modo que sólo sobreviven las células que han absorbido el constructo de DNA y que, en caso de una selección más duradera, también lo han incorporado al genoma.

A partir de estas células se obtienen fracciones de membrana que contienen una mayor cantidad de BNPI y pueden ser utilizadas para un ensayo de unión. Éste consiste en 1.) membranas que contienen el BMPI; 2.) un ligando marcado radiactivo; 3.) un tampón de unión (por ejemplo 50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA) y los ligandos analizados en cuanto a la unión. Después de la incubación de las mezclas de reacción arriba mencionadas (por ejemplo durante 30-60 minutos) a una temperatura adecuada (en la mayoría de los casos temperatura ambiente), las moléculas de ligando radiactivas no unidas se separan por filtración. La cantidad restante de ligando unido se mide en un \beta-counter (por ejemplo Trilux, firma Wallac) después de añadir un cóctel de escintilación. Si la sustancia de ensayo presenta una unión con BMPI, éste se detecta como incorporación radiactiva reducida. Este procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para realizarlo mediante un robot según el llamado procedimiento Hightroughput screening (HTS) (screening de alto rendimiento).

Ejemplo 4 Realización del procedimiento de screening con DNPI según la invención y medida de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia

Una sección de ácido nucleico que codifica DNPI se clona en un vector de expresión que permite una expresión inducible en procariotas, por ejemplo en E. coli. La sección de ácido nucleico se modifica de tal modo que es expresada como proteína de fusión con una secuencia de aminoácidos N-terminal o C-terminal adicional. Esta secuencia debería permitir, sin modificar la función del DNPI, una purificación a través de un procedimiento específico, por ejemplo fragmento de glutatión-S-transferasa que posibilita el aislamiento a partir de la mezcla de proteínas mediante la unión al glutatión. Después de la transfección de las bacterias, la inducción del gen (por ejemplo con IPTG en el promotor lac) y la desintegración de las bacterias, las proteínas de fusión se purifican y se utilizan en un experimento de quinasa in vitro. Para ello, 5 \mug de proteína se tratan a 30ºC durante 30 minutos en 50 \mul de tampón de quinasa (20 mM PIPES, pH 7,0, 5 mM MnCl_{2}, 7 mM \beta-mercaptoetanol, 0,4 mM espermina, 10 mM rATP) complementados con 10 \muCi [\gamma^{32}P]-ATP. Como sustrato se añade proteína Histona H1 purificada (firma Sigma) o proteína de fusión GST-NFATc1 expresada de forma bacteriana. Después del período de incubación, el [\gamma-^{32}P]-ATP no incorporado se separa por filtración y la cantidad de ^{32}fosfato incorporado se determina mediante escintilación \beta (Trilux, firma Wallac). En un experimento para descubrir nuevos inhibidores de BNPI, las sustancias de ensayo se incuban conjuntamente en esta carga y se utiliza la disminución de la incorporación de ^{32}P como indicador de inhibición. Este procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para realizarlo mediante un robot según el llamado procedimiento "hightroughput screening" (HTS) (screening de alto rendimiento).

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Ejemplo 5 Ejemplo de medicamento para el tratamiento del tinnitus o para el tratamiento de trastornos motoneuronales que contiene un compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención - formulación en pastillas

Las pastillas se pueden producir mediante compresión directa de una mezcla del compuesto según la invención con los materiales auxiliares adecuados, o mediante compresión de granulados que contienen dicho compuesto (en caso dado con otros materiales auxiliares). Los granulados se pueden producir bien por granulación en húmedo, por ejemplo con líquidos de granulación acuosos, y secado subsiguiente de los granulados, o bien por granulación en seco, por ejemplo mediante compactación.

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\sqbullet Compresión directa

Por ejemplo, por pastilla:	25 mg	Compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención
	271 mg	\begin{minipage}[t]{100mm} LudipressTM (granulado para la producción directa de pastillas a partir de monohidrato de lactosa, povidona K30 y crospovidona)\end{minipage}
	4 mg	Estearato de magnesio
	300 mg	Total

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Se prepara una mezcla homogénea del principio activo con los materiales auxiliares y ésta se comprime en una prensa para obtener pastillas con un Ø de 10 mm.

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\sqbullet Granulación en seco

Por ejemplo, por pastilla:	25 mg	Compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención
	166 mg	Celulosa microcristalina
	80 mg	Hidroxipropilcelulosa de baja sustitución (I-HPC LH 11^{TM})
	5 mg	Dióxido de silicio altamente disperso
	4 mg	Estearato de magnesio
	280 mg	Total

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Se prepara una mezcla homogénea del compuesto con la celulosa microcristalina y la I-HPC y se compacta. Después de tamizar los productos de compresión, el granulado formado se mezcla con estearato de magnesio y dióxido de silicio y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un Ø de 9 mm.

\sqbullet Granulación en húmedo

Por ejemplo, por pastilla:	25 mg	Compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención
	205 mg	Celulosa microcristalina
	6 mg	Povidona K30
	10 mg	Crospovidona
	4 mg	Estearato de magnesio
	250 mg	Total

Se prepara una mezcla homogénea del compuesto con la celulosa microcristalina y la crospovidona y se granula en un granulador con una solución acuosa de povidona. A continuación, el granulado húmedo se vuelve a someter a granulación y después del secado se somete a un secado adicional en un armario de secado (50ºC) durante 10 horas. El granulado seco se tamiza junto con el estearato de magnesio, se somete a mezcla final y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un Ø de 8 mm.

Ejemplo 6 Ejemplo de medicamento para el tratamiento del tinnitus o para el tratamiento de trastornos motoneuronales que contiene un compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención - solución parenteral

1 g de un compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención se disuelve a temperatura ambiente en 1 l de agua para inyección y a continuación se ajusta a condiciones isotónicas mediante adición de NaCl (cloruro de sodio).

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<120> Procedimiento de rastreo para diferentes indicaciones con BNPI y/o DNPI

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<210> 1

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<211> 2366

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<211> 2024

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<212> DNA

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<213> Rattus norvegicus

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 6

13

14

15

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<210> 7

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<211> 3946

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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16

17

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<210> 8

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<211> 582

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

18

19

20

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<210> 9

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<211> 3982

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<212> DNA

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<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 9

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21

22

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<210> 10

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<211> 582

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 10

23

24

25

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<210> 11

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<211> 2836

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 11

26

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<210> 12

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<211> 560

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

27

28

29

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<210> 13

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<211> 2528

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 13

30

31

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<210> 14

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<211> 582

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 14

32

33

34

Claims (9)

1. Procedimiento para la localización de sustancias farmacéuticamente relevantes con eficacia en las indicaciones o para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de las neuronas motoras espinales, atrofias musculares, distrofias musculares o esclerosis múltiple, con los siguientes pasos de procedimiento:

(a)

incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre:

la proteína DNPI y/o una proteína según una de las Figuras 2b), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos como mínimo en un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o a su polinucleótido antisentido,

y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,

(b)

medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o con un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,

midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular midiendo la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero,

o

midiendo la unión por el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula y/o proteína y/o por la actividad de una sustancia de ensayo marcada unida con ésta.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería genética antes del paso (a).

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la manipulación por ingeniería genética permite medir como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque mediante la manipulación por ingeniería genética se expresa una forma de una proteína G no expresada de modo endógeno en la célula o se introduce un gen indicador.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contiene como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, preferentemente en como mínimo un 95%, en particular en como mínimo un 97%.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el polinucleótido está contenido en un constructo de DNA recombinante.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la célula, después de la manipulación por ingeniería genética según la reivindicación 2 y antes del paso (a) según la reivindicación 1, se cultiva bajo condiciones que permiten una expresión, dado el caso bajo presión de selección.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula es una célula de anfibio, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero inmortalizada o nativa.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que un primer procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 se acopla con un segundo procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 de tal modo que los valores de medida y los resultados del primer procedimiento con respecto a la sustancia a medir se comparan con los valores de medida y los resultados del segundo procedimiento con respecto a la sustancia a medir, caracterizado porque en el paso (a) de uno de los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento principal, la sustancia a ensayar

se incuba con una biomolécula seleccionada de entre el grupo III:

la proteína DNPI y/o una proteína según una de las Figuras 2b), 2d) o 2f) y/o una proteína similar a una de estas proteínas arriba mencionadas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 2a), 2c) o 2e) o a su polinucleótido antisentido,

y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que sintetiza como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo III anteriormente mencionadas,

y

porque en el paso (a) del segundo de los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento secundario, la sustancia a ensayar se incuba con una biomolécula del grupo I o con una biomolécula del grupo III, no eligiéndose la biomolécula con la que ha sido incubada la sustancia en el procedimiento principal.