ES2276964T3 - Procedimiento de screening que utiliza bnpi para diferentes indicaciones. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la localización de sustancias farmacéuticamente relevantes con eficacia en las indicaciones o para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de las neuronas motoras espinales, atrofias musculares, distrofias musculares o esclerosis múltiple, con los siguientes pasos de procedimiento: (a) incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre: la proteína BNPI y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f) o 1h) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o a su polinucleótido antisentido, y/o de una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las proteínas, o biomoléculas del grupo I, anteriormente mencionadas, (b) medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, mediante la medida de la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular mediante la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante la modificación de la actividadenzimática o de la concentración del 2º mensajero, o mediante la medida de la unión por el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula y/o de la proteína y/o mediante la actividad de una sustancia de ensayo marcada unida con ésta.
Description
Procedimiento de screening que utiliza BNPI para
diferentes indicaciones.
La invención se refiere a un procedimiento para
encontrar sustancias farmacéuticamente relevantes utilizando BNPI o
biomoléculas derivadas de éste.
La localización de los lugares de ataque de
principios activos farmacéuticos, denominados "dianas"
(targets), es una de las más importantes misiones de la
investigación farmacéutica moderna. Debido a las afinidades con
estas dianas o también a los efectos fisiológicos provocados por una
interacción con estas dianas, mediante los llamados
"procedimientos de screening" (rastreo) se pueden seleccionar
de entre las numerosas sustancias conocidas, por ejemplo de
bibliotecas de sustancias de investigación farmacéutica, sustancias
o tipos de sustancias interesantes que, con mucha probabilidad,
serán eficaces en las indicaciones asociadas a la diana
correspondiente. Entre los ejemplos más importantes de estas dianas
se encuentran proteínas, en general receptores, en particular
receptores acoplados a la proteína G, y proteínas de transporte. Sin
embargo, la localización de estas dianas es, en parte, muy difícil,
ya que la selección potencial es muy amplia. Para la orientación y
la identificación se emplean, por una parte, los conocimientos
sobre la función (fisiológica) según la posición (potencial) en
cascadas de señales y rutas metabólicas, pero, por otra parte,
también se emplea la localización y el grado de expresión en los
diferentes tejidos. En el marco de esta invención, se fija especial
atención al sistema nervioso central, donde no sólo es importante
una localización general, sino también una distribución muy
específica y precisa en las diferentes regiones.
Si bien en el estado actual de la técnica se
discuten procedimientos para la localización de dianas, en ningún
caso se ha descrito una relación entre el BNPI, principios activos
derivados de éste y determinadas indicaciones. Por ejemplo, el
documento WO 01/64835 A da a conocer secuencias de ácidos nucleicos
y amioácidos obtenidas en base a proyectos de secuenciación, y
también de forma general e indeterminada un procedimiento para la
identificación de principios activos que se unen a los polipéptidos
publicados. El procedimiento de screening (rastreo) mostrado en el
documento WO 01/64835 A utiliza en principio cualquiera de las más
de 27.000 secuencias mencionadas, pero no establece ninguna
relación entre éstas y una indicación determinada, ni describe
principios activos identificados a través de estos procedimientos
de screening (rastreo).
La publicación
US-A-5 985 604 da a conocer la
secuencia de ácidos nucleicos y amioácidos de "human
sodium-dependent phosphate cotransporters"
NAPTR (cotransportadores de fosfato dependiente de sodio humanos).
El documento US-A-5 985 604 también
describe procedimientos para la preparación de este polipéptido y
para la detección del polipéptido a partir de una muestra. Sin
embargo, dicho documento no describe ningún procedimiento para la
identificación de principios activos que se unen con NAPTR, ni
tampoco describe ninguna relación con indicaciones
determinadas.
El documento WO 01/57190 A describe la
"human epidermal protein-1"
(proteína-1 epidérmica humana) aislada de cérvix
adulta y procedimientos para la detección de polinucleótidos o
polipéptidos de "epidermal protein-1"
humana en una muestra. El documento WO 01/57190 A no describe el
BNPI ni establece ninguna relación entre el BNPI e indicaciones
determinadas.
Por consiguiente, el objetivo de la invención
consistía en la localización e identificación de una o más dianas
de este tipo, en particular con localización y eficacia en el
sistema nervioso central, y en el desarrollo del procedimiento de
screening (rastreo) correspondiente. En consecuencia, la invención
se refiere a un procedimiento para la localización de sustancias
farmacéuticamente relevantes con eficacia en las indicaciones o para
el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de
las neuronas motoras espinales, atrofias musculares, distrofias
musculares o esclerosis múltiple, con los siguientes pasos de
procedimiento:
- (a)
- incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre:
- la proteína BNPI y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f), 1h) y/o una proteína similar a una de estas proteínas como mínimo en un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 1g) o un polinucleótido similar a éste en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 1g) o a su polinucleótido antisentido,
- y/o una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,
- (b)
- medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas en una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I, dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,
mediante la medida de la
regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos
y/o enzimas, en particular mediante la medida de la modificación de
la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de
membrana, mediante la modificación de la actividad enzimática o de
la concentración del 2º mensajero,
o
mediante la medida de la unión por
el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula
y/o proteína y/o mediante la actividad de una sustancia de ensayo
marcada unida a
ésta.
Este nuevo procedimiento de screening (rastreo)
se basa en que se puede encontrar la eficacia medicinal potencial
de una sustancia a través de su interacción con como mínimo una
estructura proteínica o peptídica fisiológicamente relevante, una
diana, BNPI o estructuras relacionadas. El BNPI se denomina VGLUT1
en la literatura y, en parte, también en esta invención. Por
consiguiente, estos términos se han de considerar como completamente
equivalentes, sobre todo en el marco de esta invención. En el marco
de la presente invención, como dianas interesantes se identificaron
el BNPI o las proteínas o los péptidos derivados de éste aquí
citados, o ácidos nucleicos que codifican los mismos. El BNPI
presentaba una localización en las áreas del SNC más diversas, pero
sorprendentemente - a pesar de una cercanía estrechísima en parte -
también presentaba una localización siempre separada de forma
estricta, indicando claramente esta separación estricta que a través
del BNPI se controlan importantes procesos fisiológicos. El BNPI
(VGLUT1) se expresa fuertemente en una amplia población de neuronas
DRG grandes, que son negativas a la sustancia P. En cambio, el DNPI
(VGLUT2) afín, o su mRNA, se encuentra sobre todo en las neuronas
medianas y pequeñas positivas a la sustancia P. La localización de
VGLUT1 (BNPI) es totalmente independiente de la localización del
transportador VGLUT3 afín. Dado que el BNPI está localizado en áreas
del SNC muy interesantes desde el punto de vista terapéutico y que,
en consecuencia, es interesante para múltiples indicaciones
asociadas, el BNPI constituye así una diana importante con la que se
pueden llevar a cabo procedimientos de screening (rastreo) de
compuestos farmacológicamente eficaces. En consecuencia, también es
preferible utilizar en un procedimiento de screening (rastreo) BNPI
o una de las biomoléculas derivadas de éste, como proteínas o
péptidos, o un ácido nucleico que codifica las mismas, o el
resultado de dos procedimientos de screening (rastreo) llevados a
cabo con BNPI o una de las biomoléculas derivadas de éste, como
proteínas o péptidos, o un ácido nucleico que codifica las mismas,
e identificar en ambos casos, por comparación
diferencial de los datos, sustancias farmacológicamente eficaces que, en tal caso, son altamente específicas.
diferencial de los datos, sustancias farmacológicamente eficaces que, en tal caso, son altamente específicas.
Los conceptos "farmacéuticamente relevante"
o "farmacológicamente eficaz" se refieren a una influencia
potencialmente curativa o paliativa de la sustancia sobre
determinados cuadros clínicos. El término "sustancia" incluye
cualquier compuesto adecuado como principio activo medicamentoso,
principalmente principios activos de bajo peso molecular, pero
también otros como ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o
proteínas como anticuerpos.
Por "incubación bajo condiciones adecuadas"
se ha de entender que la sustancia a examinar puede reaccionar con
la biomolécula o con la célula o el preparado correspondiente en un
medio acuoso durante un tiempo determinado antes de la medida. La
temperatura del medio acuoso se puede regular, por ejemplo entre 4ºC
y 40ºC, preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo
de incubación puede variar entre unos segundos y varias horas,
dependiendo de la interacción de la sustancia con la biomolécula o
proteína. No obstante son preferentes tiempos de incubación de 1
minuto a 60 minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o
sistemas tampón adecuados, de modo que durante la incubación el
medio tenga un pH por ejemplo entre 6 y 8, preferentemente un pH
7,0-7,5. También se pueden añadir al medio otras
sustancias adecuadas como coenzimas, nutrientes, etc. Los
especialistas pueden determinar fácilmente las condiciones
adecuadas en función de la interacción examinada de la sustancia
con la proteína basándose en su experiencia, en la literatura o en
unos pocos ensayos preliminares sencillos, con el fin de obtener el
valor de medida más claro posible en el procedimiento.
Una célula que ha sintetizado una proteína o
biomolécula determinada es una célula que ya ha expresado esta
proteína de forma endógena o una célula que ha sido modificada por
ingeniería genética de tal modo que expresa esta proteína o
biomolécula y, por tanto, contiene la proteína antes del comienzo
del procedimiento según la invención. Las células pueden ser
células de líneas celulares dado el caso inmortalizadas o células
nativas procedentes de tejidos y aisladas de éstos, estando la
agrupación celular disuelta en la mayoría de los casos. El
preparado de estas células incluye principalmente materiales
homogeneizados de células, el citosol, una fracción de membrana
celular con fragmentos de membrana, una suspensión de orgánulos
celulares aislados, etc.
La especie de procedencia de estas proteínas o
biomoléculas carece de importancia para la función del
procedimiento, pero es preferible utilizar la variante humana, de
ratón o de rata. El BNPI es conocido en cuanto a la secuencia de
DNA codificadora y la secuencia de aminoácidos y también se ha
descrito su función general. El BNPI, "brain Na^{+}
dependent inorganic phosphate cotransporter" (cotransportador
de fosfato inorgánico dependiente de Na^{+} cerebral), se
describe en el documento WO 96/34288. Además de la función como
transportador de fosfato dependiente de sodio, también se ha
descrito una función del BNPI como transportador de glutamato
vesicular, habiéndose denominado el BNPI como VGlutT1 (Bellocchio y
col. (2000), Science 189:957-960; Takamori y col.
(2000), Nature 407; 189-194).
Las etapas por las cuales el procedimiento
permite hallar sustancias de interés consisten bien en la unión a
la biomolécula o a la proteína, que se puede comprobar por el
desplazamiento de un ligando conocido o por la magnitud de la
sustancia unida, o bien en la modificación de un parámetro funcional
a través de la interacción de la sustancia con la proteína o la
biomolécula. Esta interacción puede consistir principalmente en una
regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales
iónicos y/o enzimas, y los parámetros funcionales modificados
pueden ser, por ejemplo, la expresión genética, el medio iónico, el
pH o el potencial de membrana, o la variación de la actividad
enzimática o de la concentración del 2º mensajero.
A continuación, para aclarar la invención,
además de las explicaciones conceptuales dadas en el texto general,
se muestran otras definiciones con el fin de establecer claramente
cómo se han de entender e interpretar en el sentido de esta
invención determinados conceptos utilizados principalmente en las
reivindicaciones.
- -
- Sustancia: Este término hace referencia a un compuesto químico. Más concretamente, aquí se trata de compuestos que pueden desarrollar potencialmente un efecto en el cuerpo, principios activos de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas, en este caso sobre todo principios activos de bajo peso molecular.
- -
- Sustancia farmacéuticamente relevante: En el sentido de la invención, una sustancia farmacéuticamente relevante es una sustancia que, a través de la unión a las biomoléculas de los grupos I a III, podría ser eficaz en como mínimo una de las indicaciones mencionadas y que teóricamente tiene potencial para influir fisiológicamente de forma directa o indirecta en los síntomas, en particular que parece que se pueda utilizar terapéuticamente, por ejemplo en un medicamento.
- -
- Regulador del dolor: En el sentido de la invención, "regulador del dolor" significa que la sustancia influye directa o indirectamente en la percepción del dolor, en particular que actúa como analgésico de forma natural.
- -
- Dolor: En el sentido de la invención, "dolor" significa principalmente una sensación de dolor, más concretamente dolor agudo, crónico, neuropático e inflamatorio, incluyendo migraña, en particular un dolor perteneciente a los siguientes tipos:
- dolor crónico, en particular dolor musculoesquelético; dolor neuropático, en particular dolor alodínico, hiperalgesia mecánica o neuropatía diabética; dolor visceral, dolor cerebral, dolor periférico o dolor condicionado por inflamación, en particular dolor inflamatorio periférico; y también migrañas, cefaleas agrupada o dolor en caso de una neuralgia del trigémino.
- -
- Incubación: Por "incubación" se entiende que un objeto de estudio biológico, por ejemplo una célula o una proteína, se introduce y se deja en un medio a temperatura regulada, por ejemplo en una estufa incubadora o sobre un baño de agua. En este contexto, por el concepto "condiciones adecuadas" se entiende una incubación bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo 37ºC, pH 7,2) o bajo las condiciones que permiten una medida óptima en el procedimiento.
- -
- Célula: La célula es un sistema autorregulado, abierto, que se encuentra en equilibrio dinámico con su entorno mediante el intercambio permanente de materiales, con metabolismo propio y capacidad de reproducción. La célula se puede cultivar por separado o puede formar parte de un tejido, en particular de un órgano, y encontrarse en éste de forma aislada o todavía en una agrupación celular.
- -
- Preparado celular: Por este concepto se entienden preparados producidos mediante métodos químicos, biológicos, mecánicos o físicos con modificación de la estructura celular, por ejemplo fragmentos de membrana, compartimentos celulares aislados, citosol aislado, o material homogeneizado obtenido de tejido.
- -
- Péptido: Compuesto de aminoácidos unidos en cadenas mediante enlaces peptídicos. Un oligopéptido consiste en 2 a 9 aminoácidos, un péptido consiste en 10 a 100 aminoácidos.
- -
- Proteína: Compuesto de más de 100 aminoácidos unidos en cadenas mediante enlaces peptídicos, eventualmente con una estructura espacial definida.
- -
- PIM1-quinasa; PIM3-quinasa: un protooncogén y una serina-treonina-quinasa.
- -
- Polinucleótido: El nucleótido que sirve de base es un componente básico de los ácidos nucleicos que consiste fundamentalmente en una base de nucleína, pentosa y ácido fosfórico. Corresponde a un polinucleótido de alto peso molecular de varios nucleótidos unidos entre sí a través de esterificación de la ácido fosfórico-pentosa. Pero en esta invención se utilizan también polinucleótidos modificados que, si bien conservan la sucesión de bases, disponen de un esqueleto modificado en lugar de la ácido fosfórico-pentosa.
- -
- Similar en como mínimo un 90(95,97)%: Este concepto significa que la sucesión de bases de la región codificadora de los polinucleótidos incluidos es idéntica a la de referencia (figura, etc.) en como mínimo un 90% (95%, 97%), y que la sucesión de aminoácidos de la estructura primaria de los péptidos y proteínas incluidos es idéntica a la referencia en como mínimo un 90% (95%, 97%).
- -
- Gen: Con el término "gen" se designa una sección de genoma con una secuencia de nucleótidos definida que incluye la información para la síntesis de un mRNA o pre-mRNA o de un RNA de otro tipo (por ejemplo tRNA, rRNA, snRNA, etc.). Consiste en secciones codificadoras y no codificadoras.
- -
- Fragmento de gen: Sección de ácido nucleico que incluye en su sucesión de bases una región parcial de un gen.
- -
- Biomolécula: Término general para ácidos nucleicos o poliaminoácidos, en particular también DNA, RNA, péptidos y proteínas, pudiendo estas moléculas también estar modificadas de forma artificial. En el sentido de esta invención, el término se refiere preferentemente a péptidos y proteínas.
- -
- Unión al péptido o proteína: Interacción entre la sustancia y el péptido o proteína que conduce a la fijación.
- -
- Parámetros funcionales: Por este concepto se entienden magnitudes de medida de un experimento que están en correlación con la función de una proteína (canal iónico, receptor, enzima).
- -
- Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.
- -
- Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.
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- Proteína G: Abreviatura internacional habitual para una proteína que se une a guanosin-trifosfato (GTP), que se activa como proteína de señal a través de receptores acoplados a la proteína G.
- -
- Gen indicador: Designación general para genes cuyos productos genéticos se pueden comprobar fácilmente con ayuda de sencillos métodos bioquímicos o histoquímicos, por ejemplo luciferasa, fosfatasa alcalina o Green Fluorescent Protein (GFP) (proteína fluorescente verde).
- -
- Constructo de DNA (recombinante): Designación general para todo tipo de moléculas de DNA formadas por ligadura in vitro de moléculas de DNA.
- -
- Vector de clonación: Designación general para moléculas de ácido nucleico que durante la clonación actúan como portadores de genes extraños o de partes de estos genes.
- -
- Vector de expresión: Designación para vectores de clonación construidos especialmente, los cuales, después de introducirlos en una célula huésped adecuada, permiten la transcripción y traducción del gen extraño incorporado por clonación en el vector.
- -
- Secuencia LTR: Abreviatura de long terminal repeat. Designación general para regiones de secuencia más largas que se encuentran en ambos extremos de un genoma lineal. Estas regiones de secuencia se encuentran, por ejemplo, en el genoma de retrovirus y en los extremos de transposones eucarióticos.
- -
- Cola poli-A: Los restos adenilo (aproximadamente 20-250) fijados en el extremo 3' de RNA mensajeros mediante poliadenilación.
- -
- Secuencia promotora: Designación para una región de secuencia de DNA a partir de la cual se controla la transcripción de un gen, es decir, la síntesis de mRNA.
- -
- Secuencia ORI: Abreviatura de origin of replication (origen de replicación). La secuencia ORI permite que una molécula de DNA se reproduzca como unidad autónoma en la célula.
- -
- Secuencia intensificadora: Designación para elementos genéticos relativamente cortos, que se presentan en parte en forma de repeticiones y que en general refuerzan la expresión de algunos genes en diferente medida.
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- Factor de transcripción: Designación para una proteína que influye en la transcripción de un gen a través de una unión con secuencias de DNA específicas.
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- Cultivar: Mantener células o tejidos bajo condiciones de cultivo adecuadas.
- -
- Condiciones que permiten la expresión: Por este concepto se entiende la selección y aplicación de condiciones de cultivo que permiten la expresión de la proteína de interés, entre las que se encuentran la modificación de la temperatura, el cambio de medio, la adición de sustancias inductoras, la supresión de sustancias inhibidoras.
- -
- Tiempo de incubación: Tiempo durante el cual las células o tejidos son incubados, es decir, sometidos a una temperatura determinada.
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- Presión de selección: Aplicación de condiciones de cultivo que proporcionan una ventaja de crecimiento a las células con un producto genético determinado, el denominado marcador de selección.
- -
- Célula de anfibio: Célula de un animal de la clase Amphibia.
- -
- Célula bacteriana: Célula asignable al dominio de las eubacterias o arqueobacterias, o procedente del mismo.
- -
- Célula de levadura: Célula asignable al orden de los Endomycetales, o procedente del mismo.
- -
- Célula de insecto: Célula asignable al orden de los Hexapoda, o procedente del mismo.
- -
- Célula de mamífero nativa: Célula procedente de un mamífero, cuyas características relevantes corresponden a las de la célula que se encuentra en el organismo.
- -
- Célula de mamífero inmortalizada: Célula que, mediante las condiciones de cultivo aplicadas o mediante manipulación por ingeniería genética, ha adquirido la propiedad de dividirse en el cultivo más allá de la frecuencia de división habitual (aproximadamente 100).
- -
- Marcado: Hecho accesible mediante modificación o derivación correspondiente para una reacción de comprobación. Por ejemplo, radiactivo, fluorescente o luminiscente.
- -
- Ligando: Sustancia que se une a una molécula que se encuentra en el cuerpo o en una célula, especialmente un receptor.
- -
- Desplazamiento: Separación total o parcial de un ligando de su sitio de unión.
- -
- Actividad relacionada: Valor de medida registrado bioquímica o físicamente, que está en correlación con la cantidad de ligando unida a un receptor.
- -
- Regulación: La inhibición o activación de un proceso como parte de un proceso de regulación.
- -
- Inhibición: Como caso especial de regulación, impedimento/reducción de un proceso.
- -
- Activación: Como caso especial de regulación, intensificación de un proceso.
- -
- Receptores: En el sentido más amplio, todas las moléculas presentes en el organismo procariota o eucariota a las que se puede unir un principio activo. Más concretamente, proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana, los cuales provocan una modificación en la célula mediante la unión de un principio activo.
- -
- Canales iónicos: Proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana, a través de los cuales la membrana puede ser atravesada por cationes o aniones.
- -
- Enzimas: Designación para proteínas o complejos de un componente activador no albuminoide con una proteína, que poseen propiedades catalíticas.
- -
- Expresión genética (expresar/expresable): La traducción de la información genética de un gen en RNA (expresión de RNA) o en una proteína (expresión de proteína).
- -
- Medio iónico: Concentración de uno o más iones en un compartimento determinado.
- -
- Potencial de membrana: Diferencia de tensión a través de una membrana a causa de un exceso de cationes en un lado de la membrana y de aniones en el otro.
- -
- Modificación de la actividad enzimática: Inhibición o inducción de la actividad catalítica de una enzima.
- -
- 2º mensajero: Molécula pequeña que se forma en el citosol o penetra en el mismo como respuesta a una señal extracelular y ayuda a transmitir la información al interior de la célula, por ejemplo cAMP, IP_{3}.
- -
- Sonda (genética): Designación para todo tipo de ácidos nucleicos con cuya ayuda se puede detectar un gen buscado o una secuencia de DNA determinada. Además, mediante derivación de la sonda genética (por ejemplo biotina, perlas magnéticas, digoxinina) se pueden extraer moléculas de DNA de una mezcla. Como sondas se utilizan genes clonados, fragmentos de genes, oligonucleótidos sintetizados químicamente y también RNA, que en la mayoría de los casos está marcado de forma radiactiva.
- -
- DNA: Designación internacional para el ácido desoxirribonucleico.
- -
- DNA genómico: Designación general para el DNA procedente del núcleo de una célula en organismos eucariotas.
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- cDNA: Abreviatura de complementary DNA (DNA complementario). Designación para la copia de DNA de cadena simple o doble de una molécula de RNA.
- -
- Banco/biblioteca de cDNA: Designación para una colección de fragmentos de cDNA clonados de forma arbitraria, que en conjunto representan la totalidad de los RNAs sintetizados de una célula o un tejido.
- -
- Clon de cDNA: Designación para una población de células genéticamente uniformes que se derivan de una única célula, conteniendo esta célula un fragmento de cDNA incorporado de forma artificial.
- -
- Hibridación: Formación de una molécula de ácido nucleico de cadena doble a partir de dos cadenas simples independientes mediante emparejamiento de bases.
- -
- Condiciones estrictas: Condiciones bajo las que sólo se forman cadenas de ácido nucleico con un emparejamiento de bases perfecto y que permanecen estables.
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- Aislar: Localizar y separar de una mezcla una molécula buscada.
- -
- Secuenciación de DNA: Determinación de la sucesión de bases de una molécula de DNA.
- -
- Secuencia de ácido nucleico: Designación para la estructura primaria de una molécula de DNA, es decir, la sucesión de las bases individuales de las que está compuesto un DNA.
- -
- Cebador de oligonucleótido específico de gen: Ácidos oligonucleicos, es decir, fragmentos de ácido nucleico con una longitud de 10-40 bases, que permiten, en su composición de bases, una hibridación estricta en el gen o el cDNA buscado.
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- Descubrimiento de cebadores de oligonucleótido: La búsqueda manual o asistida por ordenador de oligonucleótidos para una secuencia de DNA predeterminada, que sean óptimamente adecuados para una hibridación y/o para una reacción en cadena de polimerasa.
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- PCR: Abreviatura de reacción en cadena de polimerasa. Procedimiento in vitro para el enriquecimiento selectivo de regiones de ácido nucleico de longitud y secuencia definidas de una mezcla de moléculas de ácido nucleico.
- -
- DNA-molde: Molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas de ácido nucleico a partir de las cuales se multiplica una sección de DNA con ayuda de una PCR (véase más arriba).
- -
- RNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos.
- -
- mRNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos mensajeros, que intervienen en la transferencia de la información genética del núcleo a la célula y contienen la información para la síntesis de un polipéptido o de una proteína.
- -
- Polinucleótido antisentido: Molécula consistente en varios ácidos nucleicos naturales o modificados, cuya sucesión de bases es complementaria a la sucesión de bases de una región parcial de un RNA presente en la naturaleza.
- -
- PNA: Abreviatura internacional usual de peptidic nucleic acids (ácidos nucleicos peptídicos). En este contexto, los aminoácidos enlazados peptídicamente forman una cadena, portando los aminoácidos, como cadena lateral, una base apta para la hibridación con DNA o RNA.
- -
- Secuencia: Sucesión de nucleótidos o aminoácidos. En el sentido específico de esta invención, con este término se hace referencia a la secuencia de ácidos nucleicos.
- -
- Ribozima: Designación para un ácido ribonucleico catalíticamente activo (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
- -
- DNA-enzima: Designación para una molécula de DNA que posee actividad catalítica (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
- -
- RNA/DNA catalítico: Designación general para ribozimas o DNA-enzimas (véase más arriba).
- -
- Adenovirus: Virus citopatógenos presentes en los vertebrados.
- -
- Virus adenoasociado (AAV): Forma parte de la familia de los parvovirus. Para lograr una reproducción eficaz del AAV es necesaria una coinfección de las células huésped con virus auxiliares (por ejemplo herpesvirus, virus de la vaccinia o adenovirus). La propiedad del AAV de integrarse de forma estable en el genoma huésped lo hace especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos.
- -
- Herpesvirus: Patógeno viral de la infección herpes.
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- Modificación postraduccional: Modificación en proteínas o polipéptidos realizada después de la traducción, por ejemplo fosforilación, glicosilación, amidación, acetilación o proteolisis.
- -
- Glicosilar: Designación para la acción de añadir moléculas de azúcar individuales o cadenas de azúcares completas a proteínas.
- -
- Fosforilar: Designación para la acción de añadir uno o más restos fosfato a una proteína, preferentemente a los grupos OH de los aminoácidos serina, treonina o tirosina.
- -
- Amidar: Designación para la acción de transformar una función carboxilo en una función amida, por ejemplo en el resto aminoácido carboxi-terminal de un péptido o proteína.
- -
- Proveer de anclaje de membrana: Modificación postraduccional de una proteína, u otra molécula orgánica, de tal modo que ésta se une a la membrana de doble capa lipídica de células mediante la adición de una molécula hidrófoba, convenientemente un ácido graso o un derivado del mismo.
- -
- Segmentar: En este caso específico, la segmentación de un péptido o proteína en varias subsecuencias.
- -
- Acortar: Acortar en una o varias partes una molécula consistente en varias partes individuales.
- -
- Anticuerpos: Proteínas solubles o unidas a membranas celulares, designadas como inmunoglobulinas, con un sitio de unión específico para antígenos.
- -
- Anticuerpos monoclonales: Anticuerpos con una selectividad extremadamente alta dirigidos contra un único determinante antigénico de un antígeno.
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- Anticuerpos policlonales: Mezcla de anticuerpos dirigidos contra varios determinantes de un antígeno.
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- Transgénico: Modificado genéticamente.
- -
- Mamífero no humano: La totalidad de los mamíferos (clase de los Mammalia) excepto la especie humana.
- -
- Célula germinal: Célula con genoma haploide que permite la formación de un nuevo organismo mediante fusión con una segunda célula germinal.
- -
- Célula somática: Célula diploide como componente de un organismo.
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- Introducción cromosómica: Intervención en la secuencia de nucleótidos a nivel cromosómico.
- -
- Genoma: Definición general de la totalidad de los genes de un organismo.
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- Ascendiente del animal: Un animal (el ascendiente) que, por transmisión de su material genético de forma natural o artificial, está emparentado en línea directa con otro (el descendiente).
- -
- Expresable: Una molécula de ácido nucleico es expresable cuando incluye la información para la síntesis de un polipéptido o de una proteína y está provista de secuencias reguladoras correspondientes que permiten la síntesis de este polipéptido o proteína in vitro o in vivo. Cuando ya no se dan estas condiciones, por ejemplo por intervención en la secuencia codificadora, la molécula de ácido nucleico ya no es expresable.
- -
- Roedor: Animal del orden de los Rodentia, por ejemplo la rata o el ratón.
- -
- Identificable como sustancia reguladora del dolor: Sustancia que al ser incorporada en un organismo vivo produce un cambio de comportamiento que los especialistas designan como inhibidor del dolor (antinociceptivo, antihiperalgésico o antialodínico). En el caso del procedimiento de screening (rastreo), este concepto se refiere a que la sustancia, durante el rastreo, debido a una mayor unión o provocación de una variación de un parámetro funcional, supera claramente, por ejemplo en un 100%, a la unión o la interacción de la media de las sustancias ensayadas.
- -
- Compuesto: Otro nombre para una molécula consistente en varios átomos. En este caso una molécula identificable mediante el procedimiento según la invención.
- -
- Principio activo: Un compuesto que al ser administrado a un organismo provoca un cambio en dicho organismo. Por este concepto se entienden principalmente moléculas sintetizadas de forma orgánico-química que tienen un efecto curativo en el organismo. En este caso se trata en particular de moléculas que se unen a las proteínas y péptidos según la invención.
- -
- De bajo peso molecular: Molécula con un peso molecular < 2 kDa.
- -
- Medicamento: Una sustancia correspondiente a la definición dada en el Artículo 1 \NAK2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos.
- -
- Diagnóstico: Compuesto o procedimiento a utilizar para diagnosticar una enfermedad.
- -
- Tratamiento del dolor: Procedimiento destinado a mitigar o eliminar dolores, o para inhibir la posible aparición de dolores (analgesia preventiva).
- -
- Dolor crónico: Una sensación de dolor de duración prolongada, frecuentemente caracterizada porque va más allá del momento y el lugar del estímulo inicial y aumenta la sensibilidad del cuerpo al dolor.
- -
- Terapia genética: Por "terapia genética" se entienden todos los procedimientos que tienen el objetivo de tratar de forma causal enfermedades genéticas mediante modificaciones adecuadas del genoma.
- -
- Terapia genética in vivo: Introducción de material genético en el organismo vivo con el objetivo de la terapia genética. Se puede distinguir entre intervención somática e intervención en la línea germinal, que tienen lugar en un caso en células diploides y en otro caso en células haploides.
- -
- Terapia genética in vitro: Introducción de material genético en células fuera del cuerpo humano con el fin de usar éstas posteriormente para la terapia genética introduciéndolas de nuevo en el cuerpo humano.
- -
- Diagnosis: Procedimiento para identificar una enfermedad.
- -
- Análisis de eficacia: Análisis para examinar la eficacia de un compuesto después de su actuación en un organismo vivo.
En una forma de realización preferente del
procedimiento, la célula se manipula por ingeniería genética antes
del paso (a). En este proceso se introduce material genético en la
célula, en particular una o más secuencias de polinucleótidos. En
otra variante preferente de esta forma de realización, la
manipulación por ingeniería genética permite la medición de como
mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la
sustancia de ensayo. En esta forma de realización, mediante
manipulación por ingeniería genética se crean condiciones que
permiten medir o mejorar la medida de la variación de un parámetro
funcional. En este contexto es especialmente preferente que,
mediante la manipulación por ingeniería genética, se exprese una
proteína G no expresada de forma endógena en la célula o se
introduzca un gen indicador. Por este concepto se ha de entender
principalmente la introducción por ingeniería genética de una
proteína G no presente de forma endógena o no expresada
fisiológicamente (proteína de unión a GTP) en la célula, por
ejemplo la introducción de una proteína G quimérica, que permite
una modificación de la vía de señales, o de una proteína G
promiscua, que tiene mucha facilidad de unión. La introducción de
un gen indicador permite a su vez medir una expresión inducida
(provocada de forma extracelular) del producto genético.
En otra forma de realización preferente, la
célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contenga
como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c),
1e), 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%,
preferentemente en como mínimo un 95%, en particular en como mínimo
un 97%. De este modo se puede lograr, por ejemplo, que la célula
sintetice una proteína que no es expresada de forma endógena en la
célula o en el preparado utilizados en el procedimiento. En este
contexto es especialmente preferente que el polinucleótido esté
contenido en un constructo de DNA recombinante. Por el concepto
"constructo de DNA (recombinante)" se entiende una molécula de
DNA producida in vitro.
Si en el procedimiento la célula se manipula por
ingeniería genética antes del paso a), es preferible cultivar la
célula después de la manipulación genética y antes del paso (a) bajo
condiciones que permitan una expresión, dado el caso bajo presión
de selección. Por "cultivar" se entiende mantener células o
tejidos en condiciones que aseguran la supervivencia de las células
o de su siguiente generación. Las condiciones deberían elegirse de
tal modo que permitan una expresión del material introducido
mediante manipulación por ingeniería genética. Para ello, el pH, el
contenido en oxígeno y la temperatura se deberían mantener en
niveles fisiológicos y se deberían añadir suficientes nutrientes y
los cofactores necesarios. La presión de selección permite cultivar
únicamente aquellas células en las que la manipulación por
ingeniería genética ha tenido éxito como mínimo en parte. En este
concepto se incluye, por ejemplo, la incorporación de una
resistencia a los antibióticos a través del constructo de DNA.
En el procedimiento según la invención es
especialmente preferente que la célula utilizada consista en una
célula de anfibio, célula bacteriana, célula de levadura, de insecto
o una célula de mamífero inmortalizada o nativa. Como ejemplos se
mencionan: como células de anfibio, oocitos de Xenopus; como
células bacterianas, células de E. coli; como células de
levadura, Saccharomyces cerevisiae; como células de insecto,
células Sf9; como células de mamífero inmortalizadas, células HeLa;
y como células de mamífero nativas, la célula CHO (Chinese
Hamster Ovary - ovario de hámster chino).
En un método de medida utilizado para determinar
la unión de la sustancia a la biomolécula o proteína en el
procedimiento según la invención, la medida de la unión se realiza
mediante el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la
biomolécula o de la proteína y/o mediante la actividad relacionada
de una sustancia de ensayo marcada. El ligando es una molécula que
se une a la proteína con una alta especificidad y que es desplazada
del sitio de unión por una sustancia a ensayar que también se une a
la proteína. Por "marcado" se ha de entender una modificación
artificial en la molécula que facilita su detección. Los marcados
son por ejemplo radiactivos, fluorescentes o luminiscentes.
En otro método de medida preferente para
determinar la modificación de los parámetros funcionales provocada
por la unión de la sustancia a la proteína en el procedimiento según
la invención, la medida de como mínimo uno de los parámetros
funcionales modificados por la sustancia de ensayo se realiza
mediante la medición de la regulación, inhibición y/o activación de
receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular por la
medida de la modificación de la expresión genética, del medio
iónico, del pH o del potencial de membrana, mediante la
modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º
mensajero. De este modo, por una parte se registra directamente la
medida del efecto de la sustancia por la influencia en los
receptores, canales iónicos y/o enzimas, y por otra parte, como
ejemplos a medir de forma preferente, parámetros variables tales
como la expresión genética, el medio iónico, el pH, el potencial de
membrana, la actividad enzimática o la concentración del 2º
mensajero. En este contexto, por "medio iónico" se entiende
principalmente la concentración de uno o más iones en un
compartimento celular, en particular en el citosol; por "potencial
de membrana" se entiende la diferencia de carga entre ambos
lados de una biomembrana; y por "2º mensajero" se entienden
mensajeros de la vía de señales intracelular, por ejemplo AMP
cíclico (cAMP), inositol-trifosfato (IP3) o
diacilglicerol (DAG).
Un objeto especialmente preferente de la
invención es el procedimiento según la invención, en el que un
primer procedimiento según la invención se acopla a un segundo
procedimiento según la invención de tal modo que los valores de
medida y los resultados del primer procedimiento, en cuanto a la
sustancia a medir, se comparan con los valores de medida y los
resultados del segundo procedimiento en cuanto a la sustancia a
medir, caracterizado porque en el paso (a) de uno de los dos
procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento principal,
la sustancia a
ensayar
ensayar
- se incuba con una biomolécula seleccionada entre el grupo II:
- la proteína BNPI y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f) o 1h) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e), 1g) o a su polinucleótido antisentido,
- y/o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las proteínas o biomoléculas del grupo II anteriormente mencionadas,
y
porque en el paso (a) del otro de
los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento
secundario, la sustancia a ensayar se incuba con una biomolécula
del grupo I o con una biomolécula del grupo II, no eligiéndose la
biomolécula con la que ha sido incubada la sustancia en el
procedimiento
principal.
Por esta forma de realización especialmente
preferente se ha de entender sobre todo la combinación de la medida
de la unión a BNPI, o a biomoléculas derivadas de éste, o de la
medida de la modificación subsecuente de parámetros celulares, dado
que precisamente una comparación a la vista de la distribución,
completamente independiente pero estrechamente cercana, de los dos
canales en el tejido puede proporcionar una información importante
sobre las funciones fisiológicas. De este modo, la comparación
diferencial de los datos permite identificar aquellas sustancias
con una eficacia farmacéutica o medicinal óptima.
Mediante el procedimiento de screening (rastreo)
según la invención se puede identificar un compuesto como sustancia
farmacéuticamente relevante eficaz en como mínimo una de las
indicaciones anteriormente mencionadas. En este contexto, el
término "compuesto" se refiere sobre todo a principios activos
de bajo peso molecular, pero también a péptidos, proteínas y ácidos
nucleicos. El término "identificable" significa que el
compuesto presenta la característica consistente en que, en lo que
respecta a la unión en el procedimiento de screening (rastreo)
según la invención, se une de forma claramente más intensa,
preferentemente con el doble de intensidad, que la media de las
sustancias de ensayo, o que, en lo que respecta a la variación de
los parámetros funcionales, se desvía claramente de la media de las
sustancias de ensayo. De forma especialmente preferente, el
compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención
es un compuesto de bajo peso molecular.
Junto con el polinucleótido utilizado en el
procedimiento según la invención también están incluidos los propios
fragmentos del gen representado, y también un polinucleótido que
corresponde por completo o como mínimo a partes de la secuencia
codificadora del gen correspondiente al fragmento. Con ello también
se incluyen polinucleótidos que presentan una coincidencia de como
mínimo un 90%, preferentemente un 95% y en particular como mínimo un
97%, en la sucesión de bases con la secuencia codificadora de los
polinucleótidos representados o de la secuencia codificadora del
gen. Además es preferible que el polinucleótido consista en un RNA o
en DNA de cadena simple o doble, en particular mRNA o cDNA. También
es preferente que el polinucleótido consista en un polinucleótido
antisentido o PNA que presente una secuencia que se pueda unir
específicamente a un polinucleótico según la invención. PNA
significa "peptidic nucleic acid" (ácido nucleico
peptídico) que, si bien porta los pares de bases, su esqueleto está
unido peptídicamente. Un polinucleótido antisentido presenta la
sucesión de bases complementaria a como mínimo una parte de un
ácido nucleico base. También es preferible que el polinucleótido
sea parte de un ribozima o de otra enzima de DNA o un RNA o DNA
catalítico. Por ribozima se ha de entender un ácido ribonucleico
catalíticamente activo, y por enzima de DNA el ácido
desoxirribonucleico correspondiente, es decir RNA o DNA
catalítico.
También se puede utilizar un polinucleótico o un
oligonucleótido en el que como mínimo uno de los nucleótidos y en
particular varios de los nucleótidos son "locked nucleic
acids" ("LNA") (ácidos nucleicos bloqueados), o como
mínimo uno de los nucleótidos y en particular todos los nucleótidos
son fosfotioatos, preferentemente uno en el que varios de los
nucleótidos son "locked nucleic acids" ("LNA"). Los
"locked nucleic acids" ("LNA") son ribonucleótidos
que contienen un puente metileno que une el oxígeno 2' de la ribosa
con el carbono 4' (véase la Figura 27). Braasch D.A. y Corey, D.R.
(2001) presentan una vista general de los LNA en "Locked nucleic
acids (LNA); fine-tuning the recognition of DNA and
RNA", Chem. Biol, 8, 1-7. Se pueden adquirir
LNAs, por ejemplo, de la firma Proligo, Boulder, CO, EE.UU. Los
fosfotioatos también son conocidos por los especialistas y se
pueden encargar, por ejemplo, a MWG-Biotech AG,
Ebersberg, Alemania.
En el caso de la proteína a utilizar en el
procedimiento según la invención, o de una proteína parcial derivada
de la misma, es preferible que ésta haya sido sometida a
modificación postraduccional, en particular que haya sido
glicosilada, fosforilada, amidada, metilada, acetilada,
ADP-ribosilada, hidroxilada, provista de un anclaje
de membrana, segmentada o acortada. Las modificaciones
postraduccionales se describe, por ejemplo, en Voet/Voet,
Biochemistry, 1ª edición, 1990, páginas 935-938.
El polinucleótido utilizado (dado el caso según
el punto a) y/o el punto b)) puede ser un RNA o un DNA de cadena
simple o doble, en particular mRNA o cDNA.
El polinucleótido utilizado (dado el caso según
el punto b)) puede ser una parte de un ribozima u otra enzima de
DNA o un RNA o DNA catalítico.
Los siguientes ejemplos y figuras explican más
detalladamente la invención sin limitarla a los mismos.
Figura 1a) Secuencia de cDNA de BNPI,
humano; AN: NM_020309.
Figura 1b) Secuencia de aminoácidos de
BNPI, humano; AN: NM_020309.
Figura 1c) Secuencia de cDNA de BNPI,
humano; Nº: AAT42064 de WO96/34288.
Figura 1d) Secuencia de aminoácidos de
BNPI, humano; Nº: AAT42064 de WO96/34288.
Figura 1e) Secuencia de cDNA de BNPI, rata;
AN: U07609.
Figura 1f) Secuencia de aminoácidos de
BNPI, rata; AN: U07609.
Figura 1g) Secuencia de cDNA de BNPI,
ratón; AN: XM_133432.
Figura 1h) Secuencia de amionácidos de
BNPI, ratón; AN: XM_133432.
Figura 2a) Secuencia de cDNA de DNPI,
humano; AN: AB032435.
Figura 2b) Secuencia de aminoácidos de
DNPI, humano; AN: AB032435.
Figura 2c) Secuencia de cDNA de DNPI, rata;
AN: AF271235.
Figura 2d) Secuencia de aminoácidos de
DNPI, rata; AN: AF271235.
Figura 2e) Secuencia de cDNA de DNPI,
ratón; AN: NM_080853.
Figura 2f) Secuencia de aminoácidos de
DNPI, ratón; AN: NM_080853.
Figura 3) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en sinapsis y áreas motoras de la médula espinal lumbar de rata
(véase el Ejemplo 2a).
Figura 4) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en sinapsis de las áreas del asta dorsal de la médula espinal
lumbar de rata (véase Ejp. 2b).
Figura 5) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en sinapsis de la médula espinal sacra de rata (véase Ejp.
2c).
Figura 6) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en sinapsis del conducto médulo-cervicoespinal
del nervio trigémino de rata (véase Ejp. 2d).
Figura 7) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2e).
Figura 8) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2f).
Figura 9) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2g).
Figura 10) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2h).
Figura 11) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2i).
Figura 12) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2j).
Figura 13) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2k).
Figura 14) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2l).
Figura 15) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2m).
Figura 16) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2n).
Figura 17) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2o).
Figura 18) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2p).
Figura 19) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata (véase Ejp. 2q).
Figura 20) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata. AS significa antisentido y se
refiere a la tinción.
Figura 21) Expresión diferencial de DNPI y
BNPI en regiones cerebrales de rata. AS significa antisentido y se
refiere a la tinción.
Para la tinción inmunohistoquímica se utilizaron
antisueros de conejo policlonales contra la proteína de fusión de
DNPI o BNPI recombinante. En general se aplicaron secciones de
diferentes regiones del SNC y se comparó la expresión de DNPI con
la de BNPI. El proceso se correspe, en cuanto a las secciones y la
tinción, al procedimiento descrito por Persson S., Schäfer
MK-H, Nohr D., Ekström G., Post C., Nyberg F. y
Weihe E. (1994), Neuroscience 63; 313-326 o por
Nohr D., Schäfer MK-H., Romeo H., Persson S., Nyberg
F., Post C. y Weihe E. (1999), Neuroscience 93;
759-773. La revelación, descripción o enseñanza
técnica de estos artículos se incorpora expresamente como parte de
la revelación, descripción o enseñanza técnica de la invención aquí
presentada.
Ejemplo 2a con referencia a la
Figura
3)
Se puede ver la distribución diferencial de la
inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal lumbar de la
rata. Las secciones A a D desparafinadas adyacentes están teñidas de
la siguiente manera:
A = anti-DNPI;
B = anti-DNPI preadsorbido con
proteína de fusión de DNPI;
C = anti-BNPI;
D = anti-BNPI preadsorbido con
proteína de fusión de BNPI.
Los inmunocolorantes DNPI-(A) y BNPI-(C) eran
completamente preadsorbibles con la proteína de fusión de BNPI-(D)
y BNPI-(B) recombinante homóloga, lo que demuestra la especificidad
de la reacción inmune.
Resulta notable el patrón de distribución
mutuamente excluyente de la inmunotinción de DNPI y BNPI en el asta
dorsal exterior y profunda (A;C). La inmunotinción punteada de DNPI
se encuentra en los extremos sinápticos del asta dorsal exterior
(lámina 1 y sustancia gelatinosa) (flecha en A), mientras que la
inmunorreactividad de BNPI falta por completo (flechas en B). Se
encuentra en el asta dorsal profunda una acumulación de una
inmunotinción de BNPI, punteada positiva, mientras que la tinción de
DNPI es relativamente baja. El DNPI está presente en el núcleo
espinal lateral (LSN en A), mientras que el BNPI falta por completo
(LSN en C). El DNPI es abundante en la lámina X alrededor del canal
central, mientras que el BNPI es escaso. La inmunotinción de BNPI
es débil en el asta ventral lateral y débil o ausente en el asta
ventral medial. La tinción de DNPI punteada es abundante en todo el
asta ventral, algo menos en el asta lateral que en la ventral
medial. Hay una débil tinción de BNPI y DNPI en algunos cuerpos
celulares de las neuronas motoras del asta ventral, pero no había
sido preadsorbida por las proteínas de fusión del transportador
homólogo y, en consecuencia, se había clasificado como no
específica.
Ejemplo 2b con referencia a la
Figura
4)
Se puede ver la distribución diferencial de la
inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal lumbar
dorsal superficial lateral izquierda (left lateral superficial
dorsal lumbar spinal cord) de la rata. A y B teñidas
respectivamente para BNPI (A) y DNPI (B) muestran muchas tinciones
punteadas para DNPI, que están concentradas en la lámina I y en la
sustancia gelatinosa, donde el BNPI falta prácticamente por
completo. También se pueden ver complejos densos de puntos
positivos de DNPI en el núcleo espinal lateral, donde el BNPI falta
prácticamente por completo.
También se pueden encontrar puntos positivos de DNPI finos en el asta dorsal profundo, aunque con menor densidad.
También se pueden encontrar puntos positivos de DNPI finos en el asta dorsal profundo, aunque con menor densidad.
Ejemplo 2c con referencia a la
Figura
5)
Se puede ver la distribución diferencial de la
inmunorreactividad de BNPI y DNPI en la médula espinal sacra de la
rata. Las secciones adyacentes A y B teñidas respectivamente para
BNPI (A) y DNPI (B) muestran zonas de exclusión mutua de
inmunotinción de DNPI y BNPI punteada en el asta dorsal. El DNPI
está presente en toda la sustancia gris y se concentra en las capas
más externas del asta, donde forma una banda estrecha en el límite
con la sustancia blanca. El DNPI es abundante en el núcleo espinal
lateral y en la lámina X, al igual que en la lámina V/VI y en todo
el asta ventral. El BNPI es abundante en el asta dorsal profunda y
escaso en la ventral.
Ejemplo 2d con referencia a la
Figura
6)
Se puede ver la distribución diferencial de la
inmunorreactividad de BNPI y DNPI en el bulbo raquídeo inferior en
la transición a la médula espinal cervical. Las secciones adyacentes
A y B teñidas respectivamente para BNPI (A) y DNPI (B) muestran una
acumulación preferente de la tinción de BNPI en la parte medial del
núcleo trigeminal espinal y en la parte central e inferior de la
médula dorsal. En la médula ventral sólo se observa una tinción muy
débil con BNPI. El DNPI es abundante en la sustancia gris de la
médula. La tinción de DNPI se solapa con la tinción de BNPI en el
núcleo espinal interior V. Se ha de observar que el BNPI también se
encuentra en el núcleo trigeminal espinal superior, que es igual a
la sustancia gelatinosa espinal. La tinción de DNPI es más débil en
las regiones con presencia de BNPI que en las regiones en las que la
presencia de BNPI es baja o nula. En la región motora gris ventral
se pueden ver unos pocos puntos de BNPI.
Ejemplo 2e con referencia a la
Figura
7)
Distribución diferencial complementaria de la
inmunorreactividad de DNPI y BNPI en 2 secciones progresivas del
cerebro de rata en regiones cerebrales relevantes para el dolor,
como el córtex parietal sensitivo, el córtex cingular, el tálamo,
el cuerpo amigdalino y también el hipotálamo. El DNPI se concentra
en el córtex en las capas sensitivas granulares, en particular en
la lámina IV; el BNPI es abundante en el córtex, pero más débil en
la lámina IV que en las otras láminas. En el córtex cingular (C vs D
como ampliado), la distribución de DNPI y BNPI es alternativamente
excluyente de forma complementaria o recíproca en la densidad de las
sinapsis correspondientes. El DNPI predomina en el tálamo
claramente sobre el BNPI. En el hipotálamo, el BNPI es escaso y el
DNPI abundante. En el hipocampo, el abundante BNPI predomina sobre
el escaso DNPI con una distribución alternativa complementaria.
Tálamo = Th
Cuerpo amigdalino = Amyg.
Hipocampo = Hip
Córtex cingular = Cg
Hipotálamo = Hy
Córtex parietal = PC.
Ejemplo 2f con referencia a la
Figura
8)
Distribución diferencial complementaria de
inmunorreactividad de DNPI y BNPI en regiones cerebrales relevantes
para el dolor, como el córtex cingular (Cg) y el tectum, y también
la sustancia gris periacueductal dorsal. Dominancia de DNPI en el
tectum y la sustancia gris dorsal. Secciones progresivas de un
cerebro de rata a través del mesencéfalo superior.
Ejemplo 2g con referencia a la
Figura
9)
Distribución diferencial complementaria de
inmunorreactividad de DNPI y BNPI en regiones cerebrales relevantes
para el dolor, como el tectum (T) y también la sustancia gris
periacueductal (PAG). Dominancia de DNPI en el tectum y la
sustancia gris dorsal. Se observa una distribución diferencial de
DNPI y BNPI en el cuerpo geniculado medial (cgm) de la vía
auditiva. Secciones progresivas de un cerebro de rata a través del
mesencéfalo superior; plano del colículo superior.
Ejemplo 2h con referencia a la
Figura
10)
Abundancia de DNPI y BNPI en las habénulas (Hb).
El DNPI está presente en todo el complejo habenular (ampliación
baja, figura superior; ampliación alta, figura central). El BNPI
sólo se encuentra en el núcleo habenular medial (mHb figura
inferior, sección progresiva con respecto a la figura central).
En los siguientes Ejemplos 2i a 2q y las en
Figuras correspondientes 11 - 19 se utilizan los términos VGLUT1
para BNPI y VGLUT2 para DNPI. Estos conceptos son completamente
sinónimos en ambos casos, exactamente iguales en cuanto a su
contenido y se refieren al mismo objeto, es decir: VGLUT1 = BNPI y
VGLUT2 = DNPI. El término "preabs" significa preabsorción con
proteína de fusión de VGLUT1 o VGLUT2 antes de la inmunotinción.
Ejemplo 2i con referencia a la
Figura
11)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución y la especificidad en la
médula espinal lumbar a través de la inmunorreactividad.
Las secciones adyacentes A-D
están teñidas alternativamente con anti-VGLUT2 (A),
anti-VGLUT2, prebsorbido con proteína de fusión de
VGLUT2 (B), anti-VGLUT1 (C) y
anti-VGLUT1, preabsorbido con proteína de fusión de
VGLUT1 (D). Las inmunorreacciones en (A) y (C) son preabsorbidas por
completo con las proteínas de fusión recombinantes homólogas (B) y
(D), lo que demuestra la especificidad de la reacción inmune. Se
observa el patrón de distribución diferencial en el asta dorsal
superficial y profundo (A;C). Se puede reconocer una inmunotinción
punteada para VGLUT2 en el asta dorsal superficial (las flechas en A
identifican la lámina 1 y la sustancia gelatinosa), donde la
inmunorreactividad con VGLUT1 es mínima (flechas en C). También se
puede observar la acumulación de VGLUT1 punteado muy positivo en el
asta dorsal profunda, donde el VGLT2 es relativamente débil. El
VGLUT2 está presente en el núcleo espinal lateral (LSN; flechas en
A), donde el VGLUT1 tiene una escasa presencia (flechas en C). El
VGLUT2 está muy presente en la lámina X alrededor del canal central,
donde el VGLUT1 es escaso. La inmunotinción de VGLUT1 tiene una
intensidad de débil a mediana en el asta ventral lateral y muy
floja en la medial. En el asta ventral (VH) hay una tinción punteada
fina de VGLUT2 densa y
abundante.
abundante.
Ejemplo 2j con referencia a la
Figura
12)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el prosencéfalo (1).
Los pares de micrografías de baja y alta
potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas
alternativamente para VGLUT2 (A-D, I, K, M) y
VGLUT1 (E-H, J, L, N). Esto muestra la clara
diferencia y la exclusividad parcialmente mutua de la distribución,
densidad e intensidad de la inmunorreactividad ("ir") de VGLUT1
y VGLUT2 en regiones corticales, hipotalámicas, diencefálicas y
límbicas.
Hipotálamo y tálamo (A,E): La
VGLUT2-ir es relativamente fuerte en todo el
hipotálamo y tálamo, donde el VGLUT-2 presenta una
distribución limitada en el núcleo premamilar ventral (PMV) del
hipotálamo y en partes del núcleo del tálamo, incluyendo el núcleo
talámico posterior lateral (LP), el núcleo genicular lateral dorsal
(DLG) y el núcleo talámico posteromedial ventral (VPM). Núcleo
pretectal olivar (OPT); núcleo pretectal anterior dorsal (APTD);
núcleo precomisural (PrC).
Corteza (A; E; I; J; K; L; M; N): La
tinción de VGLUT2 es moderada en una banda del neocórtex que
contiene lámina IV. Es débil en una banda neocortical que contiene
lámina VI y mínima en las otras capas neocorticales. La
VGLUT1-ir punteada intensa es muy fuerte en todo el
córtex, incluyendo el córtex piriforme (Pir), y es algo más débil
en la banda neocortical de la lámina VI, donde se acumula una
tinción de VGLUT2 moderada. Se puede observar la exclusión mutua de
la tinción VGLUT1 y VGLUT2 en las capas de la corteza granular
retroespinal (RSG en A y E), que se muestran con una mayor
ampliación en (I) y (J). Las grandes ampliaciones M y N de la
lámina IV en K y L muestran diferentes densidades de
VGLUT1-ir y VGLUT2-ir punteada en la
comparación entre cuerpos y procesos celulares neuronales
inmunonegativos.
Hipocampo (A, E; B-D,
F-H): Los puntos VGLUT2-ir finos
están limitados normalmente a las capas granulares (g) del girus
dentado (DG) y la capa piramidal (p) de los campos CA1, CA2 y CA3
del hipocampo. Los puntos VGLUT1-ir densos tienen
una presencia muy fuerte en todo el hipocampo a excepción de las
capas celulares granuladas (g) y piramidales (p). Las secciones
identificadas con rectángulos en A y las correspondientes con
secciones adyacentes en E se muestran con una gran ampliación en
B-D y F-H, respectivamente. Se puede
observar la distribución y densidad diferencial de
VGLUT1-ir y VGLUT2-r en la capa
oriens (o), la capa piramidal (p), en el stratum lacunosum (r) y en
el stratum lacunosum molecular (I) de CA1 (B, F) y CA3 (C, G) y en
la capa molecular (m), granular (g) y polimorfa (p) del girus
dentado (DG) (D,H).
Complejo amigdalino: En este caso se
constata un determinado solapamiento, pero se puede ver claramente
la densidad e intensidad diferencial de la inmunotinción de puntos
de VGLUT1-ir y VGLUT2-ir en el
núcleo amigdalino basomedial (BMP), en el núcleo amigdalino lateral
(La) y en el núcleo amigdalino cortical (Co), y también en el
núcleo endopiriforme dorsal (DEn) adyacente.
También se puede comprobar que la "sustancia
blanca" y los tractos fibrosos son negativos con respecto a
VGLUT1 y VGLUT2 (comisura posterior (pc), fórnix (f), fasciculus
retroflexus (fr), tracto mamilotalámico (mt).
Ejemplo 2k con referencia a la
Figura
13)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el prosencéfalo (2).
Los pares de micrografías de baja y alta
potencia de dos secciones frontales adyacentes están teñidas
alternativamente para VGLUT2 (A-B, E, G) y VGLUT1
(C-D, F, H). Esto muestra la clara diferencia y la
exclusividad parcialmente mutua de la distribución, densidad e
intensidad de la inmunorreactividad (ir) de VGLUT1 y VGLUT2 en el
neocórtex (lámina IV, VI) caudate putamen (CPu), globulus pallidum
(GP), córtex piriforme (Pir), núcleo accumbens centro (AcC), núcleo
accumbens borde (AcSh), pallidum ventral (VP), tubérculo olfatorio
(Tu), islas de Calleja (ICj), la banda diagonal ventral (VDB) y el
septum lateral (LS). En el CPu, el VGLUT1 tiene una presencia algo
más débil que el VGLUT2. El VGLUT2 está presente (B) en el globus
pallidum (GP), donde el VGLUT1 falta prácticamente por completo
(D). En el córtex piriforme (Pir) y las islas de Calleja (ICj), la
VGLUT1-ir punteada es más fuerte y densa que la
VGLUT2-ir. En (E) se puede observar una acumulación
de VGLUT1-ir entre débil y moderada en las capas
celulares piramidales, donde la VGLUT2-ir falta
prácticamente por completo (F). Además se puede observar un
solapamiento y reciprocidad determinados en la tinción de VGLUT1 y
VGLUT2 en las ICj (G, H), y también la ausencia de
VGLUT1-ir y de VGLT2-ir en el tracto
fibroso comisural/cuerpo calloso (cc, comisura
anterior (ac)).
anterior (ac)).
Barras en A, C = 1 mm, en B, D = 500 \mum; en
E-H = 200 \mum.
Ejemplo 2l con referencia a la
Figura
14)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el núcleo talámico e
hipotalámico.
Las secciones frontales (A, B) adyacentes del
diencéfalo muestran la fuerte presencia diferencial específica de
núcleo de VGLUT2 (A) y VGLUT1 (B) en el tálamo y el hipotálamo. Se
observa la muy fuerte presencia de VGLUT2-ir (A) en
el núcleo talámico paraventricular (PVA), núcleo talámico reuniente
(Re), núcleo talámico reticular (Rt), núcleo talámico paracentral
(PC) y núcleo talámico anterodorsal (AD). Aquí falta prácticamente
por completo VGLUT1-ir (B) o sólo está presente en
una baja concentración. El VGLUT1 (B) está presente de forma
moderada en el núcleo talámico posterior (PT), donde el VGLUT2 (A)
es escaso. El VGLUT1 falta prácticamente por completo en la estría
medular (sm), donde VGLUT2-ir es escasa.
Las secciones frontales adyacentes C, D del
diencéfalo muestran la frecuencia de VGLUT2 (C) en el núcleo
hipotalámico anterior (AH), pero la escasez en el núcleo
paraventricular (PVN) y la escasez extrema de
VGLUT1-ir en el núcleo hipotalámico anterior (AH) y
la ausencia total en el PVN. También se observa la presencia de
VGLUT1 (D) y la ausencia de VGLUT2 (C) en el núcleo talámico
ventromedial (VM) y el núcleo talámico reuniente (Re).
Las secciones frontales adyacentes del
hipotálamo (E, F) muestran la frecuencia de VGLUT2 en LH, en el
núcleo talámico ventromedial (VHM) y el núcleo talámico dorsomedial
(DM), y la escasez de VGLUT1 en el núcleo de VMH, pero la presencia
moderada en su borde. Se puede observar la tinción débil de VGLUT2
en la eminencia mediana (ME). El VGLUT1 y el VGLUT2 faltan en los
tractos fibrosos del fórnix (f) y del tracto mamilotalámico (mt).
Tercer ventrículo (3V); barra = 500 \mum (para
A-F).
Ejemplo 2m con referencia a la
Figura
15)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el epitálamo.
Las micrografías de alta potencia de secciones
adyacentes, que están teñidas alternativamente para VGLUT2 (A) y
VGLUT1 (B), muestran la abundancia de VGLUT2 tanto en el núcleo
habenular medial (MHb) como en el núcleo habenular lateral (LHb).
Se puede observar que VGLUT1-ir en el MHb es menos
densa que VGLUT2-ir. El VGLUT1 falta prácticamente
por completo en el LHb.
Barras = 100 \mum (para A, B).
\newpage
Ejemplo 2n con referencia a la
Figura
16)
Se trata de una comparación entre VGLUT1,
tirosina-hidroxilasa y VGLUT2 con respecto a la
distribución en el mesencéfalo y el metatálamo.
Las micrografías de baja potencia (A, C, E) y de
alta potencia (B, D, F) de tres secciones adyacentes están teñidas
alternativamente para tirosina-hidroxilasa (TH),
VGLUT2 y VGLUT1 y muestran la distribución diferencial, densidad e
intensidad de la inmunotinción para VGLUT1 y VGLUT2 en comparación
con la TH. Los puntos VGLUT2-ir están concentrados
en el tectum, encontrándose las mayores cantidades en la capa
"gris" superficial del colículo superior (SuG) y cantidades
menores en la capa "gris" intermedia del colículo superior
(InG), mientras que son escasas en la capa del núcleo óptico del
colículo superior (Op). Los puntos VGLUT2-ir se
encuentran en todo el tegmentum, incluyendo el núcleo rojo (R) y la
parte compacta de la sustancia negra (SNC) positiva con respecto a
PH, y se acumulan especialmente en la sustancia gris periacueductal
dorsal (PAG), en particular en el núcleo terminal medial del
"accessory optic tract" (MT), del tracto de acceso
óptico, y también en la parte mediocaudal del núcleo posterior
lateral (LPMC), en el núcleo talámico intralaminar posterior (PIL),
en el núcleo peripeduncular (PP) y en el núcleo talámico
suprageniculado (SG). La VGLUT1-ir es mínima aquí.
La tinción de VGLUT1 se observa en cantidades moderadas en el núcleo
geniculado medial ventral (MGV), donde las cantidades de VLGUT2 son
mínimas. El VGLUT1 sólo está presente de forma mínima en todo el
tectum, la sustancia gris periacueductal y el tegmento, y falta
casi por completo en la parte compacta (SNC) y en la parte
reticulada (SNR) de la sustancia negra. En los pericariones y
puntos neuronales de la SNR hay una débil presencia de tinción de
VGLUT2 (D, micrografía de alta potencia de la indicada en (C) con un
rectángulo, donde el VGLUT1 falta prácticamente por completo
(correspondiente en F)). Acueducto mesencefálico (Aq).
Barras en A, C, E = 1 mm; en B, D, F = 200
\mum.
Ejemplo 2o con referencia a la
Figura
17)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el tronco encefálico
pontomedular.
Las micrografías de baja y alta potencia de dos
secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para
VGLUT2 (A-D) y VGLUT1 (E-H). Éstas
muestran una gran cantidad de inmunorreactividad (ir) de VGLUT2
punteado (B, D) en la oliva superior medial (MSO), donde la
VGLUT1-ir es baja (F, H). La
VGLUT2-ir es relativamente débil en el núcleo del
cuerpo trapezoide (TZ) (B-C), donde hay mayor
presencia de VGLUT1-ir (F-G). Se
puede observar que grandes puntos confluentes claramente positivos
con respecto a VGLUT1 rodean cuerpos celulares neuronales
inmunonegativos en el TZ (G). En el núcleo sensitivo central del
nervio trigémino (Pr5) hay fuertes puntos de
VGLUT1-ir, donde VGLUT2-ir es muy
baja. En el núcleo trigeminal motor (Mo5) hay puntos moderadamente
positivos con respecto a VGLUT1, donde la VGLUT2-ir
es baja. La VGLUT1-ir y la VGLUT2-ir
están presentes en menor cantidad en el núcleo parabranquial medial
lateral (LPB, MPB). El locus coerulus (LC) presenta una acumulación
moderada de VGLUT2-ir, donde la
VGLUT1-ir es muy baja. La VGLUT1-ir
y VGLUT2-ir faltan en el tracto piramidal (pyr).
Sectores adyacentes (I, J), teñidos alternativamente para VGLUT2 (I)
y VGLUT1 (J), presentan una gran cantidad de inmunorreactividad
(ir) de VGLUT1 punteada en el núcleo coclear ventral anterior (VCA),
donde, en principio, el VGLUT2 falta por completo. Una micrografía
de alta potencia (K) de J muestra puntos de VGLUT-ir
muy positivos, que encierran cuerpos celulares neuronales
inmunonegativos. En el núcleo coclear dorsal (DC) hay una mayor
cantidad de puntos de VGLUT1-ir que de puntos
positivos de VGLUT2-ir.
Barras en A,E = 500 \mum; en B, F, I, J = 200
\mum; en C, D, G, H, K = 25 \mum.
Ejemplo 2p con referencia a la
Figura
18)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el tronco encefálico
inferior.
Las micrografías de baja y alta potencia de dos
secciones frontales adyacentes están teñidas alternativamente para
VGLUT2 (A, C, E, G) y VGLUT1 (B, D, F, H), y muestran una cantidad
moderada de inmunorreactividad (ir) de VGLUT2 punteada pequeña en
el núcleo trigeminal espinal superficial (Sp5), lo que está marcado
con las flechas (A, G), donde, en principio, la
VGLUT1-ir falta por completo (flechas en B, H). El
VLGUT2 está presente de forma moderada en el núcleo motor dorsal
del vago (10), el núcleo hipogloso (12), la formación reticular
(Rt) y la parte ventral del tracto solitario (SolV) (A, C, E),
donde, en principio, el VGLUT1 falta por completo (B, D, F). La
VGLUT2-ir es muy baja en el tracto solitario dorsal
(SolD). Se puede observar la preponderancia del VGLUT1 en el Sp5
profundo (B, F, H), el cuneato (Cu) y el núcleo grácil (GR), donde
la VGLUT2-ir es muy baja. Las estrellas marcan el
canal central.
Barras en A, B = 500 \mum; C, D = 200 \mum,
E, F = 100 \mum; G, H = 100 \mum.
\newpage
Ejemplo 2q con referencia a la
Figura
19)
Se trata de una comparación entre VGLUT1 y
VGLUT2 con respecto a la distribución en el cerebelo.
Las micrografías de baja y alta potencia de dos
secciones frontales adyacentes, teñidas alternativamente para
VGLUT2 (A, B) y VGLUT1 (C, D), muestran una densidad extrema de
puntos positivos con respecto a VLGUT1 con una tinción intensa en
la capa molecular (m), muy pocos puntos de VLGUT1 alrededor de
cuerpos de la célula de Purkinje en la capa celular de Purkinje
(p), y una acumulación de tipo glomerular de puntos de VGLUT1
confluentes con una fuerte tinción en la capa granular (g). Los
puntos de VGLUT2-ir son mucho menos densos en la
capa molecular, donde están dispuestos a modo de banda. Los puntos
de VGLUT2-ir, que forman estructuras de tipo
glomerular en la capa glomerular (g), son menos densos que los
correspondientes a la tinción de VGLUT1.
Barras en A, C = 500 \mum; en B, D = 100
\mum.
La distribución diferencial de BNPI y DNPI en la
sinapsis del sistema aferente primario, trigeminal espinal y
supraespinal es una fuerte evidencia de la posibilidad de influir
selectivamente en las funciones sensitivas mediante la modulación
selectiva del transporte de glutamato por medio de DNPI o BNPI.
La presencia de BNPI y DNPI en el DRG indica la
posibilidad de influir selectivamente en inflamaciones neurogénicas
periféricas mediante la intervención selectiva en la diana de DNPI o
BNPI. La presencia en el DRG también indica una función
inmunomoduladora y la determinación de dianas correspondiente. Una
presencia de BNPI y DNPI en el vago sensitivo o el ganglio
glosofaríngeo indica la diana para baroaferencia, quimioaferencia,
función cardiovascular o cardiorrespiratoria, incluyendo asma,
hipertonía, etc., y también para emesis. También es interesante la
distribución para el eje intestino-cerebro, es decir
la regulación de la saciedad, de la "inflammatory bowel
disease" (trastorno intestinal inflamatorio) o la enfermedad
de Crohn, y también para la autoinmunidad en el sistema nervioso
central o periférico, diabetes autoinmune, neuropatía alcohólica,
pancreatitis crónica inducida por alcohol con neuroproliferación
(Fink y col. mit Weihe; Neuroscience). Ya sólo la distribución en
el SNC y el SNP hace que estas dianas sean objetos interesantes en
las demás indicaciones arriba mencionadas.
No obstante, otro punto decisivo consistía en
que se pudo detectar BNPI y DNPI en las regiones aferentes de las
zonas sensitivas del ojo y el oído, lo que, en combinación con el
resto de conocimientos, sugiere una función importante en caso de
trastornos de la vista, retinitis pigmentosa, degeneración óptica,
cataratas, desprendimiento de retina, degeneración de retina,
glaucoma o nistagmo, o trastornos auditivos, tinnitus, M. Menière,
pérdida repentina del oído, enfermedades del órgano auditivo y/o del
órgano del equilibrio o enfermedades de la vía auditiva o
vestibular.
vestibular.
También es decisivo que la distribución de
VGLUT2 (=DNPI) en la mayoría de las regiones del cerebro y la médula
espinal sea complementaria y mutuamente excluyente con respecto a
la expresión de VGLUT1 (=BNPI). Los dos transportadores de
glutamato juntos podrían ser responsables de la absorción de
glutamato por vesículas sinápticas de todas las neuronas
glutamatérgicas centrales.
Aquí se ha comprobado que los centros talámicos
y de transmisión del tronco encefálico de la vía visual y
estatoacústica se activan mediante señales diferenciales controladas
por VGLUT1 y VGLUT2. Los centros de transmisión talámicos y
mesenfálicos del sistema visual, como el colículo superior y el
núcleo geniculado dorsolateral, y el núcleo terminal medial del
"accessory optic tracts" del sistema óptico están
controlados específicamente por VGLUT2, lo que sugiere que las
células ganglionares de la retina, que representan la tercera
neurona del sentido óptico, están recubiertas como mínimo
parcialmente con VGLUT2. En cambio, los centros de transmisión
coclear del tronco encefálico, trapezoide olivar y geniculado medial
metatalámico de la vía auditiva reciben una fuerte entrada
(input) de sinapsis glutamatérgicas recubiertas de
VGLUT1.
Diferentes núcleos del sistema visual del tronco
encefálico reciben un fuerte input a través de puntos
sinápticos de VGLUT2. Por consiguiente, parece que el tronco
encefálico del sistema óptico es abastecido exclusivamente por
sinapsis glutamatérgicas de VGLUT2.
De las investigaciones se desprenden los
siguientes resultados y conclusiones: El DNPI es un marcador para
vesículas sinápticas glutamatérgicas, habiendo 2 tipos diferentes de
neuronas o sinapsis. El VGLUT1 y el VGLUT2 presentan un patrón de
distribución diferencial.
En conjunto, la distribución del BNPI y DNPI en
el SNC y el SNP indican que desempeñan una función en las
diferentes indicaciones arriba mencionadas, para las que se buscan
compuestos medicinales eficaces para dichas dianas con el
procedimiento según la invención.
Una sección de ácido nucleico que codifica BNPI
se clona en un vector de expresión que permite una expresión
constitutiva (por ejemplo promotor CMV) o una expresión inducible en
células eucariotas. El DNA se introduce en células eucariotas (por
ejemplo células CHO, células HEK293 o células
NIH-3T3) con procedimientos de transfección
adecuados, por ejemplo con lipofectamina (firma Roche Diagnostics).
Las células se cultivan en presencia de un reactivo de selección
(por ejemplo zeocina, higromicina o neomicina) de modo que sólo
sobreviven aquellas células que han absorbido el constructo de DNA
y que, en caso de una selección más duradera, también lo han
incorporado en el genoma.
A partir de estas células se obtienen fracciones
de membrana que contienen una mayor cantidad de BNPI y pueden ser
utilizadas para un ensayo de unión. Éste consiste en 1.) membranas
que contienen el BMPI; 2.) un ligando marcado radiactivo; 3.) un
tampón de unión (por ejemplo 50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA) y los
ligandos analizados en cuanto a la unión. Después de la incubación
de las mezclas de reacción arriba mencionadas (por ejemplo durante
30-60 minutos), a una temperatura adecuada (en la
mayoría de los casos temperatura ambiente), las moléculas de
ligando radiactivas no unidas se separan por filtración. La cantidad
restante de ligando unido se mide en un
\beta-Counter (por ejemplo Trilux, firma Wallac)
después de añadir un cóctel de escintilación. Si la sustancia de
ensayo presenta una unión con BMPI, éste se detecta como
incorporación radiactiva reducida. Este procedimiento se
miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en
microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para llevarlo a
cabo con un robot en el denominado procedimiento "hightroughput
screening" (HTS) (rastreo de alto
rendimiento).
rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Una sección de ácido nucleico que codifica BNPI
se clona en un vector de expresión que permite una expresión
inducible en procariotas, por ejemplo E. coli. La sección de
ácido nucleico se modifica de tal modo que se expresa como proteína
de fusión con una secuencia de aminoácidos
N-terminal o C-terminal adicional.
Esta secuencia debería permitir, sin modificación de la función del
BNPI, una purificación a través de un procedimiento específico, por
ejemplo un fragmento de
glutatión-S-transferasa, que permite
su aislamiento a partir de la mezcla de proteínas por su unión al
glutatión. Después de la transfección de las bacterias, la inducción
del gen (por ejemplo con IPTG en el promotor lac) y la
desintegración de las bacterias, las proteínas de fusión se
purifican y se utilizan en un experimento de quinasa in
vitro. Para ello, 5 \mug de proteína se tratan a 30ºC durante
30 minutos con 50 \mul de tampón quinasa (20 mM PIPES, pH 7,0, 5
mM MnCl_{2}, 7 mM \beta-mercaptoetanol, 0,4 mM
espermina, 10 mM rATP) complementados con 10 \muCi
[\gamma^{32}P]-ATP. Como sustrato se añade
proteína Histona H1 purificada (firma Sigma) o proteína de fusión
GST-NFATc1 expresada de forma bacteriana. Después
del período de incubación, el [\gamma^{32}P]-ATP
no incorporado se separa por filtración y la cantidad de
^{32}fosfato incorporado se determina por escintilación \beta
(Trilux, firma Wallac). En un experimento para descubrir nuevos
inhibidores de BNPI, las sustancias de ensayo se incuban
conjuntamente en esta carga y se utiliza la disminución de la
incorporación de ^{32}P como indicador de inhibición. Este
procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda
llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos)
para realizarlo con un robot en el denominado procedimiento
"hightroughput screening" (HTS) (rastreo de alto
rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Las pastillas se pueden producir mediante
compresión directa de mezclas del compuesto según la invención con
los materiales auxiliares correspondientes, o mediante la compresión
de granulados que contienen dicho compuesto (en caso dado con otros
materiales auxiliares). Los granulados se pueden producir bien por
granulación en húmedo, por ejemplo con líquidos de granulación
acuosos, y secado subsiguiente de los granulados, bien por
granulación en seco, por ejemplo mediante compactación.
Se prepara una mezcla homogénea del principio
activo con los materiales auxiliares y ésta se comprime en una
prensa para obtener pastillas con un \diameter de 10 mm.
Se prepara una mezcla homogénea del compuesto
con la celulosa microcristalina y la I-HPC y se
compacta. Después de tamizar los productos de compresión, el
granulado formado se mezcla con estearato de magnesio y dióxido de
silicio y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un
\diameter de 9 mm.
Se prepara una mezcla homogénea del compuesto
con la celulosa microcristalina y la crospovidona y se granula en
un granulador con una solución acuosa de la povidona. A
continuación, el granulado húmedo se vuelve a someter a granulación
y, después del secado, se somete a un secado adicional en un armario
de secado (50ºC) durante 10 horas. El granulado seco se tamiza
junto con el estearato de magnesio, se somete a mezcla final y se
comprime en una prensa para obtener pastillas con un \diameter de
8 mm.
1 g de un compuesto identificado mediante un
procedimiento según la invención se disuelve, a temperatura
ambiente, en 1 l de agua para inyección y a continuación se ajusta
a condiciones isotónicas por adición de NaCl (cloruro de sodio).
\vskip1.000000\baselineskip
Aihara Y, Mashima H. Onda
H. Hisano Setsuji, Kasuya H., Hori T.
Yamada S., Tomura H. Yamada Y., Inoue
I., Kojima I. und Takeda J. (2000), J.
Neurochem. 74: 2622–2625.
Akopian AN, Sivilotti L &
Wood JN (1995) Nature 379.
257-262.
Ausubel FM, Brent R, Kingdton RE, Moore DO,
Seidman JG, Smith JA & Struht K eds. (1190) Current
protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc. New
York, NY.
Baba H. Doubell TP, Woolf
CJ 1999: Peripheral inflammation facilitates A\beta
fiber-mediated synaptic input to the substantia
gelatinosa of the adult rat spinal cord. J Neurosci 19:
859-867.
Bauer D, Müller H, Reich J,
Riedel H, Ahrenkiel V, Warthoe P &
Strauss M (1993): Identification of differentially
expressed mRNA species by an improved display technique
(DDRT-PCR) Nucl Acids Res
21:4272-4289.
Bonini A, Anderson SM,
Steiner DF (1997) Molecular cloning and tissue
expression of a novel orphan G Protein-coupled
receptor from rat lung. Biochem Biophys Res Comm
234:190.193.
Chih-Cheng et al.,
(1995): A P2X prinoceptor expressed by a subset of sensory
neurons. Nature 377:428-432
Corderre TJ, Katz J,
Vaccarino AL, Melzack R (1993): Cantribution of
central plasticity to pathological pain: review of clinical and
experimental evidence. Pain 52: 259-285.
Dickenson (1995) Novel
pharmacological targets in the treatment of pain. Pain Rev.,
2, 1-12.
Dubuisson et al., 1997 Pain, 4:161-174.
Feng Y & Gregor P
(1997) Cloning of a novel member of the G
Protein-coupled receptor family related to peptide
receptors. Biochem Biophys Res Comm 231: 651.654.
Furukawa T, Yang Y,
Nakamoto B. Stamatoyannopoulos G,
Papayannopoulou T (1996): Identification of new genes
expressed in a human erythroleukemia cell line. Bloods Cell Mol
& Dis 22:11-22.
Gunasekar PG, Kanthasamy, AG.
Borowitz, JL, Isom GE 1995: NMDA receptor
acttvation produces concurrent generation of nitric oxide and
reactive oxygen species: implication for cell death. J
Neurochem 65: 2016-2021.
Hawes BE, Fried S, Yao X,
Weig, B, Graziano MP 1998: Nociceptin (ORL1)
and \mu-Opioid receptors mediate
mitogen-activated protein kinase activation in CHO
cells through a Gi-coupled signaling pathway;
evidence for distinct mechanisms of
agonist-meadiated desensitization. J
Neurochem 71: 1024-1033.
Hubank M & Schatz DG
(1994): identifying differences in mRNA expression by
representational difference analysis of cDNA. Nucl Acids Res
22: 5640-5648.
Klu\betamann S et al.,
1996: Nature Biotechnology 14:1112.1115.
Li L-Y & Chang
K-J 1996: The stimulatory effect of opioids
on mitogen-activated protein kinase in chinese
hamster ovary cells transfected to expresa
\mu-opioid receptors. Mol Pharm
50:599.602.
Liang P & Pardee AB
1992: Differential Display of eukaryotic messenger RNA by
means of the polymerase chain reaction. Science
257:967-971.
Methner A, Hermey G,
Schinke B, Hermanns-Borgmeyer I
(1997): A novel G Protein-coupled receptor
with homology to neuropeptide and chemoattractant receptors
expressed during bone development. Biochem Biophys Res Comm
233: 336.342.
Mohit AA, Martin JH &
Miller CA 1995: p493F12 Kinase: a novel MAP kinase
expressed in a subset of neurons in the human nervous system.
Neuron 14: 67-78.
Poirier GM.C, Pyati J, Wan
JS, Erlander MG 1997: Screening differentially
expressed cDNA dones obtained by differential display using
amplified RNA. Nucleic Acids Research 25:
913-914.
Sambrook J, Fritsch EF &
Maniats T 1989: Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor.
Sompayrac L, Jane S, Burn
TC, Tenen DG & Danna KJ 1995: Overcoming
limitations of the mRNA differential display technique. Nucleic
Acids Research 23: 47384739.
Tal M 1996: A novel antioxidant
alleviates heat hyperalgesia in rats with an experimental painful
neumpathy. Neurreport 7:1382-13134.
Tölle TR (1997): Chronischer
Schmerz. In: Klinische Neurobiologie, Herdergen T,
Tölle IR, Bähr M (Hrsg.): S. 307-336;
Spektrum Verlag, Heidelberg.
U.S. Patent 5.262.311
Velculescu VE, Zhang L,
Vogelstein B, Kinzler KW (1995): Serial
analysis of gene expression. Science 270:
484-487.
Wan JS, Sharp JS et al.
(1996): Cloning differentialy expressed mRNAs Nature
Biotech 14:4685-1691.
Watson JS & Margulies JE
(1993) Differential cDNA screening strategies to identify
novel stage-specific proteins in the developing
mammalian brain. Dev Neurosci 15: 77.86.
Wilks AF (1989) Two putative
protein-tyrosine kinases identified by application
of the polymerase chain reaction. Poc Natl Acad Sci USA 86:
1603-1607.
WO96134288
Woolf CJ, Shortland P.
Coggeshall RE 1992: Peripheral nerve injury triggers
central sprouting of myelinated afferents. Nature
355:75.78.
Zimmermann, M & Herdegen, T
(1996): Plasticity of the nervous system at the systemic,
cellular and molecular levels a mechanism of chronic pain and
hyperalgesia. Progr Brain Res 110:
233-259.
<110> GRÜNENTHAL GmbR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de screening (rastreo)
para diferentes indicaciones con BNPI y/o DNPI
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> GRA 3070-PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP 02/10707
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-09-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE10147006.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
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<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 2366
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<212> DNA
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<213> Homo Sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 560
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2716
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<212> DNA
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<213> Homo Sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<210> 5
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<211> 2024
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 3946
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 582
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<400> 8
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<210> 9
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<213> Rattus Norvegicus
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<400> 9
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 2836
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
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\newpage
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 2528
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<212> DNA
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<400> 13
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<210> 14
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 14
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Claims (9)
1. Procedimiento para la localización de
sustancias farmacéuticamente relevantes con eficacia en las
indicaciones o para el tratamiento de la esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedades de las neuronas motoras espinales,
atrofias musculares, distrofias musculares o esclerosis múltiple,
con los siguientes pasos de procedimiento:
- (a)
- incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con como mínimo una biomolécula del grupo I seleccionada entre:
- la proteína BNPI y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f) o 1h) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o a su polinucleótido antisentido,
- y/o de una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las proteínas, o biomoléculas del grupo I, anteriormente mencionadas,
- (b)
- medida de la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo con la o las biomoléculas del grupo I dado el caso sintetizadas por una célula, o con una célula y/o un preparado celular de este tipo que ha sintetizado como mínimo una de las biomoléculas del grupo I anteriormente mencionadas,
- mediante la medida de la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular mediante la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero,
- o
- mediante la medida de la unión por el desplazamiento de un ligando marcado conocido de la biomolécula y/o de la proteína y/o mediante la actividad de una sustancia de ensayo marcada unida con ésta.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería
genética antes del paso (a).
3. Procedimiento según la reivindicación
2, caracterizado porque la manipulación por ingeniería
genética permite medir como mínimo uno de los parámetros
funcionales modificados por la sustancia de ensayo.
4. Procedimiento según la reivindicación
3, caracterizado porque mediante manipulación por ingeniería
genética se expresa una forma de una proteína G no expresada de modo
endógeno o se introduce un gen indicador.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la
célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contiene
como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c),
1e) o 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%,
preferentemente en como mínimo un 95%, en particular en como mínimo
un 97%.
6. Procedimiento según la reivindicación
5, caracterizado porque el polinucleótido está contenido en
un constructo de DNA recombinante.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la célula,
después de la manipulación por ingeniería genética según la
reivindicación 2 y antes del paso (a) según la reivindicación 1, se
cultiva bajo condiciones que permiten una expresión, dado el caso
bajo presión de selección.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula es
una célula de anfibio, una célula bacteriana, una célula de
levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero
inmortalizada o
nativa.
nativa.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que un primer procedimiento según
una de las reivindicaciones 1 a 8 se acopla con un segundo
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 de tal modo
que los valores de medida y los resultados del primer procedimiento,
en cuanto a la sustancia a medir, se comparan con los valores de
medida y los resultados del segundo procedimiento, en cuanto a la
sustancia a medir, caracterizado porque en el paso (a) de uno
de los dos procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento
principal, la sustancia a ensayar
se incuba con una biomolécula seleccionada de
entre el grupo II:
- la proteína BNPI y/o una proteína según una de las Figuras 1b), 1d), 1f) o 1h) y/o una proteína similar a una de estas proteínas en como mínimo un 90%, y/o una proteína que codifica un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%, y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 1a), 1c), 1e) o 1g) o a su polinucleótido antisentido,
y/o una célula y/o un preparado celular de este
tipo que ha sintetizado como mínimo una de las proteínas o
biomoléculas del grupo II, anteriormente mencionadas,
y
porque en el paso (a) del otro de los dos
procedimientos, denominado en lo sucesivo procedimiento secundario,
la sustancia a ensayar se incuba con una biomolécula del grupo I o
con una biomolécula del grupo II, no eligiéndose la biomolécula con
la que ha sido incubada la sustancia en el procedimiento
principal.
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Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007093618A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-23 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Functional characterization of vesicular glutamate transporter 2 |
US20220308053A1 (en) * | 2021-03-29 | 2022-09-29 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Method and reagents for the detection of an autoantibody |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5686266A (en) * | 1995-04-27 | 1997-11-11 | Eli Lilly And Company | Human brain sodium dependent inorganic phosphate cotransproter and related nucleic acid compounds |
US5985604A (en) * | 1997-02-24 | 1999-11-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human sodium-dependent phosphate cotransporter |
WO2001057190A2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-09 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
AU2001238347A1 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
AU2001282967A1 (en) * | 2000-07-25 | 2002-02-05 | The Regents Of The University Of California | Novel glutamate transporters |
-
2002
- 2002-09-24 WO PCT/EP2002/010707 patent/WO2003029828A2/de active IP Right Grant
- 2002-09-24 ES ES02777190T patent/ES2276964T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-24 AT AT02777190T patent/ATE346305T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-09-24 EP EP02777190A patent/EP1430308B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-24 EP EP06018121A patent/EP1722233A3/de not_active Withdrawn
- 2002-09-24 EP EP04025751A patent/EP1526382B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-24 ES ES04025751T patent/ES2279278T3/es not_active Expired - Lifetime
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