ES2276192T3 - Procedimiento de screening. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para descubrir sustancias reguladoras del dolor, es decir, sustancias que influyen directa o indirectamente en la percepción del dolor, que incluye los siguientes pasos: (a) incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con una célula y/o un preparado celular que tiene sintetizado un péptido o una proteína seleccionado entre el siguiente grupo: - PIM-2; - un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%; - un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 35b), 35d), 35f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 90%; - y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido; (b) medida de la unión de la sustancia de ensayo al péptido o proteína sintetizado por la célula, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo al péptido o a la proteína, a través de la medida de la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular a través de la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o medida de la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido del péptido o de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada.
Description
Procedimiento de screening.
La invención se refiere a un procedimiento para
descubrir sustancias relevantes para el dolor.
Existen diferentes medicamentos para la terapia
del dolor, por ejemplo ácido acetilsalicílico, paracetamol,
dipirona, tramadol, morfina y fentanilo, pero también se utilizan
sustancias como amitriptilina y cetamina para el tratamiento de
pacientes con dolor. Sin embargo, a pesar de que los esquemas
terapéuticos son cada vez más refinados, con frecuencia no se puede
lograr una mejoría duradera para los pacientes, sobre todo en caso
de estados de dolor crónicos. Una de las causas de ello estriba en
que, en caso de dolor crónico, se producen modificaciones
permanentes en las neuronas afectadas.
En los últimos años, la investigación del dolor
ha aportado el conocimiento básico de que precisamente tras el
desarrollo de estados de dolor crónicos subyacen modificaciones
plásticas del sistema nervioso, en particular en las neuronas
nociceptivas de los ganglios de la raíz dorsal y las neuronas en el
área del asta dorsal de la médula espinal (para una idea general
véase Coderre y col. 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). La
plasticidad neuronal va acompañada de modificaciones en la
expresión de determinados genes y conduce a una modificación
persistente del fenotipo de las neuronas afectadas. Hasta ahora, el
concepto de plasticidad neuronal se había utilizado principalmente
en procesos de desarrollo, aprendizaje y regeneración, pero los
nuevos hallazgos de las investigaciones en el campo del dolor
demuestran que este concepto también es aplicable en caso de
procesos fisiopatológicos (Tölle, 1997).
Ya se ha caracterizado de forma bastante concisa
la cronificación del dolor a nivel fenomenológico en la
experimentación animal. La inducción de estados de dolor crónicos
conduce a las siguientes modificaciones:
- \bullet
- Aumento de la sensibilidad y disminución del umbral de estimulación de los nociceptores periféricos.
- \bullet
- Activación de los denominados nociceptores silenciosos.
- \bullet
- Reorganización de campos receptores.
- \bullet
- Aumento de la excitabilidad en la médula espinal.
Estas modificaciones plásticas han sido
descritas tanto en el caso de las fibras nerviosas aferentes
primarias que se encuentran en los ganglios como en el caso de las
neuronas posteriores localizadas en la médula espinal, y se presume
que también se producen en áreas supraespinales, por ejemplo en el
tálamo. De forma análoga a los mecanismos descritos para los
procesos de aprendizaje y memoria, es de suponer que en las células
afectadas se desarrolla un programa genético específico que incluye
la regulación coordinada de genes relevantes cuya expresión
contribuye después de forma decisiva a la manifestación
fisiopatológica del dolor crónico.
Por ello, el punto de partida de la invención
consistía en identificar este tipo de genes regulados por el dolor,
cuya expresión se modifica bajo condiciones de dolor y, por
consiguiente, probablemente intervienen en la generación y el
procesamiento del dolor crónico principalmente a través de sus
relaciones de regulación.
Ya se ha demostrado una regulación para diversos
genes conocidos en diferentes modelos de dolor (véase Tabla 1), por
ejemplo para neurotransmisores (sustancia P, CGRP), receptores
(sustancia p-receptor, receptores para opiáceos
\mu, \kappa, \delta, receptor NMDA) y factores de
transcripción (cJun, JunB, cFos o Krox24). El hecho de que dichos
receptores ya sean utilizados como objetivos moleculares para el
desarrollo de nuevos analgésicos (Dickenson, 1995) constituye una
indicación clara de que la identificación de nuevos genes regulados
por el dolor también tiene gran interés en el desarrollo de
analgésicos, en particular en los procedimientos de screening
(rastreo) correspondientes. La idea central consiste en interrumpir
el desarrollo o la persistencia del dolor, principalmente de tipo
crónico, influyendo en la función de aquellas proteínas cuya
formación aumenta o disminuye durante los estados de dolor.
Distintas publicaciones están dedicadas a la
idea de hallar moduladores para determinados compuestos de este
tipo.
Por ejemplo, Sargovi y col. (Trends Pharmacol.
Sci. (2000), 21(3), 93-98) se dedican al
desarrollo de agentes farmacológicos que modulen la función de la
neutrofina. Para ello se identifican ligandos de neutrofinas o sus
receptores mediante procedimientos "high-througput
screening" (rastreo de alto rendimiento), estando orientada la
investigación esencialmente al receptor p75 y también a su
intervención en la apoptosis y su influencia en el receptor
trk.
El Pim-2 se conoce, por ejemplo,
de Baytel y col. (1998), "The human Pim-2
proto-oncogene and its testicular expression",
Biochimica et Biophysica Acta, Gene Structure and Expression, tomo
1442, nº 2-3, páginas 274-285. El
artículo describe la activación de la expresión en ratones con
déficit de Pim-1 y la importancia de estos
"taggings" (marcados) compensatorios en la formación de
tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, el objetivo principal de la
invención consistía en desarrollar un procedimiento de rscreening
(rastreo) para identificar sustancias relevantes para el dolor, en
particular sustancias reguladoras del dolor. En consecuencia, la
invención se refiere a un procedimiento para descubrir sustancias
reguladoras del dolor, el cual incluye los siguientes pasos:
- (a)
- incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con una célula y/o un preparado celular que ha sintetizado un péptido o proteína seleccionado de entre el siguiente grupo:
- -
- PIM-2;
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos como mínimo en un 90%;
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 35b), 35d), 35f), o un péptido o proteína similar a éstos como mínimo en un 90%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido;
- (b)
- medición de la unión de la sustancia de ensayo al péptido o la proteína sintetizados por la célula, o medición de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo al péptido o la proteína, midiendo la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas, en particular midiendo la modificación de la expresión genética, los medios iónicos, el pH o el potencial de membrana, modificando la actividad enzimática o la concentración del 2º mensajero, o midiendo la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido del péptido o la proteína y/o a través de la actividad correspondiente de una sustancia de ensayo marcada.
Este nuevo procedimiento de screening (rastreo)
se basa en la posibilidad de hallar la potencial eficacia potencial
contra el dolor de una sustancia a través de su interacción con una
estructura peptídica o con una proteína regulada por el dolor.
En este contexto, el concepto "regulador del
dolor" se refiere a una influencia reguladora potencial en el
dolor fisiológico, en particular a un efecto analgésico. El término
"sustancia" incluye cualquier compuesto adecuado como
principio activo medicamentoso, principalmente principios activos de
bajo peso molecular, pero también otros como ácidos nucleicos,
grasas, azúcares, péptidos o proteínas como anticuerpos.
Por "incubación bajo condiciones adecuadas"
se ha de entender que la sustancia a examinar puede reaccionar con
la célula o con el preparado correspondiente en un medio acuoso
durante un tiempo determinado antes de la medida. La temperatura
del medio acuoso se puede regular, por ejemplo, a entre 4ºC y 40ºC,
preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo de
incubación puede variar desde unos segundos a varias horas,
dependiendo de la interacción de la sustancia con el péptido o la
proteína. No obstante son preferentes tiempos de incubación de 1
minuto a 60 minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o
sistemas tampón adecuados, de modo que durante la incubación en el
medio se mantenga un pH entre 6 y 8, por ejemplo, preferentemente
un pH 7,0-7,5. También se pueden añadir al medio
otras sustancias adecuadas como coenzimas, nutrientes, etc. Los
especialistas pueden determinar fácilmente las condiciones adecuadas
en función de la interacción examinada de la sustancia con el
péptido o la proteína basándose en su experiencia, en la literatura
o en algún ensayo preliminar sencillo, con el fin de obtener el
valor de medida más claro posible en el procedimiento.
Una célula que ha sintetizado un péptido o una
proteína determinada es una célula que ya ha expresado este péptido
o proteína de forma endógena o es una célula que ha sido modificada
por ingeniería genética de tal modo que expresa este péptido o
proteína y, correspondientemente, contiene el péptido o la proteína
antes del comienzo del procedimiento según la invención. Las
células pueden ser células procedentes de líneas celulares, dado el
caso inmortalizadas, o células nativas procedentes de tejidos y
aisladas de éstos, estando la agrupación celular disuelta en la
mayoría de los casos. El preparado de estas células incluye
principalmente materiales homogeneizados celulares, citosol, una
fracción de membrana celular con fragmentos de membrana, una
suspensión de orgánulos celulares aislados, etc.
Los péptidos y las proteínas aquí citados han
sido identificados como reguladores del dolor en el marco de esta
invención mediante el método consistente en provocar dolor en un
animal y, después de un tiempo adecuado, comparar el patrón de
expresión en determinados tejidos del animal con los de un animal
control no sometido a una provocación del dolor. Los péptidos y
proteínas expresados de forma modificada hallados mediante este
procedimiento también incluyen proteínas conocidas, como la proteína
quinasa, PIM-2. La especie de procedencia de estas
proteínas carece de importancia para la función del procedimiento,
pero es preferible utilizar la variante humana, de ratón o de rata.
Las proteínas mencionadas son conocidas en cuanto a su secuencia de
DNA codificadora y la secuencia de aminoácidos, y también se ha
descrito su función general. Sin embargo, en el estado actual de la
técnica hasta ahora no se las había relacionado con el dolor y, en
particular, con la regulación del dolor. Como la identificación de
las proteínas se ha realizado mediante una modificación de la
expresión en un modelo de dolor in vivo, para los futuros
medicamentos producidos con estas proteínas el procedimiento de
screening (rastreo) según la invención derivado de ellas tiene la
considerable ventaja de no estar basado exclusivamente en
razonamientos teóricos, sino que probablemente posee una gran
relevancia in vivo. Dado que este procedimiento permite la
interacción de sustancias con péptidos y proteínas no utilizadas
hasta la fecha en el campo del dolor como escala para localizar
sustancias reguladoras del dolor, con este procedimiento
probablemente se puedan encontrar ahora sustancias relevantes para
el dolor que habrían pasado inadvertidas con los procedimientos
conocidos hasta la fecha en el estado actual de la técnica, los
cuales emplean otros péptidos o proteínas. Ésta es otra ventaja
considerable del nuevo procedimiento según la invención.
Los péptidos o proteínas utilizados también se
pueden elegir entre aquellos codificados por un polinucleótido de
acuerdo con una de las Figuras 35a), 35c) o 35e). Las Figuras
muestran la mayoría de las secuencias de cDNA codificadoras
conocidas de ratón, rata y humanas de PIM-2 para el
procedimiento según la invención. También se pueden utilizar
péptidos y proteínas codificados por una secuencia de DNA similar a
una de las mostradas en las Figuras en como mínimo un 90%, ya que,
en la mayoría de los casos, desviaciones tan pequeñas no influyen
en la interacción con el péptido o la proteína y, en consecuencia,
tampoco en la función del procedimiento. En este contexto, por el
concepto "similitud en un 90%" se entiende una coincidencia de
un 90% en la sucesión de bases en la región codificadora del
polinucleótido.
Las proteínas también se pueden seleccionar
entre proteínas con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una
de las Figuras 35b), 35d) o 35f). También en este caso se trata, en
su mayoría, de secuencias conocidas en el estado actual de la
técnica, excepto la secuencia de PIM-2 de rata, que
se determinó en el marco de la invención. Aquí también se pueden
utilizar péptidos y proteínas cuya secuencia de aminoácidos sea
similar en como mínimo un 90% a una de las mostradas en las
figuras, ya que, en la mayoría de los casos, desviaciones pequeñas
en la sucesión de aminoácidos no influyen en la interacción de la
sustancia con el péptido y la proteína y, en consecuencia, tampoco
en la función del procedimiento. En este contexto, por "similitud
en un 90%" se entiende una coincidencia de un 90 % de la
sucesión de aminoácidos.
Las proteínas también se pueden seleccionar
entre proteínas codificadas por un ácido nucleico que se unen bajo
condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras
35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido. En este
contexto, por "condiciones estrictas" se entienden aquellas
condiciones bajo las cuales sólo se forman cadenas de ácido
nucleico con un emparejamiento de bases perfecto y que permanecen
estables, y por "polinucleótido antisentido" se entiende una
molécula consistente en varios ácidos nucleicos naturales o
modificados cuya sucesión de bases es complementaria a la sucesión
de bases de una región parcial de un RNA presente en la
naturaleza.
En el marco de esta invención se han
identificado y secuenciado fragmentos de genes reguladores de dolor
que en el estado actual de la técnica todavía no habían sido
asignados a ningún péptido o proteína conocidos. El fragmento de
gen secuenciado, suficientemente amplio en cada caso, define de
forma inequívoca el gen correspondiente, el polinucleótido de cuya
secuencia forma parte el fragmento de gen. Dado que el fragmento de
gen correspondiente se ha identificado como un fragmento de gen
regulador de dolor, también está perfilada una clara función
fisiológica del gen. Los especialistas pueden emplear métodos
conocidos para obtener el gen completo que incluye el fragmento.
Por ejemplo, se puede marcar un polinucleótido como una sonda,
hibridar un banco de cDNA con la sonda y lavar después el mismo
bajo condiciones estrictas, y aislar, y dado el caso secuenciar el
clon de cDNA al que se ha unido la sonda. Del mismo modo, el gen o
polinucleótido se puede obtener determinando y sintetizando
secciones de un polinucleótido como cebadores de oligonucleótido
específicos del gen, con los que después, mediante PCR, se genera,
y en caso dado se secuencia, el polinucleótido prolongado a partir
de DNA de cadena simple o doble, de bibliotecas de cDNA o de DNA
genómico como molde. Este procedimiento se explica con más precisión
más adelante en relación con un ejemplo. En comparación con los
procedimientos conocidos, este grupo de péptidos y proteínas
también tiene la ventaja de asegurar una relación in vivo en
su utilización en el procedimiento según la invención y de que el
procedimiento permite identificar sustancias potencialmente
reguladoras del dolor que posiblemente habrían pasado inadvertidas
con los métodos de screening (rastreo) conocidos hasta la fecha en
el estado actual de la técnica.
La escala a través de la cual el procedimiento
permite hallar sustancias de interés consiste bien en la unión al
péptido o la proteína, que se puede comprobar por ejemplo mediante
desplazamiento de un ligando conocido o mediante la magnitud de la
sustancia unida, o bien en la modificación de un parámetro funcional
a través de la interacción de la sustancia con el péptido o la
proteína. Esta interacción puede consistir principalmente en una
regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de
iones y/o enzimas, y los parámetros funcionales modificados pueden
ser, por ejemplo, la expresión genética, el medio iónico, el pH o el
potencial de membrana, o la variación de la actividad enzimática o
de la concentración del 2º mensajero.
A continuación, para aclarar la invención,
además de las explicaciones de los conceptos dadas en el texto
general se muestran otras definiciones con el fin de establecer
claramente cómo se han de entender e interpretar, en el sentido de
esta invención, determinados conceptos utilizados principalmente en
las reivindicaciones.
- -
- Sustancia: Este término hace referencia a un compuesto químico. Más concretamente se trata de compuestos que pueden desarrollar potencialmente un efecto en el cuerpo, principios activos de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas, en este caso sobre todo principios activos de bajo peso molecular.
- -
- Regulador del dolor: En el sentido de la invención, "regulador del dolor" significa que la sustancia influye directa o indirectamente en la percepción del dolor, en particular que actúa como analgésico de forma natural.
- -
- Incubación: Por "incubación" se entiende que un objeto de estudio biológico, por ejemplo una célula o una proteína, se introduce y se deja en un medio a temperatura regulada, por ejemplo en una estufa incubadora o sobre un baño de agua. En este contexto, por el concepto "bajo condiciones adecuadas" se entiende una incubación bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo 37ºC, pH 7,2) o bajo aquellas condiciones que permiten una medida óptima en el procedimiento.
- -
- Célula: La célula es un sistema autorregulado, abierto, que se encuentra en equilibrio dinámico con su entorno mediante un intercambio permanente de materiales, con metabolismo propio y capacidad de reproducción. La célula se puede cultivar por separado o puede formar parte de un tejido, en particular de un órgano, y encontrarse en éste de forma aislada o incluso como una agrupación celular.
- -
- Preparado celular: Por este concepto se entienden preparados obtenidos por métodos químicos, biológicos, mecánicos o físicos donde se modifica la estructura celular, por ejemplo fragmentos de membrana, compartimentos celulares aislados, citosol aislado, o material homogeneizado obtenido de tejido.
- -
- Péptido: Compuesto de aminoácidos unidos en cadenas mediante enlaces peptídicos. Un oligopéptido consiste en 2 a 9 aminoácidos, un péptido consiste en 10 a 100 aminoácidos.
- -
- Proteína: Compuesto de más de 100 aminoácidos unidos en cadenas mediante enlaces peptídicos, eventualmente con una estructura espacial definida.
- -
- PIM-2: un protooncogén y una serina-treonina-quinasa.
- -
- Polinucleótido: El nucleótido que sirve de base es un componente básico de los ácidos nucleicos que consiste fundamentalmente en una base de nucleína, pentosa y ácido fosfórico. Corresponde a un polinucleótido de alto peso molecular de varios nucleótidos unidos entre sí a través de la esterificación de una ácido fosfórico-pentosa. Pero en esta invención se utilizan también polinucleótidos modificados que, si bien conservan la sucesión de bases, poseen un esqueleto modificado en lugar de la ácido fosfórico-pentosa.
- -
- Similar en como mínimo un 90(95,97)%: Este concepto significa que la sucesión de bases de la región codificadora de los polinucleótidos incluidos es idéntica a la de referencia (figura, etc.) en como mínimo un 90% (95%, 97%), y que la sucesión de aminoácidos de la estructura primaria de los péptidos y proteínas incluidos es idéntica a la de referencia en como mínimo un 90% (95%, 97%).
- -
- Gen: Con el término "gen" se designa una sección de genoma con una secuencia de nucleótidos definida que incluye la información para la síntesis de un mRNA o pre-mRNA o de un RNA de otro tipo (por ejemplo tRNA, rRNA, snRNA, etc.). Contiene secciones codificadoras y no codificadoras.
- -
- Fragmento de gen: Sección de ácido nucleico que incluye en su sucesión de bases una región parcial de un gen.
- -
- Fragmento de gen prolongado fisiológicamente: Un fragmento de gen prolongado mediante procedimientos biológicos moleculares, por ejemplo por muestreo completo de una biblioteca de cDNA, extracción de cadenas de DNA complementarias de una mezcla de ácidos nucleicos o procedimientos con intervención de PCR (denominados protocolos RACE), de tal modo que su secuencia corresponde al mRNA expresado en el órgano diana correspondiente (cerebro, espina dorsal, ganglio de la raíz dorsal).
- -
- Unión al péptido o proteína: Interacción entre la sustancia y el péptido o proteína que conduce a su fijación.
- -
- Parámetros funcionales: Por este concepto se entienden magnitudes de medida de un experimento que están en correlación con la función de una proteína (canal iónico, receptor, enzima).
- -
- Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.
- -
- Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.
- -
- Proteína G: Abreviatura internacional habitual para una proteína que se une a guanosin-trifosfato (GTP), que se activa como proteína señal mediante receptores acoplados a la proteína G.
- -
- Gen indicador: Designación general para genes cuyos productos genéticos se pueden examinar fácilmente con ayuda de sencillos métodos bioquímicos o histoquímicos, por ejemplo luciferasas, fosfatasas alcalinas o Green Fluorescent Protein (GFP) (proteínas fluorescentes verdes).
- -
- Constructo de DNA (recombinante): Designación general para todo tipo de moléculas de DNA formadas por la unión in vitro de moléculas de DNA.
- -
- Vector de clonación: Designación general para moléculas de ácido nucleico que durante la clonación actúan como portadores de genes extraños o de partes de estos genes.
- -
- Vector de expresión: Designación para vectores de clonación construidos especialmente que, después de introducirlos en una célula huésped adecuada, permiten la transcripción y traducción del gen extraño incorporado por clonación en el vector.
- -
- Secuencia LTR: Abreviatura de long terminal repeat. Designación general para regiones de secuencia más largas que se encuentran en ambos extremos de un genoma lineal. Estas regiones de secuencia se encuentran por ejemplo en los genomas de retrovirus y en los extremos de transposones eucarióticos.
- -
- Cola poli-A: Los restos de adenilo (aproximadamente 20-250) fijados en el extremo 3’ de los RNA mensajeros mediante poliadenilación.
- -
- Secuencia promotora: Designación para una región de secuencia de DNA a partir de la cual se controla la transcripción de un gen, es decir, la síntesis de mRNA.
- -
- Secuencia ORI: Abreviatura de origin of replication. La secuencia ORI permite que una molécula de DNA se reproduzca como una unidad autónoma en la célula.
- -
- Secuencia intensificadora: Designación para elementos genéticos relativamente cortos, que se presentan en parte en forma de repeticiones, y que en general refuerzan la expresión de algunos genes en diferente medida.
- -
- Factor de transcripción: Designación para una proteína que influye en la transcripción de un gen a través de su unión a secuencias de DNA específicas.
- -
- Cultivar: Mantener células o tejidos bajo condiciones de cultivo adecuadas.
- -
- Condiciones que permiten la expresión: Por este concepto se entiende la selección y aplicación de condiciones de cultivo que permiten la expresión de una proteína de interés, entre ellas se encuentran la modificación de la temperatura, el cambio de medio, la adición de sustancias inductoras, la supresión de sustancias inhibidoras.
- -
- Tiempo de incubación: Tiempo durante el cual son incubadas las células o los tejidos, es decir, son sometidos a una temperatura determinada.
- -
- Presión de selección: Aplicación de condiciones de cultivo que proporcionan una ventaja de crecimiento a las células con un producto genético determinado, el denominado marcador de selección.
- -
- Célula de anfibio: Célula de un animal de la clase anfibia.
- -
- Célula bacteriana: Célula asignable al dominio de las eubacterias o arqueobacterias, o procedente del mismo.
- -
- Célula de levadura: Célula asignable al orden de los endomycetales, o procedente del mismo.
- -
- Célula de insecto: Célula asignable al orden de los Hexapoda, o procedente del mismo.
- -
- Célula de mamífero nativa: Células procedentes de un mamífero cuyas características relevantes corresponden a las de las células que se encuentran en el organismo.
- -
- Célula de mamífero inmortalizada: Célula que, mediante las condiciones de cultivo aplicadas o mediante manipulación por ingeniería genética ha adquirido la propiedad de dividirse en el cultivo más allá de la frecuencia de división habitual (aproximadamente 100).
- -
- Marcado: Hecho provocado por una modificación o derivación adecuada para una reacción de verificación. Por ejemplo, radiactivo, fluorescente o luminiscente.
- -
- Ligando: Sustancia que se une a una molécula que se encuentra en el cuerpo o en una célula, especialmente un receptor.
- -
- Desplazamiento: Separación total o parcial de un ligando de su sitio de unión.
- -
- Actividad relacionada: Valor de medida registrado bioquímica o físicamente que está en correlación con la cantidad de ligando unida a un receptor.
- -
- Regulación: Inhibición o activación de un proceso como parte de un proceso de regulación.
- -
- Inhibición: Como caso especial de la regulación, impedimento/reducción de un proceso.
- -
- Activación: Como caso especial de la regulación, intensificación de un proceso.
- -
- Receptores: En el sentido más amplio, todas aquellas moléculas procarióticas o eucarióticas presentes en el organismo a las que se puede unir un principio activo. Más concretamente, proteínas o complejos de varias proteínas unidos a membrana que provocan una modificación en la célula por la unión de un principio activo.
- -
- Canales iónicos: Proteínas o complejos de varias proteínas unidos a la membrana a través de los cuales ésta puede ser atravesada por cationes o aniones.
- -
- Enzimas: Designación para proteínas o complejos de un componente activador no albuminoide con una proteína que poseen propiedades catalíticas.
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- Expresión genética (expresar/expresable): La traducción de la información genética de un gen en el RNA (expresión de RNA) o en una proteína (expresión de proteína).
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- Medio iónico: Concentración de uno o más iones en un compartimento determinado.
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- Potencial de membrana: Diferencia de tensión a través de una membrana debida a un exceso de cationes en un lado de la membrana y de aniones en el otro.
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- Modificación de la actividad enzimática: Inhibición o inducción de la actividad catalítica de una enzima.
- -
- 2º mensajero: Molécula pequeña que se forma en el citosol o que penetra en el mismo como respuesta a una señal extracelular y ayuda a transmitir la información al interior de la célula, por ejemplo cAMP, IP_{3}.
- -
- Sonda (genética): Designación para todo tipo de ácidos nucleicos con cuya ayuda se puede detectar un gen buscado o una secuencia de DNA determinada. Además, mediante derivación de la sonda genética (por ejemplo biotina, perlas magnéticas, digoxinina) se pueden extraer moléculas de DNA de una mezcla. Como sondas se utilizan genes clonados, fragmentos de genes, oligonucleótidos sintetizados químicamente y también RNA, que en la mayoría de los casos está marcado de forma radiactiva.
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- DNA: Designación internacional para el ácido desoxirribonucleico.
- -
- DNA genómico: Designación general para el DNA procedente del núcleo de una célula en organismos eucarióticos.
- -
- cDNA: Abreviatura de complementary DNA (DNA-complementario). Designación para la copia de DNA de cadena simple o doble de una molécula de RNA.
- -
- Banco/librería de cDNA: Designación para una colección de fragmentos de cDNA clonados de forma arbitraria que, en conjunto, representan la totalidad de los RNAs sintetizados de una célula o un tejido.
- -
- Clon de cDNA: Designación para una población de células genéticamente uniformes que se derivan de una única célula, conteniendo esta célula un fragmento de cDNA incorporado de forma artificial.
- -
- Hibridación: Formación de una molécula de ácido nucleico de cadena doble a partir de dos cadenas simples independientes mediante emparejamiento de bases.
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- Condiciones estrictas: Condiciones bajo las cuales sólo se forman cadenas de ácido nucleico con un emparejamiento de bases perfecto y que permanecen estables.
- -
- Aislar: Localizar y separar de una mezcla una molécula buscada.
- -
- Secuenciación de DNA: Determinación de la sucesión de bases de una molécula de DNA.
- -
- Secuencia de ácido nucleico: Designación para la estructura primaria de una molécula de DNA; es decir, la sucesión de las bases individuales de las que está compuesto un DNA.
- -
- Cebador de oligonucleótido específico de gen: Ácidos oligonucleicos, es decir fragmentos de ácido nucleico con una longitud de 10-40 bases, que permiten en su composición de bases una hibridación estricta en el gen o el cDNA buscado.
- -
- Descubrimiento de cebadores de oligonucleótido: La búsqueda manual o asistida por ordenador de oligonucleótidos para una secuencia de DNA predeterminada que sean óptimamente adecuados para una hibridación y/o para una reacción en cadena de polimerasa.
- -
- PCR: Abreviatura de reacción en cadena de polimerasa. Procedimiento in vitro para el enriquecimiento selectivo de regiones de ácido nucleico de longitud y secuencia definidas de una mezcla de moléculas de ácido nucleico.
- -
- DNA-molde: Molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas de ácido nucleico a partir de las cuales se multiplica una sección de DNA con ayuda de una PCR (véase más arriba).
- -
- RNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos.
- -
- mRNA: Abreviatura internacional usual para los ácidos ribonucleicos mensajeros, que intervienen en la transferencia de la información genética del núcleo a la célula y que contienen la información para la síntesis de un polipéptido o proteína.
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- Polinucleótido antisentido: Molécula consistente en varios ácidos nucleicos naturales o modificados cuya sucesión de bases es complementaria a la sucesión de bases de una región parcial de un RNA presente en la naturaleza.
- -
- PNA: Abreviatura internacional usual de peptidic nucleic acids (ácidos nucleicos peptídicos). En este contexto, los aminoácidos enlazados peptídicamente forman una cadena, portando los aminoácidos como cadena lateral una base apta para la hibridación con DNA o RNA.
- -
- Secuencia: Sucesión de nucleótidos o aminoácidos. En el sentido específico de esta invención, con este término se hace referencia a la secuencia de ácidos nucleicos.
- -
- Ribozima: Designación para un ácido ribonucleico catalíticamente activo (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
- -
- DNA-enzima: Designación para una molécula de DNA que posee actividad catalítica (por ejemplo ligasa, endonucleasa, polimerasa, exonucleasa).
- -
- RNA/DNA catalítico: Designación general para ribozimas o DNA-enzimas (véase más arriba).
- -
- Adenovirus: Virus citopatógenos presentes en los vertebrados.
- -
- Virus adenoasociado (AAV): Forma parte de la familia de los parvovirus. Para lograr una reproducción eficaz del AAV es necesaria una coinfección de las células huésped con virus auxiliares (por ejemplo herpesvirus, virus de la vaccinia o adenovirus). La propiedad del AAV de integrarse de forma estable en el genoma huésped lo hace especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos.
- -
- Herpesvirus: Patógeno viral de la infección herpes.
- -
- Modificación postraduccional: Modificación en proteínas o polipéptidos realizada después de la traducción, por ejemplo fosforilación, glicosilación, amidación, acetilación o proteolisis.
- -
- Glicosilar: Designación para la acción de añadir moléculas de azúcar individuales o cadenas de azúcar completas a proteínas.
- -
- Fosforilar: Designación para la acción de añadir uno o más restos fosfato a una proteína, preferentemente a los grupos OH de los aminoácidos serina, treonina o tirosina.
- -
- Amidar: Designación para la acción de transformar una función carboxilo en una función amida, por ejemplo en el resto de aminoácido carboxi-terminal de un péptido o proteína.
- -
- Proveer de anclaje de membrana: Modificación postraduccional de una proteína, o de otra molécula orgánica, de tal modo que ésta se une a la membrana de doble capa lipídica de las células mediante la adición de una molécula hidrófoba, convenientemente un ácido graso o un derivado del mismo.
- -
- Segmentar: En este caso específico, la segmentación de un péptido o proteína en varias subsecuencias.
- -
- Acortar: Acortar en una o varias partes una molécula consistente en varias partes individuales.
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- Anticuerpos: Proteínas solubles o unidas a membranas celulares, designadas como inmunoglobulinas, con un sitio de unión específico para antígenos.
- -
- Anticuerpos monoclonales: Anticuerpos con una selectividad extremadamente alta dirigidos contra un único determinante antigénico de un antígeno.
- -
- Anticuerpos policlonales: Mezcla de anticuerpos dirigidos contra varios determinantes de un antígeno.
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- Transgénico: Modificado genéticamente.
- -
- Mamífero no humano: La totalidad de los mamíferos (clase de los Mammalia) excepto la especie humana.
- -
- Célula germinal: Célula con genoma haploide que permite la formación de un nuevo organismo mediante fusión con una segunda célula germinal.
- -
- Célula somática: Célula diploide como componente de un organismo.
- -
- Introducción cromosómica: Intervención en la secuencia de nucleótidos a nivel cromosómico.
- -
- Genoma: Definición general de la totalidad de todos los genes de un organismo.
- -
- Ascendiente del animal: Un animal (el ascendiente) que, por transmisión de su material genético de forma natural o artificial, está emparentado en línea directa con otro animal (el descendiente).
- -
- Expresable: Una molécula de ácido nucleico es expresable cuando incluye la información para la síntesis de un polipéptido o proteína y está provista de las secuencias reguladoras correspondientes, que permiten la síntesis de este polipéptido o proteína in vitro o in vivo. Cuando ya no se dan estas condiciones, por ejemplo por intervención en la secuencia codificadora, la molécula de ácido nucleico ya no es expresable.
- -
- Roedor: Animal del orden de los Rodentia, por ejemplo la rata o el ratón.
- -
- Identificable como sustancia reguladora del dolor: Sustancia que al ser incorporada en un organismo vivo produce un cambio de comportamiento que los especialistas designan como inhibidor del dolor (antinociceptivo, antihiperalgésico o antialodínico). En el caso del procedimiento de screening (rastreo), este concepto se refiere a que la sustancia, durante el screening, debido a una mayor unión o a que provoca una variación de un parámetro funcional, supera claramente, por ejemplo en un 100%, a la unión o la interacción de la media de las sustancias ensayadas.
- -
- Compuesto: Otro nombre para una molécula consistente en varios átomos. En este caso una molécula identificable mediante el procedimiento según la invención.
- -
- Principio activo: Un compuesto que al ser administrado a un organismo provoca un cambio en dicho organismo. Por este concepto se entienden principalmente moléculas sintetizadas de forma orgánico-química que tienen un efecto curativo en el organismo. En este caso se trata en particular de moléculas que se unen a las proteínas y péptidos según la invención.
- -
- De bajo peso molecular: Molécula con un peso molecular < 2kDa.
- -
- Medicamento: Sustancia correspondiente a la definición del Artículo 1 §2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos.
- -
- Diagnóstico: Compuesto o procedimiento a utilizar para diagnosticar una enfermedad.
- -
- Tratamiento del dolor: Procedimiento destinado a mitigar o eliminar dolores o para inhibir la aparición esperable de dolores (analgesia preventiva).
- -
- Dolor crónico: Sensación de dolor de duración prolongada, frecuentemente caracterizada porque va más allá del momento y el lugar del estímulo inicial y aumenta la sensibilidad del cuerpo al dolor.
- -
- Terapia genética: Por "terapia genética" se entienden todos los procedimientos que tienen el objetivo de tratar de forma causal enfermedades genéticas mediante modificaciones adecuadas del genoma.
- -
- Terapia genética in vivo : Introducción de material genético en el organismo vivo con el objetivo de una terapia genética. Se puede distinguir entre intervención somática e intervención en la línea germinal, que tienen lugar en un caso en células diploides y en el otro en células haploides.
- -
- Terapia genética in vitro : Introducción de material genético en células fuera del cuerpo humano con el fin de usar éstas posteriormente para la terapia genética introduciéndolas de nuevo en el cuerpo humano.
- -
- Diagnosis: Procedimiento para identificar una enfermedad.
- -
- Análisis de eficacia: Análisis para examinar la eficacia de un compuesto después de su actuación en un organismo vivo.
En una forma de realización preferente del
procedimiento, la célula se manipula por ingeniería genética en el
paso (a). En este proceso se introduce material genético en la
célula, en particular una o más secuencias de polinucleótidos. En
otra variante preferente de esta forma de realización, la
manipulación por ingeniería genética permite medir como mínimo uno
de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de
ensayo. En esta forma de realización, mediante manipulación por
ingeniería genética se crean condiciones que permiten medir o
mejorar la medida de la variación de un parámetro funcional. En este
contexto es especialmente preferente que mediante la manipulación
por ingeniería genética se exprese una proteína G no expresada de
forma endógena en la célula o se introduzca un gen indicador. Por
este concepto se ha de entender principalmente la introducción por
ingeniería genética de una proteína G no presente de forma endógena
o no expresada fisiológicamente (proteína de unión a GTP) en la
célula, por ejemplo la introducción de una proteína G quimérica, que
permite una modificación de la vía de señales, o de una proteína G
promiscua, que tiene mucha facilidad de unión. La introducción de
un gen indicador permite a su vez medir una expresión inducida
(provocada de forma extracelular) del producto genético.
En otra forma de realización preferente, la
célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contenga
como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o
35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%. De
este modo se puede lograr, por ejemplo, que la célula sintetice un
péptido o una proteína que no se expresa de forma endógena en la
célula o en el preparado utilizados en el procedimiento. En este
contexto es especialmente preferente que el polinucleótido esté
contenido en un constructo de DNA recombinante. Por el concepto
"constructo de DNA (recombinante)" se entiende una molécula de
DNA producida in vitro.
Si en el procedimiento la célula se manipula por
ingeniería genética antes del paso a), es preferible cultivar la
célula después de la manipulación genética y antes del paso (a) bajo
condiciones que permitan una expresión, dado el caso bajo presión
de selección. Por "cultivar" se entiende mantener las células o
los tejidos en condiciones que aseguran la supervivencia de las
células o de su siguiente generación. Las condiciones deberían
elegirse de tal modo que permitan la expresión del material
introducido mediante manipulación por ingeniería genética. Para
ello, el pH, el contenido de oxígeno y la temperatura se deberían
mantener en niveles fisiológicos y se deberían añadir los
suficientes nutrientes y los cofactores necesarios. La presión de
selección permite cultivar únicamente aquellas células en las que
la manipulación por ingeniería genética ha tenido éxito como mínimo
en parte. Dentro de este concepto entra, por ejemplo, incorporar una
resistencia a los antibióticos a través del constructo de DNA.
En el procedimiento según la invención es
especialmente preferente que la célula utilizada sea una célula de
anfibio, bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero
inmortalizada o nativa. Como ejemplos se mencionan: como células de
anfibio, oocitos de Xenopus; como células bacterianas,
células de E. coli; como células de levadura,
Saccharomyces cerevisiae; como células de insecto, células de
Sf9; como células de mamífero inmortalizadas, células HeLa; y como
células de mamífero nativas, la célula CHO (Chinese Hamster
Ovary - ovario de hámster chino).
En un método de medida preferente para
determinar la unión de la sustancia a un péptido o proteína en el
procedimiento según la invención, la medida de la unión tiene lugar
a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido del
péptido o la proteína y/o a través de la actividad relacionada de
una sustancia de ensayo marcada. El ligando es una molécula que se
une al péptido o proteína con una alta especificidad y que es
desplazada del sitio de unión por una sustancia a ensayar, la cual
también se une al péptido o la proteína. Por "marcado" se ha
de entender una modificación artificial en la molécula que facilita
su detección. Los marcados son, por ejemplo, radiactivos,
fluorescentes o luminiscentes.
En otro método de medida preferente para
determinar la modificación de los parámetros funcionales provocada
por la unión de la sustancia al péptido o la proteína en el
procedimiento según la invención, la medida de como mínimo uno de
los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo
tiene lugar por la medida de la regulación, inhibición y/o
activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular
a través de la medida de la modificación de la expresión genética,
del medio iónico, del pH o del potencial de membrana, a través de
la modificación de la actividad enzimática o de la concentración del
2º mensajero. De este modo, por una parte se registra directamente
la medida del efecto de la sustancia por su influencia en los
receptores, canales iónicos y/o enzimas y, por otra parte, como
ejemplos a medir de forma preferente, parámetros variables como la
expresión genética, el medio iónico, el pH, el potencial de
membrana, la actividad enzimática o la concentración del 2º
mensajero. En este contexto, por "medio iónico" se entiende
principalmente la concentración de uno o más iones en un
compartimento celular, en particular el citosol; por "potencial de
membrana" se entiende la diferencia de carga entre los dos lados
de una biomembrana; y por "2º mensajero" se entienden
mensajeros de la vía de señales intracelular, como por ejemplo AMP
cíclico (cAMP), inositol-trifosfato (IP3) o
diacilglicerol (DAG).
En los pasos (a) y (b) del procedimiento, el
péptido o la proteína se seleccionan de entre los siguientes
grupos:
- -
- PIM2;
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 95%, preferentemente un 97%; o
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las figuras 35b), 35d) o 35f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 95%, preferentemente un 97%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c), 35e), o a su polinucleótido antisentido.
Aquí también está incluida la utilización de
péptidos y sobre todo proteínas de secuencia y función conocidas
sin que en el estado actual de la técnica se conocieran sus
funciones en el campo del dolor.
El concepto "hibridación" significa la
unión de dos moléculas de ácido nucleico de cadena simple, y el
lavado bajo condiciones estrictas ha de asegurar que sólo
permanezcan unidas las moléculas de ácido nucleico hibridadas a
través de un emparejamiento de bases exacto.
Preferentemente, el polinucleótido utilizado
según la invención consiste en RNA o DNA de cadena simple o doble,
en particular mRNA o cDNA.
Del mismo modo, el polinucleótido utilizado
consiste preferentemente en un polinucleótido antisentido o PNA que
presenta una secuencia que se puede unir específicamente a un
polinucleótido según la invención. PNA significa "peptidic
nucleic acid" (ácido nucleico peptídico), que porta pares de
bases pero cuyo esqueleto está unido peptídicamente. Un
polinucleótido antisentido presenta la sucesión de bases
complementaria como mínimo a una parte de un ácido nucleico base.
También es preferente que el polinucleótido utilizado forme parte de
una ribozima o de otra DNA-enzima o sea un RNA o
DNA catalítico. Por "ribozima" se ha de entender un ácido
ribonucleico catalíticamente activo, y por
"DNA-enzima" se ha de entender un ácido
desoxirribonucleico correspondiente, es decir RNA o DNA
catalítico.
También forma parte del objeto de la invención
la modificación postraduccional del péptido o la proteína
utilizados, en particular que éste/a haya sido glicosilado,
fosforilado, amidado, metilado, acetilado,
ADP-ribosilado, hidrolizado, provisto de una
membrana, segmentado o acortado. Por ejemplo, Voet/Voet,
Biochemistry, 1ª edición, 1990, pp. 935-938, da a
conocer modificaciones postraduccionales.
Un compuesto hallado mediante un procedimiento
según la invención es identificable como sustancia reguladora del
dolor. En este contexto, el término "compuesto" se refiere
sobre todo a principios activos de bajo peso molecular, pero
también a péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. El término
"identificable" significa que el compuesto presenta la
característica consistente en que, en lo que respecta a la unión en
el procedimiento de screening (rastreo) según la invención, se une
de forma claramente más intensa, preferentemente con el doble de
intensidad, que la media de las sustancias de ensayo, o que, en lo
que respecta a la variación de los parámetros funcionales, se
desvía claramente de la media de las sustancias de ensayo.
Otro objeto de la invención consiste en la
utilización de un péptido o de una proteína seleccionados de entre
uno de los siguientes grupos:
- -
- PIM2;
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las figuras 35b), 35d) o 35f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c), 35e), o a su polinucleótido antisentido,
en un procedimiento para descubrir sustancias
reguladoras del dolor.
En suma, una base importante de la invención
consiste en la identificación de genes y fragmentos de gen
reguladores del dolor. El procedimiento de screening (rastreo) se
basa en dicha identificación.
Las secuencias se aislaron de tejido de médula
espinal. En la médula espinal, las neuronas sensoriales primarias
se proyectan en neuronas del sistema nervioso central posteriores;
además de los procesos supraespinales, se trata de la sinapsis
central para la información nociceptiva. Numerosos experimentos han
demostrado que tras el desarrollo de estados de dolor crónicos
subyacen modificaciones plásticas del sistema nervioso (para una
idea general, véase Corderre y col., 1993; Zimmermann und Herdegen,
1996). En particular, se han descrito modificaciones plásticas en
las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal y de la médula
espinal, que van acompañadas de la regulación de genes relevantes
para el dolor. Por ejemplo se ha descrito una regulación de genes
en la médula espinal en relación con una serie de
neurotransmisores-receptores importantes para la
terapia del dolor (véase la Tabla 1). En base a esto, las secuencias
de cDNA reguladas por el dolor halladas se podrían utilizar para la
terapia (terapia genética, antisentido, ribozima) y la diagnosis de
estados de dolor crónicos.
En este caso se obtienen constructos derivados
de la secuencia de ácido nucleico de cDNA completo o de regiones
parciales y que pueden reducir el mRNA o la concentración de
proteínas. Estos constructos pueden consistir, por ejemplo, en
oligonucleótidos antisentido (DNA o RNA) que, dado el caso,
utilizando componentes de nucleótido modificados (por ejemplo
O-alil-ribosa), presentan una
estabilidad elevada frente a las nucleasas. También es concebible
la utilización de ribozimas que, como moléculas de RNA
enzimáticamente activas, catalicen una segmentación específica del
RNA. Además se podrían utilizar vectores que expresen las secuencias
utilizadas según la invención, o las regiones parciales de dichas
secuencias de nucleótidos, bajo el control de un promotor adecuado
y que, en consecuencia, sean adecuados para una terapia in
vivo o ex vivo. Adicionalmente, también son posibles
constructos antisentido que, por sustitución del esqueleto fosfato
de las secuencias de nucleótidos (por ejemplo PNAs, es decir,
ácidos nucleicos peptídicos) o utilizando bases no tradicionales
como inosina, queosina o wybutosina y también formas acetil, metil o
tio modificadas de adenina, citidina, guanosina o timidina y
similares, que no puedan ser descompuestas por nucleasas endógenas o
sólo puedan serlo en escasa medida.
Aquí están incluidas aquellas sustancias que al
unirse al producto genético modifican su función. Éstas pueden
ser:
- 1.2.1.
- Moléculas orgánico-químicas halladas en el marco de un screening (rastreo) de principios activos utilizando los productos genéticos de los cDNA según la invención como pareja de unión.
- 1.2.2.
- Anticuerpos, ya sean policlonales, quiméricos, de cadena simple, fragmentos F_{ab} o fragmentos de bancos de fagos, que influyen específicamente en la función de los productos genéticos, preferentemente como anticuerpos neutralizantes, a través de una unión.
- 1.2.3.
- Aptámeros, es decir, ácidos nucleicos o derivados de ácidos nucleicos con propiedades de unión a proteínas. También pertenecen a este grupo los llamados "especulómeros", que representan oligonucleótidos inversos, y por consiguiente estables, obtenidos mediante evolución especular, que se pueden unir con alta afinidad y alta especificidad a una molécula diana (Klussmann y col., 1996).
Las secuencias descritas se pueden utilizar para
la terapia de enfermedades neurológicas, en particular de estados
de dolor crónicos, empleándola, después de una clonación en los
vectores adecuados (por ejemplo en vectores de adenovirus o
asociados a adenovirus), para la terapia in vivo o ex
vivo con el fin de contrarrestar una sobreexpresión o
subexpresión del producto genético endógeno, corregir la secuencia
del producto genético defectuoso (por ejemplo por transegmentación
con el constructo exógeno) o poner a disposición un producto
genético funcional.
Algunas secuencias de polinucleótidos
(oligonucleótidos, moléculas de RNA y DNA antisentido, PNA)
derivadas de las secuencias de nucleótidos según la invención se
podrían utilizar para la diagnosis de estados o enfermedades
asociados con una expresión de dichas secuencias genéticas. Los
ejemplos de estos estados o enfermedades comprenden enfermedades
neurológicas, incluyendo dolores crónicos o dolores neuropáticos
(provocados por ejemplo por diabetes, cáncer o SIDA), o
enfermedades neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson, corea de
Huntington, Creutzfeld-Jacob, esclerosis lateral
amiotrófica y demencias. Las secuencias de nucleótidos pueden servir
de múltiples modos (Northern Blot, Southern Blot, análisis FISH,
análisis PRINS, PCR) bien para identificar el producto genético o
los productos genéticos anormales relevantes para la diagnosis, bien
para cuantificar el producto genético. Además del diagnóstico por
ácido nucleico, para la diagnosis también se pueden utilizar
anticuerpos o aptámeros contra la proteína codificada por los ácidos
nucleicos según la invención (por ejemplo mediante ELISA, RIA,
procedimientos inmunocitoquímicos o inmunohistoquímicos), con el fin
de identificar la proteína o sus formas anormales y para
cuantificar la proteína.
En lo que respecta a un diagnóstico genético, se
podrían utilizar sondas de ácido nucleico derivadas de las
secuencias de nucleótidos según la invención para determinar el
locus del gen (por ejemplo mediante FISH, FACS, cromosomas
artificiales como YAC, BAC o constructos P1).
Los siguientes Ejemplos y Figuras explican más
detalladamente la invención sin limitarla a los mismos.
Figura 1) Fragmento de gen 111_16 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) 1^{er} fragmento de gen prolongado
correspondiente, c) 2º fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 2) Fragmento de gen 111_33 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) nuevo fragmento de gen
correspondiente].
Figura 3) Fragmento de gen 111_39.
Figura 4) Fragmento de gen 111_45 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 5) Parte del fragmento de gen 113_15.
Figura 6) Parte del fragmento de gen 113_15.
Figura 7) Parte del fragmento de gen 113_15 [a)
fragmento de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 8) Fragmento de gen 113_20.
Figura 9) Fragmento de gen 124_29 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 10) Fragmento de gen 124_4.
Figura 11) Fragmento de gen 127_3.
Figura 12) Fragmento de gen 127_34 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) 1^{er} fragmento de gen prolongado
correspondiente, c) 2º fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 13) Fragmento de gen 127_8 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) secuencia de nucleótidos humana más
amplia correspondiente (RUP), c) parte corriente arriba de la
secuencia de nucleótidos de ratón correspondiente, d) parte
corriente abajo de la secuencia de nucleótidos de ratón
correspondiente, e) parte corriente arriba de la secuencia de
nucleótidos de rata correspondiente, f) parte corriente abajo de la
secuencia de nucleótidos de rata correspondiente].
Figura 14) Fragmento de gen 135_18.
Figura 15) Fragmento de gen 135_2.
Figura 16) Fragmento de gen 135_7.
Figura 17) Parte del fragmento de gen 135_9 [a)
fragmento de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 18) Parte del fragmento de gen 135_9 [a)
fragmento de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 19) Fragmento de gen 141_1.
Figura 20) Parte del fragmento de gen 141_13 [a)
fragmento de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) secuencia de nucleótidos humana más
amplia correspondiente (relacionada con ABLIM y KIAA 0843), c)
secuencia de nucleótidos de ratón correspondiente, d) secuencia de
nucleótidos de rata correspondiente].
Figura 21) Parte del fragmento de gen 141_13 [a)
fragmento de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 22) Fragmento de gen 141_24 [a) fragmento
de gen secuenciado originalmente a partir de
DDRT-PCR, b) fragmento de gen prolongado
correspondiente].
Figura 23) Fragmento de gen 141_6.
Figura 24) Fragmento de gen 146_10.
Figura 25) Fragmento de gen 154_26.
Figura 26) Fragmento de gen 154_29.
Figura 27) Fragmento de gen 164_12.
Figura 28) Parte del fragmento de gen
164_24.
Figura 29) Parte del fragmento de gen
164_24.
Figura 30) Parte del fragmento de gen
164_24.
Figura 31) Fragmento de gen 180_12.
Figura 32) Fragmento de gen 180_8.
Figura 33) Fragmento de gen 89_28.
Figura 34a) Secuencia de cDNA de JNK3, humano,
subtipo \alpha1; AN: U34820.
Figura 34b) Secuencia de aminoácidos de JNK3,
humano, subtipo \alpha1; AN: U34820.
Figura 34c) Secuencia de cDNA de JNK3, humano,
subtipo \alpha2; AN: U34819.
Figura 34d) Secuencia de aminoácidos de JNK3,
humano, subtipo \alpha1; AN: U34819.
Figura 34e) Secuencia de cDNA de JNK3, ratón;
AN: AB005665.
Figura 34f) Secuencia de aminoácidos de JNK3,
ratón; AN: AB005665.
Figura 34g) Secuencia de cDNA de JNK3, rata; AN:
NM_012806.
Figura 34h) Secuencia de aminoácidos de JNK3,
rata; AN: NM_012806.
Figura 35a) Secuencia de cDNA de
PIM-2, humano; clonación propia.
Figura 35b) Secuencia de aminoácidos de
PIM-2, humano; clonación propia.
Figura 35c) Secuencia de cDNA de
PIM-2, ratón; AN: L41495.
Figura 35d) Secuencia de aminoácidos de
PIM-2, ratón; AN: L41495 diferentes longitudes de
proteína:
- 1.)
- 40 kDa
- 2.)
- 37 kDa
- 3.)
- 34 kDa
Figura 35e) Secuencia de cDNA de
PIM-2, rata; clonación propia.
Figura 35f) Secuencia de aminoácidos de
PIM-2, rata; clonación propia.
Figura 35g) Comparación de la secuencia de
proteína del PIM-2 representado en 35b) con la
secuencia PIM-2 humana NM_006875 depositada en el
banco de datos genéticos.
Figura 36a) Secuencia de cDNA de LR11, ratón;
AN: AB015790.
Figura 36b) Secuencia de aminoácidos de LR11,
ratón; AN: AB015790.
Figura 36c) Secuencia de cDNA de LR11, humano;
AN: Y08110.
Figura 36d) Secuencia de aminoácidos de LR11,
humano; AN: Y08110.
Figura 37a) Secuencia de cDNA de TFIIF\beta,
rata; AN: D10665.
Figura 37b) Secuencia de aminoácidos de
TFIIF\beta, rata; AN: D10665.
Figura 37c) Secuencia de cDNA de TFIIF\beta,
humano; AN: X59745.
Figura 37d) Secuencia de aminoácidos de
TFIIF\beta, humano; AN: X59745.
Figura 38a) Secuencia de cDNA de GGT, rata; AN:
L24116.
Figura 38b) Secuencia de aminoácidos de GGT,
rata; AN: L24116.
Figura 38c) Secuencia de cDNA de GGT, humano;
AN: L25441.
Figura 38d) Secuencia de aminoácidos de GGT,
humano; AN: L25441.
Figura 39a) Secuencia de cDNA de GATA3, ratón;
AN: NM_008091.
Figura 39b) Secuencia de aminoácidos de GATA3,
ratón; AN: NM 008091.
Figura 39c) Secuencia de cDNA de GATA3, humano;
AN: NM_002051.
Figura 39d) Secuencia de aminoácidos de GATA3,
humano; AN: NM_002051.
Figura 39e) Secuencia de cDNA parcial de GATA3,
rata; AN: AB000217.
Figura 40a) Secuencia de cDNA de
CCL-7, humano; AN: AF224741.
Figura 40b) Secuencia de aminoácidos de
CCL-7, humano; AN: AF224741.
Figura 40c) Secuencia de cDNA de
CCL-7, rata; AN: Z67744.
Figura 40d) Secuencia de aminoácidos de
CCL-7, rata; AN: Z67744.
Figura 40e) Secuencia de DNA genómica de
CCL-7, ratón; AN: AH063101.
Figura 40f) Secuencia de aminoácidos de
CCL-7, ratón; AN: AH063101.
Figura 41a) Secuencia de cDNA de catalasa, rata;
AN: NM_012520.
Figura 41b) Secuencia de aminoácidos de
catalasa, rata; AN: NM_012520.
Figura 41c) Secuencia de cDNA de catalasa,
ratón; AN: NM_009804.
Figura 41d) Secuencia de aminoácidos de
catalasa, ratón; AN: NM_009804.
Figura 41e) Secuencia de cDNA de catalasa,
humano; AN: NM_001752.
Figura 41f) Secuencia de aminoácidos de
catalasa, humano; AN: NM_001752.
Figura 42a) Secuencia de cDNA de
caseina-quinasa 1a, rata; AN: U77582.
Figura 42b): Secuencia de aminoácidos de
caseina-quinasa 1\alpha, rata; AN:
AAB19227.
Figura 42e) Secuencia de cDNA de
caseina-quinasa 1\alpha, humano; AN:
NM_001892.
Figura 42f) Secuencia de aminoácidos de caseína
quinasa 1\alpha, humano; AN: NM_001892.
Figura 43c) Secuencia de cDNA de
tetraspanina-6, ratón; AN: AF053454.
Figura 43d) Secuencia de aminoácidos de
tetraspanina-6, ratón; AN: AAC69711.
Figura 43e) Secuencia de cDNA de tetraspanina
TM4-D, humano; AN: AF133426.
Figura 43f) Secuencia de aminoácidos de
tetraspanina TM4-D, humano; AN: AF133426.
Figura 44e) Secuencia de cDNA de
MAP3K7/TAK-1, humano; AN: NM_003188.
Figura 44f) Secuencia de aminoácidos de
MAP3K7/TAK-1, humano; AN: NM_003188.
Figura 45a) Secuencia de cDNA de
espermidina-sintasa, rata; AN: AF337636.
Figura 45b) Secuencia de aminoácidos de
espermidina-sintasa, rata; AN: AAK21288.
Figura 45c) Secuencia de cDNA de
espermidina-sintasa, ratón; AN: L19311.
Figura 45d) Secuencia de aminoácidos de
espermidina-sintasa, ratón; AN: AAC37666.
Figura 45e) Secuencia de cDNA de
espermidina-sintasa, humano; AN: XM_042276.
Figura 45f) Secuencia de aminoácidos de
espermidina-sintasa, humano; AN: XP_042276.
Figura 46e) Secuencia de cDNA de BAB14112,
humano; AN: AK022582.
Figura 46f) Secuencia de aminoácidos de
BAB14112, humano; AN: BAB14112.
Figura 47) Caseina-quinasa en
diferentes modelos de dolor.
Figura 48) Tetraspanina (TSPAN) en diferentes
modelos de dolor.
Figura 49) M3K7-quinasa en
diferentes modelos de dolor.
Figura 50) Sinopsis de la estrategia de
clonación general empleada.
Figura 51) Sinopsis de la regulación génica y de
los fragmentos de gen identificados.
Se eligió el siguiente procedimiento (para una
mayor claridad, véase la Figura 50):
Como punto de partida para el aislamiento de
genes reguladores del dolor se eligió el llamado modelo de formalina
en ratas, en el que se inyecta formalina en la pata de la rata. El
tejido diana en el que se demostró la expresión reguladora del
dolor de los genes según la invención consistía en la parte dorsal
de la médula espinal de la rata, segmentos L3-L6.
Existen cuatro métodos para aislar los genes regulados
diferenciales:
- \bullet
- cDNA-RDA (cDNA-representational difference analysis; Hubank & Schatz, 1994).
- \bullet
- DDRT-PCR (Differential Display RT-PCR; Liang & Pardee 1992, Bauer y col., 1994).
- \bullet
- Hibridación sustractiva (Watson & Margulies, 1993).
- \bullet
- SAGE (Serial Analysis of Gene Expression, Velculescu y col., 1995).
Una evaluación comparativa de los métodos
mencionados condujo a elegir DDRT-PCR, dado que este
método, a diferencia de la hibridación sustractiva y el SAGE, puede
registrar genes regulados tanto en sentido ascendente como en
sentido descendente y también transcripciones excepcionales, y
además proporciona muchos resultados en cortos períodos de
tiempo.
Método según Liang & Pardee (1992) / Patente
U.S. 5.262.311.
Modificaciones:
- 1.
- Cebador decámero según Bauer y col. 1993.
- 2.
- Mezclas de cebadores oligoDT según Sompayrac y col. 1995.
- 3.
- Electroforesis en gel TAE-poliacrilamida.
Modelo animal. La prueba de formalina
representa un modelo adecuado para el campo del dolor
inflamatorio/persistente (Duibisson y col., 1997). Aquí se
inyectaron 50 \mul de una solución de formalina al 5% en un latedo
de la pata trasera de ratas Wistar adultas y los animales fueron
sacrificados 24 horas después de la inyección para la toma de
muestras de tejido. Paralelamente, en la pata trasera de los
animales control se inyectó una solución isotónica salina.
Toma de muestras de tejido. Se decapitan
los animales, se extrae la columna vertebral y la médula espinal se
saca del conducto raquídeo por lavado con una inyección fuerte de
una solución de sal común isotónica helada. Después de retirar la
duramadre se recortó la mitad dorsal de la región L3 a L6 y se
congeló inmediatamente en nitrógeno líquido.
Aislamiento de RNA. El RNA total de las
muestras de tejido se aisló con el Trizol-Kit (Life
Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
RNA se cuantificó por espectrometría UV (extinción a 260 nm) y su
integridad se comprobó mediante elecroforesis desnaturalizante en un
gel de formaldehído-agarosa (Sambrook y col.,
1989).
Digestión por DNasa. Antes de la
utilización en la DDRT-PCR se eliminan las
eventuales trazas de DNA genómico mediante digestión con DNasa.
Aquí se incubaron en cada caso 6 \mug de RNA en un volumen total
de 100 \mul en 1X First-Strandbuffer (Life
Techn.) y 10 unidades de RDasaI libre de RNasa (Boehringer Mannheim)
durante 15 minutos a 37ºC. Después de extracción con
fenol-cloroformo, el RNA precipitó por adición a
1/10 vol. acetato de sodio pH 5,2 y 2,5 vol. etanol, se disolvió en
DEPC-agua, se cuantificó por espectrometría UV y se
caracterizó mediante una nueva electroforesis en gel de
formaldehído-agarosa.
Transcripción inversa. En cada caso, 200
ng de RNA digerido por DNasaI en primer lugar se desnaturalizaron
por incubación de 5 minutos a 70ºC con 2,5 \muM de una mezcla de
cebadores de oligoDT (3P1, 3P2 o 3P3), después se enfriaron
bruscamente sobre hielo y luego se incubó un volumen total de 20
\mul de una mezcla de reacción durante 60 minutos a 37ºC. La
mezcla de reacción contenía 1X First-Strandbuffer
(Life Techn.), 10 mM DTT, 18,75 \muM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20
unidades de RNasin (firma Promega) y 200 unidades de transcriptasa
inversa Superscript II RNasaH^{-} (Life Techn.). A continuación,
la enzima se inactivó por 5 minutos de calentamiento a 99ºC y la
carga de cDNA se guardó a -20ºC.
DDRT-PCR. En cada caso, 2
\mul de los cDNA se sometieron a la reacción en cadena de
polimerasa (PCR) en un volumen de 20 \mul. La mezcla de reacción
contenía 1X tampón PCRII (firma Perkin-Elmer), 2,5
mM MgCl_{2}, 2 \muM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0,2 \muM cebador
de decámero (Deca1-26), 0,8 \muM mezcla de
cebadores de oligoDT (3P1, 3P2 o 3P3) y 2 \muCi
[\alpha-^{33}P]dATP (\geq 2.000
mCi/mmol, firma Amersham). Las cargas de PCR se sometieron a un
PTC200-Thermocycler (firma MJ Research) con el
siguiente perfil de temperaturas: 3 minutos a 94ºC; 40 ciclos de 15
segundos a 94ºC, 1 minuto a 40ºC, calentamiento a 72ºC en un plazo
de 70 segundos, 30 segundos a 72ºC; 10 minutos a 72ºC y parada a
4ºC.
Electroforesis en gel y evaluación. Las
muestras de PCR se concentraron en vacío hasta sequedad, se
disolvieron en 4 \mul de tampón de muestra (0,25% azul de
bromofenol, 0,25% xilencianol FF, 30% glicerina), y 2 \mul de cada
una de ellas se separaron por electroforesis en un gel de
tris-taurina-EDTA-poliacrilamida
al 6% (Multiphor-System, firma Promega) durante 2,5
horas a 50 vatios. A continuación, el gel se secó durante una hora a
80ºC y se expuso a lo largo de la noche a un
BASIII-Detectionsscreen (firma Fuji). Para la
evaluación se empleó el
STORM-Phosphor-Imager (firma
Molecular Dynamics) utilizando el software ImageQuant. Los
datos de autorradiografía se imprimieron sobre láminas a la misma
escala, que después se utilizaron para recortar los fragmentos.
Reamplificación de los fragmentos de
DDRT-PCR. Las bandas de PCR reguladas
diferenciales se recortaron del gel con un escalpelo y se eluyeron
de la pieza de gel por 10 minutos de cocción en 100 \mul de agua
bidestilada. Después, 25 \mul de este material se amplificaron de
nuevo mediante PCR en un volumen total de 50 \mul. La mezcla de
reacción PCR contenía 1 X PCR-PufferII (firma
Perkin-Elmer); 1,5 mM MgCl_{2}; 50 \muM dATP,
dCTP, dGTP, dTTP; 0,2 \muM del decámero correspondiente; 1 \muM
de mezcla de cebadores oligoDT 1PX y 2,5 \mul de unidades
Ampli-TAQ-DNA-Polymerase
(Perkin-Elmer). El perfil de temperaturas de PCR
correspondía a la reacción PCR original (véase más arriba). A
continuación, las cargas de PCR se mezclaron con 10 \mul de tampón
de muestra (0,25% azul de bromofenol, 0,25% xilencianol FF, 30%
glicerina) y se separaron por electroforesis en un gel de
TAE-agarosa al 3% con 10 \mug/ml de bromuro de
etidio. Después se recortaron del gel productos de PCR del tamaño
previsto.
Clonación en vectores de clonación TA.
Los fragmentos recortados se purificaron con un
Qiaquick-Gel-Extraktionskit (firma
Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se
concentraron hasta sequedad y se recogieron en 5 \mul de agua
bidestilada. A continuación se ligaron en el vector
pCRII-TOPO mediante un TOPO TA Cloning Kit (firma
Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se
transformaron en células de TOP10F’-E. coli. La carga de
transformación se distribuyó sobre placas LB-agar
con 100 \mug/ml de ampicilina, que previamente habían sido
tratadas con 50 \mul de X-Gal al 2% (firma Sigma)
y 50 \mul de isopropiltiogalactósido (firma Sigma). Los clones
bacterianos blancos obtenidos después de 15 horas de incubación a
37ºC se trasladaron a 5 ml de medio líquido LB con 100 \mug/ml de
ampicilina (100 \mug/ml) y se incubaron durante la noche a 37ºC
bajo agitación. A partir de estos cultivos se aisló DNA de plásmido
utilizando el
Qiagen-Spin-Miniprep-Kit
(firma Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y en
cada caso se caracterizaron 5 \mul del DNA de plásmido mediante
digestión de restricción EcoRI y electroforesis subsiguiente en gel
de TAE-agarosa.
Análisis de secuencias. Aquí se
secuenciaron en cada caso 500 ng del DNA de plásmido con el cebador
T7-PCR utilizando el Dye Terminator Cycle
Sequencing Kit (firma Perkin-Elmer) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y las reacciones se analizaron en
un Sequencer ABI 370 automático (firma Applied Biosystems Inc.).
Las secuencias de DNA se compararon con los bancos de datos
genéticos utilizando el software bioSCOUT (firma LION,
Heidelberg).
Confirmación de la regulación diferencial de
las secuencias de cDNA clonadas. Aquí se utilizó la técnica del
llamado Northern inverso, en la que los fragmentos de cDNA se
unieron a filtros de réplica después de amplificación por PCR y se
hibridaron con cDNA marcado radiactivo de médula espinal control
frente a médula espinal con formalina.
Amplificación por PCR de los fragmentos de
cDNA clonados. En cada caso 50-100 ng de los DNA
de plásmido se sometieron a la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) en un volumen de 100 \mul. La mezcla de reacción contenía
1X tampón PCRII (firma Perkin-Elmer); 1,25 mM
MgCl_{2}; 10% DMSO; 250 \muM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 0,8 \muM
de cebador T7-PCR, 0,8 \muM de cebador
M13R-PCR y 5 unidades de
Ampli-TAQ-DNA-Polymerase
(firma Perkin-Elmer). Las cargas de PCR se
sometieron al siguiente perfil de temperaturas en un
PTC200-Thermocycler (firma MJ Research): 3 minutos
a 94ºC; 40 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 15 segundos a 55ºC, 30
segundos a 72ºC; 10 minutos a 72ºC y parada a 4ºC. Una parte
alícuota de 5 \mul se separó en un gel de
TAE-agarosa al 3% y, una vez concluida la reacción
PCR con éxito, las cargas de PCR se purificaron mediante el
Quiaquick PCR-Purification-Kit
(firma Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se
cuantificaron por espectrometría UV.
Preparación de los filtros de DNA
slot-blot (autorradiograma de ranura). En
primer lugar, los filtros HybondN se bañaron durante 10 minutos en
6 X tampón SSC y se tensaron en el aparato de
slot-blot (firma Schleicher und Schüll). En
cada caso, 1 \mug de los fragmentos de DNA se diluyó en 6 X tampón
SSC, se desnaturalizó por 10 minutos de cocción y enfriamiento
brusco subsiguiente sobre hielo y se absorbió en los filtros. A
continuación, los filtros se lavaron durante 10 minutos en una
solución 1,5M NaCl/0,5M NaOH y 10 minutos en 1M NaCl/0,5M
Tris-HCl pH = 7,0, se secaron durante 30 minutos a
temperatura ambiente y se unieron a los filtros mediante 5 minutos
de irradiación UV (302 nm, transiluminador).
Producción del RNA amplificado
(modificada según Poirier y col., 1997 & Superscript Choice
System - firma Life Techn.). Cinco \mug de RNA total se
desnaturalizaron con 100 ng de cebador T7(dT)15 en un
volumen de 11 \mul durante 5 minutos a 70ºC y se enfriaron
bruscamente sobre hielo. El RNA desnaturalizado se incubó después
durante 1 hora a 42ºC en un volumen total de 20 \mul con 1 x
First-Strandbuffer (Life Techn.), 10 mM Dtt, 500
\muM dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 400 unidades de transcriptasa
inversa SuperscriptII (Life Techn.), y se enfrió a 4ºC. Para la
síntesis de cadena doble se añadieron: 91 \mul
DEPC-H_{2}O, 30 \mul de
2nd-Strandbuffer (Life Tech.), 3 \mul de 10 mM
dNTP (Boheringer Mannheim), 1 \mul de DNA-ligasa
de E. coli (10 U/\mul; Life Tech.), 4 \mul
DNA-polimerasa I de E. coli (10 U/\mul;
Life Tech.), 1 \mul Rnase H (2 U/\mul; Life Tech.). La carga se
incubó después durante 2 horas a 16ºC y, después de añadir 2 \mul
de DNA-polimerasa T4 (5 U/\mul; Life Tech.), se
incubó durante otros 5 minutos a 16ºC. La inactivación se realizó
por adición de 10 \mul de EDTA 0,5M y 10 minutos de calentamiento
a 65ºC. Después de extracción con fenol-cloroformo y
precipitación con 70 \mul de NH_{4}OAc 7,5M y 500 \mul de
etanol al 100%, enfriado a -20ºC, el precipitado se separó por
centrifugación (5 minutos 14.000 g, Tamb), se lavó con 1 ml de
etanol al 70%, se disolvió en 50 \mul de
DEPC-H_{2}O y se desalificó a través de una
columna Sephacryl S200 (Microspin; firma Pharmacia). Se cuantificó
una parte alícuota (2 \mul) por espectrometría UV. A partir de
este cDNA de cadena doble se produjo RNA mediante transcripción
in vitro. Para ello, 50 \mul de cDNA (5-10
\mug) se incubaron durante 3-4 horas a 37ºC en un
volumen total de 100 \mul con 1 x tampón de transcripción (firma
Promega), 7,5 mM rNTPs, 10 \mul de mezcla T7
RNA-polimerasa (Ribomax-Kit; firma
Promega), y después se enfriaron a 4ºC. Después de añadir 3 \mul
de RQ1-DNasa (libre de Rnasa; firma Promega), la
carga se incubó durante 15 minutos a 37ºC. Después de extracción
con fenol-cloroformo y desalificación a través de
una columna Sephacryl S200 (Microspin; firma Pharmacia), se midió
una parte alícuota (2 \mul) por espectrometría UV.
Preparación de la sonda de cDNA
radiactiva. En cada caso, 2 \mug del RNA amplificado se
desnaturalizaron con 0,8 \mul de mezcla de cebadores de hexámero
(= 750 ng; firma Boehringer Mannheim) por 5 minutos de calentamiento
a 70ºC y enfriamiento brusco subsiguiente sobre hielo, y se
sometieron a transcripción inversa en un volumen total de 25 \mul
añadiendo 2,5 \mul de tampón de PCR (Life Tech.); 2,5 \mul de
MgCl_{2} 25 mM, 2,5 \mul de DTT 0,1M; 1 \mul de
dATP/dTTP/dGTP 20 mM; 1 \mul de dCTP 120 \muM y 5 \mul de
[\alpha-^{32}P]dCTP. Después de 5 minutos
de incubación a temperatura ambiente se añadieron 2 \mul de
transcriptasa inversa SupercriptII (200 U/\mul, firma Life Tech.)
y la mezcla se incubó durante 10 minutos a 25ºC y a continuación
durante 50 minutos a 42ºC. Después de inactivación por calor (15
minutos 70ºC), la muestra se rellenó hasta 50 \mul con
DEPC-agua y la radiactividad no incorporada se
eliminó en una columna Sephacryl S200 (Microspin; firma Pharmacia).
La actividad de 0,5 \mul en cada caso de los eluatos se determinó
en un \beta-Counter (firma LKB) a través de
dispersión Tscherenkow. El RNA del resto de la carga se hidrolizó
por adición a 6 \mul de una solución de NaOH 1M/EDTA 10 mM y 20
minutos de incubación a 68ºC, después se neutralizó por adición a
60 \mul de tampón de fosfato 1M pH = 7,0 y se añadió a los
filtros de réplica prehibridados correspondientes.
Prehibridación, hibridación, lavado y
evaluación de los filtros. Los filtros se incuban durante 20
minutos a 68ºC en matraces de hibridación con 10 ml de solución
Expresshyb (firma Clontech) y 100 \mug/ml de
DNA-SalmonSperm desnaturalizado con calor (firma
Sigma). Después de verter la mezcla de prehibridación y añadir 5 ml
de la misma solución a 68ºC, se añade con pipeta la sonda de cDNA
radiactiva arriba descrita y los filtros se incuban a lo largo de
la noche a 68ºC en el horno tubular giratorio. Después siguen varios
pasos de lavado con 0,2 X SSC/0,1% SDS durante 10 minutos a
temperatura ambiente; 0,2 X SSC/0,1% SDS durante 15 minutos a 42ºC y
por último 0,2 X SSC/0,1% SDS durante 15 minutos a 65ºC. Los
filtros se plastifican en húmedo y se exponen a una
BASII-Detektionsscreen (firma Fuji). Para la
evaluación se emplea el
STORM-Phosphor-Imager (firma
Molecular Dynamics) utilizando el software ImageQuant.
Utilizando este método (véase la Figura 50) se
clonaron 35 genes reguladores del dolor (véase la Tabla 3 y la
Figura 51) primero como secuencia parcial y, en el curso posterior
del proceso de trabajo, en parte como secuencia prolongada.
Partiendo del modelo animal seleccionado, con la
estrategia de clonación aplicada se clonaron secuencias de cDNA de
rata.
En total, a partir de la médula espinal de rata
se clonaron 27 secuencias de cDNA o fragmentos de gen no
clasificados y desconocidos hasta ahora en el estado actual de la
técnica y 8 secuencias de cDNA o fragmentos de gen conocidos, cuya
expresión está regulada por condiciones de dolor crónico (véase la
Tabla 4 - fragmentos de gen desconocidos y no clasificados - y la
Tabla 5 - cDNA conocidos). En el estado actual de la técnica no se
sabe nada sobre la función de las 27 secuencias de cDNA
desconocidas y no asignadas, o en algunos casos se ha sabido algo
después de realizar un análisis más profundo. Nuestras
investigaciones prueban la existencia de una función en casos de
dolor. Sin embargo, el análisis del patrón de expresión en
diferentes tejidos de rata mostró una focalización en tejido
neuronal con 4 cDNAs (111.39, 111.45, 141.13, 154.29; véase la Tabla
5). Por consiguiente, estos cDNAs son especialmente interesantes
para el desarrollo de nuevos materiales de diagnosis y terapia para
el dolor crónico. La función de los nuevos cDNAs se puede investigar
más a fondo mediante los experimentos con oligos antisentido o
ribozimas.
El fragmento de gen 141-13
resulta especialmente interesante. El análisis de la prolongación
del fragmento de gen mostrada en las Figuras 20 y 21 ha demostrado
que se trata de un nuevo gen homólogo a UNC-115 y
otros miembros de la familia abLIM, pero desconocido hasta la
fecha. Por consiguiente, junto con el patrón de expresión y
teniendo en cuenta la importante función de UNC-115
en el desarrollo neuronal, este gen o fragmento de gen es
especialmente interesante.
También es interesante el fragmento de gen
127-8, ya que éste presenta una gran homología con
respecto a una parte del genoma humano con una expresión
notoriamente fuerte (AN: NT_009379.1 en el cromosoma 11q13).
Las funciones de los 8 cDNAs conocidos también
son conocidas en principio:
cDNAs con expresión intensificada en caso de
dolor:
- \bullet
- Geranil-geranil-transferasa
- \bullet
- Catalasa
- \bullet
- Factor de transcripción TFIIF\beta
- \bullet
- Factor de transcripción GATA-3
- \bullet
- Receptor LR-11 tipo LDL
- \bullet
- Canal de Cl^{-} ClC7
\vskip1.000000\baselineskip
cDNAs con expresión reducida en caso de
dolor:
- \bullet
- MAP-quinasa/JNK3/SAPK\beta
- \bullet
- PIM-2-quinasa
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de los cDNAs hallados mediante el
análisis más preciso de los fragmentos de gen (GF) se trata de
- GF111.33 = espermidina-sintasa
- (regulada en sentido ascendente),
- GF124-29 = MAPK3/TAK-1
- (regulada en sentido descendente),
- GF127-34 = BAB14112
- (regulada en sentido descendente),
- GF135-7 = Caseina-quinasa 1a
- (regulada en sentido descendente) y
- GF164-24 = Tetraspanina (TM4-D/TSPAN-6)
- (regulada en sentido descendente).
En este contexto se ha de destacar especialmente
la PIM-2 quinasa. En el caso de otros isotipos de
esta enzima, PIM-1 y PIM-3, se ha
podido demostrar que estas quinasas de señalización intervienen en
los procesos de aprendizaje y memoria en el hipocampo (Konietzko y
col. (1999) EMBO J., 18: 3359-3369).
En el marco de la invención se ha aislado y
caracterizado una secuencia de ácido nucleico que codifica la
proteína PIM-2 completa de rata (Figura 35e, 35f).
Hasta la fecha no se conoce la secuencia de ácido nucleico ni la
secuencia de proteína de Pim-2 de rata. Además se ha
aislado un cDNA completo, es decir que incluye toda la región
codificadora, que codifica el Pim-2 humano (35 a,
b). Una comparación de secuencias con la secuencia
PIM-2 humana publicada (nº acc. U77735) dió como
resultado las siguientes diferencias:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Entre estas diferencias, la deleción de un
nucleótido encontrada en la posición 1064 es funcionalmente
importante, dado que conduce a una modificación del marco de
lectura y, en consecuencia, produce una proteína con una secuencia
C-terminal completamente diferente, que se
representa a continuación.
Comparación de los extremos
C-terminales de las dos proteínas
PIM-2 deducidas (la Figura 35g muestra la
comparación completa).
- hPIM-2 (nº acc. U77735) TPQPLQRRPCPFGLULATLSLAWPGLAPNGQKSHPNAMSQG
- hPIM-2 (Figura 25 de patente) PLNPSKGGPAPLAWSLLP
Otro ejemplo consiste en la catalasa, que
elimina el H_{2}O_{2} nocivo para la célula mediante su
transformación en O_{2} y H_{2}O.
La proteína quinasa JNK-3 se
expresa específicamente en células nerviosas del sistema nervioso
central (Mohit y col., 1995) y, en relación con una serie de
receptores opiáceos (por ejemplo el receptor
opiáceo-\mu y ORL-1), se ha
descrito la activación posterior de
proteína-quinasas de esta familia de las
proteína-quinasas activadas por mitógeno (Li &
Chang, 1996; Hawes y col., 1998).
La proteína LR11 es una proteína mosaico de la
familia "low density lipoprotein receptor (LDLR)" (receptor de
lipoproteína de baja densidad) (Möwald y col., 1997). La expresión
más intensa de LR11-mRNA se ha podido detectar en
el cerebro, y además está regulada en función del desarrollo de tal
modo que sugiere una función en la sinaptogénesis o en el
crecimiento de los axones (Hermann-Borgmeyer y col.,
1998).
Datos de secuencia de los clones
regulados. La siguiente tabla permite asignar las figuras a los
clones de cDNA/fragmentos de gen enumerados en la misma.
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Ejemplo
2a
Ciertas ratas se sometieron a diferentes modelos
de dolor y un tiempo después de la provocación del dolor se tomaron
secciones de médula espinal. Después se analizó la expresión del gen
o del fragmento de gen correspondiente mediante hibridación in
situ con sondas de DNA o con anticuerpos específicos, y se
comparó con animales control.
Los modelos consistían en artritis inducida por
CFA (CFA), artritis inducida por colágeno (CIA) y la prueba de
formalina (formalina), véase D. Dubuisson, S.G. Dennis, Pain 4, 161
- 174 (1977).
La Tabla 5a muestra los resultados.
Ejemplo
2b
Mediante RT-PCR (véase más
arriba) se investigó el alcance de la expresión de acuerdo con
diferentes modelos de dolor en ratas en comparación con controles.
Los resultados se muestran en las Figuras 47, 48 y 49,
correspondiendo las barras claras a los animales control y las
barras oscuras a los animales tratados. El eje Y corresponde a
unidades relativas (nivel de expresión normalizado).
Ejemplo
2c
La clonación de las secuencias de cDNA de rata
completas se realiza mediante screening de bancos de cDNA o métodos
dependientes de PCR.
Los bancos de cDNA se obtuvieron con RNA de un
tejido que expresa el mRNA del gen buscado. Como sondas se utilizan
moléculas de RNA o DNA de cadena simple o doble que están marcadas
de forma radiactiva (por ejemplo con [\alpha^{32}P]dCTP)
o de forma no radiactiva (por ejemplo con UTP marcada con
digoxigenina). El banco de cDNA presente en bacterias o fagos se
aplica sobre placas de agar, después de transferirlo a membranas de
filtro adecuadas se hibrida con las sondas de ácido nucleico y se
detecta mediante un procedimiento de lavado estricto. Los clones de
cDNA identificados mediante este procedimiento se aíslan y se
analizan por secuenciación (véase Sambrooks y col., 1989; Ausubel y
col., 1990).
En los métodos dependientes de PCR, partiendo de
las secuencias de cDNA reguladas se determinan y sintetizan
cebadores de oligonucleótido en orientación sentido o antisentido.
En el procedimiento habitual 5’-RACE (Rapid Amplification of
5-cDNA Ends - amplificación rápida de extremos 5’ de
cDNA), el cebador con orientación antisentido se utiliza para la
síntesis de cDNA. El cDNA de cadena simple formado se prolonga
después mediante ligación de un oligonucleótido con
RNA-ligasa o reacción de tailing (adición de
cola) con transferasa terminal y se somete a una reacción PCR con
otro cebador dispuesto más adentro (denominado anidado) y un cebador
específico de cola. Los productos amplificados por PCR se clonan y
se analizan por secuenciación. Una modificación de este método
aprovecha el efecto de la llamada PCR de supresión para, partiendo
de un molde de cDNA, prolongar la secuencia de cDNA tanto en la
dirección 5’ como en la dirección 3’ (Marathon cDNA Amplification
Kit, firma Clontech). En este caso se elabora un cDNA de cadena
doble partiendo de RNA de médula espinal de rata, y se liga con
engarces especialmente modificados. Este cDNA se amplifica después
mediante PCR con un cebador específico del gen y un cebador
específico del engarce, y los productos de amplificación se clonan y
secuencian.
Las secuencias de cDNA humanas homólogas se
aíslan mediante una modificación de los métodos arriba mencionados.
En el rastreo convencional de bancos de cDNA se utilizan bancos de
origen humano y la hibridación se realiza bajo condiciones menos
estrictas para registrar también clones de cDNA de menor
homología.
En las estrategias dependientes de PCR, primero
se intenta amplificar un cDNA humano con numerosos cebadores
diferentes, preferentemente procedentes de la región codificadora.
Si ello no es posible, se pueden utilizar cebadores de PCR
degenerados o se eligen condiciones de PCR menos estrictas.
Una sección de ácido nucleico codificadora del
canal de cloruro CLC-7 se clona en un vector de
expresión que permite una expresión constitutiva (por ejemplo
promotor CMV) o una expresión inducible en células eucarióticas. El
DNA se introduce en células eucarióticas (por ejemplo células CHO,
células HEK293 o células NIH-3T3) con
procedimientos de transfección adecuados, por ejemplo con
lipofectamina (firma Roche Diagnostics). Las células se cultivan en
presencia de un reactivo de selección (por ejemplo zeocina,
higromicina o neomicina) de modo que sólo sobreviven las células
que han absorbido el constructo de DNA y que, en caso de una
selección más duradera, también lo han incorporado en el
genoma.
A partir de estas células se obtienen fracciones
de membrana que contienen una mayor cantidad de canal
CLC-7 y pueden ser utilizadas para un ensayo de
unión. Éste consiste en 1.) las membranas que contienen
CLC-7; 2.) un ligando marcado de forma radiactiva
(por ejemplo ácido
4,4’-diisotiocianoestilben-2,2’-disulfónico (DIDS)
marcado con tritio o ácido
4-acetamido-4’-isotiocianatoestilbeno-2,2’-disulfónico
(SITS) marcado con [^{3}H]); 3.) un tampón de unión (por ejemplo
50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA) y los ligandos analizados en cuanto a
la unión. En investigaciones funcionales en oocitos que expresan
CLC-7, las sustancias SITS y DIDS pudieron inhibir
corrientes de cloruro mediadas por CLC-7 (resultados
no publicados, Fr. Dr. Diewald, Universidad Mainz). Después de la
incubación de las mezclas de reacción arriba mencionadas (por
ejemplo durante 30-60 minutos) a una temperatura
adecuada (en la mayoría de los casos temperatura ambiente), las
moléculas de ligando radiactivas no unidas se separan por
filtración. La cantidad restante de [^{3}H]-DIDS o
[^{3}H]-SITS unido se mide en un
\beta-counter (por ejemplo Trilux, firma Wallac)
después de añadir un cóctel de escintilación. Si la sustancia de
ensayo presenta una unión con el canal CLC-7, éste
se detecta como incorporación radiactiva reducida. Este
procedimiento se miniaturiza adecuadamente de tal modo que se pueda
llevar a cabo en microplacas tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos)
para realizarlo en un robot por el lamado procedimiento
"hightroughput screening" (HTS) (rastreo de alto
rendimiento).
Una sección de ácido nucleico que codifica la
proteína quinasa PIM-2 se clona en un vector de
expresión que permite una expresión inducible en procariotas, por
ejemplo E. coli. La sección de ácido nucleico se modifica de
tal modo que es expresada como proteína de fusión con una secuencia
de aminoácidos N-terminal o
C-terminal adicional. Esta secuencia debería
permitir, sin modificación de la función de quinasa
PIM-2, una purificación a través de un
procedimiento específico, por ejemplo fragmento de glutatión
S-transferasa, que permite el aislamiento a partir
de la mezcla de proteínas mediante unión al glutatión. Después de la
transfección de las bacterias, la inducción del gen (por ejemplo
con IPTG en el promotor lac) y la desintegración de las bacterias,
las proteínas de fusión se purifican y se utilizan en un experimento
de quinasa in vitro. Para ello, 5 \mug de proteína se
tratan a 30ºC durante 30 minutos en 50 \mul de tampón de quinasa
(20 mM PIPES, pH 7,0, 5 mM MnCl_{2}, 7 mM
\beta-mercaptoetanol, 0,4 mM espermina, 10 mM
rATP) completados con 10 \muCi
[\gamma^{32}P]-ATP. Como sustrato se añade
proteína histona H1 purificada (firma Sigma) o proteína de fusión
GST-NFATc1 expresada de forma bacteriana. Después
del tiempo de incubación, el [\gamma^{32}P]-ATP
no incorporado se separa por filtración y la cantidad de
^{32}fosfato incorporado se determina mediante escintilación
\beta (Trilux, firma Wallac). En un experimento para descubrir
nuevos inhibidores de quinasa-PIM-2,
las sustancias de ensayo se incuban conjuntamente en esta carga y
se utiliza la disminución de la incorporación de ^{32}P como
indicador de un inhibidor. Este procedimiento se miniaturiza
adecuadamente de tal modo que se pueda llevar a cabo en microplacas
tituladas (96, 384 o 1.536 pocillos) para realizarlo en un robot por
el llamado procedimiento "hightroughput screening" (HTS).
Las pastillas se pueden producir mediante
compresión directa de mezclas del principio activo según la
invención con los materiales auxiliares correspondientes, o
mediante la compresión de granulados que contienen el principio
activo (en caso dado con otros materiales auxiliares). Los
granulados se pueden producir bien por granulación en húmedo, por
ejemplo con líquidos de granulación acuosos, y secado subsiguiente,
o bien por granulación en seco, por ejemplo mediante
compactación.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo por pastilla: | 25 mg | Principio activo según la invención |
271 mg | \begin{minipage}[t]{93mm} LudipressTM (granulado para la producción directa de pastillas a partir de monohidrato de lactosa , povidona K30 y crospovidona)\end{minipage} | |
4 mg | Estearato de magnesio | |
300 mg | Total |
Se prepara una mezcla homogénea del principio
activo con los materiales auxiliares y ésta se comprime en una
prensa para obtener pastillas con un \diameter de 10 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo por pastilla: | 25 mg | Principio activo según la invención |
166 mg | Celulosa microcristalina | |
80 mg | Hidroxipropilcelulosa de baja sustitución (I-HPC LH 11^{TM}) | |
5 mg | Dióxido de silicio altamente disperso | |
4 mg | Estearato de magnesio | |
280 mg | Total |
Se prepara una mezcla homogénea del principio
activo con la celulosa microcristalina y la I-HPC y
se compacta. Después de tamizar los productos de compresión, el
granulado formado se mezcla con estearato de magnesio y dióxido de
silicio y se comprime en una prensa para obtener pastillas con un
\diameter de 9 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo por pastilla: | 25 mg | Principio activo según la invención |
205 mg | Celulosa microcristalina | |
6 mg | Povidona K30 | |
10 mg | Crospovidona | |
4 mg | Estearato de magnesio | |
250 mg | Total |
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una mezcla homogénea del principio
activo con la celulosa microcristalina y la crospovidona y se
granula en un granulador con una solución acuosa de povidona. A
continuación, el granulado húmedo se vuelve a someter a granulación
y después de secado se somete a un secado adicional en un armario de
secado (50ºC) durante 10 horas. El granulado seco se tamiza junto
con el estearato de magnesio, se somete a mezcla final y se
comprime en una prensa para obtener pastillas con un \diameter de
8 mm.
1 g de un principio activo según la invención se
disuelve a temperatura ambiente en 1 l de agua para inyección y a
continuación se ajusta a condiciones isotónicas mediante adición de
NaCl (cloruro de sodio).
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\newpage
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<210> 3
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<211> 1063
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 840
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 716
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 1540
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 2025
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\newpage
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 2392
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\newpage
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 1721
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 1009
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 10
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<211> 1793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
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<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 69
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<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6648
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<212> DNA
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<213> Mus musculus
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<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
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<211> 2215
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 71
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<210> 72
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<211> 6840
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 72
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
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<211> 2214
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 73
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
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<211> 1039
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
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<211> 249
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 750
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 76
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<210> 77
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<211> 249
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 77
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<210> 78
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<211> 1568
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 78
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
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<211> 377
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 79
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
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<211> 1969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
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<210> 81
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<211> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2056
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
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<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
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<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 664
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
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<211> 805
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1761
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 337
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1058
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1096
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2769
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 730
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
Claims (10)
1. Procedimiento para descubrir sustancias
reguladoras del dolor, es decir, sustancias que influyen directa o
indirectamente en la percepción del dolor, que incluye los
siguientes pasos:
- (a)
- incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con una célula y/o un preparado celular que tiene sintetizado un péptido o una proteína seleccionado entre el siguiente grupo:
- -
- PIM-2;
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 35b), 35d), 35f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido;
- (b)
- medida de la unión de la sustancia de ensayo al péptido o proteína sintetizado por la célula, o medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales modificados por la unión de la sustancia de ensayo al péptido o a la proteína, a través de la medida de la regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales iónicos y/o enzimas, en particular a través de la medida de la modificación de la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, mediante modificación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero, o medida de la unión a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido del péptido o de la proteína y/o a través de la actividad relacionada de una sustancia de ensayo marcada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la célula se manipula por ingeniería
genética antes del paso (a).
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la manipulación por ingeniería genética
permite la medida de como mínimo uno de los parámetros funcionales
modificados por la sustancia de ensayo.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque mediante la manipulación por ingeniería
genética se expresa una forma de una proteína G no expresada de modo
endógeno o se introduce un gen indicador.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la
célula se manipula por ingeniería genética de tal modo que contiene
como mínimo un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o
35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el polinucleótido está contenido en un
constructo de DNA recombinante.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la célula,
después de la manipulación por ingeniería genética según la
reivindicación 2 y antes del paso (a) según la reivindicación 1, se
cultiva bajo condiciones que permiten una expresión, dado el caso
bajo presión de selección.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula es una
célula de anfibio, una célula bacteriana, una célula de levadura,
una célula de insecto o una célula de mamífero inmortalizada o
nativa.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el
péptido o la proteína de los pasos (a) y (b) se selecciona entre los
siguientes grupos:
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo en 95%, preferentemente un 97%; o
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 35b), 35d) o 35f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 97%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido.
10. Utilización de un péptido o de una proteína
seleccionados entre uno de los siguientes grupos:
- -
- PIM-2;
- -
- un péptido o proteína codificado, o codificado en parte, por un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o un polinucleótido similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- un péptido o proteína con una secuencia de aminoácidos según una de las Figuras 35b), 35d) o 35f) o 46f), o un péptido o proteína similar a éstos en como mínimo un 90%;
- -
- y/o una proteína codificada por un ácido nucleico que se une bajo condiciones estrictas a un polinucleótido según una de las Figuras 35a), 35c) o 35e), o a su polinucleótido antisentido,
en un procedimiento para descubrir
sustancias reguladoras del dolor, es decir, sustancias que influyen
directa o indirectamente en la percepción del
dolor.
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