ES2274863T3 - Celulas bacterinas del acido lactico que contienen porfirina y uso de las mismas. - Google Patents

Celulas bacterinas del acido lactico que contienen porfirina y uso de las mismas. Download PDF

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Abstract

Una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina, donde la célula contiene al menos 0, 1 ppm sobre una base de sustancia seca de citocromo d.

Description

Células bacterianas del ácido láctico que contienen porfirina y uso de las mismas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico y, en particular, a células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo y que contienen un compuesto de porfirina. De manera más específica, la invención proporciona un método nuevo de reducción del contenido de oxígeno en un producto alimenticio y en un producto de alimentación animal o material iniciador de los mismos, y medios de mejora de la vida de almacenamiento y/o la calidad de tales productos mediante el empleo de células bacterianas modificadas mediante cultivo. Así, tales células son útiles en la fabricación y la conservación de productos alimenticios y de productos de alimentación animal.
Antecedentes técnicos y estado de la técnica
Las bacterias del ácido láctico son usadas de manera extendida en la industria de productos alimenticios y de productos de alimentación animal en la elaboración de productos fermentados, incluidos la mayoría de los productos lácteos tales como el queso, el yogurt y la mantequilla; los productos cárnicos; los productos de panadería; el vino o los productos vegetales. Cuando son usadas para este tipo de fines, por lo general se hace referencia a los cultivos de bacterias del ácido láctico como cultivos iniciadores, y éstos transmiten características específicas a diversos productos fermentados mediante la realización aquí de varias funciones metabólicas y otras.
En el presente contexto, la expresión "bacterias del ácido láctico" designa un grupo de bacterias anaeróbicas o microaerofílicas, no motrices, grampositivas catalasa negativa, que fermentan el azúcar con la producción de ácidos, incluidos el ácido láctico como el ácido producido de manera predominante, el ácido acético, el ácido fórmico y el ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran entre la especie Lactococcus, la especie Lactobacillus, la especie Streptococcus, la especie Enterococcus, la especie Leuconostoc, la especie Oenococcus y la especie Pediococcus.
Cuando las bacterias del ácido láctico son cultivadas en un medio como la leche u otro material iniciador en la fabricación de productos alimenticios y productos de alimentación animal, el medio se acidifica como consecuencia natural del crecimiento y la actividad metabólica de los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico. Además de la producción de ácido láctico/lactato a partir del citrato, la lactosa u otros azúcares, durante el crecimiento de las bacterias del ácido láctico se producen otros varios metabolitos tales como, por ejemplo, el acetaldehído, el \alpha-acetolactato, la acetoína, el acetato, el etanol, el dióxido de carbono, el diacetil y el 2,3-butileno glicol (butanodiol).
Por lo general, la velocidad de crecimiento y la actividad metabólica de los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico pueden ser controlados mediante la selección de las condiciones de crecimiento apropiadas para las cepas del cultivo iniciador específico usado, tales como la temperatura de crecimiento apropiada, la tensión del oxígeno y el contenido de nutrientes.
Aunque la leche es por lo general un medio ideal para el crecimiento de las bacterias del ácido láctico, un alto contenido de oxígeno en la leche afecta al crecimiento de las bacterias de forma negativa, y en el sector industrial lácteo se sabe que una reducción del contenido de oxígeno de la materia prima láctea puede tener como resultado un crecimiento más rápido de las bacterias añadidas, lo que a su vez resulta en una acidificación de la leche inoculada más rápida. En la actualidad, una reducción de este tipo del contenido del oxígeno se realiza calentando la leche en sistemas abiertos, mediante la desaireación de la leche en vacío o mediante tratamientos de rociado. Los medios alternativos de reducción del contenido de oxígeno incluyen la adición de compuestos de barrido de oxígeno o el uso de cultivos mezclados que comprendan dos o más especies bacterianas del ácido láctico, al menos una de las cuales sea menos sensible al oxígeno.
WO 98/54337 expone un método de aumento de la velocidad de crecimiento de las bacterias del ácido láctico mediante el cultivo de las bacterias del ácido láctico en asociación con un organismo colaborador bacteriano del ácido láctico obtenido metabólicamente mediante ingeniería, el cual tiene un defecto en su metabolismo del piruvato, resultando en un consumo de oxígeno aumentado mediante el organismo colaborador. No obstante, este método de reducción del contenido de oxígeno en un medio se limita al uso de cepas bacterianas del ácido láctico modificadas específicas y, por lo tanto, no existe la necesidad de encontrar un método biológico de reducción de oxígeno en un material iniciador de producto alimenticio o de alimentación animal que no implique el uso de bacterias del ácido láctico modificadas metabólicamente o mutadas de manera específica.
Como se ha mencionado arriba, cuando las células bacterianas del ácido láctico han crecido anaeróbicamente fermentan los azúcares principalmente a ácido láctico/lactato por medio de piruvato. El NADH producido en las células durante este catabolismo es reoxidado mediante la lactato deshidrogenasa. No obstante, bajo condiciones aeróbicas el NADH puede ser reoxidado parcialmente por la NADH peroxidasa y la NADH oxidasa. Por lo tanto, bajo condiciones aeróbicas el piruvato puede ser convertido en otros productos finales aparte de los producidos bajo condiciones anaeróbicas, las cuales por su parte dan como resultado un aumento del rendimiento en biomasa. La mayoría de las bacterias del ácido láctico son catalasa negativa cuando han crecido en un medio sin hematina o hemo. Por lo tanto, la NADH peroxidasa puede actuar para eliminar el H_{2}O_{2} producido por los cultivos aeróbicos de especies que no pueden formar una pseudocatalasa.
Se sabe que algunas bacterias del ácido láctico pueden formar catalasa y citocromos cuando el medio de crecimiento aeróbico es complementado con hematina, sangre o hemoproteína. Sijpesteijn (1970) demostró que la fermentación de cepas de la Lactococcus lactis y de la Leuconostoc mesenteroides en la presencia de 10 ppm de hemina inducía cambios notables en la degradación aeróbica de la glucosa mediante las células en reposo de ambos organismos. Esto se observó cuando las células fueron cultivadas bajo condiciones aeróbicas y, en la presencia de hemina y glucosa, fueron transferidas a un medio de células en reposo, es decir, un medio donde las células no pueden crecer. Asimismo, se observó una absorción de O_{2} aumentada y se produjo menos ácido láctico y más ácido acético y acetoína. Se demostró que los citocromos eran formados en estos organismos cuando fueron cultivados bajo las condiciones de cultivo de arriba, y que la respiración se hizo más sensible al KCN. Este autor sugirió que, tras el crecimiento en la presencia de hemina, una respiración mediada por citocromos y regulada por hemina era principalmente responsable de la oxidación del NADH y, que la NADH oxidasa sólo desempeñaba un papel secundario bajo estas condiciones.
En un estudio sobre un sistema similar a los citocromos en bacterias del ácido láctico, Ritchey y Seeley (1976) informaron sobre resultados similares. Cuando han crecido en un medio que contiene hematina con glucosa, algunas cepas, tales como cepas de la Streptococcus faecalis o la L. lactis, por ejemplo, la L. lactis subespecie lactis biovar. diacetylactis, produjeron citocromos, mientras que la S. faecium no los produjo. Estos autores afirmaron que cepas tales como la S. faecalis o la L. lactis están bloqueadas en las fases de la síntesis del hemo, pero poseen los determinantes genéticos para establecer una cadena transportadora de electrones de citocromo ligados a membrana bajo las condiciones apropiadas.
No obstante, Kaneko et al. (1990) no pudieron observar citocromos al cultivar una cepa Citr^{+} (es decir, que metaboliza el citrato) de la L. Lactis bajo condiciones aeróbicas, y en la presencia de hemina y/o Cu^{+}. Asimismo, no observaron ninguna diferencia en la actividad de la NADH oxidasa, la diacetil reductasa o la lactato deshidrogenasa al cultivar esa cepa con estas condiciones de cultivo. No obstante, observaron un aumento en la producción del diacetilo y la acetoína debido a una activación de la diacetil sintasa mediante la hemina y/o el Cu^{+}. La solicitud de patente japonesa JP 04-36180 y la solicitud EP 430 406, ambas presentadas en nombre de Meiji Milk Production Co. Ltd., proponían el empleo de estas condiciones de cultivo para mejorar la producción del diacetilo y la acetoína mediante el uso de la cepa Citr^{+} de la L. lactis.
Todos los estudios de arriba demuestran que la adición de hemina o hematina al medio de fermentación bajo condiciones aeróbicas tiene como resultado cambios en la degradación aeróbica de la glucosa, y que una posible respiración aeróbica dependiente de los citocromos sea inducida en cepas cultivadas bajo las condiciones señaladas arriba. No obstante, las documentos de arriba no abordan el problema de la reducción del contenido de oxígeno de la materia prima láctea o de cualquier otro material iniciador para aumentar el crecimiento de las bacterias añadidas de un cultivo iniciador. Aunque se ha señalado una absorción de O_{2} aumentada en los sistemas de células en reposo bajo condiciones aeróbicas en la presencia de hemina y glucosa, no se ha sugerido la capacidad de dichas cepas cultivadas para ser usadas en un cultivo iniciador para la fabricación de un producto alimenticio o de un producto de alimentación animal.
El documento WO 00/05342 expone un proceso para preparar cultivos iniciadores de bacterias del ácido láctico aeróbicamente y en la presencia de un compuesto de porfirina.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que las cepas bacterianas del ácido láctico, cuando son cultivadas o fermentadas bajo condiciones aeróbicas en la presencia de hemina y otros compuestos de porfirina, pueden mantener su oxígeno aumentado reduciendo su actividad/capacidad cuando son inoculadas en leche u otros medios bajo condiciones apropiadas y sin la adición de un compuesto de porfirina. Así, es posible proporcionar un método biológico aplicable de forma general para reducir el contenido de oxígeno en la leche o en cualquier otro material iniciador de producto alimenticio o de alimentación animal, con lo cual el crecimiento y la actividad metabólica de los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico aquí pueden ser aumentados sustancialmente. Por lo tanto, es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un método de tales características y células modificadas mediante cultivo, las cuales sean útiles en un método de tales características.
De forma correspondiente, estas conclusiones han abierto un nuevo enfoque para proporcionar útiles cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico modificados mediante cultivo, y dicho enfoque está basado en métodos tradicionales de fermentación relativamente sencillos y no implica ingeniería genética o mutagénesis tradicional. Desde un punto de vista tecnológico práctico, esto es ventajoso, puesto que el uso de ingeniería genética o mutagénesis tradicional en la construcción de nuevas cepas requiere mucho esfuerzo e implica muchos gastos, y el uso de organismos modificados genéticamente en la producción alimenticia puede producir la aparición de preocupaciones en los consumidores.
Resumen de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona en un primer aspecto una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la cual deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina.
En otro aspecto, hay prevista una composición de cultivo iniciador que comprende la célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención.
En otro aspecto, la invención pertenece a un método de preparación de un producto alimenticio o de alimentación animal fermentado, el cual comprende la adición de una cantidad efectiva de la célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención o de la composición de arriba a un material iniciador de un producto alimenticio o de alimentación animal, donde la célula o la composición pueden fermentar dicho material iniciador para obtener el alimento fermentado.
La invención pertenece en otros aspectos al uso de la célula bacteriana del ácido láctico modificada de arriba o la composición que comprende tales células para la producción de un metabolito o para la producción de bacteriocina.
Descripción detallada de la invención
Es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un método biológico aplicable de forma general de reducción del contenido de oxígeno en un producto alimenticio o de alimentación animal o en un material iniciador para tales productos. Por consiguiente, en un aspecto está prevista una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tenga, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina.
Tal y como es usada aquí, la expresión "célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo" se refiere a una célula de una bacteria del ácido láctico que ha sido cultivada por fermentación en un medio de nutrientes apropiado en el cual está presente una cantidad efectiva de al menos un compuesto de porfirina. En el contexto presente, la expresión "una cantidad efectiva" significa una cantidad que sea suficiente para provocar que la bacteria del ácido láctico se modifique como se define aquí. De la discusión de arriba se entenderá que la presencia del compuesto de porfirina provoca que las células cultivadas bajo tales condiciones tengan una degradación aeróbica modificada de carbohidratos, tales como la lactosa, la glucosa o la galactosa. Después de la fermentación, las células bacterianas son cosechadas mediante el uso de procedimientos convencionales y, seguidamente, son usadas como un cultivo iniciador para la inoculación de un medio lácteo o cualquier otro material iniciador para la elaboración de alimentos donde las células puedan replicarse, con o sin la adición de un compuesto de porfirina al medio. De la forma en que se usa aquí, el término "fermentación" hace referencia a un proceso de propagación o cultivo de una célula bacteriana del ácido láctico bajo condiciones tanto anaeróbicas como aeróbicas.
Como se muestra en los ejemplos de abajo, fue posible para los inventores de la presente invención detectar la presencia y la cantidad de un compuesto de porfirina en células que habían sido cultivadas en la presencia de un compuesto de porfirina cuando se analizaron células modificadas mediante cultivo tras la fermentación o después de que las células hubieran sido transferidas a un medio donde las células pudieran replicarse. Fue sorprendente cuando los inventores observaron que la adición de un compuesto de porfirina al medio de cultivo tenía como resultado un contenido aumentado del compuesto de porfirina en las células modificadas mediante cultivo con respecto a las células de las cuales habían derivado. Se considerará que la expresión "con respecto a las células de las cuales han derivado" se refiere a células bacterianas del ácido láctico similares, las cuales, a diferencia de las células bacterianas modificadas mediante cultivo según la invención, no fueron cultivadas en un medio que contuviera un compuesto de porfirina.
Así, en una forma de realización preferida, la célula según la invención contiene al menos 0,1 ppm sobre una base de sustancia seca de un compuesto de porfirina, incluidas al menos 0,2 ppm, tal como al menos 0,5 ppm, incluida al menos 1 ppm, por ejemplo al menos 2 ppm, tal como al menos 5 ppm, incluidas tal como 10 ppm, tal como al menos 20 ppm, por ejemplo al menos 30 ppm, tal como al menos 40 ppm, por ejemplo al menos 50 ppm, tal como al menos 60 ppm, por ejemplo al menos 70 ppm, tal como al menos 80 ppm, por ejemplo al menos 90 ppm, tal como al menos 100 ppm sobre una base de sustancia seca de un compuesto de porfirina. Los "compuestos de porfirina" hacen referencia en el contexto presente a derivados del tetrapirrol cíclico, cuyas estructuras derivan de los de la porfirina por sustitución en los átomos de carbono situados en los ápices del núcleo del pirrol, con diversos grupos funcionales. También se refiere a los complejos de dichos derivados con un átomo de metal que forma enlaces coordinados con dos de los cuatro nitrógenos del anillo de porfirina. La definición también comprende, pero no se limita a, las uroporfirinas, las coproporfirinas, protoporfirinas y las hematoporfirinas, incluidas sus sales y ésteres y sus complejos con un átomo de metal, preferiblemente un átomo de hierro, el diclorhidrato de la coproporfirina I, el tetraetil éster de la coproporfirina III, la sal disódica de la protoporfirina IX, el dicloruro de la hematoporfirina IX, el tetraisopropil éster o el tetrametil éster de la coproporfirina, el tetraisopropil éster o el tetrametil éster de la coproporfirina III, la hematoporfirina IX, la hemoglobina, la protoporfirina IX, el dimetil éster de la protoporfirina IX, la zinc protoporfirina IX, la hematina y la citohemina. Los compuestos de la porfirina especialmente preferidos son la protoporfirina IX y sus complejos con un átomo de hierro, en particular el hemo y la hemina. Asimismo, la definición comprende diversas clorofilas, tales como la clorofila a y la clorofila b, sus derivados tales como las clorofilinas, y también sus sales y ésteres, y sus complejos con un átomo de metal, tales como un átomo de magnesio, cobre e hierro.
Tal y como se muestra más en los ejemplos de abajo, cuando se usa el método HPLC-MS, los inventores observaron picos claros en la región de la porfirina en células que habían crecido en un medio nutricional que contenía un compuesto de porfirina tanto bajo condiciones aeróbicas como bajo condiciones anaeróbicas. No se detectaron citocromos en las células cultivadas en un medio sin hemina. No obstante, se descubrió que es posible detectar citocromos en un nivel relativamente alto en las células modificadas después de que hayan sido transferidas a un medio en el cual las células puedan replicarse. Éste es un resultado muy sorprendente, puesto que hasta el momento no ha sido demostrado que las células bacterianas del ácido láctico que hayan crecido bajo condiciones aeróbicas en la presencia de un compuesto de porfirina tengan un contenido aumentado de citocromos y que las células modificadas mediante cultivo contengan citocromos tras la inoculación a un medio en el cual las células pueden replicarse. Sin pretender limitar la invención de ninguna manera, los inventores proponen que una célula bacteriana crecida bajo condiciones aeróbicas puede, a través de la acción de una NADH oxidasa, regenerar la NAD^{+} necesaria bajo un consumo de oxígeno. Si un compuesto de porfirina está presente en el medio de cultivo bajo condiciones aeróbicas, las células bacterianas producen citocromos y, debido a la respiración dependiente de los citocromos, el oxígeno es reducido a agua con la formación de energía utilizable metabólicamente, tal como el ATP y la NAD^{+}.
Se entenderá que, aunque la formación de citocromos en células bacterianas del ácido láctico es inducida por la presencia de un compuesto de porfirina, es posible observar células crecidas bajo tales condiciones con, con respecto a las células de las que derivan, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina sin la formación de citocromos. Así, es posible detectar y medir en las membranas lípidas de las células modificadas según la invención hemina libre, hemina ligada a una proteína no citocrómica, y hemina ligada a una proteína citocrómica para formar un complejo. Además, es posible observar en el citoplasma de las células modificadas hemina citoplásmica libre, hemina citoplásmica ligada a una proteína no citocrómica y hemina citoplásmica ligada a una proteína citocrómica para formar un complejo.
En el contexto presente, el término "citocromo" se refiere a un grupo de proteínas transportadoras de electrones, el cual contiene un grupo prostético hemo y, por lo tanto, a componentes de las cadenas transportadoras de electrones fotosintéticos y respiratorios, en las cuales el hierro hemo sale en estado reducido u oxidado. La definición comprende, pero no se limita a, los citocromos de los tipos a, b, c, d u o y las combinaciones de estos tipos de citocromos, como por ejemplo se menciona en Wachenfeldt y Hederstedt (1992). Se entenderá que el término "la cadena transportadora de electrones respiratorios" se refiere a una cadena transportadora de electrones de respiración aeróbica que funciona con oxígeno molecular como aceptor terminal de electrones, o una cadena transportadora de electrones de respiración anaeróbica que funciona con aceptores terminales de electrones distintos al oxígeno molecular, como el nitrato, el sulfato, el fumarato o el óxido de trimetilamina.
Así, en una forma de realización preferida, las células según la invención contienen al menos 0,1 ppm sobre una base de sustancia seca de un citocromo, incluidas al menos 0,2 ppm, tal como al menos 0,5 ppm, incluida al menos 1 ppm, por ejemplo al menos 2 ppm, tal como al menos 5 ppm, incluidas tal como 10 ppm, tal como al menos 20 ppm, por ejemplo al menos 30 ppm, tal como al menos 40 ppm, por ejemplo al menos 50 ppm, tal como al menos 60 ppm, por ejemplo al menos 70 ppm, tal como al menos 80 ppm, por ejemplo al menos 90 ppm, tal como al menos 100 ppm sobre una base de sustancia seca de un citocromo.
De conformidad con la invención, pueden ser usados cualesquiera organismos de cultivo iniciador que puedan ser usados en el sector industrial alimenticio, incluido el sector industrial lácteo. Así, las células pueden ser seleccionadas de una especie bacteriana del ácido láctico, que incluye la especie Lactococcus, la especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc, la especie Pediococcus, la especie Streptococcus, la especie Propionibacterium, la especie Bifidobacterium y la especie Oenococcus. En una forma de realización específica, las células son de la Lactococcus lactis, que incluye la cepa de la Lactococcus lactis subespecie lactis CHCC373 depositado con el número de acceso DSM12015.
Aunque es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un método biológico aplicable de manera general para reducir el contenido de oxígeno en la leche o cualquier otro material iniciador, es decir, sin el uso de organismos generados mediante ingeniería genética o mutados, se considerará que las bacterias modificadas de la invención también pueden ser una cepa modificada genéticamente previamente de una de las cepas bacterianas del ácido láctico de arriba o cualquier otra cepa de cultivo iniciador. De la forma en que es usada aquí, la expresión "bacteria modificada genéticamente" es usada con el significado convencional de dicho término, es decir, incluye cepas obtenidas mediante el sometimiento de una cepa bacteriana del ácido láctico a cualquier tratamiento de mutagenización usado convencionalmente, incluido el tratamiento con un mutágeno químico tal como el etil metano sulfonato (EMS) o la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), luz UVA o mutantes que se produzcan de manera espontánea. Asimismo, es posible proporcionar la bacteria modificada genéticamente mediante mutagénesis aleatoria o mediante la selección de mutantes que se producen de manera espontánea, es decir, sin el uso de tecnología de ADN recombinante, y se prevé que los mutantes de bacterias del ácido láctico puedan ser provistos mediante tal tecnología, incluidas la mutagénesis dirigida al sitio y las técnicas PCR, y otras modificaciones in vitro o in vivo de secuencias de ADN específicas una vez que tales secuencias han sido identificadas y aisladas.
Como se mencionó arriba, fue muy sorprendente cuando los inventores descubrieron que las células de cepas bacterianas del ácido láctico, cuando son cultivadas o fermentadas bajo condiciones aeróbicas en la presencia de un compuesto de porfirina, se vuelven capaces de mantener su capacidad aumentada para reducir el oxígeno, obtenida durante la fermentación, cuando son inoculadas en leche o en cualquier otro material iniciador que no contenga porfirina o que contenga poca porfirina bajo las condiciones apropiadas. No obstante, también es posible observar esta capacidad cuando tales células modificadas mediante cultivo son inoculadas en un medio en el cual es añadido un compuesto de porfirina. Además, los inventores pudieron demostrar que la degradación aeróbica de la lactosa tenía como resultado una absorción aumentada de O_{2}.
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Así, en una forma de realización preferida de la presente invención, las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo son células que, cuando son inoculadas en una concentración de aproximadamente 10^{7} células/ml en leche desnatada poco pasteurizada con 8 ppm de oxígeno disuelto, y dejando reposar la leche durante aproximadamente dos horas a una temperatura de aproximadamente 30ºC, consumen al menos el 25% del oxígeno. No obstante, las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención pueden ser especialmente útiles cuando las células bajo las condiciones de arriba consumen al menos el 30% del oxígeno presente en la leche, incluido al menos el 40%, tal como al menos el 50%, por ejemplo al menos 60%, tal como al menos el 70%, por ejemplo al menos el 80%, tal como al menos el 90%, por ejemplo al menos el 95% del oxígeno disuelto.
Se ha descubierto que una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención tiene, con respecto a la célula de la que deriva, una NADH oxidasa alterada, es decir, actividad de la NOX, y/o actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH). Tal y como se ha explicado arriba, es posible que las células crecidas bajo condiciones aeróbicas puedan regenerar la energía necesaria a partir de otros sistemas inducida durante la fermentación aeróbica y mantenida durante la inoculación de las células en leche o cualquier otro material iniciador que no contenga porfirina o que contenga poca porfirina. Así, en formas de realización preferidas de la presente invención, la célula modificada mediante cultivo es una célula que, con respecto a la célula de la que deriva, tiene una actividad de la NOX disminuida y/o una actividad de la LDH disminuida. Se entenderá que la enzima NOX, la cual es codificada por el gen nox, es un ejemplo de una NADH oxidasa que forma H_{2}O. Esta enzima regenera dos equivalentes del NAD^{+} bajo consumo de oxígeno molecular. Otros ejemplos de NADH oxidasas que podrían estar presentes en una célula de acuerdo con la invención son flavoproteínas del grupo no hemo, donde se han señalado dos tipos, uno que cataliza la reducción de O_{2} a H_{2}O_{2}, el otro la reducción de O_{2} a H_{2}O.
Por consiguiente, en otras formas de realización de la presente invención, la célula modificada mediante cultivo tiene una actividad de la NOX que es reducida en al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 75%, o el 95% con respecto a la célula de la que deriva. En una forma de realización interesante, la célula modificada tiene una actividad de la NOX que es reducida en aproximadamente el 100% con respecto a la célula de la que deriva, es decir, la actividad de la NOX está esencialmente ausente en esa célula modificada.
En otras formas de realización adicionales, la célula modificada mediante cultivo tiene una actividad de la LDH que está disminuida en al menos el 10%, incluidos al menos el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 75% o el 95% con respecto a la célula de la que deriva. En una forma de realización útil, la célula modificada tiene una actividad de la LDH que está disminuida en aproximadamente el 100% con respecto a la célula de la que deriva, es decir, la actividad de la LDH está esencialmente ausente en esa célula modificada.
Las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención son útiles como cultivos iniciadores en la producción de productos alimenticios. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición de cultivo iniciador que comprende la célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención la cual tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina.
Es conveniente proporcionar la composición de cultivo iniciador según la invención como un concentrado de cultivo iniciador cuando se usa en la producción alimenticia o para la producción de metabolitos que sean generados por las cepas del cultivo iniciador. Normalmente, un concentrado de tales características contiene células de los organismos de cultivo iniciador como un fermento no concentrado de la(s) cepa(s) de cultivo iniciador respectiva(s) o en una forma concentrada. Por consiguiente, la composición de cultivo iniciador de la invención puede tener un contenido de células viables (unidades que forman colonias, UFCs) que sea al menos 10^{4} UFC/g, que incluya al menos 10^{5} UFC/g, tal como al menos 10^{6} UFC/g, por ejemplo al menos 10^{7} UFC/g, 10^{8} UFC/g, 10^{9} UFC/g, 10^{10} UFC/g o 10^{11} UFC/g de la composición.
Se puede prever la composición de cultivo iniciador según la invención como una composición de cultivo iniciador líquida, congelada o secada, tal como por ejemplo, criodesecada o secada por pulverización.
Puesto que es normal en los procesos de fermentación bacteriana del ácido láctico aplicar cultivos mezclados de bacterias del ácido láctico, la composición según la invención comprende en ciertas formas de realización una multiplicidad de cepas que pertenecen a la misma especie o que pertenecen a especies diferentes. Por consiguiente, en otra forma de realización, la composición de cultivo iniciador comprende células de dos o más cepas bacterianas del ácido láctico diferentes. Un ejemplo típico de tal combinación útil de células bacterianas del ácido láctico en una composición de cultivo iniciador es una mezcla de la célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención y una o más especies Lactococcus, tales como la L. lactis subespecie lactis o la L. lactis subespecie lactis biovar. diacetylactis o la especie Leuconostoc. Tal cultivo mezclado puede ser usado en la elaboración de productos lácteos fermentados tales como suero lácteo y queso. Otro ejemplo es una mezcla de la Streptococcus thermophilus y la Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus.
En una forma de realización, la composición según la invención es una composición que además comprende al menos un componente que aumenta la viabilidad de la célula bacteriana durante el almacenaje, incluido un nutriente bacteriano, una vitamina y/o un crioprotectante. En el caso de una composición sometida a una fase de congelación, se selecciona un crioprotectante apropiado del grupo compuesto por la glucosa, la lactosa, la rafinosa, la sacarosa, la trehalosa, el adonitol, el glicerol, el manitol, el metano], el polietileno glicol, el propileno glicol, el ribitol, el alginato, la albúmina de suero bovino, la carnitina, el citrato, la cisteína, el dextrano, el dimetil sulfóxido, el glutamato de sodio, la glicina betaína, el glicógeno, la hipotaurina, la peptona, la polivinil pirrolidona, y la taurina. El crioprotectante usado es seleccionado de manera ventajosa del alginato, el glicerol, la glicina betaína, la trehalosa y la sacarosa.
De conformidad con la invención, también se prevé un método de reducción del contenido de oxígeno en un producto alimenticio o en un material iniciador de producto alimenticio, dicho método comprende la adición al producto o al material iniciador de una cantidad efectiva, por ejemplo en la forma de una suspensión, de células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención o de una composición de cultivo iniciador según la invención.
La producción industrial de productos comestibles normalmente incluye fases del proceso tales como la mezcla, el bombeado o el enfriamiento, durante lo cual aumenta el nivel de saturación de oxígeno del producto comestible y, como resultado, el material iniciador del producto comestible puede tener un contenido de oxígeno inicial relativamente alto (nivel elevado de saturación de oxígeno), que es desfavorable para los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico. Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que, cuando una suspensión de las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención o una composición de cultivo iniciador de esta invención es cultivada en un material iniciador de producto alimenticio comestible con un nivel inicial de saturación de oxígeno de al menos el 8%, por ejemplo el 10% o más, tal como el 20% o más, el cultivo iniciador puede reducir el contenido de oxígeno en el material iniciador a un contenido que sea favorable para cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico.
En el contexto presente, la expresión "reducir el contenido de oxígeno" se refiere a la capacidad de la suspensión de las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo que contiene un compuesto de porfirina o la composición de cultivo iniciador según la invención para reducir el contenido inicial del oxígeno en un medio no complementado con un compuesto de porfirina.
En formas de realización útiles del método de la presente invención, las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo o la composición de cultivo iniciador según la invención es uno, el cual pueda reducir la cantidad de oxígeno presente en el medio en al menos el 1% por hora, incluido de al menos el 10% por hora, tal como en al menos el 20% por hora, por ejemplo en al menos el 30% por hora. La reducción puede ser incluso de al menos el 40% por hora, incluido de al menos el 50% por hora, tal como al menos el 60% por hora, por ejemplo al menos el 70% por hora, tal como al menos el 80% o al menos el 90% por hora.
En una forma de realización específica del método según la invención, el cultivo iniciador bacteriano del ácido láctico es un cultivo de cepas mezcladas, el cual comprende al menos dos cepas de bacterias del ácido láctico. Arriba se describen ejemplos de tales cultivos de cepas mezcladas. Así, en formas de realización especialmente preferidas de la invención, las células modificadas mediante cultivo, cuando son inoculadas como un cultivo mezclado que comprende células de al menos otra cepa de cultivo que no fue cultivada bajo condiciones aeróbicas en la presencia de un compuesto de porfirina, pueden aumentar la velocidad de crecimiento de esa otra cepa de cultivo bacteriano del ácido láctico. Puede ser que no se encuentren condiciones de crecimiento que sean en todos los aspectos óptimas para todas las cepas de tales cultivos de cepas bacterianas mezcladas del ácido láctico. Por lo tanto, la actividad metabólica de un cultivo de cepas mezcladas puede ser controlada de manera selectiva mediante la elección de una temperatura que favorezca una producción aumentada de los metabolitos deseados mediante una o más cepas, pero la cual, por otra parte, pueda tener como resultado una producción reducida de otros metabolitos mediante otras cepas. No obstante, el resultado global del cultivo de un cultivo de cepas bacterianas mezcladas del ácido láctico con la célula modificada mediante cultivo según la invención, comparado con el cultivo de cepas bacterianas mezcladas del ácido láctico cultivado solo, es un número de células aumentado, una producción aumentada de uno o más metabolitos, incluidos compuestos aromáticos y de ácidos y/o una producción disminuida de uno o más metabolitos.
Evidentemente, la producción aumentada de ácidos del cultivo iniciador bacteriano del ácido láctico mencionada arriba tendrá como resultado una disminución del pH del medio inoculado con las células modificadas mediante cultivo de la invención que supere la obtenida en el mismo medio inoculado con el cultivo iniciador solo. Aquí se hace referencia a la diferencia en pH del medio inoculado con el cultivo iniciador solo y el medio inoculado con el cultivo iniciador en asociación con una suspensión de la célula de acuerdo con la invención como \DeltapH. En formas de realización útiles del método presente, la producción aumentada de ácido tiene como resultado un \DeltapH de al menos 0,05 después de tres horas o más de cultivo, tal como un \DeltapH de al menos 0,1 después de tres horas o más de cultivo, por ejemplo un \DeltapH de al menos 0,5 después de tres horas o más de cultivo, tal como un \DeltapH de al menos 0,8 después de tres horas o más de cultivo, por ejemplo un \DeltapH de al menos 1,0 después de tres horas o más de
cultivo.
En formas de realización preferidas de la presente invención, la proporción entre células modificadas mediante cultivo y células de cultivo iniciador bacteriano del ácido láctico no modificadas está en el intervalo de entre 1000:1 y 1:1000, tal como entre 500:1 y 1:500, por ejemplo entre 100:1 y 1:100, tal como en el intervalo entre 50:1 y 1:50, por ejemplo en el intervalo de entre 20:1 y 1:20, tal como en el intervalo de entre 10:1 y 1:10 o en el intervalo de entre 5:1 y 1:5, tal como en el intervalo de entre 2:1 y 1:2. En otras formas de realización del método presente, la cantidad de células modificadas mediante cultivo está en el intervalo de entre 10^{3} y 10^{12} UFC por g. de material iniciador. Por consiguiente, las células modificadas son añadidas en cantidades de las que se obtiene como resultado un número de células viables que es al menos 10^{3} unidades formadoras de colonia (UFC) por g. del material iniciador de producto comestible, tal como al menos 10^{4} UFC/g, incluida al menos 10^{5} UFC/g, tal como al menos 10^{6} UFC/g, por ejemplo al menos 10^{7} UFC/g, tal como al menos 10^{8} UFC/g, por ejemplo al menos 10^{9} UFC/g, tal como al menos 10^{10} UFC/g, por ejemplo al menos 10^{11} UFC/g del material iniciador.
En formas de realización útiles, el material iniciador es un material iniciador para un producto alimenticio comestible, incluida la leche, un material vegetal, un producto cárnico, un mosto, un zumo de fruta, un vino, una masa y una pasta. Como es usado aquí, ha de entenderse que el término "leche" significa cualquier tipo de leche o componente de la leche, incluidos por ejemplo la leche de vaca, la leche humana, la leche de búfalo, la leche de cabra, la leche de oveja, los productos lácteos hechos de dicha leche o el suero lácteo.
En otras formas de realización, el material iniciador es un material iniciador para un producto de alimentación animal tal como ensilaje, por ejemplo, césped, material de cereal, guisantes, alfalfa u hoja de la remolacha azucarera, donde los cultivos bacterianos son inoculados en la cosecha alimenticia para ser ensilados para obtener una conservación del presente, o en productos de desperdicios animales ricos en proteínas, tales como vísceras de matanza y vísceras de pescado, también con los objetivos de conservar estas vísceras con fines relativos a la alimentación de animales.
Otra forma de realización importante del método de conformidad con la presente invención es aquella en la que las células bacterianas modificadas mediante cultivo son derivadas de un cultivo bacteriano al que se hace referencia por lo general como un cultivo probiótico. En el presente contexto, se entiende por el término "probiótico" un cultivo microbiano el cual, cuando es ingerido en la forma de células viables por seres humanos o animales, confiere una condición de salud mejorada, por ejemplo, mediante la supresión de microorganismos dañinos en el tracto gastrointestinal, mediante la mejora del sistema inmunitario o mediante la contribución a la digestión de nutrientes.
Tal y como se ha descrito arriba, las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo que contienen un compuesto de porfirina o la composición de cultivo iniciador según la invención pueden reducir la cantidad de oxígeno en un medio. Se ha descubierto que tales cepas pueden mejorar la vida útil de productos comestibles, debido a su capacidad de reducción de oxígeno.
Por consiguiente, es otro objetivo de la invención proporcionar un método de mejora de la vida de almacenamiento y/o la calidad de un producto comestible, comprendiendo el método la adición al producto de una cantidad efectiva de una suspensión de las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención o una composición de cultivo iniciador según la invención. Como se utiliza aquí, el término "vida de almacenamiento" indica el periodo de tiempo en el cual el producto comestible es aceptable para consumo.
Se puede obtener el efecto de mejora de la vida de almacenamiento de arriba en una cepa de componentes o ingredientes de producto comestible, tales como leche, incluidos la leche (cruda) no pasteurizada, carne, masa de harina, vino y materiales vegetales, tales como verduras, frutas o las plantas forrajeras mencionadas arriba.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de preparación de un producto alimenticio o de alimentación animal fermentado basado en el uso de la cepa bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo según la invención. En su aspecto más amplio, tal método comprende que una cantidad efectiva de las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo según la invención o una composición que comprenda las células modificadas sean añadidas a un material iniciador de producto alimenticio o de alimentación animal, donde las células o la composición puedan fermentar dicho material iniciador para obtener los productos alimenticios o de alimentación animal fermentados. Se entenderá que en un método de tales características, una o más cepas de bacterias del ácido láctico modificadas no metabólicamente pueden ser usadas junto con las bacterias del ácido láctico modificadas.
Los materiales iniciadores de producto alimenticio útiles incluyen cualquier material que normalmente sea sometido a una fase de fermentación bacteriana del ácido láctico, tales como la leche, los materiales vegetales, los productos cárnicos, los zumos de fruta, el mosto, los vinos, las masas y las pastas. En otras formas de realización, el producto alimenticio fermentado resultante en el método de la invención es un producto lácteo tal como queso y leche de manteca. En otras formas de realización, el material iniciador es un material iniciador para un producto de alimentación animal tal como el ensilaje, por ejemplo, césped, materia del cereal, guisantes, alfalfa u hoja de remolacha azucarera.
Es otro objetivo de la invención proporcionar el uso de las células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo de la invención o la composición que comprende tales células para la producción de un metabolito producido por la célula o la composición. En el contexto presente "producido por la célula o la composición" supone que el metabolito puede ser uno que sea producido de forma natural por las células o que el metabolito sea producido recombinando por las células modificadas. En una forma de realización alternativa, se consigue la producción del metabolito a través del cocultivo de una célula modificada de la invención con al menos un organismo no modificado que pueda producir el metabolito. Ejemplos típicos de metabolitos que son producidos por las células incluyen el ácido láctico, el acetaldehído, el \alpha-acetolactato, la acetoína, el acetato, el etanol, el diacetil y el 2,3-butileno glicol.
De manera adicional, las células de la invención y las composiciones que comprenden tales células son útiles para la producción de bacteriocinas producidas de forma natural o mediante recombinación por las células u otros, célula no modificada que es cocultivada con la célula modificada de la invención, tal como por ejemplo la nisina, la reuterina y la pediocina.
La invención será ahora descrita en otros detalles en los ejemplos siguientes no limitativos y los dibujos donde
La figura 1a muestra el cromatograma de 10 \mug/ml de una hemina (ferriprotoporfirina IX cloruro) estándar. La hemina se eluye después de 33,3 minutos;
La figura 1b muestra el espectro el máximo de la hemina después de 33,3 minutos. El ion molecular de la hemina es observado en 616,3 m/z (m/z= masa/carga; cps= cuentas por segundo);
La figura 2a muestra el cromatograma de la muestra del detrito celular de la fermentación A del experimento 1 de abajo;
La figura 2b muestra el espectro del máximo en el momento 33,3 minutos en la figura 2a. El ion molecular de la hemina no es observado en 616,3 m/z;
La figura 3a muestra el cromatograma de la muestra del detrito celular de la fermentación B del experimento 1 de abajo;
La figura 3b muestra el espectro del máximo en el momento 33,3 minutos en la figura 3a. El ion molecular de la hemina es observado en 616,3 m/z;
La figura 4a muestra el cromatograma de la muestra del detrito celular de la fermentación C del experimento 1;
La figura 4b muestra el espectro del valor máximo en el momento 33,3 minutos en la figura 4a. El ion molecular de la hemina no es observado en 616,3 m/z;
La figura 5a muestra el cromatograma de la muestra del detrito celular de la fermentación D del experimento 1;
La figura 5b muestra el espectro del máximo en el momento 33,3 minutos en la figura 5a. El ion molecular de la hemina es observado en 616,3 m/z;
La figura 6a muestra el cromatograma de 100 \mug/ml de un citocromo c estándar. El citocromo C eluye después de 23,4 minutos;
La figura 6b muestra el espectro del máximo en el momento 23,4 minutos en la figura 6a. El ion molecular de la ferroporfirina IX es observado en 617,3 m/z, así como la proteína intacta de carga múltiple (m/z 1031; 1124; 1237; 1374; 1546; 1766) con un peso molecular estimado de 12356 Da; y
La figura 7 muestra los espectros CN-Ox (línea delgada), CN/Red-CN (línea discontinua) y Red-Ox (línea gruesa) para células cosechadas a partir de la fermentación E descrita en el experimento 2 de abajo.
Ejemplo 1 Un estudio del efecto de la adición de hemina al medio de fermentación en la enzima v las actividades de reducción del contenido de oxígeno de una bacteria del ácido láctico
Se estudió el efecto de la adición de hemina al medio de fermentación en la actividad enzimática y la actividad de reducción del contenido de oxígeno de una cepa bacteriana del ácido láctico en dos experimentos, el experimento 1 y el experimento 2. Además, se estudió la presencia de hemina y citocromos en células bacterianas del ácido láctico cuando habían crecido en un medio que contiene hemina.
Experimento 1
1. Materiales y métodos 1.1 Microorganismo
La cepa de tipo salvaje Lactococcus lactis subespecie lactis CHCC373 (de la colección de cultivos Chr. Hansen) fue aplicada en este experimento. Se depositó una muestra de la cepa de conformidad con el Tratado de Budapest en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Marscheroder Weg, 1 b, D-38124 Braunschweig, el 17 de febrero de 1998 con el número de acceso DSM 12015.
1.2 Composición del medio
El medio de fermentación tenía la siguiente composición: peptona de caseína, 30 g/l; primatona, 30 g/l; peptona de soja, 30 g/l; peptona de levadura, 15 g/l; MgSO_{4}, 1,5 g/l; Na-ascorbato, 3 g/l; y lactosa, 30 g/l. Se añadió antiespumante (Dow Corning 1510) en una concentración de 0,25 g/l.
El medio fue esterilizado mediante el tratamiento UHT. El medio terminado tenía un pH de 6.5.
Se preparó una solución fresca de hemina como sigue a continuación: un gramo de hemina (producto Fluka nº 51280, peso molecular 651,96 g/mol) fue disuelto en 1 ml. de 6,7 N NH_{4} OH y se añadió agua a un volumen final de un litro. Posteriormente, la solución fue autoclavada a 121ºC durante veinte minutos. La hemina fue añadida a las fermentaciones B y D como se describe a continuación en una concentración final de 10 mg/l.
1.3 Condiciones de fermentación
Se llevó a cabo una serie de cuatro fermentaciones con la cepa CHCC373 usando el medio de fermentación definido arriba:
Fermentación A - fermentación anaeróbica
Fermentación B - fermentación anaeróbica con adición de hemina
Fermentación C - fermentación aeróbica
Fermentación D - fermentación aeróbica con adición de hemina.
Las fermentaciones fueron inoculadas con una suspensión celular concentrada de CHCC373.
Las fermentaciones anaeróbicas fueron realizadas con nitrógeno en espacio de aire, mientras que las fermentaciones aeróbicas fueron rociadas con aire a un ritmo de 0,3 litros por minuto por litro del volumen de fermentación (a este nivel de aeración, se mantuvo la concentración de oxígeno disuelto por encima del 65% del nivel de saturación durante las fermentaciones aeróbicas).
Cada una de las cuatro fermentaciones fue llevada a cabo a una temperatura de 30ºC y con una presión del espacio de aire de aproximadamente 2 bares. Se dejó que los cultivos se acidificaran hasta un pH de 6.2. A continuación, el pH se mantuvo en 6.2 mediante la adición controlada de 13,4 N NH_{4} OH.
Se recogieron muestras de 10 ml. por todas las fermentaciones para mediciones de la densidad óptica mediante el uso de un espectrofotómetro Hitachi U-1100 a 600 nm, y la siguiente determinación del efecto de reducción del oxígeno. Las muestras fueron almacenadas a -50ºC hasta el análisis.
Cuando no se observó otro consumo de base, el cultivo respectivo fue enfriado a aproximadamente 10ºC.
1.4 Operaciones de recuperación
Tras el enfriamiento, cada uno de los caldos de fermentación A a D fueron concentrados mediante centrifugación y, seguidamente, congelados como gránulos en nitrógeno líquido. Los gránulos congelados fueron almacenados a -80ºC hasta otro análisis.
1.5 Preparación de la muestra
Aproximadamente 10 g. de gránulos congelados de cada fermentación fueron pesados con precisión. Estos gránulos fueron lavados dos veces en 40 ml. de tampón frío de 0,05 M Na-fosfato (pH 6.1). Tras cada fase de lavado, las suspensiones fueron centrifugadas a 9.000 rpm (centrifugado Sorvall con rotor SS-34) durante veinte minutos a 4ºC.
Tras el segundo lavado, las células fueron resuspendidas en 20 ml. de tampón frío de 0,05 M Na-fosfato (pH 6.1). Las suspensiones fueron sonicadas sobre hielo usando un Sonificador Branson 250 en los siguientes parámetros: temporizador, cuatro ciclos de cinco minutos cada uno (cada ciclo seguido del enfriamiento para evitar el calentamiento excesivo de las suspensiones); control de salida, dos; y ciclo de funcionamiento, 30%).
El material celular sonicado resultante fue centrifugado a 6.000 rpm (centrifugadora Sorvall con rotor SS-34) durante veinticinco minutos a 4ºC. Los sobrenadantes (extractos libres de células) y los gránulos (detrito celular) fueron separados y almacenados a -20ºC hasta la caracterización enzimática y el análisis de presencia de hemina intracelular.
1.6 Caracterización enzimática
Todos los ensayos enzimáticos fueron realizados a 30ºC usando un espectrofotómetro Secomam Antelie provisto el software Winelie (versión 1.50). Los extractos libres de célula fueron descongelados sobre hielo.
1.6.1 Medición de la actividad de la NADH oxidasa
La actividad de la NADH oxidasa de los extractos libres de células fue medida mediante el control de la oxidación del NADH a 340 nm en una mezcla de reacción con la siguiente composición: tampón de 50 mM de trisacetato (pH 6.0), 0,5 mM. de fructosa-1,6-difosfato y 0,5 mM de NADH.
1.6.2 Medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa
La actividad de la lactato deshidrogenasa de los extractos libres de células fue medida mediante el control de la oxidación del NADH a 340 nm en una mezcla de reacción con la siguiente composición: tampón de 50 mM de trisacetato (pH 6.0), 0,5 mM de fructosa-1, 6-difosfato, 25 mM de piruvato y 0,5 mM de NADH.
Posteriormente, se corrigió la actividad de la lactato deshidrogenasa para la actividad de la NADH oxidasa.
Una unidad de actividad enzimática (U) es definida como la actividad necesaria para oxidar 1 pmol de NADH por minuto.
1.6.3 Determinación de la proteína
Para medir la concentración de proteínas del extracto libre de células, se usó la prueba del ácido bicinconínico (ABC) (Pierce, Rockford, EEUU) con albúmina estándar (Pierce) como estándar de la proteína.
1.7 Método de medición del efecto de reducción del contenido de oxígeno
Las muestras recogidas durante las fermentaciones fueron descongeladas y analizadas en cuanto a su capacidad para eliminar oxígeno de la leche (leche desnatada poco pasteurizada). Se probó este efecto de reducción del oxígeno en la leche a 30ºC.
Para cada muestra de fermentación, el contenido de oxígeno de la leche fue medido regularmente por un metro de oxígeno disuelto M0128 (Mettler Toledo) tras la inoculación. La concentración inicial de oxígeno de la leche era 8,3 mg/kg.
1.8 Análisis de porfirinas y citocromos 1.8.1 Preparación de la muestra Sobrenadante de células sonicadas
A 190 \mul del sobrenadante claro (extracto libre de células) se añadieron 5 \mul de 3% de ácido clorhídrico para detener la actividad enzimática, y la muestra fue analizada usando el HPLC-MS.
Gránulo (detrito celular) - procedimiento A
Se pesaron en el interior de un tubo Eppendorf aproximadamente 60 mg. (pesados con precisión) del gránulo. Se añadió 1 ml. de 88% de ácido fórmico, y el tubo fue mezclado agitando. Se dejó la suspensión durante sesenta minutos a temperatura ambiente para extraer citocromos y porfirinas de las células. El tubo fue centrifugado (seis minutos a 10.000 rpm usando una centrifugadora Eppendorf 5415) y el sobrenadante analizado por el HPLC-MS.
Gránulo (detrito celular) - procedimiento B
Aproximadamente 250 mg (pesados con precisión) del gránulo fueron pesados en el interior de un tubo de plástico de 10 ml. Se añadieron 4 ml. de 88% de ácido fórmico, y el tubo fue mezclado agitando. Se dejó la suspensión durante sesenta minutos a temperatura ambiente para extraer citocromos y porfirinas de las células. La muestra fue distribuida en cuatro tubos Eppendorf, los cuales fueron centrifugados durante seis minutos a 10.000 rpm usando una centrifugadora Eppendorf 5415. Se mezclaron 90 \mul de partes alícuotas del sobrenadante con 10 \mul de solución de hemina estándar con concentraciones de hemina variables dando como resultado una concentración final de hemina añadida de 0; 0,2; 0,5 y 1,0 ppm, respectivamente. Las muestras fueron mezcladas agitando y analizadas por el HPLC-MS. El área de la señal de hemina específica fue usada para la cuantificación.
El contenido de materia seca del detrito celular fue determinado mediante una balanza Mettler PM480 Delta Range equipada con un dispositivo de secado Mettler LP-16 (modo: 120 seg.; calc.: %; temp.: 105ºC). Aproximadamente 300 mg. de detrito celular fueron colocados sobre 500 mg. de gránulos de piedra pómez.
1.8.2 Las condiciones del HPLC-MS para el procedimiento A
Se inyectó una muestra de 20 \mu al sistema HPLC-MS, compuesto por un HPLC PE serie 200 provisto de una columna Vydac C4 (cat.#214TP51) mantenida a 40ºC acoplada a un espectrómetro de masa (EM) PE-SCIEX AP1150EX con una entrada TurbolonSpray (L = 2, H = 7; flujo de gas de secado: 8 l/min y temperatura 300ºC). Los analitos fueron eluidos usando los ajustes de la bomba mostrados abajo (tabla 1).
TABLA 1 Ajustes de la bomba HPLC-MS
1
Fase móvil A: 0,01% (v/v) de ácido trifluoroacético + 0,1% (v/v) de ácido acético en agua Milli-Q. Fase móvil B: 0,008% (v/v) de ácido trifluoroacético + 0,1% (v/v) de ácido acético en acetonitrilo.
La señal MS se obtuvo de modo positivo usando distintas condiciones en dos escalas de masa:
escala de masa baja m/z = 450 - 650: el tamaño del paso fue de 0'250 amu, tiempo de toma de muestras de 5 ms, OR = 200, RNG = 400
\vskip1.000000\baselineskip
escala de masa alta m/z = 1.000 - 1.800: el tamaño del paso fue de 1 amu, el tiempo de toma de muestras de 5 ms, OR = 50, RNG = 200
\vskip1.000000\baselineskip
1.8.3 Condiciones del HPLC-MS para el procedimiento B
Las condiciones del HPLC-MS para el procedimiento B fueron tal y como se describe para el procedimiento A, salvo los siguientes cambios con respecto a las recopilaciones de datos:
escala de masa baja m/z = 450 – 650: el tamaño del paso fue de 0'500 amu, el tiempo de toma de muestras de 5 ms, el tiempo de pausa de 5 ms
\vskip1.000000\baselineskip
la masa específica de la hemina m/z = 616'3 m/z: el tamaño del paso fue de 0 amu, el tiempo de toma de muestras de 2.000 ms, el tiempo de pausa de 5 ms
\vskip1.000000\baselineskip
2. Resultados 2.1 Resultados del análisis enzimático
Las actividades específicas de la NADH oxidasa y la lactato deshidrogenasa de células congeladas en gránulos cosechadas a partir de cada una de las cuatro fermentaciones están listadas en la tabla 2. No se detectó actividad de la NADH oxidasa en las células a partir de las dos fermentaciones anaeróbicas A y B. Bajo condiciones aeróbicas (fermentaciones C y D), la actividad específica de la NADH oxidasa es reducida entre un 25 y un 30% por la adición de hemina al medio de fermentación. Asimismo, la adición de hemina reduce la actividad específica de la lactato deshidrogenasa en entre un 15 y un 20% bajo condiciones aérobicas.
TABLA 2 Actividades enzimáticas de las células de las cuatro fermentaciones [U/mg de proteínas]
2
2.2 Resultados para el efecto de reducción del contenido de oxígeno
En la tabla 3 se muestra el efecto específico de reducción de oxígeno de una muestra de células tomada durante cada una de las cuatro fermentaciones. Tal y como se muestra en la tabla 3, las células que habían sido cultivadas aeróbicamente en la presencia de hemina (fermentación D) podían reducir el contenido de oxígeno de la leche en mayor medida que las células tomadas de cualquiera de las otras tres fermentaciones.
TABLA 3 Efecto de reducción del contenido de oxígeno de las células de las cuatro fermentaciones
3
2.3 Resultados de la detección de porfirinas - procedimiento A
Usando el método HPLC-MS descrito arriba, la hemina eluye en un tiempo de retención de 33,3 minutos y es detectada como el ion molecular a m/z 616,3 (figuras 1a y 1b). No se detectó hemina en ninguno de los extractos libres de células de las cuatro fermentaciones, mientras que se detectó hemina en los gránulos celulares (detrito celular), cuando la hemina había estado presente en el medio de fermentación (figuras 3a, 3b, 5a, y 5b). No se detectó hemina en los gránulos celulares (detrito celular) de las fermentaciones realizadas en la ausencia de hemina (figuras 2a, 2b, 4a y 4b).
2.4 Resultados para la detección de citocromos
Usando el método HPLC-MS descrito arriba, el citocromo c eluye en un tiempo de retención de 23,4 minutos (figuras 6a y 6b) y es detectado como la proteína intacta de cargas múltiples (m/z 1031; 1124; 1237; 1374;1546; 1766), así como el ion de la ferroporfirina IX en m/z 617,3. El método puede ser aplicado para la detección de otros citocromos diferentes al citocromo c.
2.5 Cuantificación de porfirinas - procedimiento B
Usando hemina purificada como estándar, el contenido celular de hemina fue cuantificado para cada una de las fermentaciones A, B, C y D mediante el HPLC-MS usando la adición estándar (tabla 4). Se cuantificó el contenido de sustancia seca de detrito celular en 18,5% (p/p).
Como se ha descrito arriba, no se detectó hemina en las células cosechadas a partir de fermentaciones llevadas a cabo en un medio no complementado con hemina (fermentaciones A y C), mientras que se detectaron 41 ppm (sobre una base de peso seco) de hemina en células de fermentaciones realizadas en un medio complementado con hemina (fermentaciones B y D).
TABLA 4 Cuantificación de la hemina celular
4
Experimento 2
1. Materiales y métodos 1.1 Microorganismos
En este experimento se aplicó un cultivo iniciador de cepas mezcladas de Lactococcus.
1.2 Composición del medio
La fermentación E también fue realizada usando un medio de fermentación compleja convencional que contenía lactosa como la fuente de carbono. Se añadió la hemina a la concentración final de 10 mg/l.
1.3 Condiciones de fermentación
La fermentación fue inoculada con una suspensión celular concentrada del cultivo de la Lactococcus lactis. Se roció aire por el caldo de fermentación a un ritmo suficiente para mantener la concentración de oxígeno disuelto por encima del 50% del nivel de saturación. La fermentación fue llevada a cabo a una temperatura de 30ºC. Se permitió que el cultivo se acidificara hasta un pH de 6.2, tras lo cual el pH se mantuvo en 6.2 mediante la adición controlada de 13,4 N NH4OH.
1.4 Operaciones de recuperación
Las operaciones de recuperación fueron como se ha descrito en el experimento 1.
1.4.1 Determinación del contenido de sustancia seca de los gránulos congelados
Aproximadamente 5 g. de gránulos congelados fueron pesados en el interior de una bandeja metálica posicionada sobre una balanza Sartorius MA 30 equipada con un dispositivo de calentamiento y calentada a 160ºC hasta un peso constante. Se calculó el contenido de materia seca a partir de la pérdida de peso de la muestra.
1.5 Preparación de la muestra
Aproximadamente 20 g. de gránulos congelados de la fermentación E fueron pesados con precisión. Estos gránulos fueron lavados dos veces en tampón (pH 7.4) de 20 mM de ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) de sodio frío. Tras cada fase de lavado, la suspensión fue centrifugada a 4ºC en una centrifugadora Sorvall RC 50 Plus con rotor SS-34 (tras el primer lavado: 5.000 rpm durante veinte minutos; tras el segundo lavado: 8.000 rmp durante treinta minutos).
Tras el segundo lavado, las células fueron resuspendidas en 10 ml. de tampón MOPS frío (20 mM, pH 7.4), el cual contiene 0,5 mM de fenilmetilsulfonilfluorida y 5 mM de MgSO4, como se describe en Winstedt et al. (2000). Entonces, la suspensión fue pasada a través de una prensa francesa cinco veces y, posteriormente, centrifugada en la centrifugadora Sorvall (4ºC, 4,000 rpm, 30 min.). El sobrenadante fue separado y almacenado a -20ºC hasta otro análisis.
1.6 Detección espectrofotométrica y cuantificación de los citocromos
Antes del análisis, el sobrenadante congelado fue descongelado sobre hielo y centrifugado en la centrifugadora Sorvall (4ºC, 4,000 rpm, 30 min.).
Se usaron cubetas de plástico de 1,5 ml. Se usó 1 ml. de sobrenadante para las dos cubetas. Cuando se expuso, se añadieron 10 pl de cianuro y 0,5 M de KCN, obteniéndose como resultado una concentración de 5 mM. También cuando se expuso, se añadió ditionita de sodio directamente en forma seca a las cubetas para reducir las muestras.
Se aplicó un espectrofómetro Shimadzu UVPC 2101 (paso de 1 nm; corte de 5 nm; velocidad "muy lenta").
1.6.1 Espectros CN-Ox y Cn/Red-CN
Se introdujo una muestra no tratada (=oxidada) en la cubeta de referencia, así como en la cubeta de medición. Se aseguró la identidad de las muestras en las dos cubetas (espectro Ox-Ox). Se añadió KCN a la cubeta de medición, y se registró el espectro (espectro CN-Ox). Seguidamente, se añadió KCN a la cubeta de referencia, y se aseguró la identidad de las muestras en las dos cubetas (espectro CN-CN). Finalmente, se añadió ditionita de sodio a la cubeta de medición, y se registró el espectro después de entre cinco y diez minutos (espectro CN/Red-CN).
1.6.2 Espectro Red-Ox
Se introdujo la muestra no tratada (=oxidada) en la cubeta de referencia, así como en la cubeta de medición. Se aseguró la identidad de las muestras en las dos cubetas (espectro Ox-Ox). Entonces, se añadió la ditionita de sodio a la cubeta de medición, y se registró el espectro después de entre cinco y diez minutos (espectro Red-Ox).
1.6.3 Tratamiento de los espectros
Los espectros de diferencia registrados fueron sometidos a transformaciones leves antes de otro análisis de datos. Se sustrajo una línea recta de los espectros para obtener un espectro en el intervalo de entre 500 y 700 nm sin demasiada inclinación. La línea base para el pico en 630 nm fue calculada partir de los valores en 612 nm y 658 nm.
2. Resultados
En la figura 7 se muestran los espectros de diferencia registrados para células de la fermentación E. El espectro CN-Ox (línea fina) está sin ninguna característica en el intervalo de entre 500 y 700 nm. El espectro CN/Red-CN (línea discontinua) muestra un pico en 630 nm (un pico que es más pequeño que el pico correspondiente en el espectro Red-Ox (línea gruesa), es decir, el cianuro "protege" el citocromo de la reducción con la ditionita. Estas observaciones junto con el hundimiento en 650 nm son un claro indicativo de que el citocromo es un citocromo d (Gil et al., 1992).
La altura del pico en 630 nm es de 0'0008 AU. Mediante la aplicación de un coeficiente de extinción de 18,8 mM-1cm-1 (Kita et al., 1984), esto se corresponde con una concentración de citocromo d de 0'04 pM. Tomando un peso molecular de alrededor de 100 kDa, la concentración del citocromo d es de 4 mg/l. Puesto que los 20 gramos iniciales de gránulos congelados de la fermentación E contenían un 15'7% (p/p) de materia seca, la concentración celular de citocromo d es de 13 ppm (mg. por kg. de materia seca).
No se detectaron citocromos en los gránulos congelados de la fermentación anaeróbica en la ausencia de hemina (fermentación A).
Referencias
Gil, A., Kroll, R. G. & Poole, R. K. 1992. The cytochrome composition of the meat spoilage bacterium Brochothrix thermosphacta: identification of cytochrome a3- and d-type terminal oxidases under various conditions. Archives of Microbiology 158:226-233.
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Claims (18)

1. Una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina, donde la célula contiene al menos 0,1 ppm sobre una base de sustancia seca de citocromo d.
2. Una célula según la reivindicación 1, la cual es de una especie bacteriana seleccionada del grupo compuesto por la especie Lactococcus, la especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc, la especie Pediococcus, la especie Streptococcus, la especie Propionibacterium, la especie Bifidobacterium y la especie Oenococcus.
3. Una célula según la reivindicación 2, donde la especie bacteriana es de la Lactococcus lactis, incluida la cepa de la Lactococcus lactis CHCC373 depositada con el número de acceso DSM12015.
4. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la cual, cuando está en la forma de una suspensión celular, está inoculada en una concentración de 10^{7} células/ml en leche desnatada poco pasteurizada con 8 ppm de oxígeno disuelto, y dejando la leche reposar durante aproximadamente dos horas a una temperatura de aproximadamente 30ºC, consume al menos el 25% del oxígeno.
5. Una célula según la reivindicación 4, dónde la célula consume al menos el 50% del oxígeno disuelto.
6. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la cual, con respecto a la célula de la que deriva, tiene una actividad reducida de la NOX y/o una actividad reducida de la LDH.
7. Una célula según la reivindicación 6, la cual tiene una actividad de la NOX que está reducida en al menos el 10%.
8. Una célula según la reivindicación 6, la cual tiene una actividad de la LDH que está reducida en al menos el 10%.
9. Una composición de cultivo iniciador, la cual comprende una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina, donde la composición está en la forma de una composición congelada, líquida o criodesecada, y donde la composición contiene una cantidad de células bacterianas del ácido láctico modificadas mediante cultivo viables que se encuentra en el intervalo de entre 10^{10} y 10^{12} UFC por g.
10. La composición según la reivindicación 9, donde el intervalo es un intervalo de entre 10^{11} y 10^{12} UFC por g.
11. La composición según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde la célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo es una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
12. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, la cual comprende células de dos o más cepas bacterianas del ácido láctico diferentes.
13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, la cual comprende además al menos un componente que aumenta la viabilidad de la célula bacteriana durante el almacenamiento, incluidos un nutriente bacteriano y/o un crioprotectante.
14. Un método de preparación de un producto alimenticio o de alimentación animal fermentado, el cual comprende la adición de una cantidad efectiva de
(i) una bacteria del ácido láctico modificada mediante cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o
(ii) una composición de cultivo iniciador según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 a un material iniciador de producto alimenticio o de alimentación animal, donde la célula o la composición pueden fermentar dicho material iniciador para obtener el producto alimenticio o de alimentación animal fermentado,
donde el material inicial para el producto alimenticio es seleccionado del grupo compuesto por leche, material vegetal, un producto cárnico, un zumo de fruta, un mosto, un vino, una masa y una pasta.
15. Un método de preparación de un producto alimenticio o de alimentación animal fermentado, el cual comprende la adición de una cantidad efectiva de
(i) una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo, la cual tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina, o
(ii) una composición de cultivo iniciador, la cual comprende una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina a un material iniciador de producto alimenticio o de alimentación animal, donde la célula o la composición pueden fermentar dicho material iniciador para obtener el producto alimenticio o producto de alimentación animal fermentado,
donde el material inicial para el producto alimenticio es seleccionado del grupo compuesto por leche, un material vegetal, un producto cárnico, un zumo de fruta, un mosto, un vino, una masa y una pasta,
donde la leche es leche humana, leche de búfalo, leche de cabra, leche de oveja o suero lácteo.
16. El método según las reivindicaciones 14 ó 15, donde el producto alimenticio fermentado resultante es un producto lácteo seleccionado del grupo compuesto por el queso y el suero lácteo.
17. El método de preparación de un producto alimenticio o de alimentación animal de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, donde la composición de cultivo iniciador es una composición de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.
18. Uso de
(i) una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo, la cual tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina, o
(ii) una composición de cultivo iniciador, la cual comprende una célula bacteriana del ácido láctico modificada mediante cultivo que tiene, con respecto a la célula de la que deriva, un contenido aumentado de un compuesto de porfirina
para la producción de una bacteriocina, donde la bacteriocina es seleccionada del grupo compuesto por la nisina, la reuterina y la pediocina.
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