ES2274591T3 - Peptidos ramificados en ensayos para anticuerpos. - Google Patents
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Abstract
Péptidos ramificados de fórmula (I), pueden utilizarse en cantidades excepcionalmente pequeñas en un ensayo de enlace para anticuerpos en fluidos.
Description
Péptidos ramificados en ensayos para
anticuerpos.
La presente solicitud es una solicitud
divisionaria del documento EPA 92907955.6 publicado el 9 de abril de
1992.
La presente invención se refiere a un péptido
ramificado que puede utilizarse en un procedimiento de ensayo en el
que se utiliza un péptido para la detección de un anticuerpo.
Los péptidos sintéticos que corresponden a
cortos tramos lineales de secuencias de proteínas pueden ser
reconocidos por algunos anticuerpos dirigidos contra la proteína
entera. Éstos son reactivos atractivos para la detección de
anticuerpos en suero dirigidos contra dichas proteínas, debido a que
son relativamente fáciles de sintetizar y son generalmente más
baratos de producir que la proteína entera. Kits de ensayos ELISA
basados en péptidos pueden ser sensibles y específicos para el
diagnóstico de anticuerpos HIV en pacientes de SIDA, A. Närvänen
et al., J. Med. Virology 26, 111-118
(1988), y están ahora comercialmente disponibles.
Se han utilizado asimismo péptidos sintéticos
para generar antisueros reactivos con proteínas cuyo péptido
constituye una parte lineal, B. Walter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 5197-5200 (1980) y J. C.
Sutcliffe et al., Nature 287, 801-805
(1980). Más recientemente, se han utilizado péptidos ramificados
para producir antisueros antipeptídicos que son reactivos con
proteínas, J. P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
5409-5413 (1988); D. N. Possnett et al., J.
Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988). Dichos
péptidos ramificados consisten en un pequeño núcleo de polilisina
que se bifurca dos veces, sobre el cual se sintetiza el péptido de
interés. Se ha mostrado que dichos péptidos ramificados son muy
inmunogénicos y provocan una respuesta inmune mayor en ratones que
la provocada por los péptidos lineales (monoméricos)
correspondientes, G. Del Guidice et al., Eur. J. Immunol.,
20, 1619-1622 (1990) y asimismo que la
utilización de péptidos ramificados en inmunoensayos proporciona
una excelente inmunorreactividad, aumentando la sensibilidad y
fiabilidad de dichos ensayos, J. P. Tam y F. Zavala, J.
Immunological Methods, 124, 53-61 (1989),
haciendo posible de este modo que se utilicen concentraciones
inferiores de antígeno para detectar anticuerpos.
Sin embargo, la utilización de péptidos
sintéticos como reactivos en ensayos de unión, tales como ensayos
ELISA, está limitada actualmente por su coste elevado.
Tam y Zavala ((1989) J. Immunol. Meth.
124:53-61) describen un procedimiento para detectar
anticuerpos en los antígenos de péptidos sintéticos en
radioinmunoensayos que utiliza un sistema de péptido antigénico
múltiple
(MAP).
(MAP).
El documento EP-0 339 695 hace
referencia a un procedimiento para la preparación de un conjugado
antigénico o inmunogénico tal como un sistema de péptido antigénico
múltiple por reacción de una estructura ramificada sobre la base de
aminoácidos con un compuesto antigénico.
Kornan y Terenius ((1980) FEBS Lett
118:293-5) describen la utilización de análogos de
encefalina con fines de separación de afinidad.
McLean et al ((1991) J. Immunol. Meth.
137:149-157) compara la inmunogenicidad de los
péptidos ramificados con la de los péptidos conjugados a proteína y
ligados a resina.
Se ha encontrado ahora sorprendentemente que
péptidos ramificados que contienen un brazo espaciador (de una
longitud equivalente a la proporcionada por entre por lo menos 4 y
no más de 20 restos de glicina) entre la porción que contiene
epítopo y el núcleo polifuncional presentan una ventaja notable
sobre los correspondientes péptidos monoméricos y sobre péptidos
ramificados que carecen de dicho brazo espaciador, en un ensayo de
unión ya que, peso por peso, dan lugar a una sensibilidad de ensayo
notablemente mayor.
Aunque se han descrito péptidos ramificados que
son muy inmunogénicos y útiles para generar anticuerpos en
comparación con los correspondientes péptidos lineales en las
comunicaciones anteriormente citadas, y aunque se han utilizado en
ensayos ELISA contra anticuerpos producidos contra péptidos, resultó
muy inesperado descubrir que la adición de un brazo espaciador a la
estructura ramificada entre la porción que contiene epítopo y el
núcleo polifuncional aumentaría la inmunogenicidad en tal grado, que
se podrían utilizar en ensayos para la detección de anticuerpos en
cantidades muy inferiores a las de sus equivalentes lineales, o a
las estructuras ramificadas en las que la porción que contiene
epítopo estaba directamente unida al núcleo sin un brazo
espaciador.
En un aspecto, la invención proporciona dichos
péptidos que contienen espaciador per se. Las porciones que
contienen epítopo están unidas a los brazos espaciadores que
sobresalen de un núcleo polifuncional, formando así ramas que
presentan una pluralidad de epítopos en el interior de la misma
molécula, situados en sus ramas. Los brazos espaciadores son de una
longitud equivalente a entre por lo menos 4 y no más de 20 residuos
de glicina. El péptido puede utilizarse en un procedimiento de
ensayo de un fluido, especialmente el fluido corporal
(preferentemente suero) de un paciente, para determinar la presencia
en el mismo de anticuerpos, en el que se realiza una reacción de
unión entre el anticuerpo y un péptido que presenta un epítopo para
el mismo, y la aparición o el grado de unión se detecta o se mide,
respectivamente.
La invención proporciona asimismo un kit que
comprende el péptido ramificado de la invención junto con por lo
menos otros componente esencial para la realización o
estandarización de dicho ensayo, particularmente por lo menos un
reactivo para la detección o medición de la unión, p.ej., un
anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado.
Las Figuras 1, 2 y 3 son representaciones
gráficas que muestran la reactividad de péptidos ramificados que
contienen brazos espaciadores de diferentes longitudes, en
comparación con péptidos monoméricos y péptidos ramificados sin
brazos espaciadores.
La Figura 1 muestra el efecto de brazos
espaciadores que consisten en restos de glicina sobre la capacidad
de péptidos ramificados para detectar anticuerpos
anti-peptídicos.
Las Figuras 2 y 3 muestran el efecto de brazos
espaciadores que consisten en restos de glicina sobre la capacidad
de péptidos ramificados para detectar un anticuerpo
anti-peptídico. La cantidad de péptido ramificado en
cada uno de los pocillos de la placa de ensayo es de 1 \mug
(Figura 2) ó 0,01 \mug (Figura 3).
Las Figuras 4, 5 y 6 son representaciones
gráficas que muestran la reactividad de péptidos ramificados que
contienen brazos espaciadores de 4 restos de glicina en comparación
con péptidos monoméricos y péptidos ramificados sin brazos
espaciadores. El péptido consistía en un epítopo de HIV.
La Figura 4 muestra la capacidad del péptido
monomérico para detectar un anticuerpo
anti-peptídico a diferentes concentraciones del
péptido.
Las Figuras 5 y 6 muestran la capacidad de
péptidos ramificados con y sin brazos espaciadores para detectar un
anticuerpo anti-peptídico a diferentes
concentraciones del péptido.
El término "epítopo" tal como se utiliza en
la presente memoria significa toda porción de una proteína que
interactúa con un anticuerpo. La expresión "brazo espaciador"
tal como se utiliza en la presente memoria significa el resto o
restos que se encuentran intercalados entre el extremo del epítopo
más próximo al núcleo y el punto de ramificación más remoto al
núcleo, pero, en que dicho punto de ramificación está proporcionado
por el resto de un aminoácido polifuncional, excluyendo de la
consideración dicho resto de aminoácido. La expresión "porción
que contiene epítopo" tal como se utiliza en la presente memoria
hace referencia al epítopo junto con cualquier resto más allá del
extremo del epítopo más alejado del núcleo.
Los péptidos ramificados de la invención pueden
consistir en cualquier molécula ramificada en la que se presenta el
mismo epítopo del péptido más de una vez en la molécula y está
presente en más de una rama. Aunque, tal como el término
"péptido" implica, la molécula está formada predominantemente
por cadenas peptídicas y es una molécula de origen no natural, no
es necesario que la molécula entera esté compuesta por aminoácidos.
Pueden estar incluidos un núcleo no peptídico o un espaciador
parcialmente no peptídico o enlaces no peptídicos entre una rama y
otra.
El brazo espaciador irradia hacia fuera desde el
núcleo central de la molécula y comprende cualquier resto no
voluminoso y no hidrófobo. Más preferentemente la molécula del brazo
espaciador comprende restos de aminoácidos. La expresión
"aminoácido no polar" tal como se utiliza en la presente
memoria incluye alanina, valina, leucina e isoleucina.
Preferentemente, el brazo espaciador comprende una mayoría de restos
de glicina (que es un aminoácido polar no cargado) o aminoácidos no
polares. La longitud preferida del brazo espaciador es por lo menos
de 4 restos de aminoácido. Es probable que haya poca ventaja si
existen más de 20 restos, ya que puede haber demasiada posibilidad
de interferencia entre dichas ramas muy flexibles, entre sí. El
brazo espaciador es de una longitud equivalente a la proporcionada
entre de por lo menos 4 a no más de 20 residuos de glicina. Se
prefieren particularmente longitudes equivalentes a la proporcionada
por un número comprendido entre 4 y 10 restos, y muy
preferentemente entre 4 y 7 restos, en que la longitud
particularmente preferida es la equivalente a la proporcionada por
5 restos de
glicina.
glicina.
El péptido de la invención contiene por tanto
ramas que pueden irradiar hacia fuera desde cualquier núcleo
central de una molécula. El núcleo central y los brazos espaciadores
no son tan excesivamente grandes como para interferir con el ensayo
y satisfacen por otra parte los requisitos de un ensayo dirigido a
anticuerpos. Por tanto, puesto que en la mayoría de los casos se
hará que el péptido se adhiera a una superficie sólida tal como la
de una placa de microtitulación, una varilla de inmersión o perlas,
el núcleo y los brazos espaciadores no deben interferir con dicha
función.
El propio núcleo comprende preferentemente un
aminoácido polifuncional o un polímero del mismo, pero podría estar
formado en principio por una simple molécula polifuncional, tal como
un poliol, p.ej. trimetilpropano, o una poliamina, o por un
oligómero ramificado tal como un poliacrilato o polimetacrilato
reticulado de bajo peso molecular. Muy preferentemente, el núcleo
está formado por sucesivas ramificaciones hacia fuera y consiste
en, o incluye el resto de una molécula polimérica derivada de
X^{n}-1 moléculas de un monómero que presenta una
polifuncionalidad x, siendo x por lo menos 2 y usualmente de 2 a 4,
y siendo n un número entero. Aunque n no tiene en principio ningún
límite superior, es probable que el péptido se haya de sintetizar
químicamente y por conveniencia, por tanto, n rara vez excedería
probablemente de 10 e incluso más raramente de 20.
En interés por conseguir el efecto deseado en un
grado muy valioso, n es preferentemente por lo menos 3; así pues,
por ejemplo, si x es 2 y n es 3, el péptido sería un octámero
ramificado. El monómero es preferentemente un aminoácido básico,
tal como lisina.
El núcleo polifuncional estará normalmente
completamente "saturado" por ramas de brazos espaciadores, que
comprenden preferentemente restos de aminoácidos, que se extienden
desde los grupos funcionales, normalmente mediante enlaces
peptídicos entre grupos funcionales amino del núcleo y extremos
carboxilo de los restos de brazos espaciadores. Ventajosamente,
todos los epítopos están unidos al núcleo a través de brazos
espaciadores, aunque si son aceptables ventajas reducidas, algunos
podrían estar unidos directamente al núcleo. Por definición, todos
los brazos espaciadores están unidos a porciones que contienen
epítopo. Esto se realizará normalmente mediante enlaces peptídicos
entre los grupos amino de los restos de brazos espaciadores y los
extremos carboxilo de las cadenas que contienen epítopo. Un único
brazo espaciador puede llevar en el mismo un epítopo o una
pluralidad de epítopos, pero preferentemente no exceden de 2 ó 3 por
cada brazo.
En principio, sin embargo, los péptidos
ramificados se podrían preparar para que presentaran algunos brazos
de reserva equivalentes a brazos espaciadores, pero sin ningún
epítopo unido. De nuevo, habría normalmente una ventaja reducida en
dicha construcción.
En términos generales, la molécula peptídica
ramificada de la invención contendrá solamente una clase de epítopo
para que se una a anticuerpos específicos para el mismo.
Naturalmente, si existen dos o más clases de anticuerpos que se han
de detectar en un solo ensayo, p.ej. si una enfermedad pudiera ser
causada por dos o más agentes infecciosos que carecen de epítopos
comunes convenientes y si la enfermedad se trata de la misma manera
cualquiera que sea el agente infeccioso responsable, el péptido
podría incorporar diferentes epítopos. Alternativamente, el ensayo
se podría llevar a cabo utilizando péptidos ramificados separados
según la invención que contienen cada uno un solo epítopo. Con el
fin de evitar la posibilidad de falsos positivos, el péptido no
contendrá ningún enlace que pueda proporcionar una reacción de
unión con otros anticuerpos o una reacción de unión no específica.
No contendrá por tanto segmentos de ninguna proteína que pueda
producir dichos efectos.
Los péptidos se pueden preparar mediante
cualquiera de los procedimientos de síntesis bien conocidos, p.ej.
tal como se describe por Tam o por Possnett et al.
anteriormente citados, pero el procedimiento Fmoc, p.ej. tal como
se describe por H. Lankinen et al., J. Gen. Virol. 70,
3159-3169 (1989) es particularmente conveniente.
El péptido de la invención puede utilizarse de
cualquier manera apropiada para la detección de anticuerpos,
especialmente en cualquier fluido apropiado, especialmente un fluido
corporal, que contenga probablemente anticuerpos. Aunque el suero
es el fluido corporal usual, se podrían ensayar otros fluidos que
contienen ciertas inmunoglobulinas, p.ej. lágrimas, saliva o
leche.
La invención hace posible que se utilicen
pequeñas cantidades de péptido, siendo la cantidad requerida de
péptido ramificado de la invención normalmente inferior a la de su
equivalente lineal o equivalente ramificado en el que el
equivalente ramificado no contiene un brazo espaciador. La
comparación se considera sobre el peso total de péptido ramificado
incluyendo el núcleo y el brazo espaciador, frente al peso total del
péptido lineal de la misma o sustancialmente la misma composición
de aminoácidos. La comparación se puede realizar, ya sea en
términos de la cantidad de péptido requerido para conseguir un nivel
dado de señal o en términos de la concentración de anticuerpo en
suero que se puede detectar mediante la utilización de una cantidad
dada del péptido.
En la práctica normal, el ensayo se llevará a
cabo de modo heterogéneo, uniendo el péptido ramificado según la
invención a un soporte insoluble, tal como la superficie de plástico
de una placa de microtitulación, aunque la invención no está
limitada a dichos ensayos. En un ensayo sándwich, el
antisuero se incuba con el péptido durante un periodo de tiempo
apropiado para permitir la unión y con un anticuerpo para la
inmunoglobulina. De este modo, por ejemplo, si el paciente es un
ser humano y el anticuerpo es de la clase IgG, se añade un
anticuerpo anti-IgG humana, apropiadamente marcado,
la placa se lava y se mide la cantidad de marcador fijado a la
placa (por medio del anticuerpo y el péptido). Alternativamente, se
puede efectuar un ensayo de competición, en el que se permite que
una cantidad conocida de anticuerpo marcado compita con el suero o
lo desplace de su unión. Dicho ensayo, sin embargo, es menos
apropiado para detectar pequeñas concentraciones de anticuerpo. Se
puede utilizar cualquiera de los marcadores usuales, p.ej.
radiomarcadores y marcadores enzimáticos, especialmente peroxidasa
y fosfatasa alcalina. Los radiomarcadores se pueden analizar
mediante un cómputo radiactivo y los marcadores enzimáticos
mediante una señal colorimétrica, fluorescente o quimioluminiscente,
por ejemplo. Se puede utilizar un procedimiento de amplificación de
la detección, tal como "Ampak" (marca comercial registrada) de
Nordisk Diagnostics Ltd., que requiere un marcador enzimático de
fosfatasa alcalina, para sensibilizar adicionalmente el ensayo.
La cantidad de péptido que se ha de utilizar por
cada ensayo, p.ej. por cada pocillo de una placa, será normalmente
inferior a 5 \mug, preferentemente inferior a 1 \mug y muy
preferentemente inferior a 0,1 \mug. La cantidad más adecuada en
cualquier caso particular dependerá de la naturaleza del epítopo
implicado. En una placa de microtitulación convencional, que
presenta una capacidad de 100 \mul por cada pocillo, la solución
de péptido utilizada sería entonces inferior a 5 mg.
En un kit para llevar a cabo el ensayo, los
componentes esenciales serán en la mayoría de los casos el péptido
ramificado de la invención y un anticuerpo
anti-inmunoglobulina humana marcado. Éstos se
proporcionan, naturalmente, en el kit en recipientes separados.
Los ejemplos siguientes ilustran los péptidos de
la invención y su utilización. "Tween" es una marca comercial
registrada.
Ejemplo
1
Se sintetizaron péptidos mediante un
procedimiento químico Fmoc de flujo continuo, utilizando un
sintetizador de péptidos LKB y un procedimiento descrito por H.
Lankinen et al., J. Gen. Virol., 70,
3159-3169 (1989). Después de la síntesis, se
eliminaron los grupos de protección de cadenas laterales mediante
tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% en agua (más 4% en
peso/volumen de fenol para los péptidos que contenían arginina, ó
3% en peso/volumen de fenol más 2% de etanoditiol para péptidos que
contenían cisteína y arginina).
Las masas moleculares relativas de los péptidos
lineales se determinaron por espectrometría de masas
(M-Scan Ltd.) que proporcionó valores idénticos a
los esperados. La composición de aminoácidos de péptidos ramificados
se determinó por análisis de aminoácidos (Cambridge Research
Biochemicals) y de nuevo estuvieron en concordancia con las
expectativas. La pureza de los péptidos se comprobó por HPCL de fase
inversa, utilizando una columna analítica "Dynamax", (4,6 mm
de diámetro interno x 25 cm de longitud, resina 300A C8, número de
catálogo 83-303-C) utilizando un
gradiente de 0% a 95% de acetonitrilo en agua con una duración de 20
minutos y un caudal de 0,5 ml/min. Las purezas variaron del 61% al
91%.
Los péptidos sintetizados se presentan en la
Tabla 1 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) Se sintetizaron péptidos ramificados. Los
péptidos ramificados de la invención consistieron en ocho copias de
la secuencia de aminoácidos epitópicos (sec aa) cada una unida a
través del extremo COOH al grupo NH_{2} terminal de un resto de
brazo espaciador y por tanto a un núcleo de ramificación de lisina,
cuya fórmula general se presenta a continuación. Para fines
comparativos, se prepararon asimismo péptidos ramificados que
carecían del brazo espaciador, estando enlazado entonces el extremo
COOH del epítopo directamente a un grupo NH_{2} de un resto de
lisina del núcleo.
El brazo espaciador consistía en restos de
glicina. Se sintetizaron nueve péptidos en los que el número de
restos de glicina en el brazo espaciador fueron 0, 1, 2, 4, 5, 7,
10, 15 y 20 (denominados G0, G1, G2, G4, G5, G7, G10, G15 y G20).
Este epítopo es reconocido por el anticuerpo monoclonal Z1F11.
(b) Como testigos, se sintetizaron formas tanto
ramificada (2A) como monomérica (2B) de un péptido no relacionado.
La forma ramificada presentó la misma fórmula general que se ha
representado para (a) anteriormente, excepto en que no había ningún
brazo espaciador entre la porción que contenía epítopo y el núcleo
de lisina. (M. S. Chee et al., Current Topics in
Microbiology and Immunology, 154, 125-169
(1990)). Este péptido no contenía el epítopo reconocido por
Z1F11.
(c) Como testigo, se preparó una forma
monomérica de un péptido que contenía el mismo epítopo que en (a)
(D. J. McGeoch et al., J. Gen. Virol., 69,
1531-1574, (1988)).
(d) Se sintetizó la forma monomérica de este
péptido (Simmonds et al.), J. of Virol. 65,
2666-6276 [1991]) y está contenido en el
determinante principal de neutralización (Javerahian et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6768-6772
[1989]).
(e) Se prepararon formas ramificadas del péptido
que no contenían espaciadores (G0) o que contenían cuatro
espaciadores de glicina (G4).
Ejemplo
2
Se investigó el efecto de variar la distancia
entre el epítopo reactivo y el núcleo sobre la reactividad de la
molécula ramificada con el anticuerpo que se detecta.
Se sintetizaron nueve péptidos (secuencia ID
número 1) como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se empleó el
anticuerpo monoclonal Z1F11 (P. Schenk et al., J. Gen.
Virol., 69, 99-111 (1988)), un anticuerpo
monoclonal producido contra el virus del herpes simple
HSV-I, en el ensayo ELISA, ya que se había mostrado
anteriormente que éste reconocía el epítopo secuencial GDPEDLD (M.
Murphy et al., J. Gen. Virol., 70,
2357-2364 (1989)).
El ensayo ELISA se llevó a cabo de la siguiente
manera:
Se disolvieron péptidos en una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 mg/ml. Los
péptidos se diluyeron seguidamente en PBS (solución salina tamponada
con fosfato) para formar soluciones que variaron de concentración
entre 1 mg/ml y 1 pg/ml. Se añadieron 100 \mul de solución de
péptido a cada pocillo, que representaron cantidades de péptidos
que variaron de 100 \mug a 100 fg. Se dejó que los péptidos se
adsorbieran sobre la placa a una temperatura de 37ºC durante una
noche. Se eliminó el exceso de solución de antígeno y las placas se
inactivaron en una solución que contenía 1% de BSA durante 1 h a una
temperatura de 37ºC. Las placas se lavaron a continuación tres
veces en PBS que contenía el 0,01% de
"Tween-20" (PBS Tween) y se incubaron con 100
\mul de la dilución de anticuerpo apropiada a una temperatura de
37ºC durante 1 h. Para la detección de los anticuerpos unidos, las
placas se lavaron cinco veces en PBS-TWEEN y se
incubaron durante 1 h a una temperatura de 37ºC con 100 \mul por
cada pocillo de conjugado peroxidasa de rábano
picante-anti-ratón de oveja (SAPU)
(diluido 1.000 veces en PBS). Las placas se lavaron a continuación
siete veces en PBS-Tween y se hicieron reaccionar
con una solución de 50 mg/ml del sustrato enzimático
2,2'-azino-bis(ácido
3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)
[ABTS] en una solución tampón de citrato-fosfato que
contenía el 0,01% de peróxido de hidrógeno. Después de 15 minutos
de desarrollo de cambio de color, las placas se leyeron en un
lector de placas Titerek Multiscan a 405 nm. Los resultados
proporcionados son todos la media de determinaciones
duplicadas.
Los resultados del primer experimento se
presentan en la Figura 1, se ensayaron diferentes cantidades de
péptidos, que variaron de 100 \mum a 100 fg en ensayos ELISA para
determinar la reactividad con Z1F11 (diluido 1/2.000). Los testigos
incluyeron: anticuerpo monoclonal HCMV-3, (un
anticuerpo monoclonal producido contra citomegalovirus humano que
no se esperaría que reaccionase con ninguno de los péptidos de las
secuencias ID números 1, 2 y 3) en lugar de Z1F11, el péptido 2
(Tabla 1) en las formas tanto ramificada 2A como monomérica 2B como
se ha descrito en el Ejemplo 1 y una secuencia peptídica monomérica
ID número 3 (tabla 1), que contiene el epítopo reactivo con Z1F11.
La figura muestra que todos los péptidos ramificados que contenían
la secuencia GDPEDLD reaccionaron más fuertemente con Z1F11 que lo
hizo el péptido monomérico que contenía dicha secuencia (secuencia
ID número 3). Sin embargo, hubo una diferencia notable entre el
péptido ramificado (secuencia ID número 1) sin ningún espaciador de
glicina (G0), que fue sólo marginalmente más reactivo que el péptido
monomérico, y el péptido ramificado con un espaciador de solamente
una glicina (G1): con 100 \mug de péptido por cada pocillo, el G1
proporcionó una absorbancia dos veces mayor que la producida por G0
y se necesitó 10^{4} veces más de G0 que de G1 para producir una
absorbancia de 0,5. Restos de glicina adicionales aumentaron
progresivamente la absorbancia para cantidades de péptido de
aproximadamente 10 pg por cada pocillo, aunque los péptidos G5 y G7
resultaron ser los más sensibles a concentraciones bajas. Los
testigos se comportaron como se esperaba, en el sentido de que, en
primer lugar, el anticuerpo testigo HCMV-3 no
reaccionó con ningún péptido a ninguna concentración (se presentan
únicamente los datos de la reacción de este anticuerpo con el
péptido G10), en segundo lugar, el Z1F11 no reaccionó con la
secuencia de péptidos no relacionada ID número 2A (ramificada) y la
secuencia ID número 2B (monomérica) y en tercer lugar, en ausencia
de péptido, el Z1F11 no fue reactivo.
En las Figuras 2 y 3 se presentan los resultados
del segundo experimento. Se examinó el efecto de la longitud del
espaciador de glicina sobre la sensibilidad con la que los péptidos
ramificados (secuencia ID número 1) podían detectar Z1F11. Se
ensayaron tres cantidades diferentes de péptido: 0,01 \mug, 1
\mug y 100 \mug. Todas proporcionaron esencialmente los mismos
resultados y se presentan únicamente los datos para 1 \mug por
cada pocillo y 0,01 \mug por cada pocillo en las Figuras 2 y 3,
respectivamente. Se ensayó la reactividad de los péptidos frente a
diluciones de duplicación de Z1F11 que variaron de 1/250 a 1/64.000.
En la Figura 2 se presentan los resultados para péptidos
ramificados utilizados a una concentración de 1 \mug/pocillo. En
este caso, todas las formas del péptido ramificado fueron
significativamente más reactivas que el péptido monomérico testigo
(secuencia ID número 3). El efecto fue particularmente notable con
cuatro o más restos de glicina. Cuando se diluyó 64.000 veces, el
Z1F11 proporcionó una absorbancia de 0,5 con el péptido G4,
mientras que para producir la misma absorbancia con el péptido G0 el
anticuerpo se pudo diluir solamente 250 veces. Restos adicionales
de glicina no aumentaron significativamente la reactividad del
péptido ramificado. Se llega a la conclusión a partir de este
experimento, que un espaciador de cuatro o más restos de glicina
aumenta la sensibilidad para la detección de anticuerpo Z1F11 en por
lo menos 256 veces.
En la Figura 3 se presentan los resultados para
los péptidos 3, G0, G5 y G10 utilizados en una cantidad de
0,01 \mug/pocillo. A esta concentración, el péptido 3 no detectó Z1F11 a ninguna concentración y el péptido G0 presentó únicamente una reactividad marginal. En contraste con ello, el G5 y el G10 presentaron una buena reactividad.
0,01 \mug/pocillo. A esta concentración, el péptido 3 no detectó Z1F11 a ninguna concentración y el péptido G0 presentó únicamente una reactividad marginal. En contraste con ello, el G5 y el G10 presentaron una buena reactividad.
Ejemplo
3
Se investigó el efecto de variar la distancia
entre el epítopo reactivo y el núcleo sobre la reactividad de la
molécula ramificada con el anticuerpo que se detecta. Se utilizó un
epítopo diferente al del Ejemplo 2.
Se sintetizaron tres péptidos (secuencia ID
número 4) como se ha descrito en el Ejemplo 1 (d) y (e). Se
designaron sueros humanos con los números 11 y 12 procedentes de
dos individuos positivos al anticuerpo HIV-1. Se
obtuvo un suero humano designado con el número 4 procedente de un
individuo negativo al anticuerpo HIV-1.
El ensayo ELISA se llevó a cabo de la siguiente
manera:
Se disolvieron péptidos en una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 mg/ml^{-1}.
Los péptidos se diluyeron seguidamente en PBS (solución salina
tamponada con fosfato) para formar soluciones que variaron de
concentración entre 1 mg/ml y 10 fg/ml. Se añadieron 100 \mul de
solución de péptido a cada pocillo, que representaron cantidades de
péptidos que variaron de 50 \mug a 1 fg. El procedimiento para
llevar a cabo el ensayo ELISA fue exactamente como se ha descrito en
el Ejemplo 2, excepto en que la solución de
PBS-Tween utilizada para lavar las placas fue PBS
que contenía el 0,05% de "Tween 20". Los resultados
proporcionados son todos la media de determinaciones duplicadas.
Los resultados se presentan en las Figuras 4, 5
y 6. Se ensayaron diferentes cantidades de péptidos, que variaron
de 50 \mug a 1 fg, en ensayos ELISA para determinar la reactividad
con sueros humanos procedente de dos individuos positivos al
anticuerpo HIV-1 (diluidos 1/100). Suero humano
procedentes de un individuo negativo al anticuerpo
HIV-1 sirvió como testigo.
La Figura 4 muestra que los péptidos monoméricos
reaccionaron menos fuertemente con sueros humanos positivos al
anticuerpo HIV-1 (números 11 y 12) que lo hizo el
péptido ramificado que no contenía espaciadores de glicina (G0)
mostrado en la Figura 5, que a su vez reaccionó peor que el péptido
ramificado que contenía cuatro espaciadores de glicina (G4)
mostrado en la Figura 6: ni el suero 11 ni el 12 fueron
significativamente reactivos con menos de 5x10^{-4} mg del
péptido ramificado G0, mientras que fueron reactivos con
concentraciones por lo menos 100 veces inferiores del péptido
ramificado G4.
Las siguientes reivindicaciones definen algunos
aspectos importantes de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Inventores
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos ramificados en ensayos para anticuerpos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- POBLACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete, 5,25 pulgadas, Kb de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE INSCRIPCIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: la secuencia aa está presente (a) en péptidos lineales y (b) en cada una de las 8 ramas de un péptido ramificado de fórmula ([(secuencia aa)(Gly)_{5}Lys]_{2} Lys)_{2} Lys Ala
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Pro Glu Asp Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: la secuencia está presente (a) en péptidos lineales y (b) en cada una de las 8 ramas de un péptido ramificado de fórmula molecular
\vskip0.500000\baselineskip
- (secuencia)_{8}-(lisina)_{7}-alanina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Gly Gln Glu Ser Ala Phe Glu Lys Glu
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: la secuencia está presente en péptidos lineales
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser His Gly Asp Pro Glu Asp Leu Asp Gly
Ala Ala Arg Ala Gly}
\sac{Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: la secuencia aa está presente (a) en péptidos lineales y (b) en cada una de las 8 ramas de un péptido ramificado de fórmula ([(secuencia aa)(Gly_{0 \ ó \ 4}Lys]_{2}Lys)_{2} Ala
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Phe
Tyr}
Claims (15)
1. Péptido ramificado que comprende porciones de
epítopo y un núcleo polifuncional; en el que las porciones de
epítopo están unidas al núcleo polifuncional mediante brazos
espaciadores, sobresaliendo así las porciones de epítopo del núcleo
polifuncional y presentando así una pluralidad de epítopos en el
interior de la misma molécula situada en sus ramas; en el que el
brazo espaciador presenta una longitud que es equivalente a la
longitud de un brazo espaciador proporcionada por desde por lo menos
4 a no más de 20 restos de glicina.
2. Péptido según la reivindicación 1, en el que
el brazo espaciador presenta una longitud que es equivalente a la
longitud de un brazo espaciador proporcionada por de 4 a 10 restos
de glicina.
3. Péptido según la reivindicación 2, en el que
el brazo espaciador presenta una longitud que es equivalente a la
longitud de un brazo espaciador proporcionada por de 4 a 7 restos de
glicina.
4. Péptido según la reivindicación 3, en el que
el brazo espaciador presenta una longitud que es equivalente a la
longitud de un brazo espaciador proporcionada por 5 restos de
glicina.
5. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que los brazos espaciadores
comprenden restos no hidrófobos de moléculas.
6. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones, en el que los brazos espaciadores comprenden los
aminoácidos.
7. Péptido según la reivindicación 6, en el que
la mayoría de los restos de aminoácidos consisten en glicina o
aminoácidos no polares.
8. Péptido según la reivindicación 7, en la que
la totalidad de los aminoácidos consisten en glicina.
9. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el núcleo comprende un resto
de una molécula polimérica derivada de x^{n}-1
moléculas, o un monómero polifuncional, en el que x es la
funcionalidad del monómero y por lo menos 2, y n es un número
entero.
10. Péptido según la reivindicación 9, en el que
x es igual a 2 ó 3 y n no excede de 20.
11. Péptido según la reivindicación 9 ó 10, en
el que el monómero es la lisina.
12. Composición que comprende un péptido
ramificado en contacto con un fluido corporal humano, en la que el
péptido ramificado comprende porciones de epítopo y un núcleo
polifuncional; en la que las porciones de epítopo están unidas al
núcleo polifuncional mediante brazos espaciadores, sobresaliendo así
las porciones de epítopos del núcleo polifuncional y presentando
así una pluralidad de epítopos en el interior de la misma molécula
situada en sus ramificaciones.
13. Kit para su utilización en un ensayo de
unión para analizar la presencia de anticuerpos en un fluido, que
comprende un péptido ramificado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, y por lo menos otro componente esencial
para la realización o la estandarización del ensayo diferente a un
kit para realizar un ensayo de una muestra de un fluido corporal de
un paciente que comprende un anticuerpo
anti-inmunoglobulina humana marcado para la
detección o la medición de la unión entre el péptido y los
anticuerpos en el fluido.
14. Kit según la reivindicación 13, para su
utilización en un ensayo de unión para analizar la presencia de
anticuerpos en un fluido corporal.
15. Kit según la reivindicación 13, que
comprende por lo menos un reactivo para la detección y la medición
de la unión entre el péptido y los anticuerpos en el fluido.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB9107434 | 1991-04-09 | ||
| GB919107434A GB9107434D0 (en) | 1991-04-09 | 1991-04-09 | Peptide-based assay |
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| IT1241395B (it) * | 1990-04-02 | 1994-01-10 | Eniricerche Spa | Composti immunogenici,il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria |
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