DE69233666T2

DE69233666T2 - Verzweigte Peptide zum Nachweis von Antikörpern

Info

Publication number: DE69233666T2
Application number: DE69233666T
Authority: DE
Inventors: Howard Marsden; John Herbert Subak-Sharpe
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1992-04-09
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2012-04-10
Also published as: EP0994121A2; ATE343587T1; ATE188483T1; DE69230530T2; ES2274591T3; DE69230530D1; EP0994121A3; ES2141105T3; EP0579661B1; EP0994121B1; DK0994121T3; DE69233666D1; WO1992018528A1; GB9107434D0; EP0579661A1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung aus der EP-A-92 907 955.6, eingereicht am 9. April 1992.
Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein verzweigtes Peptid, das in einem Assayverfahren verwendet werden kann, in welchem ein Peptid für die Feststellung von Antikörpern verwendet wird.
2. Beschreibung des technischen Hintergrundes
Synthetische Peptide, die kurzen, linearen Ausmaßen von Proteinsequenzen entsprechen, können von einigen Antikörpern, die gegen das gesamte Protein gerichtet sind, erkannt werden. Sie sind attraktive Reagenzien für eine Feststellung von Serumantikörpern, die gegen solche Proteine gerichtet sind, da sie relativ einfach zu synthetisieren und im allgemeinen preiswerter als das gesamte Protein herzustellen sind. Auf Peptiden basierende ELISA-Kits können für die Diagnose von HIV-Antikörpern in Aids-Patienten sensitiv und spezifisch sein, A. Närvänen et al., J. Med. Virology 26, 111–118 (1988), und sie sind jetzt handelsüblich erhältlich.
Synthetische Peptide wurden auch verwendet, um Antiseren herzustellen, die mit Proteinen, von welchen das Peptid einen linearen Anteil darstellt, reagieren, B. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5197–5200 (1980) und J.C. Sutcliffe et al., Nature 287, 801–805 (1980). In jüngerer Zeit wurden verzweigte Peptide verwendet, um Anti-Peptid-Antiseren hervorzubringen, die mit Proteinen reagieren, J.P. Tam, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 5409–5413 (1988); D.N. Possnett et al., J. Biol. Chem. 263, 1719–1725 (1988). Diese verzweigten Peptide bestehen aus einem kleinen zweifach verzweigten Polylysinkern, auf welchem das interessierende Peptid synthetisiert wird. Es wurde gezeigt, daß solche verzweigten Peptide hochgradig immunogen sind und in Mäusen eine größere Immunantwort hervorrufen als dies die entsprechenden linearen (monomeren) Peptide tun, G. Del Guidice et al., Eur. J. Immunol., 20, 1619–1622 (1990), und auch daß die Verwendung der verzweigten Peptide in Immunoassays ausgezeichnete Immunreaktivität liefern, wobei sie die Sensitivität und Zuverlässigkeit dieser Assays erhöhen, J. P. Tam und F. Zavala, J. Immunological Methods, 124, 53–61 (1989), wodurch sie ermöglichen, daß geringere Konzentrationen von Antigen verwendet werden, um Antikörper festzustellen.
Jedoch ist die Verwendung von synthetischen Peptiden als Reagenzien in Bindungsassays, wie ELISA, derzeit aufgrund ihrer hohen Kosten beschränkt.
Tam und Zavala ((1989) J. Immunol. Meth. 124:53–61) beschreiben ein Verfahren zum Detektieren von Antikörpern gegen synthetische Peptidantigene in Festphasen-Radioimmuntests unter Verwendung eines Systems mit Peptiden mit mehreren Antigenen (MAP).
Die EP 0 339 695 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines antigenen oder immunogenen Konjugats, wie eines mehrfach antigenen Peptidsystems, durch Umsetzen einer verzweigten Struktur auf Basis von Aminosäuren mit einer antigenen Verbindung.
Koman und Terenius ((1980) FEBS Lett. 118:293–5) beschreiben die Verwendung von bifunktionalen Enkephalin-Analogen für Affinitätstrennungszwecke.
McLean et al. ((1991) J. Immunol. Meth. 137:149–157) vergleichen die Immunogenität von verzweigten Peptiden mit derjenigen von Harz-verknüpften und Protein-konjugierten Peptiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun überraschend gefunden, daß verzweigte Peptide, welche zwischen dem epitophaltigen Anteil und dem polyfunktionalen Kern einen Abstandshalterarm (mit einer Länge, die zu der Länge, die von 4 bis zu nicht mehr als 20 Glycinresten gebildet wird, äquivalent ist) enthalten, einen deutlichen Vorteil gegenüber den entsprechenden monomeren Peptiden und gegenüber verzweigten Peptiden, denen solch ein Abstandshalterarm fehlt, in einem Bindungsassay haben, da sie bezogen auf das Gewicht zu einer deutlich höheren Sensitivität des Assays führen.
Obwohl verzweigte Peptide als hochgradig immunogen und als geeignet zur Herstellung von Antikörpern gegen das entsprechende lineare Peptid in den oben zitierten Veröffentlichungen beschrieben wurden und obwohl sie in ELISAs gegen Antikörper, die gegen Peptide gerichtet waren, verwendet wurden, war es höchst unerwartet zu finden, daß das Hinzufügen eines Abstandshalterarmes zu der verzweigten Struktur zwischen dem epitophaltigen Anteil und dem polyfunktionalen Kern die Immunogenität in solch einem Maße erhöhen würde, daß sie in Assays für die Feststellung von Antikörpern in sehr viel geringeren Mengen als ihre linearen Gegenstücke oder als die verzweigten Strukturen, in denen der epitophaltige Anteil ohne einen Abstandshalterarm direkt an den Kern gebunden war, verwendet werden könnten.
In einem Aspekt liefert die Erfindung solche Abstandshalter enthaltenden Peptide per se. Die epitophaltigen Anteile sind an Abstandshalterarme gebunden, die von einem polyfunktionalen Kern aus vorspringen und dabei Verzweigungen bilden, welche mehrere Epitope innerhalb desselben Moleküls präsentieren, die an dessen Verzweigungen angeordnet sind. Die Abstandshalterarme haben eine Länge, die zu der Länge, die von wenigstens 4 bis zu nicht mehr als 20 Glycinresten gebildet wird, äquivalent ist. Das Peptid kann in einem Verfahren zum Testen einer Flüssigkeit, insbesondere der Körperflüssigkeit (vorzugsweise Serum) eines Patienten hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern darin verwendet werden, in welchem man eine Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und einem Peptid mit einem Epitop dafür ausführt und das Auftreten oder das Ausmaß von Bindung feststellt bzw. mißt.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Kit, welches das verzweigte Peptid der Erfindung zusammen mit wenigstens einem anderen wichtigen Bestandteil zur Durchführung oder Standardisierung solch eines Assays, insbesondere wenigstens ein Reagens zur Feststellung oder Messung der Bindung, z. B. eines markierten Anti-Mensch-Immunglobulinantikörpers, enthält.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1, 2 und 3 sind Diagramme, welche die Reaktivität von verzweigten Peptiden, die Abstandshalterarme unterschiedlicher Längen enthalten, im Vergleich mit monomeren Peptiden und verzweigten Peptiden ohne Abstandshalterarme zeigen.
1 zeigt den Effekt von Abstandshalterarmen, die aus Glycinresten bestehen, auf die Fähigkeit von verzweigten Peptiden, Anti-Peptid-Antikörper festzustellen.
Die 2 und 3 zeigen den Effekt von Abstandshalterarmen, die aus Glycinresten bestehen, auf die Fähigkeit von verzweigten Peptiden, Anti-Peptid-Antikörper festzustellen. Die Menge an verzweigtem Peptid in jeder der Vertiefungen der Assayplatte beträgt 1 μg (2) oder 0,01 μg (3).
Die 4, 5 und 6 sind Diagramme, welche die Reaktivität von verzweigten Peptiden, die Abstandshalterarme von 4 Glycinresten enthalten, im Vergleich mit monomeren Peptiden und verzweigten Peptiden ohne Abstandshalterarme zeigen. Das Peptid war ein HIV-Epitop.
4 zeigt die Fähigkeit des monomeren Peptids, Anti-Peptid-Antikörper bei verschiedenen Konzentrationen des Peptids festzustellen.
Die 5 und 6 zeigen die Fähigkeit der verzweigten Peptide mit und ohne Abstandshalterarme, Anti-Peptid-Antikörper bei verschiedenen Konzentrationen von Peptid festzustellen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Begriff "Epitop", wie er hierin verwendet wird, bedeutet alle die Abschnitte eines Proteins, die mit einem Antikörper wechselwirken. Der Begriff "Abstandshalterarm", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Rest oder die Reste, welche zwischen dem Ende des Epitops, welches dem Kern am nächsten ist, und dem äußersten Verzweigungspunkt des Kerns liegen, aber, wo dieser Verzweigungspunkt von dem Rest einer polyfunktionalen Aminosäure geliefert wird, ist dieser Aminosäurerest von der Betrachtung ausgeschlossen. Der Begriff "epitophaltiger Anteil", wie er hier verwendet wird, bezeichnet das Epitop zusammen mit jeglichen Resten jenseits des Endes des Epitops am weitesten entfernt von dem Kern.
Die verzweigten Peptide der Erfindung können irgendwelche verzweigten Moleküle sein, in welchen das gleiche Peptidepitop mehr als einmal in dem Molekül auftritt und an mehr als einer Verzweigung vorhanden ist. Obwohl der Begriff "Peptid" impliziert, daß das Molekül hauptsächlich aus Peptidketten besteht und ein nicht natürliches Molekül ist, ist es nicht notwendig, daß das gesamte Molekül aus Aminosäuren zusammengesetzt ist. Ein Nichtpeptidkern oder nicht aus Peptiden bestehender Abstandshalter oder nicht aus Peptiden bestehende Verbindungsstücke zwischen einer Verzweigung und einer weiteren können umfaßt sein.
Der Abstandshalterarm erstreckt sich von dem zentralen Kern des Moleküls nach außen und enthält irgendwelche nicht voluminösen und nicht hydrophoben Reste. Am meisten bevorzugt um faßt das Abstandshalterarm-Molekül Reste von Aminosäuren. Der Begriff "unpolare Aminosäure", wie er hierin verwendet wird, umfaßt Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin. Vorzugsweise enthält der Abstandshalterarm einen Hauptanteil von Glycinresten (welches eine ungeladene polare Aminosäure ist) oder Reste aus unpolaren Aminosäuren. Die bevorzugte Länge des Abstandshalterarmes beträgt wenigstens 4 Aminosäurereste. Einen geringen Vorteil erhält man mit mehr als 20 Resten, da dann eine zu große Möglichkeit von Wechselwirkung zwischen solchen hochgradig flexiblen Verzweigungen untereinander bestehen kann. Der Abstandshalterarm hat eine Länge, die zu der Länge, die von wenigstens 4 bis zu nicht mehr als 20 Glyceinresten gebildet wird, äquivalent ist. Besonders bevorzugt sind Längen, äquivalent zu denjenigen, die von zwischen 4 und 10 Resten und am meisten bevorzugt von zwischen 4 und 7 Resten gebildet werden, wobei die besonders bevorzugte Länge derjenigen äquivalent ist, die von 5 Glycinresten gebildet wird.
Das Peptid der Erfindung enthält somit Verzweigungen, die sich von irgendeinem zentralen Kern eines Moleküls nach außen erstrecken können. Der zentrale Kern und die Abstandshalterarme sind nicht so übermäßig groß, daß sie den Assay stören, und erfüllen andererseits die Anforderungen an einen auf Antikörper gerichteten Assay. Da das Peptid in den meisten Fällen dazu gebracht wird, an einer festen Oberfläche, wie derjenigen einer Mikrotiterplatte, eines Tauchstabes oder derjenigen von Perlen zu haften, dürfen der Kern und die Abstandshalterarme daher diese Funktion nicht stören.
Der Kern enthält vorzugsweise selbst eine polyfunktionale Aminosäure oder ein Polymer davon, aber er könnte prinzipiell aus einem einfachen polyfunktionalen Molekül aufgebaut sein, wie einem Polyol, z. B. Trimethylolpropan, oder einem Polyamin oder aus einem verzweigten Oligomer, wie einem vernetzten Polyacrylat oder Polymethacrylat mit niedrigem Molekulargewicht. Besonders bevorzugt ist der Kern aus sich aufeinanderfolgend nach außen erstreckenden Verzweigungen aufgebaut und besteht oder enthält die Reste eines polymeren Moleküls, das von xⁿ – 1 Molekülen eines Monomers mit einer Polyfunktionalität x erhalten wurde, wobei x wenigstens 2 und üblicherweise 2 bis 4 beträgt und n eine ganze Zahl ist. Obwohl n prinzipiell keine Obergrenze hat, ist es wahrscheinlich, daß das Peptid chemisch synthetisiert wird und daher aus praktischen Gründen n wahrscheinlich selten 10 und noch seltener 20 überschreiten würde.
Im Interesse, den erwünschten Effekt in einem hochgradig lohnenden Ausmaß zu erzielen, ist n vorzugsweise wenigstens 3; somit wäre, wenn z. B. x 2 ist und n 3 ist, das Peptid ein verzweigtes Octamer. Das Monomer ist vorzugsweise eine basische Aminosäure, wie Lysin.
Der polyfunktionale Kern ist üblicherweise vollständig "gesättigt" durch Verzweigungen von Abstandshalterarmen, welche vorzugsweise Aminosäurereste enthalten, die sich von den funktionalen Gruppen aus erstrecken, üblicherweise durch Peptidbindungen zwischen funktionalen Aminogruppen des Kerns und Carboxylenden der Abstandshalterarmreste. Vorteilhaft sind alle Epitope über Abstandshalterarme an den Kern gebunden, obwohl, wenn eine Verringerung der Vorteile akzeptabel ist, einige direkt an den Kern gebunden sein können. Definitionsgemäß sind alle Abstandshalterarme an Epitop enthaltende Anteile gebunden. Dies geschieht üblicherweise durch Peptidbindungen zwischen den Aminogruppen der Abstandshalterarmreste und den Carboxylenden der epi tophaltigen Ketten. Ein einzelner Abstandshalterarm kann darauf ein Epitop oder mehrere Epitope tragen, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 2 oder 3 pro Arm.
Prinzipiell können die verzweigten Peptide jedoch so hergestellt sein, daß sie einige zusätzliche Arme haben, die äquivalent zu Abstandshalterarmen sind, aber keine Epitope gebunden haben. Dies würde wiederum normalerweise den Vorteil in solch einem Aufbau verringern.
Allgemein ausgedrückt wird das verzweigte Peptidmolekül der Erfindung nur eine Epitopart für eine Bindung an dafür spezifische Antikörper enthalten. Wenn zwei oder mehr Arten von Antikörpern in einem einzelnen Test festzustellen sind, z. B. wenn eine Krankheit von zwei oder mehr infektiösen Stoffen verursacht werden könnte, die keine geeigneten üblichen Epitope haben, und wenn die Krankheit auf die gleiche Weise behandelt wird, unabhängig davon, welcher infektiöse Stoff verantwortlich ist, könnte das Peptid natürlich verschiedene Epitope enthalten. Alternativ könnte der Assay unter Verwendung getrennter verzweigter Peptide der Erfindung, von denen jedes ein einzelnes Epitop enthält, durchgeführt werden. Um die Möglichkeit falscher Positiver zu vermeiden, wird das Peptid keine Verbindungsstücke enthalten, die eine Bindungsreaktion mit anderen Antikörpern oder eine unspezifische Bindungsreaktion eingehen. Es wird daher keine Abschnitte von irgendwelchen Proteinen enthalten, die solche Effekte erzeugen könnten.
Die Peptide können nach irgendeinem der gut bekannten synthetischen Verfahren hergestellt werden, wie z. B. von Tam oder von Posnett et al., die oben zitiert sind, beschrieben wurde, jedoch ist das Fmoc-Verfahren, wie es z. B. von H. Lankinen et al., J. Gen. Virol. 70, 3159–3169 (1989) beschrieben ist, besonders geeignet.
Das Peptid der Erfindung kann in jeder für die Feststellung von Antikörpern geeigneten Weise verwendet werden, insbesondere an einer geeigneten Flüssigkeit, insbesondere einer Körperflüssigkeit, die üblicherweise Antikörper enthält. Obwohl Serum die übliche Körperflüssigkeit ist, können andere Flüssigkeiten, die bestimmte Immunglobuline enthalten, z. B. Tränen, Speichel oder Milch, untersucht werden.
Die Erfindung ermöglicht es, kleine Peptidmengen zu verwenden, wobei die erforderliche Menge an verzweigtem Peptid der Erfindung normalerweise geringer ist als diejenige ihres linearen Gegenstücks oder ihres verzweigten Gegenstücks, wobei das verzweigte Gegenstück keinen Abstandshalterarm enthält. Der Vergleich berechnet sich bezüglich des Gesamtgewichts an verzweigtem Peptid, einschließlich Kern und Abstandshalterarm, gegenüber dem Gesamtgewicht des linearen Peptids der gleichen oder im wesentlichen gleichen Aminosäurezusammensetzung. Der Vergleich kann entweder bezüglich der Menge an Peptid, die erforderlich ist, eine vorgegebene Signalhöhe zu erzielen, oder bezüglich der Konzentration von Antikörper in Serum, welcher unter Verwendung einer vorgegebenen Menge des Peptides festgestellt werden kann, vorgenommen werden.
In der üblichen Praxis wird der Assay heterogen durch Bindung des verzweigten Peptides der Erfindung an einen unlöslichen Träger, wie die Kunststoffoberfläche einer Mikrotiterplatte, durchgeführt, obwohl die Erfindung nicht auf solche Assays beschränkt ist. Bei einem Sandwich-Assay wird das Antiserum mit dem Peptid für einen geeigneten Zeitraum, um eine Bindung zu ermöglichen, und mit einem Antikörper gegen das Immunglobulin inkubiert. Wenn der Patient z. B. ein Mensch und der Antikörper von der IgG-Klasse ist, wird daher ein Anti-Mensch-IgG-Antikörper, der in geeigneter Weise markiert ist, hinzugegeben, die Platte gewaschen und die Menge an Markierung, die an die Platte (über den Antikörper und das Peptid) gebunden ist, gemessen. Alternativ kann ein Konkurrenz-Assay durchgeführt werden, bei welchem man eine bekannte Menge von markiertem Antikörper mit dem Serum konkurrieren oder dieses von seiner Bindung verdrängen läßt. Solch ein Assay ist jedoch für die Feststellung geringer Antikörperkonzentrationen weniger geeignet. Es können irgendwelche der üblichen Markierungen, z. B. radioaktive Markierungen und Enzymmarkierungen, verwendet werden, insbesondere Peroxidase und alkalische Phosphatase. Radioaktive Markierungen können durch radioaktive Zählung und Enzymmarkierungen z. B. durch ein kolorimetrisches, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzsignal untersucht werden. Es kann ein Feststellungsverstärkungsverfahren, wie "Ampak" (registrierte Marke) von Nordisk Diagnostics Ltd., welches eine alkalische Phosphatase-Enzymmarkierung erfordert, verwendet werden, um den Assay noch empfindlicher zu machen.
Die Menge an Peptid, die pro Assay, z. B. pro Vertiefung einer Platte, zu verwenden ist, wird normalerweise geringer sein als 5 μg, vorzugsweise geringer als 1 μg und besonders bevorzugt geringer als 0,1 μg. Die in einem bestimmten Fall geeignetste Menge hängt von der Art des verwendeten Epitops ab. In einer herkömmlichen Mikrotiterplatte mit einer Kapazität von 100 μl pro Vertiefung hätte die verwendete Peptidlösung dann weniger als 5 μg.
In einem Kit zur Durchführung des Assays sind die wesentlichen Bestandteile in den meisten Fällen das verzweigte Peptid der Erfindung und ein immunglobulinmarkierter Anti-Mensch-Antikörper. Diese werden natürlich in dem Kit in getrennten Behältern geliefert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Peptide der Erfindung. "Tween" ist eine registrierte Marke.
Beispiel 1
Synthese linearer und verzweigter Peptide
Peptide wurden mittels Dauerfluß-Fmoc-Chemie unter Verwendung eines LKB Peptidsynthetisierers und nach einem Verfahren, welche von H. Lankinen et al., J. Gen. Virol., 70, 3159–3169 (1989), beschrieben ist, synthetisiert. Nach der Synthese wurden Seitenkettenschutzgruppen durch Behandlung mit 95% Trifluoressigsäure in Wasser (plus 4% w/v Phenol für die argininhaltigen Peptide oder 3% w/v Phenol plus 2% Ethandithiol für cystein- und argininhaltige Peptide) entfernt.
Relative molekulare Massen der linearen Peptide wurden mittels Massenspektometrie (M-Scan Ltd.) bestimmt, welche Werte lieferte, die mit den erwarteten identisch waren. Die Aminosäurezusammensetzung verzweigter Peptide wurde mittels Aminosäureanalyse (Cambridge Research Biochemicals) bestimmt und war wiederum in Übereinstimmung mit den Erwartungen. Die Reinheit von Peptiden wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer "Dynamax" Analysesäule (4,6 mm innerer Durchmesser x 25 cm Länge, 300A C8 Säule, Katalog Nr. 83-303-C) unter Anwendung eines Gradienten von 0%–95% Acetonitril in Wasser über eine Zeitdauer von 20 Minuten und mit einer Strömungsrate von 0,5 ml/min überprüft. Reinheiten lagen im Bereich von 61 % bis 91 %.
Die synthetisierten Peptide sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 – in Beispiel 1 verwendete Peptide

(a) Verzweigte Peptide wurden synthetisiert. Die verzweigten Peptide der Erfindung bestanden aus 8 Kopien der epitopischen Aminosäuresequenz (aa seq), von denen jede über den COOH-Terminus mit der terminalen NH₂-Gruppe eines Abstandshalterarmrestes und daher mit einem verzweigenden Lysinkern, dessen allgemeine Formel nachfolgend gezeigt ist, verbunden war. Zu Vergleichszwecken wurden auch verzweigte Peptide hergestellt, denen der Abstandshalterarm fehlte, wobei der COOH-Terminus des Epitops dann direkt an eine NH₂-Gruppe eines Lysinrestes des Kerns gebunden war.
Der Abstandshalterarm bestand aus Glycinresten. Es wurden 9 Peptide synthetisiert, in welchen die Anzahl von Glycinresten in dem Abstandshalterarm 0, 1, 2, 4, 5, 7, 10, 15 und 20 (bezeichnet als G0, G1, G2, G4, G5, G7, G10, G15 und G20) betrug. Dieses Epitop wird von dem monoklonalen Antikörper Z1F11 erkannt.
(b) Als Kontrollen wurden sowohl verzweigte (2A) als auch monomere (2B) Formen eines Peptides ohne Beziehung synthetisiert. Die verzweigte Form hatte die gleiche allgemeine Formel, wie sie für (a) oben angegeben ist, mit der Ausnahme, daß zwischen dem epitophaltigen Anteil und dem Lysinkern kein Abstandshalterarm war. (M.S. Chee et al., Current topics in Microbiology and Immunology, 154, 125–169 (1990)). Dieses Peptid enthielt nicht das von Z1F11 erkannte Epitop.
(c) Als Kontrolle wurde eine monomere Form eines Peptides, welches das gleiche Epitop wie in (a) enthielt, hergestellt (D. J. McGeoch et al., J. Gen. Virol., 69, 1531–1574 (1988)).
(d) Die monomere Form dieses Peptids wurde synthetisiert (Simmonds et al), J. of Virol. 65, 6266–6276 [1991]), und ist innerhalb der prinzipneutralisierenden Determinante enthalten (Javerahian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6768–6772 [1989]).
(e) Es wurden verzweigte Formen des Peptides hergestellt, welche kein (G0) oder vier (G4) Glycinabstandshalter enthielten.

Beispiel 2
Enzymverbundener Immuonosorbent-Assay (ELISA)
Der Effekt der Variation des Abstandes zwischen dem reaktiven Epitop und dem Kern auf die Reaktvitität des verzweigten Moleküls mit dem feststellenden Antikörper wurde untersucht.
Es wurden neun Peptide (Sequenz-ID-Nummer 1) synthetisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Der monoklonale Antikörper Z1F11 (P. Schenk et al.,. J. Gen. Virol., 69, 99–111 (1988)), ein gegen das Herpes simplex-Virus HSV-1 gerichteter monoklonaler Antikörper, wurde in dem ELISA-Assay verwendet, da zuvor gezeigt wurde, daß dieser das Sequenzepitop GDPEDLD erkennt (M. Murphy et al., J. Gen. Virol., 70, 2357–2364 (1989)).
Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt:
Peptide wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Die Peptide wurden anschließend in PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) zu Lösungen, deren Konzentrationen zwischen 1 mg/ml^–1 und 1 pg/ml variierten, verdünnt. 100 μl Peptidlösung wurden in jede Vertiefung gegeben, was Mengen an Peptiden im Bereich von 100 μg bis herab zu 100 fg entsprach. Die Peptide wurden bei 37°C über Nacht an die Platte adsorbieren gelassen. Überschuß an Antigenlösung wurde entfernt und die Platten in einer Lösung, welche 1% BSA enthielt, für 1 Stunde bei 37°C blockiert. Die Platten wurden anschließend dreimal in PBS, welches 0,01% "Tween-20" (PBS-Tween) enthielt, gewaschen und mit 100 μl der geeigneten Antikörperverdünnung bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Zur Feststellung von gebundenen Antikörpern wurden die Platten fünfmal in PBS-Tween gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit 100 μl pro Vertiefung eines Meerrettichperoxidase-Schaf-Anti-Maus-Konjugates (SAPU) (1000fach in PBS verdünnt) inkubiert. Die Platten wurden anschließend siebenmal in PBS-Tween gewaschen und mit einer 50 μg/ml Lösung des Enzymsubstrates 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) [ABTS] in Citrat-Phosphatpuffer, welcher 0,01 % Wasserstoffperoxid enthielt, zur Reaktion gebracht. Nach 15 Minuten des Farbveränderungsverlaufs wurden die Platten in einem Titerek Multiscan Plattenleser bei 405 nm abgelesen. Die angegebenen Ergebnisse sind alle der Mittelwert aus Doppelbestimmungen.
Die Ergebnisse des ersten Experiments sind in 1 dargestellt, wobei unterschiedliche Mengen an Peptiden im Bereich von 100 μg bis herab zu 100 fg in ELISA-Assays bezüglich Reaktivität mit Z1F11 (1/2000 verdünnt) untersucht wurden. Die Kontrollen umfaßten: monoklonalen Antikörper HCMV-3 (ein gegen humanes Cytomegalovirus gerichteter Antikörper, von dem man nicht erwarten würde, daß er mit irgendeinem der Peptide der Sequenz-ID-Nummern 1, 2 oder 3 reagiert) anstelle von Z1F11, Peptid 2 (Tabelle 1) sowohl in der verzweigten 2A und der monomeren 2B Form, wie in Beispiel 1 beschrieben, und monomeres Peptid Sequenz-ID-Nummer 3 (Tabelle 1), welches das Z1F11-reaktive Epitop enthält. Die Figur zeigt, daß alle verzweigten Peptide, welche die Sequenz GDPEDLD enthielten, stärker mit Z1F11 reagierten als das monomere Peptid, welches diese Sequenz enthielt (Sequenz-ID-Nummer 3). Jedoch gab es einen deutlichen Unterschied zwischen dem verzweigten Peptid (Sequenz-ID-Nummer 1) ohne Glycinabstandshalter (G0), welches nur geringfügig reaktiver war als das monomere Peptid, und dem verzweigten Peptid mit einem Glycinabstandshalter (G1): bei 100 μg Peptid pro Vertiefung lieferte G1 die zweifache Absorption derjenigen, die von G0 erzeugt wurde, und es wurde 10⁴fach mehr G0 als G1 benötigt, um eine Absorption von 0,5 zu erzeugen. Zusätzliche Glycinreste erhöhten die Absorption für Peptidmengen von 10 pg pro Vertiefung fortlaufend weiter, obwohl die Peptide G5 und G7 bei niedrigen Konzentrationen am empfindlichsten zu sein schienen. Die Kontrollen verhielten sich wie erwartet dahingehend, daß erstens der Kontrollantikörper HCMV-3 mit keinem Peptid bei irgendeiner Konzentration reagierte (es sind nur die Reaktionsdaten dieses Antikörpers mit dem Peptid G10 gezeigt), zweitens Z1F11 nicht mit den Peptiden ohne Bezug der Sequenz-ID-Nummer 2A (verzweigt) und der Sequenz-ID-Nummer 2B (monomer) reagierte und drittens Z1F11 in Abwesenheit von Peptid nicht reaktiv war.
Die Ergebnisse des zweiten Experiments sind in den 2 und 3 dargestellt. Die Wirkung der Länge des Glycinabstandshalters auf die Empfindlichkeit, mit der verzweigte Peptide (Sequenz-ID-Nummer 1) Z1F11 feststellen konnten, wurde untersucht. Drei verschiedene Mengen von Peptid wurden getestet: 0,01 μg, 1 μg und 100 μg. Alle lieferten im wesentlichen das gleiche Ergebnis, und in den 2 bzw. 3 sind nur die Daten für 1 μg pro Vertiefung bzw. 0,01 μg pro Vertiefung wiedergegeben. Die Reaktivität der Peptide wurde gegen Verdoppelungsverdünnungen von Z1F11 im Bereich von 1/250 bis 1/64000 untersucht. Die Ergebnisse für verzweigte Peptide, die in einer Konzentration von 1 μg/Vertiefung verwendet wurden, sind in 2 gezeigt. Hier waren alle Formen des verzweigten Peptides erheblich reaktiver als das monomere Kontrollpeptid (Sequenz-ID-Nummer 3). Die Wirkung war besonders deutlich mit vier oder mehr Glycinresten. Bei 64000facher Verdünnung lieferte Z1F11 eine Absorption von 0,5 mit dem G4-Peptid, wogegen der Antikörper zur Erzeugung der gleichen Absorption mit dem Peptid G0 nur 250fach verdünnt werden konnte. Zusätzliche Glycinreste erhöhten die Reaktivität des verzweigten Peptides nicht wesentlich. Aus diesem Experiment wird geschlußfolgert, daß ein Abstandshalter von vier oder mehr Glycinresten die Empfindlichkeit für die Feststellung des Antikörpers Z1F11 um wenigstens das 256fache erhöht.
Die Ergebnisse für die Peptide 3, G0, G5 und G10, welche mit 0,01 μg/Vertiefung verwendet wurden, sind in 3 gezeigt. Bei dieser Konzentration stellte Peptid 3 Z1F11 bei keiner Konzentration fest, und das G0-Peptid zeigte nur geringfügige Reaktivität. Im Gegensatz dazu zeigten G5 und G10 gute Reaktivität
Beispiel 3
Enzymverbundener Immunosorbent-Assay
Es wurde die Wirkung der Variation des Abstandes zwischen dem reaktiven Epitop und dem Kern auf die Reaktivität des verzweigten Moleküls mit dem feststellenden Antikörper untersucht. Es wurde ein gegenüber dem in Beispiel 2 verwendeten verschiedenes Epitop verwendet.
Drei Peptide (Sequenz-ID-Nummer 4) wurden synthetisiert, wie in Beispiel 1 (d) und (e) beschrieben. Menschliche Seren, bezeichnet mit den Nummern 11 und 12, stammten aus zwei bezüglich HIV-1-Antikörper positiven Individuen. Menschliches Serum, bezeichnet mit der Nummer 4, wurde aus einem bezüglich HIV-1-Antikörper negativen Individuum erhalten.
Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt:
Peptide wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 1 mg/ml^–1 gelöst. Die Peptide wurden anschließend in PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) zu Lösungen, deren Konzentrationen zwischen 1 mg/ml und 10 fg/ml variierten, verdünnt. 100 μl Peptidlösung wurden in jede Vertiefung gegeben, was Peptidmengen im Bereich von 50 μg bis herab zu 1 fg entsprach. Das Verfahren zur Durchführung des ELISA war genau dasjenige, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die zum Waschen der Platten verwendete PBS-Tween-Lösung PBS war, welches 0,05% "Tween-20" enthielt. Die angegebenen Ergebnisse sind alle der Mittelwert von Doppelbestimmungen.
Die Ergebnisse sind in den 4, 5 und 6 gezeigt. Es wurden verschiedene Mengen von Peptiden im Bereich von 50 μg bis herab zu 1 fg in ELISA-Assays bezüglich der Reaktivität mit menschlichen Seren aus den zwei bezüglich HIV-1-Antikörper positiven Individuen (1/100 verdünnt) untersucht. Menschliche Seren aus einem bezüglich HIV-1-Antikörper negativen Individuum dienten als Kontrolle.
4 zeigt, daß die monomeren Peptide schwächer mit bezüglich HIV-1-Antikörper positiven menschlichen Seren (Nummern 11 und 12) reagierten als das verzweigte Peptid, welches keine Glycinabstandshalter enthielt (G0), dargestellt in 5, welches wiederum schlechter reagierte als das verzweigte Peptid, welches vier Glycinabstandshalter enthielt (G4), dargestellt in 6: weder die Seren 11 noch 12 waren mit weniger als 5 × 10^–4 μg des G0-verzweigten Peptides in bedeutsamer Weise reaktiv, wogegen sie mit wenigstens 1000fach geringeren Konzentrationen des G4-verzweigten Peptides reagierten.
Die nachfolgenden Patentansprüche definieren einige wichtige Gesichtspunkte der Erfindung.

Claims

Verzweigtes Peptid, welches Epitopabschnitte und einen polyfunktionalen Kern umfaßt, wobei die Epitopabschnitte mittels Abstandsarmen an den polyfunktionalen Kern angebunden sind, wodurch die Epitopabschnitte von dem polyfunktionalen Kern vorstehen und dadurch eine Vielzahl von Epitopen innerhalb desselben Moleküls präsentieren, die auf seinen Verzweigungen angeordnet sind, wobei der Abstandsarm eine Länge hat, die gleich der Länge eines Abstandsarms ist, der durch wenigstens 4 bis zu nicht mehr als 20 Glycinresten bereitgestellt wird.
Peptid nach Anspruch 1, wobei der Abstandsarm eine Länge hat, die gleich der Länge eines Abstandsarms ist, der durch 4 bis 10 Glycinreste bereitgestellt wird.
Peptid nach Anspruch 2, wobei der Abstandsarm eine Länge hat, die gleich der Länge eines Abstandsarms ist, der durch 4 bis 7 Glycinreste bereitgestellt wird.
Peptid nach Anspruch 3, wobei der Abstandsarm eine Länge hat, die gleich der Länge eines Abstandsarms ist, der durch 5 Glycinreste bereitgestellt wird.
Peptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Abstandsarm nicht-hydrophobe Molekülreste umfaßt.
Peptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Abstandsarme Aminosäuren umfassen.
Peptid nach Anspruch 6, wobei die Mehrzahl der Aminosäurereste Glycin oder nicht-polare Aminosäuren sind.
Peptid nach Anspruch 7, wobei alle Aminosäuren Glycin sind.
Peptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Kern einen Rest eines polymeren Moleküls, abgeleitet von xⁿ – 1 Molekülen, oder ein polyfunktionales Monomer umfaßt, wobei x die Funktionalität des Monomers ist und wenigstens 2 ist und n eine ganze Zahl ist.
Peptid nach Anspruch 9, wobei x 2 oder 3 ist und n nicht größer als 20 ist.
Peptid nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Monomer Lysin ist.
Zusammensetzung, welche ein verzweigtes Peptid umfaßt, das mit einer menschlichen Körperflüssigkeit in Kontakt steht, wobei das verzweigte Peptid Epitopabschnitte und einen polyfunktionalen Kern umfaßt, wobei die Epitopabschnitte mittels Abstandsarmen an den polyfunktionalen Kern angebunden sind, wodurch die Epitopabschnitte von dem polyfunktionalen Kern vorstehen und dadurch innerhalb desselben Moleküls eine Vielzahl von Epitopen präsentieren, die auf seinen Verzweigungen angeordnet sind.
Kit für die Verwendung in einem Bindungsassay zum Untersuchen des Vorhandenseins von Antikörpern in einer Flüssigkeit, welcher ein verzweigtes Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und wenigstens eine weitere zum Durchführen oder Standardisieren der Untersuchung notwendige Komponente umfaßt, welcher kein Kit zum Durchführen einer Untersuchung einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten ist, die zum Erfassen oder Messen der Bindung zwischen dem Peptid und den Antikörpern in der Flüssigkeit einen markierten Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörper umfaßt.
Kit nach Anspruch 13 für die Verwendung in einem Bindungsassay zum Untersuchen des Vorhandenseins von Antikörpern in einer Körperflüssigkeit.
Kit nach Anspruch 13, welcher wenigstens ein Reagens zum Erfassen oder Messen von Bindungen zwischen dem Peptid und den Antikörpern in dem Fluid umfaßt.