DE69230530T2

DE69230530T2 - Verzweigte peptide zum nachweis von antikörpern

Info

Publication number: DE69230530T2
Application number: DE69230530T
Authority: DE
Inventors: Sinkinson Marsden; Herbert Subak-Sharpe
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1992-04-09
Publication date: 2000-07-06
Anticipated expiration: 2012-04-10
Also published as: DE69230530D1; EP0994121A2; ATE188483T1; ATE343587T1; EP0579661A1; DE69233666D1; DE69233666T2; EP0579661B1; GB9107434D0; EP0994121B1; ES2274591T3; EP0994121A3; ES2141105T3; WO1992018528A1; DK0994121T3

Description

Verzweigte Peptide zum Nachweis von Antikörpern

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Assayverfahren, in welchem ein Peptid für die Feststellung von Antikörpern verwendet wird.

2. Beschreibung des technischen Hintergrundes

Synthetische Peptide, die kurzen, linearen Ausmaßen von Proteinsequenzen entsprechen, können von einigen Antikörpern, die gegen das gesamte Protein gerichtet sind, erkannt werden. Sie sind attraktive Reagenzien für eine Feststellung von Serumantikörpern, die gegen solche Proteine gerichtet sind, da sie relativ einfach zu synthetisieren und im allgemeinen preiswerter als das gesamte Protein herzustellen sind. Auf Peptiden basierende ELISA-Kits können für die Diagnose von HIV-Antikörpern in Aids-Patienten sensitiv und spezifisch sein, A. Närvänen et al., J. Med. Virology 26, 111-118 (1988), und sie sind jetzt handelsüblich erhältlich.
Synthetische Peptide würden auch verwendet, um Antiseren herzustellen, die mit Proteinen, von welchen das Peptid einen linearen Anteil darstellt, reagieren, B. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5197-5200 (1980) und J.C. Sutcliffe et al., Nature 287, 801-805 (1980). In jüngerer Zeit wurden verzweigte Peptide verwendet, um Anti-Peptid-Antiseren hervorzubringen, die mit Proteinen reagieren, J.P. Tam, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 5409-5413 (1988); D.N. Possnett et al., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988). Diese verzweigten Peptide bestehen aus einem kleinen zweifach verzweigten Polylysinkern, auf welchem das interessierende Peptid synthetisiert wird. Es wurde gezeigt, daß solche verzweigten Peptide hochgradig immunogen sind und in Mäusen eine größere Immunantwort hervorrufen als dies die entsprechenden linearen (monomeren) Peptide tun, G. Del Guidice et al., Eur. J. Immunol., 20, 1619-1622 (1990), und auch daß die Verwendung der verzweigten Peptide in Immunoassays ausgezeichnete Immunreaktivität liefern, wobei sie die Sensitivität und Zuverlässigkeit dieser Assays erhöhen, J.P. Tam und F. Zavala, J. Immunological Methods, 124, 53-61 (1989), wodurch sie ermöglichen, daß geringere Konzentrationen von Antigen verwendet werden, um Antikörper festzustellen.
Die oben zitierte Veröffentlichung aus 1988 von Tam verwendet einen ELISA, um zu überprüfen, ob die verzweigten Peptide immunogen sind. Daher beschreibt sie unter der Überschrift "Test of the MAP to Elicit Specific Antisera" die Reaktion identifizierter verzweigter Peptide mit Peptidresten von 9-16 Aminosäuren, ausgehend von einer 8-valenten Lysin- Kernmatrix, mit einem polyklonalen Antikörper, der gegen das verzweigte Peptid gerichtet ist.
Sie beschreibt auch einen kompetitiven ELISA, in welchem das "monomere" (unverzweigte) Peptid mit dem verzweigten Peptid um eine begrenzte Menge des Antikörpers konkurriert. Ein anderer Teil der gleichen Veröffentlichung mit der Überschrift "Concept and Design" beschreibt, daß die verzweigten Peptide ein Triglycyl-Verbindungsstück oder - Verlängerungsstück aufweisen, das Peptide von 6-15 Aminosäureresten mit der Kernmatrix (verzweigter Träger), welche 3-15 trifunktionale Aminosäuren hat, verbindet.
Die oben zitierte Veröffentlichung aus 1989 von Tam et al., welche im März 1989 und damit nach der Veröffentlichung der Druckschrift aus 1988 von der Zeitschrift erhalten wurde, betrifft die Verwendung von verzweigten Peptiden in Immunoassays, jedoch wird hierin nicht auf Verbindungsstücke bezug genommen, obwohl man rückblickend annehmen könnte, daß ein 17 Reste langes Peptid (Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn)&sub2;Gly aus einem 16 Reste langen Epitoppeptid und einem einzelnen Glycinverbindungsstück besteht.
Jedoch ist die Verwendung von synthetischen Peptiden als Reagenzien in Bindungsassays, wie ELISA, derzeit aufgrund ihrer hohen Kosten beschränkt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun überraschend gefunden, daß verzweigte Peptide, welche zwischen dem Epitopanteil und dem polyfunktionalen Kern einen Abstandshalterarm mit einer Länge, die zu 4- 20 Glycinresten äquivalent ist, enthalten, einen deutlichen Vorteil gegenüber den entsprechenden monomeren Peptiden und gegenüber verzweigten Peptiden, denen solch ein Abstandshalterarm fehlt, in einem Bindungsassay haben, da sie bezogen auf das Gewicht zu einer deutlich höheren Sensitivität des Assays führen.
Obwohl verzweigte Peptide als hochgradig immunogen und als geeignet zur Herstellung von Antikörpern gegen das entsprechende lineare Peptid in den oben zitierten Veröffentlichungen beschrieben wurden und obwohl sie in ELISAs gegen Antikörper, die gegen Peptide gerichtet waren, verwendet wurden, war es höchst unerwartet zu finden, daß das Hinzufügen eines Abstandshalterarmes zu der verzweigten Struktur zwischen dem epitophaltigen Anteil und dem polyfunktionalen Kern die Immunogenität in solch einem Maße erhöhen würde, daß sie in Assays für die Feststellung von Antikörpern in sehr viel geringeren Mengen als ihre linearen Gegenstücke oder als die verzweigten Strukturen, in denen der epitophaltige Anteil ohne einen Abstandshalterarm direkt an den Kern gebunden war, verwendet werden könnten.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Testen der Körperflüssigkeit (vorzugsweise Serum) eines Patienten hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern darin, in welchem man eine Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und einem Peptid mit einem Epitop dafür ausführt und das Auftreten oder das Ausmaß von Bindung feststellt bzw. mißt, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine verzweigte molekulare Struktur hat, in der Epitopanteile an Abstandshalterarme gebunden sind, welche Aminosäurereste umfassen, die von einem polyfunktionalen Kern aus vorspringen und dabei Verzweigungen bilden, welche mehrere solcher Epitope innerhalb desselben Moleküls präsentieren, die an dessen Verzweigungen angeordnet sind, wobei jeder Abstandshalterarm äquivalente Länge zu der hat, die von 4-20 Glycinresten erhalten wird.
Die Erfindung liefert weiterhin die Verwendung der verzweigten Peptide der Erfindung in solch einem Bindungsassay und ein Kit, welches das verzweigte Peptid der Erfindung zusammen mit wenigstens einem anderen wichtigen Bestandteil zur Durchführung oder Standardisierung solch eines Assays, insbesondere wenigstens ein Reagens zur Feststellung oder Messung der Bindung, z. B. eines markierten Anti-Mensch-Immunglobulinantikörpers, enthält.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1, 2 und 3 sind Diagramme, welche die Reaktivität von verzweigten Peptiden, die Abstandshalterarme unterschiedlicher Längen enthalten, im Vergleich mit monomeren Peptiden und verzweigten Peptiden ohne Abstandshalterarme zeigen.
Fig. 1 zeigt den Effekt von Abstandshalterarmen, die aus Glycinresten bestehen, auf die Fähigkeit von verzweigten Peptiden, Anti-Peptid-Antikörper festzustellen.
Fig. 2 und 3 zeigen den Effekt von Abstandshalterarmen, die aus Glycinresten bestehen, auf die Fähigkeit von verzweigten Peptiden, Anti-Peptid-Antikörper festzustellen. Die Menge an verzweigtem Peptid in jeder der Vertiefungen der Assayplatte beträgt 1 ug (Fig. 2) oder 0,01 ug (Fig. 3).
Fig. 4, 5 und 6 sind Diagramme, welche die Reaktivität von verzweigten Peptiden, die Abstandshalterarme von 4 Glycinresten enthalten, im Vergleich mit monomeren Peptiden und verzweigten Peptiden ohne Abstandshalterarme zeigen. Das Peptid war ein HIV-Epitop.
Fig. 4 zeigt die Fähigkeit des monomeren Peptids, Anti-Peptid-Antikörper bei verschiedenen Konzentrationen des Peptids festzustellen.
Fig. 5 und 6 zeigen die Fähigkeit der verzweigten Peptide mit und ohne Abstandshalterarme, Anti-Peptid-Antikörper bei verschiedenen Konzentrationen von Peptid festzustellen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Der Begriff "Epitop", wie er hierin verwendet wird, bedeutet alle die Abschnitte eines Proteins, die mit einem Antikörper wechselwirken. Der Begriff "Abstandshalterarm", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Rest oder die Reste, welche zwischen dem Ende des Epitops, welches dem Kern am nächsten ist, und dem äußersten Verzweigungspunkt des Kerns liegen, aber, wo dieser Verzweigungspunkt von dem Rest einer polyfunktionalen Aminosäure geliefert wird, ist dieser Aminosäurerest von der Betrachtung ausgeschlossen. Das Peptid kann zusätzlich zu dem "Epitopanteil" Reste jenseits des Endes des Epitops am weitesten entfernt von dem Kern umfassen.
Die verzweigten Peptide der Erfindung können irgendwelche verzweigten Moleküle sein, in welchen das gleiche Peptidepitop mehr als einmal in dem Molekül auftritt und an mehr als einer Verzweigung vorhanden ist. Obwohl der Begriff "Peptid" impliziert, daß das Molekül hauptsächlich aus Peptidketten besteht und ein nicht natürliches Molekül ist, ist es nicht notwendig, daß das gesamte Molekül aus Aminosäuren zusammengesetzt ist. Ein Nichtpeptidkern oder teilweise nicht aus Peptiden bestehender Abstandshalter oder nicht aus Peptiden bestehende Verbindungsstücke zwischen einer Verzweigung und einer weiteren können umfaßt sein.
Die Abstandshalterarme erstrecken sich von dem zentralen Kern des Moleküls nach außen und enthalten Reste von Aminosäuren. Vorzugsweise umfassen die Abstandshalterarme irgendwelche nicht voluminösen und nicht hydrophoben molekularen Reste. Der Begriff "unpolare Aminosäure", wie er hierin verwendet wird, umfaßt Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin. Vorzugsweise enthält der Abstandshalterarm einen Hauptanteil von Glycinresten (welches eine ungeladene polare Aminosäure ist) oder Reste aus unpolaren Aminosäuren. Die bevorzugte Länge des Abstandshalterarmes beträgt wenigstens 4 Aminosäurereste, aber auch ein einzelner Rest hat einen geringen Effekt. Einen geringen Vorteil erhält man mit mehr als 20 Resten, da dann eine zu große Möglichkeit von Wechselwirkung zwischen solchen hochgradig flexiblen Verzweigungen untereinander bestehen kann. Besonders bevorzugt sind Längen, äquivalent zu denjenigen, die von zwischen 4 und 10 Glycinresten, besonders bevorzugt zwischen 4 und 7 Resten gebildet werden, wobei die besonders bevorzugte Länge derjenigen äquivalent ist, die von 5 Glycinresten gebildet wird.
Das Peptid der Erfindung enthält somit Verzweigungen, die sich von irgendeinem zentralen Kern eines Moleküls nach außen erstrecken können. Der zentrale Kern und die Abstandshalterarme sind nicht so übermäßig groß, daß sie den Assay stören, und erfüllen andererseits die Anforderungen an einen auf Antikörper gerichteten Assay. Da das Peptid in den meisten Fällen dazu gebracht wird, an einer festen Oberfläche, wie derjenigen einer Mikrotiterplatte, eines Tauchstabes oder derjenigen von Perlen zu haften, dürfen der Kern und die Abstandshalterarme daher diese Funktion nicht stören.
Der Kern enthält vorzugsweise selbst eine polyfunktionale Aminosäure oder ein Polymer davon, aber er könnte prinzipiell aus einem einfachen polyfunktionalen Molekül aufgebaut sein, wie einem Polyol, z. B. Trimethylolpropan, oder einem Polyamin oder aus einem verzweigten Oligomer, wie einem vernetzten Polyacrylat oder Polymethacrylat mit niedrigem Molekulargewicht. Besonders bevorzugt ist der Kern aus sich aufeinanderfolgend nach außen erstreckenden Verzweigungen aufgebaut und besteht oder enthält die Reste eines polymeren Moleküls, das von xn-1 Molekülen eines Monomers mit einer Polyfunktionalität x erhalten wurde, wobei x wenigstens 2 und üblicherweise 2 bis 4 beträgt und n eine ganze Zahl ist. Obwohl n prinzipiell keine Obergrenze hat, ist es wahrscheinlich, daß das Peptid chemisch synthetisiert wird und daher aus praktischen Gründen n wahrscheinlich selten 10 und noch seltener 20 überschreiten würde.
Im Interesse, den erwünschten Effekt in einem hochgradig lohnenden Ausmaß zu erzielen, ist n vorzugsweise wenigstens 3; somit wäre, wenn z. B. · 2 ist und n 3 ist, das Peptid ein verzweigtes Octamer. Das Monomer ist vorzugsweise eine basische Aminosäure, wie Lysin.
Der polyfunktionale Kern ist üblicherweise vollständig "gesättigt" durch Verzweigungen von Abstandshalterarmen, welche vorzugsweise Aminosäurereste enthalten, die sich von den funktionalen Gruppen aus erstrecken, üblicherweise durch Peptidbindungen zwischen funktionalen Aminogruppen des Kerns und Carboxylenden der Abstandshalterarmreste. Vorteilhaft sind alle Epitope über Abstandshalterarme an den Kern gebunden, obwohl, wenn eine Verringerung der Vorteile akzeptabel ist, einige direkt an den Kern gebunden sein können. Definitionsgemäß sind alle Abstandshalterarme an Epitop enthaltende Anteile gebunden. Dies geschieht üblicherweise durch Peptidbindungen zwischen den Aminogruppen der Abstandshalterarmreste und den Carboxylenden der epitophaltigen Ketten. Ein einzelner Abstandshalterarm kann darauf ein Epitop oder mehrere Epitope tragen, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 2 oder 3 pro Arm.
Prinzipiell können die verzweigten Peptide jedoch so hergestellt sein, daß sie einige zusätzliche Arme haben, die äquivalent zu Abstandshalterarmen sind, aber keine Epitope gebunden haben. Dies würde wiederum normalerweise den Vorteil in solch einem Aufbau verringern.
Allgemein ausgedrückt wird das verzweigte Peptidmolekül der Erfindung nur eine Epitopart für eine Bindung an dafür spezifische Antikörper enthalten. Wenn zwei oder mehr Arten von Antikörpern in einem einzelnen Test festzustellen sind, z. B. wenn eine Krankheit von zwei oder mehr infektiösen Stoffen verursacht werden könnte, die keine geeigneten üblichen Epitope haben, und wenn die Krankheit auf die gleiche Weise behandelt wird, unabhängig davon, welcher infektiöse Stoff verantwortlich ist, könnte das Peptid natürlich verschiedene Epitope enthalten. Alternativ könnte der Assay unter Verwendung getrennter verzweigter Peptide der Erfindung, von denen jedes ein einzelnes Epitop enthält, durchgeführt werden. Um die Möglichkeit falscher Positiver zu vermeiden, wird das Peptid keine Verbindungsstücke enthalten, die eine Bindungsreaktion mit anderen Antikörpern oder eine unspezifische Bindungsreaktion eingehen. Es wird daher keine Abschnitte von irgendwelchen Proteinen enthalten, die solche Effekte erzeugen könnten.
Die Peptide können nach irgendeinem der gut bekannten synthetischen Verfahren hergestellt werden, wie z. B. von Tam oder von Possnett et al., die oben zitiert sind, beschrieben wurde, jedoch ist das Fmoc-Verfahren, wie es z. B. von H. Lankinen et al., J. Gen. Virol. 70, 3159-3169 (1989) beschrieben ist, besonders geeignet.
Die Erfindung kann in jeder für die Feststellung von Antikörpern geeigneten Weise durchgeführt werden, insbesondere an einer geeigneten Flüssigkeit, insbesondere einer Körperflüssigkeit, die üblicherweise Antikörper enthält. Obwohl Serum die übliche Körperflüssigkeit ist, können andere Flüssigkeiten, die bestimmte Immunglobuline enthalten, z. B. Tränen, Speichel oder Milch, untersucht werden.
Die Erfindung ermöglicht es, kleine Peptidmengen zu verwenden, wobei die erforderliche Menge an verzweigtem Peptid der Erfindung normalerweise geringer ist als diejenige ihres linearen Gegenstücks oder ihres verzweigten Gegenstücks, wobei das verzweigte Gegenstück keinen Abstandshalterarm enthält. Der Vergleich berechnet sich bezüglich des Gesamtgewichts an verzweigtem Peptid, einschließlich Kern und Abstandshalterarm, gegenüber dem Gesamtgewicht des linearen Peptids der gleichen oder im wesentlichen gleichen Aminosäurezusammensetzung. Der Vergleich kann entweder bezüglich der Menge an Peptid, die erforderlich ist, eine vorgegebene Signalhöhe zu erzielen, oder bezüglich der Konzentration von Antikörper in Serum, welcher unter Verwendung einer vorgegebenen Menge des Peptides festgestellt werden kann, vorgenommen werden.
In der üblichen Praxis wird der Assay heterogen durch Bindung des verzweigten Peptides der Erfindung an einen unlöslichen Träger, wie die Kunststoffoberfläche einer Mikrotiterplatte, durchgeführt, obwohl die Erfindung nicht auf solche Assays beschränkt ist. Bei einem Sandwich- Assay wird das Antiserum mit dem Peptid für einen geeigneten Zeitraum, um eine Bindung zu ermöglichen, und mit einem Antikörper gegen das Immunglobulin inkubiert. Wenn der Patient z. B. ein Mensch und der Antikörper von der IgG-Klasse ist, wird daher ein Anti-Mensch-IgG- Antikörper, der in geeigneter Weise markiert ist, hinzugegeben, die Platte gewaschen und die Menge an Markierung, die an die Platte (über den Antikörper und das Peptid) gebunden ist, gemessen. Alternativ kann ein Konkurrenz-Assay durchgeführt werden, bei welchem man eine bekannte Menge von markiertem Antikörper mit dem Serum konkurrieren oder dieses von seiner Bindung verdrängen läßt. Solch ein Assay ist jedoch für die Feststellung geringer Antikörperkonzentrationen weniger geeignet. Es können irgendwelche der üblichen Markierungen, z. B. radioaktive Markierungen und Enzymmarkierungen, verwendet werden, insbesondere Peroxidase und alkalische Phosphatase. Radioaktive Markierungen können durch radioaktive Zählung und Enzymmarkierungen z. B. durch ein kolorimetrisches, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzsignal untersucht werden. Es kann ein Feststellungsverstärkungsverfahren, wie "Ampak" (registrierte Marke) von Nordisk Diagnostics Ltd., welches eine alkalische Phosphatase-Enzymmarkierung erfordert, verwendet werden, um den Assay noch empfindlicher zu machen.
Die Menge an Peptid, die pro Assay, z. B. pro Vertiefung einer Platte, zu verwenden ist, wird normalerweise geringer sein als 5 ug, vorzugsweise geringer als 1 ug und besonders bevorzugt geringer als 0,1 ug. Die in einem bestimmten Fall geeignetste Menge hängt von der Art des verwendeten Epitops ab. In einer herkömmlichen Mikrotiterplatte mit einer Kapazität von 100 ul pro Vertiefung hätte die verwendete Peptidlösung dann weniger als 5 mg.
In einem Kit zur Durchführung des Assays sind die wesentlichen Bestandteile in den meisten Fällen das verzweigte Peptid der Erfindung und ein immunglobulinmarkierter Anti- Mensch-Antikörper. Diese werden natürlich in dem Kit in getrennten Behältern geliefert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. "Tween" ist eine registrierte Marke.

Beispiel 1

Synthese linearer und verzweigter Peptide

Peptide wurden mittels Dauerfluß-Fmoc-Chemie unter Verwendung eines LKB Peptidsynthetisierers und nach einem Verfahren, welche von H. Lankinen et al., J. Gen. Virol., 70, 3159-3169 (1989), beschrieben ist, synthetisiert. Nach der Synthese wurden Seitenkettenschutzgruppen durch Behandlung mit 95% Trifluoressigsäure in Wasser (plus 4% w/v Phenol für die argininhaltigen Peptide oder 3% w/v Phenol plus 2% Ethandithiol für cystein- und argininhaltige Peptide) entfernt.
Relative molekulare Massen der linearen Peptide wurden mittels Massenspektometrie (M- Scan Ltd.) bestimmt, welche Werte lieferte, die mit den erwarteten identisch waren. Die Aminosäurezusammensetzung verzweigter Peptide wurde mittels Aminosäureanalyse (Cambridge Research Biochemicals) bestimmt und war wiederum in Übereinstimmung mit den Erwartungen. Die Reinheit von Peptiden wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer "Dynamax" Analysesäule (4,6 mm innerer Durchmesser · 25 cm Länge, 300A C8 Säule, Katalog Nr. 83-303-C) unter Anwendung eines Gradienten von 0%-95% Acetonitril in Wasser über eine Zeitdauer von 20 Minuten und mit einer Strömungsrate von 0,5 ml/min überprüft. Reinheiten lagen im Bereich von 61% bis 91%.
Die synthetisierten Peptide sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 - in Beispiel 1 verwendete Peptide
(a) Verzweigte Peptide wurden synthetisiert. Die verzweigten Peptide der Erfindung bestanden aus 8 Kopien der epitopischen Aminosäuresequenz (aa seq), von denen jede über den COOH-Terminus mit der terminalen NH&sub2;-Gruppe eines Abstandshalterarmrestes und daher mit einem verzweigenden Lysinkern, dessen allgemeine Formel nachfolgend gezeigt ist, verbunden war. Zu Vergleichszwecken wurden auch verzweigte Peptide hergestellt, denen der Abstandshalterarm fehlte, wobei der COOH-Terminus des Epitops dann direkt an eine NH&sub2;- Gruppe eines Lysinrestes des Kerns gebunden war.
Der Abstandshalterarm bestand aus Glycinresten. Es wurden 9 Peptide synthetisiert, in welchen die Anzahl von Glycinresten in dem Abstandshalterarm 0, 1, 2, 4, 5, 7, 10, 15 und 20 (bezeichnet als G0, G1, G2, G4, G5, G7, G10, G15 und G20) betrug. Dieses Epitop wird von dem monoklonalen Antikörper Z1F11 erkannt.
(b) Als Kontrollen wurden sowohl verzweigte (2A) als auch monomere (2B) Formen eines Peptides ohne Beziehung synthetisiert. Die verzweigte Form hatte die gleiche allgemeine Formel, wie sie für (a) oben angegeben ist, mit der Ausnahme, daß zwischen dem epitophaltigen Anteil und dem Lysinkern kein Abstandshalterarm war. (M.S. Chee et al., Current topics in Microbiology and Immunology, 154, 125-169 (1990)). Dieses Peptid enthielt nicht das von Z1F11 erkannte Epitop.
(c) Als Kontrolle wurde eine monomere Form eines Peptides, welches das gleiche Epitop wie in (a) enthielt, hergestellt (D.J. McGeoch et al., J. Gen. Virol., 69, 1531-1574 (1988)).
(d) Die monomere Form dieses Peptids wurde synthetisiert (Simmonds et al), J. of Virol. 65, 6266-6276 [1991]), und ist innerhalb der prinzipneutralisierenden Determinante enthalten (Javerahian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6768-6772 [1989]).
(e) Es wurden verzweigte Formen des Peptides hergestellt, welche kein (G0) oder vier (G4) Glycinabstandshalter enthielten.

Beispiel 2

Enzymverbundener Immuonosorbent-Assay (ELISA)

Der Effekt der Variation des Abstandes zwischen dem reaktiven Epitop und dem Kern auf die Reaktvitität des verzweigten Moleküls mit dem feststellenden Antikörper wurde untersucht.
Es wurden neun Peptide (Sequenz-ID-Nummer 1) synthetisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Der monoklonale Antikörper Z1F11 (P. Schenk et al., J. Gen. Virol., 69, 99-111 (1988)), ein gegen das Herpes simplex-Virus HSV-I gerichteter monoklonaler Antikörper, wurde in dem ELISA-Assay verwendet, da zuvor gezeigt wurde, daß dieser das Sequenzepitop GDPEDLD erkennt (M. Murphy et al., J. Gen. Virol., 70, 2357-2364 (1989)).
Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt:
Peptide wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Die Peptide wurden anschließend in PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) zu Lösungen, deren Konzentrationen zwischen 1 mg/ml und 1 pg/ml variierten, verdünnt. 100 ul Peptidlösung wurden in jede Vertiefung gegeben, was Mengen an Peptiden im Bereich von 100 ug bis herab zu 100 fg entsprach. Die Peptide wurden bei 37ºC über Nacht an die Platte adsorbieren gelassen. Überschuß an Antigenlösung wurde entfernt und die Platten in einer Lösung, welche 1% BSA enthielt, für 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Die Platten wurden anschließend dreimal in PBS, welches 0,01% "Tween-20" (PBS-Tween) enthielt, gewaschen und mit 100 ul der geeigneten Antikörperverdünnung bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Zur Feststellung von gebundenen Antikörpern wurden die Platten fünfmal in PBS-Tween gewaschen und für 1 Stunde bei 37ºC mit 100 ul pro Vertiefung eines Meerrettichperoxidase-Schaf-Anti-Maus- Konjugates (SAPU) (1000fach in PBS verdünnt) inkubiert. Die Platten wurden anschließend siebenmal in PBS-Tween gewaschen und mit einer 50 ug/ml Lösung des Enzymsubstrates 2,2- Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) [ABTS] in Citrat-Phosphatpuffer, welcher 0,01% Wasserstoffperoxid enthielt, zur Reaktion gebracht. Nach 15 Minuten des Farbveränderungsverlaufs wurden die Platten in einem Titerek Multiscan Plattenleser bei 405 nm abgelesen. Die angegebenen Ergebnisse sind alle der Mittelwert aus Doppelbestimmungen.
Die Ergebnisse des ersten Experiments sind in Fig. 1 dargestellt, wobei unterschiedliche Mengen an Peptiden im Bereich von 100 ug bis herab zu 100 fg in ELISA-Assays bezüglich Reaktivität mit Z1F11 (1/2000 verdünnt) untersucht wurden. Die Kontrollen umfaßten: monoklonalen Antikörper HCMV-3 (ein gegen humanes Cytomegalovirus gerichteter Antikörper, von dem man nicht erwarten würde, daß er mit irgendeinem der Peptide der Sequenz-ID- Nummern 1, 2 oder 3 reagiert) anstelle von Z1F11, Peptid 2 (Tabelle 1) sowohl in der verzweigten 2A und der monomeren 2B Form, wie in Beispiel 1 beschrieben, und monomeres Peptid Sequenz-ID-Nummer 3 (Tabelle 1), welches das Z1F11-reaktive Epitop enthält. Die Figur zeigt, daß alle verzweigten Peptide, welche die Sequenz GDPEDLD enthielten, stärker mit Z1F11 reagierten als das monomere Peptid, welches diese Sequenz enthielt (Sequenz-ID-Nummer 3). Jedoch gab es einen deutlichen Unterschied zwischen dem verzweigten Peptid (Sequenz-ID- Nummer 1) ohne Glycinabstandshalter (G0), welches nur geringfügig reaktiver war als das monomere Peptid, und dem verzweigten Peptid mit einem Glycinabstandshalter (G1): bei 100 ug Peptid pro Vertiefung lieferte G1 die zweifache Absorption derjenigen, die von G0 erzeugt wurde, und es wurde 10&sup4;fach mehr G0 als G1 benötigt, um eine Absorption von 0,5 zu erzeugen. Zusätzliche Glycinreste erhöhten die Absorption für Peptidmengen von 10 pg pro Vertiefung fortlaufend weiter, obwohl die Peptide G5 und G7 bei niedrigen Konzentrationen am empfindlichsten zu sein schienen. Die Kontrollen verhielten sich wie erwartet dahingehend, daß erstens der Kontrollantikörper HCMV-3 mit keinem Peptid bei irgendeiner Konzentration reagierte (es sind nur die Reaktionsdaten dieses Antikörpers mit dem Peptid G10 gezeigt), zweitens Z1F11 nicht mit den Peptiden ohne Bezug der Sequenz-ID-Nummer 2A (verzweigt) und der Sequenz-ID- Nummer 2B (monomer) reagierte und drittens Z1F11 in Abwesenheit von Peptid nicht reaktiv war.
Die Ergebnisse des zweiten Experiments sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Die Wirkung der Länge des Glycinabstandshalters auf die Empfindlichkeit, mit der verzweigte Peptide (Sequenz-ID-Nummer 1) Z1F11 feststellen konnten, wurde untersucht. Drei verschiedene Mengen von Peptid wurden getestet: 0,01 ug, 1 ug und 100 ug. Alle lieferten im wesentlichen das gleiche Ergebnis, und in den Fig. 2 bzw. 3 sind nur die Daten für 1 ug pro Vertiefung bzw. 0,01 ug pro Vertiefung wiedergegeben. Die Reaktivität der Peptide wurde gegen Verdoppelungsverdünnungen von Z1F11 im Bereich von 1/250 bis 1/64000 untersucht. Die Ergebnisse für verzweigte Peptide, die in einer Konzentration von 1 ug/Vertiefung verwendet wurden, sind in Fig. 2 gezeigt. Hier waren alle Formen des verzweigten Peptides erheblich reaktiver als das monomere Kontrollpeptid (Sequenz-ID-Nummer 3). Die Wirkung war besonders deutlich mit vier oder mehr Glycinresten. Bei 64000facher Verdünnung lieferte Z1F11 eine Absorption von 0,5 mit dem G4-Peptid, wogegen der Antikörper zur Erzeugung der gleichen Absorption mit dem Peptid G0 nur 250fach verdünnt werden konnte. Zusätzliche Glycinreste erhöhten die Reaktivität des verzweigten Peptides nicht wesentlich. Aus diesem Experiment wird geschlußfolgert, daß ein Abstandshalter von vier oder mehr Glycinresten die Empfindlichkeit für die Feststellung des Antikörpers Z1F11 um wenigstens das 256fache erhöht.
Die Ergebnisse für die Peptide 3, G0, G5 und G10, welche mit 0,01 ug/Vertiefung verwendet wurden, sind in Fig. 3 gezeigt. Bei dieser Konzentration stellte Peptid 3 Z1F11 bei keiner Konzentration fest, und das G0-Peptid zeigte nur geringfügige Reaktivität. Im Gegensatz dazu zeigten G5 und G10 gute Reaktivität

Beispiel 3

Enzymverbundener Immunosorbent-Assay

Es wurde die Wirkung der Variation des Abstandes zwischen dem reaktiven Epitop und dem Kern auf die Reaktivität des verzweigten Moleküls mit dem feststellenden Antikörper untersucht. Es wurde ein gegenüber dem in Beispiel 2 verwendeten verschiedenes Epitop verwendet.
Drei Peptide (Sequenz-ID-Nummer 4) wurden synthetisiert, wie in Beispiel 1 (d) und (e) beschrieben. Menschliche Seren, bezeichnet mit den Nummern 11 und 12, stammten aus zwei bezüglich HIV-1-Antikörper positiven Individuen. Menschliches Serum, bezeichnet mit der Nummer 4, wurde aus einem bezüglich HIV-1-Antikörper negativen Individuum erhalten. Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt:
Peptide wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Die Peptide wurden anschließend in PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) zu Lösungen, deren Konzentrationen zwischen 1 mg/ml und 10 fg/ml variierten, verdünnt. 100 ul Peptidlösung wurden in jede Vertiefung gegeben, was Peptidmengen im Bereich von 50 ug bis herab zu 1 fg entsprach. Das Verfahren zur Durchführung des ELISA war genau dasjenige, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die zum Waschen der Platten verwendete PBS-Tween-Lösung PBS war, welches 0,05% "Tween-20" enthielt. Die angegebenen Ergebnisse sind alle der Mittelwert von Doppelbestimmungen.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 4, 5 und 6 gezeigt. Es wurden verschiedene Mengen von Peptiden im Bereich von 50 ug bis herab zu 1 fg in ELISA-Assays bezüglich der Reaktivität mit menschlichen Seren aus den zwei bezüglich HIV-1-Antikörper positiven Individuen (1/100 verdünnt) untersucht. Menschliche Seren aus einem bezüglich HiV-1-Antikörper negativen Individuum dienten als Kontrolle.
Fig. 4 zeigt, daß die monomeren Peptide schwächer mit bezüglich HIV-1-Antikörper positiven menschlichen Seren (Nummern 11 und 12) reagierten als das verzweigte Peptid, welches keine Glycinabstandshalter enthielt (G0), dargestellt in Fig. 5, welches wiederum schlechter reagierte als das verzweigte Peptid, welches vier Glycinabstandshalter enthielt (G4), dargestellt in Fig. 6: weder die Seren 11 noch 12 waren mit weniger als 5 · 10&supmin;&sup4; ug des G0- verzweigten Peptides in bedeutsamer Weise reaktiv, wogegen sie mit wenigstens 1000fach geringeren Konzentrationen des G4-verzweigten Peptides reagierten.
Die nachfolgenden Patentansprüche definieren einige wichtige Gesichtspunkte der Erfindung.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Erfinder
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Peptidbasierender Assay
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) BRIEFADRESSE:
(A) ADRESSAT:
(B) STRASSE:
(C) ORT:
(D) BUNDESLAND:
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL:
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette 5,25 Zoll, Kb Speicherkapazität
(B) COMPUTER:
(C) BETRIEBSSYSTEM:
(D) SOFTWARE:
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(viii)ANGABEN ZUM VERTRETER:
(A) NAME:
(B) VERTRETERNUMMER:
(C) AKTENZEICHEN:
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(v) Fragmentart: inneres Fragment
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: Die aa Sequenz ist (a) in linearen Peptiden und (b) in jeder von 8 Verzweigungen eines verzweigten Peptides der Formel ([(aa Sequenz)(Gly)&sub5;Lys]&sub2;Lys)&sub2;Lys Ala vorhanden
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(3) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(v) Fragmentart: inneres Fragment
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: Die Sequenz ist (a) in linearen Peptiden und (b) in jeder von 8 Verzweigungen eines verzweigten Peptides der Formel (Sequenz)e-(Lysine)&sub7;- Alanin vorhanden
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(4) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(v) Fragmentart: inneres Fragment
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: Die Sequenz ist in linearen Peptiden vorhanden
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(5) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE; 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(v) Fragmentart: inneres Fragment
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: Die aa Sequenz ist (a) in linearen Peptiden und (b) in jeder von 8 Verzweigungen eines verzweigten Peptides der Formel ([(aa Sequenz)(Gly&sub0; oder 4 Lys]&sub2;Lys)&sub2;Ala vorhanden
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Claims

1. Antikörper-Assayverfahren in einer Probe einer Körperflüssigkeit, die von einem Patienten erhalten wurde, indem man eine Bindungsreaktion zwischen den Antikörpern und einem Peptid mit mehreren Epitopanteilen hierfür ausführt und das Auftreten oder das Ausmaß von Bindung feststellt bzw. mißt, wobei das Peptid ein verzweigtes Peptid ist, das die Epitopanteile an Abstandshalterarme gebunden umfaßt, welche Aminosäurereste umfassen, die von einem polyfunktionellen Kern aus vorspringen, und dabei mehrere der Epitope in dem gleichen Molekül an seinen Verzweigungen liegend aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Abstandshalterarm äquivalente Länge zu der hat, die von 4 bis 20 Glycinresten erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandshalterarme nichthydrophobe Molekülreste umfassen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Hauptteil der Aminosäurereste in den Abstandshalterarmen Glycin oder nicht polare Aminosäuren sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminosäuren Glycin sind.

5. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandshalterarm von äquivalenter Länger zu jener ist, die von 4 bis 10 Glycinresten gebildet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandshalterarm von äquivalenter Länge zu jener ist, die von 4 bis 7 Glycinresten gebildet wird.

7. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern einen Rest eines sich von xn-1 Molekülen herleitenden Polymermoleküls eines polyfunktionellen Monomers umfaßt, worin x die Funktionalität des Monomers und wenigstens 2 ist und n eine ganze Zahl bedeutet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomer Lysin ist.

9. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid in einer kleineren Gewichtsmenge verwendet wird, als erforderlich wäre, die gleiche Assay-Empfindlichkeit zu erreichen oder ein bestimmtes Signal zu erzeugen, wenn ein entsprechendes lineares Peptid oder ein Abstandshalterarm ohne verzweigtes Peptid zwischen dem Kern und den Epitopen stattdessen verwendet würden.

10. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid in einer Menge von weniger als 5 ug/Platz verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid in einer Menge von weniger als 1 ug/Platz verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid in einer Menge von weniger als 0,1 ug/Platz verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Form eines Sandwich-Assays stattfindet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.

15. Kit zur Durchführung eines Assays mit einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern darin, wobei die Bindungsreaktion zwischen den Antikörpern und einem Peptid mit einem Epitop hierfür durchgeführt wird und das Vorhandensein oder Ausmaß von Bindung festgestellt bzw. gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit (1) ein in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiertes verzweigtes Peptid und (2) einen markierten Anti-human-Immunoglobinantikörper zur Feststellung oder Messung de Bindung umfaßt.