ES2200472T3 - Procedimiento para proporcionar una indicacion util en el diagnostico de la infeccion del virus de la inmunodeficiencia felina (vif) y dispositivo para llevar a cabo un analisis para el vif. - Google Patents
Procedimiento para proporcionar una indicacion util en el diagnostico de la infeccion del virus de la inmunodeficiencia felina (vif) y dispositivo para llevar a cabo un analisis para el vif.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR SI UN FELINO ESTA INFECTADO CON UN VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA FELINA ("FIV"). LOS PROCEDIMIENTOS COMPRENDEN LA UTILIZACION DE UNA COMPOSICION AGLUTINANTE CON ANTICUERPOS QUE INCLUYE DOS POLIPEPTIDOS MEJORADOS, UNO QUE CONTIENE UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DEL PRECURSOR "GAG" DE FIV P55 Y EL OTRO CONTIENE UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DEL PRECURSOR "ENV" FIV GP 130. TAMBIEN SE DESCRIBEN DISPOSITIVOS PARA PRACTICAR ESTOS PROCEDIMIENTOS.
Description
Procedimiento para proporcionar una indicación
útil en el diagnóstico de la infección del virus de la
inmunodeficiencia felina (VIF) y dispositivo para llevar a cabo un
análisis para el VIF.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para proporcionar una indicación útil en el
diagnóstico de la infección del virus de la inmunodeficiencia felina
("VIF"), y a un dispositivo para llevar a cabo un análisis
para el VIF.
La infección con una variedad de lentivirus está
asociada a la enfermedad de la inmunodeficiencia. Los gatos
infectados con el VIF (Pedersen y otros, Science
235:790-793, 1987; patente americana nº 5.037.753),
por ejemplo, muestran una serie de síntomas patógenos reminiscentes
de la enfermedad de la inmunodeficiencia adquirida ("SIDA")
(Yamamoto y otros. Am. J. Vet. Res 49:1246-1258,
1988; Ackley y otros, J. Virol. 64:5652-5655, 1990;
Siebelink y otros, AIDS Res. Hum. Retroviruses
6:1373-1378, 1990). El SIDA felino asociado al VIF
es una enfermedad felina importante, con incidencias tan grandes
como un 15% en poblaciones de animales enfermos (O'Connor y otros,
J. Clin. Microbiol. 27:474-479, 1989). La viremia
transitoria de bajo nivel que se aprecia con frecuencia con
relación a la persistencia de provirus intracelulares hace que la
detección de la reacción de los anticuerpos a la infección sea un
análisis fiable para la infección por VIF.
Los ensayos de inmunoabsorción enzimática
("ELISA") para la detección de anticuerpos del VIF utilizan
viriones y/o antígenos de VIF purificado e inactivado como reactivos
de fase sólida para enlazar anticuerpos de VIF en muestras. Se han
detectado anticuerpos que reconocen epitopos de las proteínas de
cápside p24 de GAG codificado ("p24") y nucleocápsides p15 y
de las proteínas superficiales de transmembrana gp40 codificada ENV
("gp40") y gp100 a través de un análisis de radio
inmunoprecipitación ("RIPA") o inmunoblot (Hosie y otros, AIDS
4:215-220, 1990; Steinman y otros, J, Gen. Virol.
71:701-706, 1990; Andersen y otros, patente
americana nº 5.656.732; Kemp y otros, patente americana nº
5.591.572; Mermer y otros, Similarities between the Transmembrane
Proteins of VIF and HIV, Cold Spring Harbor Symposium, RNA Tumor
Viruses, 1991; Milton y otros, J. Clin. Microbiol.
28:898-904, 1990). Se han generado también diversos
anticuerpos anti-VIF (O'Connor y otros, patentes
americanas nº 5.219.725 y 5.177.014).
IDEXX Laboratories, INC. comercializan un
dispositivo de diagnóstico del VIF bajo la marca SNAP® COMBO, que
detecta anticuerpos VIF en muestras felinas. El dispositivo incluye
p24 recombinante como reactivo de captura de fase sólida. El
anticuerpo VIF capturado por el reactivo de fase sólida es
detectado con VIF descompuesto conjugado a peroxidasa de rábano
silvestre. Véase patentes americanas nº 5.726.010 y 5.726.013.
Hemos descubierto ahora que la detección de
anticuerpos de VIF indicativos de infección de VIF se mejora
utilizando una composición de marcado de polipéptidos que se mejora
por la presencia tanto de polipéptidos VIF ENV como de polipéptidos
VIF GAG. Se entiende por "mejora" que los polipéptidos VIF ENV
y GAG están presentes en la composición de marcado en niveles de
porcentaje en peso más elevados que en una mezcla simple de
proteínas VIF obtenida a partir de un virus descompuesto. La mejora
puede conseguirse, por ejemplo, disponiendo a la mezcla una
preparación purificada o parcialmente purificada de los
polipéptidos ENV y GAG, o utilizando dicha preparación como
composición de marcado sin la inclusión de la mezcla vírica.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención,
se dispone un procedimiento para proporcionar una indicación útil
en el diagnóstico de si un felino está infectado con el virus de la
inmunodeficiencia felina (VIF), comprendiendo el procedimiento poner
en contacto una muestra de un felino in vitro con una
composición de captura de enlace de anticuerpos que comprende (i)
un primer polipéptido de captura mejorado que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF GAG p55, y (ii) un segundo
polipéptido de captura mejorado que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF ENV gp130; y detectar la reacción de
anticuerpos en la muestra con la composición de captura.
Se describe un procedimiento de diagnóstico para
determinar la infección de VIF poniendo en contacto una muestra
felina (por ejemplo una muestra de suero o de sangre) con una
composición de captura de enlace de anticuerpos que incluye
polipéptidos mejorados VIF tanto ENV como GAG. Un polipéptido
mejorado (por ejemplo, purificado) puede ser un polipéptido
recombinante o sintético, o un polipéptido aislado de viriones VIF.
La reacción de los anticuerpos de la muestra con la composición de
captura indica que el donante de la muestra está infectado con
VIF.
Un fragmento inmunógeno de un polipéptido es un
fragmento polipéptido que se puede enlazar a uno o más anticuerpos
que son específicos al polipéptido en su conformación nativa.
Fragmentos inmunógenos de un precursor VIF GAG p55 incluyen, pero no
se limitan a éstos, el propio p55, productos de desdoblamiento del
p55 tales como p25, p15, y p10, y cualquier fragmento de p55
reconocido por el anticuerpo monoclonal ("mAb") 2D4 (American
Type Culture Collection ("ATCC") HB9890), 3H8 (ATCC HB12531),
4F2 (ATCC HB9888), 2H4 (ATCC HB12530), o 6E6 (ATCC HB9899). Los
fragmentos inmunógenos de un precursor VIF ENV gp130 incluyen,
aunque no quedan limitados a éstos, el propio gp130, productos de
desdoblamiento del gp130 tales como gp40, y gp110; también incluyen
cualquier fragmento de gp130 que contenga un bucle de cisteína de
gp40 y cualquier fragmento de gp130 que se una al mAb 2F11 (ATCC
HB10295), 1C9 (ATCC HB12529), o 3H9 (ATCC HB12528). Un fragmento
inmunógeno típico de gp130 es el ELGCNQNQFFCK (ID. SEC. No: 1). Un
segundo polipéptido de captura típico es el CELGCNQNQFFCK (ID. SEC.
No: 2).
En una realización del procedimiento descrito
anteriormente, la composición de enlace se une a una fase (por
ejemplo, una fase sólida) inmiscible con la muestra. Puede aplicarse
una composición de detección de enlace de anticuerpos para detectar
la reacción de anticuerpos en la muestra felina con la composición
de captura. Esta composición de detección puede incluir dos
polipéptidos de detección que contengan respectivamente fragmentos
inmunógenos de p55 y gp130. Por ejemplo, la composición de
detección puede contener un VIF descompuesto (por ejemplo, una
mezcla de proteínas víricas obtenida a través de viriones VIF
nativos descompuestos con un detergente) con un péptido que
presenta la secuencia de ID. SEC. No: 1 ó 2. Los polipéptidos de la
composición de detección se marcan preferiblemente con un grupo
detectable, tal como una enzima que catalice una reacción
detectable, oro coloidal, un radionúclido, y un fluoforo.
De acuerdo un segundo aspecto alternativo de la
invención, se dispone un dispositivo para llevar a cabo un análisis
que determina si un felino está infectado con el virus de la
inmunodeficiencia felina (VIF), comprendiendo el dispositivo (i) un
primer polipéptido de captura mejorado que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF GAG p55, y (ii) un segundo
polipéptido de captura mejorado que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF ENV gp130, y una composición de
detección de enlace de anticuerpos para detectar la presencia de
anticuerpos enlazados a la composición de captura.
Se describe un dispositivo para llevar a cabo un
análisis que determine si un felino está infectado con VIF. Este
dispositivo contiene las composiciones de captura y de detección de
enlace de anticuerpos descritas anteriormente. En una realización,
la composición de detección se alosa en un recipiente.
Salvo que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo
significado tal como se entienden comúnmente por los expertos en la
materia a la cual pertenece la invención. Se describen a
continuación procedimientos y materiales de ejemplo, si bien pueden
utilizarse también procedimientos y materiales similares o
equivalentes a los que aquí se describen en la práctica o el
análisis del procedimiento y el dispositivo que aquí se
describe.
En caso de conflicto, mandará la presente
memoria, incluyendo las definiciones. Los materiales,
procedimientos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden
ser limitativos.
Otras características y ventajas del
procedimiento y el dispositivo resultarán evidentes a partir de la
siguiente descripción detallada, y a partir de las
reivindicaciones.
En los dibujos:
La figura nº 1 es un diagrama que representa los
componentes de un análisis VIF de la invención.
La figura nº 2 es una vista en despiece de un
dispositivo de análisis de un solo uso para detectar el VIF.
La figura nº 3 es una sección transversal del
dispositivo de la figura nº 2 montado, antes de utilizar.
La figura nº 4 es una sección transversal del
dispositivo de la figura nº 2, después de utilizar.
Se describe unos análisis para la detección de
anticuerpos VIF en una muestra. La figura nº 1 muestra los
componentes básicos de uno de tales análisis. El anticuerpo es
capturado mediante reactivos de captura (es decir, una composición
de enlace de anticuerpos) (10a) y (10b) que son inmovilizados en un
substrato sólido (12) por cualquiera de un gran número de
procedimientos conocidos. En particular, los reactivos de captura
son una mezcla de polipéptidos VIF que pueden incluir (a) p24
recombinante tal como se describe a continuación con mayor detalle,
y (b) un péptido inmunodominante sintético ENV (por ejemplo, gp40)
("IDP"), que también se describe a continuación. Los reactivos
de captura se enlazan a los anticuerpos VIF (11a) y (11b) de la
muestra, y el material no enlazado es enjuagado o eliminado por
otros medios conocidos. La presencia del anticuerpo de VIF
capturado es detectada por el uso de un reactivo de detección
marcado (14) que se enlaza específicamente al anticuerpo capturado.
El reactivo es una mezcla de polipéptidos nativos, recombinantes,
y/o sintéticos se enlazan específicamente al anticuerpo de destino.
Estos polipéptidos (por ejemplo, (18a) y (18b)) se conjugan cada
uno a una enzima (16) que cataliza una reacción de detección.
Debido a que los anticuerpos son bivalentes, los anticuerpos de VIF
capturados pueden ser detectados utilizando los mismos epitopos tal
como se utilizaron en los reactivos de captura. Un reactivo de
detección específico incluye un VIF nativo descompuesto añadido con
un IDP gp40 sintético que puede ser el mismo que se ha descrito
anteriormente.
Puede utilizarse cualquiera de un gran número de
formatos de ensayo inmunológico conocidos para detectar la
presencia de anticuerpos anti-VIF en una muestra
utilizando los reactivos anteriores. Uno de tales formatos es el
formato de flujo inverso utilizado en el dispositivo SNAP® de IDEXX
Laboratories, Inc. y descrito en general en las patentes americanas
nº 5.726.010 y 5.726.013.
Las figuras nº 2 a 4 representan un ejemplo de un
dispositivo de un solo uso para llevar a cabo un análisis de VIF.
En la figura nº 2, el dispositivo incluye una matriz de flujo
absorbente (22) que se aloja entre una base (23) y una tapa (24).
Un activador (25a) y un cuerpo (25b) rodean la matriz de flujo
(22). Se disponen dos cavidades de reactivos (una cavidad de
substrato de enzima (27) y una cavidad de enjuague (28)) en la base
y se tapan con un cierre estanco (29). El activador (25a) incluye
dos lanzas orientadas hacia abajo (30) que incluyen unas mechas
absorbentes (32) en su parte central. En una cavidad (35) de la
base se coloca una almohadilla absorbente (34).
En la figura nº 3, antes del uso, la tapa (24) y
el activador (25a) se encuentran inclinados hacia arriba desde una
articulación (36). Las cavidades (27) y (28) se llenan y se tapan.
La muestra se introduce en el recipiente de muestras (38), y la
muestra fluye de derecha a izquierda (en la figura nº 3) a lo largo
de la matriz (22). El reactivo de detección designado para enlazarse
a los anticuerpos de VIF y permitir la detección de los mismos en
la muestra puede mezclarse con la muestra antes de que se aplique a
la matriz de flujo, o puede aplicarse previamente a la matriz (por
ejemplo en (42)), que se va adquirir por los anticuerpos de VIF a
medida que la muestra se desplaza a lo largo de la matriz. Una zona
de captura de analizados (40) incluye los reactivos de captura
descritos en otro lugar de esta solicitud. Los reactivos de captura
son inmovilizados a la zona de captura (40) de acuerdo con técnicas
estándar, tal como se describe, por ejemplo, en las patentes
americanas nº 5.726.010 y 5.726.013. Los anticuerpos de VIF que
reaccionan con los reactivos de captura se enlazan a los reactivos
de captura y, de este modo, permanecen en la zona (40). Tras un
período de tiempo establecido para permitir que la muestra se
desplace a través de la zona (40), el activador (25a) se cierra
girándolo alrededor de la articulación (36). Las lanzas (30)
perforan el cierre estanco (29) de la cavidad permitiendo que la
solución de substrato de enzimas de la cavidad (27) y la solución de
enjuague de la cavidad (28) se desplacen hacia arriba a través de
las mechas (32) y sobre la matriz (22). Al mismo tiempo, la
almohadilla absorbente (34) se dispone en contacto con la matriz
(29) justo a continuación (a la derecha en la figura) del
recipiente de la muestra (38), provocando la inversión del flujo de
la matriz (desplazándose de izquierda a derecha). Este flujo enjuaga
el material no enlazado de la zona (40) y dispone el substrato de
enzima en contacto con la enzima conjugada de los reactivos de
captura, provocando una reacción detectable (por ejemplo, de
generación de un color) en la zona (40) indicativa de la presencia
de un anticuerpo de VIF en la muestra.
También pueden utilizarse otros formatos ELISA
(por ejemplo ELISA microplaca). Los resultados de los experimentos
ELISA pueden confirmarse a través de un análisis Western Blot.
Los reactivos de captura van unidos a una fase
inmiscible con la muestra de prueba. Por ejemplo, los reactivos de
captura se inmovilizan sobre una fase sólida. La fase sólida puede
ser en cualquier forma (por ejemplo, una partícula, una cavidad de
la microplaca, o una tira), y pueden tener, por ejemplo, una
superficie unitaria (plana o curva) o una estructura porosa.
Materiales útiles como fase sólida incluye, pero no quedan
limitados a éstos, vidrio, geles, papel, celulosa, nailon,
poliestireno, y látex. Los reactivos de captura también pueden
enlazarse de manera covalente a un disolvente inmiscible al agua
que puede formar una emulsión con la muestra de prueba para
permitir el contacto entre los reactivos de captura y los
anticuerpos de destino.
Los polipéptidos que sirven como reactivos de
captura pueden unirse a la superficie sólida a través de cualquier
procedimiento estándar, incluyendo la absorción directa o el
acoplamiento químico a grupos de reactivos sobre la superficie. Por
ejemplo, una superficie sólida puede ser derivatizada para generar
grupos de aminas activos; y después se utiliza un degradador
heterobifuncional reactivo amino- y sulfidrilo- (por ejemplo,
succinimidil-4-(N-maleimidometil)
ciclohexano-1-barboxilato
("SMCC")) u otro degradador DOUBLE-AGENT™
disponible de Pierce, Rockford, IL, o reactivo equivalente de otros
vendedores para enlazar un grupo libre de cisteína en el
polipéptido al grupo amina sobre la superficie sólida.
Alternativamente, pueden utilizarse degradadores homobifuncionales
disponibles también de Pierce u otros vendedores.
Los polipéptidos de captura pueden contener un
fragmento inmunógeno de p55 o gp130. Para identificar dichos
fragmentos inmunógenos se puede digerir p55 o gp130 (o sus productos
de desdoblamiento naturales, por ejemplo, p24 o gp40) con una
peptidasa o CNBR, y purificar los péptidos inmunógenos separados
por su capacidad para enlazarse a una columna de afinidad que
contiene un anticuerpo anti-p55 o
anti-gp130. Los anticuerpos anti-p55
o anti-gp130 pueden generarse a través de
procedimientos bien conocidos. Véase, por ejemplo, las patentes
americanas 5.177.014 y 5.219.725; Lombardi y otros, AIDS Res Hum
Retroviruses 9:141-146, 1993; y Lombardi y otros, J
Gen Virol 76(Pt 8):1893-1899, 1995.
Fragmentos inmunógenos útiles de gp130 incluyen
cualquiera de los cuatro péptidos gp40 mostrados en la columna 3 de
la patente americana nº 5.591.572. Puede ser también un segmento de
cualquiera de estas cuatro secuencias de péptidos gp40 que contenga
los residuos centrales CNQNQFFC (ID. SEC. No: 3). Tales péptidos
contienen una bucle de disulfuro interno que mantiene la
conformación inmunógena de la región correspondiente en el gp40
nativo. Un reactivo de captura gp40 de ejemplo es un péptido (es
decir, IRG2) que consiste en residuos aminoácidos CELGCNQNFFCK (ID.
SEC. No: 2). Este péptido tiene un enlace de disulfuro interno
formado por residuos (5) y (12) durante la síntesis química. El
residuo de cisteína en el terminal amino no forma parte del IDP
nativo correspondiente, sino que se introduce para permitir la
conjugación. Por ejemplo, el péptido puede enlazarse a través de
esta cisteína, p. ej., a suero albúmina bovina ("ASB") que, a
su vez, puede ser enlazada de manera covalente o absorbida a una
superficie sólida. El terminal carboxi del IRG2 es amidatado
opcionalmente para imitar el estado natural del terminal carboxi del
IRG2.
Los polipéptidos de captura pueden contener
adicionalmente una marca de epitopo artificial tal como FLAG™ para
facilitar la purificación y la identificación de los polipéptidos.
Es evidente que es preferible que esta marca de epitopo no se
encuentre normalmente en los felinos de manera que no provoque
reacciones cruzadas en el ensayo inmunológico. Pueden utilizarse
también marcas de proteínas tales como
\beta-galactosidasa (véase, por ejemplo, Mermer y
otros, Veterinary Immunology and Immunopathology
35:133-141, 1992).
Los anticuerpos enlazados a los reactivos de
captura sobre un soporte sólido pueden detectarse mediante una
composición de detección de enlace de anticuerpos. Esta composición
puede incluir polipéptidos de detección que contengan secuencias
inmunógenas de p55 o gp130. Por ejemplo, puede utilizarse un VIF
descompuesto con un fragmento inmunógeno de gp130 como composición
de detección. Estos antígenos se enlazan a un grupo detectable tal
como un radionúclido (por ejemplo, ^{125}1 y ^{35}S), un
fluoroforo (por ejemplo, fluoresceína, ficoeritrina, Texas Red, o
aloficocianina), o una enzima que catalice una reacción
colorimétrica o quimioluminiscente (por ejemplo peroxidasa de
rábano silvestre o fosfatasa alcalina). En una realización, la
muestra de prueba se dispone en contacto con los antígenos marcados
mientras se aplica a una fase sólida o antes de aplicarla.
Alternativamente, los antígenos marcados se aplican a la superficie
sólida después de que el anticuerpo de destino se haya enlazado. En
cualquier caso, el anticuerpo de destino, el antígeno marcado, y el
antígeno inmovilizado formarán un complejo sobre la superficie
sólida. Después de enjuagar los antígenos marcados no enlazados se
determina una señal generada desde la superficie sólida como
indicación de la presencia de un anticuerpo no enlazado.
Los polipéptidos utilizados como reactivos de
captura o de detección pueden ser de un VIF natural, o pueden
obtenerse, por ejemplo, por medio de técnicas recombinantes o
síntesis química. Las estructuras de ácidos nucleicos para la
expresión de dichos polipéptidos pueden prepararse a través de
técnicas estándar tales como la reacción en cadena de la polimerasa
en base a secuencias de ácidos nucleicos de VIF identificado, por
ejemplo, la secuencia genómica del VIF descrita en Talbott y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5743-5747, 1989.
El siguiente ejemplo pretende ilustrar los
procedimientos y materiales de la presente invención.
Se utilizó la línea celular de un riñón felino
Crandall (CRFK) para propagar la cepa Petaluma del VIF (O'Connor y
otros, J. Clin. Microbiol. 27:474-479, 1989). El VIF
purificado fue descompuesto utilizando un detergente (por ejemplo,
SDS o NP-40) y calor. El detergente residual se
eliminó utilizando "bio-perlas" antes de la
conjugación (Labs. Bio-Rad, Richmond, CA).
El gen para el p24 fue amplificado por la
reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") a partir de
lisados de células de CRFK infectadas por Petaluma de VIF. Los
iniciadores se basaron en la secuencia publicada (Talbott y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5743-5747, 1989). Los
productos de la PCR fueron clonados en pUC19, y los insertos con
secuencia de ADN verificado fueron transferidos al vector pEX
apropiado (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN)
para permitir la síntesis de una proteína de fusión
\beta-galactosidasa-p24 (es decir,
EXP24) en E. coli N48 30-1
(Boehringer-Mannheim). La expresión de las proteínas
fue inducida por incubación a 42ºC durante 2 horas.
La proteína de fusión
\beta-galactosidasa se purificó de los lisados
bacterianos como cuerpos de inclusión insolubles por sonicación y
centrifugación tal como se ha descrito anteriormente (Hoppe y
otros, Biochemistry 28:2956-2960, 1989; Wingender y
otros, J. Biol. Chem. 264:4367-4373, 1989). La
pureza se evaluó tras una coloración azul Coomassie de geles de
poliacrilamida SDS mediante inspección o densitometría tras una
electroforesis PhastSystem (Pharmacia, Piccataway, NJ).
Se realizó un análisis ELISA mediante la
sustitución de los antígenos recombinantes por el antígeno del
virus entero de la fase sólida en los análisis PETCHEK y SNAP (IDEXX
Laboratorios; véase también Mermer y otros, supra).
La composición de captura del análisis ELISA
contenía IRG2 y EXP24, donde IRG2 fue conjugado a BSA por medio de
SMCC. El BSA-IRG2 y EXP24 fueron inmovilizados
mediante absorción pasiva en una superficie sólida de poliestireno a
2 \mug/ml y 5 \mug/ml, respectivamente.
El IRG2 fue conjugado a peroxidasa de rábano
silvestre por medio de SMCC. El VIF nativo descompuesto se acopló a
la peroxidasa de rábano silvestre mediante la química del
periodato. La mezcla de los dos conjugados en una proporción molar
aproximada de 1:1 se utilizó como reactivo de detección.
Para analizar si la composición de captura
BSA-IRG2/EXP24 puede detectar de manera específica
un anticuerpo a un gp40, se llevó a cabo un ELISA microplaca.
Brevemente, se recubrieron las paredes interiores de las
microcavidades de una microplaca con la composición de captura. Se
añadió después a las cavidades suero de bovino fetal ("SBF")
que contenía diversas concentraciones de un mAb
anti-gp40, es decir, mAb 2F11 o mAb 1C9. El SBF que
contenía un mAb a p27 de virus de leucemia felina (mAb A2; véase
Lutz y otros, J. Immunol. Meths. 56:209-220, 1983)
se utilizó como control negativo. El IRG2 conjugado a peroxidasa de
rábano silvestre se utilizó para detectar el anticuerpo
anti-gp40 que se había enlazado a las cavidades.
Los resultados que se muestran en la Tabla 1 demuestran que el ELISA
microplaca de p24/gp40 puede detectar de manera específica
anticuerpos anti-gp40.
| MAB | A2 | 2F11 | 1C9 |
| 100 \mug/ml | 0,038 | 0,465 | 1,291 |
| 50 \mug/ml | 0,062 | 0,415 | 1,421 |
| 10 \mug/ml | 0,039 | 0,159 | 2,617 |
| 5 \mug/ml | n/d* | 0,094 | 1,726 |
| 0 \mug/ml | 0,044 | 0,044 | 0,044 |
| *no determinado |
Se examinaron después 590 muestras de ratones de
los Estados Unidos en peligro de infección del VIF para determinar
los anticuerpos a p24 o a gp40. Para detectar los anticuerpos a p24,
se utilizaron PETCHEK (Mermer y otros, supra) y SNAP, que
ambos son equipos disponibles en el mercado de IDEXX Laboratories
(Westbrook, ME). Para detectar los anticuerpos a gp40, se utilizó
WITNESS, un equipo disponible en el mercado de Synbiotics
Corporation (San Diego, CA). Una combinación de los resultados
obtenidos de ambos tipos de pruebas mostró una prevalencia de un
13,8% (70/509) de muestras VIF-positivas.
De estas 70 muestras
VIF-positivas, 4 de ellas (5,7%) reaccionaron
solamente con antígenos p24 o gp40 en estos análisis comerciales.
Una muestra fue positiva solamente en pruebas basadas en p24,
mientras que otras tres muestras fueron positivas solamente en
pruebas basadas en gp40. Estas muestras discrepantes proporcionaron
resultados positivos en análisis ELISA, SNAP™ y Western Blot que
detectan anticuerpos tanto p24 como gp40. Este descubrimiento
demuestra que la detección de anticuerpos dirigidos tanto a p24
como gp40 es importante para los resultados definitivos en pruebas
de diagnóstico del VIF.
De manera notable, las 439 muestras que fueron
negativas en el análisis PETCHEK también fueron negativas en el
análisis SNAP que detecta anticuerpos tanto p24 como gp40. De este
modo, sin desear comprometernos a una teoría específica (lo cual no
es necesario para la práctica de la invención), proponemos que el
uso de los dos marcadores resulta de particular importancia por el
hecho de que cada marcador indica ciertas muestras que el otro
marcador no detecta, sin una correspondiente pérdida de
selectividad, es decir, sin un aumento significativo de los
resultados de falsos positivos.
Bajo los términos del Tratado de Budapest sobre
el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos
para los Objetivos del Procedimiento de Patente, los depósitos de
hibridomas 3H9, 1C9, 2H4 y 3H8 se han realizado con la American Type
Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, USA, donde a los
depósitos se les asignó el Número de Acceso HB12528, HB12529,
HB12530, y HB12531, respectivamente.
Son también posibles otras realizaciones. Por
ejemplo, los polipéptidos utilizados para capturar p24 y gp40
pueden ser inmovilizados respectivamente en zonas separadas de una
superficie sólida, donde la detección del anticuerpo enlazado en
cualquier zona indica que el donante felino de la muestra de prueba
está infectado por el VIF.
Claims (12)
1. Procedimiento para proporcionar una indicación
útil en el diagnóstico de si un felino está infectado con el virus
de la inmunodeficiencia felina (VIF), comprendiendo el procedimiento
poner en contacto una muestra de un felino in vitro con una
composición de captura de enlace de anticuerpos que comprende (i)
un primer polipéptido de captura que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF GAG p55, y (ii) un segundo
polipéptido de captura que contiene un fragmento inmunógeno de un
precursor VIF ENV gp130, caracterizado en que los
polipéptidos VIF ENV y GAG están presentes en niveles de porcentaje
en peso más elevados que en una mezcla simple de proteínas VIF
obtenida a partir de un virus descompuesto; y detectar la reacción
de anticuerpos en la muestra con la composición de captura.
2. Equipo para llevar a cabo un análisis que
determina si un felino está infectado con el virus de la
inmunodeficiencia felina (VIF), comprendiendo el dispositivo una
composición de captura de enlace de anticuerpos que comprende (i) un
primer polipéptido de captura que contiene un fragmento inmunógeno
de un precursor VIF GAG p55, y (ii) un segundo polipéptido de
captura que contiene un fragmento inmunógeno de un precursor VIF
ENV gp130, caracterizado en que los polipéptidos VIF ENV y
GAG están presentes en niveles de porcentaje en peso más elevados
que en una mezcla simple de proteínas VIF obtenida a partir de un
virus descompuesto; y una composición de detección de enlace de
anticuerpos para la detección de la presencia de anticuerpos
enlazados a la composición de captura.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o
equipo según la reivindicación 2, caracterizado en que la
composición de captura se incorpora a una fase que es inmiscible con
la muestra, preferiblemente una fase sólida.
4. Procedimiento o equipo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado en que el primer
polipéptido de captura comprende p24, p15,
\hbox{o
p10.} 5. Procedimiento o equipo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado en que el
segundo polipéptido de captura comprende gp110 o un bucle de
cisteína de gp40.
6. Procedimiento o equipo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado en que el
segundo polipéptido de captura tiene la secuencia ELGCNQNQFFCK (ID.
SEC. No: 1) o CELGCNQNQFFCK (ID. SEC. No: 2).
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, caracterizado en que comprende,
además, la aplicación de una composición de detección de enlaces de
anticuerpos a la fase sólida para permitir la detección de la
reacción de anticuerpos en la muestra con la composición de
captura.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, o
equipo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6,
caracterizado en que la composición de detección comprende
un primer polipéptido de detección que contiene un fragmento
inmunógeno de un precursor VIF GAG p55, y un segundo polipéptido de
detección que contiene un fragmento inmunógeno de un precursor VIF
ENV gp130, siendo marcados el primer y el segundo polipéptido de
detección con un grupo detectable.
9. Procedimiento o equipo según la reivindicación
8, caracterizado en que el segundo polipéptido de detección
comprende la secuencia ELGCNQNQFFCK (ID. SEC. No: 1) o CELGCNQNQFFCK
(ID. SEC. No: 2).
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, o equipo según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, 8 y 9, caracterizado en que la
composición de detección comprende un VIF descompuesto y un péptido
cuya secuencia es ID. SEC. No: 1 ó 2, siendo marcados tanto el VIF
descompuesto como el péptido con un grupo detectable.
11. Procedimiento o equipo según la
reivindicación 10, caracterizado en que el grupo detectable
es oro coloidal, un radionúclido, un fluoroforo, o una enzima que
catalice una reacción detectable.
12. Equipo según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 y 8 a 11, caracterizado en que la
composición de detección se aloja en un recipiente.
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