ES2272318T3 - Composiciones y metodos para el cultivo celular mejorado. - Google Patents
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Abstract
Una célula eucariótica manipulada genéticamente para expresar un gen para una proteína de interés, en donde la célula huésped com- prende una ruta de señalización de IGF-1 intracelular y en donde la proteína de inte- rés se expresa como un producto extracelular; y para sobreexpresar el gen de la ruta de señalización de IGF-1 PKB (proteína quinasa B), o para expresar una proteína PKB alterada que tiene una actividad incrementada o está activada constitutivamente, en donde dicho gen de la ruta de señalización de IGF-1 se expresa bajo el control de un elemento regulador heterólogo, y en donde dicha célula huésped es capaz de crecimiento en un medio libre de suero.
Description
Composiciones y métodos para el cultivo celular
mejorado.
La invención está dentro del campo de las
células eucarióticas y los métodos mejorados para la producción de
proteínas recombinantes. Más específicamente, la invención se
refiere a la modulación de la ruta de señalización de
IGF-1 en células eucarióticas cultivadas a fin de
obtener líneas celulares que puedan usarse en medios libres de
suero y/o libres de proteínas y/o libres de peptonas.
El suero se usa a menudo para la propagación de
líneas celulares de mamífero. Sin embargo, cuando se usan células
de mamífero para la producción de proteínas recombinantes, existe
una presión creciente para retirar el suero del procedimiento de
fabricación. Algunas de las razones impulsoras para poner en
práctica la tecnología del cultivo celular libre de suero son el
coste del suero, la variación entre lotes de suero y la calidad del
suero, problemas reguladores relativos a agentes biológicos del
suero y la carga de retirar proteínas séricas en el procesamiento
aguas arriba. Adamson R., 1994, Ann. Hematol. 68 Suppl 3:
S9-14; Thomas y otros, Animal Cell Technology:
Products of Today, Prospects for Tomorrow (Spier RE, Griffiths
JB & Berthold W (ed.) pp. ESACT
Butterworth-Heinemann, 1994)). También existe una
necesidad reconocida en la especialidad, por razones de coste
reducido y uniformidad de los medios incrementada, para la
producción de líneas celulares capaces de crecer en medio libre de
aditivos de peptona. Además, los factores de crecimiento peptídicos
son uno de los componentes más cotosos de los medios; la retirada
de tales factores de crecimiento alcanza una reducción de costes
significativa.
La adaptación de líneas celulares de producción
recombinantes para el crecimiento libre de suero puede ser una
etapa que consume tiempo en el desarrollo del procedimiento, con
efectos variables sobre la expresión de proteínas recombinantes y
la calidad de las proteínas (Barnes y otros, 1980, Anal. Biochem.
102: 255-270; Evans y otros, 1956, Cancer Res. 16:
77-86; Hamilton y otros, 1977, In Vitro 13:
537-547; Sinacore y otros, 1996, Biotech. Bioeng.
52:518-528). Por ejemplo, líneas celulares CHO han
sido adaptadas por Gandor y otros para el crecimiento en medio
libre no solo de suero y factores de crecimiento (tales como
insulina) sino de todas las proteínas (Gandor y otros 1995, FEBS
Lett. 377: 290-294). Sin embargo, con esta
adaptación, se producen dificultades provocadas por la inversión de
la línea celular. Las células, que inicialmente eran
DHFR-negativas, se invierten a un fenotipo
DHFR-positivo durante el cultivo continuo prolongado
en el medio libre de suero. Otros investigadores encontraron que
cultivos libres de suero previamente adaptados se invertían hasta el
fenotipo dependiente del suero cuando se cultivaban en medios que
contenían suero (Yao y otros, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88:
9422-9425).
Otra línea celular, denominada
"Veggie-CHO", se adaptó para poder crecer en
medio libre de suero y libre de proteínas mientras que todavía era
deficiente en DHFR (Rasmussen y otros, 1998, Cytotechnology
28:31-42). El procedimiento de adaptación implicaba
la reducción gradual de la complementación de suero en el medio y
la substitución de suero por bajos niveles de factores de
crecimiento, IGF-1 y transferrina, en un medio de
crecimiento celular enriquecido. Las células que habían crecido en
medio libre de suero se apartaron a continuación de estos factores
de crecimiento. Se ha observado que las células
Veggie-CHO mantienen un tiempo de doblamiento medio
de 22 horas en cultivos de crecimiento continuo durante un período
de 3 meses y han retenido el fenotipo deficiente en DHFR de sus
células DXB11-CHO parentales (id.). Sin embargo, el
procedimiento para alcanzar Veggie-CHO consumía
mucho tiempo y requería por encima de 160 pasadas. Adicionalmente,
había una enorme diferencia en la respuesta celular (que se medía
mediante viabilidad y tiempo de doblamiento) al crecimiento en medio
con bajas concentraciones de suero y al crecimiento en medio sin
suero. Solo haciendo una transición gradual hasta medio sin suero,
con un período de adaptación prolongado, se obtenían líneas
celulares (DHRF-) viables y
estables.
estables.
Un método que se ha propuesto para generar
líneas celulares que puedan crecer en medios con citoquinas,
hormonas y factores de crecimiento reducidos es hacer que las
células expresen un gen bcl-2 (WO 93/20200 de Evan y
otros). Evan y otros presentaron que si se toman células de
mieloma/hibridoma (que se elegían como células que no expresaban
esencialmente mRNA o proteína de blc-2) y se
introducía en ellas un constructo de expresión de
blc-2, las líneas celulares resultantes tenían más
resistencia al estrés y requerimientos disminuidos de suero de
ternero fetal (id.). Sin embargo, no se presentó la retirada
completa de suero y factores de crecimiento del medio en el que se
hacían crecer las células de hibridoma (id.). En otro estudio que se
dirigía a analizar la señalización de la quinasa MEK1, Greulich y
Erickson transfectaron células NIH-3T3 con un vector
de expresión que codificaba para una proteína de fusión que
contenía un mutante de MEK1 activado constitutivamente (denominado
DD) fusionado al dominio que se une a hormona del receptor de
estrógeno (que codifica un producto denominado
"Mek-ER") (Greulich y otros, 1998, J. Biol.
Chem. 273:13280-13288). La adición del ligando
sintético 4-hidroxitamoxifeno presumiblemente
activaba Mek-ER. Estos autores presentaron que, en
presencia de 4-hidroxitamoxifeno, las células que
expresaban Mek-ER podían proliferar en poco (0,5%)
suero (id.). Sin embargo, cuando las células se hacían crecer en
medio sin 4-hidroxitamoxifeno pero con suero al 10%,
proliferaban tres veces más rápidamente. Así, concluyeron que la
expresión de MEK1 no podía anular el requerimiento de suero y
factores de crecimiento en estas
células.
células.
Otra línea celular más, adaptada al crecimiento
en medio libre tanto de suero como de factores de crecimiento, se
ha denominado "Super CHO" (Pak y otros, 1996, Cytotechnology
22:139-146; véase también WO 97/05240). Para vencer
la necesidad de factor de crecimiento añadido exógenamente, vectores
de expresión que contenían los genes para transferrina e
IGF-1 se transfectaron en células CHO (id.). Además,
EP 0 666 312 describe un método para generar cultivos celulares que
pueden proliferar en medio libre de suero y libre de proteínas
transfectando células con un vector de expresión que codifica las
proteínas reguladoras del ciclo celular ciclina E y/o factor de
transcripción ESF-1.
Aunque se han realizado muchos avances técnicos,
todavía sigue existiendo una necesidad en la especialidad de
generar rápidamente y fiablemente cultivos celulares industriales
importantes que puedan proliferar en medios libres de suero y/o
libres de proteínas y/o libres de peptonas. La presente invención se
dirige a cumplir esta necesidad.
La invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de que las células que se han adaptado a lo largo de
muchas generaciones al crecimiento en medio libre de suero y libre
de proteínas, células Veggie-CHO, tienen
alteraciones en la cascada de señalización del receptor de
IGF-1. Los presentes inventores encontraron que los
fenotipos ventajosos de las células Veggie-CHO
podían duplicarse de una manera más controlada, constante y fiable
manipulando genéticamente componentes individuales de las rutas de
señalización de IGF-1.
De acuerdo con esto, en un aspecto la invención
proporciona una célula huésped eucariótica manipulada genéticamente
para expresar un gen para una proteína de interés, en donde la
célula huésped comprende una ruta de señalización de IGF
intracelular, y en donde la proteína de interés se expresa como un
producto extracelular; y para sobreexpresar el gen PKB (proteína
quinasa B) de la ruta de señalización de IGF-1 o
para expresar una proteína PKB alterada que tiene actividad
incrementada o está activada constitutivamente, en donde dicho gen
de la ruta de señalización de IGF-1 se expresa bajo
el control de un elemento regulador heterólogo, y en donde dicha
célula huésped es capaz de crecimiento en medio libre de suero. En
otro aspecto de la invención, la célula huésped se manipula
genéticamente para sobreexpresar un segundo gen de la ruta de
señalización de IGF-1. El segundo gen de la ruta de
señalización de IGF-1 puede ser MEK.
Genes de la ruta de señalización de
IGF-1 preferidos son un gen PKB (por ejemplo,
PKB\alpha, PKB\beta y PKB\gamma), un gen MEK (por ejemplo,
MEK1 y MEK2), un gen glut5, un gen glut1, un gen ERK (por ejemplo,
ERK1, también conocido como MAPK p44, y ERK2, también conocido como
MAPK p42), un gen JNK, un gen de proteína
14-3-3, un gen PDK, un gen IRS y un
gen de quinasa PI3. La proteína de interés puede ser cualquier
proteína recombinante de interés económico. Ejemplos de tales
proteínas incluyen, pero no se limitan a, un receptor de TNF
soluble, un receptor de IL-4 soluble, un receptor de
IL-1 tipo II soluble, un ligando de Flt3 soluble,
un ligando de CD40 soluble, una eritropoyetina, un anticuerpo y
hormonas, por nombrar solo unos pocos. Opcionalmente, el gen para
la proteína de interés y/o el gen o los genes de la ruta de
señalización de IGF-1 pueden conectarse a un
marcador seleccionable. Células huésped preferidas son células de
mamífero y más preferiblemente células de mamífero que se hacen
crecer en cultivo. Además, la célula huésped puede adaptarse para
crecer en medio libre de suero y/o libre de proteínas y/o libre de
peptonas.
En otro aspecto relacionado, la invención
proporciona un método para producir una proteína de interés,
comprendiendo el método cultivar la célula huésped eucariótica
anterior bajo condiciones tales que se expresa la proteína de
interés. Opcionalmente, el método implica recoger y/o purificar la
proteína de interés del cultivo celular. Tales métodos son
particularmente ventajosos para cultivar las células huésped en
medios libres de suero y/o libres de factores de crecimiento y/o
libres de proteínas y/o libres de peptonas. Además, los métodos de
la invención frecuentemente mejoraban los rendimientos de la
proteína de interés.
En otro aspecto más, la invención se refiere a
un método para producir una célula eucariótica para la producción
de una proteína de interés, comprendiendo el método manipular
genéticamente una célula eucariótica para expresar un gen que
codifica la proteína de interés, en donde la célula eucariótica
comprende una ruta de señalización de IGF-1
intracelular y en donde la proteína de interés se expresa como un
producto extracelular, y para sobreexpresar el gen PKB (proteína
quinasa B) de la ruta de señalización de IGF-1, o
para expresar una proteína PKB alterada que tiene actividad
incrementada o está activada constitutivamente, en donde dicho gen
de la ruta de señalización de IGF-1 se expresa bajo
el control de un elemento regulador heterólogo; y en donde dicha
célula huésped es capaz de crecimiento en medio libre de suero. Las
células pueden manipularse genéticamente en cualquier orden o
simultá-
neamente.
neamente.
Otro aspecto de la invención es un método para
producir una línea celular de mamífero capaz de crecimiento en
medio libre de suero, comprendiendo el método exponer células que se
han manipulado genéticamente para sobreexpresar el gen PKB
(proteína quinasa B) de la ruta de señalización de
IGF-1 a medio libre de suero, y aislar una línea
celular que crece en medio libre de suero. En modalidades
alternativas o adicionales, las células se exponen a medio libre de
proteínas y/o libre de peptonas, y las líneas celulares que crecen
en medio libre de proteínas y/o libre de peptonas se aíslan. Las
células pueden además manipularse genéticamente para sobreexpresar
al menos dos genes de la ruta de señalización de
IGF-1. Genes de señalización de
IGF-1 preferidos son genes MEK, genes de MAP
quinasa y genes PKB.
Figura 1. Las Figuras 1A y 1B comparan el
comportamiento (valoración de proteína de interés y viabilidad,
respectivamente) de fracciones reunidas de PKB (F, G y H) con la
línea celular parental (25H9) en condiciones de producción con
IGF-1 (F+, G+ y H+; también indicadas con líneas
sólidas) y sin IGF-1 (F-, G- y H-; también
indicadas con líneas punteadas).
Figura 2. Producción mediante PKB, fracciones
reunidas de control y células parentales en medios que contienen
peptona e IGF-1. Las Figuras 2A y 2B muestran el
porcentaje de viabilidad y la concentración de la proteína de
interés, respectivamente. Las fracciones reunidas se probaron en
medios con 5 g/l de peptonas Hy-Soy y 1 mg/ml de
IGF-1. C125h9 indica las células parentales que
expresan la proteína de interés; PKB indica las células parentales
transfectadas con el plásmido de expresión de PKB; y pCDNA indica
las células parentales transfectadas con el vector vacío
(pcDNA3).
Figura 3. Producción mediante PKB, fracciones
reunidas de control y células parentales en condiciones libres de
peptonas e IGF-1. Las Figuras 3A y 3B muestran el
porcentaje de viabilidad y la concentración de la proteína de
interés, respectivamente. Las fracciones reunidas se probaron en
medios sin peptonas Hy-Soy y sin
IGF-1. C125h9 indica las células parentales que
expresan la proteína de interés; PKB indica las células parentales
transfectadas con el plásmido de expresión de PKB; y pCDNA indica
las células parentales transfectadas con el vector vacío
(pcDNA3).
Figura 4. Análisis de expresión y fosforilación
de MAPK en extractos de células CHO que crecen en medio libre de
suero y libre de proteínas y en extractos de células CHO que crecen
en medio libre de suero en respuesta a IGF-1. Tanto
el Cuadro A como el Cuadro B son transferencias Western que se
sondan con anticuerpo
anti-fosfo-MAPK para detectar solo
la forma fosforilada de MAPK en los extractos celulares. El Cuadro A
presenta los resultados de un experimento del transcurso del tiempo
en el que las células se transfirieron desde medio que contenía
LongR^{3}-IGF-1 a medio libre de
IGF-1. Los carriles 1 a 3 son extractos de células
CHO cultivadas en medio libre de suero con
LongR^{3}-IGF-1 (carril 1), o
inicialmente desarrolladas con
LongR^{3}-IGF-1 y a continuación
cambiadas a medio libre de IGF-1 durante 30 minutos
(carril 2) o 4 horas (carril 3). Los carriles 4 a 6 contienen
extractos de células Veggie-CHO sin
IGF-1 a 0 minutos (carril 4), 30 minutos (carril 5)
o 4 horas (carril 6) después del comienzo del experimento. El
Cuadro B muestra los resultados de un experimento en el que
LongR^{3}-IGF-1 se añade de nuevo
al medio después de 8 horas de cultivo en medio libre de
IGF-1. El carril 1 en el Cuadro B contiene
extractos de células CHO cultivadas en medio libre de suero sin
IGF-1 durante 8 horas. Los carriles 2 a 5 contienen
extractos celulares recogidos a los 5 minutos (carril 2), 30 minutos
(carril 3), 1 hora (carril 4) o 4 horas (carril 5) después de la
nueva adición de LongR^{3}-IGF-1.
Los carriles 6 a 10 contienen extractos de células
Veggie-CHO recogidas antes de la adición de
IGF-1 (carril 6), 5 minutos (carril 7), 30 minutos
(carril 8), 1 hora (carril 9) o 4 horas (carril 10) después de la
adición de LongR^{3}-IGF-1.
Figura 5. Transferencias Western de MAPK y MEK1
en células 2A5-3 transfectadas con plásmidos de
expresión de MEK1 y en células de control. La Figura 5A demuestra
la proteína MAPK total presente en el extracto celular o la forma
fosforilada total de MAPK en el extracto celular. La Figura 5B
muestra una transferencia Western que demuestra la proteína MEK
total presente en los extractos celulares y la forma fosforilada
total de MEK en el extracto celular. M = marcadores del peso
molecular; carriles 2 y 3: fracciones reunidas de
2A5-3/MEK 1 y 2, respectivamente; carriles 4 y 5:
fracciones reunidas de 2A5-3/PKB/MEK 1 y 2,
respectivamente; carriles 6 y 7: fracciones reunidas de
2A5-3/myrPKB/MEK 1 y 2, respectivamente; carril 9:
2A5-3/pcDNA3 (control de vector vacío); carril 10:
clon de IL 1R Tipo II 25H0/PKB (para comparación.
Figura 6. Fracciones reunidas adaptadas a la
suspensión en medios que contienen suero se sembraron en medios de
suspensión libres de suero a densidades de siembra de 6 x 10^{5}
células/ml y se cultivaron a 160 rpm a 37ºC. La Figura 6A demuestra
el % de viabilidad de las fracciones reunidas adaptadas a lo largo
del tiempo. La Figura 6B demuestra la velocidad de crecimiento
media de las fracciones reunidas a lo largo del tiempo.
Figura 7. Adaptación de fracción reunida de
Glut5-B al crecimiento en medio libre de
IGF-1.
Numerosas moléculas extracelulares modulan las
funciones celulares de células eucarióticas a través de unión a
receptores de membrana sobre la superficie celular; las acciones de
estas moléculas extracelulares son mediadas a su vez por mecanismos
de señalización (Coffer y otros, 1998, Biochem J.
335:1-13). Algunas actividades son mediadas por
mecanismos de señalización de IGF-1 (Thomas y otros,
1994; Butler y otros, 1998, Comparative Biochemistry and
Physiology, Part B 121:19-26). La invención se basa,
en parte, en el descubrimiento de que aunque las células
Veggie-CHO no regulan al alza niveles de
IGF-1 o insulina endógenos, estas células tienen
más receptores de IGF-1 que DXB11 CHO o células CHO
adaptadas al crecimiento en medio libre de suero. Además, en
ausencia de IGF-1, la fosforilación del receptor de
IGF-1 no se regula al alza en células
Veggie-CHO. Sin embargo, cuando crecen en medio de
crecimiento que carece de IGF-1, las células
Veggie-CHO tienen un incremento en la fosforilación
basal de PKB y MAPK en comparación con células CHO desarrolladas en
suero, o con células CHO adaptadas a medio libre de suero con
IGF-1. Por otra parte, cuando se añade
IGF-1 a los medios de crecimiento, PKB y MAPK se
hiperfosforilan. Esta sensibilidad incrementada a
IGF-1 y la ausencia de sobreexpresión de
IGF-1 endógeno en las propias células indican que
las líneas celulares Veggie-CHO tienen señalización
de IGF-1 intracelular alterada.
Así, en una modalidad de la presente invención,
líneas celulares con propiedades ventajosas similares a las de
líneas celulares Veggie-CHO (por ejemplo, con
capacidad incrementada para crecer en medio que carece de suero,
factores de crecimiento y/o peptonas) se crean manipulando
genéticamente líneas celulares para expresar uno o más genes de la
ruta de señalización de IGF-1. Por ejemplo, para un
gen de la ruta de señalización de IGF-1 cuya
regulación al alza activa la ruta de señalización de
IGF-1, se manipulan genéticamente células para
expresar niveles superiores y/o productos génicos de la ruta de
señalización de IGF-1 constitutivamente activados.
Alternativamente, para un gen de la ruta de señalización de
IGF-1 cuya regulación a la baja conduce a la
capacidad de crecimiento en medio que carece de suero, factores de
crecimiento y/o peptonas, las células se manipulan genéticamente
para reducir o inactivar totalmente ("knock out") la expresión,
o para expresar formas mutantes (por ejemplo, mutante dominante) de
los productos génicos de la ruta de señalización de
IGF-1.
Para los propósitos de la invención, un "gen
de la ruta de señalización de IGF-1" excluye los
genes que codifican los propios factores de crecimiento tales como
IGF-1 e insulina, así como los genes para factores
de transcripción regulados por el ciclo celular y proteínas
mitocondriales tales como bcl-2. En cambio, la
invención se refiere a la manipulación de la maquinaria
intracelular descrita posteriormente que normalmente responde a
IGF-1 extracelular como parte de un mecanismo de
cascada de quinasas citoplásmicas. La traducción de la señal del
receptor de IGF-1 es revisada en Butler y otros,
1998, anteriormente.
Una ruta de señalización de
IGF-1 implica la activación de fosfatidilinositol
3-quinasa (PI-3K), que da como
resultado la generación de un segundo mensajero restringido a la
membrana, polifosfatidilinosida que contiene
3'-fosfato (Coffer y otros, 1998, anteriormente).
Los componentes de señalización de IGF-1 implicados
en la ruta de señalización de PI-3K incluyen el
receptor de IGF-1, IRSs, PKBs, PKB fosfatasa,
PI-3K y PDKs. Otra ruta de señalización de
IGF-1 implica la activación de
p21-MAPK. Componentes de señalización implicados en
esta ruta incluyen MEK, RAF y MAPK (incluyendo ERK1, también
conocido como p44 MAPK, y ERK2, también conocido como p42 MAPK).
Como otra respuesta a la señalización de IGF-1, las
células también regulan al alza el número de transportadores de
azúcar, por ejemplo glut1 y glult4, sobre la superficie celular. En
la presente invención, estos diversos productos génicos de la ruta
de señalización de IGF-1 se modulan manipulando
genéticamente las células de la manera apropiada. La modulación de
un componente o componentes de señalización incluye mutar y/o
sobreexpresar o regular al alza y/o expresar a la baja o regular a
la baja el gen o los genes que codifican el componente o los
componentes.
Genes de la ruta de señalización de
IGF-1 que ventajosamente son regulados al alza en
las composiciones y los métodos de la invención incluyen el
receptor de IGF-1 (Nº de Registro del Genbank NM
000875; Ullrich y otros, 1986, EMBO J. 5:2503-12;
revisado en LeRoith y otros, 1995. Endocr. Rev.
16:143-164) (particularmente, la subunidad \beta
que contiene el dominio de tirosina quinasa e interactúa con
moléculas de señalización aguas abajo), PKBs (PKB\alpha,
PKB\beta y PKB\gamma; revisados en Coffer y otros, 1998), las
MEKs (MEK1 y MEK2; véase, por ejemplo Pages y otros, 1994, EMBO J.
13:3003-3010, que describe la secuencia que codifica
MKE1 de hámster y Brott y otros, 1993, Cell Growth Different. 4:921
y Nº de Registro del Genbank S68267, que describe MEK2 murina), las
MAPKs (incluyendo p38, Han y otros, 1994, Science
265:808-811, Nº de Registro del Genbank L35253; y
particularmente p44/ERK1 y p42/ERK2, descritos en Owaki y otros,
BBRC 1992:1416), JNK1 (por ejemplo, la secuencia murina descrita en
el Nº de Registro del Genbank AB005663), JNK2 (por ejemplo, la
secuencia humana descrita en el Nº de Registro del Genbank L31951;
Sluss y otros, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:8376-8384),
JNK3 (por ejemplo, la secuencia murina descrita en el Nº de
Registro del Genbank AB005665), proteína
14-3-3 (Yu y otros, 1997, Mol.
Endocrinol. 11:1858), IRS-1 (Nº de Registro del
Genbank L24563; Araki y otros, 1994, Biochim. Biophys. Acta.
1221:353-6; Sun y otros, 1991, Nature 352:
73-77), IRS-2 (Nº de Registro del
Genbank AF073310; Vassen y otros, 1999, Mol. Endocrinol.
13:485-494; las proteínas IRS también son revisadas
en Waters y Pessin, 1996. Trends Cell Biol. 6:1), BAD (por ejemplo,
la secuencia murina descrita en el Nº de Registro del Genbank
L37296; Yank y otros, 1995, Cell 80:285-291), PI3
quinasa (revisada en Kapeller y Cantley, 1994, BioEssays 16:565;
véase además, por ejemplo, Escobedo y otros, 1991, Cell
65:75-82 para una descripción de la secuencia que
codifica la subunidad de 85 kd y Ruis y otros, 1992, Cell
70:419-429, que describe la secuencia que codifica
la subunidad de 110 kd), PDK1 (por ejemplo, el Nº de Registro del
Genbank AF086625 (murino) y AF017995 (humano); también revisado en
Galetic y otros, 1999, Pharmacol Ther. 82:409-25) y
PDK2 (por ejemplo, el Nº de Registro del Genbank U40282 y
NM004517). Según se muestra mediante los datos experimentales
presentados aquí, se prefiere particularmente la regulación al alza
de PKB, ERK1, ERK2 y MEK1 debido a que estas son las proteínas que
se encuentra que son reguladas al alza (según se mide mediante
hiperfosforilación) en las células Veggie-CHO que
estaban adaptadas a lo largo de muchas generaciones para crecer en
medio libre de suero y libre de proteínas. Además, también se
prefiere la regulación al alza de transportadores de azúcar tales
como glut1 y glut5 (Mueckler, 1994, Eur. J. Biochem.
219:713-725). Genes de la ruta de señalización de
IGF-1 que son ventajosamente regulados a la baja en
las composiciones y los métodos de la invención incluyen BAD, gsk3
(por ejemplo, el Nº de Registro del Genbank
NM-002093; Stambolic y Woodgett, 1994, Biochem. J.
303:701-704) y fosfatasas que desfosforilan
cualquiera de las proteínas, o sus substratos, que ventajosamente
son reguladas al alza.
En una modalidad de la presente invención, las
células se manipulan genéticamente para sobreexpresar un gen PKB a
fin de generar células que son más fácilmente adaptadas al
crecimiento y/o la producción en medio libre de suero y/o libre de
peptonas y/o libre de factores de crecimiento. Los genomas de
mamífero contienen tres genes que codifican PKBs (revisado en
Coffer y otros, 1998, Biochem. J. 335:1-13),
denominados PKB\alpha, PKB\beta y PKB\gamma, que pueden
usarse en la práctica de la invención. En un ejemplo no limitativo
de la invención descrito posteriormente, la sobreexpresión de
PKB\alpha en células CHO que expresan la proteína
IL-1R II recombinante mejoraba la viabilidad de las
células bajo condiciones de producción. Células transfectadas con
un vector de expresión de PKB que se hacían crecer sin
IGF-1 añadido al medio de producción tenían
viabilidades similares que células de control transfectadas con
vector vacío que se hacían crecer con IGF-1 en el
medio de producción. Además, las fracciones reunidas de células
manipuladas genéticamente para sobreexpresar PKB y adaptadas para
crecer en medio sin IGF-1 o peptona tienen
viabilidad superior y niveles proteínicos superiores de la proteína
de interés que fracciones reunidas de control o la línea celular
parental, C125H9. Así, la sobreexpresión de PKB en una célula de
producción de mamífero permite experimentos de producción
satisfactorios bajo condiciones libres de suero y/o libres de
proteínas y/o libres de peptonas.
En otra modalidad más de la presente invención,
MAP quinasa (MAPK) se regula al alza dentro de la célula de
producción. Según se demuestra aquí, la fosforilación de MAPK en
células Veggie-CHO se incrementa a niveles basales
y es hipersensible a la adición de IGF-1. La
hiperfosforilación en respuesta a la adición de
IGF-1 puede estar implicada en el crecimiento y la
supervivencia independientes de IGF-1 de células CHO
adaptadas para crecer en medio libre de suero y libre de proteínas.
Este cambio en el estado de fosforilación puede ser el resultado de
un incremento en la actividad de MEK en células adaptadas para
crecer en medio libre de suero y libre de proteínas.
Así, en otra modalidad de la presente invención,
la ruta de MEK se regula al alza en células de producción. Los
datos presentados aquí a modo de ejemplos no limitativos demuestran
que la fosforilación de MAPKs dentro de las células facilita su
adaptación al crecimiento en medio libre de suero y libre de
proteínas. Según se describe posteriormente, la sobreexpresión de
MEK1 (incluyendo diversas formas activas de MEK1) en células DXB11
facilitaba la adaptación rápida y directa de las células al
crecimiento libre de suero y al crecimiento en medio libre de suero
y libre de peptonas. La sobreexpresión de PKB junto con MEK no
parece influir en el procedimiento de adaptación libre de suero;
sin embargo, las células doblemente transfectadas (MEK/PKB y
MEK/myrPKB) pueden tener una ventaja en el crecimiento en ausencia
de IGFs y/o peptonas. La sobreexpresión de MEK en otras líneas
celulares dependientes del suero también puede facilitar la
adaptación al crecimiento libre de suero.
Así, otro aspecto más de la invención es
manipular genéticamente las células para modular dos o más de los
genes de la ruta de señalización de IGF-1. Así, la
invención incluye la regulación al alza y/o la regulación a la baja
de cualesquiera dos o más de los genes de la ruta de señalización de
IGF-1 mencionados anteriormente. Este aspecto de la
invención se ilustra a modo de ejemplos no limitativos
posteriormente, con lo que los genes tanto PKB como MEK1 se
coexpresan en líneas celulares de mamífero.
En otra modalidad más de la invención, las
células que pueden crecer en medio libre de suero y libre de
proteínas se derivan manipulando genéticamente las células para
expresar constitutivamente un transportador de azúcar sobre la
superficie de la célula. La ruta de señalización de
IGF-1 hace habitualmente que el transportador de
glucosa 1 (glut1) se regule al alza sobre la superficie celular.
Subsiguientemente, la captación de glucosa se incrementa y el
metabolismo celular se regula al alza (Coffer y otros, 1998,
anteriormente). Genes transportadores de azúcar para los que las
células pueden manipularse genéticamente para regular al alza
incluyen, pero no se limitan a, el gen glut1 y el gen glut5. Según
se describe posteriormente en una modalidad no limitativa de la
presente invención, células CHO se transfectaron con un vector de
expresión que dirige la sobreexpresión del gen transportador de
glucosa 5 (glut5). Las células CHO transfectadas crecían en medio
que contiene fructosa, y no glucosa, como la fuente de carbono.
Usar fructosa permite mayor control sobre la cantidad de fuente de
carbono usada por la célula, y crear menos subproductos que son
tóxicos para el cultivo. Por otra parte, después de un período de
adaptación, las células que sobreexpresaban el gen glut5 podían
crecer en un medio libre de suero y libre de proteínas, mientras
que las células transfectadas con un vector vacío de control no lo
hacían.
Por el término "genéticamente manipulado"
se entiende cualquier método de DNA o RNA recombinante usado para
crear una célula huésped eucariótica que exprese un gen a niveles
elevados, a niveles disminuidos o una forma mutante del gen. En
otras palabras, la célula se ha transfectado, transformado o
transducido con una molécula polinucleotídica recombinante, y de
ese modo se ha alterado a fin de hacer que la célula altere la
expresión de una proteína deseada. Métodos y vectores para
manipular genéticamente células y/o líneas celulares para expresar
una proteína de interés son bien conocidos por los expertos en la
especialidad; por ejemplo, diversas técnicas se ilustran en
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, eds.
(Wiley & Sons, Nueva York, 1988 y actualizaciones trimestrales)
y Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Cold Spring Laboratory Press, 1989). Técnicas de ingeniería
genética incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión,
recombinación homóloga dirigida y activación génica (véase, por
ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.272.071 de Chappel) y
transactivación mediante factores de transcripción manipulados
(véase, por ejemplo, Segal y otros, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
96(6):2758-63).
96(6):2758-63).
Métodos para regular al alza un producto génico
de la ruta de señalización de IGF-1 incluyen la
sobreexpresión de la proteína silvestre codificada, la expresión de
una proteína alterada (por ejemplo, mutante parcialmente o
constitutivamente activado) o manipular genéticamente las células
para expresar una proteína con una distribución celular alterada
(por ejemplo, una proteína PKB miristilada que se orienta a la
membrana celular, según se describe posteriormente en los ejemplos)
que tiene actividad incrementada. Aunque se desea la sobreexpresión
del producto génico de la ruta de señalización de
IGF-1, debe apuntarse que la expresión de niveles
extremadamente altos de cualquier producto génico, especialmente
productos génicos de la ruta de señalización de
IGF-1, es perjudicial o incluso letal para una
célula, y como tal debe evitarse. La valoración del nivel de
expresión apropiado puede manipularse de cualquiera de un número de
modos (por ejemplo, mediante elección de promotor o cambio en el
número de copias de genes) y está dentro de la experiencia de la
técnica.
Preferiblemente, las células se manipulan
genéticamente para expresar un producto génico de la ruta de
señalización de IGF-1 que es homólogo al, o deriva
de la misma especie que el, de la célula. Por ejemplo, en las
modalidades no limitativas descritas posteriormente, se usaron
cebadores basados en las secuencias de codificación de PKB\alpha
y MEK1 conocidas para clonar la secuencia correspondiente de células
de ovario de hámster chino, que a su vez se usaron como el huésped
de expresión. Sin embargo, como los genes de la ruta de señalización
de IGF-1 tienden a estar bien conservados, se
espera que incluso la expresión de productos génicos heterólogos
sea ventajosa.
Métodos para regular a la baja la expresión de
un gen de la ruta de señalización de IGF-1 incluyen
el uso de tecnologías de ribozimas, tecnologías de antisentido y
triple hélice, recombinación homóloga orientada para suprimir la
expresión o alterar de otro modo el gen endógeno, y expresión de
formas mutantes negativas dominantes del producto génico de la ruta
de señalización de IGF-1. Tales métodos para regular
al alza y/o regular a la baja la expresión de productos génicos son
bien conocidos por los expertos en la especialidad.
Por un "elemento regulador heterólogo" se
entiende un elemento codificado genéticamente que afecta a la
regulación transcripcional o traduccional de una secuencia
codificante conectada operablemente al mismo, en donde el elemento
normalmente no se encuentra en la naturaleza asociado o conectado
operablemente a la secuencia codificante. Sistemas reguladores
heterólogos pueden ser promotores, regiones potenciadoras, sitios de
iniciación transcripcional, señales de terminación transcripcional
(por ejemplo, señales de poliadenilación), secuencias de iniciación
traduccional, etc. Los promotores pueden ser promotores
constitutivos (por ejemplo, los derivados de genes caseros
("housekeeping") cuya velocidad de transcripción es
relativamente constante, o algunos promotores virales), promotores
inducibles (por ejemplo, el promotor de metalotionina que es
inducido en presencia de metales pesados), promotores específicos
para un tipo de tejido o célula (por ejemplo, los promotores de
globina) o promotores derivados de virus animales (por ejemplo, los
de CMV, SV40, adenovirales, herpesvirus, RSV, HIV, etc.). Los
potenciadores incrementan típicamente el nivel de transcripción a
partir de genes conectados operativamente. Los potenciadores
también pueden ser constitutivos, específicos para tejidos y/o
inducibles (por ejemplo, el potenciador de CMV, el potenciador de
SV40, el potenciador TAR de HIV).
Células huésped para usar en la invención son
células huésped ecuarióticas y preferiblemente células de mamífero.
Preferiblemente, las células también se manipulan genéticamente para
expresar un gen de interés. Aún más preferiblemente, las células
huésped son células de producción de mamífero adaptadas para crecer
en cultivo celular. Ejemplos de tales células comúnmente usadas en
la industria son células CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos),
MDCK, 293, 3T3, líneas celulares de mieloma (especialmente murino),
PC12 y WI38.
Células huésped particularmente preferidas son
células de ovario de hámster chino (CHO), que son ampliamente
usadas para la producción de varias proteínas recombinantes
complejas, por ejemplo citoquinas, factores de coagulación y
anticuerpos (Brasel y otros, 1996, Blood 88:
2004-2012; Kaufman y otros, 1988, J.Biol Chem 263:
6352-6362; McKinnon y otros, 1991, J Mol Endocrinol
6:231-239; Wood y otros, 1990, J. Immunol
145:3011-3016). La línea celular mutante deficiente
en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub y otros, 1980, Proc Natl
Acad Sci USA 77:4216-4220), DXB 11 y
DG-44 son las líneas celulares huésped CHO de
elección debido a que el eficaz sistema de expresión génica
seleccionable y amplificable DHFR permite una expresión de proteína
recombinante de alto nivel en estas células (Kaufman R.J., 1990,
Meth Enzymol 185:527-566). Además, estas células son
fáciles de manipular como cultivos adherentes o en suspensión y
exhiben estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y
las proteínas recombinantes que se expresan en ellas se han
caracterizado intensivamente y han sido aprobadas para el uso en la
fabricación clínica por las agencias reguladoras.
Para los propósitos de la invención, un gen para
una proteína de interés es un gen que codifica una proteína de
valor farmacéutico, medicinal, nutricional y/o industrial. Proteínas
de interés particularmente preferidas son fármacos basados en
proteína. Preferiblemente, las proteínas de interés se expresan como
productos extracelulares. Proteínas de interés que pueden
producirse usando los métodos de cultivo celular y las composiciones
de la invención incluyen, pero no se limitan a, un ligando de Flt3,
un ligando de CD40, eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina,
ligando de Fas, ligando para el activador del receptor de
NF-kappa B (RANKL), ligando inductor de la
apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), ORK/Tek, linfopoyetina
derivada de estroma tímico, factor estimulante de colonias de
granulocitos, factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos, factor de crecimiento de
células cebadas, factor de crecimiento de células pluripotenciales,
factor de crecimiento epidérmico, RANTES, hormona de crecimiento,
insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a
insulina, hormona paratiroidea, iterferones, factores de
crecimiento nerviosos, glucagón, interleuquinas 1 a 18, factores
estimulantes de colonias, linfotoxina-\beta,
factor de necrosis tumoral, factor inhibidor de leucemia,
oncoestatina-M y diversos ligandos para moléculas
de la superficie celular Elk y Hek (tales como los ligandos para
quinasas relacionadas con eph o LERKS). Descripciones de proteínas
que pueden expresarse de acuerdo con los métodos de la invención
pueden encontrarse en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for
Basic and Clinical Research. Vol. II (Aggarwal y Gutterman, eds.
Blackwell Sciences, Cambridge MA, 1998); Growth Factors:A
Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press
Inc., Nueva York, 1993) y The Cytokine Handbook (AW Thompson,
ed.; Academic Press, San Diego CA, 1991).
Receptores para cualquiera de las proteínas
mencionadas anteriormente también pueden expresarse usando los
métodos y las composiciones de la invención, incluyendo tanto formas
de receptor de factor de necrosis tumoral (denominadas p55 y p75),
receptores de interleuquina-1 (tipo 1 y 2), receptor
de interleuquina-4, receptor de
interleuquina-15, receptor de
interleuquina-17, receptor de
interleuquina-18, receptor de factor estimulante de
colonias de granulocitos-macrófagos, receptor de
factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores para
oncoestatina-M y factor inhibidor de leucemia,
activador del receptor de NF-kappa B (RANK),
receptores para TRAIL y receptores que comprenden dominios muertos,
tales como Fas o receptor inductor de la apoptosis (AIR).
Otras proteínas que pueden expresarse usando los
métodos y las composiciones de la invención incluyen un aglomerado
de antígenos de diferenciación (denominado proteínas CD), por
ejemplo, los descritos en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the
VIth International Workshop and Conference; Kishimoto, Kikutani
y otros, eds.; Kobe, Japón, 1996) o moléculas CD descritas en
talleres de trabajo posteriores. Ejemplos de tales moléculas
incluyen CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos para las mismas (ligando
de CD27, ligando de CD30 y ligando de CD40). Varios de estos son
miembros de la familia de receptores de TNF, que también incluye
41BB y OX40; los ligandos a menudo son miembros de la familia de TNF
(como son el ligando de 41BB y el ligando de OX40). De acuerdo con
esto, miembros de las familias de TNF y TNFR también se expresan
usando la presente invención.
Proteínas que son enzimáticamente activas
también pueden expresarse de acuerdo con la presente invención.
Ejemplos incluyen miembros de la familia de
metaloproteinasas-desintegrinas, diversas quinasas,
glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del
plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E,
apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de
IL-2, antitripsina alfa-1, enzima
convertidora de TNF-alfa y muchas otras enzimas.
Ligandos para proteínas enzimáticamente activas también pueden
expresarse aplicando la presente invención.
Las composiciones y los métodos de la invención
también son útiles para la expresión de otros tipos de proteínas
recombinantes, incluyendo moléculas de inmunoglobulina o porciones
de las mismas, y anticuerpos quiméricos (es decir un anticuerpo que
tiene una región constante humana que se acopla a una región de
unión a antígeno murina) o fragmentos de los mismos. Se conocen
numerosas técnicas por las que DNA que codifica moléculas de
inmunoglobulina puede manipularse para dar DNAs capaces de codificar
proteína recombinante, tales como anticuerpos monocatenarios,
anticuerpos con afinidad potenciada u otros polipéptidos basados en
anticuerpos (véanse, por ejemplo, Larrick y otros, 1989,
Biotechnology 7:934-938; Reichmann y otros, 1988,
Nature 332:323-327; Roberts y otros, 1987, Nature
328:731-734; Verhoeyen y otros, 1988, Science
239:1534-1536; Chaudhary y otros, 1989, Nature 339:
394-397).
Diversas proteínas de fusión también pueden
expresarse usando los métodos y las composiciones de la invención.
Ejemplos de tales proteínas de fusión incluyen proteínas expresadas
como fusión con una porción de una molécula de inmunoglobulina,
proteínas expresadas como proteínas de fusión con un resto de
cremallera, y nuevas proteínas polifuncionales tales como proteínas
de fusión de una citoquina y un factor de crecimiento (es decir,
GM-CSF e IL-3, MGF e
IL-3). WO 93/08207 y WO 96/40918 describen la
preparación de diversas formas oligómeras solubles de una molécula
denominada CD40L, incluyendo una proteína de fusión con
inmunoglobulina y una proteína de fusión con cremallera,
respectivamente; las técnicas analizadas allí son aplicables a otras
proteínas.
Sin embargo, para los propósitos de esta
solicitud, la definición de un gen para una proteína de interés
excluye genes que codifican proteínas que se usan típicamente como
marcadores seleccionables en un cultivo celular, tales como
marcadores auxotróficos, de antimetabolitos y/o antibióticos. No
obstante, la invención incluye el uso de un marcador seleccionable
como una ayuda para seleccionar células y/o amplificar clones que se
manipulan genéticamente para expresar un gen de interés y/o un gen
de la ruta de señalización de IGF-1.
Preferiblemente, el gen marcador seleccionable está situado
adyacente al gen de interés y/o un gen de la ruta de señalización
de IGF-1 de modo que la selección y/o la
amplificación del gen marcador seleccionará y/o amplificará el gen
adyacente.
Ejemplos específicos de genes que codifican
marcadores seleccionables son aquellos que codifican resistencia a
antimetabolitos, tales como la proteína DHFR, que confiere
resistencia a metotrexato (Wigler y otros, 1980, Natl. Acad. Sci.
USA 77:3567; O'Hare y otros, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1527); la proteína GPT, que confiere resistencia a ácido
micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2072), el marcador de resistencia a neomicina, que confiere
resistencia al aminoglicósido G-418
(Colberre-Garapin y otros, 1981, J. Mol. Biol.
150:1); la proteína Hygro, que confiere resistencia a higromicina
(Santerre y otros, 1984, Gene 30:147); y el marcador de resistencia
Zeocin™ (disponible comercialmente de Invitrogen). Además, los
genes de timidina quinasa de virus de herpes simple (Wigler y otros,
1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina
fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 48:2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y
otros, 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk^{-},
hgprt^{-} y aprt^{-}, respectivamente.
Diversos medios de cultivo tisular, incluyendo
medios de cultivo libres de suero y/o definidos, están disponibles
comercialmente. Los medios de cultivo tisular se definen, para los
propósitos de la invención, como medios adecuados para el
crecimiento de células animales, y preferiblemente células de
mamífero, en un cultivo celular in vitro. Típicamente, los
medios de cultivo tisular contienen un tampón, sales, una fuente de
energía, aminoácidos, vitaminas y elementos esenciales traza.
Pueden usarse cualesquiera medios capaces de apoyar el crecimiento
de la célula eucariótica apropiada en cultivo; la invención es
ampliamente aplicable a células eucarióticas en cultivo,
particularmente células de mamífero, y la elección de los medios no
es crucial para la invención. Medios de cultivo tisular adecuados
para el uso en la invención están disponibles comercialmente de, por
ejemplo, ATCC (Manassas, VA). Por ejemplo, puede usarse uno
cualquiera o una combinación de los siguientes medios: medio
RMPI-1640, medio de Eagle modificado de Dulbecco,
medio esencial mínimo de Eagle, medio F-12K, medio
de Dulbecco modificado de Iscove. Cuando se usa un medio definido
que está libre de suero y/o libre de peptona, el medio está
habitualmente altamente enriquecido con respecto a aminoácidos y
elementos traza (véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº
5.122.469 de Mather y otros y la Patente de EE.UU. Nº 5.633.162 de
Keen y otros).
El término "libre de suero", que se aplica
a los medios, incluye cualquier medio de cultivo celular de mamífero
que no contenga suero, tal como suero bovino fetal. El término
"libre de insulina", según se aplica a los medios, incluye
cualquier medio al que no se ha añadido insulina exógena. Por
exógeno se entiende, en este contexto, distinto a lo producido por
el cultivo de las propias células. El término "libre de
IGF-1", según se aplica a los medios, incluye
cualquier medio al que no se ha añadido factor de crecimiento
similar a insulina-1 (IGF-1) o
análogo (tal como, por ejemplo,
LongR^{3}-IGF-1, véase
posteriormente) exógeno. El término "libre de factor de
crecimiento", según se aplica a los medios, incluye cualquier
medio al que no se ha añadido factor de crecimiento (por ejemplo,
insulina, IGF-1) exógeno. El término "libre de
proteínas", según se aplica a los medios, incluye medio libre de
proteína, tal como, por ejemplo, transferrina y los factores de
crecimiento proteínicos IGF-1 e insulina, añadida
exógenamente. Los medios libres de proteínas pueden o no tener
peptonas. El término "libre de peptonas", según se aplica a
los medios, incluye cualquier medio al que no se han añadido
hidrolizados de proteína exógenos, tales como, por ejemplo,
hidrolizados de proteínas de animales y/o plantas. Los medios
libres de peptonas tienen las ventajas de una variabilidad de lote a
lote inferior y menos problemas de filtración que los medios que
contiene hidrolizados de plantas o animales. Los medios definidos
químicamente son medios en los que cada componente está definido y
se obtiene de una fuente pura, preferiblemente una fuente no
animal.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, y no a modo de limitación. Los expertos en la
especialidad reconocerán que pueden hacerse variaciones de la
invención encarnada en los ejemplos, especialmente a la luz de las
enseñanzas de las diversas referencias citadas aquí.
Ejemplo
1
El huésped Veggie-CHO (adaptado
al crecimiento en medio libre de suero) y las DXB
11-CHO huésped que requieren suero parentales se
manipularon genéticamente usando el método de selección y
amplificación génica de DHFR/MTX para secretar altos niveles de
ligando de Flt3 recombinante (McKenna y otros, 1995). Las fracciones
reunidas de transfectantes de Veggie-CHO se
seleccionaron con respecto al crecimiento en metotrexato (MTX) 150
nM para amplificar la expresión de proteína recombinante. La
selección de la fracción reunida de transfectantes de
Veggie-CHO en niveles de MTX superiores a una
concentración de 150 nM no daba como resultado un incremento
significativo en la expresión de esta molécula de citoquina. Las
fracciones reunidas (es decir, colonias) de transfectante de DXB1
se amplificaron por etapas hasta una concentración de MTX final de
250 nM según se describe por Ramussen y otros, 1998,
anteriormente.
Líneas celulares recombinantes que expresan
ligando de Flt3 clonal
(Veggie-CHO:FLT-3L y
DXB11:FLT-3L) se aislaron de estas fracciones
reunidas amplificadas finales usando la técnica de dilución
limitativa de 96 pocillos. Se controlaron el crecimiento y la
expresión de proteína recombinante de los cultivos. Las células
Veggie-CHO:FLT-3L exhibían mejor
crecimiento, tenían un tiempo de doblamiento más corto y alcanzaban
densidades celulares superiores de las células DXB
11:FLT-3L. Estas dos líneas celulares producían
concentraciones finales similares de proteína recombinante.
Debido a que las células
Veggie-CHO crecían independientemente de factores de
crecimiento peptídicos añadidos exógenamente, se examinó la
producción de insulina e IGF-1 por estas células.
Aunque se encontró que las células Veggie-CHO no
regulaban al alza insulina o IGF-1 endógenos, estas
células tienen más receptores de IGF-1 que células
DXB11 CHO o CHO adaptadas para el crecimiento en medio libre de
suero que contiene IGF-1. En ausencia de
IGF-1, la fosforilación del receptor de
IGF-1 no se regulaba al alza en células
Veggie-CHO. Sin embargo, cuando se hacían crecer en
medio que carecía de IGF-1, las células
Veggie-CHO tenían un incremento en la fosforilación
basal de PKB. Por otra parte, cuando se añadía IGF-1
a los medios de crecimiento, la PKB intracelular se
hiperfosforilaba. Esta sensibilidad incrementada a la señalización
de IGF y la ausencia de sobreexpresión de IGF-1
endógeno en las propias célu-
las indican que las líneas celulares Veggie-CHO tienen un incremento en la señalización de IGF-1 a través de PKB.
las indican que las líneas celulares Veggie-CHO tienen un incremento en la señalización de IGF-1 a través de PKB.
Ejemplo
2
Se purificó RNA total de células DXB11 CHO
usando un Neasy Mini Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) y se
transcribió inversamente en cDNA usando un First Strand cDNA
Synthesis Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El
alelo A del gen de proteína quinasa B (PKB) se amplificó a partir
del cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa como un
casete de NotI I usando los siguientes nucleótidos:
5'-TTGCGGCCGCATGAACGACGTAGC
CATTGTG-3' (Nº ID SEC: 1) y 5'-AATAATGCGGCCGCTCAGGCTGTGCCACTGG-3'(Nº ID SEC: 2) y el Expand Hi Fidelity PCR System (Boehringer-Mannheim Biochemicals). El fragmento génico de pkb amplificado se purificó sobre un gel de poliacrilamida al 6% y la banda apropiada se cortó del gel y se eluyó con 0,1 x SSC durante la noche a 37ºC. Después de la precipitación con etanol, el fragmento amplificado que codificaba el alelo A de pkb se clonó en pPCR-script amp SK(+) usando el PCR-Script Amp Electroporation-Competent Cell Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Varios clones se seleccionaron y se sometieron a secuenciación mediante métodos estándar. Uno de estos, el clon A, se eligió y se denominó pCR-pkbA4. El gen PKB se transfirió a continuación como un fragmento Not I al sitio Not I del plásmido pcDNA3 (Invitrogen) para crear el plásmido pcDNA3-PKBA. La composición del plásmido final se verificó mediante análisis de la secuencia.
CATTGTG-3' (Nº ID SEC: 1) y 5'-AATAATGCGGCCGCTCAGGCTGTGCCACTGG-3'(Nº ID SEC: 2) y el Expand Hi Fidelity PCR System (Boehringer-Mannheim Biochemicals). El fragmento génico de pkb amplificado se purificó sobre un gel de poliacrilamida al 6% y la banda apropiada se cortó del gel y se eluyó con 0,1 x SSC durante la noche a 37ºC. Después de la precipitación con etanol, el fragmento amplificado que codificaba el alelo A de pkb se clonó en pPCR-script amp SK(+) usando el PCR-Script Amp Electroporation-Competent Cell Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Varios clones se seleccionaron y se sometieron a secuenciación mediante métodos estándar. Uno de estos, el clon A, se eligió y se denominó pCR-pkbA4. El gen PKB se transfirió a continuación como un fragmento Not I al sitio Not I del plásmido pcDNA3 (Invitrogen) para crear el plásmido pcDNA3-PKBA. La composición del plásmido final se verificó mediante análisis de la secuencia.
Ejemplo
3
Un receptor de IL-1, clonado a
partir de células B mediante expresión en mamífero, se expresa en
muchos tipos de células (McMahan y otros, 1991, EMBO J. Vol 10:
2821-2832). Un fragmento de cDNA de huIL1R tipo II,
que codifica los 346 aminoácidos que comprenden el dominio
extracelular de la proteína de IL1R tipo II incluyendo la secuencia
de señal, se generó a través de PCR usando cDNA de IL1R tipo II como
un DNA de plantilla. El vector pG3.6I-huIL1R tipo
II se construyó subclonado un fragmento StuI-NotI
que codifica el IL1R tipo II humano soluble en pG3.6I cortado con
SmaI-NotI. El vector de expresión de CHO pG3.6I es
un derivado de pG3.6 (Aldrich y otros, 1998, Cytotechnology
28:9-17) que contiene una secuencia IRES (Jang y
otros, 1991, Genes Dev. 4:1560-1572) entre el cDNA
que codifica el gen de interés y el cDNA que codifica DHFR.
Una línea celular CHO que expresa IL1R tipo II
humano (la línea celular 25H9) se construyó transfectando células
CHO con el vector de expresión estable pG3.6I-huIl1R
tipo II usando el bien conocido método de transfección de
Lipofectamine. Las células CHO usadas para las transfecciones se
adaptaron previamente al crecimiento en medio libre de suero que
contenía LongR^{3}-IGF-1
(disponible comercialmente de JRH Biosciences Inc., Lenexa,
Kansas). La línea celular clonada 25H9 se derivaba de la fracción
reunida transfectada del vector pG3.6I-huIL1R tipo
II que se seleccionaba y amplificaba en metotrexato 300 nM.
Ejemplo
4
El plásmido de expresión de PKB,
pcDNA3-PKBA, y el vector vacío de control, pcDNA3,
se transfectaron separadamente en la línea celular 25H9 usando
Lipofectamine. Las transfecciones se realizaron por triplicado
usando 10 \mug de DNA plasmídico complejado con 100 \mul de
Lipofectamine (Gibco BRL, Rockford, MD) para 1 x 10^{7} células.
Las fracciones reunidas de células se transfectaron con
pCDNA3-PKBA o pcDNA3 (vector vacío) y las fracciones
reunidas de células se denominaron PKB-F,
PKB-G, PKB-H,
pcDNA3-F, pcDNA3-G y
pcDNA3-H. Las células se hicieron crecer en un
medio libre de suero que contenía
LongR^{3}-IGF-1 y se dejaron
recuperar en un medio no selectivo.
Después de 3 días, las células se transfirieron
a un medio selectivo que contenía 400 \mug/ml de G418 (Gibco).
Las células se sometieron a pasadas cada de 2 a 3 días hasta que
alcanzaban 90% de viabilidad. Las fracciones reunidas se
transfectaron a continuación a un medio selectivo que contenía G418
sin LongR^{3}-IGF-1, sin peptona
o sin LongR^{3}-IGF-1 ni
peptona.
Ejemplo
5
Las fracciones reunidas de PKB descritas en el
Ejemplo 4 y células 25H9 parentales (CL25H9) se sometieron a
pasadas durante dos días en matraces giratorios. Estas células se
usaron a continuación para sembrar matraces agitadores a 31ºC que
contenían medio libre de suero con peptonas y una osmolalidad de 300
mOsm. Se establecieron dos matraces agitados para cada fracción
reunida de células: uno contenía medio libre de
IGF-1 y el otro contenía medio con
LongR^{3}-IGF-1. Matraces
agitadores de 125 ml se sembraron con 30 ml de células a
aproximadamente 3,0 x 10^{6} células/ml. Se añadió al cultivo 1
mM de butirato sódico. Los matraces agitadores se pusieron en
comunicación con la atmósfera el día 0. Durante la fase de
producción de la proteína de IL1R tipo II, los cultivos se
verificaron muestreando con respecto a la densidad de células
viables (VCD), el porcentaje de viabilidad, el pH, la glucosa y el
lactato un día sí y uno no o cada tres días. Una alimentación de
aminoácidos, que elevaba las concentraciones de aminoácidos en
L-glutamina 4 mM, L-asparagina 2 mM,
L-isoleucina 0,5 mM, L-leucina 0,8
mM, L-triptófano 0,15 mM y
L-fenilalanina 0,363 mM, se administró el cuarto
día.
Como se muestra en la Figura 1, las fracciones
reunidas de PKB cultivadas sin
LongR^{3}-IGF-1 producían
concentraciones superiores de la proteína deseada (Figura 1A) y
exhibían mayor viabilidad celular (Figura 1B) que la línea celular
parental, CL25H9, cultivada sin
LongR^{3}-IGF-1. Para las
fracciones reunidas de PKB H y F sin
LongR^{3}-IGF-1, las
concentraciones de la proteína deseada eran comparables con la línea
celular parental cultivada con
LongR^{3}-IGF-1, indicando que la
sobreexpresión de PKB en células CHO permite experimentos de
producción sin la necesidad de añadir factor de crecimiento.
Ejemplo
6
Este experimento se diseñó para probar el efecto
de sobreexpresar PKB sobre la producción de una proteína de interés
en medio libre de suero que carece tanto de proteínas como de
peptonas. La línea celular parental 25H9 que expresa
IL-1R tipo II (etiquetada CL25H9 en las figuras), la
fracción reunida H de PKB y una de las fracciones reunidas de
vector vacío descritas en el Ejemplo 4, que se habían adaptado para
crecer en medio libre de IGF-1, se examinaron con
respecto a la expresión de IL-1R tipo II.
La alimentación de aminoácidos descrita en el
Ejemplo 5 se administró el día 4. Las líneas celulares se hicieron
crecer en (1) medio de producción que contenía peptona y
LongR^{3}-IGF-1 (Figura 2A y B) o
(2) medios de producción que no contenían peptona ni
IGF-1 (Figura 3A y B). Según se muestra en la Figura
3A, las células que expresaban PKB mantenían una viabilidad
superior que las células parentales o una fracción reunida de
células transfectadaws con plásmido de control pcDNA3. El día 10 del
cultivo, la fracción reunida de PKB tenía una viabilidad
significativamente superior en comparación con las células
parentales, C125H9, o la fracción reunida de vector vacío pcDNA. En
la Figura 3B, puede observarse que la fracción reunida de PKB tenía
concentraciones significativamente superiores que las células
parentales, C125H9, o la fracción reunida de vector vacío pcDNA.
Las Figuras 2A y 2B demuestran que incluso cuando los cultivos de
producción se establecen en medio que contiene
LongR^{3}-IGF-1 y peptonas, la
fracción reunida de PKB exhibía mejor viabilidad y una producción
algo superior de la proteína de interés.
Ejemplo
7
Este estudio examinaba la expresión y la
fosforilación de MAPK en células Veggie-CHO (que
crecen en medio libre de suero y se hacen crecer independientemente
de factores de crecimiento) y en células CHO que crecen en medio
libre de suero pero requieren factor de crecimiento peptídico en
cultivos de reserva (crecimiento) y en respuesta a la retirada de
IGF-1, o además de IGF-1.
Para determinar los efectos sobre la MAPK de
retirar IGF-1, la línea celular
Veggie-CHO, que está adaptada para el crecimiento
en medio libre de suero y libre de proteínas (libre de
IGF-1), y una línea celular adaptada para el
crecimiento en medio solo libre de suero se cultivaron cada una a
una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml en medio libre de
suero con LongR^{3}-IGF-1 a una
concentración final de 100 ng/ml. Las células se cambiaron a
continuación a medio libre de suero sin IGF-1 y 5 x
10^{6} células de cada tipo de célula se recogieron en diversos
momentos después del cultivo (es decir, 0,5 h, 1 h, 4 h, 8 h).
Para determinar los efectos sobre MAPK de añadir
IGF-1, la línea celular Veggie-CHO,
que está adaptada para el crecimiento en medio libre de suero y
libre de proteínas (y libre de IGF-1), y una línea
celular adaptada para el crecimiento en medio solo libre de suero
se cultivaron cada una durante 8 horas a una densidad celular de 2
x 10^{6} células/ml sin IGF-1 en un medio de
crecimiento libre de suero y libre de proteínas. Se añadió a
continuación LongR^{3}-IGF-1 hasta
una concentración final de 100 ng/ml. Se recogieron 5 x 10^{6}
células de cada tipo de célula en diversos momentos después de las
adiciones de LongR^{3}-IGF-1 (es
decir, 5 minutos, 0,5 h, 1 h, 4 h, 8 h).
Células de las muestras experimentales descritas
anteriormente, junto con cultivos de reserva de CHO adaptados para
el crecimiento en medio libre de suero y libre de proteínas, y
cultivos de reserva de CHO adaptados para el crecimiento en medio
libre de suero (que se habían mantenido con 100 ng/ml de
LongR^{3}-IGF-1) se recogieron y
se solubilizaron en detergente Triton. Los extractos celulares
resultantes se analizaron en 2 x geles de
SDS-PAGE-Tris-glicina
al 4%-20% y se electrotransfirieron sobre nitrocelulosa. Las
transferencias Western se sondaron con anticuerpo
anti-fosfo-MAPK (Promega
Corporation, Madison, WI) para detectar solo la forma fosforilada
de MAPK en los extractos.
Como muestra la Figura 4, el nivel basal de
fosforilación de MAPK observado en las células CHO adaptadas para
el crecimiento en medio libre de suero y libre de
IGF-1 es superior que el observado en las células
CHO adaptadas para el crecimiento en medio libre de suero con o sin
la adición de LongR^{3}-IGF-1. La
señal de mayor tamaño del doblete de MAPK (que contiene MAPK p44 y
MAPK p42) era significativamente más intensa en muestras
desarrolladas en medio libre de suero y libre de proteínas que en
muestras desarrolladas en medio libre de suero, con los anticuerpos
tanto anti-fosfo-MAPK como
anti-MAPK, sugiriendo que la expresión y la
fosforilación de MAPK está regulada al alza en células CHO
adaptadas al crecimiento en medio libre de suero y libre de
proteínas. Tanto en ausencia de IGF-1 como durante
la adición de IGF-1, ERK2/MAPK p44 y en una menor
extensión ERK1/MAPK p42 se fosforilaban mas altamente en los
cultivos de Veggie-CHO que en las células CHO
adaptadas al crecimiento en medio libre de suero. Este incremento
en la fosforilación podía ser un resultado de la actividad de
quinasa MAPK (MEK) incrementada observada o debido a la actividad
de fosfatasa MAPK disminuida en células
Veggie-CHO.
Ejemplo
8
Genes MEK de CHO silvestres se amplificaron a
partir de cDNA de células CHO en dos reacciones de PCR. El primer
grupo usado para la primera amplificación era
5'-GGATCCGCCGCCACCATGCCCAAGAAGAAGCCGAC-3'
(Nº ID SEC: 3) con
5'-CTGGAGTCTCTCGGGCGACATGTAT-3' (Nº
ID SEC: 4). La segunda amplificación por PCR usaba los cebadores
5'-CCCGAGAGACTCCAGGGGACT-3' (Nº ID
SEC: 5) con 5'-GCGGCCGCTCA
GATGCTAGCGGCATGGGTT-3' (Nº ID SEC: 6). Los fragmentos de PCR de MEK se dimensionaron sobre geles de poliacrilamida al 6% y se cortaron de los geles y se eluyeron con 0,1 x SSC durante la noche a 37ºC. Después de la precipitación con etanol, los fragmentos se clonaron cada uno en el plásmido pPCR-script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos génicos de MEK se verificaron mediante análisis de la secuencia y a continuación se clonaron en el plásmido pcDNA3 en una ligazón de tres días. El plásmido resultante se denominó pwtMEK-1.
GATGCTAGCGGCATGGGTT-3' (Nº ID SEC: 6). Los fragmentos de PCR de MEK se dimensionaron sobre geles de poliacrilamida al 6% y se cortaron de los geles y se eluyeron con 0,1 x SSC durante la noche a 37ºC. Después de la precipitación con etanol, los fragmentos se clonaron cada uno en el plásmido pPCR-script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos génicos de MEK se verificaron mediante análisis de la secuencia y a continuación se clonaron en el plásmido pcDNA3 en una ligazón de tres días. El plásmido resultante se denominó pwtMEK-1.
El gen MEK se transfirió del plásmido
pwtMEK-1 al plásmido pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen,
Carlsbad, CA) como un fragmento BamHI-NotI. Este
plásmido se denominó pwtMEK-20 y se sometió a
secuenciación para confirmar la presencia del gen MEK.
Ejemplo
9
La clonación molecular de DNA que codifica el
receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR) de
75-80 kDa humano se ha descrito con detalle en la
Patente de EE.UU. Nº 5.395.760 y Smith y otros, 1990, Science
248:1019, 1990. TNFR:Fc es un polipéptido de fusión que comprende
un dominio extracelular de TNFR conectado a una región constante de
IgG humana. El producto de traducción primario es una molécula
simple de TNFR soluble ligado a una cadena simple de Fc derivada de
IgG1 humana. Después de la traducción, pero antes de la secreción,
esta molécula de fusión se dimeriza a través de residuos de
cisteína en la región Fc. Polipéptidos de fusión de TNFR:Fc se han
descrito en, entre otros, la Patente de EE.UU. Nº 5.605.690.
La construcción del vector de expresión de
mamífero de TNFR:Fc pCAVDHFRrhuTNFR:Fc se describe en la Patente de
EE.UU. Nº 5.605.690. El vector pCAVDHFRrhuTNFR:Fc se transfectó en
células DXB-11 CHO usando reactivo Lipofectin™ de
Gibco BRL. Aproximadamente 10 \mug de DNA se añadieron a 10 placas
de cultivo tisular que contenían 2 x 10^{6} células DXB11 CHO.
Después de la transfección, las células se seleccionaron con
respecto a la expresión de DHFR y las colonias resultantes se
transfirieron a placas de 24 pocillos y se analizaron con respecto a
la expresión de TNFR:Fc. Para la amplificación, los cultivos de
expresión más alta se expusieron a concentraciones crecientes de
metotrexato y las células capaces de crecer en metotrexato 25 nM se
clonaron mediante dilución limitativa en placas de 96 pocillos. Los
clones de expresión más alta se transfirieron a un cultivo en
suspensión. La línea celular "2A5-3" se eligió
para el trabajo adicional, basándose en su alto nivel de expresión
de TNFR:Fc.
El alelo A del gen de proteína quinasa B (pkb)
de CHO se clonó en un vector de expresión como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2.
Se construyó un mutante de deleción miristilado
del gen PKB de CHO. Este mutante myrPKB se elaboró debido a
que se esperaba que fuera más activo que PKB silvestre en virtud de
su localización en la membrana celular. Un fragmento de DNA que
codifica el gen se amplificó mediante PCR a partir del
pCR-pkbA4 descrito anteriormente en el Ejemplo 2.
Los cebadores usados eran
5'-CCCGGGCCGCCACCATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGG
ACCCCAGCCAGC GCAACGACGGGGCTGAGGAGATGGAGGTGT-3' (Nº ID SEC: 7) y 5'-AATAATGCGGCC
GCTCAGGCTGTGCCACTGG-3' (Nº ID SEC: 8). El primer cebador anterior añadía un sitio de restricción de SmaI, una secuencia Kozak y la señal de miristilación de src (Cross y otros, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:1834-1842). También perdía los aminoácidos 4-129 del gen pkb (Kohn y otros, 1996, J. Biol. Chem. 271:21920-21926). La PCR se realizó usando el Expand Hi Fidelity PCR System (Boehringer-Mannheim Biochemicals).
ACCCCAGCCAGC GCAACGACGGGGCTGAGGAGATGGAGGTGT-3' (Nº ID SEC: 7) y 5'-AATAATGCGGCC
GCTCAGGCTGTGCCACTGG-3' (Nº ID SEC: 8). El primer cebador anterior añadía un sitio de restricción de SmaI, una secuencia Kozak y la señal de miristilación de src (Cross y otros, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:1834-1842). También perdía los aminoácidos 4-129 del gen pkb (Kohn y otros, 1996, J. Biol. Chem. 271:21920-21926). La PCR se realizó usando el Expand Hi Fidelity PCR System (Boehringer-Mannheim Biochemicals).
El fragmento génico de pkb miristilado se
purificó a partir de un gel de poliacrilamida al 6%. Se cortó del
gel y se eluyó con 0,1 x SSC durante la noche a 37ºC. Después de la
extracción con etanol, los fragmentos se clonaron cada uno en el
plásmido pPCR-script Amp SK(+) (Stratagene, La
Jolla, CA). El gen pkb miristilado se sometió a secuenciación a
partir de cuatro clones. Uno de los clones con la secuencia correcta
se seleccionó y se denominó pCR-mpkbA3. El gen
pkb miristilado procedente de este plásmido se clonó en
pcDNA3 como un fragmento SmaI-NotI. Este plásmido
se denominó pcDNA3-mpkbA3.
Ejemplo
10
Usando células de 2-3 días de
edad, platos de cultivo tisular de 10 cm se sembraron con 2,5 x
10^{6} células/ml/plato en medio de crecimiento adherente
reciente y a continuación se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%. Para
cada una de las tres líneas celulares, 2A5-3,
2A5-3 supertransfectada con
pcDNA3-pkbA y 2A5- supertransfectada con
pcDNA3-mpkbA3, se sembraron cinco platos. Para cada
plato que había de transfectarse, 15 \mug de DNA (pwtMEK1 o
pwtMEK20 del Ejemplo 8) se diluyeron en 0,8 ml de un medio de
transfección libre de suero que contenía Hepes, GHT, DMEM
F-12, L-Gln y
LongR^{3}-IGF-1 en un tubo. Una
mezcla de Lipofectamine (GibcoBRL) suficiente para 200 \mul de
Lipofectamine/plato en 0,8 ml/plato totales se elaboró en los medios
de transfección libres de suero. A cada muestra de DNA se añadieron
800 \mul de mezcla de Lipofectamine/SFTM para un total de 1,6 ml
por plato, se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
Cuando la confluencia de los platos era
aproximadamente 60%, cada plato se enjuagó dos veces con los medios
de transfección libres de suero y se añadieron 6,4 ml de los medios
de transfección a la mezcla de DNA/Lipofectamine, se mezclaron
suavemente y se depositaron sobre las células. Los platos se
incubaron a continuación a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 6 horas.
La mezcla de transfección se aspiró a continuación y se descartó y
los platos se volvieron a alimentar con 10 ml de un medio de
crecimiento apropiado y se volvieron a poner en la incubadora.
Después de 3-5 días de
postransfección, las células se retiraron mediante tripsinización y
se contaron a través de exclusión con azul de tripano en un
hemocitómetro. Las células se sembraron a continuación en matraces
T175 a aproximadamente 2,5-4,0 x 10^{6} células/30
ml/matraz. Para las células 2A5-3/PKB/MEK y
2A5-3/myrPKB/MEK, se añadió el agente selectivo
Bleocin™ a los medios de crecimiento a 30 \mug/ml para seleccionar
con respecto al plásmido que contiene el gen MEK. Los matraces se
dosificaron a continuación con medios que contenían 200 \mug/ml
de Zeocin™ como el agente selectivo. La dosificación de Zeocin™ se
redujo hasta 50 \mug/ml después de que se obtuvieran cultivos
estables. Se añadieron 400 \mug/ml de G418 (neomicina) a las
células transfectadas 2A5-3/MEK como el agente
selectivo y la dosificación se redujo hasta aproximadamente 200
\mug/ml después de que se obtuvieran cultivos estables.
Después de aproximadamente 10 días de selección,
las células formaban monocapas confluentes en sus matraces
respectivos. Las células se pusieron a continuación en medios
farmacológicos reducidos según se describe anteriormente y los
cultivos se expandieron. Las células de cada fracción reunida de
transfección se sembraron a continuación en matraces agitados para
adaptación a la suspensión.
Ejemplo
11
Dos fracciones reunidas de cada una de las
transfecciones del Ejemplo 10 se adaptaron al crecimiento en
suspensión. Las células se sembraron en 30 ml a 4 x 10^{5}
células/ml en un medio de suspensión en matraces agitados de 125 ml
y se cultivaron a 37ºC a 160 rpm. Estas células se subcultivaron
mediante centrifugación cada 2-3 días hasta
4-5 x 10^{5} células/ml. Después de una semana,
las células se habían adaptado satisfactoriamente al crecimiento en
suspensión según se demostraba por las viabilidades sostenidas y el
crecimiento razonable mostrados en la Figura 6.
Ejemplo
12
Las fracciones reunidas de transfectantes de MEK
adaptadas a la suspensión del Ejemplo 11 se analizaron en
transferencias Western para examinar la expresión de MEK y la
expresión de MAPK y la fosforilación en estas células. Las células
(5 x 10^{6}) se suspendieron en 250 \mul de tampón de lisis
celular Triton y se incubaron sobre hielo 15 minutos. Estas células
se centrifugaron a continuación a aproximadamente 13.000 rpm durante
15 minutos a 4ºC. Extractos celulares solubilizados con detergente
clarificados se analizaron mediante análisis de transferencia
Western. Los extractos se sometieron a electroforesis sobre geles de
SDS-PAGE con Tris-glicina al
4-20% y se electrotransfirieron a nitrocelulosa. Las
transferencias se sondaron con anticuerpo anti-MPA
(MAPK; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para detectar
proteína MAPK total presente en los extractos o se sondaron con
anti-fosfo-MAPK (Promega Corp.,
Madison, WI) para detectar solo la forma fosforilada de MAPK en los
extractos celulares (Figura 5A). Un segundo grupo de transferencias
que contenían los extractos celulares de muestra se sondó con
respecto a MEK y fosfo-MEK usando anticuerpos de New
England Biolabs Inc. (Beverly, MA).
Los resultados se muestran en la Figura 5. Los
carriles son como sigue: M = marcadores del peso molecular;
carriles 2 y 3: fracciones reunidas de 2A5-3/MEK 1 y
2, respectivamente; carriles 4 y 5: fracciones reunidas de
2A5-3/PKB/MEK 1 y 2, respectivamente; carriles 6 y
7: fracciones reunidas de 2A5-3/myrPKB/MEK 1 y 2,
respectivamente; carril 9: 2A5-3/pCDNA3; carril 10:
clon 25H9/PKB de IL1R tipo II. La flecha indica la posición de MAPK
(Figura 5A) o MEK (Figura 5B). Estos resultados demuestran que la
proteína de MEK se sobreexpresaba y los substratos para MEK (MAPK
p44 y p42) se hiperfosforilaban en las fracciones reunidas de
células transfectadas con MEK.
Ejemplo
13
Cada una de las fracciones reunidas adaptadas a
suspensión del Ejemplo 11 se sembró en matraces agitados a 6 x
10^{5} células/ml y se subcultivó cada 2-3 días en
medio libre de suero que contenía
LongR^{3}-IGF-1 y peptonas.
Cuando la velocidad de crecimiento de los cultivos empezaba a
recuperarse a niveles de fracciones reunidas que contenían suero,
la densidad de siembra inicial se disminuyó gradualmente hasta 4 x
10^{5} células/ml. Como se observa en la Figura 6, las células
empezaban a recuperarse después de 10 días en el medio libre de
suero. Se alcanzaban viabilidades consistentemente altas y buen
crecimiento después del subcultivo de las fracciones reunidas
transfectadas con MEK en medio libre de suero durante tres semanas.
Con la excepción de 2A5-3/pcDNA3, los cultivos
recuperaban y alcanzaban una viabilidad celular por encima de 90% y
velocidades de crecimiento de aproximadamente 0,75 genera-
ciones/día.
ciones/día.
Estos resultados demuestran que la
sobreexpresión de MEK en células DXB-11 facilita su
adaptación rápida y directa al crecimiento libre de suero. La
sobreexpresión de PKB junto con MEK no parece potenciar el proceso
de adaptación libre de suero. Sin embargo, la sobreexpresión de PKB
podía ayudar a la adaptación a otras condiciones de cultivo (por
ejemplo, ausencia de factor de crecimiento o peptonas).
Ejemplo
14
Las fracciones reunidas adaptadas a medio libre
de suero del Ejemplo 13 se evaluaron a continuación con respecto a
su capacidad para sobrevivir en medios libres de
IGF-1 o libres de peptonas. Como anteriormente, cada
una de las fracciones reunidas se sembró en matraces agitados a 6 x
10^{5} células/ml y se subcultivó cada 2-3 días.
A medida que las células se recuperaban y se adaptaban al medio
menos nutrido, la densidad de plantación se disminuía según se
analiza anteriormente. Los resultados de este experimento se resumen
en la siguiente tabla.
La sobreexpresión de un gen MEK1, con o sin
sobreexpresión de un gen PKB, facilitaba la adaptación al
crecimiento en medios libres de peptonas. Dos de las cuatro
fracciones reunidas de MEK adaptadas al crecimiento libre de suero
sobrevivían en medio sin IGF-1: una fracción reunida
que sobreexpresa MEK y una fracción reunida que sobreexpresa tanto
PKB como MEK. Sin embargo, el análisis más detallado de las
fracciones reunidas indicaba que la fracción reunida de PKB no se
adaptaba bien al crecimiento en medio sin IGF-1, de
hecho, no expresaba niveles tan altos de PKB como la fracción
reunida que se adaptaba bien (según se medía mediante transferencia
Western). La tinción de fracciones reunidas de células indicaba que
solo aproximadamente de 10 a 15% de esta fracción reunida expresaba
PKB (en oposición a más de 90% de la fracción reunida que se
adaptaba bien). Así, la PKB no parece facilitar la adaptación al
crecimiento en medio sin IGF-1.
Aunque la sobreexpresión de MEK1 facilitaba la
adaptación y el crecimiento rápidos en medios libres de suero y
libres de peptonas, la expresión de MEK1 no evitaba de forma
consiguiente los requerimientos de IGF-1. Así,
parece que la expresión de PKB\alpha, que evita los requerimientos
de IGF-1, podría combinarse ventajosamente con la
expresión de MEK1. En otras palabras, la sobreexpresión de MEK en
estas células CHO parecía facilitar el crecimiento en medios libres
de suero y libres de peptonas y la sobreexpresión de PKB parece
facilitar el crecimiento independiente de factores de crecimiento
(específicamente, factores de crecimiento proteínicos).
Ejemplo
15
La secuencia que codifica el transportador de
glucosa 5 (Glut5) humano se clonó usando RT-PCR.
cDNa de intestino delgado humano se adquirió de Clonetech (Palo
Alto, California) y se usó en la reacción de PCR. Los cebadores
5'-CCACCATCTAGATCACTGTTCCGAAGTGACAGGT-3'
(Nº ID SEC: 9) y 5'-CCCCAAGCTTGTCGACGCCGC
CACCATGGAGCAACAGGATCAGAGCATGAA-3' (Nº ID SEC: 10) se usaron en la reacción de PCR. El producto de PCR se clonó subsiguientemente en los sitios EcoRV-NotI de pcDNA3 para la expresión en células CHO.
CACCATGGAGCAACAGGATCAGAGCATGAA-3' (Nº ID SEC: 10) se usaron en la reacción de PCR. El producto de PCR se clonó subsiguientemente en los sitios EcoRV-NotI de pcDNA3 para la expresión en células CHO.
Células que crecen en medio libre de suero se
transfectaron por triplicado con pcDNA3-glut5 y
pcDNA3 usando Lipofectamine. Para la selección, las células se
sembraron a 6 x 10^{5} c/ml en medio que contenía glucosa,
peptonas HySoy, L-gln,
LongR^{3}-IGF-1, intralípidos y
G418. La densidad de siembra era 8 x 10^{5} c/ml para las pasadas
1 y 2 y a continuación volvía a 6 x 10^{5} c/ml.
Al alcanzar \geq 90% de viabilidad, las
fracciones reunidas de pcDNA3-glut5 y pcDNA3 se
pusieron en un medio de selección que contenía bicarbonato sódico,
sulfato ferroso, Pluronic F-68,
LongR^{3}-IGF-1, Hepes, cloruro
sódico y fructosa. Este medio no contenía glucosa y se denominó
medio selectivo de fructosa. Las fracciones reunidas se sembraron a
una densidad de 8 x 10^{5} células/ml. Aunque las fracciones
reunidas de pcDNA morían en una pasada, las fracciones reunidas de
glut5 (glut5-B, glut5-C y
glut5-D) se sometieron a de 12 a 35 pasadas en el
medio.
La fracción reunida de glut5-B
se seleccionó y se sembró en el medio de selección libre de glucosa
descrito anteriormente sin
LongR^{3}-IGF-1 pero que contenía
fructosa. Las células se sometieron a 14 pasadas y a continuación
se congelaron. Según se muestra en la Figura 7, una vez que las
células glut5-B se adaptaban al medio de selección
sin LongR^{3}-IGF-1, la viabilidad
se incrementaba hasta 87%.
Una de las fracciones reunidas transfectadas con
pcDNA3 procedentes del Ejemplo 14 se descongeló desde -70ºC a un
medio de selección elaborado con glucosa. Las células se hicieron
pasar con un volumen de 60 ml a un matraz agitador de 250 ml a 37ºC
tres veces a la semana mediante intercambio completo de medios. La
densidad de siembra inicial era 8 x 10^{5} células/ml. Las
células se hicieron pasar a continuación a un medio de crecimiento
idéntico al medio selectivo de fructosa pero que contenía glucosa y
no fructosa, hasta que la velocidad de crecimiento se estabilizaba
y la viabilidad alcanzaba aproximadamente 90%. Las células se
transfirieron a continuación al mismo medio de selección elaborado
sin IGF-1. Se realizaron dos intentos de alcanzar el
crecimiento en estos medios. En ambos casos, las células
transfectadas solo con el vector pcDNA3 (controles) morían.
Así, estos resultados demuestran que la
expresión constitutiva de glut5 evita la necesidad de factor de
crecimiento IGF-1 y permite el crecimiento sobre
medio que contiene fructosa en lugar de glucosa como una fuente de
energía.
Ejemplo
16
Este experimento se diseñó para evaluar el
efecto de sobreexpresar proteínas MEK silvestres y mutantes sobre
la dependencia del suero y la dependencia de factor de crecimiento
de cultivos celulares. Vectores de expresión que codifican para dos
formas hiperactivas mutadas de la proteína MEK (Mansour y otros,
1994, Science 265:966-970) se construyeron en
pCDNA3. SS-mutMEK tiene dos cambios de aminoácidos:
glu en lugar de ser en la posición 218 y asp en lugar de ser en la
posición 222. El constructo \Delta-nutMEK tiene
los dos cambios de aminoácidos anteriores así como una deleción de
los aminoácidos 32-51.
Los dos constructos de MEK mutantes se
transfirieron a las células adherentes dependientes del suero
2A5-3 y los transfectantes se seleccionaron y se
adaptaron para el crecimiento en cultivos en suspensión. Se fijaron
tres fracciones reunidas libres de suero de cada una de las dos
fracciones reunidas de suspensión transfectadas con mutMEK y de las
células 2A5-3/pwtMEK descritas en el Ejemplo 10.
Cada fracción reunida se sembró en matraces agitados a 6 x 10^{5}
células/ml y se subcultivó cada 2-3 días. Después de
aproximadamente cuatro semanas, las pasadas de 3 días se sembraron
a una densidad celular inicial disminuida de 5 x 10^{5}
células/ml. Además, después de la adaptación de las células al
crecimiento libre de suero, las células se evaluaron a continuación
con respecto al crecimiento en medios libres de peptonas y libres de
suero y medios libres de IGF-1 y libres de
suero.
Se evaluó el crecimiento de cada uno de los
diferentes transfectantes: las células transfectadas con vector
vacío pcDNA3 de control, las células transfectadas con MEK silvestre
y las células transfectadas con MEK mutante en medio libre de
suero. Fracciones reunidas de las tres células transfectadas con MEK
diferentes crecían mejor en medios libres de suero y en medios
libres de suero y libres de peptonas que las células transfectadas
con vector de control. Las fracciones reunidas transfectadas con
SS-mutMEK tenían las velocidades de crecimiento más
altas y las mejores viabilidades en medios libres de suero y en
medios libres de peptonas. Las células que expresaban el constructo
SS-mutME se adaptaban más eficazmente y rápidamente
al crecimiento libre de suero que las células que expresaban los
constructos wtMEK o delta-MEK.
La producción de proteínas recombinantes en
medio libre de suero también se examinó en fracciones reunidas de
células transfectadas con los vectores de expresión pcDNA3 (vector
vacío), PKB/MEK, MEK o MEK mutante. Las células se indujeron por
triplicado en diversos medios. Las células 2A5-3
transfectadas con el constructo SS-Mut MEK
superaban consecuentemente a todas las otras fracciones reunidas con
respecto a viabilidad y concentración. Estas células mantenían su
densidad de siembra inicial durante todo el experimento, lo que, en
combinación con concentraciones superiores, daba la productividad
específica acumulativa más alta. Sin embargo, todos los constructos
que expresaban MEK producían una productividad acumulativa superior
bajo condiciones libres de suero.
A continuación, se examinó el comportamiento de
células transfectadas con pCDNA3, MEK y MEK mutante en condiciones
de producción libres de peptonas y libres de suero. Las células se
indujeron por triplicado en medios libres de suero con y sin
peptonas. De nuevo, las fracciones reunidas de células transfectadas
con MEK y MEK mutante mostraban una productividad específica
superior que las fracciones reunidas de control. Además, el
constructo SS-Mut-MEK superaba
consecuentemente a todas las otras fracciones reunidas con respecto
a viabilidad y concentración.
Ejemplo
17
El efecto de sobreexpresar PKB se examinó en
células 293, COS 1 y CV 1. Las tres células huésped diferentes se
transformaron con pcDNA (vector vacío) o pcDNA-PKB
descritos en el Ejemplo 2 y 9. Además, 293 y CV1 también se
transformaban con el vector de expresión
pcDNA-myrPKB que se describe en el Ejemplo 9.
Las líneas celulares 293, CV1 y COS 1
transformadas transitoriamente se supertransfectaron con diferentes
plásmidos de expresión que dirigían la expresión de una proteína
recombinante de interés usada como un gen informador. La producción
de la proteína recombinante en las células supertransfectadas se
mejoraba en las células que sobreexpresaban PKB\alpha.
Se realizaron experimentos similares con
transformantes estables de células COS 1 y CV 1 que se habían
transformado con pcDNA (vector vacío) o los constructos de
expresión de PKB, y a continuación se supertransfectaron
transitoriamente con un vector de expresión para una proteína
recombinante. No se observaron incrementos consecuentes en la
expresión de proteína recombinante cuando se examinaban líneas
celulares no clonales. Sin embargo, un clon de CV1, KD4, que
expresa PKB aproximadamente 3 veces sobre el fondo, demostraba una
expresión de proteína recombinante mejorada cuando se comparaba con
un clon de pcDNA (PF1) u otro clon de PKB (KD12) que expresa muy
poca proteína PKB (según se mide mediante transferencia Western).
Así, la expresión de proteína recombinante transitoria incrementada
parece correlacionarse con el nivel de sobreexpresión de
PKB\alpha.
La adaptación al crecimiento en medio libre de
suero se examinó en los transformantes de células COS I. Los
resultados indican que la sobreexpresión de PKB permitía que las
células COS I se cultivaran bajo condiciones libres de suero.
Ejemplo
18
Células CV1 y células 293 transformadas
establemente con el vector de expresión de PKB se cultivan en medio
libre de suero. Las células que sobreexpresan PKB pueden crecer en
medio libre de suero. Las células que sobreexpresan PKB se
supertransfectan a continuación con un vector de expresión que
codifica MEK1. Estas células se adaptan a continuación al
crecimiento en medio libre de suero y libre de proteínas.
<110> Immunex Corporation
\hskip1cmMorris, Arvia E
\hskip1cmReddy, Pranhitha
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones y Métodos para el
Cultivo Celular Mejorado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2938-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> pendiente de cesión
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-08-25
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/171.949
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/168.948
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<151>
1999-12-03
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/150.645
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-08-25
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcggccgc atgaacgacg tagccattgt g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill31
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipggatccgccg ccaccatgcc caagaagaag ccgac
\hfill35
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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\hfill25
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<210> 5
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Artificial: cebador de DNA sintético
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\hfill21
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<210> 6
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\hfill30
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<210> 7
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 34
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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\hfill34
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador de DNA sintético
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipccccaagctt gtcgacgccg ccaccatgga gcaacaggat cagagcatga a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Una célula eucariótica manipulada
genéticamente
para expresar un gen para una proteína de
interés, en donde la célula huésped comprende una ruta de
señalización de IGF-1 intracelular y en donde la
proteína de interés se expresa como un producto extracelular; y
para sobreexpresar el gen de la ruta de
señalización de IGF-1 PKB (proteína quinasa B), o
para expresar una proteína PKB alterada que tiene una actividad
incrementada o está activada constitutivamente, en donde dicho gen
de la ruta de señalización de IGF-1 se expresa bajo
el control de un elemento regulador heterólogo, y
en donde dicha célula huésped es capaz de
crecimiento en un medio libre de suero.
2. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la célula huésped está manipulada
genéticamente para sobreexpresar un segundo gen de la ruta de
señalización de IGF-1.
3. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que el segundo gen de la ruta de
señalización de IGF-1 es MEK.
4. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el elemento regulador heterólogo es un
promotor viral.
5. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que el promotor viral se selecciona del
grupo que consiste en un promotor de CMV, un promotor de SV40, un
promotor de RSV y un promotor adenoviral.
6. La célula huésped de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la
proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en un
receptor de TNF soluble, un receptor de IL-4
soluble, un receptor de IL-1 tipo II soluble, un
ligando de Flt3 soluble, un ligando de CD40 soluble, CD39, CD30,
CD27, un TEK/Ork, IL-15, un receptor de
IL-15 soluble, Ox 40, GM-CSF, RANKL,
RANK, TRAIL, un receptor de TRAIL soluble, activador del
plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E,
apolipoproteína A-I, un receptor de
IL-2, un antagonista de IL-2,
antitripsina alfa-1, calcitonina, hormona del
crecimiento, insulina, insulinotropina, un factor de crecimiento
similar a insulina, hormona paratiroidea, un interferón, superóxido
dismutasa, glucagón, una eritropoyetina, un anticuerpo,
glucocerebrosidasa, una proteína de fusión de Fc, una globina, un
factor de crecimiento nervioso, una interleuquina y un factor
estimulante de colonias.
7. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 6, en donde la célula huésped está manipulada
genéticamente de forma adicional para expresar un primer marcador
seleccionable.
8. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que el gen que codifica el marcador
seleccionable es adyacente al gen de la ruta de señalización de
IGF-1.
9. La célula huésped de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la
célula huésped es una célula de mamífero.
10. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 9, en donde la célula huésped se selecciona del grupo
que consiste en CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1, MDCK, 293, 3T3, mieloma,
PC12 y WI38.
11. La célula huésped de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la
célula huésped es una célula CHO.
12. Un método para producir una proteína de
interés, comprendiendo el método cultivar la célula huésped
eucariótica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-11 bajo condiciones estables tales que se expresa
la proteína de interés.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, que comprende además recoger la proteína de interés.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
12 ó 13, en el que la célula huésped se cultiva en medio libre de
suero.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que el medio está libre de factor de crecimiento.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que el medio está libre de proteínas.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que el medio está libre de peptonas.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 12-17, en el que la célula
huésped es una célula CHO.
19. Un método para producir una célula
eucariótica para la producción de una proteína de interés,
comprendiendo el método manipular genéticamente una célula
eucariótica para expresar un gen que codifica la proteína de
interés, en donde la célula eucariótica comprende una ruta de
señalización de IGF-1 intracelular y en donde la
proteína de interés se expresa como un producto extracelular, y para
sobreexpresar el gen de la ruta de señalización de
IGF-1 PKB (proteína quinasa B), o para expresar una
proteína PKB alterada que tiene actividad incrementada o está
activada constitutivamente, en donde dicho gen de la ruta de
señalización de IGF-1 se expresa bajo el control de
un elemento regulador heterólogo; y
en donde dicha célula huésped es capaz de
crecimiento en medio libre de suero.
20. Un método para producir una línea celular de
mamífero capaz de crecimiento en medio libre de suero, comprendiendo
el método exponer células que se han manipulado genéticamente para
expresar el gen de la ruta de señalización de IGF-1
PKB (proteína quinasa B) a medio libre de suero y aislar una línea
celular que crece en medio libre de suero.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
20, que comprende además exponer las células a medio libre de
peptonas y aislar una línea celular que crece en medio libre de
peptonas.
22. El método de acuerdo con la reivindicación
20 ó 21, que comprende además exponer las células a medio libre de
proteínas y aislar una línea celular que crece en medio libre de
proteínas.
23. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, en el que la célula se
manipula genéticamente para sobreexpresar al menos dos genes de la
ruta de señalización de IGF-1.
24. El método de acuerdo con la reivindicación
23, en el que el segundo gen de la ruta de señalización de
IGF-1 se selecciona del grupo que consiste en un gen
MEK y un gen MAPK.
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