CN1276832A - 鉴定pkb激酶抑制剂的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于鉴定影响PKB活性的化合物的组合物及方法,所述化合物具有诊断和治疗疾病的医药用途。

Description

鉴定PKB激酶抑制剂的组合物及方法

发明所属领域

本发明属于分子生物学领域，包括蛋白激酶B激酶的鉴定及其医疗用途。发明背景

胰岛素与其它生长因子启动磷脂酰肌醇(PI)3-激酶的活化，该酶将PI4，5二磷酸(PIP2)转化成推定的第二信使PI 3，4，5三磷酸(PIP3)。有多种形式的PI 3-激酶，它们都能将磷脂酰肌醇(PtdIns)、磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns-4P)和磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PtdIns-4，5-P2)的D-3位置磷酸化，从而分别产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PtdIns-3，4-P2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PtdIns-3，4，5-P3，或PIP3)。

蛋白激酶B(PKB)处于PIP3的信号转导途径，位于PI 3-激酶的下游。参见，Franke等人，(1995)细胞(Cell)，81卷，727-736页。例如，如果将细胞与PI 3-激酶的抑制剂(已知最好的是渥曼青霉素或LY 294002)预温育或通过超量表达PI 3-激酶的显性负性突变体，可阻止胰岛素或生长因子活化PKB。参见，Burgering，B M.和Coffer，P.J.(1995)自然(Nature)，376卷，599-602页。而且，在PDGF受体(该受体磷酸化时与PI 3-激酶结合)上的酪氨酸残基的突变也可阻止PKBα(PKB的异构形式)的活化。最近的报道表明通过另一种PIP3下游的激酶PKB可自身活化。参见，Alessi，D.R.等人，Curr.Biol.7卷，261(1997)。该激酶称为PKB激酶或磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶(PDK1)，其活化需要PIP3。参见，Stokoe，D.等人(1997)科学(Science)，277卷，567-570页。

PKB是PIP3途经的关键酶，参与调节细胞生长。该酶可能在某些人类癌症中起作用；例如，已知其在部分卵巢癌、乳腺癌和胰癌中可被扩增。参见，Bellacosa，A.等人(1995)国际癌症杂志(Int.J.Cancer)64，280-285页以及Cheng，J.Q.等人(1996)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A) 93卷，3636-3641。该酶的扩增给予肿瘤细胞防止编程性细胞死亡的机制。这样，可以明显地看到抑制PKB活性的药物对于治疗具有不希望的细胞生长的疾病(包括癌症)有益。达到这种目的的一种方法是开发鉴定这种药物的测定方法。发明概述

本发明的第一个目的是描述PKB激酶、用于纯化并表达激酶的方法和组合物，以及编码这些激酶的cDNA序列。

本发明的第二个目的是描述由PtdIns(3，4，5)P₃活化PKB激酶以促进PKB的磷酸化。

本发明的第三个目的是描述用于鉴定化合物的组合物和方法，其中的化合物对涉及不希望的细胞生长的疾病(包括癌症)具有预防和治疗效果。

对于本领域熟练技术人员，基于本发明的充分公开，本发明的这些或其它目的是显而易见的。附图简述图1.得自绵羊脑的PKB激酶的纯化

A.该流程图概述了得自绵羊脑胞质溶胶的PKB激酶A-D的纯化，并记录了每一步骤所含的蛋白质的量。最初胞质溶胶级分的活性的总回收率为15.5％。

B.该图显示了Abs 280nm下PKB激酶活性图以及考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，分析最后柱中蛋白质的洗脱，在纯化PKB激酶A-D时的所有HPLC体积排阻层析(SEC)。HPLC-SEC用Biosilect柱(VT11.6ml，BioRad)进行。装载35-45μl的样品，流量为40μl/分钟，收集到80μl级分。SEC缓冲液包含0.15M NaCl、20mM HEPES pH7.4，40C、0.5mM EGTA、0.1mM EDTA、1％甜菜碱、0.03％Tween 20、0.01％叠氮化物、2mM B-甘油磷酸、1mM DTT以及胃蛋白酶抑制剂A、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶(均为2μg/ml)。

估计PKB激酶A-D的天然大小分别为58、58、68和54kD，其SDS-变性的大小分别为57、57、70和55kD(标明了在SDS-PAGE中相对于220、97、69、46和31kD分子量标准迁移的位置)。

C.PKB激酶活性与[³²P]-PtdIns(3，4，5)P₃结合蛋白质共纯化。将部分纯化的PKB激酶制剂进行SEC，分析级分的PtdIns(3，4，5)P₃依赖的PKB激酶活性(底部图)、[³²P]-PtdIns(3，4，5)P₃结合蛋白质(中间图，通过用[³²P]-PtdIns(3，4，5)P₃(18)探查复性的Western印迹)、(C)SDS-变性的蛋白质(上部图，通过银染SDS-PAGE凝胶)。

通过将蛋白质Western印迹到硝酸纤维素膜上(样品仅与SDS样品缓冲液加热至50℃)测定[³²P]PtdIns(3，4，5)P₃结合。将滤膜在包含1％NP40、1mM EGTA、0.01％叠氮化物的PBS中于4℃下温育12小时。将滤膜在另外还包含0.1％胆酸盐、50μgml^-1磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱、1mMMgCl₂和1mM DTT的上述溶液中封闭30分钟(室温)。将[³²P]PtdIns(3，4，5)P₃(从重组的p101/p120-PI3K、PtdIns(4，5)P₂和[γ³²P]-ATP制备(参见，L.R.Stephens等人，细胞89，105-114(1997))超声处理进封闭溶液中(10μCi，10ml)，加入到经封闭的滤膜中保持20分钟(室温)，然后用新鲜封闭溶液洗涤(5次，每次5分钟以上)，最后用包含1％NP40的PBS洗涤。将滤膜在空气中干燥并放射自显影。图2.PKB激酶A-D的特性

A.纯化的PKB激酶是PtdIns(3，4，5)P₃依赖的并可活化PKB。

测定分两步进行。第一步与混合的脂囊泡进行，其中有或无D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃(最终浓度为5μM)，有或无PKB激酶(6nM)、野生型(EE)-PKB(2.5μM)或T308A/S473A-(EE)-PKB)和[γ³²P]-ATP(50μM)。终止测定，用α(EE)-珠粒免疫沉淀PKB蛋白质并洗涤，然后与[³²p]-ATP(10μM)和髓磷脂碱性蛋白质(MBP；7μM)温育以确定固定化的PKB的活性。结果得自单个试验并表示为平均值±SE(n＝3-5)，另外四个试验得出了相似的结果。PKB激酶B、C和D得出十分相似的结果。

B.PKB磷酸化活化的磷脂特异性

测定包含恒定浓度的混合脂囊泡，该脂囊泡包含指定浓度的肌醇磷脂、(EE)-PKB(2.5μM)、PKB激酶A(5nM)和[γ³²P]-ATP(1μM，总体积12μl)。所示的数据收集自12个分离的试验，是平均值(n＝3-6，其平均SE为6％)。在PKB激酶B、C和D中观察到了相同方式的活化。

为了测定PKB和PKB激酶与脂囊泡的结合以及不同脂类对PKB磷酸化的影响，通过下述方法制备脂囊泡：将干燥脂膜超声处理进0.2M蔗糖、20mM KCl、20mM HEPES，pH7.4 30℃、0.01％叠氮化物中(在测定中最终浓度为200μM磷脂酰胆碱、150μM磷脂酰丝氨酸、20μM磷脂酰乙醇胺、10μM spingomylin加指定浓度的肌醇脂)。将这些物质与相关激酶在包含下列物质的测定缓冲液中混合：1mgml^-1BSA、0.12 M NaCl、1mM EGTA、0.2mM钙、1.5mM MgCl₂、1mM DTT、0.01％叠氮化物、5mM KCl、20mM HEPES，pH 7.4，30℃(大约50nM游离钙，均为在测定中的最终浓度)、有或无[γ³²P]-ATP(1μM最终浓度)和(EE)-PKB(2.5μM最终浓度)。如果该测定用于估计激酶与脂囊泡的结合，在30℃下保持4分钟后离心测定物(airfuge(Beckman)最大速率离心30分钟)。取出上清液的等分试样以用于测定和免疫印迹。用测定缓冲液快速漂洗沉淀物，再次离心并溶解在SDS-样品缓冲液中。如上所述定量PKB的磷酸化。

C.PKB与脂囊泡的结合

将(EE)-PKB(40nM)与以蔗糖填充的脂囊泡(或其载体)在与上述B部分中相似的条件下温育。4分钟后通过离心沉淀囊泡，通过用α-(EE)单克隆抗体免疫印迹测定上清液和沉淀中的PKB的量。插图免疫印迹显示了使用D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃(在测定中最大浓度为16μM，参见，A.Toker，L.C.Cantley，自然386，673-67642(1997))试验的结果。数据从共7个独立的试验中收集并表示为平均值(n＝2-3，这些平均值的平均范围为11.0％)。

D.PKB激酶与脂囊泡的结合

将PKB激酶A(5nM)与包含如图2B所示多种浓度肌醇磷脂的以蔗糖填充的脂囊泡(或仅其载体)混合。30℃下4分钟后，通过离心沉淀囊泡，在5μM D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃存在下测定PKB激酶活性。在不包含添加的肌醇磷脂的脂囊泡存在下，沉淀平均8.2％的总活性。在不包含添加的肌醇脂的脂囊泡离心后留在上清液中的活性被定义为100％以供其它处理参考。所显示的数据是平均值(n＝4-6，从16个分离的试验中收集，平均SE是8％)。图3.PKB激酶的一级结构

显示了分离自人U937细胞文库的cDNA定义的最小可能的ORF。源自绵羊脑PKB激酶A的四个肽序列在所述序列上以黑体显示。与其它蛋白激酶催化结构域同源的区域以实线框框出；与其它PH-结构域同源的区域以虚线框框出。图4.PKB激酶在cos-7细胞中的表达

将如图3所示的包含NH₂-端被标记的PKB激酶开放读框的哺乳动物表达载体((EE)-II是指整个ORF，(EE)-I是指‘激酶被折衷的’剪接变体)在cos-7细胞中瞬时表达。通过蛋白质的(EE)标记纯化蛋白质(使用myc抗体作为对照)，将等分试样进行Western印迹。然后将用α(EE)单克隆抗体探查的PVDF滤膜(由ECL检测；右上图)用考马斯蓝染色(左上图；所显示的数据仅适用于(EE)-II；用(EE)-I可获得相似的结果)。在脂囊泡的存在下(有或无D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃和[γ³²P]-ATP(300nM；分别为3μM和1μM的最终浓度))测定等分试样中的PKB激酶活性。放射自显影图显示了在PKB中的[³²P]。

图5显示了一种cDNA(SEQ ID.No.1)及其所编码的PKB激酶的氨基酸序列。发明详述

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请都被本发明引用作为参考，其程度就如本发明特定而单个地指出引用每个出版物或专利申请作为参考一样。定义

在开始时值得注意的是：除非特别指出，本文使用的所有技术和科技术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。通常，本文所使用的术语和下述的试验室操作步骤是本领域熟知的和常用的。使用标准技术进行重组核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶反应和纯化步骤通常按照制造厂商的说明进行。技术和操作步骤通常按照本领域的常规方法以及多种常用的参考文献进行(通常参见，Sambrook等人，分子克隆：试验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)冷泉港试验室出版社，冷泉港，纽约，此处引用作为参考)，这些参考文献在全文中提到。本文使用的术语和下述分析化学、有机合成化学和药物制备试验室操作步骤是本领域熟知的和常用的。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备和递送以及患者的治疗。

本文使用PKB(或蛋白激酶B)指大约60kD激酶，该酶与蛋白激酶c和蛋白激酶a具有同源性，如Coffer，P.J.和Woodgctt，J.R.(1991)欧洲生物化学杂志(Eu r.J.Biochem.)，201卷，475-481页和Jones，P.F.等人，(1991)美国国家科学院院报，88卷，4171-4175所述。也参见WO 97/22360和Stokoe，D.等人(1997)科学，277卷，567-570页。该定义包括所述酶的同工形式，其中四种是目前已知的。PKB也称作c-Akt或Rac-Pk。

磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸的‘生物立体异构体’的正式名称为(对于一个特定的脂肪酸组合物)(1-硬脂酰基，2-花生四烯酰基)sn-磷脂酰基D-肌醇(3，4，5)-三磷酸。在保留了所有用于定义特定异构体有关的可区别的精确度的同时，我们将其简称为D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃，第二个D是指甘油主链的手性，即D-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃是(2-花生四烯酰基，3-硬脂酰基)sn-磷脂酰基D-肌醇(3，4，5)-三磷酸。二棕榈酰衍生物简称为D-D-P/P-PtdInS(3，4，5)P₃。D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃的对映异构体是L-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃。

本文使用的术语“天然产生的”当用于物体时是指该物体可以在自然界中找到这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中、可以从天然来源分离并且没有被人类在试验室中特意修饰的多肽或多核苷酸是天然产生的。

本文使用的术语“多核苷酸”是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其中一种核苷酸的修饰形式。该术语包括单链或双链形式的DNA。

本文使用的术语“寡核苷酸”包括通过天然产生的和非天然产生的寡核苷酸连键连接在一起的天然产生的和修饰的核苷酸。寡核苷酸长度为200个碱基或更短的多核苷酸子集。寡核苷酸长度优选地为10-60个碱基，更优选地长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。尽管寡核苷酸可以是双链(例如，用于构建基因突变体的寡核苷酸)，但寡核苷酸通常为单链(例如，用于探针的寡核苷酸)。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。本文使用的术语“天然产生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的术语“修饰的核苷酸”包括具有被修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文使用的术语“寡核苷酸连键”包括如下的寡核苷酸连键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。如果需要，寡核苷酸可以包括用于检测的标记。

本文使用的术语“序列同源性”描述了两个核酸序列之间碱基匹配的比例或两个氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性以百分比(例如，50％)表示时，百分比是指与一些其它序列相比，PKB激酶序列长度匹配的比例。可以允许使用间隙(在两个序列之一上)以使匹配最大化；通常使用15个碱基或更短的间隙长度，优选的为6个碱基或更短，更优选的为2个碱基或更短。当使用寡核苷酸作为探针或处理时，在20个可能的寡核苷酸碱基对配对中，靶核酸或寡核苷酸序列之间的序列同源性通常不少于17个靶碱基匹配(85％)。优选地在10个可能的寡核苷酸碱基对配对中不少于9个匹配(90％)，最优选地在20个可能的寡核苷酸碱基对配对中不少于19个匹配(95％)。

如果两个氨基酸序列部分或完全相同，则两个氨基酸序列同源。例如，85％的同源性是指当两个序列进行序列对比以找出最大匹配性时85％氨基酸序列相同。可以允许使用间隙(在对比的两个序列之一上)以使匹配最大化；5或更短的间隙长度是优选的，更优选的是2或更短。替代的和优选的是，如果使用程序ALIGN(使用突变数据矩阵，间隙罚为6或更多)时两个蛋白质序列序列对比得分大于5(标准误差单位)，这两个蛋白质序列(或源自其的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)是同源的(即本文使用的术语)。参见Dayhoff，M.O.，蛋白质序列和结构图谱(Altas of ProteinSequence and Structure)，1972，5卷，国家生物医学研究基金会，101-110页以及该卷的增刊2：1-10页。当使用ALIGN程序进行最佳序列对比时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50％相同，它们是更优选的同源。

本文使用的“基本上纯的”是指一种物质是存在的主要物质(即在摩尔基础上，该物质比组合物中的任何其它种类的物质都多)，优选地基本上纯化的级分是其中所述物质占存在的所有大分子物质的至少大约50％(在摩尔的基础上)的组合物。通常基本上纯的组合物占存在于组合物中的所有大分子物质的大约80％以上，更优选地占大约85％、90％、95％和99％以上。最优选的是，将该物质纯化至基本上均质(通过常规的检测方法不能检测到组合物中的杂质)，其中所述组合物基本上由单一大分子物质组成。

本文所使用的化学术语按照本领域的常规用法使用，由McGraw-Hill化学术语字典(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(编者：Parker，S.，1985)，McGraw-Hill，旧金山，此处引用作为参考。

通过遗传工程从所克隆的基因生产蛋白质的方法是熟知的。参见，例如美国专利4,761,371，Bell等人，第6列第3行至第9列第65行(本文引用的所有专利参考的说明书在此引用作为参考)。因而，下述讨论意在作为本领域的概述，而并不意在反映本领域的全部现状。

当DNA区域功能性地相互相关时，可以有效地连接这些区域。例如，如果一种启动子控制序列的转录，可将其有效地连接到编码序列上；如果核糖体结合位点处于可允许翻译的位置时，可将其有效地连接到编码序列上。通常，有效地连接是指相连，在前导序列的情况下是指相连并位于读框内。

适合的宿主细胞包括原核生物、酵母细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))或芽孢杆菌属(Bacillii)。高等真核细胞包括如下所述的来源于哺乳动物的建立的细胞系(即cos细胞)。例证的宿主细胞为DH5a、大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌294(ATCC 31,446)。假单胞菌属(Pseudomonas)的种、芽胞杆菌属(Bacillus)的种和沙雷氏菌属(Serratia)的种也是适合的。

在一种昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)可用作表达外源基因的载体。(例如，参见Smith等，1983，病毒学杂志(J.Virol.)46：584；Smith，美国专利4,215,051)。在一个下述的实施方案中，用杆状病毒载体感染Sf9昆虫细胞，其中杆状病毒载体可表达具有6×组氨酸标记、或myc或EE-标记(即Glu-Glu-标记)的PKB激酶构建体。“E”指氨基酸谷氨酸。

可得到多种适合的微生物载体。通常，微生物载体包含可被预定的宿主识别的复制起点、在宿主中起作用的启动子以及表型选择基因，如编码赋予抗生素抗性或提供自养需要的蛋白质的基因。可以建造用于其它宿主的相似构建体。一般使用pBR322转化大肠杆菌。参见Bolivar等，基因(Gene)2，95(1977)。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因，这样就提供了简便的鉴别已转化的细胞的方法。表达载体应包含可被宿主生物体识别的启动子。这通常是指获自预定的宿主的启动子。最常用于重组微生物表达载体的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等人，自然275，615(1978)；Goeddel等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)8，4057(1980)；EPO申请公开文本36,776)以及tac启动子(H.De Boer等人，美国国家科学院院报80，21(1983))。

PKB激酶的鉴别

可以使用几种不同的技术鉴别PKB激酶，其中包括用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。在PKB激酶活性检测的某些点，预期可以确定PIP3对它的活化。参见，Stokoe，D.等人(1997)科学，277卷，567-570页。

可以使用的常规方法为细胞裂解物或获自细胞裂解物的蛋白质的免疫共沉淀、交联和通过梯度或层析柱共纯化，并鉴定在将靶蛋白质(优选的为PKB)或其它适合底物磷酸化的细胞裂解物中的蛋白质。这样的测定可以使用全长PKB靶或一个肽。一旦分离后，就可以鉴定这样的胞内PKB激酶，并与标准技术结合用于鉴别与其相互作用的其它蛋白质。例如，可以使用本领域技术人员熟知的技术(如Edman降解技术)确定与PKB相互作用的PKB激酶的至少部分氨基酸序列。(参见，例如，Creighton，1983，“蛋白质：结构及分子原理”(Proteins：Structures and MolecularPrinciples)，W.H.Freeman&Co.，纽约，34-49页)。所获得的氨基酸序列可以用作产生寡核苷酸混合物的指导，该寡核苷酸混合物可用于筛选编码这样的胞内蛋白质的基因序列。筛选可以通过，例如，标准杂交或PCR技术完成。产生寡核苷酸混合物和筛选的技术是周知的。(参见，例如，Ausubel，同上以及PR草案：方法和应用指导(PR Protocols：A Guide toMethods and Applications)，1990，Innis，M.等人，学术出版公司，纽约)。

另外，也可以使用可同时鉴别编码与PKB激酶相互作用的胞内蛋白质的基因的方法。这些方法包括，例如，以与熟知的λgtl 1文库抗体探查技术相似的方式使用标记的蛋白质或融合蛋白(例如，融合到标记(如酶、荧光、发光蛋白质或染料)上)或Ig-Fc结构域探查表达文库。

一种检测蛋白质在体内相互作用的而且不依赖于PKB激酶的激酶活性的方法是双杂交系统，对其详细描述仅是为了说明而非限制。对该系统已有描述(美国专利5,283,173 Chien等人，1991，美国国家科学院院报，88：9578-9582)，可以从Clontech(Palo Alto，CA)购买。简而言之，使用这样的系统，可以构建编码双杂交蛋白质的质粒：一种质粒包含编码转录活化剂蛋白质的DNA结合结构域的核苷酸(该核苷酸融合到编码PKB、或肽或融合蛋白的PKB核苷酸序列上)，另一种质粒包含编码转录活化剂蛋白质的活化结构域的核苷酸(该核苷酸融合到编码未知蛋白质的cDNA上，该cDNA已被重组进所述质粒并作为cDNA文库的一部分)。将DNA结合结构域融合质粒和cDNA文库转化进包含报导基因(例如HBS或lacZ)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株中，其中报道基因的调节区域包含转录活化剂结合位点。任何一种杂合蛋白质单独不能活化报道基因的转录；DNA结合结构域杂合体不能这样是因为其不提供活化功能，活化结构域杂合体不能这样是因为其不能定位活化剂结合位点。两种杂合体蛋白质的相互作用重新组成了有功能的活化剂蛋白质，导致了报道基因的表达，其表达是通过测定报道基因产物检测的。

双杂交系统或相关的方法可用于筛选与“诱饵”基因产物相互作用的蛋白质的活化结构域文库。为了例证而非限制，PKB或肽或其融合蛋白可用作诱饵基因产物。将全部基因组或cDNA序列融合到编码活化结构域的DNA上。将该文库和编码融合到DNA结合结构域的诱饵PKB基因产物杂合体的质粒共转化进酵母报道菌株中，在形成的转化体中筛选表达报道基因的转化体。纯化这些菌落，分离负责报道基因表达的文库质粒。然后使用DNA测序鉴定由文库质粒编码的蛋白质。

可以使用本领域常用的方法建造细胞系的cDNA文库，在该cDNA文库中可以检测与诱饵细胞周期靶基因产物相互作用的蛋白质。例如，按照本文所述的具体的系统，可以将cDNA片段插入载体中以便其可以在翻译时融合到GAL4的转录活化结构域上。可以将该文库与诱饵细胞周期靶基因-GAL4融合质粒一起共转染进酵母菌株中，该酵母菌株包含由含有GAL4活化序列的启动子驱动的lacZ基因。融合到GAL4转录活化结构域上的cDNA编码的蛋白质(该蛋白质可与诱饵周期靶基因产物相互作用)可重新组成活性的GAL4蛋白质，由此驱动HIS3基因的表达。可以通过表达HIS3的菌落在缺乏组氨酸的半固体琼脂培养基的培养皿上的生长检测它们。然后从这些菌株中纯化cDNA，并使用本领域常用的技术将其用于生产和分离与诱饵周期靶基因相互作用的蛋白质。

一旦使用双杂交测定分离到蛋白质后，就可进行独立的测定以确定该蛋白质是否具有激酶活性。这样的测定在本领域是熟知的，其例子由Stokoe，D.等人(1997)，科学，277卷，567-570页描述。

              编码PKB激酶的核酸

按照本发明的编码PKB激酶的核酸可从多种不同来源获得。它可获自DNA或RNA，如聚腺苷酸化的mRNA，该mRNA可分离自，例如，组织、细胞或整个生物体。核酸可以直接获自DNA或RNA，或获自cDNA文库。核酸可以获自特定发育阶段并具有所需的基因型、表型的细胞(例如致癌转化的细胞或癌细胞)等。

包含编码按照本发明的多肽的核苷酸的核酸可包括：仅包含PKB激酶的编码序列、PKB激酶的编码序列和其它编码序列(例如，编码前导、分泌、导向、酶促、荧光或其他诊断肽的序列)、PKB激酶的编码序列和非编码序列(例如，在5＇或3＇端任一端或分散在编码序列中的不翻译的序列，如内含子)。包含不中断地编码PKB激酶多肽的核苷酸序列的核酸是指所述核苷酸序列包含编码PKB激酶多肽的氨基酸的序列，在编码序列中无非编码核苷酸中断或干扰，例如，无内含子。这样的核苷酸序列也可以描述为连续的。

按照本发明的核酸也可包含表达控制序列，该序列可有效地连接到如上所述的核酸上。短语“表达控制序列”是指调节多肽表达的核酸序列，其中多肽由与它有效连接的核酸编码。表达可以在mRNA或多肽的水平上调节。这样，表达控制序列包括与mRNA相关的元件和与蛋白质相关的元件。这样的元件包括启动子、增强子(病毒的或细胞的)、核糖体结合序列、转录终止子等。当表达控制序列以这样的方式起作用或完成编码序列的表达时，表达控制序列为有效地连接到核苷酸编码序列上。例如，当启动子有效地连接到编码序列5＇上时，编码序列的表达由启动子驱动。表达控制序列相对于正常的基因可以是外源的或内源的。

按照本发明的核酸可以基于核酸杂交进行选择。双链核酸制剂相互杂交的能力是其核苷酸序列互补性的表现，例如，核苷酸之间的碱基配对，如A-T、G-C等。这样，本发明也涉及可与包含图5所示的核苷酸序列(SEQID NO：1)的核酸杂交的核酸。可与后一种序列杂交的核苷酸序列具有互补的核酸链，或在聚合酶(即适当的核酸合成酶)存在下作为核酸的模板。本发明包括核酸的两条链，如有义链和反义链。

可以选择杂交条件以选择与图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)具有所需数量的核苷酸互补的核酸。能与这样的序列杂交的核酸在序列之间优选地具有50％的互补性，更优选地为70％互补性。具体地说，本发明涉及可与图5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)在严格条件下杂交的DNA序列。本文所使用的“严格条件”是指任何在核酸之间至少有95％核苷酸互补性、优选地97％互补性时可以杂交的条件。这样条件包括：例如Northern杂交：在42℃下的5×SSPE、10×Denhardts溶液、100μg/ml新变性并剪切的鲑精DNA、50％甲酰胺、2％SDS；用于从cDNA文库克隆的杂交：在42℃下的1×PAM、0.1％SDS、50％甲酰胺。

按照本发明，核酸或多肽可包含与在图5所示的核苷酸或氨基酸序列(SEQ ID NO：1)有一个或多个不同。对核苷酸和/或氨基酸序列的改变或修改可以通过任何可使用的方法(包括定点和随机突变)完成。

编码按照本发明的PKB激酶的核酸可以包括天然产生的PKB激酶基因中的核苷酸，例如，天然产生的多态性、正常或突变的等位基因(核苷酸或氨基酸)中的核苷酸、在天然哺乳动物(人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔)群体中发现的突变中出现的核苷酸。术语天然产生的是指核酸获自天然来源，如动物组织和细胞、体液、组织培养细胞、法医样品。PKB激酶天然产生的突变可包括核苷酸序列的缺失(例如，截短的氨基或羧基末端)、取代或添加。可以检测这些基因并按照本领域技术人员所知的方法通过核酸杂交分离。可以认识到，与其它致癌基因类似，天然产生的PKB激酶变体包括缺失、取代和添加，其产生了在宿主细胞和生物体中病理条件。

本发明的编码PKB激酶多肽的核苷酸序列可以包含在天然产生的基因、转录物或cDNA(例如，如在图5中所示的(SEQ ID NO：1))中发现的密码子，该核苷酸序列也可以包含编码相同氨基酸序列的简并密码子。

本发明的另一个方面是PKB激酶独特的核苷酸序列。PKB激酶独特的核苷酸序列是指存在于PKB激酶(例如，在图5的核苷酸序列中(SEQ IDNO：1))中、但却很少或不常出现在其它核酸中的确定顺序的核苷酸，尤其是不出现在动物核酸中，优选地为哺乳动物，如人、大鼠、小鼠等。有义和反义核苷酸序列都包括在内。按照本发明的独特的核酸可使用常规方法确定。包含PKB激酶的独特序列的核酸可用作杂交探针(例如，Northern印迹)以鉴定PKB激酶在包含核酸混合物的样品中的存在。杂交可以在严格条件下进行以选择与探针至少有95％相同(即互补)的核酸，但是也可以使用严格程度较低的条件。独特的PKB激酶核苷酸序列也可在其5＇或3＇端符合读框地融合到本专利全文提到的多种核苷酸序列，包括PKB激酶编码序列的其它部分、酶、GFP等、表达控制序列等。

杂交可依赖于所需的选择性在不同条件下进行，如Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)，1989描述。例如，为了特异性地检测PKB激酶，可以使寡核苷酸与靶核酸在一定条件下杂交，其中寡核苷酸仅与PKB激酶杂交，例如，当寡核苷酸与靶100％互补时。如果需要选择少于100％核苷酸互补(例如至少大约99％、97％、95％、90％、70％、67％)的靶核酸，可以使用不同的条件。因为PKB激酶基因中的突变可以引起疾病或病理情况，例如，癌症、良性肿瘤，可以在诊断时使用按照本发明的寡核苷酸。例如，具有癌症症状或其它与PKB激酶信号传递途径相关的情况的患者可以通过使用按照本发明的寡核苷酸诊断疾病，使用聚合酶链式反应与其后的DNA测序鉴定序列是否正常。在一个优选的方法中，本发明涉及诊断癌症的方法，该方法包括：使包含靶核苷酸的样品与寡核苷酸在靶核苷酸和该寡核苷酸可以杂交的条件下接触；检测杂交，其中所述寡核苷酸包含PKB激酶序列，优选地包含PKB激酶的独特序列；确定与寡核苷酸杂交的靶核酸的核苷酸序列。该序列可以按照多种方法确定，这些方法包括分离靶核酸或其cDNA并按照所需方法确定其序列。

              细胞生长紊乱的诊断

可以使用多种方法诊断和预测细胞生长紊乱(包括癌症)，并可鉴定具有这种紊乱倾向的受治疗者。

这样的方法可以使用试剂，例如，如上所述的PKB激酶核苷酸序列和PKB激酶抗体。具体地说，这样的试剂可以用于，例如：(1)PKB激酶基因突变存在的检测，或者检测相对于非细胞生长紊乱状态而言PKB激酶mRNA的过量表达或表达不足；(2)相对于非细胞生长紊乱状态而言PKB激酶基因过度丰富或不足；(3)检测PKB激酶调节的信号传递途径的紊乱或失常。

本文描述的方法可以通过，例如，使用预先包装的诊断试剂盒进行，该试剂盒包含至少一种本文所述的特定的PKB激酶核苷酸序列或PKB激酶抗体试剂，它可以很方便地在，例如，临床装置中使用以诊断表现出细胞活化紊乱失常的患者。

要检测PKB激酶，可以使用任何有核细胞作为基因组核酸的最初来源。要检测PKB激酶表达，可以使用PKB激酶在其中表达的任何细胞类型或组织。

基于核酸的检测技术描述如下。肽检测技术也叙述如下。

            PKB激酶基因及转录物的检测

在PKB激酶基因内的突变可以利用许多技术检测。得自任何有核细胞的核酸可以作为这种测定技术的开始，可按照本领域技术人员熟知的标准核酸制备方法分离。

DNA可以用于生物样品的杂交或扩增测定以检测基因结构的失常，这些失常包括点突变、插入、缺失和染色体重新排列。这样的测定可以包括，但并不限于Southern分析、单链构象多态性分析(SSCP)以及PCR分析。

这样的检测PKB激酶特定突变的诊断方法可以包括，例如，使包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并突变体的核酸与一种或多种标记的核酸试剂接触并温育，所述核酸获自样品，如源自患者的样品或其它适当的细胞来源，所述核酸试剂包括如上所述的重组DNA分子、克隆的基因或其简并突变体，接触并温育的条件适合于这些试剂对PKB激酶内与其互补的序列的特异性退火。这些核酸试剂的长度优选地为至少15至30个核苷酸。在温育后，从核酸分子杂交体中除去所有非退火的核酸，然后检测杂交后的核酸分子的存在(如果存在这样的分子的话)。使用这样的检测方法，可以将得自目标细胞类型或组织的核酸固定化到，例如，固体支持物(如在微滴定板或聚苯乙烯珠粒上的膜或塑料表面)上。在这种情况下，在温育后，上述的非退火的、标记的这类核酸试剂易于除去。剩余的退火并标记的PKB激酶核酸试剂的检测可以通过使用本领域技术人员熟知的标准技术完成。为了确定基因突变是否存在，可以比较核酸试剂退火的PKB激酶基因序列与正常基因预期的退火方式。

检测在患者样品中或其它的适当的细胞来源中的PKB激酶基因特异性核酸分子的另一种诊断方法可以包括其扩增(例如，通过PCR，在Mullis，K.B.，1987，美国专利4,683,202中提出的试验性实施方案)，其后为使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。将形成的扩增序列与如果所扩增的核酸仅包含正常拷贝的PKB激酶基因时预期的序列进行比较，以确定是否存在基因突变。

             PKB激酶基因产物的检测

针对上述野生型或突变的PKB激酶基因产物或其保守的变体或肽片段的抗体也可用于本文所述的细胞生长紊乱诊断和预测。这样的诊断方法可用于检测PKB激酶基因表达水平的失常，或在PKB激酶的结构和/或瞬间、组织、细胞或亚细胞位点的失常，该方法可在体内或体外进行，如在活组织检查时。

要分析的组织或细胞类型通常包括已知或可能包含表达PKB激酶的细胞(例如，如渗入发炎组织的中性细胞)的组织或细胞类型。本文使用的蛋白质分离方法可以，例如，是Harlow和Lane描述的方法(Harlow，E.和Lane，D.，1988，“抗体：试验室手册”(Antibodies：LaboratoryManual)，冷泉港试验室出版社，冷泉港，纽约)，本文引用其全部作为参考。所分离的细胞可以源自细胞培养物或患者。分析得自培养物的细胞在评价可以用作基于细胞的基因治疗技术的一部分的细胞时是必须的步骤，或替代的是，在测定化合物对PKB激酶基因表达的影响时是必须的步骤。

例如，如上所述的抗体或抗体片段在本发明中可用于PKB激酶基因产物或其保守变体或肽片段的定量和定性检测。这可以通过，例如，使用荧光标记的抗体的免疫荧光技术(见下)与光学显微镜、流式细胞仪、荧光测定法检测相结合完成。

用于本发明的抗体(或其片段)或融合蛋白或偶联蛋白质可以在组织学上(如免疫荧光、免疫电子显微镜或非免疫测定)用于PKB激酶基因产物或其保守变体或肽片段的原位检测。

原位检测可以通过从患者身上取出组织样品、向其加入本发明标记的抗体或融合蛋白完成。抗体(或片段)或融合蛋白优选地通过将标记的抗体(或片段)覆盖到生物样品上使用。通过使用这种方法，不仅可以确定PKB激酶基因产物或保守变体或肽片段的存在，也可以确定其在所检测的样品中的分布。使用本发明，本领域的普通技术人员易于认识到：可以修改多种组织学方法的任何一种(如染色方法)以完成这样的原位检测。

PKB激酶基因产物或其保守的变体或肽片段的免疫测定或非免疫测定一般包括：在可检测的标记抗体存在下温育样品(如在细胞培养基上培养的生物液体、组织提取物、新收获的细胞或细胞裂解产物)，其中的标记抗体可以鉴定PKB激酶基因产物或其保守的变体或肽片段；通过任何一种本领域熟知的技术检测结合的抗体。

可以将生物样品接触并固定化在固相支持物或载体(如硝酸纤维素膜)或其它可固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的固体支持物上。然后用适合的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测地标记的PKB激酶抗体或融合蛋白处理。第二次用缓冲液洗涤固相支持物以除去未结合的抗体或融合蛋白。然后可通过常规方法检测在固体支持物上结合的标记的数量。

“固相支持物或载体”意在包括任何可结合抗原或抗体的支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。载体的性质为了本发明的目的在一定程度上可溶或不溶。支持物事实上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子可以结合到抗原和抗体上。这样，支持物构型可为圆形(如珠粒)或圆柱形(如试管的内表面或棒柱的外表面)。另外，表面可以是平面的，如片状或测试带等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员知道许多其它适合用于结合抗体或抗原的载体，或者可以通过使用常规试验确定适合的载体。

给定的PKB激酶抗体或融合蛋白的结合活性可按照熟知的方法确定。本领域技术人员通过使用常规试验可以确定每个测试的可操作的和优选的测定条件。

对于抗体，方法之一(其中抗体可以被可检测地标记)是通过将抗体连接到酶上并在酶免疫测定(EIA)中使用(Voller，“酶联免疫吸附剂测定(ELISA)”(The Enzyme Linked Immunosorbent Assay)(ELISA)1978，诊断地平线(Diagnostic Horizons)2：1-7，微生物协会季刊，Walkersville，MD)；Voller等人，1978，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)31：507-520；Butler，1981，酶学方法(Meth.Enzymol.)73：482-523；Maggio(ed.)，1981，酶免疫测定(Enzyme Immunoassay)，CRC出版社，Boca Raton，FL，，Ishikawa等人，(eds.)，1981酶免疫测定，Kgaku Shoin，东京)。与抗体结合的酶可与适当的底物(优选的为显色底物)在一定的方式下反应以产生可以检测的化学部分，该化学部分可通过，例如，分光光度法、荧光测定法或可视方式检测。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不限于)苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天门冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测可以通过比色方法完成，该方法使用酶的显色底物。检测也可以通过视觉将底物酶促反应的程度和相似的制备标准加以比较完成。

检测也可以通过使用多种其它免疫测定方法之一完成。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可以使用放射免疫测定(RIA)检测PKB激酶(参见，例如，Weintraub，B.放射免疫测定原理(Principles ofRadioimmunoassays)，放射配体测定技术的第七次训练课，内分泌协会，1986年3月，此处引用作为参考)。放射性同位素可以通过如使用γ计数仪或闪烁计数仪或通过放射自显影检测。

也可以用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露在适当波长的光下时，其存在可通过荧光检测。最常使用的荧光标记化合物为异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和荧光胺。

抗体也可以使用发射荧光的金属(如¹⁵²Eu或镧系的其它金属)可检测地标记。可以使用金属螯合基团(如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA))将这些金属连接到抗体上。

也可以通过将抗体偶联到化学发光化合物上可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在确定化学发光剂标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子为鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯。

另外，也可以使用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统内发现的一类化学发光，催化蛋白质可增加化学发光反应的效率。生物发光蛋白质的存在通过检测发光的存在确定。用于标记的重要的生物发光化合物为荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

                    药物制剂

可以将已确定影响PKB激酶基因表达或PKB激酶活性或PKB激酶与其任一结合伴侣相互作用的化合物(包括但不限于PIP3或PKB)以治疗有效剂量施用于患者，来治疗或改善造血细胞生长紊乱(包括癌症)。治疗有效剂量是指足以引起这样的紊乱症状改善的化合物的量。

                    有效剂量

这样的化合物在细胞培养物或实验动物中的毒性或治疗效果可通过标准药物方法确定，例如用于确定LD₅₀(50％群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果间的剂量比就是治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀。治疗指数大的化合物是优选的。在可以使用表现出毒性副作用的化合物的同时，应该仔细设计将这样的化合物朝向有效组织位点的递送系统以使对未感染的细胞的潜在破坏最小化，从而降低副作用。

从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于制定在人中使用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地处于循环浓度的范围内，该浓度包括毒性很小或无毒性的ED₅₀。依赖于所使用的剂量形式和所用的施用路线剂量可在此范围内变化。对于任何在本发明的方法中使用的化合物，治疗有效剂量最初可从细胞培养物测定中估计。在动物模型中制定剂量以达到循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养物中确定的IC₅₀(即达到症状最大抑制率一半的测试化合物的浓度)。这样的信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。在血浆中的水平可以通过，例如，高效液相色谱测定。

                     制剂与用途

按照本发明使用的药物组合物可以用常规的方法使用一个或多个生理可接受的载体或赋形剂制成制剂。

这样，可以将化合物及其生理可接受的盐和溶剂合物制成制剂以通过吸入或吹入(通过口或鼻)施用或口、颊、肠胃外、直肠施用。

对于口服施用，药物组合物可以采取，例如，片剂或胶囊的形式，这些形式通过常规方法与药学上可接受的赋形剂一起制备：其中的赋形剂如粘合剂(例如预先凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)；填充物(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；湿润剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。口服的液体制剂可采取，例如，溶液、糖浆或悬浮液的形式。它们也可以以在使用前与水或其它适当的载体组合的干燥产物存在。这样的液体制剂可以通过常规方法与药学上可接受的添加剂一起制备：这些添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非液相载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。

也可以将口服的制剂制成适当的制剂以形成活性化合物的缓释形式。

可以将化合物制成用于通过注射(例如大剂量注射或连续注入)的肠胃外施用的制剂。用于注射的制剂可以以单位剂量形式(例如，安瓿或多剂量容器)与添加的防腐剂存在。

下列实施例的提出是为了说明本发明并帮助本领域普通技术人员制造或使用本发明。实施例并不意在以任何其它方式限制说明书的范围或由在此的文件授予的保护范围。

                         实施例1

                      PKB激酶的纯化

用于纯化PKB激酶的测定包含：与5μl的混合物混合的1μl的柱级分(使用前5分钟混合，在冰上保存)，该混合物包含：1)3μl[γ³²P]-ATP 5μCi(在测定物中最终浓度为1μM)；2)1μl测定缓冲液(0.1M KCl，5mMMgCl₂，1mM EGTA，30mM HEPES，pH 7.4，30℃，在6μl测定物中的最终浓度)；3)0.5μl(EE)-PKB(最终浓度为2.5μM；母液为包含1mMDTT、1mM EGTA，然后与甘油1∶1(v/v)混合的PBS；激酶从用克隆重组的杆状病毒感染的SF9细胞纯化，蛋白质通过其(EE)标记纯化，洗脱的肽通过凝胶过滤分离)；4)0.5μl脂囊泡制剂，该制剂包含磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，有或无D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃(在测定物中的最终浓度分别为100、100、20和15μM，囊泡的制备通过将干燥脂膜超声波处理进25mM HEPES(pH 7.4，30℃)并在4℃下贮存3天以上)。测定将在30℃下进行12分钟，通过添加下列物质终止：先添加400μl冰冷1％tritonX100、0.3M NaCl、10mM EDTA、1mM焦磷酸钠、10mMβ-甘油磷酸、50mM氟化钠、1mM EGTA、0.01％叠氮化物、25mM HEPESpH 7.4，4℃，然后添加30μlα(EE)珠粒(每次测定4μl压紧的珠粒；将蛋白质G-sepharose共价交联到饱和数量的α(EE)单克隆抗体上)。将试管在4℃下混合25分钟，用上述终止缓冲液洗涤一次，用盖革计数仪测定每个试管的[³²P]含量。稀释柱级分以使在任何测定中最大消耗总[γ³²P]-ATP的40-45％。用Biosilect柱进行HPLC-SEC(VT 11.6ml，BioRad)。装载35-45μl样品，流量为40μl/分钟，收集到80μl级分。SEC缓冲液包含0.15MNaCl、20mM HEPES pH 7.4 4℃，0.5mM EGTA、0.1mM EDTA、1％甜菜碱、0.03％Tween 20、0.01％叠氮化物、2mM β-甘油磷酸、1mM DTT和胃蛋白酶抑制剂A、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶(均为2μg/ml)。

图1显示了磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸[³²P]-PtdIns(3，4，5)P₃结合蛋白质与PKB激酶活性共纯化，最终可从相似的部分纯化的制剂的更大规模制剂解析出四个不同形式的PKB激酶。所有四个活性都磷酸化并在PtdIns(3，4，5)P₃或PtdIns(3，4)P₂(例如(1-硬脂酰基，2-花生四烯酰基)sn-磷脂酰基D-肌醇(3，4，5)-三磷酸：‘D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃’的生物立体异构体存在下活化PKB(通过髓磷脂碱性蛋白质(MBP)磷酸化判断)；参见图2A。

结果表明：纯化的激酶就如部分纯化的活性一样：(a)在这些脂或PtdIns(4，5)P₂的对映异构体存在下对PKB无活性；(b)在这些脂的硬脂酰基花生四烯酰基化合物而非二棕榈油酰基化合物的低浓度下有活性；(c)可通过D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃及其非对映异构体同样有效地活化，该非对映异构体仅在甘油主链的手性中心排列上有不同(即D-L-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃)，这说明尽管识别/相互作用依赖于脂肪酸的性质，对于水溶性的头部基因却并不受其立体化学的限制；图2B。

在用于PKB磷酸化研究的相同检测条件下，我们研究了PKB激酶((图2D)和PKB自身(图2C)与这些测定中的脂囊泡的结合。为了测定PKB和PKB激酶与脂囊泡的结合以及不同脂类对PKB磷酸化的影响，通过将干燥脂膜超声处理进下列物质制备脂囊泡：0.2M蔗糖、20mM KCl、20mMHEPES，pH 7.4 30℃、0.01％叠氮化物(在测定中最终浓度为200μM磷脂酰胆碱、150μM磷脂酰丝氨酸、20μM磷脂酰乙醇胺、10μM spingomylin加指定浓度的肌醇脂。将这些物质与相关激酶在包含下列物质的测定缓冲液中混合：1mgml^-1 BSA、0.12 M NaCl、1mM EGTA、0.2mM钙、1.5mMMgCl₂、1mM DTT、0.01％叠氮化物、5mM KCl、20mM HEPES，pH 7.4，30℃(大约50nM游离钙，均为在测定中的最终浓度)、有或无[γ³²P]-ATP(1μM最终浓度)和(EE)-PKB(2.5μM最终浓度)。如果该测定为了估计激酶与脂囊泡的结合，在30℃下保持4分钟后离心测定物(airfuge(Beckman)最大速率离心30分钟)。取出上清液的等分试样以用于测定和免疫印迹。用测定缓冲液快速漂洗沉淀物，再次离心并溶解在SDS-样品缓冲液中。如本文所述定量PKB的磷酸化。

PKB激酶与包含低摩尔百分比的PtdIns(3，4，5)P₃立体异构体(对于D-D-S/A PtdIns(3，4，5)P₃为0.003％)和D-D-P/P-PtdIns(3，4)P₂的脂囊泡结合但不与包含PtdIns(4，5)P₂或L-L-P/PtdIns(3，4)P₂)的脂囊泡结合。这与下述观察一致：PKB激酶可以结合[³²P]-PtdIns(3，4，5)P₃，水溶性的30mer肽(基于Thr308周围的PKB的序列)的磷酸化受PtdIns(3，4，5)P₃或PtdIns(3，4)P₂的明显抑制(未显示)。

在相同的测定条件下，PKB也可以表现为与脂囊泡结合(图2C)。然而，需要大大提高浓度的3-磷酸化的脂类以检测易位，而且在结合3-磷酸化的脂类上和PKB激酶表现出了不同的特异性。但是，与PKB的磷酸化非常相似(比较图2B和C)。这说明了几点：1)两个激酶的脂结合性质相当不同，2)磷酸化的特异性主要受PKB的募集反应的影响(即PKB的PH结构域的亲合性与特异性)，3)仅相当小部分的PKB与活性脂浓度的脂囊泡可能结合，这引起了大多数PKB激酶结合，由此导致了4)PKB激酶的易位对PKB磷酸化的相对最大影响可在非常低浓度的PtdIns(3，4，5)P₃下出现，在更高水平时，PKB的易位变成了主要因素。

将PKB激酶A制剂Western印迹到硝酸纤维素上，并在原位受胰蛋白酶作用。使释放的肽通过N-端测序和质谱法进行分析。参见，L.R.Stephens等人，细胞89，105-1 14(1997)。确定了四个肽并用于数据库检索，鉴定到了一族人EST序列(TIGR：THC193570)。肽序列(以确定读框)以及获自EST克隆测序和从人U937细胞cDNA文库分离的cDNA的测序的信息的结合，确定了具有最小可能的开放读框的cDNA，该cDNA包含所有四个肽(允许种间差异)并编码具有55kd预期分子量的蛋白质。该预期的蛋白质包含NH₂端蛋白质激酶结构域和COOH-端PH结构域(图3)。

与PKB激酶基因相关的人和小鼠EST序列可以在TIGR数据库(THC：193570)中找到。通过筛选人U937细胞Oligo dT-引物的文库(在λZAPI1，Stratagene中)和大鼠脑Oligo dT/随机引物的文库(在UniZAPXR，Stratagene中)用源自IMAGE克隆526583的[³²P]标记的0.3kb EcoRI-HindIII片段鉴别cDNA编码的PKB激酶。鉴定并纯化阳性斑，cDNA作为基于pBluescript的质粒被切割。DNA测序在ABI自动测序仪上通过Babraham研究所微量化学设备(Babraham Institute MicrochemicalFacility)进行。

                     实施例2

               PKB激酶cDNA的鉴定

使用数据库中的基因组序列信息，我们可以确定精确的染色体位置(人染色体16p13.3；(参见，T.C.Bunn等人，基因组研究(Genome Research)6，525-537(1996)。))以及PKB激酶的某些(但不是全部)内含子/外显子边界。从该信息以及许多cDNA的测序可以清楚地看到：这种定位产生了替代的剪接转录物的复杂模式。从我们的U937细胞文库鉴定的一个转录物精确地相当于图3定义的ORF，除了其无编码蛋白质激酶结构域的底物识别基元的外显子(残基188-213；我们的肽序列数据一致表明我们纯化的酶包含该基元，图3)之外。我们使用该cDNA产生了PKB激酶被折衷的激酶(见下)。

我们还鉴定了得自大鼠脑cDNA文库的cDNA克隆，该克隆清楚地得自相当的基因位点，但是其扩大了图3的潜在的ORF以编码大约65kd的蛋白质。看起来好象替代的剪接或起始密码子使用造成产生超过一个得自该基因位点的PKB激酶异构体(注：在图3显示的大多数PKB激酶A肽的N端不同于所显示的预期ORF，这也许表明该酶的截短形式可通过替代剪接产生)。进一步的数据库检索也鉴定到了在果蝇属(Drosophila)(Embl：Y07908)中的未知功能的相近同系物。参见，K.Salim等人，EMBO杂志(EMBO J.)15，6241-6250(1996)。

                   实施例3

               PKB激酶的表达

我们构建了编码55kd PKB激酶的N-端EE标记形式的哺乳动物表达载体及其‘激酶被折衷的’剪接变体。通过使用标准的基于PCR的克隆策略将图3中定义的ORF符合读框地置于pCMV3瞬时表达载体中的N-端标记(参见，L.R.Stephens等人，细胞89，105-114(1997))。使用缺失编码残基188-213的核苷酸的cDNA也可以构建一种载体(这通过使用IMAGE克隆510982和526583建成：本文中作为‘激酶被折衷的剪接变体’)。通过测序校验所有的构建体。

这些蛋白质在cos-7细胞中表达，并纯化自该细胞(参见，L.R.Stephens等人，细胞89，105-114(1997)，参见，图4)。具有完整的蛋白质激酶结构域的蛋白质以PtdIns(3，4，5)P3敏感的方式使PKB磷酸化，表明该活性存在于图3定义的ORF中。

简而言之，通过蛋白质的(EE)标记纯化蛋白质(使用myc抗体作为对照)，将等分试样进行Western印迹。然后将用α(EE)单克隆抗体探查的PVDF滤膜(由ECL检测；右上图)用考马斯蓝染色(左上图；所显示的数据仅适用于(EE)-II；用(EE)-I可获得相似的结果)。在脂囊泡的存在下(有或无D-D-S/A-PtdIns(3，4，5)P₃和[γ³²P]ATP(300nM；分别为3μM和1μM的最终浓度)测定等分试样中的PKB激酶活性。放射自显影图显示了在PKB中的[³²P]。

                    实施例4

              PKB激酶抑制剂的鉴定与用途

PKB是PIP3途径的关键酶，参与调节细胞生长。该酶可能在某些人类癌症中起作用；例如，已知其在部分卵巢癌、乳腺癌和胰癌中可被扩增。参见，Bellacosa，A.等人(1995)国际癌症杂志64，280-285页以及Cheng，J.Q.等人(1996)美国国家科学院院报：93卷，3636-3641。该酶的扩增给予肿瘤细胞防止编程性细胞死亡的机制。这样，可以明显地看到抑制PKB活性的药物对于治疗具有不需要的细胞生长的疾病(包括癌症)有益。达到这种目的的一种方法是开发鉴定这种药物的测定方法。

PKB激酶抑制剂的鉴定可以通过测定抑制PKB激酶活性的PIP3活化的化合物实现。这可以通过在化合物存在或不存在时测定PKB的磷酸化进行。可以如上所述进行测定，或通过Stokoe，D.等人(1997)科学，277卷，567-570页的方法进行。例如，使用实施例3中描述的测定，55kd PKB激酶的末端EE标记形式可以与PIP3、ATP再生系统一起温育，其中优选地包含5mM MgCl₂、2mM ATP、10mM磷酸肌酸、肌酸激酶(50μg/ml)、1％NP-40以及PKB或另一个适合的底物。在适当的时期后，可以免疫沉淀PKB并测定磷酸化的量。

本发明并不限于本文描述的特定实施方案的范围，所述的实施方案意在作为本发明某一方面的单个说明，功能相当的方法和组分属于本发明的范围。事实上，结合前面的的说明和所附的插图，本发明的各种改良(除了本文所显示的和描述的之外)对本领域技术人员都会变得显而易见。这样的改良属于本发明的范围。

Claims (15)

1.一种分离的核酸分子，该分子包含编码PKB激酶活性的核苷酸序列。

2.一种分离的核苷酸序列，该序列编码一种嵌合蛋白质，其包含融合到编码异源多肽的第二种核苷酸序列上的权利要求1的核苷酸序列。

3.一种核苷酸载体，包含权利要求1的核苷酸序列。

4.一种表达载体，包含权利要求1的核苷酸序列，该序列与控制核苷酸序列在宿主细胞中表达的核苷酸调节序列有效地连接。

5.一种宿主细胞，该细胞经遗传工程化以包含权利要求1的核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，该细胞经遗传工程化以包含权利要求1的核苷酸序列，该序列与控制核苷酸序列在宿主细胞中表达的核苷酸调节序列有效地连接。

7.一种可以免疫特异性地与PKB激酶结合的抗体。

8.一种用于诊断哺乳动物疾病的方法，该方法包括检测包含在哺乳动物基因组中的PKB激酶突变。

9.一种用于筛选用来治疗细胞生长紊乱的化合物的方法，包括以下步骤：

在溶液中混合化合物、活化的PKB激酶、PKB激酶的底物、ATP再生系统、PKB活化剂；且

在所述的化合物存在或不存在时鉴定磷酸从ATP到PKB激酶底物的转移。

10.权利要求9的方法，其中所述的PKB活化剂是PIP3。

11.一种用于治疗哺乳动物中细胞生长紊乱的方法，该方法包括将在权利要求11中鉴定的化合物以足以抑制PKB活性的量施用于哺乳动物。

12.一种用于活化PKB激酶的方法，该方法包括在溶液中温育所述的PKB激酶与PIP3。

13.通过权利要求10的方法鉴定的化合物。

14.一种分离的PKB激酶。

15.一种分离的PKB激酶，该激酶包含SEQ.ID.No.1。

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