JP2004508288A - 記憶固定を調節する方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、長期記憶など、抑制的回避で上方又は下方調節される遺伝子の発見に基づくものである。従って、前記の遺伝子は、記憶固定に関与していると考えられる。具体的には、我々は、記憶固定には、ｚｉｆ２６８（ＥＧＲ１）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、グルタミン酸受容体１（ＧＬＵＲ１）、グルタミン酸受容体２（ＧｌｕＲ２）、Ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦなどの遺伝子の発現の調節が関与していることを発見した。容易に読めるよう、これらの遺伝子をここではまとめて「ＬＴＭ遺伝子」と呼び、それらがコードするタンパク質を「ＬＴＭたんぱく」と呼ぶ。

Description

【０００１】
発明の背景
行動の研究により、人の心は、鍵となる特定の時間間隔で記憶を固定することが分かった。記憶固定の最初の段階は、新しい考えを思いついたとき、又は、新しい体験から学習したときの数分後に起きる。ある学習体験が我々にとって進行中の意味を持つとき、次の週からしばらくは、更なる記憶固定期間となる。実際、このような題材の保存が短期記憶から長期記憶へと移動するのはこの段階である。
【０００２】
長期記憶を形成するには遺伝子発現が必要であることは、数十年にわたって公知である。長期記憶（ＬＴＭ）の形成を説明するのに主流となっている仮説は、記憶項目が導入されると、既存のニューロンの接続パターンが変化してその情報を長期保存するのに役立つニューロンネットワークを形成する、という説である。特定のシナプス内でシナプス伝達に変化が起きたり、シナプス接点に変化が起きると、シナプス効果の変調が誘導される。これらの変化はもともと、伝達又はシナプスのリモデリングを担う分子に支えられている。ニューロン内のタンパク質の（永続的な記憶に比較したときの）相対的な短命を克服するためにＬＴＭが形成されるには、遺伝子発現の変調が起きることが必要なのではないか、と示唆されている。
【０００３】
学習及び記憶の動物モデルでは、訓練時付近にデノボタンパク質合成が起きる必要のあることが、他の種類の記憶維持法から長期記憶を分かつ決定的な性質であった。従って、長期記憶の保存には、遺伝子発現という細胞内プログラム、タンパク質合成の変化、及び新しいシナプス接点の成長が伴う。例えば、記憶形成のこのような性質には、ｃＡＭＰ応答性の転写が関与し、かつ、ｃＡＭＰ応答配列結合たんぱく（ＣＲＥＢ）ファミリーの転写因子が媒介する、特定の分子的支持があるのではないかと、最近の研究では示唆されている。
【０００４】
ＣＲＥＢは、自分のプロモータの中にｃＡＭＰ応答配列を持つ遺伝子の転写を変調する核内たんぱくである。カルシウム又はｃＡＭＰの濃度が増加すると、ＣＲＥＢのリン酸化及び活性化が誘起される。リン酸化したＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ応答遺伝子の上流領域にあるエンハンサー配列ＣＲＥに結合することで転写を誘導する。新たに合成されたタンパク質の一部が、更なる転写因子となって最終的には後期応答遺伝子の活性化を引き起こすが、この後期応答遺伝子の産物が、ＬＴＭにつながるシナプス効果の変調を担うのである。
【０００５】
ＣＲＥＢは、多様な脳構造を利用する多様な種類の作業の記憶形成に役立っている。ＣＲＥＢがＬＴＭに役立つ遺伝子の転写を調節していることを示す証拠がある。例えばアメフラシ属で、ＣＲＥ含有オリゴヌクレオチドを培養ニューロンに顕微注射することにより、ＣＲＥＢの活性化が干渉されている。ショウジョウバエ科では、リバース遺伝子法を用いてＣＲＥＢ機能が破壊されている。このように、ＣＲＥＢリプレッサ型のアイソフォームの発現を誘導することでＬＴＭを特異的に遮断したり、活性化型のアイソフォームの発現を誘導することで促進することに成功している。マウスでは、ＣＲＥＢ遺伝子に部位指定変異を起こさせたノックアウト系の行動分析で、ＣＲＥＢの役割が確認されている。これらの変異動物では、学習及び短期記憶は正常であるが、長期記憶は損なわれている。まとめると、これらのデータから、長期記憶の符号化には、高度に保存された分子機序が関与していることが分かる。
【０００６】
内側側頭及び関連する視床構造に異常を持つ動物には、記憶固定の深在性の破壊が見られる。我々は以前、脳弓依存的な損傷誘導性健忘症に、海馬の特定の下位領域における遺伝子発現の調節異常が関係していることを実証した。例えば、Ｔａｕｂｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２ ： ３０９−１０を参照されたい。正常な動物では、抑制性回避訓練を行うと、ＣＲＥＢのリン酸化が急速かつ永久的に増加するが、この増加が、記憶固定に必要なＣＲＥ媒介型遺伝子発現の調節に必要なステップなのである。このようなＣＲＥＢリン酸化の変化は、主に海馬ＣＡ１領域及び歯状回に限られて起き、訓練後少なくとも６時間は続く。脳弓に損傷を持つ動物は抑制性回避を学習し、コントロールレベルで最高６時間は記憶を示すが、２４時間後までには健忘症を呈する。さらにこの健忘症動物では、訓練後の海馬ＣＲＥＢリン酸化の上昇も何ら見られない。我々の結果は、脳弓を通過して入る海馬への入力が、海馬ニューロンでのＣＲＥＢ媒介型遺伝子発現を調節することで、この種類の記憶の固定を調節していることを示唆している。
【０００７】
初期学習は、動物が空間中のどこにいるかに関する情報を運ぶシナプス伝達の変化が端緒であると思われる。これらの変化が永久的になるかどうかは、新たな遺伝子発現が折良く起きるかどうかに左右される。脳弓を通じて海馬ニューロンにシグナルが入ってくることが、長期記憶の確立に必要な遺伝子発現の調節による記憶固定に貢献している。鍵となる化学的シグナル及びそれらの伝達経路を同定できれば、側頭葉記憶系の損傷に関連した健忘症の治療法が明らかとなるであろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、一態様では、ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子， グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦのうちの一つ以上の活性を変調する作用薬で動物を処置するステップを含む、動物の長期記憶固定を変調する方法を提供するものである。
【０００９】
別の態様の本発明は、グルタミン酸受容体１（ＧｌｕＲ１）又はグルタミン酸受容体２（ＧｌｕＲ２）のシグナル伝達経路を変調する作用薬であって、ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２受容体のリガンドである作用薬、で動物を処置するステップを含む、動物の長期記憶固定を高める方法に関する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体１ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体 ２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される遺伝子にコードされた産物の活性を検出する反応系を提供するステップと；
（ｉｉ）前記系をテスト化合物に接触させるステップと；
（ｉｉｉ）テスト化合物が前記遺伝子産物の活性を変化させるかどうかを判定するステップと、
を含む、記憶固定を変調する作用薬を（例えば薬物発見アッセイとして）同定する方法に関する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体１ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体 ２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される遺伝子の発現レベルを検出する反応系を提供するステップと；
（ｉｉ）前記系をテスト化合物に接触させるステップと；
（ｉｉｉ）テスト化合物が前記遺伝子の発現レベルを変化させるかどうかを判定するステップと、
を含む、記憶固定を変調する作用薬を（例えば薬物発見アッセイとして）同定する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの好適な実施例では、前記反応系は精製済みのタンパク質製剤又は細胞ライセートなどの無細胞系である。他の実施例では、前記反応系は全細胞系である。
【００１３】
好適な実施例では、前記アッセイを、複数の異なるテスト作用薬の中から記憶固定を変調する作用薬を同定するのに利用することができる。
【００１４】
いくつかの好適な実施例では、前記テスト化合物は、例えば２５００ａｍｕ未満の分子量のものなど、小型の有機分子であってもよい。
【００１５】
さらに別の態様の本発明は、
（ｉ）上記の薬物発見アッセイの一つ以上により、前記遺伝子の発現レベル又は遺伝子産物の活性をテスト化合物を同定するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で同定された作用薬か、又はその更なる類似体に対し、動物における効験及び毒性に関する治療上のプロファイリングを行うステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で同定された一つ以上の作用薬を含む製剤を、許容可能な治療的プロファイルを有するものとして調合するステップと、
を含む薬物発見事業を行う方法を提供するものである。
いくつかの好適な実施例では、前記事業法は、前記製剤を販売に向けて流通させるための流通システムを確立する更なるステップを含み、選択によっては前記製剤を市場に送る販売グループを確立するステップを含めてもよい。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、
（ｉ）上記の薬物発見アッセイの一つ以上により、前記遺伝子の発現レベル又は遺伝子産物の活性をテスト化合物を同定するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で同定された作用薬か、又はその更なる類似体に対し、動物における効験及び毒性に関する治療上のプロファイリングを（選択に応じて）行うステップと；
（ｉｉｉ）第三者に対し、前記同定された作用薬のその後の薬物開発の権利を与えるステップと
を含む、ターゲット発見事業を行う方法を提供するものである。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、上記のアッセイで同定された一つ以上の化合物を、薬学的に許容可能な医薬品添加物中に調合して含む製剤を提供する。いくつかの実施例では、前記製剤には、さらに神経成長因子、神経生存因子、及び／又は神経栄養因子のうちの一つ以上を含めてもよい。
【００１８】
本製剤には、さらに、例えばアデニル酸シクラーゼを活性化するｃＡＭＰアゴニストなどのｃＡＭＰを上昇させる作用薬や、ｃＡＭＰ類似体、又はｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤など、ＣＲＥＢ依存性転写を活性化させる作用薬を含めることもできる。
【００１９】
本製剤は、動物の記憶固定を高める処置法の一部として、又は、ＣＮＳニューロンの機能を高める処置法の一部として、動物に投与することができる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体１ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体 ２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及び ＶＧＦからなる群より選択される一つ以上の遺伝子の発現もしくは変異、又は、これらの遺伝子産物の活性レベルを、（選択に応じて）患者の海馬で検出するステップを含む、学習及び／又は記憶の機能について患者を評価する方法を提供するものである。
【００２１】
本発明を実施するに当たっては、他に特に明示しない限り、当業者に公知の技術水準内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を利用することになるであろう。このような技術は文献で解説されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： １９８９）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．， １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ．， １９８４）；　Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． の米国特許第４，６８３，１９５号 ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）； Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ． １． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７） ； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ． Ｙ．）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．， １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １５４ ａｎｄ １５５ （Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）， Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ＩＶ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， １９８６）； Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．，　１９８６）を参照されたい。
【００２２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明白となるであろう。
【００２３】
発明の詳細な説明
Ｉ．概観
本発明は、長期記憶など、抑制性回避で上方又は下方調節される遺伝子であって、従って記憶固定に一役買っていると思われる遺伝子の発見に基づくものである。具体的には、我々は、記憶固定には、ｚｉｆ２６８ （ＥＧＲ１）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、グルタミン酸受容体１ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦなどの遺伝子の発現の調節が関与していることを発見したのである。容易に読めるよう、これらの遺伝子をここではまとめて「ＬＴＭ遺伝子」と呼び、それらがコードするタンパク質を「ＬＴＭたんぱく」と呼ぶ。
【００２４】
本発明の一態様は、動物の長期記憶固定を、ＬＴＭ遺伝子又はＬＴＭたんぱくの一つ以上の機能を変調することで改変するのに利用できる作用薬を同定するようデザインされたアッセイを、このような遺伝子及びそれらの産物を利用して行うことに関する。以下にさらに詳述するように、ＬＴＭたんぱくの酵素活性を変調したり、ＬＴＭたんぱくの半減期を変調したり、ＬＴＭたんぱくと他のタンパク質との間の相互作用や、核酸、糖質もしくは他の生体分子との間の相互作用を変調したり、ＬＴＭたんぱくの細胞内位置を変調するなど、ＬＴＭたんぱくの活性を阻害又は増強する能力について、細胞ベースのアッセイ又は無細胞アッセイで、テスト作用薬を評価することができる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、当該薬物スクリーニングアッセイで同定された化合物を利用して、動物の学習及び／又は記憶の欠陥の発生を変化（増加又は減少）させ、ひいては、動物の学習能力及び／又は記憶能力を変化させることに関する。つまり、本発明の化合物は、例えば毒物への暴露、脳損傷、てんかん、小児の精神遅滞や、アルツハイマー病を含む老人性痴呆症など、記憶障害の治療薬として有用であろう。
【００２６】
ＩＩ．定義
便宜上、本明細書、実施例、及び付属の請求の範囲で用いたいくつかの用語及び文言の意味を以下に解説する。
【００２７】
「細胞」、「ホスト細胞」又は「組換えホスト細胞」は、ここでは互換可能に用いられた用語である。このような用語は、特定の当該細胞だけでなく、そのような細胞の後代細胞又は後代と思われる細胞も言うものであることを、理解されたい。突然変異又は環境からの影響が原因で後の世代に若干の改変が起きる場合があるため、このような後代は実際には親細胞と同一ではないかも知れないが、ここで用いる場合のこの用語の範囲に包含される。
【００２８】
ここで用いる「相補」配列とは、ハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに充分な相補性を有する配列を言う。
【００２９】
「ＣＲＥＢ」ファミリーのたんぱく（時にはＡＴＦファミリーとも呼ばれる）については、ＣＲＥＢ自体、ＣＲＥＭ及びＡＴＦ−１という、ｃＡＭＰ応答性転写を媒介できる三つの種類が最も良く知られている （ＤｅＧｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ７： １４５−１５３）。これらの基本的な領域であるロイシン・ジッパーたんぱくは、合成がｃＡＭＰ応答性である遺伝子の上流調節領域によく見られるｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）部位と呼ばれるＤＮＡ配列に結合する。分子解析の結果、ＣＲＥ部位、そしてそれらのＣＲＥＢファミリーメンバーとの相互作用が、ｃＡＭＰ応答性に必要であることが分かっている。ＰＫＡの触媒性サブユニットが核内へ移行すると、これはＣＲＥＢの１３３位にあるセリン残基を直接リン酸化してこのタンパク質を活性化させ、このｃＡＭＰ伝達経路を新たな遺伝子発現の誘導に直接結び付けることができる（Ｂａｃｋｓａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ２２２−２２６； ａｎｄ Ｈａｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３： ４８５２−４８５９）。ＣＲＥＢはまた、上に解説したものや、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｅｕｒｏｎ １６： ８９−１０１ ； Ｉｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｅｕｒｏｎ １６： ９７３−８２； 及びＩｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｅｕｒｏｎ ２１： ８６９−８８３に解説されたものなど、他のキナーゼを通じてもリン酸化する。
【００３０】
良く知られているように、ある個人のゲノム内には、ある一つのポリペプチドに対する遺伝子が一種類しかなかったり、又は複数のコピーがあったりする。このような重複した遺伝子同士は同一である場合もあるが、ヌクレオチド置換、付加又は欠失を含めいくつかの改変がありながら、実質的には同じ活性を持つポリペプチドをコードしている場合もある。従って、あるポリペプチドを「コードするＤＮＡ配列」という用語は、ある特定の個人の一種以上の遺伝子を言う場合がある。さらに、個々の生物同士の間には、対立遺伝子と呼ばれる、ある程度の違いがヌクレオチド間にあることがある。このような対立遺伝子による違いの結果、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に違いがあったり、なかったりするが、それでも尚、同じ生物活性を持つタンパク質をコードしている場合がある。
【００３１】
ここで用いる用語「遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、エクソン及び（選択に応じて）イントロン配列の両方を含め、一つのポリペプチドをコードする開放読み取り枠を含む核酸分子を言う。用語「イントロン」とは、一個の遺伝子中に存在し、タンパク質に翻訳されない、一般にエクソン同士の間に見られるＤＮＡ配列を言う。
【００３２】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、二つのペプチド間、又は二つの核酸分子間での配列の類似性を言う。相同性は、比較を目的としてアライメントしたときの各配列中のある位置を比較することで、決定することができる。比較の対象となった配列中のある位置が、同じ塩基又はアミノ酸で占められていれば、それらの分子はその位置において相同ということになる。配列間の相同性の程度は、配列同士の間にある対合位置又は相同位置の数の関数である。「同一性のパーセント」と言う用語は、二つのアミノ酸配列又は二つのヌクレオチド配列の間にある配列の同一性を言う。同一性はそれぞれ、比較を目的にアライメントしたときの各配列中のある位置を比較することで、決定することができる。比較の対象となった配列中の同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸で占められていれば、それらの分子はその位置において同一ということになる。また、同等の部位が同じ又は類似のアミノ酸残基（例えば立体上及び／又は電子的性質で類似であるなど）で占められている場合、それらの分子はその位置において相同（類似）であるということができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージ表現とは、比較の対象となった配列同士の間にある、ある位置での同一又は類似のアミノ酸の数の関数を言う。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含め、様々なアラインメント・アルゴリズム及び／又はプログラムを利用できる。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン州マジソン、ウィスコンシン大学）の一部として入手でき、例えばデフォルト設定値と一緒に利用できる。ＥＮＴＲＥＺは、メリーランド州ベセズダ、米国国立衛生研究所、国立医学図書館のナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーションを通じて入手できる。ある一つの実施例では、例えば各アミノ酸ギャップを二つの配列間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドのミス対合とみなしてウェートするなど、二つの配列の同一性のパーセントを、ギャップ・ウェイトを１としてＧＣＧプログラムで決定することができる。
【００３３】
ここで用いる用語「相互作用する」とは、例えば二種ハイブリッドアッセイなどを用いて検出できるものなど、分子間の検出可能な相互作用を含むものと、意図されている。相互作用する、という用語には、さらに分子間の「結合性」相互作用も含まれるものと、意図されている。相互作用は、天然のタンパク質対タンパク質のものでも、又は、タンパク質対核酸のものでもよい。
【００３４】
ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸についてここで用いる「単離された」という用語は、巨大分子の天然源に存在する、それぞれ他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を言う。例えば、ある特定のポリペプチドをコードする単離された核酸には、好ましくは、ゲノムＤＮＡ中で当該遺伝子を天然で直近でフランクする１０キロベース以下の核酸配列、より好ましくは、５ｋｂ以下のこのような天然フランキング配列、そして最も好ましくは１．５ｋｂ未満のこのような天然フランキング配列が含まれているとよい。ここで用いる単離されたという用語は、細胞物質、ウィルス物質や、又は組換えＤＮＡ技術により作製された場合には培養基、又は化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質、を概ね含まない核酸又はペプチドも言う。さらに「単離された核酸」には、天然では断片として存在せず、天然状態では見られないであろう核酸断片も含まれるものと、意図されている。用語「単離された」とは、ここでは、他の細胞たんぱくから単離されたポリペプチドを言及するのにも用いられており、精製済みポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含することを意図している。
【００３５】
ここで用いる用語「変調」とは、応答の上方調節即ち刺激、及び下方調節即ち抑制の両方を言う。
【００３６】
本発明の「非ヒト動物」には、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシなどの哺乳動物、ニワトリ、両生類、は虫類、等々が含まれる。好適な非ヒト動物は、ラット及びマウスを含むげっ歯科から選択されるが、最も好ましいのはマウスである。ここで用いる用語「キメラ動物」とは、組換え遺伝子が見られる動物、又は、組換え遺伝子がその動物の全部ではなく一部の細胞で発現している動物、を言う。用語「組織特異的キメラ動物」とは、組換え遺伝子の一つが、特定の組織で存在及び／又は発現又は破壊されているが、他の組織では存在及び／又は発現又は破壊されていないことを指す。
【００３７】
ここで用いる用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び、該当する場合のリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを言う。この用語には、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡ又はＤＮＡの類似体や、解説する実施例に該当する場合、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるものと、理解されたい。
【００３８】
ここで用いる用語「プロモータ」とは、当該プロモータに機能的に連鎖した所定のＤＮＡ配列の発現を調節すると共に、細胞内の所定のＤＮＡ配列の発現を実行するＤＮＡ配列を意味する。この用語は、「組織特異的」プロモータ、即ち、特定の細胞（例えば特定の組織の細胞）でのみ、所定のＤＮＡ配列の発現を実行するプロモータ、を包含するものである。この用語はさらに、所定のＤＮＡの発現を主にある一つの組織で調節するが、他の組織でも発現を起こさせるような所謂「リーキー」プロモータも包含する。さらにこの用語は、非組織特異的プロモータや、構成的に発現するプロモータ又は誘導性プロモータ（即ち発現レベルを制御できるもの）も包含する。
【００３９】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物を言う場合はここでは互換可能に用いられている。
【００４０】
用語「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ技術により作製された本発明のポリペプチドを言い、このとき一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡは適した発現ベクタ内に挿入されるが、このベクタは続いて、異種のタンパク質を産生するようホスト細胞を形質転換するのに用いられる。さらに、組換え遺伝子に関する「由来とする」という文言は、天然のタンパク質のアミノ酸配列か、又は、天然型のタンパク質の置換及び欠失（切断も含む）を含む変異で出来たそれに類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を、「組換えタンパク質」の意味に含めることを、意図している。
【００４１】
「転写調節配列」とは、開始シグナル、エンハンサ、及びプロモータなど、機能的に連鎖したタンパク質コーディング配列の転写を誘導又は制御するＤＮＡ配列を言うのに本明細書全体を通じて用いられた包括的な用語である。好適な実施例では、組換え遺伝子の一つの転写は、発現を意図した細胞種内で、この組換え遺伝子の発現を制御するプロモータ配列（又は他の転写調節配列）の制御下にある。さらに、本組換え遺伝子は、天然型のタンパク質の転写を調節する配列と同じ転写調節配列の制御下にあっても、又は、異なる転写調節配列の制御下にあってもよいことを、理解されたい。
【００４２】
ここで用いる用語「トランスフェクション」は、発現ベクタなどの核酸を、レシピエントの細胞に、核酸を媒介とする遺伝子導入法により導入することを意味する。ここで用いる「形質転換」とは、例えば形質転換細胞が組換え型のポリペプチドを発現したり、又は、導入した遺伝子からのアンチセンス発現の場合には、天然型のタンパク質の発現が破壊されるなど、外来のＤＮＡ又はＲＮＡの細胞内への取り込みの結果、細胞の遺伝子型が変化するプロセスを言う。
【００４３】
ここで用いる用語「導入遺伝子」とは、導入先のトランスジェニック動物又は細胞に対して部分的又は完全に異種である、即ち外来であるか、又は、導入先のトランスジェニック動物又は細胞の内因性遺伝子に対して同種であるが、挿入された細胞のゲノムを変化させるような態様（例えば、天然遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、又は、その挿入の結果、ノックアウトが起きるなど）で、動物のゲノムに挿入されるようデザインされているか、又は、挿入される、あるポリペプチドをコードする核酸配列又はそれに対してアンチセンスの転写産物を意味する。導入遺伝子には、所定の核酸が最適に発現するのに必要であろう一つ以上の転写調節配列及び他の核酸（例えばイントロンとしてなど）が含まれていてもよい。
【００４４】
「トランスジェニック動物」とは、その動物の細胞の一つ以上が、当業で公知の遺伝子導入技術などにより、人の介入により導入された異種の核酸を含有するような、あらゆる動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類又は両生類、を言う。当該核酸は細胞に直接導入されたり、又は、顕微注射や組換えウィルスの感染を用いるなどの意図的な遺伝子操作を通じて細胞の前駆体に導入するなど、間接的に導入される。遺伝子操作という用語は、伝統的な交雑育種やインビトロ授精を含まず、組換えＤＮＡ分子の導入に向けられた用語である。この分子は染色体内に組み込まれても、又は、染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。ここで解説する典型的なトランスジェニック動物においては、導入遺伝子は細胞にアゴニスト型又はアンタゴニスト型である組換え型のタンパク質を発現させるものである。しかし、例えば、下に説明するＦＬＰ又はＣＲＥリコンビナーゼ依存的コンストラクトなど、組換え遺伝子がサイレントになったトランスジェニック動物も考察されたところである。さらに、「トランスジェニック動物」には、組換え及びアンチセンス技術の両方を含め、人の介入により遺伝子破壊が行われたような組換え動物も含まれる。
【００４５】
ここで用いる用語「ベクタ」とは、連結された先の別の核酸を輸送することのできる核酸分子を言う。好適なベクタの種類の一つはエピソーム、即ち染色体外で複製できる核酸、である。好適なベクタは、連結された先の核酸を自律的複製及び発現させることができるものである。機能的に連結された先の遺伝子の発現を命令できるベクタを、ここでは「発現ベクタ」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で実用性のある発現ベクタは、ベクタ型のままでは染色体に結合しない、環状の二本鎖ＤＮＡループを一般に指す「プラスミド」の形であることが多い。プラスミドが最もよく用いられている形のベクタであるため、本明細書では「プラスミド」及び「ベクタ」を互換可能に用いている。しかしながら、同等の機能を果たし、本記載を通じて当業者に公知となるような、他の形の発現ベクタも、本発明は包含することを意図している。
【００４６】
ＩＩＩ．典型的な実施例
Ａ．ＬＴＭたんぱくをコードする核酸
以下に解説するように、本発明のアッセイのいくつかの実施例では、ここでは「ＬＴＭ」たんぱく又はポリペプチドと呼ぶこととする、記憶固定に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を利用する。同等物という用語は、ここに解説するようなＬＴＭたんぱくの活性を有する機能的に同等のＬＴＭポリペプチド又は機能的に同等のペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含するものと、理解されている。同等のヌクレオチド配列には、例えば対立遺伝子バリアントなど、一箇所以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を違いとする配列が含まれるであろう。
【００４７】
好適な核酸は脊椎動物のＬＴＭ核酸である。特に好適な脊椎動物ＬＴＭ核酸は哺乳動物のものである。種を考えないと、特に好適なＬＴＭ核酸は、脊椎動物ＬＴＭたんぱくのアミノ酸配列に少なくとも８０％類似であるポリペプチドをコードするものである。ある実施例では、当該核酸は、当該ＬＴＭポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡである。
【００４８】
本発明のさらに別の好適な核酸は、少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、１５０又は２００個のアミノ酸残基から成るＬＴＭポリペプチドをコードするものである。例えば、プローブ／プライマ又はアンチセンス分子（即ち非コーディング核酸分子）として用いるのに好適な核酸分子には、少なくとも約６、１２、２０、３０、５０、１００、１２５、１５０又は２００塩基対長が含まれていてよいが、一方、コーディング核酸分子には約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、９５０、９７５、１０００ 塩基対が含まれているであろう。
【００４９】
本発明の別の態様では、クローンされたＬＴＭ遺伝子をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。例えば約４５℃の６．０ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いた後に、５０℃の２．０ｘのＳＳＣで洗浄するなど、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進するのに適したストリンジェントな条件は当業者に公知であり、又は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見ることができる。例えば、洗浄ステップの塩濃度は、５０℃の約２．０ ｘ ＳＳＣという低ストリンジェンシーから、５０℃の約 ０．２ ｘ ＳＳＣ という高ストリンジェンシーの間で選択することができる。さらに、洗浄ステップの温度は、室温の約２２℃という低ストリンジェンシー条件から約６５℃という高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度及び塩の両方とも変更してもよいが、又は塩濃度の温度を一定にし、他方の可変値を変更してもよい。好適な核酸は、ＬＴＭ遺伝子の核酸配列に対し、少なくとも７５％相同、より好ましくは８０％相同、そしてさらにより好ましくは少なくとも８５％相同、な配列を有するものである。ＬＴＭ遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８乃至９９％、相同な核酸ももちろん、本発明の範囲内にある。
【００５０】
遺伝暗号の縮重のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １−Ｘの一つに示したヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸も、本発明の範囲内にある。このような核酸は、機能的に同等のペプチド（即ち、ＬＴＭポリペプチドの生物活性を有するペプチド）をコードしているが、遺伝暗号の縮重のために、配列表に示した配列とは、配列が異なっている。例えば、数多くのアミノ酸が、二つ以上の三文字で表される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードしている）があるために、変異が「サイレント」になり、ＬＴＭポリペプチドのアミノ酸配列には影響しない場合がある。しかしながら、当該ＬＴＭポリペプチドのアミノ酸配列の変化につながらないようなＤＮＡ配列多型が哺乳動物間にあると考えられる。当業者であれば、天然の対立遺伝子上のバリエーションが原因で、ＬＴＭポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチドの一つ以上（例えばヌクレオチドの最大約３乃至５％に）には、このようなバリエーションが、ある一つの種の個体間であることは、理解されよう。
【００５１】
Ｂ．ＬＴＭたんぱく
本発明のいくつかのアッセイでは、他の細胞たんぱく、特に、ＬＴＭポリペプチドに通常関連していると思われる他のシグナル伝達因子及び／又は転写因子、から単離された、又は実質的に含まない、単離されたもしくは組換えＬＴＭポリペプチドを利用する。用語「（ここでは「混入たんぱく」とも呼ぶ）他の細胞たんぱくを概ね含まない」又は「概ね純粋なもしくは精製済みの製剤」は、（乾燥重量で）約２０％未満の混入たんぱく、そして好ましくは約５％未満の混入たんぱくを有するＬＴＭポリペプチドの製剤を包含するものであると、定義しておく。機能的な形の当該ポリペプチドは、まず、ここで解説するクローン化遺伝子を利用した精製済みの製剤として、調製できる。「精製された」とは、ペプチド又はＤＮＡもしくはＲＮＡ配列について言う場合、その明示した分子が、他のタンパク質などの他の生物巨大分子を概ね伴わない状態で存在することを意味する。ここで用いる用語「精製された」とは、好ましくは、乾燥重量で少なくとも８０％、より好ましくは重量で９５乃至９９％の範囲、そして最も好ましくは重量で少なくとも９９．８％が、同じ種類の生物巨大分子であることを意味する（しかし水、緩衝液、及び他の小分子、特に分子量が５，０００未満の分子、は存在していてもよい）。ここで用いる用語「純粋な」とは、好ましくは、すぐ上に「精製された」について示したのと同じ数値範囲を有するとよい。「単離された」及び「精製された」は、天然状態のままの天然物質や、構成成分に（例えばアクリルアミドゲルで）分離されてはいるが、純粋な（例えば混入タンパク質や、アクリルアミド又はアガロースなどの変性剤及びポリマーなどのクロマトグラフィ用試薬を含まないなど）物質又は溶液としては得られない天然物質、のいずれをも包含しない。好適な実施例では、精製されたＬＴＭ製剤は、例えばヒトＬＴＭたんぱくを非ヒト細胞で組換え発現させれば達成できるように、ＬＴＭが通常産生されるのと同じ動物を由来とする混入たんぱくを含まないものであろう。
【００５２】
完全長たんぱく、又は、一つ以上の特定のモチーフ及び／又はドメインに相当する、又は、例えば少なくとも５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０アミノ酸長などの任意の大きさに相当するフラグメントが、本発明の範囲内にある。
【００５３】
例えば、単離後のＬＴＭポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １−Ｘのいずれかに示した核酸配列の全部又は一部分にコードされていてもよい。また、このようなペプチドをコードする核酸の相当するフラグメントから組換えにより生成されたペプチドをスクリーニングすれば、ＬＴＭたんぱくのうちの単離ペプチジル部分を得ることができる。さらに、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ 化学法など、当業で公知の技術を用いれば、フラグメントを化学合成することもできる。例えば、本発明のＬＴＭポリペプチドを、フラグメントの重複しない、任意の所望の長さのフラグメントに分割しても、又は、好ましくは、所望の長さの、重複したフラグメントに分割してもよい。フラグメントを（組換え又は化学合成により）生成し、検査して、野生型（例えば「本物の」）ＬＴＭたんぱくのアゴニスト又はアンタゴニストとして機能できるようなペプチジルフラグメントを同定することもできる。
【００５４】
天然ＬＴＭたんぱくに加え、本発明で好適な組換えポリペプチドは、ＬＴＭたんぱくのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同、より好ましくは９０％相同、そして最も好ましくは９５％相同な核酸にコードされたものである。ある好適な実施例では、本発明のＬＴＭたんぱくは、哺乳動物ＬＴＭたんぱくである。リン酸化などのいくつかの翻訳後修飾が起きると、ＬＴＭたんぱくの見かけの分子量が修飾前のこのポリペプチド鎖に比較して増加する場合があることは、理解されよう。
【００５５】
さらに、場合によっては、ＬＴＭアゴニスト（ミメティック）又はＬＴＭアンタゴニストのいずれか一つとして働く能力が制限されており、従って天然型の本たんぱくの生物活性のうちの一部のみを促進又は阻害するような当該ＬＴＭポリペプチドの一つの相同体を提供すると、有利な場合があることは、概ね理解されよう。こうして、機能の限られた相同体で処置することで、特定の生物学的効果を引き出すことができ、天然型のＬＴＭたんぱくの生物活性のすべてに向けられたアゴニスト又はアンタゴニストで処置したときに比べて、副作用を小さくすることができる。
【００５６】
当該ＬＴＭたんぱくの各々の相同体は、離散点変異又はトランケーションなどの突然変異誘発法で作製することができる。例えば、変異により、由来となった元のＬＴＭポリペプチドの生物活性と略同じ生物活性を持つか、又はその一部の生物活性が残った相同体を得ることができる。あるいは、ＬＴＭたんぱくを含むＬＴＭカスケードの下流又は上流の因子に競合的に結合するなどにより、天然型の本タンパク質の機能を阻害することのできるアンタゴニスト型の本タンパク質を作製することも可能である。また、構成的に活性となるアゴニスト型の本タンパク質も作製できよう。このように、本発明の提供するＬＴＭたんぱく及びその相同体は、記憶固定の正の調節物質でも、又は負の調節物質であってもよい。
【００５７】
Ｃ．ＬＴＭたんぱくを発現する細胞
以下に解説するように、本発明のアッセイには、組換え型の本ＬＴＭポリペプチドを発現するようトランスフェクトされた細胞が含まれるであろう。ホスト細胞はいかなる原核細胞でも、又は真核細胞でもよい。従って、哺乳動物ＬＴＭたんぱくのクローニングで得られた、完全長の本タンパク質の全部又は所定の一部分をコードするヌクレオチド配列を用いれば、組換え型のＬＴＭポリペプチドを、微生物又は真核生物の細胞プロセスを通じて生成させることができる。ポリヌクレオチド配列を連結して発現ベクタなどの遺伝子コンストラクトにしたり、真核生物（酵母、鳥類、昆虫又は哺乳動物）又は原核生物（細菌細胞）などのホストを形質転換又はトランスフェクトする手法は、ＭＡＰキナーゼ、ｐ５３、ＷＴ１、ＰＴＰホスファターゼ、ＳＲＣ、等々、他の公知のタンパク質を生成させるのに用いられている標準的な手法である。同様な方法、又はそれらの改良法を利用すれば、本発明に基づいた微生物手段又は組織培養技術により組換えＬＴＭポリペプチドを調製することができる。
【００５８】
Ｄ．薬物スクリーニングアッセイ
本発明の一態様では、動物の長期記憶固定を、ＬＴＭ遺伝子の一つ以上の機能を変調することで変更するのに利用できる作用薬を同定するようデザインされたアッセイを行うのに、ＬＴＭ遺伝子及び／又はＬＴＭ遺伝子産物を利用する。以下にさらに詳述するように、テスト作用薬は、ＬＴＭたんぱくの活性の阻害能又は増強能に関し、細胞ベースのアッセイ又は無細胞アッセイで評価することができる。実施例で説明するように、ＬＴＭ遺伝子は、細胞表面受容体及び分泌タンパク質から転写因子のものまで、様々であってもよい。従って、本発明は、例えばＬＴＭたんぱくの酵素活性を変調する、ＬＴＭたんぱくの半減期を変調する、ＬＴＭたんぱくの他のタンパク質、核酸、糖質又は他の生物分子との相互作用を変調する、ＬＴＭたんぱくの細胞内局在化を変調する、等々といった化合物を検出するような薬物スクリーニングフォーマットを考察している。多種のアッセイフォーマットが条件を満たすものであり、本発明を鑑みれば、当業者の想到するところであろう。
【００５９】
本薬物スクリーニングアッセイで調べられる代表的な作用薬には、例えば分子量が２５００ａｍｕ未満、より好ましくは１０００ａｍｕ未満、７５０ａｍｕ未満、又は５００ａｍｕ未満であるなど、小有機分子が含まれる。このような分子には、ペプチド及びペプチド以外の部分、核酸、糖質、等々を含めることができる。多くの実施例では、複数の異なるテスト作用薬について、アッセイを繰り返すのが好ましいであろう。例えば、少なくとも１０種類の異なるテスト作用薬について当該アッセイを繰り返すことができ、他の実施例では、少なくとも１００種類、又は少なくとも１０００種類もの異なるテスト作用薬について、繰り返してもよい。
【００６０】
（ｉ）無細胞アッセイ
化合物のライブラリ及び天然抽出物を調べる多くの薬物スクリーニングプログラムでは、高スループットのアッセイが、ある時間内で調べられる化合物数を最大にするには好ましい。精製済み又は半精製済みのタンパク質で得られるであろうものなど、無細胞系で行われるアッセイが、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。なぜならそれらは、急速な展開を可能として、テスト化合物が媒介する分子標的の変化を比較的に容易に検出できるよう、作製することができるからである。さらに、テスト化合物の細胞傷害性の作用及び／又は生物学的利用能は、インビトロ系では概ね無視することができ、代わりにこのアッセイでは、上流又は下流の因子との結合親和性の変化又は内因性の酵素活性の変化に現れると考えられる、分子標的に対する当該薬物の作用に主に注目することができる。本方法で同定されるＬＴＭたんぱくの多くは、何らかの形の無細胞アッセイフォーマットになじむことであろう。可溶性のタンパク質は、細胞質内のものであれ、又は細胞外のものであれ、組換えにより発現させることができ、少なくとも部分的に精製するか、又はライセートとして提供して、無細胞アッセイでの利用に向けることができる。場合によっては、膜関連たんぱくを、界面活性剤又はリポソーム中に精製したり、又は、細胞膜画分の一部又はオルガネラ製剤として、単離することもできる。
【００６１】
従って、本発明のある例示的なスクリーニング・アッセイでは、ＬＴＭたんぱくと、このＬＴＭたんぱくと相互作用する一つ以上のタンパク質（又は核酸）（このような分子をここでは「ＬＴＭ相互作用相手」又は「ＬＴＭ−ＩＰ」と呼ぶ）とを含有する反応混合液を作製する。ＬＴＭ−ＩＰの例には、正又は負のいずれに調節するかに関係なく、ＬＴＭポリペプチドの上流で働く（ＬＴＭ活性のアクチベータ及びリプレッサを含む）タンパク質や、下流で働くタンパク質又は核酸がある。この反応混合液は、さらに一種類以上のテスト化合物を含有する。ＬＴＭたんぱくと、上流又は下流のＬＴＭ−ＩＰとの複合体の検出及び定量は、ＬＴＭとＬＴＭ−ＩＰとの間の複合体形成を阻害又は増強する上での化合物の効果を判定する手段となる。化合物の効果は、テスト化合物を様々な濃度で用いて得られたデータから用量応答曲線を作製すれば、評価できる。さらに、比較用の基線を設けるためにコントロール・アッセイを行ってもよい。あるコントロール・アッセイでは、単離・精製されたＬＴＭポリペプチドを、ＬＴＭ−ＩＰを含有する組成物に加えて、複合体の形成をテスト化合物の不在下で定量する。
【００６２】
ＬＴＭポリペプチドの結合相手との間の複合体形成は、様々な技術によって検出してよい。複合体形成の変調は、例えば、放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識されたタンパク質など、検出可能に標識されたタンパク質を用いる方法；イムノアッセイ；又は、クロマトグラフィ検出法などにより、定量することができる。
【００６３】
多くの場合、ＬＴＭ又はその相互作用相手のいずれかを固定すると、これらの一方又は両者のタンパク質の、複合体を形成していない形のものから複合体を簡単に分離したり、アッセイの自動化をはかるには、好ましいであろう。候補作用薬の存在下及び不在下で、上流又は下流の因子にＬＴＭたんぱくを結合させるのは、反応物を容れるのに適していればいかなる容器内で行ってもよい。例には、微量定量プレート、試験管、及びマイクロ遠心管がある。実施例の一つでは、当該タンパク質をマトリックスに結合可能にするドメインを加えた融合タンパク質を提供してもよい。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＬＴＭ（ＧＳＴ／ＬＴＭ）融合タンパク質を、グルタチオン・セファロース・ビーズ（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社製）又はグルタチオン誘導体化微量定量プレートに吸着させ、次にこれを細胞ライセートか、又は、ＬＴＭ−ＩＰ及びテスト化合物を含有する他の製剤に配合し、この混合液を、例えば生理条件の塩及びｐＨなど、（テスト化合物の不在下で）複合体形成が導かれる条件下でインキュベートすることができるが、僅かによりストリンジェントな条件が好ましいであろう。インキュベート後、ビーズを洗浄して結合しなかったＬＴＭ−ＩＰを洗い落とし、マトリックスを固定し、マトリックス中か、又は、複合体を解離させた後の上清中のＬＴＭ−ＩＰ量を調べる。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ビーズ画分中に見つかったＬＴＭ−ＩＰのレベルを、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量してもよい。
【００６４】
タンパク質又は核酸をマトリックス上に固定する他の技術も、本アッセイで利用できる。例えば、ＬＴＭ又はその認識結合相手のいずれかを、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を利用して固定してもよい。例えば、ビオチン化ＬＴＭたんぱくを、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当業で公知の技術（例えばイリノイ州ロックフォード、ピアース・ケミカルズ社製、のビオチニレーション・キットなど）から調製し、ストレプトアビジンで被膜した９６ウェルプレート（ピアース・ケミカル社製）のウェル内に固定してもよい。あるいは、ＬＴＭたんぱくとは反応性であるが、上流又は下流の結合相手の結合には干渉しないような抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、ＬＴＭたんぱくをこのウェル内に、抗体結合により捕獲することもできる。上記のように、ＬＴＭ−ＩＰ及びテスト化合物の製剤を、ＬＴＭを施したプレートのウェル内でインキュベートし、ウェル内に捕獲された複合体の量を定量することができる。このような複合体を検出する方法の例には、ＧＳＴ固定複合体について上述したものも含め、ＬＴＭ結合相手と反応性であるか、又は、ＬＴＭたんぱくと反応性でこの結合相手と競合するような抗体を用いて複合体を検出する免疫検出法や、結合相手に関連した、内因性又は外因性の活性である酵素活性の検出に依拠した酵素結合アッセイ、がある。後者の場合、酵素を化学共役させても、又は、ＬＴＭ−ＩＰとの融合タンパク質として提供してもよい。実例を挙げると、ＬＴＭ−ＩＰを西洋わさびペルオキシダーゼに化学的に架橋するか又は遺伝子融合させ、複合体内に捕獲されたポリペプチドの量を、例えば ３，３’−ジアミノ−ベンズアジンテトラヒドロクロリド又は４−クロロ−１−ナフトールなど、この酵素の色素産生性基質で評価することができる。同様に、本ポリペプチド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んで成る融合タンパク質を提供し、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてこのＧＳＴの活性を検出すれば、複合体形成を定量できる（Ｈａｂｉｇ ｅｔ ａｌ （１９７４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４９： ７１３０）。
【００６５】
複合体に捕獲されたタンパク質の一つを定量するのに免疫検出に依拠するプロセスでは、抗ＬＴＭ抗体など、当該タンパク質に対する抗体を利用できる。あるいは、複合体中で検出しようとするタンパク質に、抗体を容易に（例えば市販のものを）得られるような第二のポリペプチド配列を含有する融合タンパク質の形で「エピトープのタグを付け」てもよい。例えば、上に解説したＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いた結合の定量にも利用できる。他の有用なエピトープ・タグには、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列を含む菌エピトープ（例えばＥｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：　　　 ２１１５０−２１１５７を参照されたい）や、ｐＦＬＡＧ系（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社製）又は ｐＥＺＺ−プロテインＡ 系（ニュージャージー州、ファルマシア社製）がある。
【００６６】
他の無細胞の実施例には、ＬＴＭたんぱく又はＬＴＭたんぱく含有複合体の内因性の活性を検出して、この活性を増加又は阻害する化合物を同定するようなアッセイがある。例えば、ＬＴＰタンパク質と、ＬＴＭたんぱくの酵素活性の基質と、テスト作用薬とを含有する反応混合液を作製してもよい。基質の生成物への転化速度を調べ、ＬＴＭたんぱく及び基質のみを混合したものなどのコントロール試料に比較することができる。テスト作用薬がＬＴＭ活性の阻害剤であれば、基質の生成物への転化速度が低下するであろうし、一方、この速度を上昇させるテスト作用薬は、ＬＴＭ活性のアゴニストであろうと思われる。
【００６７】
好適な実施例では、当該基質は容易に検出可能であり、例えば基質の生成物への転化により、反応混合液に比色又は蛍光上の変化が起きて、この変化を分光手段で検出できるか、又は、エピトープが生じる又は破壊されて、これをイムノアッセイで検出することができる、などである。
【００６８】
（ｉｉ）細胞ベースのアッセイ
上に解説した無細胞アッセイに加え、本発明により提供された容易に入手できるＬＴＭたんぱくにより、小分子のアゴニスト／アンタゴニスト等々を同定する細胞ベースのアッセイを容易に作製することができる。細胞中のＬＴＭたんぱくの活性をテスト作用薬が変化させる能力には、ＬＴＭたんぱくを含有する複合体の形成を直接検出すること、ＬＴＭたんぱくの内因性酵素活性を検出すること、ＬＴＭたんぱくの細胞内局在化の変化を直接検出すること、ＬＴＭたんぱくの翻訳後修飾又はＬＴＭたんぱくの安定性変化を検出すること、又は、このような事象のいずれか一つの下流の結果を検出すること、が含まれよう。
【００６９】
このようなアッセイは簡単な結合アッセイでもよい。例えばＬＴＭたんぱくが受容体である場合、このアッセイを利用して、この受容体に結合する化合物を同定したり、又は、この受容体がそのリガンドに結合する能力を実行させる化合物を同定することができる。他の実施例では、ＬＴＭたんぱくの存在又は活性に対して細胞内で形態上の変化を起こすなどの表現型上感受性のある細胞に、注目のテスト作用薬の存在下及び不在下で組換えＬＴＭたんぱくを過発現又は不足発現させ、このテスト作用薬が媒介した、標的細胞によるＬＴＭ応答の変調を、このアッセイで採点することができる。無細胞アッセイと同様、（阻害又は増強のいずれかの）ＬＴＭ依存性応答における統計上有意な変化を生じる作用薬を同定することができる。例えば、あるＬＴＭたんぱくの存在又は活性に応答して上方又は下方調節された遺伝子発現レベル又は遺伝子産物レベルを検出してもよい。好適な実施例では、例えば５’側フランキングプロモータ及びエンハンサ領域など、このような遺伝子の調節領域を、検出が容易にできる遺伝子産物をコードする検出可能マーカ（例えばルシフェラーゼ）に操作により連結する。
【００７０】
ＬＴＭたんぱく自体、又は、他のタンパク質との複合体中のＬＴＭたんぱくが、ＤＮＡに結合して、ある遺伝子の転写を変調することができる場合、転写をベースにしたアッセイを利用できると思われ、例えばそのとき、ＬＴＭ応答性調節配列を検出可能なマーカ遺伝子に操作により連結する。
【００７１】
本発明のさらに別の態様では、当該薬物スクリーニングアッセイで本ＬＴＭたんぱくを利用して「二種ハイブリッド」アッセイを作製することができる（例えば米国特許第５， ２８３， ３１７ 号； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２： ２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．　（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． ２６８： １２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４： ９２０−９２４ ； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８： １６９３−１６９６； 及びＰＣＴ公報 Ｎｏ． ＷＯ ９４／１０３００を参照されたい）。簡単に説明すると、この二種ハイブリッドアッセイは、二つの別々の融合タンパク質から、機能的な転写アクチベータたんぱくをインビボで再構築することに依拠するものである。具体的には、この方法は、ハイブリッドたんぱくを発現するキメラ遺伝子を利用するものである。実例を挙げると、転写アクチベータのＤＮＡ結合ドメインのコーディング配列を、ＬＴＭたんぱくのコーディング配列にフレーム内で融合させてある第一のキメラ遺伝子を作製することができる。第二のハイブリッドたんぱくは、ＬＴＭたんぱくに結合する、ＬＴＭ−ＩＰなどの別のポリペプチドにインフレームで融合された転写活性化ドメインをコードしている。これら二つの融合タンパク質が相互作用し、例えばＬＴＭ依存性複合体を形成するなどができると、転写アクチベータの二つのドメインが近接した位置に来る。この近接度は、第一の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが結合する転写調節部位に操作により連結させたレポータ遺伝子の転写を起こさせるのに充分であり、このレポータ遺伝子の発現を検出して利用すれば、ＬＴＭと試料タンパクとの相互作用を採点することができる。
【００７２】
ａ．ＬＴＭたんぱくの例：ＧｌｕＲｌ 及びＧｌｕＲ２
いくつかの実施例では、当該のアッセイを用いて、ＧｌｕＲ１ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １ 及び ２） 又はＧｌｕＲ２ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３ 及び４）など、グルタミン酸受容体の活性を変調する化合物を同定する。
【００７３】
このアッセイは、受容体に結合することで、例えば天然リガンドの活性を模倣又は増強したり、又は、受容体の結合又はシグナル伝達を阻害するなどする作用薬を同定するのに利用できる。実例を挙げると、結合試験の場合、競合的な結合についてテスト作用薬を検査することができる。例えば、［^３Ｈ］ ＡＭＰＡ 結合を以下のように評価できる。ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２を発現している細胞を、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ ７．４、の中で３０分間、プレインキュベートし、次に、４℃で４時間、１００ ｍＭ 緩衝液に１００ ｍＭ ＫＣＳＮ、７０ ｎＭ ［^３Ｈ］ ＡＭＰＡ （マサチューセッツ州ボストン、ＮＥＮ社製、５３ Ｃｉ／ｍｍｏｌ） 及びテスト作用薬を加えたものの中でインキュベートする。この放射性標識されたＡＭＰＡの結合を評価し、テスト化合物の不在時の結合レベルに比較する。非特異的結合は、１ ｍＭのＬ−グルタミン酸の存在下で測定する。
【００７４】
ＧｌｕＲ１ 及びＧｌｕＲ２ 受容体は、シナプス後リン酸イノシトール代謝に共役して、例えばＰＬＣ／ＰＫＣ／ＣＲＥＢ／ＭａｐＫ 経路や、ｃＡＭＰ−媒介経路を活性化していると思われる。従って、セカンド・メッセンジャーの生成及び遺伝子発現の調節を利用すれば、ＧｌｕＲ１ 又はＧｌｕＲ２の活性を阻害又は増強する上でのテスト作用薬の能力を評価することができる。
【００７５】
ｂ．ＬＴＭたんぱくの例：インシュリン様成長因子１
ＩＧＦ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７ 及び８）は細胞外たんぱくの一つであり、細胞上でのその誘導作用を、少なくとも部分的に、ＩＧＦ１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）への結合を通じて伝達している。この受容体はある内因性のチロシンキナーゼ活性を有するが、この活性を本アッセイで標的として、キナーゼ活性の阻害剤を同定することができる。
【００７６】
この受容体からのシグナル伝達には、ＳＨ２含有タンパク質チロシンホスファターゼ２ （ＳＨＰ−２）及びＳＨＣを含め、Ｓｒｃホモロジー−２（ＳＨ２）ドメインを含有する一連のタンパク質との相互作用が含まれる。当該のアッセイは、ＩＧＦ１−ＲのＳＨ２ドメインとの相互作用を阻害したり、又は、ＩＧＦ１−Ｒと相互作用するＳＨ２タンパク質の酵素活性を阻害するような作用薬を同定するのに、利用できる。 例えば、本アッセイで、チロシンリン酸化ＩＧＦ−１Ｒのβサブユニットと、ＳＨＰ−２の少なくともＳＨ２ドメインと、テスト作用薬とを組み合わせ、このテスト作用薬が、ＩＧＦ１−Ｒ及びＳＨＰ−２を含有する複合体の形成を変化させる能力を検出することができる。
【００７７】
ＩＧＦ１−Ｒはまた、Ｊａｋたんぱくチロシンキナーゼファミリーの活性化を通じてシグナルを伝達するが、その結果、ＳＴＡＴ転写アクチベータ因子がリン酸化する。例えば、Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ （１９９５） ＰＮＡＳ ９２： ７７７９−７７８３； Ｓｃｈａｒｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｌｏｏｄ ８６： ２０７７２０８５； Ｂａｃｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＮＡＳ ９２： ７３０７−７３１１）； 及びＳａｋａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０： １７５２８−１７５３４を参照されたい。Ｊａｋリン酸化の下流の事象も解明されている。例えば、ＩＧＦ１−Ｒ は、転写シグナルトランスデューサ及びアクチベータ （ＳＴＡＴ） たんぱくＳＴＡＴ１□、ＳＴＡＴ２β、及びＳＴＡＴ３や、二つのＳＴＡＴ関連たんぱく、即ちｐ９４ 及びｐ９５をリン酸化することができる。これらＳＴＡＴたんぱくは核へ移行して特異的ＤＮＡ配列に結合するが、このことからＩＧＦ１−Ｒが特定の遺伝子を活性化させる一つの機序が分かる。
【００７８】
本アッセイで採点の可能であろう検出手段には、リン酸化の変化などでセカンド・メッセンジャーを直接検出することに加え、ＳＴＡＴたんぱくに応答性の転写調節配列を含有するレポータ・コンストラクト又は指標遺伝子がある。
【００７９】
ｃ．ＬＴＭたんぱくの例：神経内分泌ＶＧＦ
ニューロトロフィン誘導性遺伝子ＶＧＦ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １１ 及び１２）は、神経組織及び内分泌組織で発現する。これは、神経細胞でたんぱく分解によるプロセシングによって低分子量のポリペプチドになるある分泌たんぱくをコードしている。細胞をＶＧＦに接触させると起きるセカンド・メッセンジャの誘導をターゲティングする方法に加え、本アッセイも、ＶＧＦのたんぱく分解プロセシングを阻害する作用薬を同定するために、利用できる。
【００８０】
ｄ．ＬＴＭたんぱくの例： ＺＩＦ２６８
Ｚｉｆ２６８ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５ 及び６） はｋｒｏｘ−２４、ｅｇｒ−１、ＴＩＳ ８、ＮＧＦＩ−Ａ又はｚｅｎｋとしても知られる。これは、例えば ５’−ＣＧＣＣＣＣＣＧＣ 又は５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧなどの転写調節配列など、いわゆる「ＥＧＲ１モチーフ」に結合する亜鉛フィンガー転写因子である。例えば、Ｒａｕｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０： １２５９； 及びＰａｖｌｅｔｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ８０９を参照されたい。
【００８１】
いくつかの実施例では、本アッセイは、ＥＧＲ１モチーフをその転写調節配列の一部として有するレポータ遺伝子を含む、転写をベースにしたアッセイであってもよい。テスト作用薬に対しては、Ｚｉｆ２６８依存的転写を向上又は阻害する上での能力について、評価することができる。
【００８２】
他の実施例では、Ｚｉｆ２６８がそのＥＧＲ１モチーフと結合することを向上又は阻害する能力について、例えばこのモチーフを含有する核酸などの競合結合アッセイで、テスト作用薬を調べることができる。
【００８３】
ｅ．ＬＴＭたんぱくの例：Ｃ／ＥＢＰβ
別の実施例では、当該の薬物スクリーニングアッセイの標的は、 ＣＣＡＡＴ／エンハンサたんぱくとも呼ばれる転写因子 Ｃ／ＥＢＰβ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９ 及び１０）である。このＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合たんぱく（Ｃ／ＥＢＰ）ファミリーは、塩基性ロイシン・ジッパークラスの転写因子に属する。このＣ／ＥＢＰ たんぱくはＣＣＡＡＴ−ボックス（コンセンサスＧＧ^Ｔ／_ＣＣＡＡＴＣＴ）に結合する。
【００８４】
Ｚｉｆ２６８について上述したように、Ｃ／ＥＢＰ依存的転写活性又は競合結合アッセイを用いて、テスト化合物が、Ｃ／ＥＢＰβの活性を向上又は阻害する能力を評価することができる。
【００８５】
ｆ．スクリーニング及び選択アッセイの例：セカンド・メッセンジャーの生成
テスト化合物の生物活性についてスクリーニングをかける場合、細胞内のセカンド・メッセンジャーの生成を直接測定してもよい。アデニリルシクラーゼ、環状ＧＭＰ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチダーゼＣ、及びホスホリパーゼＡ_２や、多種のイオンを含め、多種の細胞内エフェクターが上に記載したＬＴＭたんぱくのいくつかの調節を受けると、判明している。
【００８６】
実施例の一つでは、ＭＥＫＫ、ＭＥＫ、又はＭａｐキナーゼなどの細胞内タンパク質のリン酸化を検出したり、又は、ｃ−ｆｏｓ 及び／又は ｃ−ｊｕｎに対して応答性の転写調節配列を含むレポータ・コンストラクト又は指標遺伝子を利用することで、検出シグナルを提供する。
【００８７】
別の実施例では、当業で公知の技術を用いて□^３２Ｐ ＧＴＰの分解を調べることで、ＧたんぱくによるＧＴＰａｓｅ酵素活性を、細胞膜製剤中で測定することができる（例えば、Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｇ． Ｍｉｌｌｉｇａｎ， Ｅｄ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄを参照されたい）。ｃＡＭＰを変調する受容体を調べる場合、標識のないｃＡＭＰの存在下で［^３Ｈ］ｃＡＭＰを定量する競合アッセイなど、ｃＡＭＰを検出する標準的な技術を利用できるであろう。
【００８８】
当該ＬＴＭたんぱくのうちのいくつかは、ホスホリパーゼＣの活性を刺激することで、ホスファチジルイノシトール ４，５， ビホスフェートの（細胞内Ｃａ＋＋を移動させる）１，４，５−ＩＰ３及び（タンパク質キナーゼＣを活性化させる）ジアシルグリセロール （ＤＡＧ）への分解を刺激する。イノシトールリピドは、標準的なリピド抽出技術を用いて抽出及び分析することができる。ＤＡＧはまた薄層クロマトグラフィを用いても測定できる。三種類のイノシトールリピド（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３）すべての水溶性の誘導体も、放射性標識技術又はＨＰＬＣを利用して定量することができる。
【００８９】
ＰＩＰ２分解のもう一方の産物であるＤＡＧは、ホスファチジルコリンからも生成する。受容体が媒介するシグナル伝達に応答したこのホスホリピドの分解も、多種の放射性標識技術を用いて測定することができる。
【００９０】
ホスホリパーゼＡ２の活性化は、例えば細胞内のアラキドン酸の生成などを含む公知の技術を利用して容易に定量できる。
【００９１】
ＩＧＲ１−Ｒなどのいくつかの受容体では、細胞内のリン酸化の変化についてスクリーニングを行うのが好ましいかも知れない。このようなアッセイ・フォーマットは、目的の受容体が受容体キナーゼ又はホスファターゼである場合に有用であろう。例えば抗ホスホチロシン、抗ホスホセリン又は抗ホスホスレオニン抗体を利用した免疫ブロット法である （Ｌｙｏｎｓ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ７４２６−７４３０）。加えて、リン酸化を調べる方法は、受容体自体はキナーゼではない可能性はあるが、シグナル伝達経路の下流で働くタンパク質キナーゼ又はホスファターゼを活性化するような場合にも、有用かも知れない。
【００９２】
このようなカスケードの一つは、様々な細胞種で有糸分裂性の分化及びストレス反応の両方を媒介していると思われるＭＡＰキナーゼ経路である。成長因子受容体が刺激を受けると、Ｒａｓが活性化し、続いて ｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ、並びにｐ４４ 及び ｐ４２ ＭＡＰ キナーゼ （ＥＲＫ１ 及びＥＲＫ２）が順に活性化する。活性化したＭＡＰキナーゼは次に、数多くの鍵となる調節たんぱくをリン酸化するが、これら調節たんぱくの中には、ＭＡＰキナーゼが核に移行するとリン酸化するｐ９０ＲＳＫ 及びＥｌｋ−１ もある。哺乳動物細胞及び酵母細胞には相同の経路が存在する。例えば、Ｓ．セレビジエのフェロモンシグナル伝達経路の基本的な部分は、ＳＴＥ１１、ＳＴＥ７、及びＦＵＳ３／ＫＳＳ１（後者の対は別個であるが、機能的には重複している）遺伝子の産物から成るタンパク質キナーゼカスケードから成る。従って、このキナーゼカスケードのメンバーのリン酸化及び／又は活性化を検出すれば、受容体への結合を定量するのに利用できる。チロシンリン酸化の増加を測定するにはホスホチロシン特異抗体が利用でき、ホスホ特異抗体は市販のものが入手可能である（マサチューセッツ州ビバリー、ニューイングランド・バイオラブズ社製）。
【００９３】
さらに別の実施例では、本ＬＴＭたんぱくのシグナル伝達経路は、細胞に添加することのできる基質を開裂させられる酵素の発現を上方調節するか、又は、この酵素を活性化させるものである。このシグナルを、検出可能な基質を用いて検出し、この場合は基質シグナルが失われるのを観察するが、又はその代わりに、検出可能な生成物を生じる基質を用いることで、検出する。好適な実施例では、活性化した酵素により基質が生成物へ転化すると、テスト細胞の光学的な特徴に検出可能な変化が生じ、例えば基質及び／又は生成物が色素生成上又は蛍光生成上、活性となる。例示的な実施例では、当該シグナル伝達経路は、たんぱく分解酵素の活性を変化させて、これが基質ペプチドを開裂させる速度を変化させる（又は単に酵素を基質に向かって活性化する）ものである。このペプチドには、蛍光放出性ラジカルなどの蛍光生成性供与基ラジカルと、芳香族ラジカルなどの受容基ラジカルとが含まれ、この受容基ラジカルは、受容基ラジカル及び蛍光生成性供与基ラジカルが近い位置に共有結合したときに蛍光生成性供与基ラジカルの蛍光エネルギーを吸収する。例えば、ＵＳＳＮ 第５，５２７，６８１号、第５，５０６，１１５号、第５，４２９，７６６号、第５，４２４，１８６号及び第５，３１６，６９１号、並びに Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０４： ９６−１０２を参照されたい。例えば、基質ペプチドが、１−アミノ安息香酸（アントラニル酸又はＡＢＺ） 又はアミノメチルクマリン（ＡＭＣ） などの蛍光供与基を当該ペプチド上の一箇所に有し、ルシファー・イェロー、メチルレッド又はニトロベンゾ−２−オキソ１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）などの蛍光停止基を、このペプチドの遠位端近傍の異なる位置に有するなどである。活性化した酵素の開裂部位は、供与基及び受容基の部位の各々の間に位置することになるであろう。蛍光供与分子から停止分子へ分子内共鳴エネルギーが移動すると、これら二者が空間中で充分な近さにあった場合、例えばこのペプチドがインタクトである場合などに、供与分子の蛍光が停止することになる。しかしこのペプチドが開裂すると、停止基は供与基から分離して、後に蛍光フラグメントが残る。従って、酵素が活性化すると検出ペプチドの開裂が起きて、蛍光基の蛍光が再開する。
【００９４】
さらに別の実施例では、カルシウム、イノシトールリン酸の加水分解生成物、ｃＡＭＰ、等々のセカンド・メッセンジャーの濃度に活性が依存するような酵素又は色素生成性／蛍光プローブを利用して、検出可能なシグナルを生成させることができる。例えば、細胞内カルシウムの移動、又は、細胞外からのカルシウムの流入を、標準的な技術を用いて測定してもよい。適当なカルシウム指標物質、蛍光性、生物発光性、金属クロム、又はＣａ＋＋感受性の微小電極の選択は、研究対象となった細胞種、事象の規模及び時定数に応じる（Ｂｏｒｌｅ （１９９０） Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ ８４： ４５−５６）。Ｃａ＋＋ 検出法の一例として、標準的な方法を用いてＣａ＋＋感受性蛍光染料 ｆｕｒａ−２ 又はｉｎｄｏ−１で細胞を染色し、Ｃａ＋＋の変化を、蛍光光度計を用いて測定してもよいであろう。
【００９５】
上記のいくつかの実施例から分かるように、セカンド・メッセンジャーの生成を直接測定する方法に加え、受容体又はイオンチャンネル経路のシグナル伝達活性は、遺伝子の受容体／チャンネル媒介性転写活性化（又は抑制）を検出するなど、転写産物を検出すれば測定できる。転写産物の検出には、遺伝子転写物の検出、産物の直接の（例えばイムノアッセイによる）検出、又は、タンパク質の活性の検出（例えば酵素活性又は色素生成性／蛍光生成性活性など）があるが、これらの方法のそれぞれを、ここでは一般に、指標遺伝子の発現を検出する手段と呼ぶ。指標遺伝子は、ホスト細胞の修飾前の内因性遺伝子でも、修飾後の内因性遺伝子でも、又は、レポータ遺伝子コンストラクトの一部であるなど、完全に異種のコンストラクトの一部でも、よい。
【００９６】
実施例の一つでは、指標遺伝子は修飾前の内因性遺伝子である。場合によっては、シグナル経路による内因性指標遺伝子の転写活性化レベルを上昇させることが、例えばテスト系のシグナル対ノイズ比を向上させたり、又は、特定の検出技術にとって適したレベルに応答レベルを調節するために、好ましいかも知れない。ある実施例では、細胞内シグナルカスケードに関与するタンパク質の一つ以上、特にこの経路に関与する酵素、を過剰発現させることで、当該シグナル経路の転写活性化能力を増幅することができる。例えば、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の発現を上昇させると、ＭＥＫ／ＭＥＫＫ経路の一シグナルで起きる転写活性化レベルを増強することができる。このアプローチはもちろん、異種のレポータ遺伝子の転写レベルを増強するためにも、利用できる。
【００９７】
他の実施例では、天然遺伝子座にある指標遺伝子プロモータ配列を操作することで、内因性の指標遺伝子の感受性を向上させることができる。このような操作は、内因性調節配列の点変異から、調節配列の全部又は大部分の全体的な置換まで、様々な幅が考えられる。一般に、指標遺伝子のゲノム配列の操作は、相同組換えを含め、当業で公知の技術を用いて行うことができる。
【００９８】
別の例示的な実施例では、内因性遺伝子のプロモータ（又は他の転写調節配列）を、異種のプロモータ配列で「スイッチ・アウト」して、指標遺伝子座でキメラ遺伝子を形成するなどができる。やはり、相同組換えなどの技術を利用しても、指標遺伝子のゲノム遺伝子座で調節配列をこのように変更できる。
【００９９】
さらに別の実施例では、異種のレポータ遺伝子コンストラクトを用いて、指標遺伝子の機能を提供することができる。レポータ遺伝子コンストラクトは、レポータ遺伝子を、少なくとも一つの転写調節配列に機能的に連結させることで、調製される。転写調節配列をひとつだけ含める場合、それは調節可能なプロモータでなくてはならない。少なくとも一つの所定の転写調節配列が、所定の細胞表面受容体の活性により間接的又は直接的に調節されねばならず、こうすれば、受容体の活性を、レポータ遺伝子の転写を通じて観察できる。
【０１００】
数多くのレポータ遺伝子及び転写調節配列が当業者に公知であり、他のものも、当業者に公知の方法で同定又は合成できよう。
【０１０１】
ｇ．スクリーニング及び選択アッセイの例：レポータ遺伝子
レポータ遺伝子の例には、限定はしないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｖａｐｎｅｋ （１９７９）， Ｎａｔｕｒｅ ２８２： ８６４−８６９） ルシフェラーゼ、及び他の酵素検出系、例えばベータ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： ７２５−７３７）； バクテリアルシフェラーゼ （Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ （１９８４）， ＰＮＡＳ １： ４１５４−４１５８； Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： ３６６３−３６６７） ； アルカリホスファターゼ （Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２： ２３１−２３８， Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８３）　Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． ２： １０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ （Ｃｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｉｍ （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１６： ３６２−３６８）、がある。
【０１０２】
レポータ遺伝子コンストラクトで用いたり、又は、指標遺伝子のゲノム遺伝子座を改変するための転写調節配列には、限定はしないが、プロモータ、エンハンサ、並びにリプレッサ及びアクチベータ結合部位、がある。適した転写調節配列は、細胞表面たんぱくと、この細胞表面たんぱくの活性を変調するエフェクターたんぱくとの間の接触後、急速、一般には数分で、発現が誘導されるような遺伝子の転写調節領域を由来とするものであろう。このような遺伝子の例には、限定はしないが、ｃ−ｆｏｓなどの最初期遺伝子（Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｅｕｒｏｎ ４： ４７７−４８５）、がある。最初期遺伝子とは、リガンドが細胞表面たんぱくに結合すると急速に誘導される遺伝子である。遺伝子コンストラクトで用いるのに好適な転写調節配列には、最初期遺伝子由来の転写調節配列、最初期遺伝子の特徴のいくつか又は全部を呈する他の遺伝子を由来とする配列、又は、機能的に連結した先の遺伝子がこのような特徴を呈するよう構築された合成の配列、がある。転写調節配列の由来となる好適な遺伝子の特徴には、限定はしないが、静止期細胞で発現が低い又は検出不能であること、細胞外刺激から数分以内に転写レベルが急速に誘導されること、誘導が一過性であり、新しいタンパク質合成から独立していること、その後の転写の停止に新たなタンパク質合成が必要であること、そして、これらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの半減期が短いこと、が挙げられる。これらの性質すべてがあることが必要な訳ではない。
【０１０３】
上記のものに加え、他のプロモータ及び転写調節配列には、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答性；Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ６６６２−６６６６）；ソマトスタチン遺伝子プロモータ （ｃＡＭＰ 応答性；Ｍｏｎｔｍｉｎｙ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８．３： ６６８２−６６８６）；プロエンケファリンプロモータ（ｃＡＭＰ応答性、ニコチン性アゴニスト、及びホルボールエステル ； Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３５３−３５６）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシ−キナーゼ遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ 応答性；Ｓｈｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： ９７２１−９７２６）；ＮＧＦＩ−Ａプロモータ （ＮＧＦ、ｃＡＭＰ、及び血清応答性；Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３７７−３８１） ； 及び当業者に公知又は調製可能な他のもの）、がある。
【０１０４】
サイクリックＡＭＰを変調する受容体の場合、転写をベースにした読み取りは、ある特定のセリン（Ｓ１３３）でリン酸化すると活性が調節を受ける転写因子である、サイクリックＡＭＰ応答配列結合たんぱくのＣＲＥＢを用いて構築することができる。このセリン残基がリン酸化すると、ＣＲＥＢは、プロモータの５’側に見つかるＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答配列）として公知のある認識配列に結合するが、この認識配列はｃＡＭＰレベルの上昇に応答性であることが知られている。リン酸化したＣＲＥＢがＣＲＥに結合すると、このプロモータからの転写が増加する。
【０１０５】
ＣＲＥＢのリン酸化は、ｃＡＭＰレベルの上昇と、細胞内Ｃａレベルの上昇の両方に応答する形で見られる。ｃＡＭＰレベルが上昇すると、ＰＫＡが活性化し、続いてＣＲＥＢがリン酸化してＣＲＥに結合し、転写活性化が起きるのである。細胞内カルシウムレベルが上昇すると、カルシウム／カルモジュリン応答性キナーゼＩＶ（ＣａＭ キナーゼＩＶ）が活性化する。ＣＲＥＢのＣａＭ キナーゼ ＩＶによるリン酸化は実際上はＰＫＡによるＣＲＥＢリン酸化と同じであり、ＣＲＥ含有プロモータの転写活性化につながる。細胞外シグナル関連プロテインキナーゼ （ＥＲＫ） 及び Ｒｓｋ２の活性化も、ＣＲＥＢのリン酸化及び転写活性化につながる。Ｉｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｅｕｒｏｎ ２１： ８６９−８８３．
【０１０６】
従って、転写をベースにした読み取りは、ＣＲＥを一つ以上含有する基礎プロモータにより発現が駆動されるレポータ遺伝子を含有する細胞で、構築することができる。（リガンドが結合した受容体の活性変化の結果として）細胞内のＣａ^＋＋濃度に変化が起きると、ａ）ＣＲＥＢもこの細胞内で共発現する場合、及びｂ）カルシウム増加に応答して内因性の酵母ＣａＭキナーゼがＣＲＥＢをリン酸化するか、又は、外因性で発現したＣａＭキナーゼＩＶが同じ細胞内に存在する、のいずれかの場合に、このレポータ遺伝子の発現レベルが変化するであろう。換言すれば、ＰＬＣ活性を刺激すると、ＣＲＥＢのリン酸化が起き、ＣＲＥコンストラクトからの転写が増加する一方、ＰＬＣ活性を阻害すると、ＣＲＥ応答性コンストラクトからの転写が減少することになる。
【０１０７】
Ｂｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １５７５−１５７９に解説されているように、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞をＣＮＴＦ処置すると、ＳＴＡＴ／ｐ９１及びＳＴＡＴ関連たんぱくの、特定のＤＮＡ配列との相互作用が向上するという観察から、これらのタンパク質が、ＣＮＴＦにより惹起される遺伝子発現の変化の鍵となる調節物質と考えられることが分かった。この可能性と一致するのは、ＳＴＡＴ／ｐ９１の結合に必要なコンセンサスＤＮＡ配列と同様のＤＮＡ配列要素が、ＣＮＴＦにより誘導されることがこれまでに見つかった数多くの遺伝子の上流に存在するという発見である（例えばヒトｃ−ｆｏｓ、マウスｃ−ｆｏｓ、マウスｔｉｓ １１、ラットｊｕｎＢ、ラットＳＯＤ−１、及びＣＮＴＦ）。これらの著者は、ＳＴＡＴ／ｐ９１結合部位が、非応答性のレポータ遺伝子にＣＮＴＦ応答性をもたらすことができるということを実証した。従って、サイトカイン受容体からなど、ＳＴＡＴたんぱくを通じたシグナル伝達を検出するのに本発明で利用するレポータコンストラクトは、マウスｃ−ｆｏｓ遺伝子の−７１から＋１０９までを、細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（−７１ｆｏｓＣＡＴ）又は他の検出可能なマーカ遺伝子に融合させて用いることで、作製できる。サイトカイン受容体による誘導により、ＳＴＡＴ及びＳＴＡＴ関連たんぱくのチロシンリン酸化が誘導され、それに伴う転位、及びこれらのタンパク質のＳＴＡＴ−ＲＥへの結合、が起きる。次に、このＤＮＡ配列をそれらのプロモータ内に含有する遺伝子の転写が活性化するのである。
【０１０８】
好適な実施例では、レポータ遺伝子は、発現するとスクリーニング又は淘汰が可能な表現型上の変化が起きるような遺伝子である。変化が淘汰可能なものである場合、表現型上の変化により、レポータ遺伝子を発現した細胞と、発現しない細胞との間で成長率又は生存率の違いが出る。変化がスクリーニング可能なものである場合、表現型上の変化により、細胞の何らかの検出可能な特徴に違いが出て、この違いにより、マーカを発現している細胞を発現していないものから区別できる。淘汰がスクリーニングよりも好ましい。なぜなら、それは、受容体エフェクタであるテストポリペプチドを発現する細胞を、細胞培養物から増幅する手段となるからである。
【０１０９】
マーカ遺伝子は、マーカ遺伝子の発現が受容体の活性化に依存するよう、受容体シグナリング経路に共役させる。この共役は、マーカー遺伝子を受容体応答性プロモータに操作により連結することで、達成できよう。「受容体応答性プロモータ」という用語は、標的である受容体のシグナル伝達経路の何らかの産物により調節されるプロモータを指す。
【０１１０】
反対に、プロモータは当該受容体経路によって抑制されるものでもよく、こうして細胞にとって有害な生成物の発現が妨げられるものでもよい。受容体により抑制されるプロモータの場合、このプロモータを有害遺伝子に連結してアゴニストについてのスクリーニングを行ったり、有益な遺伝子に連結してアンタゴニストについてのスクリーニングを行ってもよい。抑制は、マーカ遺伝子がコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分（コーディング領域又はフランキング領域のいずれでも）に対してアンチセンスとなったｍＲＮＡをコードする遺伝子に、受容体で誘導されるプロモータを操作により連結することで、このｍＲＮＡの翻訳を阻害すれば、達成できよう。また、受容体で誘導されるプロモータを、ＤＮＡ結合リプレッサたんぱくをコードする遺伝子に連結し、適したオペレータ部位を、マーカ遺伝子のプロモータ又は他の適した領域に組み込んでも、抑制を達成できるであろう。
【０１１１】
ｈ．例示的な実施例：ホスト細胞
本アッセイを作製するのに適したホスト細胞には、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞、特に哺乳動物細胞、がある。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。適した哺乳動物ホスト細胞系の例には、サル腎細胞のＣＯＳ−７株 （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１） （Ｇｌｕｚｍａｎ （１９８１） Ｃｅｌｌ ２３： １７５）、ＣＶ−１細胞 （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、Ｌ 細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞及びＢＨＫ細胞株がある。淘汰又はスクリーニングを行うには、ホスト細胞は適切な表現型を持つものでなくてはならないことは、理解されよう。
【０１１２】
酵母細胞を用いる場合、その酵母は、培養が可能であり、かつ、外因性の受容体を、ホスト細胞の適したシグナル伝達機構に乗るように作製できれば、いかなる種のものでもよい。適した種には、クリュイベラ−ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス−ポンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、及びウスチラゴ−マイディス（Ｕｓｔｉｌａｑｏ ｍａｙｄｉｓ）があるが、サッカロミセス−セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。本発明を実施するのに利用の可能な他の酵母は、ニューロスポラ−クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、アスペルギルス−ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス−ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ピチア−パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ−トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及びハンセヌラ−ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。ここで用いる用語「酵母」には、厳密な分類学的意味の酵母、即ち単細胞生物だけでなく、酵母様の多細胞の真菌又は糸状菌が含まれる。
【０１１３】
適したホスト細胞の選択は検出シグナルの選択によっても左右されるであろう。例えば、下に解説するようなレポータ・コンストラクトは、目的のＬＴＭタンパク質に共役したシグナル伝達経路に応答した転写活性化（又は不活性化）が起きると、淘汰可能又はスクリーニング可能な形質をもたらすことができる。レポータ遺伝子は、酵母の成長停止を担う遺伝子など、ホスト細胞経路に既に存在する、未改変のままの遺伝子であってもよい。それは、「受容体応答性の」プロモータに操作により連結してあるホスト細胞遺伝子であってもよい。あるいは、そのように連結された異種の遺伝子（例えば「レポータ遺伝子コンストラクト」など）であってもよい。適した遺伝子及びプロモータを、下で解説することとする。他の実施例では、例えば細胞内カルシウムの移動又はホスホリピド代謝を定量するなど、セカンド・メッセンジャーの生成を検出ステップで直接測定することができる。更に別の実施例では、指標遺伝子を用いて、受容体が媒介するシグナル伝達を検出することもできる。
【０１１４】
Ｅ．薬物リードをバリデートするための動物モデルの利用
上記のアッセイで有効であると明らかになった化合物を、さらに、多種の動物系で、ＬＴＭを調節する上でのインビボ効果について評価することができる。
【０１１５】
実施例の一つでは、例えば脳弓構造に損傷を加えた動物など、脳弓が媒介する記憶固定の研究用動物モデルで、このような化合物をテストすることができる。我々が以前に解説したように（Ｔａｕｂｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２： ３０９）、脳弓に損傷を与えた動物は抑制的回避を学習し、最高６時間まではコントロールレベルの記憶を呈するが、２４時間後までには健忘症を示す。
【０１１６】
概略的には、本方法は、脳弓が媒介する海馬へのシグナル伝達を少なくとも部分的に破壊するよう操作された動物を利用するものである。前記の破壊は、動物の記憶固定及び学習行動に影響を与えるものである。動物には、脳弓損傷のない哺乳動物であれば学習行動に至るような学習又は記憶計画で条件付けをする。テスト作用薬を動物に投与して、それらの記憶固定に対する作用を評価する。テスト作用薬がない場合に比較して、学習行動が増加していれば、そのテスト作用薬が記憶固定を向上させることが分かる。
【０１１７】
本発明の方法においては、学習行動の保持を、例えば、学習段階の終了から少なくとも約１２乃至２４時間後、１４乃至２２時間後、１６乃至２０時間後、及び又は１８乃至１９時間後に調べて、作用薬が記憶固定を促進するかどうかを判定することができる。ある具体的な実施例では、学習行動の保持を、学習段階の終了後２４時間で調べることができる。
【０１１８】
本発明の数々の方法においては、損傷哺乳動物は、脳弓に損傷があっても、又は、関連脳構造（例えば周辺皮質、扁桃、内側中隔核、青斑核、海馬、ママラディー・ボディ（原語：ｍａｍｍａｌｌａｒｙ ｂｏｄｉｅｓ）に記憶固定を破壊するような損傷があってもよい。該哺乳動物の損傷は機械的又は化学的破壊により、生じさせることができる。例えば、脳弓の損傷は、外科的除去術、電解質、神経毒性及び他の化学的除去術で生じさせることができ、又は、テトロドオキシン又はリドカインなどの麻酔薬を注射するなどの可逆的非働化を行って、脳弓の活動を一時的に停止させてもよい。
【０１１９】
さらに実例を挙げると、フィンブリエ−脳弓（げっ歯類）及び脳弓（霊長類）の損傷は定位切除術で作ってもよい。具体的には、脳弓構造のニューロンを、離断又は吸引（吸引）切除などにより、軸索切断する。脳弓を完全に離断すると、コリン作動性及びＧＡＢＡ作動性の機能や電気的活動が破壊されて、海馬構成体で形態学的な再器質化が誘導される。一般的には、本方法で用いる脳弓離断術は、新皮質から海馬周辺領域を切り離すものとはならないであろう。これらの実施例では、このような脳弓の離断は、海馬周辺領域が海馬構成体による処理から独立に行うことのできる機能を破壊することはなく、よって、より完全な海馬系損傷後に見られる完全な記憶喪失を起こすとは、思われない。
【０１２０】
ある実施例では、当該動物はラットでもよい。簡単に説明すると、ケタミン−キシラジン混合液の腹腔内注射などで動物を麻酔し、Ｋｏｐｆ 定位器具に配置する。頭皮を前後に切開し、ブレグマから２．０ｍｍ後方及び３．０横方向に開頭する。２０番ゲージのチップなどの吸引装置を定位したフレーム（Ｋｏｐｆ装置）に取り付け、この吸引チップを動物脳内の正しい定位位置に配置して、フィンブリエ−脳弓を吸引する。吸引による損傷を片側に作るには、帯状回皮質を通じて吸引を行ったり、片側のフィンブリエ脳弓を完全に離断し、そして（選択に応じて）海馬の背側先端及びやその上の帯状回皮質を切除して、目的の海馬の部分的神経切除を行う。さらに Ｇａｇｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２６８ ： ２７ ａｎｄ Ｇａｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９ ： ２４１も参照されたい。
【０１２１】
別の例示的な実施例では、当該動物はサルであってもよい。動物をイソフルラン（１．５乃至２．０％）などで麻酔することができる。マンニトール（０．２５ｇ／ｋｇ、静注）で予備処置後、左脳弓の片側離断を、Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２９８ ： ４４３などが解説するように行うことができる。簡単に説明すると、外科用ドリルを用いて傍矢状の骨弁を作り、前頭上矢状静脈洞を露出させる。硬膜を後退させ、留置開創器を用いて半球間裂溝を露出させる。脳梁を長手方向に切開する。脳弓は、モンロー線の孔の高さに、散在性の２乃至３ｍｍ幅の白い線維束として肉眼で簡単に見える。脳弓はまずボール解剖器を用いて離断することもできる。次に、脳弓の切断端を吸引して、損傷部の完全さを確実にしてもよい。
【０１２２】
さらに別の例示的実施例では、興奮性毒素又は他の化学的手段により、脳弓のニューロンか、又は、脳弓ニューロンの神経支配を受ける海馬の細胞を抑制又は切除することにより、脳弓の損傷を作ってもよい。いくつかの好適な実施例では、コリン作動性、ＧＡＢＡ作動性及び／又はセロトニン作動性ニューロンなどの特定のニューロン種、そしていくつかの実施例では、このようなニューロン種の特定の形態学的サブタイプ、を選択的に破壊することにより、脳弓の損傷を作製する。例えば、セロトニン作動性ニューロンの選択的切除は、ｄ−メトアンフェタミン（ｄ−ＭＡ）、メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＡ）及びメチレンジオキシメトアンフェタミン（ＭＤＭＡ）、及び５，７−ジヒドロキシトリプトアミン（５，７−ＤＨＴ）などのメトアンフェタミンで脳弓構造を処置することで、達成できる。コリン作動性ニューロンによる海馬への求心性脳弓シグナルは、アトロピン遮断により切除することができる。コリン作動性ニューロンを切除するもう一つの手段は、脳弓及び海馬への脳室内注射など、１９２ＩｇＧ−サポリン（１９２ＩｇＧ−サポリン）の利用である。他の実施例では、６−ＯＨＤＡ及びイボテン酸などの作用薬を用いて、切除計画の一部として脳弓ドーパミンニューロンを選択的に破壊することもできる。脳弓損傷を生じさせるのに利用できると思われる他の作用薬の例には、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸 （ＮＭＤＡ）、キノリン酸、及びメチルアゾキシメタノールがある。
【０１２３】
損傷動物及び正常動物を用いて行うことのできる認知機能のテスト、特に学習及び記憶のテストには、様々なものがある。 学習及び／又は記憶テストには、例えば、抑制的回避、文脈的恐怖の条件付け、ビジュアル・ディレイ・ノン−マッチ・トゥー・サンプル（ｖｉｓｕａｌ ｄｅｌａｙ ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ ｔｏ ｓａｍｐｌｅ）、スペイシャル・ディレイ・ノン−マッチ・トゥー・サンプル（ｓｐａｔｉａｌ ｄｅｌａｙ ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ ｔｏ ｓａｍｐｌｅ）、視覚弁別、バーンズの環状迷路、モリスの水迷路及びラジアル・アーム・迷路テスト、がある。
【０１２４】
ある受動的回避テストの一例では、暗室からスライド式ドアで隔てることのできる明室から成る装置を利用する。訓練時、動物を明室にしばらくの間置き、ドアを開放する。少し遅れて動物は暗室へ移動するが、この潜時を記録する。暗室に入ったらすぐドアを閉め、フットショックを与える。このテストを繰り返し行い、潜時を記録することで、例えば２４時間又は４８時間など、様々な時間が経過した時点で、この体験が保持されているか調べる。このプロトコルは、数多くある抑制的回避法の変更例の一つである（レビューはＲｕｓｈ （１９８８） Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒａｌ Ｂｉｏｌ ５０ ： ２５５を参照されたい）。
【０１２５】
迷路テスト実施例の一つは、水迷路ワーキング・メモリーテストである。概略的には、この方法は、環状の水槽から成る装置を利用する。水槽内の水は粉ミルクを入れて濁らせておく。透明なプレキシガラス製のプラットホームを、水槽の底面に取り付けた可動のスタンドで支持して、水面から少し下に沈めておく。正常では、泳ぎ回るラットは、プラットホームの位置を認知することこそできないが、記憶に何らかの障害がない限り、前の経験及び訓練から想起することができる。プラットホームの位置が分かるまでの時間を測定し、これを潜時と呼ぶ。この実験中、天井の明かり等々、方向をつかむ手がかりはすべて、変えないものとする。一般に、記憶に何らかの障害のあるラットでは、長い潜時が認められる。
【０１２６】
別の記憶テストには、白色ノイズ及び定常音を与えた後に、被験体のまばたきを刺激する空気を柔らかくひと吹きするという、まばたき条件付けテストがある。
【０１２７】
利用の可能なさらに別の記憶テストは、「手がかりあり」及び「文脈的」な恐怖の条件付けなど、恐怖条件付けである。ある実施例では、フリーズ（動作停止）観察者が一連の刺激（音、ショック）を与え、次に、ショックが誘発した動物のフリーズからの回復を測定して、一連の潜時を記録する。
【０１２８】
損傷動物を調べる別の記憶テストは、テスト容器の床の四隅に並んだ（四つの）開放穴が中にある回転するホールボード装置を利用するホールボードテストである。穴の中に頭を突っ込み、その都度、報酬を入れた「餌有り」の穴からは食べ物の報酬を得られるよう、マウスを訓練する。露出したそれぞれの穴には、食べ物の報酬（例えばフルートループ）があるが、この穴はスクリーンで隔てられて届かないようになっている。スクリーンは、報酬の匂いが穴から発散させるが、強化子には届かないようになっている。ある一個の穴を餌有りにする場合、一個のフルート・ループをスクリーンの上に置いて届くようにする。この装置全体は回転テーブルの上に載っており、近位の（例えば嗅覚）手がかりに頼れないよう、容易に回転する。開始チューブは装置の中心に配置されている。被験体はこのチューブから放たれると、餌有りの（「正しい」）穴を探すことができる。
【０１２９】
Ｆ．同定された作用薬の製剤
本アッセイでいくつかのテスト化合物を、記憶固定の増強物質又は阻害物質などと同定したら、本アッセイ担当者は、所定の化合物のインビトロ及びインビボの両方での効験及び特異性のテストに続けてもよい。その後インビボでのテストに向けるしろ、又は認可薬として動物へ投与するにしろ、本アッセイで同定された作用薬は、動物、好ましくはヒトへのインビボ投与にとって薬学的に許容可能な医薬品添加物中に調合することができる。
【０１３０】
従って、本アッセイで選択された化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を、例えば水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、等々）又はこれらの混合物などの生物学的に許容可能な媒質と一緒に投与できるよう、調合してもよい。選択された媒質中の有効成分の最適な濃度は、薬品化学者に公知の手法に基づき、経験的に決定することができる。ここで用いる「生物学的に許容可能な媒質」には、当該製剤の所望の投与経路にとって適切であろうあらゆる溶媒、分散媒、等々が含まれる。薬学的に有効な物質へのこのような媒質の利用は当業で公知である。従来の媒質又は物質が当該化合物の活性にとって不適合である場合を除き、本発明の製剤へのその利用は考察されたところである。他のタンパク質を含め、適した賦形剤及びそれらの処方は、例えば、書籍「レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡ １９８５）」に解説されている。これらの賦形剤には、注射可能な「デポジット（原語：ｄｅｐｏｓｉｔ）製剤」も含まれる。上記に基づくと、このような製剤は、排他的ではないが、一種以上の薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤と一緒に、当該化合物の溶液又は凍結乾燥粉末を含み、適したｐＨの、生理流体と等浸透圧性の緩衝媒質に含有される。好適な実施例では、本化合物は、局所及び／又は全身投与様の無菌の製剤中に配置することができる。凍結乾燥製剤の場合、排他的ではないがマンニトール又はグリシンなどの支持性医薬品添加物を用いてもよく、所望容の適切な緩衝液を加えて、好ましいｐＨの、充分に等張な緩衝液とすることとなる。同様な溶液は、所望の容の等張液に溶かした化合物製剤にも用いてよく、これには、排他的ではないが、所望のｐＨ（例えば中性のｐＨ）の等張性製剤が必ず得られるよう、適した濃度のリン酸又はクエン酸を加えた緩衝生理食塩水の利用も含まれる。
【０１３１】
いくつかの実施例では、本発明の製剤は、治療用ＬＴＭ遺伝子による遺伝子治療のための遺伝子送達系である。このような遺伝子治療系は、それぞれが当業で公知のいかなる数多くある方法のいずれを用いて患者に導入してもよい。例えば、遺伝子送達系の製剤を静注などで全身に導入すると、主に、遺伝子送達用伝播体のもたらすトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現を調節する転写調節配列が原因の細胞種もしくは組織種特異的な発現、又はこれらの組合せにより、当該タンパク質の標的細胞への特異的形質導入が起きる。他の実施例では、動物への導入を大変局部的なものにして、組換え遺伝子の当初の送達をより制限する。例えば、遺伝子送達伝播体は、カテーテル（米国特許第５， ３２８， ４７０号を参照されたい）又は定位注射（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３０５４−３０５７）により、導入することができる。
【０１３２】
遺伝子治療コンストラクトの製剤は、遺伝子送達系を許容可能な希釈剤に溶かしたものから基本的に成っていてもよく、又は、遺伝子送達伝播体を包埋した徐放マトリックスから成っていてもよい。あるいは、完全な遺伝子送達系を、レトロウィルスベクタなどの組換え細胞からインタクトで生成できれば、遺伝子送達系を生成する一個以上の細胞を製剤に含めてもよい。
【０１３３】
Ｆ．処置の方法
多様な実施例では、本発明は、一つ以上の当該ＬＴＭ遺伝子（例えば遺伝子治療による場合）又はそれに対するアンチセンス・コンストラクト、ＬＴＭたんぱく（例えばタンパク質治療による場合）又はそのペプチドミメティック、又は、当該の薬物スクリーニングアッセイで同定された化合物、を利用する処置形態又は予防形態を考察する。これらの作用薬は、生物の学習及び／又は記憶の異常の発生を変化（増加又は減少）させることで、この生物の学習能力及び／又は記憶能力を変化させるのに、有用であろう。他の実施例では、本発明の製剤を、単に正常の記憶機能を高めるのに、利用することもできる。
【０１３４】
本発明の方法に基づいて治療できる記憶障害は、機能的機序（不安、うつ）、生理学的加齢（年齢に関連する記憶障害）、薬物、又は解剖学的損傷（痴呆）など、多数の原因を有するものであってよい。このような製剤が有用だと思われる適応症には、学習障害、例えば毒物暴露、脳損傷、加齢などを原因とする記憶障害、分裂病、てんかん、小児性精神遅滞、及び、アルツハイマー病を含む老人性痴呆、がある。
【０１３５】
いくつかの実施例では、本発明は、健忘症の治療を考察するものである。健忘症は、叙述的記憶の特異的障害であると解説されている。記憶が忠実に符号化されるには、情報の登録、リハーサル、及び保持が必要である。最初の二つの要素は、海馬及び内側側頭葉構造が関与していると思われる。保持又は保管には、ヘテロモーダル（原語：ｈｅｔｅｒｏｍｏａｄａｌ）関連領域が関与しているようである。健忘症は、蓄積された記憶の喪失として体験されたり、又は、新しい記憶を形成できないこととして、体験される。蓄積された記憶の喪失は逆行性健忘症として知られる。新しい記憶を形成できないことは、前向き性健忘症として知られる。
【０１３６】
記憶に問題があるという愁訴はよくある。集中力の低さ、覚醒の低さ及び注意力の低さはすべて、ある程度、記憶のプロセスを破壊するのであろう。従って、記憶に問題があるという主観的な愁訴を真の健忘症から区別しなければならない。これは通常は、より肉眼的な評価で臨床的に、かつ特定の神経心理学的検査で行われる。視覚及び言語の記憶障害は、このような検査で区別することができる。健忘症の場合、定義上、論理などの他の精神能力は損なわれていない。上述した、記憶の神経生物学的理論によれば、健忘症には、比較的に少ない数の病理生物学的バリエーションしかないと予想される。臨床的には、健忘症という問題は、しばしば、他の点では健康な人間の突然の病気の結果、発症する。
【０１３７】
本方法で治療できると思われる健忘症の形の例には、短期間の健忘症、アルコール性ブラックアウト、ウェルニッケ−コルサコフ（初期）、部分的複雑性発作、一過性全健忘症、トリアゾラム（ハルシオン）などの投薬に関連するもの、脳底動脈片頭痛、がある。当該の方法は、脳震盪後や、ヘルペス脳炎の結果などの、より長期の健忘症を治療するのにも、利用できよう。
【０１３８】
（ｉ）有効な用量
本発明の治療法で用いる化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を調べるためなどの細胞培養又は実験動物での標準的な薬学的手法により、調べることができる。毒性作用と治療作用との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。毒性の副作用を呈する化合物を用いてもよいが、非罹患細胞へ損傷を与える可能性を低くし、ひいては副作用を軽減するためには、罹患組織の部位へこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするよう、注意しなければならない。
【０１３９】
細胞培養アッセイ及び動物試験で得たデータを、ヒトで利用する投薬量範囲を作製するのに、利用できる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんど又は全くないようなＥＤ５０を含む血中濃度範囲内にあるのが好ましい。用いる投薬型及び用いる投与経路に応じて、この範囲内で投薬量を変更してもよい。本発明の方法で用いる化合物はいずれのものも、まず細胞培養アッセイから治療上有効な用量を推測しておくことができる。細胞培養で調べたときにＩＣ５０（即ち、症状の半分から最大を抑えるようなテスト化合物濃度）を含むような血中血漿濃度範囲が得られるよう、動物モデルで用量を作製してもよい。このような情報を用いると、ヒトに利用できる用量をより精確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定してもよい。
【０１４０】
Ｇ．診断用アッセイ及び予後用アッセイ
さらに本発明は、記憶固定の悪化を特徴とする障害のリスクが被験体にあるかどうかを調べる方法も提供する。好適な実施例では、本方法は、（ｉ）ＬＴＭたんぱくをコードする遺伝子の一体性に影響を与える変化、又は（ｉｉ）ＬＴＭ遺伝子の誤発現、の少なくとも一方を特徴とする遺伝子の損傷の有無を被験体から採った細胞試料中で検出することを含むことが特徴であってよい。実例を挙げると、このような遺伝子の損傷は、（ｉ）ＬＴＭ遺伝子からの一つ異常のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）ＬＴＭ遺伝子に対する一つ以上のヌクレオチドの追加、（ｉｉｉ）ＬＴＭ遺伝子の一つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＬＴＭ遺伝子の全体的な染色体再編成、（ｖ）ＬＴＭ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物のレベルの全体的変化、（ｖｉ）ゲノムＤＮＡなどのメチル化パターンなど、ＬＴＭ遺伝子の異常な修飾、（ｖｉｉ）ＬＴＭ遺伝子の非野生型スプライシングパターンのメッセンジャーＲＮＡ転写産物の存在、（ｖｉｉｉ）非野生型レベルのＬＴＭたんぱく、（ｉｘ）ＬＴＭ遺伝子の対立遺伝子喪失、及び（ｘ）ＬＴＭたんぱくの適当でない翻訳後修飾、のうちの少なくとも一つの存在を確認することにより、検出できる。以下に解説するように、本発明は、ＬＴＭ遺伝子の損傷を検出する数多くのアッセイ技術を提供し、重要なことに、ある一つの障害の基礎となっている異なる分子的原因同士を判別する可能性を提供するものである。
【０１４１】
ある例示的な実施例では、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５、７、９又は１１のいずれかで表されるなどのＬＴＭ遺伝子又はその天然型変異体のセンス又はアンチセンス配列か、又は、前記ＬＴＭ遺伝子又はその天然発生型変異体に天然で伴う５’側又は３’側フランキング配列又はイントロン配列のセンス又はアンチセンス配列にハイブリダイズすることができる一領域のヌクレオチド配列を含む（精製済みの）オリゴヌクレオチド・プローブを含んで成る核酸組成物を提供する。ある細胞の核酸をハイブリダイゼーションに利用できるよう取り出し、プローブを前記試料の核酸に暴露し、このプローブの試料核酸へのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術を利用すれば、欠失、置換、等々を含めたゲノムレベル又はｍＲＮＡレベルの損傷を検出したり、ｍＲＮＡ転写産物レベルを調べることができる。
【０１４２】
好適な実施例では、本方法は、概略的には、あるＬＴＭ遺伝子の一体性に影響を与える変化を特徴とした遺伝子損傷の有無を被験体から採った細胞試料中で検出することを含むことを特徴としてよい。実例を挙げると、（ｉ）ＬＴＭ遺伝子からの一つ以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）ＬＴＭ遺伝子への一つ以上のヌクレオチドの追加、（ｉｉｉ）ＬＴＭ遺伝子の一つ以上のヌクレオチドの置換、及び（ｉｖ）ＬＴＭ遺伝子の非野生型スプライシング・パターンのメッセンジャーＲＮＡ転写産物の存在、のうちの少なくとも一つの存在を確認することにより、このような遺伝子損傷を検出することができる。以下に解説するように、本発明は、ＬＴＭ遺伝子の損傷を検出する数多くのアッセイ技術を提供するものである。
【０１４３】
いくつかの実施例では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４， ６８３， １９５号及び第４， ６８３， ２０２号などを参照されたい）や、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０７７−１０８０； 及び Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ９１： ３６０−３６４を参照されたい）で前記プローブ／ポリマーを利用することを含むが、後者は特にＬＴＭ遺伝子の点変異を検出するのに有用であろう（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２３： ６７５−６８２を参照されたい）。単に例示的な実施例では、本方法は、（ｉ）患者から細胞試料を採集するステップと、（ｉｉ）核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡ又は両者）を前記試料の細胞から単離するステップと、（ｉｉｉ）（存在する場合の）前記ＬＴＭ遺伝子のハイブリダイゼーション及び増幅が起きるような条件下で、ＬＴＭ遺伝子に特異的にハイブリダイズする一つ以上のプライマーに前記核酸試料を接触させるステップと、（ｉｖ）増幅産物の有無を検出するか、又は、増幅産物の大きさを検出してその長さをコントロール試料に比較するステップと、を含む。ここに解説した変異を検出するのに用いられる技術のいずれかと関連した予備増幅ステップとして、ＰＣＲ及び／又はＬＣＲを用いるのが好ましいと予測できる。
【０１４４】
本発明の別の実施例は、ＬＴＭ遺伝子又はその天然型変異体のセンス又はアンチセンス配列か、又は、前記ＬＴＭ遺伝子又はその天然発生型変異体に天然で伴う５’側又は３’側フランキング配列又はイントロン配列のセンス又はアンチセンス配列にハイブリダイズすることができる一領域のヌクレオチド配列を含む（精製済みの）オリゴヌクレオチド・プローブを含んで成る核酸組成物を提供する。ある細胞の核酸をハイブリダイゼーションに利用できるよう取り出し、プローブを前記試料の核酸に暴露し、このプローブの試料核酸へのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術を利用すれば、欠失、置換、等々を含めたゲノムレベル又はｍＲＮＡレベルの損傷を検出したり、ｍＲＮＡ転写産物レベルを調べることができる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブは、記憶固定の悪化などに顕れるであろう対立遺伝子変異の予測的及び治療的評価の両方に利用することができる。
【０１４５】
ここに解説した方法を、ここに解説した少なくとも一つのプローブ核酸又は抗体試薬を含んで成る予め梱包された診断用キットを利用して、行ってもよく、このようなキットは、記憶又はＬＴＭ遺伝子に関与する疾患又は病気の症状又は家族歴のある患者を診断する臨床の場などで用いると便利であろう。
【０１４６】
上に解説した、野生型又は変異ＬＴＭタンパク質に対する抗体を、疾患の診断及び予後に利用してもよい。このような診断方法は、ＬＴＭたんぱくの発現レベルの異常、又は、ＬＴＭたんぱくの構造及び／又は組織、細胞、又は細胞レベル下位置の異常を検出するのにも利用できよう。構造上の違いには、例えば、正常ＬＴＭたんぱくに対する変異ＬＴＭたんぱくの大きさ、電気的陰性度、又は抗原性を含めてもよい。分析しようとする組織又は細胞種由来のタンパク質は、限定はしないがウェスタン・ブロット分析を含め、当業者に公知の技術を用いて容易に検出又は単離することができよう。ウェスタン・ブロット分析を行う方法の詳細な説明については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９の第１８章を参照されたい。ここで用いたタンパク質検出法及び単離法は、例えば（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， １９８８， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．）（この文献を言及をもってここに編入することとする）のハーロー・アンド・レーンなどに解説されたものであってもよい。
【０１４７】
これは、例えば蛍光標識した抗体（下記参照）を、光学顕微鏡検出法、フローサイトメトリ検出法、又は蛍光分析検出法に組み合わせて用いた免疫蛍光技術により、行うことができる。さらに、ＬＴＭたんぱくをインシトゥー検出できるよう、本発明で有用な抗体（又はそのフラグメント）を免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡法などで組織学的に用いてもよい。インシトゥー検出は、患者から組織標本を採取し、それに本発明の標識付き抗体を付着させることにより、行ってもよい。抗体（又はフラグメント）を付着させるには、好ましくは、標識付き抗体（又はフラグメント）を生物試料に重ねるとよい。このような手法を利用すると、ＬＴＭたんぱくの存在だけでなく、検査組織中のその分布も調べることができる。本発明を用いると、このようなインシトゥー検出を行えるよう、様々な組織学的方法（例えば染色法）のいずれを改良してもよいことは、当業者であれば容易に納得されるであろう。
【０１４８】
抗原又は抗体を結合させることのできる支持体として、固相支持体又は担体がしばしば用いられる。公知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改良セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス（原語：ｇａｂｂｒｏｓ）、及び磁鉄鉱、がある。担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度可溶性であっても、又は不溶性であってもよい。支持体材料は、結合した分子が抗原又は抗体に結合できる限り、実質的にいかなる可能な構造上の形状を有していてもよい。従って、支持体の形状はビーズのような球形であっても、又は、試験管内面又は棒の外表面のような管状であってもよい。あるいは、この表面はシート、試験紙、等々、平らであってもよい。好適な支持体には、ポリスチレン・ビーズがある。当業者であれば、抗体又は抗原を結合させる他の適した担体を多く知るところであり、又は通常の実験を用いて同担体を確認できることであろう。
【０１４９】
抗ＬＴＭたんぱく特異抗体を標識する手段の一つは、酵素への結合を介する方法、及び酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）での利用である（Ｖｏｌｌｅｒ，”Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）”， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２： １−７，１９７８， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．； Ｖｏｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．　３１： ５０７−５２０ （１９７８）； Ｂｕｔｌｅｒ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３： ４８２−５２３ （１９８１）； Ｍａｇｇｉｏ， （ｅｄ．） Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．， １９８０； Ｉｓｈｉｋａｗａ， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．） Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｋｇａｌｃｕ Ｓｈｏｉｎ， Ｔｏｋｙｏ， １９８１）。抗体に結合した酵素は、分光光度計、蛍光光度計、又は視覚的手段などで検出できる化学部分を生じるような態様で、適した基質、好ましくは色素産生性基質、と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに利用できる酵素には、限定はしないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ、がある。検出は、酵素に対する色素産生性基質を用いた比色法で行うことができる。また、基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準に比較する視覚的比較でも、検出を行ってもよい。
【０１５０】
さらに、多種の他のイムノアッセイを用いても検出できよう。例えば、抗体又は抗体フラグメントを放射性標識すると、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を利用すれば、フィンガープリント遺伝子野生型又は変異型ペプチドを検出できる（例えば言及をもってここに編入することとするＷｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｍａｒｃｈ， １９８６を参照されたい）。放射性同位体はガンマカウンタ又はシンチレーションカウンタや、オートラジオグラフィを利用するなどの手段で検出できる。
【０１５１】
さらに、蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。この蛍光標識した抗体を適当な波長の光に暴露すると、蛍光により、その存在を検出することができる。最も普通に用いられている蛍光標識付け化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド及びフルオレスカミンである。
【０１５２】
また抗体を、^１５２Ｅｕ、又は他のランタニド族などの蛍光放出金属を用いて、検出可能に標識付けすることができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて、抗体に付着させることができる。
【０１５３】
また抗体を化学発光化合物に結合させても、検出可能に標識付けすることができる。こうして、化学発光標識した抗体の存在は、化学反応の過程で生ずる化学発光の存在を検出して、判定される。特に有用な化学発光標識付け化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（原語：ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジン塩及びシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物を用いても、本発明の抗体を標識付けすることができよう。生物発光は生物系に見られる化学発光の一種であり、この場合、触媒たんぱくにより、化学発光反応の効果が上昇する。生物発光たんぱくの存在は、発光の存在を検出することで、判定される。標識付けの目的で重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０１５４】
さらに、ＬＴＭ遺伝子又は遺伝子産物の変化を検出する上記の方法はいずれも、処置又は治療の経過を観察するためにも利用できることは、理解されよう。
【０１５５】
Ｈ．トランスジェニック動物
これらの系は、多種の用途で利用できよう。例えば、細胞及び動物をベースとしたモデル系を用いて、当該のＬＴＭ遺伝子及びたんぱくが記憶で果たす役割をさらに特徴づけてもよい。加えて、このようなアッセイは、疾患症状を軽減させることのできる化合物を同定するようデザインされたスクリーニング戦略の一部として、利用してもよい。従って、動物及び細胞をベースとしたモデルを用いて、疾患を治療するのに有効であろう薬物、製剤、治療、及び介入法を判定してもよい。
【０１５６】
本発明の一態様は、本発明の導入遺伝子を含有する（動物の）細胞から成り、かつ、（選択的ではあるが）好ましくは外因性のＬＴＭたんぱくを動物の一個以上の細胞で発現するようなトランスジェニック動物の利用に関するものである。ＬＴＭ導入遺伝子は、野生型の当該タンパク質をコードするものでも、又は、アゴニスト及びアンタゴニストの両方を含めその相同体やアンチセンス・コンストラクトをコードするものであってもよい。好適な実施例では、導入遺伝子の発現は、所望のパターンで発現を調節するｃｉｓ作用性配列などを利用する特定の細胞下位集団、組織又は発生段階に制限されている。本発明において、ＬＴＭたんぱくのこのようなモザイク型発現は多くの形の系統にとって重要であると思われ、他の点では正常な胚の小さな組織部分での発生を肉眼的に変えかねないＬＴＭ発現不足の作用を評価する手段にもなるであろう。この目的のために、組織特異的調節配列及び条件付き調節配列を用いれば、導入遺伝子の発現を特定の空間パターンで調節することができる。さらに、発現の時間的パターンは、条件付き組換え系又は原核生物の転写調節配列により、提供することができる。
【０１５７】
例示的な一実施例では、導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞系に導入して、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」を作製する。様々な発生段階の胚性標的細胞を、導入遺伝子を導入するのに利用できる。胚性標的細胞の発生段階に応じて、異なる方法を用いる。本発明を実施するのに用いる動物の特定の系は、全身の良好な健康、良好な胚収率、胚中の前核の良好な可視性、及び良好な生殖能上適合性に基づいて、選択される。加えて、ハプロタイプが有意な因子である。例えば、トランスジェニックマウスを作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６ 又はＦＶＢ系などの株がしばしば用いられている （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍｅ．）。好適な株は、Ｃ５７ＢＬ／６ 又はＤＢＡ／１などのＨ−２^ｂ、Ｈ−２^ｄ又はＨ−２^ｑ ハプロタイプである。本発明を実施するのに用いる株はそれ自体がトランスジェニックであっても、及び／又はノックアウト（即ち一種以上の遺伝子を部分的又は完全に抑制してある動物から得られるもの）であってもよい。
【０１５８】
一実施例では、相同組換えを用いて動物のゲノムを改変する方法である遺伝子ターゲティングを利用して、培養胚性幹細胞に変化を加えることができる。目的のＬＴＭ遺伝子をＥＳ細胞にターゲティングすると、これらの変化を動物の生殖細胞系に加えてキメラを作製することができる。遺伝子ターゲティング法は、標的ＬＴＭ遺伝子座に相同な部分を含有し、さらに、ＬＴＭゲノム配列に対して目的配列改変（例えば挿入、欠失、点変異など）も含有するＤＮＡターゲティングコンストラクトを組織培養細胞に導入することで、行われる。次に、処置細胞を精確なターゲティングが行われたかどうかスクリーニングにかけて、ターゲティングが適正に行われたものを同定及び単離する。
【０１５９】
胚性幹細胞における遺伝子ターゲティングは、実際のところ、一つ以上のＬＴＭゲノム配列と相同組換えを起こすようデザインされたターゲティング導入遺伝子コンストラクトを利用してＬＴＭ遺伝子機能を破壊する手段として、本発明が考察するスキームである。このターゲティング・コンストラクトは、ＬＴＭ遺伝子の一配列と組換えを起こしたときに、正の選択マーカーが標的遺伝子のコーディング配列内に挿入（又は置換）されるよう、構成することができる。挿入された配列はそのＬＴＭ遺伝子を機能的に破壊するが、正の選択形質ももたらす。ＬＴＭターゲティング・コンストラクトの例を、以下にさらに詳述する。
【０１６０】
以下の実施例で本発明をさらに解説するが、以下の説明を何ら限定的なものとして捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された（書籍文献、発行済み特許、公開済み特許出願を含む）参考文献すべての内容を、言及をもってここに編入することを明示しておく。
【０１６１】
実施例
実施例１
ノーザン・ブロット分析により、いくつかの最初期遺伝子がＩＡ訓練後に誘導され、この訓練に関連した遺伝子調節は脳弓の損傷に感受性であることが分かる
無脊椎動物アプリシア−カルフォルニカ（Ａｐｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）で、記憶形成の基礎を成す遺伝子発現変化は、調節的な最初期遺伝子（ＩＥＧ）の誘導から始まることが実証された。具体的には、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合たんぱく（Ｃ／ＥＢＰ）転写因子ファミリーの一員であるＡｐＣ／ＥＢＰが誘導されることが、アプリシアで記憶形成の基礎を成す長期のシナプス可塑性にとって必須である（Ａｌｂｅｒｉｎｉ， １９９４）。これらのデータに基づき、記憶を誘導する刺激により、ある遺伝子カスケードが活性化し、そこでＣＲＥＢが調節的ＩＥＧの発現を調節し、ひいては長期記憶に必要なより下流の標的遺伝子の発現を調節する、ということを我々は提案した （Ａｌｂｅｒｉｎｉ， １９９４）。このモデルは、なぜ遺伝子発現が初期の短時間に限って必要なのかを説明している。この必須遺伝子の発現は短時間であるように思われる。なぜなら、これは、調節的ＩＥＧの発現に必要な重要な時間に相当し、この時間が、長期記憶に結び付く事象の分子カスケードの速度制限ステップであろうと思われるからである。
【０１６２】
哺乳動物においては、ｃ−ｆｏｓ及びｚｉｆ２６８などのＩＥＧのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの変化が、記憶及びシナプス可塑性のモデルで広汎に調査されてきた。特に精確な調節又は定量的な測定がないために（当該研究は主に免疫組織化学的分析に基づいていた）、まだ議論を残すところであるが （Ｃａｍｐｅａｕ， １９９１）、ｃ−ｆｏｓ及びｚｉｆ２６８ は両方とも、異なる種類の学習後にいくつかの脳領域で上方調節されることが、報告されている（レビューは Ｄｒａｇｕｎｏｗ， １９９６）。従って、我々の最初のパイロット実験では、我々は、ＰＣＲＥＢの誘導で示唆される時間枠、即ち訓練後３、６、９、及び２０時間後に焦点を絞って、ＩＡ訓練後の海馬ｚｉｆ２６８及びｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡレベルの変化のノーザン・ブロット分析を行った。各時点毎に３匹の動物を調べ、シクロフィリン遺伝子をコントロール・プローブとして用いてハイブリダイゼーションを正規化した。同じメンブランを全てのプローブに順にハイブリダイズさせた。図１に示すように、我々は、訓練後９時間及び２０時間の時点ですべての訓練済み動物でｚｉｆ２６８が誘導されることを見いだした。反対に、ｃ−ｆｏｓはこの時間経過に渡って何ら明白な変化を示さなかった。従って、ＩＡ訓練に対するＩＥＧの応答は、活性化した遺伝子や、訓練後の時間に対して選択的であることになる。
【０１６３】
図１。ＩＡ訓練後のｚｉｆ２６８及びｃ−ｆｏｓの時系列ノーザン・ブロット分析。ｚｉｆ２６８ ｍＲＮＡの増加が、すべての動物で訓練後９及び２０時間の時点で見られるが、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの増加は見られない。これらの結果は、ｚｉｆ２６８がＩＡにより海馬で誘導されることを示した。さらにこれらから、ＩＡ後の海馬でＩＥＧが誘導されるのを検出可能となる時期、即ち９時間後及び２０時間後、が明らかになった。これらのデータに基づき、我々は、下に解説するように、訓練から９時間後に動物から得られるＲＮＡを用いて我々の第一アレイハイブリダイゼーション分析を行うことに決めた。
【０１６４】
ｚｉｆ２６８を用いたこれらの結果を励みとし、我々は次に、ＣＣＡＡＴエンハンサ結合たんぱくファミリーの一員である Ｃ／ＥＢＰ β□を含む別の転写因子を狙ったプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズした。我々は、ＩＡ後の、ｚｉｆ２６８と同じ時間枠の間、Ｃ／ＥＢＰ βが誘導されることを見いだした（図２）。この発見は非常に印象的である。なぜならこれは、ＣＲＥＢと同様、Ｃ／ＥＢＰファミリーの仲間も、記憶形成の間に活性化される遺伝子カスケードの進化上保存された構成要素である可能性を示唆しているからである。
【０１６５】
Ｃ／ＥＢＰ□β発現の上昇が、新しい環境の探索よりはＩＡ記憶に関係するかどうかを定義するために、暗室内でフットショックを受けずに抑制的回避装置を歩き回った対コントロール動物と、ＩＡ訓練動物とを各時点で比較した。さらに、海馬Ｃ／ＥＢＰ βｍＲＮＡのレベルは、文脈的な学習のないショックだけを受けて、９時間後及び２０時間後（図示せず）に死なせた動物では変化しなかった。これは驚くべきことではない。なぜなら、学習 （Ｆａｎｓｅｌｏｗ， １９９０）とＰＣＲＥＢの上昇 （Ｔａｕｂｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９９）の両者とも、ショックだけを受けた動物では起きないからである。従って、Ｃ／ＥＢＰ□βはＩＡ訓練により選択的に誘導されるようである。
【０１６６】
次に、記憶に関連すると我々が見いだしたＣ／ＥＢＰ β応答が脳弓損傷に感受性があるかという問題に我々は対処し始めた。図２に示すように、損傷のある動物は、ＩＡ訓練後もＣ／ＥＢＰβの発原に何ら変化を見せなかった。
【０１６７】
図２．未施術ラット及び脳弓損傷ラットの海馬におけるＩＡ訓練後のＣ／ＥＢＰ及びシクロフィリン（コントロール）ｍＲＮＡの時系列ノーザン・ブロット分析。重要なことに、脳弓損傷のある動物における海馬Ｃ／ＥＢＰ□βのレベルは、未施術の動物のそれと違わない（図２のショック無しの０と、ショック無しの脳弓損傷有りを比較されたい）。この発見は、脳弓が、ＩＡ訓練に応答したこの遺伝子応答に特異的に必要であることを明白に実証するものであり、我々が観察した変化は、記憶固定に選択的に関係しているという仮説を強固に裏付けるものである。
【０１６８】
実施例２
アレイ・ハイブリダイゼーションは、ＩＡ訓練に対する新たな遺伝子応答を明らかにする。
我々は、我々のモデル系が、長期記憶で示差的に発現する遺伝子の探索に特に役立つものであると信じる。我々は、学習能力のある動物と、記憶に障害のある動物とで、どこ、そしていつ示差的分析を行うかを決定した。さらに、学習により、脳弓に感受性のある海馬遺伝子応答が誘導されることは我々の知るところである。
【０１６９】
示差的に発現する遺伝子を同定できることは、特定の機能に連携した遺伝子パターンを理解する最も強力な方法の一つである。示差的に発現する遺伝子を単離する無数の技術が近年可能となり、いくつかが、長期記憶に関与する遺伝子を単離するのに成功を収めている （Ｃａｖａｌｌａｒｏ， １９９７）。これらの技術のうちで最も進歩した世代はＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションである。アレイは、上にＤＮＡフラグメントを系統的に固定してある支持体（ナイロン又はガラス）から成る。この技術がどのように用いられるかを示した概略図を図３に示す。
【０１７０】
図３．ｃＤＮＡ発現アレイを用いた広範囲の発現プロファイリング。二つの異なるＲＮＡ集団から調製されたｃＤＮＡプローブを用いたサイド・バイ・サイド・ハイブリダイゼーションにより、アレイ上のすべてのｃＤＮＡの発現レベルを同時に比較することができる（クロンテック社のユーザ・マニュアルより）。アレイには、原則的に、クローンされたＤＮＡ配列すべてを含めることができる。我々は、我々の分析を、当時最も完全な市販のアレイであった比較的に小型のアレイであるクロンテック社（カリフォルニア州パロアルト）製ＡｔｌａｓＴＭ ラットｃＤＮＡ 発現アレイを用いて開始した。このアレイは、ラット脳から単離された、シグナリング分子、受容体、シグナル伝達たんぱく、細胞外たんぱく、構造分子、シナプス伝達に関与する分子、及び、アルツハイマー病を含む神経病理に関与する分子など、脳機能を調節する経路に関与する多種の分子をコードする５８８種の遺伝子を含有していた。これらＤＮＡは正に帯電したナイロンメンブレーン上に固定されていた。
【０１７１】
ＩＡ訓練後９時間の時点で、コントロールに比較したｍＲＮＡ発現の変化を検出できるため、我々は、アレイ・ハイブリダイゼーションを用いて記憶における示差的遺伝子発現の検索を開始し、ショックを受けずに（０ショック無し）装置内を歩き回った直後に死なせた動物を、ＩＡ訓練を行って９時間後に死なせた動物と比較した。４匹のコントロール（０ショックなし）及び４匹の訓練動物から採った海馬を解剖し、それらのＲＮＡを分離及びプールした。コントロール及び訓練動物のプールしたＲＮＡを用いて二つの同一のメンブレンにハイブリダイズさせた。アレイ・ハイブリダイゼーションは大変きれいなままであり、５８８種のうち２、３の点がメンブレン上に顕れて、ハイブリダイゼーション・シグナルに変化があったことが分かった。重要なのは、輝度の変化を示したこれらの点の周りに、大変目立つ別のハイブリダイゼーションシグナルがあったことである。すべての動物で、ＩＡ訓練後９時間の時点で、ほぼ１５種の転写産物の濃度に変化があることを我々は発見し、そのうちの８種を解析して、ノーザン分析で確認した。図４は、これらアレイを用いた我々の結果の二つの例を示す。（結果の守秘のために、いくつかの遺伝子の名称を明らかにしていない。これらは番号で示した。しかしこれが本出願の審査に当たって障害となるのであれば、遺伝子の正体を開示する意向である。）図４に示すように、ｚｉｆ２６８に相当する点の上昇を我々は見いだした。このことは、このアレイ解析に、我々がノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションで観察した変化を検出するのに充分な感受性があることを裏付けた。ここで遺伝子２番と命名する別の点は明らかに減少していた。
【０１７２】
図４．ＩＡ訓練後のｍＲＮＡの示差的発現を反映した遺伝子アレイ・ハイブリダイゼーションにおける変化の例。コントロール・ラットの海馬を、訓練後９時間の時点で死なせたラットの海馬に比較する。これらのアレイ上では、各配列は複式で点が付くことに留意されたい。このアレイ・ハイブリダイゼーションは、強力なスクリーニング法である。しかしながら、この技術で同定された転写産物の発現がＩＡ訓練後に実際に変化することを立証するために、同定された配列の各々にノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション解析を行う必要があった。前記アレイ・ハイブリダイゼーションではなく、このノーザン・ブロットが、ある遺伝子の発現が訓練後に変化するかどうかを最終的に定義するものである。従って、必要なコントロールはすべて、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションで行い、アレイ・ハイブリダイゼーションでは行わなかった。次に、Ｃ／ＥＢＰβを解析するのに用いた、図４で上述した時系列解析を載せた同じメンブレンを再度ハイブリダイズさせて、遺伝子２番の発現と、アレイ・ハイブリダイゼーションで減少して見えた、我々が遺伝子３番と呼んだ別の遺伝子の発現とを、解析した。図５に示すように、ノーザン・ブロットテストの結果、両転写産物２番及び３番のレベルは、訓練後９時間及び２０時間で強く減少したことが確認できた。ＩＡ後３及び６時間の時点では変化は観察されず、対コントロール動物では、いずれの時点でも有意な変化は検出されなかった。
【０１７３】
これらの結果は、遺伝子２番及び３番の調節がＩＡ訓練と選択的に関連していることを示す。Ｃ／ＥＢＰβと同様、学習で起きる遺伝子２番の調節は、脳弓損傷動物では失われていたが、この遺伝子の基礎発現は損傷の影響を受けていなかった。これらのデータから、ＩＡ記憶形成には、脳弓を通過する入力により誘導される遺伝子発現の調節が伴っていることが確認できた。一方、遺伝子３番は、脳弓損傷のあるすべての動物でも、ＩＡ記憶で下方調節されるようであった。これらのデータから、我々は、脳弓の損傷により、海馬内のいくつかの遺伝子調節の変化が生まれると結論する。この結果は興味深いものであり、脳弓が、構成的又はＩＡ誘導性遺伝子発現のいずれかを変調することにより、記憶形成に寄与している可能性を示唆するものである。
【０１７４】
まとめると、これらのデータは、我々がＩＡ訓練後の遺伝子発現変化を検出及び解析できることを実証するものである。我々は、これらの変化のいくつかが、記憶固定が損なわれている脳弓損傷動物の海馬では起きないのだということを、確認した。これらの予備データは、我々のＩＡモデルが長期記憶における遺伝子発現変化の解析に適していることを十二分に示していると、我々は信ずるところである。
【０１７５】
我々は最近、リサーチ・ジェネティック社からごく最近入手可能となったより完全なアレイのハイブリダイゼーション条件の確立に着手した。これらのアレイは５，０００種のラット転写産物を含有している。我々の目標は、ラットクローン化遺伝子の系統的解析を行い、訓練後どの発現が変化するかを明らかにすることである。訓練後異なる時点でその発現が変化する遺伝子をスクリーニングするために、リサーチ・プランの項で解説するように、我々は訓練後いくつかの時間枠で解析を行い、ノーザン・ブロット解析でフォローアップを行う計画を立てる。さらに、ＩＡで活性化する遺伝子カスケードが記憶の一般的分子機序かどうかを定義するために、同定された遺伝子の発現を、文脈的恐怖条件付け及びモリスの水迷路を含め、他の形の記憶でも解析することとする。
【０１７６】
実施例３
記憶固定中の遺伝子応答を遅らせ、長引かせると、モリスの水迷路後の変化の検出が可能となる。
長期記憶固定に関与する遺伝子は、進化上だけでなく、同じ神経構造を利用する様々な種類の記憶に渡って保存されている、という期待がある。我々は最初からＩＡ訓練を選んだが、それはなぜなら、遺伝子活性化の時系列を精確に定義するのに利用できそうだったからである。脳内のＰＣＲＥＢ変化を調べた我々の調査から、我々の関心は海馬に向いた。海馬は、モリスの水迷路を用いて調べられる記憶の発現にとっても必須である（Ｒｉｅｄｅｌ， １９９９）。水迷路訓練は、記憶固定中の遺伝子応答を調べるのに我々が選択した一番目の実験ではなかった。なぜなら、これは、数日間にわたる数多くの試行を必要とすることが多いからである。しかしながら、ＩＡ訓練から得られたデータでは、最初の訓練期間から、最高２４時間後まで、遺伝子応答がかなり長引く場合があることが示されている。従って我々はラットを水迷路で訓練して、一日間だけ訓練した後の２４時間後にどれくらいの記憶が示されるかを調べた。
【０１７７】
モリスの水迷路は大変信頼性が高く、海馬機能を調べるのに広く用いられているアッセイである。海馬形成自体、内側嗅領及び脳弓を含めた海馬系の部分のいずれかに損傷を持つラットはこの課題で重篤な障害を示す（Ｈａｎｎｅｎｓｏｎ， １９９８； Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ， １９８９）。水迷路装置は、白色のテンプラペイントを加えて不透明にした水を満たした大型で環状のプールから成る。脱出用プラットホームが水面下ぎりぎりに隠されており、ラットは、プールの端周囲の様々な開始位置から、この隠れたプラットホームまで泳がねばならない。正常なラットは、プラットホームまで直行する迷路外のてがかりの形状を利用及び記憶して、この課題を迅速に獲得することができる。学習は、脱出するまでの潜時の短縮と、プラットホームに辿り着くまでにラットが泳ぐ経路の長さの減少とに、反映される。
【０１７８】
以下の実施例では、どれくらい多くの情報が、比較的に短期間の訓練期間で学習及び記憶できるかを調べるために、コントロール・ラット（ｎ＝６）を水迷路で訓練した。各ラットは、一日８回の訓練を、連続四日間受けた。図８に見られるように、コントロール・ラットはプラットホームまで直接泳ぐことを大変速く学習し、３日間の訓練後に漸近能力に達した。相当量の学習が僅かに一日の訓練後に見られ、脱出潜時中間値は第１日目の３９．８８秒から第２日目の１６．８１秒まで減少した（図８も参照されたい）。これらの結果は、妥当に強固な空間記憶が水迷路で一日訓練後に形成されることを示すものである。従って、この課題を、我々の長期記憶における遺伝子発現変化の解析に含めてもよいであろう。
【０１７９】
図６。パネルＡ。水迷路で訓練したラットの脱出潜時中間値。ラットは一日当たり８回の訓練を連続四日間受けた。パネルＢ。第１日目（訓練１−８）及び第２日目（訓練９−１６）の８回の訓練それぞれの脱出潜時中間値。
【０１８０】
実施例４
アレイのハイブリダイゼーションで検出した遺伝子発現における変化
このプロジェクトでは、我々は、遺伝子及び発現配列タグ（ＥＳＴ）を含めほぼ５，０００種ある転写産物のなかで、どの遺伝子がＩＡ記憶形成中に海馬で調節を受けるかを同定することになる。我々は、非訓練動物及び訓練動物の海馬ＲＮＡから得たｃＤＮＡプローブに同一アレイを並行ハイブリダイズさせたものを比較することになる。訓練条件と、非訓練条件との間で発現に有意な変化の見られた転写産物を、さらに、上記の１乃至４で解説したステップの順に、ノーザン・ブロットで解析することになろう。
【０１８１】
ＩＡ訓練後に示差的に発現する遺伝子をスクリーニングするこのアレイ・ハイブリダイゼーションは、リサーチ・ジェネティックス社（アラバマ州ハンツビル）から購入したアレイで行うこととする。この会社は最近、市販のもので最も完全なラットＤＮＡアレイである「ラットＧｅｓｚｅＦｉｌｔｅｒｓマイクロアレイ」を発売した。これらのアレイは、約１，７００種の命名済みラット遺伝子と、他の生物の命名済み遺伝子に同様であると思われる多くのラットＥＳＴとを表す、５，０００を越えるスポットを含有するものである。メンブレン上の各スポットは、ある一個の遺伝子の３’端を含有するｃＤＮＡクローンから採った約０．５ｎｇのインサートＤＮＡを含有している。このインサートｃＤＮＡは変性させて、正に帯電したメンブレンにＵＶ架橋結合させてある。大半のプローブ（実験対象のｍＲＮＡから採ったｃＤＮＡ）がこれらスポットを飽和させないような条件下でハイブリダイゼーションを行うよう確認する詳細な実験計画案を、このメーカは提供している。しかし、以下に解説するように、記憶で調節される遺伝子の同定を成功させる確率の最も高くなるいくつかのハイブリダイゼーション条件を、我々は提示する予定である。これらのアレイ（ナイロン・メンブレン）は我々がクロンテック社から購入して、予備実験の項で解説したように、いくつかの遺伝子を同定するのに成功したものと同様である。最後に、リサーチ・ジェネティックス社はソフトウェア解析ツールも提供しており、このツールをジーン・フィルタ（Ｇｅｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ）と組み合わせて用いると、ホスホール画像系で生成された画像から遺伝子発現を比較することができる。この系により、複数の実験に渡る正規化が可能となり、またこの系は、生画像及び加工済みデータの両方のアーカイブを容易にできるビルト−インデータベースを有している。我々は、ＩＡ訓練後の遺伝子発現レベルの変化を検出できる確率を最大限にするために、複数のアレイ・ハイブリダイゼーションを行うであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＡ訓練後のｚｉｆ２６８及びｃ−ｆｏｓの時系列ノーザン・ブロット分析を示す。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡでなくｚｉｆ２６８ ｍＲＮＡの増加が、訓練後９時間及び２０時間の時点ですべての動物に見られる。
【図２】図２は、未施術ラット及び脳弓損傷ラットの海馬における、ＩＡ訓練後のＣ／ＥＢＰβ及びシクロフィリン（コントロール）ｍＲＮＡの時系列ノーザン・ブロット分析を示す。
【図３】図３は、ｃＤＮＡ発現アレイを用いた広範囲発現プロファイリングを示す。二つの異なるＲＮＡ集団から調製したｃＤＮＡプローブを用いたサイド・バイ・サイド・ハイブリダイゼーションにより、アレイ上ですべてのｃＤＮＡの発現レベルを同時に比較することができる（クロンテック社のユーザーマニュアルより）。
【図４】図４は、ＩＡ訓練後のｍＲＮＡの示差的発現を反映した、遺伝子アレイ・ハイブリダイゼーションにおける変化の例を示す。コントロール・ラットの海馬を、訓練後９時間で死なせたラットの海馬と比較する。これらのアレイで、各配列は複式で点が付いていることに留意されたい。
【図５】図５は、いくつかの転写産物のレベルを確認するノーザン・ブロットテストを示す。
【図６】図６のパネルＡは水迷路で訓練したラットの脱出潜時中間値を示す。ラットは一日８回の訓練を、連続四日間受けた。パネルＢは第１日目（訓練１−８）及び第２日目（訓練９−１６）の８回の訓練のそれぞれの脱出潜時中間値を示す。
【配列表】

Claims (26)

1. ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦのうちの一つ以上の活性を変調する作用薬で動物を処置するステップを含む、動物の長期記憶固定を変調する方法。
2. グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１） 又はグルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）のシグナル伝達経路を変調する作用薬であって、ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２受容体のリガンドである作用薬、で動物を処置するステップを含む、動物の長期記憶固定を高める方法。
3. （ｉ） ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される遺伝子がコードする産物の活性を検出するための反応系を提供するステップと；
   （ｉｉ）前記系をテスト化合物に接触させるステップと；
   （ｉｉｉ）前記テスト化合物が前記遺伝子産物の活性を変化させるかどうかを判定するステップと、
   を含む、記憶固定を変調する作用薬を同定する方法。
4. （ｉ） ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される遺伝子の発現レベルを検出するための反応系を提供するステップと；
   （ｉｉ）前記系をテスト化合物に接触させるステップと；
   （ｉｉｉ）前記テスト化合物が前記遺伝子の発現レベルを変化させるかどうかを判定するステップと、
   を含む、記憶固定を変調する作用薬を同定する方法。
5. 前記反応系が無細胞系である、請求項３又は４に記載の方法。
6. 前記無細胞系が精製済みタンパク質製剤である、請求項５に記載の方法。
7. 前記無細胞系が細胞ライセートである、請求項５に記載の方法。
8. 前記反応系が全細胞系である、請求項３又は４に記載の方法。
9. 前記テスト作用薬が、分子量が２５００ａｍｕ未満の有機分子である、請求項３又は４に記載の方法。
10. 複数の異なるテスト作用薬について反復される、請求項３又は４に記載の方法。
11. 薬学的に許容可能な医薬品添加物中に調合された、請求項３又は４のアッセイで同定された一種以上の化合物を含む製剤。
12. 神経成長因子、神経生存因子、及び神経栄養因子のうちの一つ以上をさらに含む、請求項１１に記載の製剤。
13. ＣＲＥＢ依存的転写を活性化する作用薬を、記憶向上効果を生むのに充分な量、さらに含む、請求項１１に記載の製剤。
14. 請求項１１に記載の製剤を動物に投与するステップを含む、動物の記憶固定を高める、又は、ＣＮＳニューロンの機能を高める方法。
15. 請求項１１に記載の製剤を動物に投与するステップを含む、学習及び記憶を増強する、又は、ＣＮＳニューロンの機能を高める方法。
16. 前記製剤と一緒に、神経成長因子、神経生存因子、及び神経栄養因子のうちの一つ以上を投与するステップをさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記製剤と一緒に、記憶向上効果を生むのに充分な量のＣＲＥＢ依存的転写を活性化する作用薬を投与するステップをさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
18. 前記ＣＲＥＢ活性化作用薬がｃＡＭＰ上昇作用薬である、請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも一つのｃＡＭＰアゴニストがアデニル酸シクラーゼを活性化する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＣＲＥＢ活性化作用薬がｃＡＭＰ類似体である、請求項１７に記載の方法。
21. 前記ＣＲＥＢ活性化作用薬がｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
22. ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される遺伝子の発現、又は、これらの遺伝子産物の活性レベル、を患者の海馬で検出するステップを含む、学習及び／又は記憶機能について患者を評価する方法。
23. ｚｉｆ ２６８、インシュリン様成長因子、グルタミン酸受容体 １ （ＧｌｕＲ１）、グルタミン酸受容体２ （ＧｌｕＲ２）、ｃ／ＥＢＰβ及びＶＧＦからなる群より選択される一種以上の遺伝子の発現もしくは変異、又は、これらの遺伝子産物の活性レベル、を（選択的に）患者の海馬で、検出するステップを含む、学習及び／又は記憶機能について患者を評価する方法。
24. （ｉ）請求項３又は４のアッセイにより、前記遺伝子の発現レベル又は遺伝子産物の活性をテスト化合物を同定するステップと；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で同定された作用薬か、又はその更なる類似体に対し、動物における効験及び毒性に関する治療上のプロファイリングを行うステップと；
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で同定された一つ以上の作用薬を含む製剤を、許容可能な治療的プロファイルを有するものとして調合するステップと、
    を含む、薬物発見事業を行う方法。
25. 前記製剤を販売に向けて流通させるための流通システムを確立する更なるステップを含み、選択によっては前記製剤を市場に送る販売グループを確立するステップを含めてもよい、請求項２４に記載の方法。
26. （ｉ）請求項３又は４に記載のアッセイにより、前記遺伝子の発現レベル又は遺伝子産物の活性をテスト化合物を同定するステップと；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で同定された作用薬か、又はその更なる類似体に対し、動物における効験及び毒性に関する治療上のプロファイリングを（選択に応じて）行うステップと；
    （ｉｉｉ）第三者に対し、前記同定された作用薬のその後の薬物開発の権利を与えるステップと
    を含む、ターゲット発見事業を行う方法。

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