JP2001518302A - Ｐｋｂキナーゼインヒビターを同定するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 病気の診断及び治療のための医学的適用を有するＰＫＢキナーゼ活性に作用する化合物のためのアッセイに役立つ組成物及び方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、分子生物学の分野にあり、プロテインキナーゼＢキナーゼ類の同定
及びそれらの医学的適用に関する。

【０００２】 発明の背景 インスリン及び他の成長因子は、ＰＩ４，５ビスホスフェート（ＰＩＰ２）を
セカンドメッセンジャーと予想されるＰＩ３，４，５トリホスフェート（ＰＩＰ
３）に交換する酵素であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼの
活性化を誘発する。ＰＩ３−キナーゼには複数の型があり、それらは全て、ホス
ファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、ホスファチジルイノシトール−４−
ホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ−４−Ｐ）及びホスファチジルイノシトール−４，
５−ビスホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ−４，５−Ｐ２）のＤ−３位をリン酸化し
て、各々ホスファチジルイノシトール−３−ホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ−３−
Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ
−３，４−Ｐ２）及びホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェ
ート（ＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３、又はＰＩＰ３）を作り出すことができ
る。

【０００３】 プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）はＰＩＰ３のシグナル伝達経路にあり、ＰＩ
３−キナーゼの下流にある。Frankeら（1995) Cell, vol. 81 、ページ 727-736
を参照のこと。例えば、インスリン又は成長因子によるＰＫＢの活性化は、Ｗｏ
ｒｔｍａｎｎｉｎもしくはＬＹ２９４００２として最も知られているＰＩ３−キ
ナーゼのインヒビターと一緒に細胞をプレインキュベートするなら、又はＰＩ３
−キナーゼの主要ネガティブ変異体の過剰発現により防止される。Burgering, B
.M. 及びCotter, P.J. (1995) Nature ; vol. 376 、ページ 599-602を参照のこ
と。更に、リン酸化された時にＰＩ３−キナーゼに結合するＰＤＧＦレセプター
内のチロシン残基の変異も、ＰＫＢの異型であるＰＫＢαの活性化を防ぐ。現在
の報告は、ＰＫＢはＰＩＰ３の下流の別のキナーゼによってもそれ自体活性化さ
れることを示している。Alessi, D ら、Curr. Biol. vol. 7, 261 (1997)を参照
のこと。このＰＫＢキナーゼと呼ぶキナーゼ、又はホスファチジルイノシチド（
ＰｔｄＩｎｓ）３−キナーゼ（ＰＤＫ１）は、活性化のためにＰＩＰ３を必要と
する。Stokoe, D.ら、(1997) Science, vol. 277、ページ 567-570を参照のこと
。

【０００４】 ＰＫＢはＰＩＰ３経路において重要な酵素であり、細胞成長を調節することに
関係する。それは特定のヒトの癌に関係しており；例えば、卵巣癌、乳癌、及び
膵臓癌の割合が増加することが知られている。Bellacosa, Aら（1995) Int. J.
Cancer 64 、ページ 280-285、及びCheng, J.Qら（1996）Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. vol. 93, 3636-3641を参照のこと。その酵素の増幅は、腫瘍細胞に、
アポトーシスを回避するためのメカニズムを与える。これにより、ＰＫＢ活性を
阻害する薬剤は、癌を含む不要な細胞成長に関する病気の治療のために有益であ
ろうことが認められよう。この目的を達成するための１つの方法は、これを同定
するアッセイを開発することである。

【０００５】 発明の概要 本発明の第１の対象は、ＰＫＢキナーゼ、該キナーゼを精製及び発現するため
の方法及び組成物、並びにそれらをコードするｃＤＮＡ配列である。 本発明の第２の対象は、ＰＫＢのリン酸化を行うための、ＰｔｄＩｎｓ（３，
４，５）Ｐ₃ によるＰＫＢキナーゼの活性化である。

【０００６】 本発明の第３の対象は、癌を含む不要な細胞増殖に関する病気を治療するため
の診断又は治療に利益を有する化合物を同定するための組成物及び方法である。 本発明のこれら及び他の対象は、本発明の十分な開示に基づいて当業者に明ら
かになるであろう。 発明の詳細な記載 本明細書に言及される全ての出版物及び特許出願は、各々の個々の出版物又は
特許出願が詳細かつ個々に引用により組み込まれて示されるのと同じ程度まで、
引用により本明細書に組み込まれる。

【０００７】 定義 最初に、特に示さなければ、本明細書に用いる全ての技術及び科学用語は、本
発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本
明細書に用いる命名法及び以下に記載の研究手順は公知のものであり、当該技術
分野において一般に用いられるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合
成、及び微生物培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェク
ション）のために標準的な技術を用いる。一般に、酵素反応及び精製ステップは
、製造元の細胞に従って行う。それらの技術及び手順は、当該技術分野において
慣用的な方法及びこの本明細書全体を通して供される種々の一般的参照文献（一
般に、引用により本明細書に組み込まれるSambrookら、Molecualr Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従って一般に行う。本明細書に用いる命名法、
並びに以下に記載する分析化学、有機合成化学、及び医薬調剤における研究手順
は公知であり、当該技術分野において一般に用いられる。化学合成、化学分析、
医薬調剤及びデリバリー、並びに患者の治療のためには標準的技術を用いる。

【０００８】 ＰＫＢ、又はプロテインキナーゼＢは、Coffer, P.J.及びWoodgett, J.R. (19
91) Eur. J. Biochem. vol. 201 、ページ 475-481、及びJones, P.F. ら（1991
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 88, 4171-4175 、に記載されるように、プ
ロテインキナーゼｃ及びプロテインキナーゼａと相同性を有する約６０kDキナー
ゼを意味するとして本明細書で用いられる。また、ＷＯ９７／２２３６０、及び
Stokoe, D.ら（1997) Science, vol. 277 、ページ 567-570も参照のこと。その
定義には、その４つが知られている酵素の異型を含む。ＰＫＢはｃ−Ａｋｔ及び
Ｒａｃ−ＰＫとも呼ぶ。

【０００９】 ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェートの‘生物学的
立体異性体’の形式的な名前は、（特定の脂肪酸の組合せのため）；（１−ステ
アロイル、２−アラキドニル）Ｓｎ−ホスファチジルＤ−ミオイノシトール（３
，４，５）−トリホスフェートである。我々は、これを略記するが、特定の異性
体を定義するために関連する識別する正確さの全てを残す。ここで、Ｄ−Ｄ−Ｓ
／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ は、２番目のＤがグリセロール骨格のキ
ラリティーをいい、即ちＤ−Ｌ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ は（
２−アラキドニル、３−ステアロイル）Ｓｎ−ホスファチジルＤ−ミオイノシト
ール（３，４，５）−トリホスフェートである。ジパルミトイル誘導体はＤ−Ｄ
−Ｐ／Ｐ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ と略記する。Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−Ｐｔ
ｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ のエナンチオマーはＬ−Ｌ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ
（３，４，５）Ｐ₃ である。

【００１０】 対象に適用する場合に本明細書に用いる用語“天然”は、対象が自然に見い出
すことができることをいう。例えば、自然のソースから単離することができ、研
究所でヒトにより意図的に改変されていない（ウイルスを含む）生物中に存在す
るポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然である。 本明細書に用いる用語“ポリヌクレオチド”は、リボヌクレオチドもしくはデ
オキシリボヌクレオチド又はいずれかのヌクレオチドの型の改変型である少くと
も１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。

【００１１】 本明細書に用いる用語“オリゴヌクレオチド”は、天然の及び非天然のオリゴ
ヌクレオチド結合により一緒に結合された、天然の及び改変されたヌクレオチド
を含む。オリゴヌクレオチドは、２００塩基又はそれより少い長さのポリヌクレ
オチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基
長であり、最も好ましくは、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９
又は２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブにつ
いて、一本鎖であるが、例えば遺伝子変異体の作製に用いるために、オリゴヌク
レオチドは２本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又は
アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。本明細書に用いる用語“天然のヌ
クレオチド”は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明
細書に用いる用語“改変されたヌクレオチド”は、改変された又は置換された糖
基等を有するヌクレオチドを含む。本明細書に用いる用語“オリゴヌクレオチド
結合”は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチ
オエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデート等を含む。オリゴヌクレ
オチドは、必要に応じて、検出のための標識を含み得る。

【００１２】 本明細書に用いる用語“配列相同性”は、２つの核酸配列間の塩基適合の割合
又は２つのアミノ酸配列間のアミノ酸適合の割合をいう。配列相同性をパーセン
テージ、例えば５０％として表す場合、そのパーセンテージは、特定の他の配列
と比較した。ＰＫＢキナーゼからの配列の長さにわたる適合のパーセンテージを
いう。（２つの配列のいずれかの）ギャップは、マッチングを最大にするのを許
容し；１５塩基又はそれ未満のギャップ長が通常用いられ、６塩基又はそれ未満
か好ましくは、２塩基又はそれ未満がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプロ
ーブ又は処理として用いる場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配
列相同性は一般に、２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対適合のうち１７以上
の標的塩基適合（８５％）；好ましくは１０の可能な塩基対適合のうち９以上の
適合（９０％）、最も好ましくは２０の可能な塩基適合のうち１９以上の適合（
９５％）である。

【００１３】 ２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的な又は完全な同一性があるな
ら、相同である。例えば、８５％相同性は、その２つの配列が最大に適合するよ
うにアラインされた時にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（適合
している２つの配列のいずれかの）ギャップは、適合を最大にすることができ；
５又はそれ未満のギャップ長が好ましく、２又はそれ未満がより好ましい。ある
いは及び好ましくは、２つのタンパク質配列（又は少くとも３０アミノ酸長のそ
れら由来のポリペプチド配列）は、それらが、６又はそれ超の変異データマトリ
ックス及びギャップ・ペナルティーでプログラムＡＬＩＧＮを用いて（標準偏差
単位で）多くとも５のアラインメント・スコアを有するなら、本明細書でこの用
語を用いて、相同である。Dayhoft, M.O. (Atlas of Protein Sequence and Str
ucture, 1972, volumeら、National Biomedical Research Foundation, pp 101-
110 、及びSupplement 2からこの巻、pp. 1-10) を参照のこと。２つの配列又は
その部分は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを用
いて最適にアラインした時に５０％より大きい又はそれに等しい同一性を有する
なら、相同である。

【００１４】 本明細書に用いる場合、“実質的に純粋”とは、対象種が存在する支配的な種
である（即ちモラーベースで、それが、組成物中でいずれの他の個々の種よりも
豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象種が
存在する全ての高分子種の少くとも５０％（モルベース）を含む組成物である。
一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０
％超を含むであろう。より好ましくは約８５％、９０％、９５％、及び９９％よ
り多い。最も好ましくは、対象種は、組成物が単一高分子種から本質的になる本
質的に均一になる（汚染種が慣用的な検出法により組成物中で検出できない）ま
で精製される。

【００１５】 本明細書に用いる化学用語は引用により本明細書に組み込まれるThe McGraw-H
ill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, Sa
n Francisco に例示されるような、当該技術分野での慣用的な利用に従って用い
る。 遺伝子操作によってクローン化された遺伝子からのタンパク質の生産は公知で
ある。例えば、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，７６１，３７１の第６欄、３行〜第
９欄、６５行を参照のこと（本明細書に言及される全ての特許文献の開示内容は
引用により本明細書に組み込まれる）。従って、後の議論は、この分野の概観と
して意図し、当該技術分野の全ての状態を反映することを意図したものではない
。

【００１６】 ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連している場合、作用可能に結合している。
例えば、プロモーターは、それが配列の転写を制御するなら、コーディング配列
に作用可能に結合しており；リボソーム結合部位は、それが翻訳を許容するよう
に位置するなら、コーディング配列に作用可能に結合している。 適切な宿主細胞には、原核生物、イースト細胞、又は高等真核生物細胞がある
。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）又はバチルスがある。高等真核生物細胞には、以下に記載されるような哺乳動
物源の確立された細胞系（即ちｃｏｓ細胞）がある。典型的な宿主細胞は、ＤＨ
５ａ、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７
７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）及び大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）
がある。シュードモナス種、バチルス種、及びセラチア・マルセサンス（Serrat
ia marcesans) も適している。

【００１７】 昆虫系において、オートグラファ・カリホルニカ（Autographa californica）
核ポリヒドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現させるためにベ
クターとして用いることができる（例えば、Smith ら、1983, J. Virol. 46 : 5
84 ; Smith、米国特許第４，２１５，０５１を参照のこと）以下に記載の一実施
形態において、Ｓｆ９昆虫細胞に、６×ヒスチジンタグ、ｍｙｃ、又はＥＥ−タ
グ（即ちＧｌｕ−Ｇｌｕ−タグ）のいずれかを伴うＰＫＢキナーゼ構成物を発現
するバキュロウィルスベクターを感染させる。

【００１８】 広範囲の種々の適切な微生物ベクターが利用できる。一般に、微生物ベクター
は、意図した宿主により認識される複製の起点、宿主内で機能するであろうプロ
モーター及び表現型選択遺伝子、例えば抗生物質耐性を与え又は自己栄養要求を
供給するタンパク質をコードする遺伝子を含むであろう。同様の構成物は、他の
宿主について製造されよう。大腸菌は、典型的には、ｐＢＲ３２２を用いて形質
転換される。Bolivar ら（Gene 2, 95 (1977））を参照のこと。ｐＢＲ３２２は
、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、これにより、
形質転換された細胞を同定するための容易な手段を供する。発現ベクターは、宿
主細胞により認識されるプロモーターを含むべきである。これは、一般的に、意
図した宿主から得られるプロモーターを意味する。組換え微生物発現ベクターに
最も一般的に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペンシリナーゼ
）及びラクトースプロモーターシステム（Chang ら、Nature 275, 615 (1978)；
及びGoeddel ら、Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) 及びＥＰＯ出願公開番号
３６，７７６）並びにｔａｃプロモーター（H. De Boerら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80, 21 (1983)がある。

【００１９】 ＰＫＢキナーゼの同定 ＰＫＢキナーゼは、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法を
含む、いくつかの異なる技術を用いて同定することができる。ＰＫＢキナーゼ活
性の確認における特定の点で、ＰＩＰ３による活性化が決定されるであろうと予
想される。Stokoe, D ら（1997) Science, vol. 277 、ページ 567-570を参照の
こと。

【００２０】 用いることができる古典的な方法には、細胞ライゼート又は細胞ライゼートか
ら得られたタンパク質の勾配又はクロマトグラフィーカラムを介して、標的タン
パク質、好ましくはＰＫＢ、又は他の適切な基質をリン酸化するライゼート中の
タンパク質を同定するための、同時免疫沈降法、架橋及び同時精製である。この
ようなアッセイは、全長のＰＫＢ標的又はペプチドを用いることができる。単離
した後、このような細胞内ＰＫＢキナーゼを同定し、次に、標準的な技術と組み
合わせてそれを用いて、それが相互作用する他のタンパク質を同定することがで
きる。例えば、ＰＫＢと相互作用する細胞内ＰＫＢキナーゼのアミノ酸配列の少
くとも一部は、当業者に公知の技術を用いて、例えばエドマン分解法を用いて確
認することができる（例えばCreighton, 1983,“Proteinsi Structures and Mol
ecular Principles ”，W.H. Freeman & Col. N.Y., pp. 34-49 を参照のこと）
。得られたアミノ酸配列は、このような細胞内タンパク質をコードする遺伝子配
列についてスクリーニングするのに用いることができる。スクリーニングは、例
えば標準的ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術により行うことができる。オ
リゴヌクレオチド混合物の生成及びスクリーニングのための技術は公知である（
例えばAusubel 、前掲、及びPR Protocols : A Guide to Methods and Applicat
ions, 1990, Innis, Mら、eds, Academic Press, Inc., New York を参照のこと
）。

【００２１】 更に、ＰＫＢキナーゼと相互作用する細胞内タンパク質をコードする遺伝子の
同時に同定する方法を用いることができる。これらの方法は、例えば、標識化タ
ンパク質、又は例えばマーカー（例えば酵素、蛍光、ルミネセンスタンパク質、
又は染料）又はＩｇ−Ｆｃドメインに融合した、融合タンパク質を用いる、λｇ
ｔｌｌライブラリーの抗体プロービングの公知の技術と同様に発現ライブラリー
をプロービングすることを含む。

【００２２】 生体内でタンパク質を検出し、ＰＫＢキナーゼのキナーゼ活性に依存しない。
１つの方法は、２−ハイブリッドシステムであり、実例のためのみに詳細に記載
され、限定するものではない。このシステムは、開示されており（Chien らの米
国特許第５，２８３，１７３号、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 957
8-9582), Clonetech (Palo Alto. CA)から市販される。要約すると、このような
システムを利用して、次の２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミ
ドが作製される：ＰＫＢ、又はペプチドもしくは融合タンパク質をコードするＰ
ＫＢヌクレオチド配列に融合された転写アクティベータータンパク質のＤＮＡ結
合ドメインをコードするヌクレオチドからなる１つのプラスミド、並びにｃＤＮ
Ａライブラリーの一部としてこのプラスミドに組み込まれている未知のタンパク
質をコードするｃＤＮＡに融合された転写アクティベータータンパク質の活性化
ドメインをコードするヌクレオチドからなる他方のプラスミド。ＤＮＡ結合ドメ
イン融合プラスミド及びｃＤＮＡライブラリーは、調節領域が転写アクティベー
ターの結合部位を含むリポーター遺伝子（例えばＨＢＳ又はｌａｃＺ）を含むイ
ーストサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae) の株に形
質転換される。いずれかのハイブリッドタンパク質のみではリポーター遺伝子の
転写を活性化することができず；ＤＮＡ結合ドメインは、それが活性化機能を供
さないのでできず、活性化ドメインはそれがアクティベーターの結合部位に局在
化することができないので、できない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作
用は機能的なアクティベータータンパク質を再構成し、リポーター遺伝子を発現
させ、それはリポーター遺伝子産物のためのアッセイにより検出される。

【００２３】 ２−ハイブリッドシステム又は関連する方法は、“ベイト（bait）”遺伝子産
物と相互作用するタンパク質のための活性化ドメインライブラリーをスクリーニ
ングするために用いることができる。例として、限定するものではないが、ＰＫ
Ｂもしくはペプチド、又はそれら由来の融合タンパク質をベイト遺伝子産物とし
て用いることができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列が活性化ドメインをコードす
るＤＮＡに融合される。ＤＮＡ結合ドメインに融合されたベイトＰＫＢ遺伝子産
物のハイブリッドをコードするこのライブラリー及びプラスミドは、イーストリ
ポーター株に同時形質転換され、生じた形質転換体は、リポーター遺伝子を発現
するものについてスクリーニングされる。これらのコロニーは精製され、リポー
ター遺伝子発現の原因となるライブラリープラスミドが単離される。次にＤＮＡ
配列決定を用いてライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質が同定
される。

【００２４】 ベイト細胞周期標的遺伝子産物と相互作用するタンパク質をそれから検出する
ことができる細胞系のｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野においてルーチン
的に実施されている方法を用いて作ることができる。本明細書に記述される特定
のシステムによれば、例えば、ｃＤＮＡフラグメントは、それらがＧＡＬ４の転
写活性化ドメインに翻訳により融合されるようにベクターに挿入することができ
る。このライブラリーは、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動さ
れるｌａｃＺ遺伝子を含むイースト株に、ベイト細胞周期標的遺伝子−ＧＡＬ４
融合プラスミドと共に同時トランスフェクトすることができる。ベイト周期標的
遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡコ
ード化タンパク質は、活性なＧＡＬ４タンパク質を再構成し、それによりＨＩＳ
３遺伝子の発現を駆動するであろう。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、ヒスチジ
ンを欠如する米国体寒天ベース培地を含むペトリ皿上でのそれらの増殖によって
検出することができる。次にそのｃＤＮＡは、これらの株から精製され、当該技
術でルーチン的に実施されている技術を用いて、ベイト周期標的遺伝子−相互作
用タンパク質を作り、単離するために用いることができる。

【００２５】 タンパク質を２−ハイブリッドアッセイを用い単離する限り、そのタンパク質
がキナーゼ活性を有するか否かを確認するための独立したアッセイが行われる。
このようなアッセイは当該技術分野において公知であり、例はStokoe, D ら（19
97) (Science, vol. 277、ページ 567-570) により記載される。 ＰＫＢキナーゼコーディング核酸 本発明による核酸をコードするＰＫＢキナーゼは種々の異なるソースから得る
ことができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばポリアデニル化ｍＲＮＡ、例えば組織
、細胞、もしくは全体の生物から単離されたものから得ることができる。その核
酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡから直接、又はｃＤＮＡライブラリーから得ること
ができる。その核酸は、要求される遺伝子型表現型（例えばオンコジーンで形質
転換された細胞又は癌細胞）等を有する発達の特定の段階の細胞から得ることが
できる。

【００２６】 本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、、Ｐ
ＫＢキナーゼのみのコーディング配列；ＰＫＢキナーゼのコーディング配列及び
更なるコーディング配列（例えばリーダー、分泌、標的化、酵素、蛍光又は他の
診断ペプチドをコードする配列）；ＰＫＢキナーゼのコーディング配列及び非コ
ーディング配列、例えば５′又は３′にある非翻訳配列。又はコーディング配列
内に分散している配列例えばイントロンを含み得る。ＰＫＢキナーゼポリペプチ
ドを中断なくコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、そのヌクレオチド配列
が、そのコーディング配列中に介在する又はそれを中断する非コーディングヌク
レオチドがない。例えばイントロンがないＰＫＢキナーゼポリペプチドのための
アミノ酸コーディング配列を含むことを意味する。このようなヌクレオチド配列
は、隣接的（contiguous) と記述することもできる。

【００２７】 本発明による核酸は、上述のような核酸に作用可能に結合された発現調節配列
も含み得る。句“発現調節配列”は、作用可能に結合された核酸により、コード
されたポリペプチドの発現を制御する核酸配列を意味する。発現は、ｍＲＮＡ又
はポリペプチドのレベルで制御することができる。これにより、発現調節配列は
、ｍＲＮＡ関連要素及びタンパク質関連要素を含む。このような要素には、プロ
モーター、エンハンサー（ウイルス又は細胞）、リボソーム結合配列、転写ター
ミネーター等がある。発現調節配列は、その発現調節配列がコーディング配列の
発現に作用し又はそれを達成するように位置する場合、ヌクレオチドコーディン
グ配列に作用可能に結合される。例えば、プロモーターをコーディング配列に、
５′に作用可能に結合させた場合、そのコーディング配列の発現はそのプロモー
ターにより駆動される。発現調節配列は、その通常の遺伝子に対して異種であっ
ても内因性であってもよい。

【００２８】 本発明による核酸は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて選択することが
できる。２つの一本鎖核酸調製物が一緒にハイブリダイズする能力は、それらの
ヌクレオチド配列相補性の基準、例えばヌクレオチド間、例えばＡ−Ｔ，Ｇ−Ｌ
等の塩基対である。これにより、本発明は、図５（配列番号：１）に記載される
ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸にも関する。後者の配列
にハイブリダイズするヌクレオチドは、相補的核酸鎖を有するか、又はポリメラ
ーゼ（即ち適切な核酸合成酵素）の存在下でそれのためのテンプレートとして機
能するであろう。本発明は、核酸の両方の鎖、例えばセンス及びアンチセンス鎖
を含む。

【００２９】 図５（配列番号：１）に記載のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド
の必要な量を有する核酸を選択するためにハイブリダイゼーション条件を選択す
ることができる。このような配列にハイブリダイズすることができる核酸は、好
ましくは、それら配列間に、５０％、より好ましくは７０％の相補性を有する。
本発明は、特に、ストリンジェント条件下で図５（配列番号：１）に記載のヌク
レオチド配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。本明細書に用いる場合
、“ストリンジェント条件”は、それら核酸間に少くとも約９５％、好ましくは
９７％のヌクレオチド相補性がある場合にハイブリダイゼーションがおこるであ
ろういずれかの条件を意味する。このような条件には、例えば、Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎのためのハイブリダイゼーション：５×ＳＳＰＥ，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶
液、１００μｇ／mlの新しく変性させ、せん断したサケ精子ＤＮＡ、５０％ホル
ムアミド、２％ＳＤＳで４２℃；ｃＤＮＡライブラリーからのクローニングのた
めのハイブリダイゼーション：１×ＰＡＭ，０．１％ＳＤＳ，５０％ホルムアミ
ドで４２℃がある。

【００３０】 本発明によれば、核酸又はポリペプチドは、図５（配列番号：１）に記載のヌ
クレオチド又はアミノ酸配列内に１又は複数の差を含み得る。ヌクレオチド及び
／又はアミノ酸配列への変化又は改変は、直接又はランダム変異誘発を含む、利
用できるいずれかの方法によって行うことができる。 本発明によるＰＫＢキナーゼをコードする核酸は、天然のＰＫＢキナーゼ、例
えば天然の多形、正常もしくは変異体対立遺伝子（ヌクレオチド又はアミノ酸）
、哺乳動物、例えばヒト、サル、ブタ、マウス、ラット、もしくはウサギの自然
の集団内で発見される変異体内にあるヌクレオチドを含み得る。天然との用語は
、その核酸が、自然のソース、例えば動物組織及び細胞、体液、組織培養細胞、
法医学サンプルから得られることを意味する。ＰＫＢキナーゼへの天然の変異は
、ヌクレオチド配列の欠失（例えばトランケートされたアミノ−又はカルボキシ
−末端）、置換、又は付加を含み得る。これらの遺伝子は、当業者が知っている
であろう方法に従って、核酸ハイブリダイゼーションにより検出し、単離するこ
とができる。他のオンコジーンと同様に、ＰＫＢキナーゼの天然の変異体は、宿
主細胞及び生物において病因状態を作り出す欠失、置換、及び付加を含む。

【００３１】 本発明のＰＫＢキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然
の遺伝子、転写物、又はｃＤＮＡ、例えば図５（配列番号：１）に記載されるも
のに見い出されるコドンを含んでも、同じアミノ酸配列をコードする縮重コドン
を含んでもよい。 本発明の別の態様は、ＰＫＢキナーゼに特有であるヌクレオチド配列である。
ＰＫＢキナーゼに特有の配列とは、ＰＫＢキナーゼ内、例えば図５（配列番号：
１）のヌクレオチド配列内にあるが、他の配列内にはまれに又は珍しい、特に動
物核酸、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、ラット、マウス等内にない所定の順
番のヌクレオチドを意味する。センス及びアンチセンスヌクレオチドの両方が含
まれる。本発明による特有の核酸は、ルーチン的に決定することができる。ＰＫ
Ｂキナーゼの特有の配列を含む核酸は、例えばノーザンブロット上で、核酸の混
合物を含むサンプル中でＰＫＢキナーゼの存在を同定するためにハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションは、プロ
ーブに対して少くとも９５％の同一性（即ち相補性）を有する核酸を選択するた
めにストリンジェント条件下で行うことができるが、より低いストリンジェント
条件も用いることができる。特有のＰＫＢキナーゼヌクレオチド配列は、枠内で
、その５′又は３′端で、ＰＫＢキナーゼの他の部分についてのコーディング配
列、酵素、ＧＦＰ等、発現調節配列等を含む、本特許全体を通して言及される種
々のヌクレオチド配列に融合させることもできる。

【００３２】 ハイブリダイゼーションは、例えばSambrookら、Molecular Cloning, 1989 に
記載されるように、要求される選択性により、異なる条件下で行うことができる
。例えば、ＰＫＢキナーゼを特異的に検出するために、例えばオリゴヌクレオチ
ドがその標的に対して１００％相補的である場合に、そのオリゴヌクレオチドの
みがＰＫＢキナーゼにハイブリダイズする条件下で標的核酸にハイブリダイズさ
せることができる。１００％未満で少くとも約９９％，９７％，９５％，９０％
，７０％，６７％のヌクレオチド相補性を有する標的核酸を選択することが要求
されるなら、異なる条件を用いることができる。ＰＫＢキナーゼ遺伝子内の変異
は病気又は病因状態、例えば癌、良性腫瘍を引きおこし得るので、本発明による
オリゴヌクレオチドを診断に用いることができる。例えば、癌又はＰＫＢキナー
ゼシグナル伝達経路に関連する他の状態の症状を有する患者は、ポリメラーゼ鎖
反応、次のＤＮＡ配列決定によりその配列が正常であるか否かを同定することに
おいて、本発明によるオリゴヌクレオチドを用いることによりその病気を診断す
ることができる。好ましい方法において、本発明は、癌を診断する方法であって
、標的核酸を含むサンプルを、オリゴヌクレオチドに、該標的及びオリゴヌクレ
オチドの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させ；
ハイブリダイゼーションを検出し、そして前記オリゴヌクレオチドがハイブリダ
イズする標的核酸のヌクレオチド配列を決定することを含み、前記オリゴヌクレ
オチドが、ＰＫＢキナーゼの配列、好ましくはＰＫＢキナーゼの特有な配列を含
むことを特徴とする方法に関する。その配列は、標的核酸又はそのｃＤＮＡを単
離し、そして要求される方法に従ってその配列を決定することを含む種々の方法
に従って決定することができる。

【００３３】 細胞成長異常の診断 癌を含む細胞成長異常の診断及び予後評価のために、及びこのような異常への
素因を有する患者の同定のために種々の方法を用いることができる。 このような方法は、例えば、上述のような、ＰＫＢキナーゼヌクレオチド配列
、及びＰＫＢキナーゼ抗体のような試薬を利用する。特に、このような試薬は、
例えば（１）ＰＫＢキナーゼ遺伝子変異体の存在の検出、又は非細胞成長異常状
態に対するＰＫＢキナーゼｍＲＮＡの過剰又は下降発現の検出；（２）非細胞成
長異常状態に対するＰＫＢキナーゼ遺伝子産物の過剰な又は過少な量の検出；及
び（３）ＰＫＢキナーゼにより媒介されるシグナル伝達経路における混乱又は異
常の検出のために用いることができる。 本明細書に記載される方法は細胞活性化疾患異常を示す患者を診断するために
、例えば、臨床的設定において、便利に用いることができる、少くとも１の本明
細書に記載される特定のＰＫＢキナーゼヌクレオチド配列又はＰＫＢキナーゼ抗
体試薬を含む予め包装された診断キットを利用することにより行うことができる
。

【００３４】 ＰＫＢキナーゼの検出のために、ゲノム核酸のための出発源としていずれかの
凝集した細胞を用いることができる。ＰＫＢキナーゼ発現のために、ＰＫＢキナ
ーゼが発現されるいずれかの細胞型又は組織を利用することができる。 核酸ベースの検出技術が以下に記載される。ペプチド検出技術も以下に記載さ
れる。

【００３５】 ＰＫＢキナーゼ遺伝子及び転写物の検出 ＰＫＢキナーゼ内の変異は、いくつかの技術を利用することにより検出するこ
とができる。いずれかの凝集細胞からの核酸を、このようなアッセイ技術のため
の出発点として用いることができ、当業者に公知である標準的な核酸調製法に従
って単離することができる。

【００３６】 ＤＮＡは、点変異、挿入、欠失及び染色体再配置を含む、遺伝子構造に関する
異常を検出するための生物サンプルのハイブリダイゼーション又は増幅アッセイ
に用いることができる。このようなアッセイは、これらに限らないが、サザン分
析、一本鎖コンホメーション多形性分析（ＳＳＬＰ）、及びＰＣＲ分析を含み得
る。

【００３７】 ＰＫＢキナーゼ特異的変異の検出のためのこのような診断法は、例えば、サン
プルから、例えば患者サンプル又は他の適切な細胞ソースから得た組換えＤＮＡ
分子、クローン化遺伝子又はその縮重変異体を含む、核酸を、上述のような組換
えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子又はその縮重変異体を分析、１又は複数の標識
化核酸に、ＰＫＢキナーゼ内のそれらの相補配列へのこれらの試薬の特定のアニ
ーリングのために好ましい条件下で接触させ、インキュベートすることに関連し
得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少くとも１５〜３０ヌクレオチド
である。インキュベーションの後、全ての非アニール化核酸を核酸分子ハイブリ
ッドから除去する。次に、ハイブリダイズしている核酸の存在は、いずれかのこ
のような分子が存在するなら、検出される。このような検出スキームを用いて、
関係する細胞型又は細胞は、例えば固体支持体、例えば膜、又はプラスチック表
面、例えばマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズ上に固定する
ことができる。この場合、インキュベーションの後、上述の型のアニールしてい
ない標識された核酸試薬は容易に除去される。残ったアリールした標識化ＰＫＢ
キナーゼ核酸試薬の検出は、当業者に公知の標準的技術を用いて行われる。核酸
試薬がアニールしているＰＫＢキナーゼ遺伝子配列は、遺伝子変異が存在するか
否かを決定するために、正常な遺伝子配列から予想されるアニーリングパターン
と比較することができる。

【００３８】 患者サンプル又は他の適切な細胞ソースにおいて、ＰＫＢキナーゼ遺伝子特異
的核酸分子を検出するための別の診断方法は、例えば、ＰＣＲ（Mullis, K.B.,
1987、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の実験例）、次の当業者に公知の
技術を用いるその増幅された分子の検出により、それらの増幅に関連し得る。生
じた増幅された配列は、遺伝子変異が存在するか否かを決定するために、その増
幅された遺伝子がＰＫＢキナーゼ遺伝子の唯一の正常なコピーを含むなら、予想
されるであろうものと比較することができる。

【００３９】 ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物の検出 先に議論される、野生型又は変異体ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物又はその保存性
変異体もしくはフラグメントは、本明細書に記載される通り、細胞増殖異常診断
及び予想として用いることができる。このような診断法は、ＰＫＢキナーゼ遺伝
子発現のレベルの異常、又はＰＫＢキナーゼの構造及び／又は一時的、組織、細
胞、もしくは亜細胞位置の異常を検出するために用いることができ、生体内又は
試験管内で、例えばバイオプシー組織で行うことができる。

【００４０】 分析すべき組織又は細胞型は、一般に、ＰＫＢキナーゼ遺伝子を発現する細胞
を含むと知られているもの又はそのように予想されるもの、例えば炎症に浸潤し
ている好中球細胞を含むであろう。本明細書に用いるタンパク質単離法は、例え
ば、その全体から引用により本明細書に組み込まれるHarlow及びLane (Harlow,
E.及びLane, D., 1988“Antibodies : A Laboratory Manual”, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, New York)に記載されるようなも
のであり得る。その単離された細胞は、細胞培養物から又は患者から得ることが
できる。培養物からとった細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法の一部として
用いることができる細胞の評価において、又はＰＫＢキナーゼ遺伝子の発現への
化合物の効果をテストするために必要なステップであり得る。

【００４１】 例えば、抗体、又は抗体のフラグメント、例えば上述のものは、ＰＫＢキナー
ゼ遺伝子産物又はその保存性変異体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量
的又は定性的に検出するために本発明に役立つ。これは、例えば、光学顕微鏡、
フローサイトメトリー、又は蛍光測定検出と合わせて蛍光で標識された抗体（以
下を参照）を用いる免疫蛍光技術により、行うことができる。

【００４２】 本発明に役立つ抗体（又はそのフラグメント）又はその融合もしくはコンジュ
ゲート化タンパク質は、更に、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡又は非免疫アッセイと
して、ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物又はその保存性変異体もしくはペプチドフラグ
メントのイン・シトゥ検出のために組織学的に用いることができる。 イン・シトゥ検出は、患者から組織学的試料を除去し、そしてそれに、本発明
の標識化抗体又は融合タンパク質を適用することにより行うことができる。その
抗体（又はフラグメント）又は融合タンパク質は、好ましくは、その標識化抗体
（又はフラグメント）を生物サンプルに重ねることにより適用される。このよう
な手順の使用を介して、ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物又は保存性変異体もしくはペ
プチドフラグメントの存在ばかりでなく、検査した組織中のその分布も決定する
ことが可能である。本発明を用いて、当業者は、（染色手順のような）広範囲の
種々の組織学的方法を、このような、イン・シトゥ検出を行うために改変するこ
とができることを直ちに認めるであろう。

【００４３】 ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物又はその保存性変異体もしくはペプチドフラグメン
トのためのイムノアッセイ及び非イムノアッセイは、典型的には、サンプル、例
えば生物流体、組織抽出物、新しく収集した細胞、又は細胞培養においてインキ
ュベートされている細胞のライゼートを、ＰＫＢキナーゼ遺伝子産物又はその保
存性変異体もしくはペプチドフラグメントの存在下でインキュベートし、そして
当該技術で公知であるいくつかの技術のいずれかによりその結合した抗体を検出
することを含むであろう。

【００４４】 生物サンプルは、固相支持体又は担体、例えばニトロセルロース、又は細胞、
細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体に接
触させて、それ以上に固定化することができる。その支持体は、次に、適切な緩
衝液で洗い、次に検出可能に標識されたＰＫＢキナーゼ抗体又は融合タンパク質
で処理することがてぎる。次に、固相支持体は、緩衝液で洗い、結合していない
抗体又は融合タンパク質を除去することができる。次に、固体支持体上の結合し
た標識の量は、慣用的な手段によって検出することができる。

【００４５】 “固相支持体又は担体”は、抗原又は抗体に結合することができるいずれかの
支持体を包含することを意図する。公知の支持体又は担体には、ガラス、ポリス
チレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ
、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい者、及び磁鉄鉱がある
。担体の性質は、本発明の目的のためある程度可溶性であっても不溶性であって
もよい。支持体材料はその結合した分子が抗原又は抗体に結合することができる
限り本質的にいずれの可能性ある構造を有してもよい。これにより、支持体構造
は、ビーズとして球形であっても、テストチューブの内側表面として柱状であっ
ても、ロッドの外側表面であってもよい。あるいは、その表面は、平ら、例えば
、シート、テストストリップ等であってもよい。好ましい支持体には、ポリスチ
レンビーズがある。当業者は、抗体又は抗原を結合するための多くの他の適切な
担体を知っているであろうし、それを、慣用的な実験により確認することができ
るであろう。

【００４６】 ＰＫＢキナーゼ抗体又は融合たんぱく質の所定の組の結合活性は、公知の方法
に従って決定することができる。当業者は、慣用的な実験を用いることにより、
各々の測定のための作用的及び最適なアッセイ条件を決めることができるであろ
う。 抗体に関して、その抗体を検出可能に標識する方法の１つは、それを酵素に結
合し、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる（Voller, “The Enzy
me Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ”, 1978, Diagnostic Horizons 2 :
1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD)
; Voller et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31 : 507-520 ; Butler, 1981, Me
th. Enzymol. 73 : 482-523 ; Maggio (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC
Press, Boca Raton, FL. ; Ishikawa et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoass
ay, Kgaku Shoin, Tokyo) 。抗体に結合した酵素は、適切な基質、好ましくは色
原基質と、例えば分光測定、蛍光測定又は視覚的手段により検出することができ
る化学成分を作り出すように反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに
用いることができる酵素には、これらに限らないが、マレートデヒドロゲナーゼ
、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、イ
ーストアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアシラーゼ及びアセチルコリンエス
テラーゼがある。その検出は、酵素のための色原基質を用いる比色測定法により
行うことができる。検出は、同様に調製された標準と比べた基質の酵素反応の程
度の視覚的な比較により行うこともできる。

【００４７】 検出は、種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて行うこともできる。例
えば、抗体又は抗体フラグメントを放射能標識化することにより、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）の使用によりＰＫＢキナーゼを検出することが可能である（
例えば、引用により組み込まれるWeintraub, B., Prirciple of Radio immunoas
says, Seveenth Training Course on Radioligand Assay Techriques, The Endo
crine Society, March, 1986を参照のこと）。放射性同位体は、ガンマカウンタ
ー又はシンチレーションカウンターのような手段により又はオートラジオグラフ
ィーにより検出することができる。

【００４８】 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。その蛍光で標識された抗体を
正確な波長の光に露出した場合、その存在は、蛍光により検出することができる
。最も一般的に用いられる蛍光標識化化合物には、フルオレセインイソチオシア
ネート、ロダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン及
びフルオレスカミンがある。

【００４９】 抗体は、蛍光放射性金属、例えば ¹⁵²Ｅｕ、又は他のランタノイド列のものを
用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のよう
な金属キレート化グループを用いて抗体に結合させることができる。 抗体は、それを化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識するこ
ともできる。次にその化学発光（ケミルミネセント）標識化抗体の存在は、化学
反応の過程で生ずるルミネセンスの存在を検出することにより測定される。特に
有用なケミルミネセンス標識化化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セ
ロマチック（theromatic) アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニ
ウム塩及びオキサレートエステルである。

【００５０】 同様に、バイオルミネセンス化合物を、本発明の抗体を標識するために用いる
ことができる。バイオルミネセンスは、触媒タンパク質がケミルミネセンス反応
の効率を増加させる生物系において見い出されるケミルミネセンスの型である。
バイオルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することに
よって測定される。標識化の目的のための重要なバイオルミネセンス化合物は、
ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。

【００５１】 医薬調製物 ＰＫＢキナーゼ遺伝子発現もしくはＰＫＢキナーゼ活性、又はこれらに限らな
いがＰＩＰ３もしくはＰＫＢを含むいずれかの結合パートナーとのＰＫＢキナー
ゼの相互作用に作用すると測定された化合物は、患者に、癌を含む造血組織成長
異常を治療又は改善するために治療に有効な投与量で投与することができる。治
療に有効な投与量とは、このような異常の症状を緩和するのに十分な化合物の量
をいう。

【００５２】 有効投与量 これら化合物の毒性及び治療効能は、例えばＬＤ₅₀（その集団の５０％に致死
的な投与量）及びＥＤ₅₀（その集団の５０％に治療的に有効な投与量）を測定す
るための、細胞培養又は実験動物における標準的医薬手順により決定することが
できる。毒性及び治療効果の間の投与比は治療指数であり、それは、比ＬＤ₅₀／
ＥＤ₅₀として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性
副作用を示す化合物を用いることができるが、非感染細胞への潜在的損傷を最小
にし、それにより副作用を減少させるために、これら化合物を影響を受けている
組織の部位に標的化するデリバリーシステムをデザインすることに注意を払うべ
きである。

【００５３】 細胞培養アッセイ及び動物培養から得られたデータは、ヒトに用いるための所
定範囲の投与量を調剤するのに用いることができる。このような化合物の投与量
は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性がないＥＤ₅₀を含む範囲の循環濃度内に
ある。投与量は、用いる投与型及び利用する投与の経路によりこの範囲内で多様
であり得る。本発明の方法に用いるいずれかの化合物のために、治療に有効な投
与量は、細胞培養アッセイから最初に評価することができる。投与量は、細胞培
養において決定されるように、ＩＣ₅₀（即ち、症状の最大の半分の阻害を達成す
るテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルに
おいて調剤することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な投与量を
より正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高性
能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

【００５４】 調剤及び使用 本発明に従って用いるための医薬組成物は、１又は複数の生理的に許容される
担体又は賦形剤を用いて慣用的な方法で調剤することができる。 これにより、本化合物並びにそれらの生理的に許容される塩及び溶媒和物は、
吸入又は吹き込み（口又は鼻のいずれかを介する）により、又は経口、頬側、非
経口又は直腸投与による投与のために調剤することができる。

【００５５】 経口投与のために、医薬組成物は、医薬として許容される賦形剤、例えば結合
剤（例えばプレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セ
ルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム
、タルク又はシリカ）；分解剤（例えばポテトデンプン又はナトリウムデンプン
グリコレート）；又は潤滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）と共に、慣用的
手段により調製された、例えば錠剤又はカプセルの型をとり得る。錠剤は、当該
技術で公知の方法によってコートすることができる。経口投与のための液体調製
物は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとっても、それらは、使用前に
、水又は他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として供してもよい。こ
のような液体調製物は、医薬として許容される添加物、例えば懸濁剤（例えばソ
ルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂）；乳化剤（例えばレ
シチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油状エステル、
エチルアルコール又は分画した植物油）；及び防腐剤（例えばメチル又はプロピ
ル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）と共に、慣用的な手段によっ
て調製することができる。その調剤は、緩衝性塩、芳香剤、着色剤及び甘味剤も
、適切なら含み得る。

【００５６】 経口投与のための調剤は、適切には、活性成分の制御された放出を供するよう
に調剤することができる。 本化合物は、注入により、例えばボーラス注入又は連続注入による非経口投与
のために調剤することができる。注入のための製剤は、単位投与形態、例えばア
ンプル又は複数投与容器で、防腐剤を添加して供することができる。

【００５７】 以下の例は、本発明を詳述し、当業者がそれを作り用いるのを助けるために供
する。その例は、本特許による開示又は保護の範囲を限定することを意味するも
のではない。 実施例１ ＰＫＢキナーゼの精製 ＰＫＢキナーゼ活性を精製するために用いるアッセイは、１）３μｌの〔γ³² Ｐ〕−ＡＴＰ ５μCi；（アッセイ中１μＭ最終濃度）；２）１μｌのアッセイ
緩衝液（０．１Ｍ ＫＣｌ，５mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＥＧＡ，３０mM ＨＥＰ
ＥＳ，pH７．４，３０℃；６μｌアッセイ中最終濃度）；３）０．５μｌの（Ｅ
Ｅ）−ＰＫＢ（最終濃度２．５μＭ；ストックは１mM ＤＴＴ，１mM ＥＧＴＡ
を含むＰＢＳであり、次に１：１（ｖ／ｖ）でグリセロールと混合した；キナー
ゼはクローン化した組換えバキロウィルスを感染させたＳＦ９細胞から精製し、
そのタンパク質は（ＥＥ）−タグを介して精製し、その溶出したペプチドはゲル
ろ過により除去した）；４）Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ あり又はなしのホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミンを含む０．５μｌの脂質小胞（各々１００，１００，２０及び
１５μＭのアッセイ中最終濃度、その小胞は、脂質の乾燥フィルムを２５mM Ｈ
ＥＰＥＳ（pH７．４，３０℃）に音波処理することにより調製し、３日まで、４
℃で保存した）の混合物５μｌと混合した１μｌのカラム画分を含んだ（使用前
５分、一緒にし、氷上で保存）。アッセイは、３０℃で１２分、行い、４００μ
ｌの氷冷１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００，０．３Ｍ ＮａＣｌ，１０mM ＥＤＴ
Ａ，１mMピロリン酸ナトリウム、１０mM β−グリセロホスフェート、５０mMフ
ッ化ナトリウム、１mM ＥＧＴＡ，０．０１％アジド、２５mM ＨＥＰＥＳ pH
７．４を４℃で加え、次に３０μｌのα（ＥＥ）ビーズ（アッセイ当り４μｌの
充填化ビーズ；飽和量のα（ＥＥ）モノクローナル抗体に共有結合で架橋したプ
ロテインＧ−セファロース）を加えることにより停止させた。そのチューブを４
℃で２５分、混合し、次に上述の停止緩衝液で１回、洗い、各々のチューブの〔 ³² Ｐ〕含有量をガイガーカウンターで定量した。全〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰの最大４
０〜４５％がいずれかのアッセイにおいて消費されるように、カラム画分を希釈
した、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを、Ｂｉｏｓｉｌｅｃｔカラム（ＶＴ １１．６mls ，
ＢｉｏＲａｄ) で行った。３５〜４５μｌのサンプルを充填し、流速を４０μｌ
・ min^-1にし、８０μｌの画分を収集した。そのＳＥＣ緩衝液は、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ，２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４（４℃），０．５mM ＥＧＴＡ，０．
１mM ＥＤＴＡ，１％ベタイン、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．０１％ア
ジド、２mM β−グリセロホスフェート、１mM ＤＴＴ及びペプスタチンＡ、ロ
イペプチン、アプロチニン及びアンチパイン（全て２μｇ・ml^-1）を含んだ。

【００５８】 図１は、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート〔³² Ｐ〕−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 結合タンパク質のＰＫＢキナーゼ活性で
の同時精製、及びＰＫＢの最後の４つの明確な型が、同様の部分精製した調製物
の大規模型から解明することができたことを示す。全部で４つの活性は、Ｐｔｄ
Ｉｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 、又はＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ₂ （例えば（１−ス
テアロイル、２−アラキドニル）Ｓｎ−ホスファチジルＤ−ミオイノシトール（
３，４，５）−トリホスフェート：‘Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，
５）Ｐ₃ ’の生物学的立体異性体の存在下で（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ
Ｐ）リン酸化により判断して）ＰＫＢをリン酸化し、活性化する；図２Ａを参照
のこと。

【００５９】 結果は、精製されたキナーゼが、部分精製した活性と同様に、（ａ）これらの
脂質又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂ のエナンチオマーの存在下でＰＫＢに対し
て不活性であり；（ｂ）これらの脂質のジパルミトイル型より低い濃度のステア
ロイルアラキドニルで活性であり、そして（ｃ）Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ
（３，４，５）Ｐ₃ 及びグリセロール骨格中のキラル中心の配置において異なる
だけのジアステレオ異性体（即ちＤ−Ｌ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）
Ｐ₃ ）により等しく有効に活性化された。このことは、認識／相互作用は脂肪酸
の性質に依存するが、それは、水溶性ヘッドグループに関してそれらの正確な立
体化学により指図されないことを示唆する。

【００６０】 ＰＫＢリン酸化研究のために用いるのを同じアッセイ条件下で、我々は、ＰＫ
Ｂキナーゼ（図２Ｄ）及びＰＫＢ自体（図２Ｃ）の両方の脂質小胞との会合を、
これらのアッセイにおいて研究した。ＰＫＢ及びＰＫＢキナーゼの脂質小胞との
会合、並びにＰＫＢのリン酸化への異なる脂質の効果をアッセイするため、脂質
小胞を、乾燥フィルムを０．２Ｍスクロース；２０mM ＫＣｌ；２０mM ＨＥＰ
ＥＳ，pH７．４，３０℃；０．０１％アジド中に音波処理することにより調製し
て、アッセイで最終的に、２００μＭのホスファチジルコリン、１５０μＭのホ
スファチジルセリン、２０μＭのホスファチジルエタノールアミン、１０μＭの
スフィンゴミエリン＋示される濃度のイノシトールリン脂質を供した。これらを
、１mg・ml^-1 ＢＳＡ；０．１２Ｍ ＮａＣｌ；１mM ＥＧＴＡ；０．２mMカル
シウム；１．５mM ＭｇＣｌ₂ ；１mM ＤＴＴ；０．０１％アジド；５mM ＫＣ
ｌ；２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４，３０℃（約５０μＭの遊離カルシウム、全
てアッセイ中の最終濃度）を、〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（１μＭ最終濃度）及び（Ｅ
Ｅ）−ＰＫＢ（２．５μＭ最終濃度）と共に又はそれらなしで含むアッセイ緩衝
液中で関連するキナーゼと混合した。脂質小胞とのキナーゼの会合を評価するた
めにアッセイを行う場合、３０℃で４分後に、そのアッセイを遠心した（ａｉｒ
ｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ）最大速度で３０分）。その上清のアリコートをアッ
セイ又はイムノブロッティングのために除いた。そのペレットを迅速にアッセイ
緩衝液で洗い、再び遠心してＳＤＳ−サンプル緩衝液に溶かした。ＰＫＢのリン
酸化を本明細書に記載されるように定量した。

【００６１】 極めて低いモル濃度のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 立体異性体（Ｄ−Ｄ−
Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ について０．００３％）及びＤ−Ｄ−
Ｐ／Ｐ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ₂ を含む脂質小胞とＰＫＢキナーゼに会合し
たが、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂ 又はＬ−Ｌ−Ｐ／Ｐ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４
）Ｐ₂ ではそうでなかった。これは、ＰＫＢキナーゼが、〔³²Ｐ〕−ＰｔｄＩｎ
ｓ（３，４，５）Ｐ₃ と結合することができること、及びＴｈｒ３０８周辺のＰ
ＫＢの配列に基づく水溶性の３０−ｍｅｒペプチドのリン酸化がＰｔｄＩｎｓ（
３，４，５）Ｐ₃ 又はＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ₂ により劇的に阻害されること
（不図示）という観察結果と一致する。

【００６２】 同じアッセイ条件下で、ＰＫＢは、脂質小胞と会合することを示すことができ
た（図２Ｃ）。しかしながら、転移を検出するために実質的により高濃度の３−
リン酸化脂質が要求され、それは、３−リン酸化脂質への結合について、ＰＫＢ
キナーゼのそれと異なる特異性を示したが、ＰＫＢのリン酸化のものと極めて類
似するものであることを示した（図２Ｂ及びＣの比較）。これは、いくつかのこ
と；１）２つのキナーゼの脂質結合特性が全く異なること、２）リン酸化の特異
性がＰＫＢの補充によってかなり指図されること（即ちＰＫＢのＰＨドメインの
アフィニティー及び特異性）、３）ＰＫＢの比較的小さな割合だけが、おそらく
、ＰＫＢキナーゼの大部分を会合させる活性な脂質の濃度で小胞と会合すること
、及び従って４）ＰＫＢのリン酸化へのＰＫＢキナーゼの転移の相対的に最も大
きな効果は、低めて低濃度のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ で存在し、より高
レベルでは、ＰＫＢの転位は主要な要因になることを意味する。

【００６３】 ＰＫＢキナーゼＡの調製物をニトロセルロース上にウェスタン・ブロットし、
その場でトリプシン処理した。その遊離させたペプチドをＮ末端配列決定及び質
量分析による分析にかけた。L.R. Stephens ら、Cell 89, 105-114 (1997) を参
照のこと。４つのペプチドを規定し、データベースを調査するために用い；ヒト
ＥＳＴ配列のファミリーが同定された（ＴＩＧＲ：ＴＨＣ１９３５７０）。（読
み枠を固定するための）ペプチド配列の組み合わせての使用並びにＥＳＴクロー
ン及びヒトＵ９３７細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡの更なる配
列決定からの情報は、ｃＤＮＡを、（種の差を許容する）全部で４つのペプチド
を含み、５５kdと予想される分子量のタンパク質をコードする最小オープン読み
枠であると規定した（図３）。この予想されるタンパク質はＮＨ₂ 末端プロテイ
ンキナーゼドメイン及びＣＯＯＨ末端ＰＨドメインを含む（図３）。

【００６４】 ＰＫＢ遺伝子に関するヒト及びマウスＥＳＴ配列がＴＩＧＲデータベースで見
い出すことができた（ＴＨＣ：１９３５７０）。ＰＫＢキナーゼをコードする更
なるｃＤＮＡを、ヒトＵ９３７細胞オリゴｄＴ−プライムドライブラリー（λＺ
ＡＰII：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ内）及びラット脳オリゴｄＴ／ランダムプライム
ドライブラリー（Ｕｎｉ ＺＡＰＸＲ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ内）を、ＩＭＡＧ
Ｅクローン５２６５８３由来の〔³²Ｐ〕標識化０．３kb ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
III フラグメントでスクリーニングすることにより同定した。陽性プラークを同
定し、精製し、そしてそのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ登録商標ベースの
プラスミドとして切り出した。ＤＮＡ配列決定は、Babraham Institute Microch
emical Facility によりＡＢＩ自動シーケンサーで行った。

【００６５】 実施例２ ＰＫＢキナーゼｃＤＮＡの同定 データベース内のゲノム配列情報を用いて、我々は、正確な染色体局在化（ヒ
ト染色体１６ｐ １３．３；（T.C. Bunn ら、Genome Research 6, 525-537 (19
96) を参照のこと））及び全てではないがいくつかのＰＫＢキナーゼのイントロ
ン／エキソン境界を規定することができた。この情報から、及びいくつかのｃＤ
ＮＡの配列決定から、この座が交互にスプライシングする転写物の複雑なパター
ンを生ずることが明らかである。我々のＵ９３７細胞ライブラリーから同定され
た１つの転写物は、それがプロテインキナーゼドメインの基質認識モチーフ１残
基：１８８〜２１３；我々のペプチド配列データは、我々の精製した酵素がこの
モチーフを含んでいることを明確に示す、図３）をコードするエキソンを失って
いることを除いて図３に示すＯＲＦに正確に等しい。我々は、このｃＤＮＡを、
ＰＫＢキナーゼのキナーゼ−コンプロミスト型を作るのに利用した（以下を参照
のこと）。

【００６６】 我々は、等価の遺伝子座から明らかに生ずるが、図３に示す潜在的なＯＲＦに
広がり約６５kdのタンパク質をコードするラット脳ｃＤＮＡライブラリーから更
なるｃＤＮＡクローンを同定した。交互のスプライシング及び開始コドン利用は
、この遺伝子座からＰＫＢキナーゼの１超の異型を作り出す原因であろうと思わ
れる（注意：図３に示すほとんどのＮ末端ＰＫＢキナーゼＡペプチドは、示され
る予想されるＯＲＦから分岐しており、これは、おそらく、この酵素のトランケ
ート型がスプライシングによって作ることができることを示す）。更なるデータ
ベースサーチは、ドロソフィア（Drosophila) における未知の機能の近い相同体
も同定した（Ｅｍｂｌ；ＹＤ７９０８）。K. Salimら（EMBO J. 15, 6241-6250
(1996)を参照のこと）。

【００６７】 実施例３ ＰＫＢキナーゼの発現 我々は、５５kd ＰＫＢキナーゼ及びその‘キナーゼ−コンプロミスト’スプ
ライス変異体のＮ末端にＥＥ標識した型をコードする哺乳動物発現ベクターを作
製した。図３に示すＯＲＦを、標準的ＰＣＲベースのクローニングストラテジー
を用いることにより、ｐＣＭＶ３転移発現ベクター（L.R. Stephens ら、Cell 8
9, 105-114 (1997) を参照のこと）内のＮ末端ＥＥ−タグと共に枠内に置いた。
残基１８８〜２１３についてのヌクレオチドコーディングを欠損するｃＤＮＡを
用いた型も作製した（これは、ＩＭＡＧＥクローン５１０９８２及び５２６５８
３を用いて作った；‘キナーゼ−コンプロミストスプライス変異体’として本明
細書に言及される）。全ての作製物は、配列決定により確認した。これらのタン
パク質をｃｏｓ−７細胞内で発現させ、それから精製した（L.R. Stephens ら、
Cell 89, 105-114 (1997) 、図４を参照のこと）。完全なプロテインキナーゼド
メインを有するタンパク質は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ −センシティブ
様式にＰＫＢをリン酸化し、このことは、この活性が図３に示すＯＲＦ内にある
ことを示す。

【００６８】 要約すると、タンパク質は、それらの（ＥＥ）−タグを介して精製しＬｍｙｃ
抗体を対照として用いた）、アリコートをウェスタン・ブロットした。次に、α
（ＥＥ）モノクローナル抗体でプローブしたＰＶＤＦフィルター（ＥＣＬにより
検出；右上パネル）をクーマシーブルーで染色した（左上パネル；示すデータは
（ＥＥ）−IIのみについてのものであり；（ＥＥ）−Ｉでも同様の結果が得られ
た）。アリコートを、Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 、及び
〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（３００mM；各々３μＭ及び１μＭ最終濃度）あり又はなし
で脂質小胞の存在下でＰＫＢキナーゼ活性についてアッセイした。オートラジオ
グラムの写真はＰＫＢ中の〔³²Ｐ〕を示す。

【００６９】 実施例４ ＰＫＢキナーゼインヒビターの同定及び使用 ＰＫＢはＰＩＰ３経路において重要な酵素であり、細胞成長の制御に関する。
それは特定のヒト癌に関連しており；即ち、卵巣癌、乳癌、及び膵臓癌の割合に
おいて増幅されていることが知られている。Bellacosa, Aら（1995) Int. J. Ca
ncer 64 、ページ 280-288、及びCheng, J.Q. ら（1996) Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. vol. 93, 3636-3641を参照のこと。酵素の増幅は、腫瘍細胞に、アポ
トーシスを回避するメカニズムを供する。これにより、ＰＫＢ活性を阻害する薬
剤が癌を含む、不要な細胞増殖に関する病気の治療のために有益であろうことが
認められよう。この目的を達成するための１つの方法は、ＰＫＢキナーゼへの化
合物の効果を測定するアッセイを開発することである。

【００７０】 ＰＫＢキナーゼインヒビターの同定は、ＰＫＢキナーゼ活性のＰＩＰ３活性化
を阻害する化合物についてアッセイすることにより行うことができる。これは、
化合物の存在及び欠如下でＰＫＢリン酸化を測定することによって行われよう。
そのアッセイは、上述の通り、又はStokoe, D ら（1997) Science, vol. 277 、
ページ 567-570の通り行うことができる。例えば、実施例３に記載のアッセイを
用いて、５５kd ＰＫＢキナーゼの末端にＥＥ−タグを付した型は、ＰＩＰ３、
ＡＴＰ再生システム、好ましくは５mM ＭｇＣｌ₂ ，２mM ＡＴＰ，１０mMクレ
アチンリン酸、クレアチンキナーゼ（５０μｇ／ml）、１％ＮＰ−４０からなる
もの、及びＰＫＢ、又は他の適切な基質と共にインキュベートされよう。適切な
時間の後、ＰＫＢは免疫沈降させて、リン酸化の量を決定することができる。

【００７１】 本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるも
のではなく、その例は、本発明の個々の態様のうちの一例として示したものであ
り、機能的に等価な方法及び構成物も本発明の範囲内にある。実際、本明細書に
記載され、示されるものに加えて、本発明の種々の改良が、先の記載及び添付の
図面から当業者に明らかになるであろう。このような改良は、添付の請求の範囲
内に含まれることを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒツジ脳からのＰＫＢキナーゼの精製 Ａ．流れ図は、ヒツジ脳サイトソルからのＰＫＢキナーゼＡ−Ｄの精製を要約
し、各々のステップを介して保たれるタンパク質の量を記録する。最初のサイト
ソル画分からの活性の全体の回収率は１５．５％であった。 Ｂ．図は、全てＰＫＢキナーゼＡ−Ｄの精製におけるＨＰＬＣサイズ排除カラ
ム（ＳＥＣ）である最終的なカラムからのタンパク質の溶出を分析する。Ａｂｓ
２８０nm，ＰＫＢキナーゼ活性プロフィール及びクーマシー染色したＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルを示す。ＨＰＬＣ−ＳＥＣは、Ｂｉｏｓｉｌｅｃｔカラム（ＶＴ １
１．６mls ，ＢｉｏＲａｄ）で行った。３５〜４５μｌサンプルを充填し、その
流速は４０μｌ／分であり、８０μｌ画分を収集した。ＳＥＣ緩衝液は、０．１
５Ｍ ＮａＣｌ，２０mM ＨＥＰＥＳ pH７．４，４０℃，０．５mM ＥＧＴＡ
，０．１mM ＥＤＴＡ，１％ベタイン、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．０
１％アジド、２mM β−グリセロホスフェート、１mM ＤＴＴ及びペプスタチン
Ａ、ロイペプチン、アプロチニン及びアンチパン（全て２μｇ／ml）を含んだ。 ＰＫＢキナーゼＡ〜Ｄのネイティブサイズは、各々５８，５８，６８及び５４
kDであると評価され、それらのＳＤＳ変性サイズは各々５７，５７，７０及び５
５kDであると評価された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に移動した２２０，９７．６９
，４６及び３１kD標準の位置を示す）。 Ｃ．ＰＫＢキナーゼ活性の〔³²Ｐ〕−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 結合タ
ンパク質との同時精製。ＰＫＢキナーゼの部分精製した調製物をＳＥＣにかけ、
画分を、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 依存性ＰＫＢキナーゼ活性（底のパネ
ル）、〔³²Ｐ〕−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 結合タンパク質（中のパネル
、〔³²Ｐ〕−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ での再生ウェスタンブロットをプ
ロービングすることによる、（１８））及び（Ｃ）ＳＤＳ変性タンパク質（上の
パネル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色することによる）について分析した。 〔³²Ｐ〕−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 結合を、タンパク質をニトロセル
ロース上にウェスタンブロットする（サンプルはＳＤＳサンプル緩衝液と共に５
０℃に加熱しただけである）ことによりアッセイした。そのフィルターを１％Ｎ
Ｐ４０，１mM ＥＤＴＡ，０．０１％アジドを含むＰＢＳ中で１２時間、４℃で
インキュベートした。そのフィルターを３０分（室温）、０．１％コレート、５
０μｇ・ｍ^-1ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリン、１mM ＭｇＣｌ ₂ 及び１mM ＤＴＴを更に含む上述の溶液中でブロックした。（組換えｐ１０１
／ｐ１２０−Ｐ１３Ｋ，ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂ 及び〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（
L.R. Stephans ら、Cell 89, 105-114 (1997) を参照）から調製した）〔³²Ｐ〕
−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ をブロック溶液（１０ml中１０μCi）内に音
波処理し、２０分（室温）、ブロックフィルターに適用し、次に新しいブロック
溶液（５×５分超）、最後に１％ＮＰ４０を含むＰＢＳで洗い落とした。そのフ
ィルターを空気乾燥させてオートラジオグラフィーを撮った。

【図２】 ＰＫＢキナーゼＡ〜Ｄのキャラクタリゼーション Ａ．精製したＰＫＢキナーゼはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 依存性であり 、ＰＫＢを活性化する アッセイを２段階で行った。第１段階は、Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３
，４，５）Ｐ₃ （最終濃度５μＭ）あり又はなしで、ＰＫＢキナーゼＡ（６nM）
、野生型（ＥＥ）−ＰＫＢ（２．５μＭ）又はＴ３０８Ａ／Ｓ４７３Ａ−（ＥＥ
）−ＰＫＢ）及び〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（５０μＭ）の存在又は欠如下で混合脂質
小胞で行った。そのアッセイを停止し、ＰＫＢタンパク質をα（ＥＥ）−ビーズ
で免疫沈降させ、洗浄し、次に〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（１０μＭ）及びシエリン塩
基性タンパク質（ＭＢＰ；７μＭ）と共にインキュベートして固定されたＰＫＢ
の活性を測定した。結果は一回の実験からのものであり、平均±ＳＥ（ｎ＝３〜
５）として示す；４つの更なる実験も同様の結果を供した。ＰＫＢキナーゼＢ，
Ｃ及びＤは極めて類似した結果を供した。 Ｂ．ＰＫＢリン酸化の活性化のリン脂質特異性 アッセイは、示される濃度のイノシトールリン脂質、（ＥＥ）−ＰＫＢ（２．
５μＭ）、ＰＫＢキナーゼＡ（５mM）及び〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（１μＭ、全量１
２μｌ）を含む一定濃度の混合脂質小胞を含んだ。示されるデータは、１２の別
個の実験からプールし、平均したものである（ｎ＝３〜６、それらの平均ＳＥは
６％であった）。活性化の同一パターンがＰＫＢキナーゼＢ，Ｃ及びＤについて
観察された。 ＰＫＢ及びＰＫＢキナーゼの脂質小胞との会合及び異なる脂質の、ＰＫＢのリ
ン酸化への効果をアッセイするために、脂質小胞を、乾燥脂質フィルムを０．２
Ｍスクロース；２０mM ＫＣｌ；２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４，３０℃；０．
０１％アジドを音波処理することにより調製し、２００μＭホスファチジルコリ
ン、１５０μＭホスファチジルセリン、２０μＭホスファチジルエタノールアミ
ン、１０μＭスフィンゴミエリン＋示される濃度のイノシトールリン脂質をアッ
セイの最後に供した。これらを、１mg・ml^-1 ＢＳＡ；０．１２Ｍ ＮａＣｌ；
１mM ＥＧＴＡ；０．２mMカルシウム；１．５mM ＭｇＣｌ₂ ；１mM ＤＴＴ；
０．０１％アジド；５mM ＫＣｌ；２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４，３０℃（約
５０nM遊離カルシウム、全てアッセイの最終濃度）を含むアッセイ緩衝液中で、
〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ（１μＭ最終濃度）及び（ＥＥ）−ＰＫＢ（２．５μＭ最終
濃度）あり又はなしで関連するキナーゼと混合した。そのアッセイを、脂質小胞
とのキナーゼの会合を評価するなら、３０℃で４分後、そのアッセイを遠心（Ａ
ｉｒｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、最大速度で３０分）した。その上清のアリコ
ートをアッセイ又はイムノブロッティングのために除去した。そのペレットを迅
速にアッセイ緩衝液で洗い、再び遠心してＳＤＳサンプル緩衝液に溶かした。Ｐ
ＫＢのリン酸化を上述の通り定量した。 Ｃ．ＰＫＢの脂質小胞との会合 （ＥＥ）−ＰＫＢ（４０nM) を、先のＢ部のものと同様の条件下でスクロース
を充填した脂質小胞（又はそれらの小胞）と共にインキュベートした。４分後に
、その小胞を遠心によりペレット状にし、上清及びペレット中のＰＫＢの量を、
α−（ＥＥ）モノクローナル抗体でイムノブロッティングすることにより定量し
た。インセットイムノブロットは、Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５
）Ｐ₃ での実験の結果を示す（１６μＭのアッセイ中最大濃度、A. Toker, L.C.
Cantley, Nature 386, 673-67642 (1997)を参照のこと）。示されるデータは、
全部で７つの独立した実験からプールし、平均を示す（ｎ＝２〜３、これらの平
均についての平均範囲は１１．０％であった）。 Ｄ．ＰＫＢキナーゼの脂質小胞との会合 ＰＫＢキナーゼＡ（５nM）を、図２Ｂに示すように、種々の濃度のイノシトー
ルリン脂質を含むスクロース充填小胞（又はそれらの小胞のみ）と混合した。３
０℃で４分後に、その小胞を遠心によりペレット状にし、その上清のアリコート
を、５μＭ Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ の存在下でＰＫ
Ｂキナーゼ活性についてアッセイした。全活性の平均８．２％を、イノシトール
リン脂質を加えない脂質小胞の存在下で沈降させ、イノシトール脂質を加えてい
ない脂質小胞を遠心の後に上清中に残った活性を、他の処理に対する１００％値
と定義した。示されるデータは、平均（ｎ＝４〜６，１６の別個の実験からのプ
ール、平均ＳＥは８％であった）。

【図３】 ＰＫＢキナーゼの一次構造 我々のヒトＵ９３７細胞ライブラリーから単離したｃＤＮＡにより規定される
最小の潜在的なＯＲＦを示す。ヒツジ脳ＰＫＢキナーゼＡ由来の４つのペプチド
配列を配列上にボールドで示す。他のプロテインキナーゼ触媒ドメインと相同な
領域は連続線内にボックスで示す。他のＰＨ−ドメインと相同な領域は点線でボ
ックスで示す。

【図４】 ｃｏｓ−７細胞におけるＰＫＢキナーゼの発現 図３に示すＰＫＢキナーゼオープン読み枠のＮＨ₂ 末端タグ化型を含む哺乳動
物発現ベクター（（ＥＥ）−IIは完全なＯＲＦをいい、（ＥＥ）−Ｉは‘キナー
ゼコンプロミスト’スプライス変異体という）をｃｏｓ−７細胞内で一時的に発
現させた。タンパク質を、それらの（ＥＥ）−タグを介して精製し（ｍｙｃ抗体
を対照として用いた）、アリコートをウェスタン・ブロットした。次にα（ＥＥ
）モノクローナル抗体でプロービングしたＰＶＤＦフィルター（ＥＣＬにより検
出；右上パネル）を、クーマシーブルーで染色した（左上パネル；示すデータは
（ＥＥ）−IIのみであり、（ＥＥ）−Ｉでも同じ結果が得られた）。アリコート
を、Ｄ−Ｄ−Ｓ／Ａ−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ₃ 及び〔γ³²Ｐ〕−ＡＴＰ
（３６０nM；各々３μＭ及び１μＭ最終濃度）あり又はなしで脂質小胞の存在下
でＰＫＢキナーゼ活性についてアッセイした。オートラジオグラムの写真はＰＫ
Ｂ中の〔³²Ｐ〕を示す。

【図５】 ＰＫＢキナーゼのｃＤＮＡ（配列番号：１）及びコードされたアミノ酸配列を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ストコー，デビット アメリカ合衆国，カリフォルニア 94706, バークレー，ギルマン ストリート 1221 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA10 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA12 4B050 CC03 CC10 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ02 QQ26 QR07 QR42 QR84 QS28 QX07 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 CA29 CA44 CA46 4C084 AA16 BA35 ZB262 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA28 EA51 FA74 【要約の続き】

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＰＫＢキナーゼ活性をコードするヌクレオチド配列を含む単
   離された核酸分子。
2. 【請求項２】 異種ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に融
   合された請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むキメラタンパク質をコードす
   る単離されたヌクレオチド配列。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベク
   ター。
4. 【請求項４】 宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオ
   チド調節配列と作用的に結合した請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む発現
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むように遺伝子的に
   工作されている宿主細胞。
6. 【請求項６】 宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオ
   チド調節配列と作用的に結合した請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むよう
   遺伝子的に工作されている宿主細胞。
7. 【請求項７】 ＰＫＢキナーゼに免疫特異的に結合する抗体。
8. 【請求項８】 哺乳動物のゲノム内に含まれるＰＫＢキナーゼ変異を検出す
   ることを含む哺乳動物において病気を診断するための方法。
9. 【請求項９】 細胞成長異常の治療のために役立つ化合物をスクリーニング
   するための方法であって、 溶液中で、化合物、活性化ＰＫＢキナーゼ、ＰＫＢキナーゼのための基質、Ａ
   ＴＰ再生システム、ＰＫＢ活性化剤を組み合わせるステップと、 前記化合物の存在又は欠如下で、ＡＴＰからＰＴＢキナーゼ基質へのホスフェ
   ートの転移についてアッセイするステップと、 を含む方法。
10. 【請求項１０】 前記ＰＫＢ活性化剤がＰＩＰ３であることを特徴とする請
    求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 哺乳動物において細胞成長異常を治療するための方法であ
    って、請求項１０で同定された化合物を、哺乳動物に、ＰＫＢ活性を阻害するの
    に十分な量で投与することを含む方法。
12. 【請求項１２】 溶液中で、前記ＰＫＢキナーゼを、ＰＩＰ３と一緒にイン
    キュベートすることを含むＰＫＢキナーゼを活性化するための方法。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の方法により同定される化合物。
14. 【請求項１４】 単離されたＰＫＢキナーゼ。
15. 【請求項１５】 配列番号：１を含む単離されたＰＫＢキナーゼ。