ES2271649T3 - Compuesto antitumoral y usos terapeuticos del mismo. - Google Patents

Abstract

El uso del compuesto (E)¿1, 3¿dihidro¿5, 6¿dimetoxi¿3¿[(4¿ hidroxifenil)metileno]¿2H¿indol¿2¿ona o de sales o isómeros no tóxicos del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores que implican una tirosina quinasa seleccionada de las oncoproteínas Met, PDGF¿R, FGF¿R1, FGF¿R3, Kit o RET, incluyendo

Description

Compuesto antitumoral y usos terapeuticos del mismo.

La presente invención se refiere al uso del compuesto (E)-1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona en el tratamiento de tumores que implican tirosina quinasas Met, PDGF-R, FGF-R1, FGF-R3 y Kit, u oncoproteínas Ret.

Antecedentes de la técnica

Los oncogenes RET/PTC están implicados en los procedimientos de transformación de tumores papilares de tiroides humanos y tienen su origen en la retransposición del dominio de tirosina quinasa de proto-RET con genes donantes diferentes. Los productos de tales retransposiciones de genes muestran actividad tirosina-quinasa independiente del ligando y se localizan en el citoplasma. Ret/ptc 1 es el producto del oncogen RET/PTC1, que se origina en la retransposición del dominio de tirosina quinasa de proto-RET con el gen H4/D10S170.

El documento Int. J. Cancer 85, 384-390 (2000) reseña la inhibición de actividad tirosina quinasa de la oncoproteína Ret/ptc1 por medio de compuestos de ariliden-2-indolinona. El derivado 1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona (en lo sucesivo "Cpd 1") se indica como particularmente efectivo para revertir el fenotipo morfológico de células NIH3T3 transformadas con el oncogen RET/PTC1. En el mismo documento, se propone la inhibición de tirosina quinasa por medio decompuestos de ariliden-2-indolinona para el estudio de señalización por Ret y para controlar la proliferación celular en enfermedades relacionadas con Ret y Ret/ptc.

El documento US6268391 describe inhibidores de tirosina quinasa relacionados estructuralmente con Cpd 1.

Descripción de la invención

Actualmente se ha descubierto que Cpd 1 inhibe de forma efectiva tirosina quinasas, distintas a Ret/pctl, que desempeñan una función importante en la aparición, progresión y diseminación de tumores en órganos distantes. De forma específica, Cpd1 ha demostrado inhibir completamente la autofosforilación de tirosina quinasas Ret/MEN2A (mutaciones C634R y C634W), Ret/MEN2B (mutM918T), Met, PDGF-R, FGF-R1, FGF-R3 y Kit (c-Kit y mut\Delta559), para reducir su expresión (regulación hacia abajo) y para revertir el fenotipo de células transformadas de ese modo.

Por tanto, el objeto de la invención es el uso del compuesto (E)-1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona, o de sus sales con bases farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento de tumores que implican al menos una de las tirosina quinasas Met, PDGF-R, FGF-R1, FGF-R3 y Kit, incluyendo receptores Ret que llevan mutaciones relacionadas con MEN2, en las etapas iniciales de transformación celular o en las etapas siguientes de proliferación y diseminación tumoral.

La invención también se refiere al uso de cualquier estereoisómero o forma tautomérica de Cpd1.

La inhibición de receptores Ret desregulados, constitutivamente activos, es útil para el tratamiento de carcinomas medulares de tiroides (MTC) y enfermedades relacionadas con MEN2 esporádicas, que incluyen feocromocitoma, hiperplasia paratiroidea y ganglioneuromas entéricos.

La inhibición de Met es útil para antagonizar el fenotipo invasivo/metastático de tumores con origen epitelial. En lo que se refiere a alteraciones que activan Met, Cpd 1 también puede tener una indicación específica en la terapia de tumores renales.

La inhibición de Kit es útil para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, carcinomas pulmonares de células pequeñas, seminomas y malignidades hematológicas, tales como mastocitosis y leucemia mielógena aguda.

La activación incontrolada de PDGF-R y su implicación en bucles autocrinos respaldan el uso de Cpd 1 en tumores que no responden a terapias convencionales, tales como glioma y dermatofibrosarcoma protuberans. Además, PDGF-R está implicado en angiogénesis tumoral y desarrollo vascular, respaldando así el uso de Cpd1 para el control y neoangiogénesis en tumores sólidos.

Cpd 1 se puede usar para el tratamiento de melanomas y gliomas que expresan niveles elevados de FGF-R1 y del ligando bFGF respectivo implicado finalmente en bucles autocrinos. Como este receptor tiene una función importante en procedimientos angiogénicos, su inhibición por medio de Cpd 1 es útil para controlar la vascularización tumoral.

La inhibición de FGF-R3 es útil para el tratamiento de mieloma múltiple, carcinomas de vejiga y de cuello uterino.

RPI-1 y sus sales se pueden formular con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables, para uso en terapia. La función fenol de Cpd 1 se puede salificar mediante el tratamiento con bases orgánicas o inorgánicas adecuadas. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral, parenteral, sublingual o transdérmica, preferiblemente en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes, soluciones, suspensiones, supositorios, formas de liberación controlada.

Las composiciones se pueden preparar mediante técnicas convencionales, usando ingredientes conocidos en la técnica. La cantidad de principio activo puede variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad, edad del paciente, tipo y vía de administración, pero en general, se usa una cantidad de 0,1 mg/kg a 1.000 mg/kg, preferiblemente de 5 mg/kg a 300 mg/kg, más

\hbox{preferiblemente de 20 mg/kg a 200 mg/kg, en dosis únicas
o múltiples, una o más veces al día.}

Descripción detallada de la invención

Las oncoproteínas Ret que llevan sustituciones aminoácidas que provocan actividad tirosina quinasa constitutiva están implicadas en MTC esporádicos y en los síndromes de Neoplasia Endocrina Múltiple de tipo 2 hereditaria (MEN2A, MEN2B y MTC familiar), caracterizados todos por la aparición de MTC (Jhiang S. M. y col. Oncogene 19, 5590, 2000). Mientras que las mutaciones RET son somáticas en MTC esporádicos, en pacientes con MEN2 las mutaciones RET están presentes a nivel de línea germinal. Estas mutaciones provocan activación constitutiva del receptor sin modificar su localización en la membrana celular. Las oncoproteínas Ret usadas en este estudio implican Cys634 (indicado como Ret/MEN2A^{C634R} y Ret/MEN2A^{C634W}) o Met 918 (indicado como Ret/MEN2B^{M918T}) y representan las oncoproteínas Ret expresadas con más frecuencia en MEN2A y MEN2B, respectivamente. El efecto inhibidor de Cpd 1 se ha demostrado en células murinas transfectadas con el gen RET/MEN2A(C634R) (células NIH3T3^{MEN2A(C634R)}) y en las líneas celulares TT y MZ-CRC-1 del carcinoma medular de tiroides humano, caracterizadas respectivamente por la expresión de Ret/MEN2A(C634W) y Ret/MEN2B(M918T) (Figuras 1, 2). Se observa una reducción de fosforilación de tirosina y expresión de la oncoproteína en estas líneas celulares (Figuras 1C y 2A). La inhibición de autofosforilación del receptor Ret/MEN2A y Ret/MEN2B por Cpd 1 está relacionada con un efecto antiproliferativo (Figuras 1B y 2B). Los transfectantes NIH3T3^{MEN2A(C634R)} revirtieron su fenotipo transformado después de la exposición a Cpd1 (Figura 1A). Se ha observado una actividad antitumoral dependiente de dosis importante en ratones desnudos xenotransplantados con el tumor TT: después de la administración por vía oral de una dosis diaria de 50-100 mg/kg (dos veces al día), el tratamiento de Cpd 1 alcanzó el 80% de inhibición del peso tumoral (TWI) sin inducir toxicidad (Fig. 3). La eficacia farmacológica y bioquímica demostrada de Cpd 1 para controlar la proliferación de células MTC es particularmente importante tendiendo en cuenta la agresividad de tales tumores y la ineficacia de terapias convencionales.

Met, el receptor del factor de crecimiento del hepatocito, es una proteína tirosina quinasa implicada en el procedimiento de invasión característico de la progresión del tumor y crecimiento metastático (Maulik G. y col Cytok. Growth Factor Rev. 13, 41, 2000). Las alteraciones tales como mutaciones, sobreexpresión o la implicación en bucles autocrinos son la causa de la activación constitutiva incontrolada de la quinasa. La actividad quinasa incontrolada de Met está implicada en la invasividad de muchos tumores de origen epitelial. Met se sobreexpresa con frecuencia en carcinomas papilares de tiroides. Los resultados ilustrados en la Figura 4 muestran una inhibición dependiente de dosis de autofosforilación de Met en la línea celular TPC1 del carcinoma papilar de tiroides tratada con Cpd1. Los niveles de la proteína Met también se reducen en las células tratadas.

Otras tirosina quinasas receptoras, tales como PDGF-R (Rosenkranz S. y Kazlauskas A. Growth Factors 16, 201, 1999) y FGF-R1 (Powers C. J. y col. Endocr. Rel. Cancer 7, 165, 2000), que están implicadas en bucles autocrinos o en procedimientos neoangiogénicos, desempeñan una función importante en el crecimiento del cáncer. Se observa una actividad desregulada de estos receptores en tumores que no responden a terapias convencionales, tales como gliomas y melanomas. Los resultados ilustrados en las Figuras 5 y 6 muestran una inhibición dependiente de dosis en Cpd 1 de autofosforilación del receptor inducida por estimulación autocrina (Figura 5A) o por ligando exógeno (Figuras 5B y 6A). Estos efectos están relacionados con una expresión reducida del receptor. Las concentraciones de Cpd 1 superiores a 15 \muM provocan la inhibición completa de fosforilación de PDGF-R.

Las mutaciones de activación del receptor tirosina quinasa FGF-R3, tales como traslocaciones cromosomales o mutaciones puntuales producen receptores FGF-R3 desregulados, constitutivamente activos, que han estado implicados en mieloma múltiple y en carcinomas de vejiga y de cuello uterino (Powers C. J. y col. Endocr. Rel. Cancer 7, 165, 2000). En la Figura 6B se ilustra la capacidad de Cpd 1 para regular hacia abajo tanto la autofosforilación de tirosina como la expresión de FGF-R3 (mutY373C) expresado exógenamente en transfectantes NIH3T3.

La tirosina quinasa Kit se activa constitutivamente como consecuencia de mutaciones o de su implicación en bucles autocrinos en tumores diferentes, tales como cánceres pulmonares de células pequeñas, tumores estromales gastrointestinales, seminomas y leucemias (Heinrich M. C. y col. J. Clin. Oncol. 20, 1692, 2002). Como se muestra en la Figura 7, Cpd 1 inhibe la autofosforilación constitutiva y expresión del mutante Kit (\Delta559) expresado exógenamente en células NIH3T3 (Figura 7B). Tal inhibición se relaciona con la reversión del fenotipo morfológico transformado de las células transfectadas (Figura 7A). Además, la Figura 7C muestra la inhibición dependiente de dosis en Cpd 1 de c-Kit activado a través del bucle autocrino en la línea celular N592 del carcinoma pulmonar de células pequeñas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el témino "tumor" pretende abarcar la proliferación celular anormal de células malignas o no malignas de diversos tejidos y/o órganos tales como músculo, hueso o tejido conectivo, la piel, cerebro, pulmones, órganos sexuales, los sistemas linfáticos o renales, células mamarias o sanguíneas, hígado, el sistema digestivo, páncreas y glándulas tiroides o suprarrenales. La proliferación celular anormal puede incluir tumores del ovario, pecho, cerebro, próstata, colon, hígado, pulmón, ovario, útero, cuello uterino, páncreas, tracto gastrointestinal, cabeza, cuello, nasofaringe, piel, vejiga, estómago, riñón o testículos, sarcoma de Kaposi, colangiocarcinoma, coriocarcinoma, neuroblastoma, tumor de Wilm, enfermedad de Hodgkin, melanoma, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica y linfoma granulocítico crónico o agudo.

Los compuestos de acuerdo con la presente invención se pueden administrar solos o junto con otros agentes antitumorales o anticáncer, entre los que se incluye adriamicina, daunomicina, metotrexato, vincristina, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, 5-FU, hexametilmelamina, carboplatino, cisplatino, idarubicina, paclitaxel, docetaxel, topotecán, irinotecam, gemcitabina, L_PAM, BCNU y VP-16. Los compuestos de acuerdo con la presente invención también pueden incluirse en un kit para el tratamiento de tumores.

El kit puede incluir agentes anticánceres o antitumorales adicionales.

Las siguientes Figuras ilustran la invención en mayor detalle.

Descripción de las Figuras

Figura 1. Efectos de Cpd 1 sobre los transfectantes NIH3T3^{MEN2A(C634R)} que expresan RET/MEN2A(C634R) exógeno. A) Reversión del fenotipo morfológico transformado de células NIH3T3^{MEN2A(C634R)}. Se expusieron las células a 6 \muM de Cpd1 durante 24 h. y después se fotografiaron en un microscopio de contraste de fase (magnificación original X 100). B) Efecto antiproliferativo. Se trataron células NIH3T3^{MEN2A(C634R)} y las células parentales NIH3T3 con concentraciones en aumento del fármaco durante 72 h. y después se contaron con un Contador Coulter. Las curvas de respuesta de dosis, a partir de las cuales se calcularon los valores reseñados CI_{50}, mostraron la sensibilidad más elevada al fármaco de la línea celular de la positiva de la oncoproteína Ret. C) Inhibición de autofosforilación y expresión de Ret/MEN2A(C634R). Se trataron las células con solvente (-) ó 10 \muM de Cpd1 (+), durante los tiempos indicados. Se prepararon lisatos de células enteras y se sometieron a SDS-PAGE y transferencia de Western con anticuerpo anti-pTyr. Después de depurar, se secó el filtro con anticuerpo anti-Ret. Las flechas indican las formas glicosiladas parcial y completamente del receptor Ret/MEN2A. Después de 2 h. de exposición al fármaco, el receptor apareció parcialmente desfosforilado. En tiempos superiores, una desfosforilación de tirosina completa se relacionó con una expresión reducida del receptor.

Figura 2. Efectos de Cpd 1 sobre líneas celulares de MTC humano que contienen mutantes RET asociados a MEN2. A) Inhibición de autofosforilación de Ret. Se trataron células TT y MZ-CRC-1, que expresan respectivamente RET/MEN2A(C634W) y RET/MEN2B (M918T) con las concentraciones indicadas de Cpd1, durante 24 h. Las células de control (C) recibieron el solvente. Se procesaron los extractos de células enteras para transferencia de Western y se sondearon con anticuerpos anti-pTyr y anti-Ret. Como se demuestra en las transferencias de anti-pTyr, el tratamiento celular con el compuesto indujo una inhibición dependiente de dosis de fosforilación de tirosina de receptores Ret en ambas líneas celulares. Se observó una expresión reducida de concentraciones del receptor en células tratadas con las concentraciones más elevadas del fármaco. B) Efecto antiproliferativo. Se trataron células TT y MZ-CRC-1 con concentraciones en aumento de Cpd 1 durante 7 días y después se contaron con un Contador Coulter. Las curvas de respuesta de dosis documentaron la capacidad del fármaco para interferir en la proliferación potencial de las dos líneas celulares de MTC.

Figura 3. Actividad antitumoral de Cpd 1 en ratones desnudos que contienen xenotransplantes de carcinoma medular de tiroides TT. El tratamiento del fármaco empezó 25 días después del inóculo subcutáneo de las células tumorales. Se liberó Cpd 1 por boca a 50 mg/Kg ó 100 mg/Kg, dos veces al día (2qd), durante 10 días consecutivos (indicado con flechas). Los ratones de control recibieron el vehículo. El tratamiento indujo una inhibición dependiente de dosis importante del crecimiento del tumor. TWI fue del 60% (P < 0,005) y el 80% (P < 0,0005) para las dosis de 50 mg/Kg y 100 mg/Kg, respectivamente.

Figura 4. Inhibición de autofosforilación y expresión de Met en células de carcinoma papilar de tiroides humano (TPC-1) tratadas con Cpd1. A): Las células TPC-1 se expusieron al solvente (-) o a las concentraciones indicadas de Cpd 1 durante 72 h. Se usaron cantidades iguales de proteína para inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo anti-Met o para la preparación de lisatos de células enteras (WCL). Se separaron las proteínas inmunoprecipitadas y WCL por medio de SDS-PAGE, se trasfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se sometieron a transferencia de Western con anticuerpos anti-pTyr o anti-Met. B): Se trataron las células como en A. Se inmunoprecipitaron extractos de células con anticuerpo anti-pTyr y se sondearon con anticuerpo anti-Met. C): Las células se privaron de suero durante 24 h. y se expusieron a solvente o Cpd1 (60 \muM) durante las últimas 18 h. Después se dejaron sin tratar (-) o estimularon con 20 ng/ml de HGF (+), durante 10 minutos. Se inmunoprecipitaron los lisatos celulares con anti-Met y se sondearon con anticuerpo anti-pTyr o anti-Met. El tratamiento del fármaco suprimió la fosforilación de tirosina de Met constitutiva o inducida por HGF e indujo una reducción de la expresión de Met.

Figura 5. Inhibición de autofosforilación y expresión de PDGF-R en células enteras por Cpd 1. A): Se trataron células 2N5A (NIH3T3 transformadas por la retransposición COL1A1/PDGFB que genera la estimulación autocrina de PDGF-R) con Cpd 1 en las concentraciones indicadas, durante 72 h. Se inmunoprecipitaron extractos de células con anti-PDGF-R y se sometieron a transferencia de Western con anticuerpos anti-pTyr o anti- PDGF-R. B): Las células Swiss 3T3 se privaron de suero durante 24 h. y después se trataron con Cpd1 en las concentraciones indicadas, durante 18 h. Después de la estimulación con 1 nM de PDGF durante 5 minutos, se prepararon lisatos de células enteras y se sometieron a transferencia de Western con anti-pTyr o anti-PDGF-R. Se muestra una carga de proteína por transferencia de anti-actina. En ambos sistemas celulares, se documentó una inhibición dependiente de dosis de fármaco inducido de fosforilación y expresión del receptor de tirosina.

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Figura 6. Inhibición de autofosforilación y expresión de receptores FGF-R1 y FGF-R3 en células enteras por Cpd1. A): Las células Swiss3T3 se privaron de suero durante 24 h. y después se trataron con Cpd1 en las concentraciones indicadas, durante 18 h. Después de la estimulación con 100 ng/ml de FGF durante 5 minutos, se prepararon lisatos de células enteras y se sometieron a transferencia de Western con anti-pTyr o anti-FGF-R1. Se muestra una carga de proteína por transferencia de anti-actina. B) se trataron NIH3T3 transformadas por el mutante Y373C de FGF-R3 con las concentraciones indicadas, durante 72 h. Se inmunoprecipitaron extractos de células con anti- FGF-R3 y después se sometieron a transferencia de Western con anticuerpos anti-pTyr o anti-FGF-R3. En ambos sistemas celulares, se documentó una inhibición dependiente de dosis por Cpd 1 de fosforilación y expresión del receptor de tirosina.

Figura 7. Efectos de Cpd1 sobre líneas celulares que expresan formas activadas constitutivamente de Kit. A) Reversión del fenotipo morfológico transformado de transfectantes NIH3T3 que expresan KIT exógeno mutado (\Delta559). Se trataron células con 20 \muM de Cpd1 y se fotografiaron 24 h. después en un microscopio de contraste de fase (magnificación original X 100). B): Inhibición de autofosforilación y expresión de Kit (\Delta559) en transfectantes NIH3T3. Se trataron células con Cpd 1 en las concentraciones indicadas, durante 72 h. Se inmunoprecipitaron lisatos de células con un anticuerpo anti-Kit y se sometieron a transferencia de Western con anticuerpos anti-pTyr o anti-Kit. C): Inhibición de expresión y autofosforilación activada por bucle autocrino de c-Kit en la línea celular N592 de SCLC. Se trataron células con Cpd 1 en las concentraciones indicadas, durante 24 h. Se sometieron lisatos de células enteras a transferencia de Western con anticuerpo anti-Kit o con un anticuerpo que reconoce específicamente la tirosina fosforilada/activada de Kit (p-Kit). En ambos sistemas celulares, se documentó una inhibición dependiente de dosis de fármaco inducido de fosforilación y expresión del receptor de tirosina.

Materiales y procedimientos Líneas celulares y condiciones de cultivo

En este estudio se usaron las siguientes líneas celulares de carcinoma medular de tiroides humano (MTC). La línea celular TT derivada de un MTC asociado a MEN2A se caracterizó por expresión del oncogen RET que lleva la mutación C634W. La línea celular MZ-CRC-1 derivada de MTC asociado a MEN2B se caracterizó por expresión del oncogen RET que lleva la mutación M918T. Las células TT se cultivaron en un medio de Ham F12 (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) suplementado con el 15% de suero fetal bovino (FCS) (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), mientras que las células MZ-CRC-1 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Doubelco (DMEM) (BioWhittaker) suplementado con el 10% de FCS. La línea celular de carcinoma papilar de tiroides humano TPC-1, que se usó como modelo de sobreexpresión de Met, se cultivó de forma rutinaria en DMEM con el 10% de FCS. Las células N592, derivadas de un SCLC humano, se caracterizaron por activación de Kit a través de estimulación autocrina por medio del ligando SCF. Se cultivaron células N592 en RPMI 1640 suplementado con el 10% de FCS. Los fibroblastos de ratón SWISS3T3 y NIH3T3 se cultivaron en DMEM con el 10% de suero bovino (Colorado Serum Company, Denver, CO). Además, se usaron células NIH3T3 transfectadas con oncogenes diferentes. Los transfectantes NIH3T3^{MEN2A} expresan la isoforma abreviada del oncogen RET-MEN2A (C634R); las células NIH3T3^{KIT\Delta 559} expresan KIT que lleva la mutación de activación \Delta559 que se encuentra en GIST. NIH3T3^{FGFR3(Y373C)} expresa el gen FGF-R3 que lleva la mutación de activación Y373C que se encuentra en una línea celular de mieloma múltiple humano. Las células 2N5A son células NIH3T3 transformadas por la retransposición COL1A1/PDGFB que genera estimulación autocrina de PDGF-R. Todos los transfectantes NIH3T3 se mantuvieron en DMEM más el 5% de suero bovino en una atmósfera del 10% de CO_{2}.

Ensayos proliferativos

Se tripsinizaron las células después de 3 días (células NIH3T3 y NIH3T3^{MEN2A}) ó 7 días (células MTC) de tratamiento con Cpd1 y se contaron con un Contador Coulter (Coulter Electronics, Luton, R. U.). Se calcularon las concentraciones capaces de inhibir la proliferación de células en un 50% (CI_{50}) a partir de las curvas de respuesta de dosis. Cada experimento se realizó por duplicado.

Anticuerpos

Se usaron los siguientes anticuerpos policlonales: anti-Ret que reconoce una secuencia COOH terminal (aa 1.000-1.014) común a las dos isoformas de Ret (Borrello M. G. y col., Mol. Cell Biol. 16, 2151, 1996); anti-cKit, anti-Met y anti-FGF-R3 de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anti-actina de Sigma (St. Louis, MO); anti-PDGF-R \alpha/\beta de Upstate Biotechnology (Lake Placid, N. Y.); anti fosfo-cKit (Tyr 719) de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos antifosfotirosina (anti-pTyr) 4G10 y anti-FGF-R1 monoclonales de ratón eran de Upstate Biotechnology.

Inmunoprecipitación y transferencia de Western

Para la preparación del extracto de células enteras, se lisaron células en tampón de muestra de dodecilsulfato sódico (SDS) (Tris-HCI 62,5 mM (pH 6,8), 2% SDS) con PMSF 1 mM, pepstatina 10 \mug/ml, leupeptina 12,5 \mug/ml, aprotinina 100 KIU, ortovanadato de sodio 1 mM, molibdato de sodio 1 mM. Se determinó la concentración proteica en alícuotas diluidas apropiadamente por medio del procedimiento del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL), después se ajustaron las muestras hasta una concentración final de glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,001%.

Para experimentos de inmunoprecipitación, se trataron células con Cpd1 o solvente durante los tiempos indicados. Se aclararon las monocapas celulares dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría más ortovanadato de sodio 0,1 mM y después se dejaron durante 20 minutos sobre hielo en tampón de lisis (HEPES 50 mM pH 7,6, NaCl 150 Mm, glicerol al 10%, Tritón X-100 al 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, EGTA 1 mM de, NaF 100 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, 10 \mug/ml de antipaina, 20 \mug/ml de quimostatina, 10 \mug/ml de E64m, 1 mg/ml de pefabloc SC). Después se recogieron las células, se aspiraron a través de una aguja de calibre 22 y se centrifugaron a 10.000 g durante 20 minutos, a 4°C. La concentración proteica se determinó por medio del reactivo BCA (Pierce). Los extractos celulares se incubaron con proteína A-agarosa y el anticuerpo indicado durante 2 horas a 4°C en rotación. Después de lavar 3 veces con HEPES 20 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, glicerol al 10%, Tritón X-100 al 0,1%, se eluyeron las concentraciones con tampón de muestra completa.

Se resolvieron los inmunoprecipitados normalizados (0,5 mg a 4 mg de extractos de células) o lisatos de célula entera (30 \mug a 60 \mug) en SDS-PAGE y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se incubaron las membranas con anticuerpos primarios a 4°C, durante toda una noche. Se detectaron bandas inmunorreactivas por medio de anticuerpos anticonejo o antiratón conjugados con peroxidasa de rábano picante usando sistemas de detección de quimioluminiscencia potenciada de Amersham Biosciences (Little Chalfont, Reino Unido) o Pierce.

Estudios in vivo

Todos los experimentos se realizaron usando ratones atímicos desnudos CD-1 hembras, de 8 a 11 semanas de vida (Charles River, Calco, Italia). Se mantuvieron los ratones en recintos cerrados con flujo laminar a temperatura y humedad constantes. Los protocolos experimentales se aprobaron por parte del Comité Ético de Experimentación Animal del Instituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori (Milán, Italia), de acuerdo con el Comité de Coordinación del Reino Unido sobre Directrices para la investigación sobre el Cáncer (Workman P. y col. British Journal of Cancer, 77, 1, 1998).

Las células TT de MTC (células 1,6x10^{7}) se inocularon subcutáneamente en ratones en forma de una suspensión celular a partir de un cultivo celular in vitro. Cada grupo de control o tratado con fármaco incluyeron 8-10 tumores. Las células tumorales se inyectaron el día 0, y el crecimiento tumoral se siguió de medidas bisemanales del diámetro de los tumores con un calibrador Vernier. Se calculó el peso del tumor (TW) de acuerdo con la fórmula: TW (mg) = volumen del tumor (mm^{3}) = d^{2}xD/2, en la que d y D con el diámetro menor y mayor, respectivamente. El tratamiento del fármaco comenzó cuando los tumores eran simplemente medibles (TW medio aproximadamente 50 mg), 25 días después del inóculo de células tumorales. Se disolvió Cpd1 en etanol al 5%, Cremofor EL al 5%, solución salina al 90% de (NaCl al 0,9%) y se liberó por boca dos veces al día (2qd)), según un programa diario de 10 días. Los ratones de control recibieron la solución solvente.

Se evaluó la eficacia del fármaco en porcentaje de inhibición de TW (TW% en ratones tratados con fármaco frente a de control expresado como: TWI% = 100 (TW medio tratado / TW medio de control x 100). Para análisis estadísticos, se compararon TW en ratones de control y tratados en el día de la evaluación de TW%, por medio del Ensayo de Student (de dos colas). Los valores P inferiores a 0,05 se consideraron importantes estadísticamente.

Preparación de (E) 1,3-dihidro-4-hidroxibenziliden-5,6-dimetoxi-(1H)-indol-2-ona (Cpd1) 1) Síntesis de ácido 2-nitro-4,5-dimetoxifenilacético

1

C_{10}H_{11}NO_{6}, pm 241,20

Se disolvieron 45 g (0,23 moles, 1 eq.) de ácido 3,4-dimetoxifenilacético en 100 mL (2,2 volúmenes) de ácido acético glacial a 28°C-35°C, bajo atmósfera N_{2} y depuración mecánica. Se enfrió la solución a 15°C-20ºC y se añadió con una mezcla de ácido nítrico humeante (98%, 33 mL) en ácido acético glacial (25 mL) durante un periodo de 45'. Una vez que se completó la adición, se observó precipitación de un sólido rojo. Se vertió la suspensión en agua helada (600 mL) y se mantuvo bajo depuración durante 2 h. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó a 60°C durante 8 h. Se obtuvo 44 g del producto final.

Rendimiento: 79,3% (mmol/mmol)

TLC (SiO_{2}; Acetato de etilo 10/AcOH 0,5) Rf_{ácido} = 0,6; Rf _{producto} / 0,5

Punto de fusión 199°C-202°C

1H-RMN, (DMSO): 3,9 ppm (s, 6H); 4,0 ppm (s., 2H); 7,12 ppm (s., 1H); 7,7 ppm (s.,1H)

2) Síntesis de 1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-(1H)-indol-2-ona

2

C_{10}H_{11}NO_{3, } pm., 193,11

Se suspendieron 9,2 g (38,14 mmoles, 1 eq.) de ácido 3,4-dimetoxi-2-nitro-fenilacético en ácido acético glacial (92 mL, 10 volúmenes) a 25°C bajo atmósfera N_{2} y depuración mecánica. Se añadió a la suspensión polvo Fe°, 325 malla, 97% (12,0, 214,86 mmoles, 5,6 eq.) en dos porciones iguales. La primera porción se añadió a temperatura ambiente; después se mantuvo la mezcla a reflujo y 30 minutos después se añadió la segunda porción Fe°. 30' más tarde la reacción estaba completa,

TLC (SiO_{2}, CHCl_{3} 9/MeOH 1) Rf_{nitro} = 0,65, Rf_{indolinona} = 0,71.

Se enfrió la suspensión gris a temperatura ambiente, se evaporó el ácido acético a baja presión hasta un sólido crudo, que se suspendió en cloroformo (200 mL). Se filtraron las sales y se lavó la fase orgánica con una solución saturada NaCl (100 mL), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó hasta que se secó. El sólido se suspendió en éter etílico (35 mL) durante 30', se filtró y se secó a 50°C durante 2 h. Se obtuvo un sólido de color beige de 6,7 g.

Rendimiento 90,9% (mmol/mmol)

Punto de fusión 199°C-201°C

TLC (SiO_{2}; Acetato de etilo 10/AcOH 0,5) Rf_{ácido} = 0,6; Rf _{producto} / 0,5

1H-RMN, (DMSO): 3,4 ppm (s, 2H); 3,69 ppm (s., 3H); 3,72 ppm (s., 3H); 6,49 ppm (s., 1H); 6,92 ppm (s., 1H); 10,15 (s., 1H).

3) Síntesis de (E)-1,3-dihidro-4-hidroxibenziliden-5,6-dimetoxi-1H-indol-2-ona

3

C_{17}H_{15}NO_{4}, pm., 297,31

Se disolvieron 6,7 g (36,9 mmoles, 1 eq.) de 1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-(1H)-indol-2-ona en DMSO anhidro (50 mL) a temperatura ambiente. Se añadió a la solución 4-hidroxibenzaldehído (5,41 g, 44,3 mmoles, 1,2 eq.) y piperidina (4,38 g, 44,3 mmoles, 1,2 eq.), después se depuró durante 16 horas. Se vertió la mezcla en H_{2}O (250 mL) y HCl 0,5 N (150 mL), y se observó la precipitación de un sólido. Se enfrió la solución a 5°C-10°C durante 1 h., se filtró y se secó en vació a 80°C durante 2 h. Se obtuvieron 13 g de sólido húmedo y después se cristalizó a partir de etanol absoluto, con un rendimiento de 6,77 g de producto final.

Rendimiento 61,6% (mmol/mmol)

Punto de fusión 238°C-240°C

Rf (Sílice; acetato de etilo 100%) = 0,68

^{1}H-RMN, (DMSO): 3,6 ppm (s, 3H); 3,8 ppm (s., 3H); 6,5 ppm (s., 1H); 6,9 ppm (d., 2H, J=8,6 Hz); 10 ppm (s. ancho); 12,8 ppm (s.).

La configuración E del enlace doble exocíclico en la posición 2 se determinó por medio de experimentos de RMN 1 D NOE.

Claims (20)

1. El uso del compuesto (E)-1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona o de sales o isómeros no tóxicos del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores que implican una tirosina quinasa seleccionada de las oncoproteínas Met, PDGF-R, FGF-R1, FGF-R3, Kit o RET, incluyendo las mutaciones asociadas MEN2.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las mutaciones de secuencia activada son RET/MEN2A (C634R), RET/MEN2A (C634W) y RET/MEN2B (M918T).

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para el tratamiento de carcinomas medulares de tiroides, feocromocitoma, hiperplasia paratiroidea, ganglioneuroma entérico.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores que llevan una alteración que activa Met.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dichos tumores son de origen epitelial.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, para el tratamiento de tumor renal.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores que expresan Kit activado consitutivamente.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que Kit se activa constitutivamente de acuerdo con mutaciones de secuencia o implicación en bucles autocrinos.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, carcinomas pulmonares de células pequeñas, leucemias o seminomas.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores que implican la activación incontrolada de PDGF-R.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dichos tumores son gliomas y dermatofibrosarcoma protuberans.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores que expresan de forma elevada FGF-R1 y/o su ligando bFGF.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dichos tumores son melanomas y gliomas.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores que expresan formas de activación constitutivas de FGF-R3.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichos tumores son mieloma múltiple, carcinomas de vejiga y de cuello uterino.

16. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 y 12, para la inhibición de angiogénesis tumoral.

17. Una composición farmacéutica que contiene en forma de ingrediente activo el compuesto (E)-1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, en la que dicho vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración por vía oral o parenteral.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, que además comprende un agente antitumoral o anticáncer que es distinto de (E)-1,3-dihidro-5,6-dimetoxi-3-[(4-hidroxifenil)metileno]-2H-indol-2-ona.

20. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicho agente antitumoral o anticáncer se selecciona del grupo compuesto por adriamicina, daunomicina, metotrexato, vincristina, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, 5-FU, hexametilmelamina, carboplatino, cisplatino, idarubicina, paclitaxel, docitaxel, topotecán, irinotecam, gencitabina, Lpam, BCNU y VP-16.