ES2271330T3 - Dispositivo y procedimiento de ensayo quimico microfluidico. - Google Patents

Dispositivo y procedimiento de ensayo quimico microfluidico. Download PDF

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Abstract

Un aparato de ensayo electroquímico microfluídico, que comprende: al menos un microchip, disponiendo el, o cada, microchip citado de al menos un microcanal sellado que permite manipulaciones microfluídicas y que posee: un extremo de punta adaptado para la toma de una muestra fluido en, y/o la descarga de una muestra de fluido desde, el citado microcanal; un extremo de conexión microfluídica; y un electrodo integrado en dicho microcanal de tal manera que está en contacto directo con un fluido presente en dicho microcanal; una unidad de control microfluídico que comunica con el citado extremo de conexión microfluídica de dicho microcanal, y que está adaptada para empujar, extraer o bloquear fluidos en el citado microcanal; que se caracteriza por una unidad electroquímica adaptada para monitorizar, a través de dicho al menos un electrodo integrado, la presencia, la velocidad o el flujo de un fluido en la posición local de dicho al menos un electrodo integrado, mediante medición electroquímicade una reacción de reducción o de oxidación en la misma.

Description

Dispositivo y procedimiento de ensayo químico microfluídico.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a dispositivos y procedimientos para llevar a cabo, de forma totalmente o semi-automatizada, ensayos o reacciones electroquímicos en microchips fluídicos.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, la miniaturización de herramientas analíticas químicas y bioquímicas ha resultado ser un campo en expansión. Los principales factores que fomentan el desarrollo de aparatos químicos miniaturizados, son el deseo de un consumo de analito reducido, un análisis rápido y una capacidad de automatización mejorada. Estas necesidades son particularmente evidentes en el sector de las ciencias biológicas, en el que los diagnósticos biomédicos, los análisis genéticos, proteólisis y alta capacidad de rendimiento en el descubrimiento de medicamentos, han resultado ser crecientemente importantes. La necesidad de limitar el consumo de analito se ha visto acentuada por el creciente número de ensayos que se realizan, el uso de reactivos para análisis que requieren que se mantenga tan bajo como sea posible con el fin de no sólo reducir costes sino también limitar la producción de desechos. En el caso de los diagnósticos biomédicos, se requiere con frecuencia el análisis de volúmenes extremadamente pequeños y resulta deseable la minimización del tiempo de análisis, como son los procedimientos de manipulación simplificados que reducen las manipulaciones y minimizan la contaminación cruzada de una muestra a otra muestra. Con anterioridad, se han investigado dos estrategias diferentes pero complementarias para conseguir estos objetivos: los dispositivos microfluídicos y las matrices 2-D de alta densidad con reactivos de afinidad inmovilizados.
En el campo de los sistemas microanalíticos, un tema muy importante para el desarrollo de dispositivos verdaderamente operativos consiste en la automatización de los ensayos, puesto que la reproductibilidad de las mediciones y también el número de análisis que se pueden realizar pueden ser así mejorados significativamente. Para la automatización de las mediciones utilizando microsistemas, el punto más crítico consiste probablemente en el sistema de dispensación de reactivo. Hasta ahora, se han desarrollado algunos dispositivos automatizados para micro-procedimientos basados en redes paralelas altamente densas, tales como matrices de micro-puntos o de micro-cavidades. En estos casos, los sistemas de suministro están generalmente compuestos por una o varias agujas que permiten la aspiración y la dispensación de los volúmenes requeridos de reactivos en puntos muy precisos. En el caso de sistemas microfluídicos, un problema clave adicional para la automatización de las mediciones consiste en el llenado de microcanales y en el control del movimiento de los reactivos en el interior de los mismos. Con anterioridad se han desarrollado sistemas automatizados microfluídicos basados en electroforesis capilar; por ejemplo, un analizador completo de ADN fue implementado en un único dispositivo con una cámara de reacción de cadena de polimerasa seguida de separación electroforética.
Se han desarrollado algunos procedimientos analíticos automatizados, en los que se utilizan puntas de micropipeta como fases sólidas de la reacción y para la manipulación del reactivo. Esto se ha hecho inmovilizando biomoléculas, tales como anticuerpos, sobre las paredes de las puntas, y utilizando estas puntas para medir con pipeta los reactivos. Utilizando una alternativa de este tipo, se pueden limitar los riesgos de contaminación de una muestra a otra muestra. La conexión de los dispositivos microfluídicos con la solución de muestra externa, ha sido direccionada a través de diferentes medios, tal como conectando el chip microfluídico a un capilar, y haciendo gotear a continuación el capilar en la solución de muestra y bombeando la solución al interior del microchip mediante flujo electroforético (documento WO 00/21666). En otros casos, el chip se ha conectado a un número de bombas microjeringa con el fin de suministrar la muestra al interior del microchip (documento WO 01/63270). Algunos dispositivos han utilizado pulsos para permitir que la muestra entre en el chip con gas o con alta tensión (documento US 6.395.232). Otros han utilizado relleno capilar procedente de una punta de aguja con canal atacado químicamente, para tener su canal sometido a muestreo por acción capilar, y para realizar ensayos electroquímicos tales como detección de glucosa (Sensor Actuator A, vol. 95, 2002, 108-113). Tales procedimientos no permiten ningún control de los fluidos en el interior del canal.
El documento US 5.580.523 A describe un sintetizador químico integrado que posee reactores que pueden ser de tipo electroquímico.
Cuando se realizan pruebas analíticas, resulta de principal importancia controlar la velocidad de flujo durante el suministro de la muestra. En efecto, debido al volumen tan pequeño del canal (del orden de picolitros a microlitros), pequeñas variaciones en la velocidad de flujo de la muestra inducen una variación drástica en el volumen que se transfiere a través del canal. Si la reacción incluye inmuno-sorción o fisi-sorción, por ejemplo, se puede producir una desviación severa de la detección para la misma concentración de muestra. Por esta razón, la presente invención tiene como objetivo controlar y monitorizar el flujo de la solución de muestra a través de medios electroquímicos.
Sumario de la invención
La invención está definida por el alcance de las reivindicaciones 1, 36 y 58 anexas, junto con las reivindicaciones dependientes que definen realizaciones preferidas.
El aparato y los procedimientos relacionados de la presente invención, son adecuados para realizar ensayos o reacciones de forma automatizada o semiautomatizada en microchips. Los microchips incluyen microcanales o matrices o redes de microcanales, que permiten el manejo de la muestra y de los reactivos, así como la consecución de reacciones seguidas de eventos electroquímicos. Éstos pueden ser utilizados también para manipulación de reactivos solamente, por ejemplo en el caso en que se utilice el presente aparato para extraer o dispensar fluidos desde un microchip.
Por lo general, los microchips incorporan microcanales sellados con dos aberturas (una en cada extremo), y pueden ser fabricados utilizando diferentes materiales incluyendo los materiales conductores para su uso en ensayos electroquímicos.
Se puede fabricar individualmente uno o varios microchips individuales o interconectados y/o sobre el mismo soporte. Éstos pueden ser utilizados individualmente o como matriz de microestructuras independientes o interconectadas.
Con preferencia, el extremo inferior del microchip incorpora al menos una punta conectada al (a los) microcanal(es) que se pondrá en contacto con la solución de muestra que se va a ser analizada o va a reaccionar. La parte superior del microchip contiene con preferencia una salida para el(los) microcanal(es)
que puede estar conectada con un dispositivo de control microfluídico automatizado que permita el llenado y/o el vaciado de los microcanales. En algunas realizaciones, el dispositivo de control fluídico puede ser una simple micropipeta para bombeo mecánico. Con preferencia, los microchips son susceptibles de desplazamiento (por ejemplo, desplazamiento secuencial) según las direcciones X, Y y/o Z, ya sea con medios automatizados o ya sea de forma manual.
El control del flujo en la microestructura durante el muestreo, es importante para permitir resultados reproducibles. Por esta razón, el aparato incorpora un electrodo integral para monitorizar el flujo de fluido en la microestructura. Se conoce bien el hecho de utilizar un electrodo, no sólo para detectar si un canal está lleno o vacío, sino también para medir el flujo de solución mediante amperometría. La detección de la conductividad puede ser utilizada para medir el tiempo requerido para que la solución atraviese la microestructura. Esto puede hacerse disponiendo diferentes pares de electrodos a la entrada, en diferentes lugares a lo largo de la microestructura, y a la entrada o la salida de la microestructura. El control fluídico puede ser realizado monitorizando la velocidad de flujo por medio de detección amperométrica, habiéndose demostrado previamente que la corriente detectada depende de la velocidad de flujo de acuerdo con la ecuación de likowich:
I = 0,925nFcL(lD)^{2/3}(Fv/h^{2})^{1/3}
donde I es la corriente, n el número de electrones intercambiados por molécula oxidizada, L es la anchura del electrodo, l es la longitud del electrodo, D es el coeficiente de difusión de la molécula oxidizada, Fv es la velocidad de flujo, h es la altura media del canal, d es la anchura del canal.
Se debe apreciar que esta clase de medición electromecánica puede ser cuantitativa (es decir, cuando se utiliza amperometría para monitorizar la concentración de una especie electroactiva). Por lo tanto, la señal medida durante la carga de muestra, durante las diversas etapas de un ensayo (incubación, lavado, etc), o durante la adición de reactivos, puede ser utilizada para ajustar la señal de detección obtenida al final del ensayo. Como ilustración, en el caso de por ejemplo un ensayo inmunosorbente, la corriente medida durante las etapas de lavado, carga de la muestra o las adiciones de reactivo, varía de microestructura en microestructura, y la señal obtenida al final del ensayo es muy probable que sea diferente de microestructura en microestructura. En efecto, la variación de la corriente medida indica que las velocidades de flujo no eran iguales en todos los microcanales, ni, posiblemente, en todas las etapas del ensayo. Como consecuencia, el tiempo de estancia de las moléculas en las microestructuras varía, lo que genera también variación en los valores finales obtenidos para el ensayo. Con el control electroquímico de las sustancias fluídicas, es posible entonces corregir estas variaciones y con ello, mejorar la precisión y la repetitividad de los ensayos.
De esta manera, el aparato y los procedimientos de esta invención, proporcionan un medio para llevar a cabo análisis con calibración interna del ensayo. Como ejemplo, fluirán muestras con ligeros cambios de viscosidad por el interior de las microestructuras a diferentes velocidades; de forma similar, se pueden bombear soluciones o ser empujadas por el interior de la microestructura a diversas velocidades dependiendo de la precisión de la unidad de control microfluídico. Una gran ventaja del presente aparato consiste en que estas variaciones pueden ser monitorizadas por medio de la unidad electroquímica. El resultado final del análisis puede ser así corregido teniendo en cuenta las variaciones microfluídicas monitorizadas electrónicamente durante las diversas etapas del ensayo. Tales mediciones y el posterior procesamiento de datos, proporcionan por tanto una calibración interna, lo que mejora considerablemente la precisión y la repetitividad de los análisis.
Los microchips pueden contener también medios para controlar la temperatura, para la minimización del ruido electrónico, y para la minimización de la evaporación.
Con anterioridad al uso del aparato de acuerdo con la invención, se dispensan los reactivos en el microcanal o en una matriz de microestructuras. Las puntas de los microchips que componen las entradas de la microestructura, se sumergen en cavidades o depósitos, y el sistema de control fluídico permite el llenado y/o el vaciado de la(s) microestructura(s) con los reactivos. Utilizando esta técnica con implementaciones que poseen una pluralidad de microestructuras, todas las microestructuras pueden ser llenadas con los mismos o con diferentes reactivos simultáneamente, y los riesgos de contaminación muestra-a-muestra quedan así limitados. Para algunas aplicaciones, la(s) punta(s)
de microestructura puede(n) estar integrada(s) en un depósito en el que puede ser cargada la muestra.
El sistema puede ser utilizado para llevar a cabo reacciones o ensayos en microcanales. Se puede emplear en presencia de una fase molecular en solución o fijado a la superficie de la microestructura o en un material sólido integrado en la microestructura, por ejemplo una membrana, un filtro, perlas o similares.
Dependiendo de la reacción o del ensayo, la detección puede ser realizada utilizando varios principios. El transductor que se necesita para la medición de las señales, puede estar colocado en contacto próximo con, o incluso integrado en, los microchips.
El término "microchip", según se utiliza aquí, se refiere a cualquier sistema que comprenda al menos una estructura miniaturizada (o microestructura), que sea una cámara de reacción o de separación o un conducto similar a una micro-cavidad, un micro-canal, un micro-orificio, y similares, sin limitación en cuanto a forma y tamaño, pero que permitan manipulaciones microfluídicas. En la presente invención, al menos una de tales microestructuras miniaturizadas comprende al menos un electrodo para llevar a cabo ensayo(s) electroquímico(s) (según se define más adelante). El electrodo está conectado al aparato de control fluídico, y se utiliza para diferentes eventos electroquímicos (según se describe más adelante). En todos los casos, el electrodo puede servir para comprobar si el canal se llena o no homogéneamente durante las etapas de toma de muestra y/o de ensayo, y para controlar si cada canal está vacío o si se ha realizado un cambio de solución durante un experimento multi-etapa. Los parámetros importantes, tal como la velocidad de flujo, pueden ser controlados en cualquier momento durante el ensayo con los medios electroquímicos. En este sentido, la presencia del electrodo, conectado a la unidad de control fluídico, es único y proporciona varias ventajas frente a alternativas similares que utilizan detección óptica y en las que el flujo no puede ser monitorizado de manera tan precisa.
El término "microcanal", según se utiliza aquí, se refiere a un microcanal simple, una matriz de microcanales, o una red de microcanales interconectados, sin limitación en cuanto a número o configuración, pero que están sellados y que tienen una sección transversal que permite la manipulación microfluídica.
Los microchips y microcanales son preferentemente desechables, y pueden ser fabricados con diversos materiales, tales como por ejemplo, vidrio, cuarzo, polímero (por ejemplo, polietileno, poliestireno, tereftalato de polietileno, polimetilmetacrilato, poliimida, policarbonato, poliuretano o poliolefinas), una serie de polímeros o una combinación de los mismos. También pueden contener elementos suplementarios tales como, aunque sin limitación, membranas, cámaras con perlas, fase sólida, sol-gel, electrodos, almohadillas conductoras o bobinas para controlar la temperatura y/o el flujo electrocinético. Los electrodos pueden ser utilizados para llevar a cabo mediciones electroquímicas o para aplicar una alta tensión para transferir la muestra a un espectrógrafo de masas por medio de alguna técnica de electropulverización.
El término "punta" ha sido previsto para que se refiera a un extremo de la(s) estructura(s) miniaturiza-
da(s) contenida(s) en el microchip, desde la que se una muestra se carga en la estructura miniaturizada o bien se dispensa hacia fuera de la estructura miniaturizada. El término "extremo de conexión" (también mencionado como "extremidad de conexión"), está previsto que se refiera a la segunda extremidad de la estructura miniaturizada que está conectada a la unidad de control microfluídico del aparato de esta invención. Para mayor claridad, en el caso en que la estructura miniaturizada es un microcanal, la punta se refiere o bien a la entrada o bien a la salida del microcanal que no está conectada a la unidad de control microfluídico (también citada como "dispositivo de medición con pipeta" en relación con algunas realizaciones). La punta puede ser fabricada con diferentes características geométricas tal como dotada de una entrada de microcanal en la dirección del microcanal o perpendicular al mismo, o en la pared lateral del microcanal; también puede estar sumergida en un depósito o circundada por un depósito de fluido; finalmente, la punta se realiza con preferencia con el mismo cuerpo que el propio microchip, sin extensión hasta el sistema de conexión o capilar externo.
El término "unidad de control microfluídico" o "dispositivo de medición con pipeta" significa un dispositivo que comprende tubos o capilares y que permite la generación de un flujo molecular no turbulento, por convección, migración o una combinación de ambas; la conexión entre el microchip y la unidad de control microfluídico puede realizarse afianzando el microchip de modo que las conexiones microfluídicas se sitúen en posición alineada con respecto al(a los) extremo(s) de conexión de la microestructura; la unidad de control microfluídico proporciona un medio susceptible de generar un flujo de moléculas mediante tracción o empuje de solución, y/o para bloquear la solución en las estructuras miniaturizadas cuando esto sea necesario durante una reacción o en el tiempo de espera. La unidad de conexión microfluídica puede estar también ventajosamente acoplada a depósitos de solución que contengan los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción o un ensayo, así como también agentes de bloqueo, amortiguadores, soluciones de lavado, y similares.
El término "ensayo electroquímico" se referirá a cualquier experimento electroquímico que haga uso de la conductividad eléctrica y de la energía con el fin de llevar a cabo una reducción, una oxidación o una reacción de transferencia iónica, lo para llevar a cabo mediciones de conductimetría y/o de impedancia, o para generar un campo eléctrico en una solución, como por ejemplo para realizar mediciones de ionoforesis o de afianzamiento de parche, o para inducir bombeo electrocinético o de electro-osmosis, o para generar una electropulverización según pueda ser utilizada, por ejemplo, para transferir moléculas desde la punta de una estructura miniaturizada hacia un espectrómetro de masas.
El aparato de esta invención comprende también una "unidad electroquímica" que constituye el aparato electrónico requerido para realizar cualquiera de los ensayos mencionados anteriormente. Por ejemplo, puede incluir almohadillas conductoras que permitan la conexión eléctrica entre la presente solución en la(s) estructura(s) miniaturizada(s) y el dispositivo utilizado para realizar el ensayo electroquímico (por ejemplo, un potenciostato, una fuente de energía eléctrica controlada, una unidad de medición de impedancia, y similares).
La combinación de los elementos anteriores permite la realización de ensayos electroquímicos precisos en microchips: una estructura miniaturizada que comprende un medio de punta para cargar y/o dispensar una muestra, así como también una conexión a una unidad de control microfluídico, y al menos un electrodo conectado a la unidad electroquímica que permite llevar a cabo ensayo(s) electroquímico(s).
En algunas aplicaciones, se puede añadir ventajosamente una especie electroactiva a la solución de muestra, con el fin de seguir las sustancias microfluídicas mediante la generación de una señal electroquímica, por ejemplo la corriente resultante de la reducción y/o la oxidación de esta especie electroquímica o de la resistencia a lo largo de la microestructura. Esto se puede utilizar ventajosamente para proporcionar una calibración interna del análisis realizado con el presente aparato, puesto que los resultados finales pueden ser corregidos de acuerdo con las variaciones de la señal electroquímica medida durante las etapas microfluídicas de los ensayos.
El aparato de esta invención puede estar también conectado ventajosamente a, o incluso integrado en, un ordenador, permitiendo con ello el procesamiento de datos en línea y el control computarizado de los ensayos o reacciones.
Este aparato se utiliza preferentemente para realizar análisis o reacciones biológicas o químicas, tales como, aunque sin limitación a ninguna clase de mediciones de espectrometría de masas, ensayos diagnósticos in vitro o in vivo, todas las clases de ensayos de afinidad o toxicológicos y de caracterizaciones físico-químicas, o la síntesis combinacional de productos.
Descripción detallada de la invención
La invención va a ser descrita en lo que sigue con mayor detalle, a título de ejemplo solamente, con referencia a las figuras anexas, en las que:
La Figura 1 es una representación esquemática que muestra algunos ejemplos de estructuras de microchip y de microcanal y de conexiones de acuerdo con la invención;
La Figura 2 es una representación esquemática que muestra una vista (A) lateral y una vista (B) en planta de una realización de aparato de acuerdo con la presente invención;
La Figura 3 es una representación esquemática de una realización de aparato de acuerdo con la invención, que comprende una serie de microcanales conectados a un sistema automatizado que permite tanto la aspiración de los reactivos como el desplazamiento de los microchips en direcciones X, Y y Z;
La Figura 4 es una representación esquemática del principio de un inmuno-ensayo de sándwich realizado en un microchip situado en una realización de aparato de acuerdo con la invención;
La Figura 5 es una representación esquemática de la interconexión de una serie de microcanales con un espectrómetro de masas que utiliza una realización de aparato de acuerdo con la invención;
La Figura 6 es una serie de fotografías de una realización de aparato de acuerdo con la presente invención, que se utiliza para tomar una muestra situada en depósitos 18 de solución (mencionada aquí como placa microconcentradora); la Figura 6A muestra una vista general del aparato con un microchip que comprende una serie de 8 microestructuras que está soportado en un sistema de Plexiglás que permite la conexión con la unidad electroquímica (no representada) por medio de almohadillas 15 eléctricas integradas en el microchip, así como también la conexión con la unidad de control microfluídico (representada sólo parcialmente) a modo de pequeños orificios 10 de conexión y tubuladuras 10'; la Figura 6B muestra una vista más cercana del microchip y de los sistemas de conexión con las unidades de control electroquímico microfluídico; las Figuras 6C y 6D muestran las mismas partes del aparato que las Figuras 6A y 6B, pero en una posición en la que las puntas 3 de la microestructura penetran en los depósitos de solución con el fin de tomar las muestras deseadas;
La Figura 7 es una fotografía de una realización de aparato de acuerdo con la presente invención, que comprende un microchip que posee puntas de microestructura en la parte superior del microchip y que están rodeadas por depósitos;
La Figura 8 muestra la secuencia operativa de un ensayo multi-etapa realizado con una realización de aparato de la invención, que comprende las etapas de: A) conectar un microchip que tiene una punta de estructura rodeada por un depósito, a una unidad electroquímica (no representada) y a una unidad 11 de control microfluídico desde las que soluciones o incluso aire 31-34 pueden se bombeadas, aspiradas, o bloqueadas en la microestructura; B) cargar una muestra en el depósito 28 de solución; C) llenar la microestructura con la solución de muestra, ya sea por capilaridad o ya sea por aspiración, utilizando la unidad de control microfluídico, y dejando eventualmente que la solución de muestra encubé dentro de la microestructura; D) vaciar la microestructura bombeando ya sea aire o ya sea una solución 31 hacia la microestructura, expeliendo con ello la solución de muestra hacia el depósito 28 y llenando los tubos 10' de conexión con una o una serie 32-34 de soluciones; E) dispensar estas soluciones en la microestructura; F) realizar un ensayo electroquímico (ya sea durante el bombeo de una o de todas las soluciones 31-32 en el interior de la microestructura o con el bloqueo de una o, secuencialmente, de cada una de estos soluciones en el interior de la microestructura);
La Figura 9 muestra la secuencia operativa de un ensayo multi-etapa realizado con una realización de aparato de acuerdo con la invención, similar a la secuencia mostrada en la Figura 8, pero donde la punta de la microestructura se pone en contacto con la solución de muestra y, opcionalmente, donde la etapa final consiste en dispensar la solución de analito en un espectrómetro 25 de masas mediante la generación de una electropulverización 26, y
La Figura 10 es un ejemplo del resultado de un ensayo electroquímico realizado con una realización de aparato de acuerdo con la invención, que muestra cómo se pueden utilizar señales electroquímicas para determinar la precisión del flujo de solución controlado por la unidad de control de sustancias microfluídicas. Esta Figura muestra la evolución vatimétrica cíclica de la detección de 500 \muM de metanol ferroceno bajo convección forzada, con el microcanal que se ha presentado en la Figura 3a a 10 mV/s; el inserto muestra la evolución de la corriente de placa a 300 mV respecto a la velocidad de flujo entre 0,2 y 128 \muL/h.
El concepto básico de la invención puede ser entendido con referencia a las Figuras anexas, a partir de las cuales van a ser detalladas en lo que sigue las diversas realizaciones de la invención. Se debe entender que cada uno de los canales presentados en las Figuras tiene un electrodo integrado de tal modo que permite el control de flujo según se describe aquí. Por motivos de claridad, los electrodos no se representan siempre.
La Figura 1A y B, muestra un ejemplo de microchip 1 con diversas configuraciones de microcanal de estructuras 2 miniaturizadas (microcanales simples y redes de microcanales interconectados). La Figura 1A muestra la situación en la que se ha cortado el chip en forma triangular, con el extremo en el borde del microcanal, y la 1B muestra el chip con un extremo del canal sobre el lado del microcanal. Cada una de estas microestructuras contiene una o una pluralidad de puntas 3 y de extremidades 4 de conexión. Una de estas microestructuras muestra un electrodo 5 integrado, mientras que otra de estas microestructuras muestra bobinas 6 integradas. Las extremidades de punta de los microchips contienen las entradas de microcanal. Esta Figura muestra también cómo algunos de los electrodos 5 y de las bobinas 6 pueden ser integrados en los canales.
La red de microcanales del lado izquierdo, ilustra el hecho de que dos microcanales pueden ser puestos en contacto con el fin de realizar la separación y/o la reacción de dos soluciones que pueden ser bombeadas simultáneamente desde las puntas microfluídicas. Según se muestra en el centro de la Figura 1, más de dos microcanales son convergentes hacia una zona de contacto que permite la separación y/o la reacción. En algunas realizaciones, las puntas microfluídicas no están dispuestas en el mismo plano, sino que están hechas en un cuerpo multi-capa que permite una disposición según las tres dimensiones.
Los microcanales pueden tener también diferentes propiedades superficiales para evitar o favorecer la adsorción de algunos compuestos sobre las paredes.
Los microcanales pueden ser también modificados con algunos compuestos porosos, tal como, por ejemplo, membranas de policarbonato, Teflón microporoso, u otros polímeros, permitiendo la difusión específica de gas o de líquido. Esto puede encontrar aplicación, por ejemplo, cuando las reacciones o los ensayos realizados en los microcanales producen gas que necesita ser eliminado, o cuando se ha de realizar experimentos de transferencia de iones en la interfaz entre dos líquidos. También, membranas para separar físicamente dos soluciones o fases pueden estar integradas ventajosamente en el dispositivo microchip. Adicionalmente, tal material poroso puede ser utilizado también para purificar una muestra por adsorción de un compuesto presente en la muestra.
En la presente invención, el sistema de control fluídico puede ser, aunque sin limitación, un sistema de aspiración (por ejemplo, incluyendo el bombeo mecánico o a presión), un dispositivo de flujo de fuerza capilar, o un dispositivo de flujo impulsado electrocinético. El dispositivo de control fluídico puede permitir el llenado y/o el vaciado de los microcanales. El sistema de control fluídico puede estar conectado a un dispositivo automatizado que permita el desplazamiento secuencial de los microchips en las direcciones X, Y y/o Z. En otra realización, el dispositivo de control fluídico puede ser también una micropipeta única que permita el bombeo mecánico y el desplazamiento manual de los microchips.
En algunas realizaciones, el dispositivo de desplazamiento manual o automatizado puede permitir la modificación de la orientación del(de los) microca-
nal(es) con el fin de cambiar el ángulo de exposición de la(s) extremidad(es) de punta del(de los) microcanal(es).
La Figura 2 muestra una representación esquemática (A: vista lateral; B: vista en planta) de un aparato de acuerdo con la presente invención. El microchip 1 comprende una matriz de ocho estructuras miniaturizadas, estando cada una de ellas compuesta por un microcanal 2, una punta 3, y un extremo 4 de conexión. El microchip se sitúa en un portador 7 que se ha fabricado de modo que permite la alineación precisa de los extremos 4 de conexión con la unidad 11 de control fluídico por medio de conductos, tubos y/o capilares 10, 10'. El aparato comprende además conexiones 12 eléctricas que permiten la conexión de la unidad 13 electroquímica con los electrodos 14 integrados en las estructuras miniaturizadas y con las almohadillas 15 eléctricas dispuestas en el microchip (estas conexiones eléctricas han sido mostradas solamente para una de las ocho microestructuras).
En una realización, una solución de muestra puede ser cargada en las microestructuras del aparato mediante el depósito de una gota de solución en cada punta 3 de microcanal. Los microcanales 2 se llena a continuación por capilaridad o por aspiración utilizando la unidad 11 de control fluídico (tras haber afianzado el soporte 16' de conexión sobre los microchips con la aplicación de una presión sobre los resortes 17 con el fin de inducir estanquidad).
A continuación, la solución de muestra puede ser recuperada desde la microestructura utilizando la unidad de control fluídico (por ejemplo, mediante aspiración o bombeo de aire o de otra solución). Las microestructuras pueden ser a continuación llenadas y vaciadas de nuevo con el fin de realizar etapas de análisis adicionales.
En otra realización, la solución de muestra puede ser introducida en las microestructuras mediante bombeo utilizando la unidad de control microfluídico, con el fin de estar en condiciones de controlar la velocidad de flujo durante tal introducción de muestra. A continuación, las puntas de las microestructuras son utilizadas, ya sea como interfaces con los depósitos de residuos, o ya sea como sistemas de dispensación.
La unidad electroquímica puede ser utilizada también en cualquier etapa de llenado, vaciado o bloqueo de la solución de muestra en las microestructuras con el fin de realizar un ensayo electroquímico. En algunas aplicaciones, el ensayo electroquímico (por ejemplo, reducción u oxidación de un compuesto electroactivo, o mediciones de conductividad o de impedancia), se lleva a cabo durante todas las etapas de llenado y de vaciado de los análisis con el fin de obtener una señal que mida el control apropiado de las sustancias microfluídicas en cada microestructura.
En otra realización, el aparato se utiliza para controlar el llenado de la muestra en el interior de la microestructura. A este efecto, el chip puede ser colocado ventajosamente en el aparato con anterioridad a que la punta entre en contacto con la muestra. En este caso, la microestructura se ha conectado ya a la unidad de control microfluídico con anterioridad a la aplicación de la muestra. Puesto que el microchip está conectado herméticamente a la unidad de control microfluídico, el aire queda bloqueado en el interior de la microestructura y no puede escapar (no hay posibilidad de ventilación). De esta manera, cuando la punta de la microestructura se pone en contacto con la muestra, esta muestra no puede llenar la microestructura (no puede ocurrir ningún llenado capilar), y esto puede ser comprobado merced al electrodo integrado y a la unidad electroquímica. Con el fin de permitir que la muestra rellene la microestructura, es necesario aplicar una retro-presión por medio de la unidad de control microfluídico. En otra realización, el microchip puede ser también desconectado de la unidad de control microfluídico (por ejemplo, accionando un sistema de afianzamiento utilizado para asegurar la conexión hermética al fluido entre la microestructura y la unidad de control microfluídico), de modo que el aire sea susceptible de escapar hacia fuera de la microestructura a través de su extremo de conexión, permitiendo con ello el llenado de la microestructura por capilaridad. Una vez llena, la unidad de control microfluídico se conecta de nuevo de modo que, o bien bloquea la muestra en el interior de la microestructura, o bien bombea o empuja esta muestra y/u otras soluciones. Tal control del llenado de muestra es de gran ayuda para fijar de forma precisa el punto de inicio de una reacción (es decir, el tiempo igual a cero), que es crucial para la precisión de experimentos que dependen del tiempo de reacción (como por ejemplo, en pruebas enzimáticas). Este método de bloqueo que utiliza el aparato de esta invención, permite mejorar la precisión de los ensayos y su repetitividad.
En una realización adicional, el chip puede tener una barrera hidrofóbica para evitar el llenado por capilaridad de la muestra. Éste estará de nuevo controlado por el electrodo situado en el interior del microcanal. En este caso específico, sin embargo, el microchip no necesita estar conectado a la unidad de control microfluídico durante la aplicación de la muestra a la punta de la microestructura.
En algunas realizaciones, la unidad de control microfluídico se utiliza durante el análisis con el fin de bloquear una solución de analito en el interior de las microestructuras. La unidad electroquímica puede ser utilizada entonces ventajosamente para inducir un flujo molecular por aplicación de un potencial; en un análisis de este tipo, el aparato de esta invención puede ser así utilizado para realizar experimentos de electroforesis.
La Figura 3 muestra cómo los microchips pueden ser conectados a una unidad 11 de control microfluídico, que en este caso es un sistema de aspiración semiautomático similar a un dispositivo de medición con pipeta, que permite la dispensación de los reactivos en los microcanales 2, y el desplazamiento de los microchips 1 según las direcciones X, Y y Z. Las puntas de as microestructuras 3 se sumergen secuencialmente en una serie de depósitos 18 de solución (representados aquí como cavidades de una placa microconcentradora), que contienen varios reactivos, amortiguadores y/o soluciones de lavado. Los microcanales 2 son así rellenados sucesivamente con los reactivos, amortiguadores y/o soluciones de lavado necesarios para las reacciones o los ensayos.
En una realización preferida, la invención puede ser aplicada al campo de la química combinatoria, con lo que se injertan moléculas sobre la superficie de las microestructuras y se combinan con otras moléculas para la síntesis de nuevos compuestos que después son liberados y analizados.
En algunas realizaciones, en las que las reacciones o los ensayos realizados en los microcanales son endotérmicos, la punta puede ser calentada por incubación de los microchips en una cámara equipada con termostato, o haciendo pasar corriente a través de los electrodos integrados, según se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Al contrario, la temperatura de la solución puede ser reducida con el fin de detener la reacción.
En algunas realizaciones, la invención puede ser utilizada para realizar ensayos (bio)químicos homogéneos o heterogéneos en los microcanales. Estos ensayos pueden incluir un elemento de (bio)reconocimiento altamente específico tal como, aunque sin limitación, una enzima, un anticuerpo, un antígeno, un hapteno, un ácido nucleico, un oligonucleótico o un péptido. También se puede lograr un enlace covalente en los microcanales con compuestos químicos que permitan un (bio)reconocimiento específico. En este caso, los reactivos necesarios para los ensayos pueden ser colocados en una placa ELISA con anterioridad a las mediciones. Los microcanales pueden ser así utilizados, por ejemplo, para realizar inmunoensayos homogéneos o heterogéneos.
Los microcanales pueden contener también características específicas para realizar una separación y/o purificación. A este fin, al menos una porción del microcanal puede contener un compuesto adsorbido covalentemente o físicamente, o una fase heterogénea (como un gel, una membrana, perlas y similares).
La Figura 4 resume el principio el principio y las etapas sucesivas necesarias para llevar a cabo un inmunoensayo en sándwich en microchips 1 que incorporan a menos un electro 14, según se utilizan en la presente invención. El microcanal 2 se llena en primer lugar con una solución de anticuerpo 20 específica para el analito. El anticuerpo es así adsorbido en las paredes de los microcanales. La superficie se bloquea a continuación por incubación de agente 21 de bloqueo (por ejemplo, solución de BSA). Este agente de bloqueo se adsorbe en los sitios de las paredes del canal que permanecían libres tras la adsorción del anticuerpo 20. Esto evita el enlace no específico que podría ocurrir en las siguientes etapas del ensayo. Las muestras que van a ser analizadas son incubadas a continuación, lo que conduce al enlace del analito 22 deseado con el anticuerpo 20. La última etapa incluye incubar un anticuerpo 23 conjugado etiquetado específico para el analito. Entre cada etapa, los canales son lavados normalmente con agua o con soluciones amortiguadoras con el fin de eliminar los compuestos no fijados. A continuación se puede llevar a cabo la detección del complejo de sándwich. Se pueden utilizar diferentes principios de detección dependiendo de la (bio)química del ensayo. Durante las etapas que preceden a la detección del complejo de sándwich, se realiza un ensayo electroquímico con el fin de determinar la eficacia de la unidad de control microfluídico. Por ejemplo, las mediciones de conductimetría permiten una evaluación de si se han llenado las microestructuras completamente con la solución; de manera similar, pueden ser realizadas mediciones amperométricas con el fin de evaluar la eficacia de las diversas etapas del ensayo.
Los ensayos o las reacciones llevadas a cabo en los microcanales pueden ser detectados utilizando varios principios tales como, aunque sin limitación, luminiscencia (fluorescencia, VV/Vis, bioluminiscencia, quimiluminiscencia, electroluminiscencia), electroquímica o espectrometría de masas.
En algunas realizaciones, los microchips son interconectados con un detector situado fuera de los microcanales. En este caso, el detector puede ser, por ejemplo, un tubo fotomultiplicador o un espectrómetro de masas.
Con anterioridad a la etapa de detección, la solución contenida en el microcanal puede ser sometida a una purificación y/o a una etapa de separación (por ejemplo, utilizando cromatografía, membranas selectivas, filtros o separación electroforética).
La Figura 5 muestra como los extremos 3 de punta de los microchips 1 pueden ser interconectados con un espectrómetro 25 de masas para la detección de una molécula. Con la terminación de, por ejemplo, una reacción inmunológica en los microcanales 2, el complejo se desorbe y se extrae. El extremo 3 de punta se utiliza entonces para inyectar la parte extraída en el espectrómetro de masas mediante generación de una electropulverización 26. A este fin, la solución debe estar en contacto con un electrodo y con una unidad electroquímica que sirve para aplicar una alta tensión entre la microestructura y el espectrómetro de masas. La Figura 5 muestra ese electrodo 14, el cual puede estar situado en varias posiciones en los microcanales o en el extremo 4 de conexión de la microestructura. Cuando este electrodo está integrado en el microcanal, se fabrica una almohadilla 15 conductora directamente sobre el microchip; El electrodo se enchufa también a continuación en la unidad electroquímica por medio de conexiones 12 eléctricamente conductoras (por ejemplo, cables apantallados).
En algunas realizaciones, el detector puede estar integrado en los microcanales. En este caso, el transductor puede ser, por ejemplo, un electrodo o un fotodiodo.
En otras realizaciones, no se utiliza la punta de microcanal para llenar el microcanal con la solución que interesa, sino que se utiliza para dispensar la solución hacia fuera del microcanal, hacia otro aparato de separación, purificación o detección. A este fin, la unidad de control microfluídico permite el control del volumen de solución dispensada desde las puntas de la microestructura. Por ejemplo, el microcanal puede ser utilizado como interfaz de electropulverización para análisis MS. En otra realización, el microchip puede ser colocado horizontalmente, y una serie de depósitos de solución (por ejemplo, una placa microconcentradora) puede ser situada verticalmente de tal modo que permita una toma de muestra más fácil en las microestructuras, y una dispensación posterior de la solución en el espectrómetro de masas.
La Figura 6 presenta varias vistas de un ejemplo de aparato de acuerdo con la presente invención, en el que los depósitos 18 de solución se disponen en contacto con las puntas 3 de microestructura con el fin de llenar una serie de microcanales con soluciones de analito. Es evidente que, o bien el microchip o bien los depósitos de solución, pueden ser desplazados en todas las direcciones X, Y y Z. El microchip que soporta las estructuras se sitúa en un portador que permite la interconexión con las unidades de control electroquímicas y microfluídicas (no representadas) por medio de conexiones 15 eléctricas y de tubuladuras 10'. En este caso, el microchip puede incorporar una fase sólida de tal modo que permita la desalación, un ensayo de afinidad específica, u otra preparación de la muestra. Una solución de pulverización, compuesta por ejemplo de metanol, acetonitrilo y solución acídica, puede ser almacenada en los tubos 10' y puede servir para desorber muestras que han sido previamente inmovilizadas en el microchip. En una realización, se pueden disponer microperlas en un depósito entre el chip y la unidad de control microfluídico con el fin de permitir un pre-tratamiento de la muestra (como por ejemplo, reacciones de desalación o de afinidad), con anterioridad a los análisis por espectrometría de masas.
En alguna realización, la punta de la microestructura constituye una entrada por el lado del microchip en contacto con la solución de muestra que va a ser analizada. La Figura 7 muestra un ejemplo de tal punta de microestructura insertada en un aparato de la presente invención. En este ejemplo, los depósitos 28 pueden estar integrados en la parte superior de las puntas de microestructura de tal modo que permitan que la solución de muestra sea dispensada a través de las puntas hacia las microestructuras. La solución puede entrar entonces en la microestructura, ya sea por acción capilar o ya sea por aspiración desde el extremo de conexión. En algunas realizaciones, el microchip puede ser conectado al dispositivo de control fluídico de tal modo que el llenado capilar será impedido por la retro-presión asegurada por el dispositivo de control fluídico. Solamente cuando el dispositivo de control fluídico está aspirando, la muestra puede entrar en el canal. La Figura 7 muestra también la unidad 13 electroquímica con sus conexiones 12 eléctricas, la cual se utiliza para llevar a cabo el(los) ensa-
yo(s) electroquímico(s) en cada microestructura.
Las Figuras 8 y 9 ilustran la secuencia de un ensayo realizado con un aparato de la invención, dependiendo de la forma de la muestra y de los reactivos que se dispensan en las microestructuras, y con dos diseños de puntas de microestructura diferentes. En la Figura 8, se ha integrado un depósito en el extremo de punta de la microestructura y asegura el contacto de la solución con el chip. Resulta apreciable que este depósito puede ser utilizado para recibir soluciones sucesivas para la realización de ensayos multi-etapa tales como síntesis, análisis, y así sucesivamente. En una realización, se pueden cargar diferentes reactivos 32, 33 y 34 en el tubo 10' de conexión de flujo no turbulento, y ser separados con un solvente de entrada o incluso con una burbuja 31 de gas. El bombeo de los diferentes reactivos en el interior del microchip puede hacer que ocurra una reacción, tal como, aunque sin limitarse a, ELISA, ensayos de afinidad, etapas de lavado, etapa de desalación, etc.
En algunas realizaciones, el reactivo 31 a 35 puede contener perlas que son bombeadas por medio de la unidad de control microfluídico tal como para empaquetarlas en el extremo de las tubuladuras (10') de conexión, o en una posición deseada en el interior de la microestructura. Estas perlas pueden tener diversas propiedades físico-químicas y pueden ser funcionalizadas con moléculas, dependiendo del uso de estas perlas. Tal adición de perlas puede ser utilizada ventajosamente, por ejemplo, para desalar una solución, para llevar a cabo una reacción de afinidad, o para sintetizar compuestos mediante química combinatoria, en especial con moléculas previamente injertadas en estas perlas. En determinadas aplicaciones, se puede colocar también una membrana entre los tubos (10') de conexión y el extremo de conexión de la microestructura (4), tal como para permitir una filtración, o diferentes reacciones tales como adsorción, desorción, desalación, inmunocaptura, ensayos enzimáticos, etcétera.
La integración de perlas, o de membranas, en el interior del aparato de esta invención, es de interés particular en el análisis de espectrometría de masas, mientras que por lo general se requiere desalación sistemática de la muestra con anterioridad a la inyección en el espectrómetro de masas. Las características anteriores pueden ser así utilizadas ventajosamente en aplicaciones en las que el presente aparato sirve, por ejemplo, para inyectar muestras en un espectrómetro de masas mediante ionización de electropulverización (ESI) desde el microchip, o para dispensar muestras sobre una placa destinada a mediciones de espectrometría de masas utilizando ionización de desorción de matriz asistida por láser (MALDI).
En otra realización, el ensayo se realiza con la punta colocada en contacto con la cavidad para la carga de la muestra.
En otra realización, el contacto entre la extremidad 4 de conexión de la microestructura y la unidad 11 de control microfluídico no es hermético (véase la Figura 2), y permite que el microchip sea llenado por acción capilar. Es importante observar que el flujo de solución se detendrá en el extremo de la microestructura. A este fin, se puede colocar opcionalmente una capa hidrofóbica alrededor de la salida de la microestructura, evitando con ello la contaminación cruzada del aparato. Tras el llenado de la muestra, se puede aplicar presión en la parte superior del soporte 7' que sirve como conexión entre el microchip y la unidad de control microfluídico tal como para inducir un sellado hermético y evitar fugas de solución. En esta fase, se puede bombear una solución hacia el, y a través del, microchip sin contaminar la unidad de control microfluídico. A continuación pueden ser bombeados una sucesión de diferentes analitos en el interior de las microestructuras tal como para disponer una solución diferente como se ejemplifica en las Figuras 3 y 4, así como también en las secuencias de las Figuras 8 y 9. La tubuladura fluídica deberá tener un diámetro interno tal que pueda evitar la generación de flujos turbulentos, y que se puedan bombear segmentos de diferentes soluciones hasta el chip, estando dichos segmentos de solución separados por una burbuja de aire. Por ejemplo, cada solución de lavado, soluciones de anticuerpo secundario o de otro reactivo (tal como, por ejemplo, un substrato enzimático), pueden ser pre-cargadas en los tubos con un segmento de burbuja de aire para separación de las mismas. A continuación, el bombeo de estas soluciones a través de las microestructuras permite que se lleve a cabo el inmunoensayo de sándwich completo sin ninguna manipulación y sin adición de reactivo externo.
Como demostración del aparato de esta invención, se han llevado a cabo experimentos mediante la conexión del microchip a una bomba de jeringa que sirve como unidad de control microfluídico con el fin de aplicar una convección forzada a una serie de microestructuras. Solamente se ha integrado un microcanal en el aparato de la invención, el cual es similar al mostrado en la Figura 6, pero solamente con una conexión microfluídica. Los microchips utilizados aquí son hojas de poliimida de 75 micras en las que las estructuras que comprenden un microcanal de 100 x 60 x 10.000 \mum con una punta y con una extremidad de conexión en cada extremo del microcanal, han sido fabricadas por ataque químico de plasma. Estas microestructuras incorporan además microelectrodos de oro y pistas conductoras que están conectadas a un potenciostato que es la unidad electroquímica utilizada para realizar el ensayo electroquímico que consiste aquí en la oxi-reducción de una solución acuosa de 500 \muM de metanol ferroceno. La respuesta vatimétrica a una velocidad de exploración de 10 mV/s en función de la velocidad de flujo (establecida entre 0,2 y 128 \muL/h) inducida por una jeringa de 100 \muL, ha sido registrada y se ha representado en la Figura 10. El inserto de la Figura 10 muestra además la evolución de la corriente de placa a un potencial aplicado de 300 mV frente a plata/cloruro de plata, en función de la velocidad de flujo. La intensidad de la corriente es fuertemente dependiente de la velocidad de flujo debido a que la convección forzada esta renovando constantemente la capa de difusión por encima del electrodo.

Claims (67)

1. Un aparato de ensayo electroquímico microfluídico, que comprende:
al menos un microchip, disponiendo el, o cada, microchip citado de al menos un microcanal sellado que permite manipulaciones microfluídicas y que posee: un extremo de punta adaptado para la toma de una muestra fluido en, y/o la descarga de una muestra de fluido desde, el citado microcanal; un extremo de conexión microfluídica; y un electrodo integrado en dicho microcanal de tal manera que está en contacto directo con un fluido presente en dicho microcanal;
una unidad de control microfluídico que comunica con el citado extremo de conexión microfluídica de dicho microcanal, y que está adaptada para empujar, extraer o bloquear fluidos en el citado microcanal;
que se caracteriza por una unidad electroquímica adaptada para monitorizar, a través de dicho al menos un electrodo integrado, la presencia, la velocidad o el flujo de un fluido en la posición local de dicho al menos un electrodo integrado, mediante medición electroquímica de una reacción de reducción o de oxidación en la misma.
2. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se dispone una señal resultante de la monitorización de la presencia de dicho fluido, para comprobar el resultado final del ensayo.
3. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se dispone una señal resultante de la monitorización de la velocidad o el flujo de dicho fluido, para calibrar o corregir el resultado final del ensayo.
4. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende una pluralidad de microcanales previstos en uno de una pluralidad de microchips, que permiten la medición electroquímica simultánea en más de un microcanal.
5. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha unidad de control microfluídico comprende una bomba o un sistema de medición con pipeta.
6. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una válvula dispuesta entre dicha unidad de control microfluídico y el citado extremo de conexión microfluídica de dicho al menos un microcanal.
7. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado está hecho con polímero, vidrio, cuarzo o una combinación de los mismos.
8. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado es desechable.
9. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado se produce mediante fotoablación láser, moldeo por inyección, estampación, ataque químico de plasma, fusión elastómera, tecnología de silicona, o una combinación de los mismos.
10. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además medios de soporte adaptados para soportar el(los) cita-
do(s) microchip(s) en relación con la citada unidad de control fluídico, de una manera tal que asegura la conexión hermética al fluido entre ambos.
11. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un detector dispuesto por fuera del, o de cada, microcanal citado, estando dicho(s) detector(es) interconectado(s) con el(los) citado(s) microchip(s).
12. Aparato de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho detector es un fotomultiplicador, un espectrómetro de masas, o un sistema de resonancia magnética nuclear (NMR).
13. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho microchip comprende una red o matriz de microcanales interconectados.
14. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se lamina o se encola una capa de polímero para sellar el citado microcanal.
15. Aparato de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende una disposición de microcanales interconectados en la que una pluralidad de microcanales convergen hacia un único microcanal, con lo que dicha disposición comprende una única punta de microcanal y una pluralidad de extremos de conexión microfluídica, o una pluralidad de puntas de microcanal y un sólo extremo de conexión microfluídica.
16. Aparato de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichos canales interconectados no están dispuestos en el mismo plano de dicho microchip, sino que están fabricados en tres dimensiones.
17. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una porción de las paredes de dicho microcanal ha sido modificada con medios químicos, biológicos o físicos, o mediante la provisión de material poroso o mediante una combinación cualquiera de los que se mencionan anteriormente.
18. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho microcanal comprende una fase sólida.
19. Aparato de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicha fase sólida comprende moléculas, una membrana, un gel, un sol-gel o perlas.
20. Aparato de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, que comprende además moléculas injertadas en al menos dicha porción de paredes de dicho microcanal y/o en dicha membrana, gel, sol-gel o perlas.
21. Aparato de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dichas moléculas son proteínas, péptidos, antígenos, anticuerpos, enzimas, oligonucleótidos, secuencias de ácido nucleico, haptenos o una combinación de los mismos.
22. Aparato de acuerdo con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que dichas moléculas están injertadas mediante adsorción física o química, mediante enlace covalente, o mediante una combinación de los mismos.
23. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que dicha membrana separa físicamente dos soluciones o fases.
24. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta ha sido formada en el borde de dicho microchip.
25. Aparato de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha punta es ahusada hacia el extremo de dicho microchip.
26. Aparato de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, en el que dicha punta posee una configuración piramidal, paralelepipédica o cónica.
27. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta está adaptada para generar una electropulverización por medio de dicho al menos un electrodo integrado en el citado microcanal.
28. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta está integrada en, o está circundada por, un depósito de fluido.
29. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta comprende un electrodo.
30. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un medio de soporte comprende un sistema de afianzamiento para asegurar una conexión hermética al fluido entre dicho(s) extremo(s) de conexión microfluídica y la citada unidad de control microfluídico.
31. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho aparato y/o el citado microchip pueden ser desplazados en dirección X, Y y Z, ya sea manualmente o ya sea por medio de un dispositivo automatizado.
32. Aparato de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicho dispositivo manual o automatizado permite la modificación de la orientación del microchip con el fin de cambiar el ángulo de orientación de dicha punta de microcanal.
33. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una unidad de control de temperatura, una cámara de aislamiento eléctrico (por ejemplo, una jaula de Faraday), y/o una cámara de humedad controlada que evita la evaporación.
34. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha unidad electroquímica, dicha unidad de control microfluídico, y si están previstos, dichos medios de soporte, se han integrado en una plataforma única, con el fin de proporcionar un sistema portátil.
35. Aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se encuentra conectado además a, y/o está integrado en, un ordenador.
36. Un procedimiento de realización de un ensayo microfluídico con monitorización electroquímica in situ de la presencia, velocidad o flujo de un fluido en un microcanal, utilizando el aparato de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) disponer una muestra en contacto con la citada punta de microcanal;
(b) llenar el citado microcanal con la citada muestra, ya sea por acción capilar o ya sea por bombeo o aspiración de la citada muestra por medio de dicha unidad de control microfluídico;
(c) utilizar la citada unidad de control microfluídico, tanto para arrastrar, empujar o bloquear la citada muestra en el citado microcanal;
(d) accionar la citada unidad electroquímica para monitorizar, a través de dicho al menos un electrodo integrado, la presencia, la velocidad o el flujo de un fluido en la posición local de dicho al menos un electrodo integrado, mediante medición electroquímica de una reacción de reducción o de oxidación en la misma, y
(e) opcionalmente, repetir las etapas (a) a (d) anteriores.
37. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la etapa (d) comprende monitorizar la presencia de dicho fluido, y la señal obtenida en la etapa (d) se utiliza para comprobar el resultado de dicho ensayo microfluídico.
38. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, en el que la etapa (d) comprende monitorizar la velocidad o el flujo de dicho fluido, y la señal obtenida en la etapa (d) se utiliza para calibrar o corregir el resultado de dicho ensayo microfluídico.
39. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, 37 ó 38, en el que una pluralidad de muestras y/o de otras soluciones se introducen en dicho microcanal utilizando la citada unidad de control microfluídico.
40. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39, en el que dichas otras soluciones son soluciones de lavado, soluciones amortiguadoras, y/o soluciones de reactivo.
41. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en el que dicho fluido, dicha(s) muestra(s), o la(s) citada(s) otra(s) solu
ción(es) contienen uno de entre un anticuerpo, una enzima, un oligonucleótido, un hapteno, una molécula de ADN, una secuencia de ácido nucleico, o similar.
42. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, que comprende además la etapa de añadir una especie electroactiva a dicha(s) muestra(s) o a la(s) otra(s) solución(es) citada(s), y monitorizar las sustancias microfluídicas de las mismas realizando un(os) ensayo(s) electroquímico(s), por ejemplo midiendo la generación de una corriente resultante de la reducción y/o la oxidación de dicha especie electroactiva en la posición local de dicho al menos un electrodo integrado.
43. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, en el que dicha monitorización electroquímica in situ de la presencia, ausencia, velocidad o flujo de un fluido en un microcanal, se realiza durante al menos una etapa de un ensayo de afinidad para el que dicho al menos un electrodo integrado sirve como medio de detección electroquímica para calibración o comprobación.
44. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42 ó 43, en el que dicha especie electroactiva añadida es un compuesto de ferroceno.
45. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, en el que un software procesa los datos obtenidos durante la monitorización electroquímica de las sustancias microfluídicas para realizar dicha calibración interna de la señal de detección final.
46. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 45, que comprende además la etapa de poner dicha punta de microcanal en contacto con un depósito de solución para permitir la toma o la descarga de una muestra y/o de otra solución.
47. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 46, en el que dicha punta de microcanal se utiliza como parte desechable del dispositivo de medición con pipeta.
48. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47, en el que se impide el llenado de la muestra en dicho microcanal por acción capilar, ya sea por medio de dicha unidad de control microfluídico o ya sea mediante la presencia de una barrera hidrofóbica en dicha punta de microcanal.
49. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 48, en el que dicha punta es ahusada hacia el extremo del citado microchip.
50. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 49, en el que dicha punta ahusada se inserta en un depósito de solución para la toma y/o la descarga de fluido.
51. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 49, en el que dicha punta se utiliza para generar una electropulverización por medio de al menos un electrodo integrado en el citado microcanal.
52. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 51, que comprende la etapa adicional de inyectar dicha(s) muestra(s) o dicha(s) otra(s) solución(es) contenida(s) en el citado microcanal, en un dispositivo de purificación, separación y/o detección, como por ejemplo un cromatógrafo, un espectrómetro, un fotómetro, un gel, una columna, una membrana selectiva, un filtro, o un aparato de separación electroforética.
53. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 52, en el que el ensayo realizado en dicho microcanal se detecta o se sigue utilizando absorción de luz, luminiscencia (por ejemplo fluorescencia, bioluminiscencia, quimiluminiscencia, electroquimiluminiscencia), electroquímica o espectrometría de masas.
54. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 53, en el que las señales electroquímicas medidas para la citada monitorización electroquímica de la presencia, ausencia, velocidad o flujo de un fluido en dicho microcanal, y dicho resultado final de ensayo microfluídico, son obtenidos por medio de dicho al menos un electrodo integrado.
55. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 54, para la realización de análisis y/o síntesis químicos y/o biológicos.
56. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 55, en el que el resultado microfluídico final se obtiene mediante análisis de espectrometría de masas.
57. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 56, en el que dicho aparato comprende medios para desalar muestras con anterioridad a su inyección en un espectrómetro de masas mediante generación de una electropulverización, o con anterioridad a la dispensación de dichas muestras sobre una placa matriz de ionización de desorción iónica asistida (MALDI).
58. Uso de un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 para realizar análisis y/o síntesis químicos y/o biológicos.
59. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 en análisis de espectrografía de masas.
60. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 ó 59 para realizar diagnósticos clínicos, humanos o veterinarios in vitro.
61. Uso de acuerdo con la reivindicación 60 para la realización de ensayos inmunológicos.
62. Uso de acuerdo con la reivindicación 58, para llevar a cabo ensayos físico-químicos, ensayos toxicológicos, ensayos de afinidad, ensayos microbiológicos y/o ensayos celulares.
63. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 para realizar mediciones de lipofilicidad, reacciones de transferencia de iones, ensayos de solubilidad y/o pruebas de permeabilidad.
64. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 para realizar síntesis mediante química combinatoria.
65. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 64, para realizar análisis y/o síntesis químicos y/o biológicos con calibración electroquímica interna del resultado final del ensayo.
66. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 65, en el que la señal obtenida durante la monitorización electroquímica in situ de (a) la presencia o ausencia, o (b) la velocidad o el flujo de una especie electroactiva, sirve (a) para comprobar o (b) para calibrar o validar el resultado final del ensayo microfluídico, respectivamente.
67. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 65 para realizar un análisis y/o una síntesis completamente automatizados.
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