ES2271330T3 - Dispositivo y procedimiento de ensayo quimico microfluidico. - Google Patents
Dispositivo y procedimiento de ensayo quimico microfluidico. Download PDFInfo
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Abstract
Un aparato de ensayo electroquímico microfluídico, que comprende: al menos un microchip, disponiendo el, o cada, microchip citado de al menos un microcanal sellado que permite manipulaciones microfluídicas y que posee: un extremo de punta adaptado para la toma de una muestra fluido en, y/o la descarga de una muestra de fluido desde, el citado microcanal; un extremo de conexión microfluídica; y un electrodo integrado en dicho microcanal de tal manera que está en contacto directo con un fluido presente en dicho microcanal; una unidad de control microfluídico que comunica con el citado extremo de conexión microfluídica de dicho microcanal, y que está adaptada para empujar, extraer o bloquear fluidos en el citado microcanal; que se caracteriza por una unidad electroquímica adaptada para monitorizar, a través de dicho al menos un electrodo integrado, la presencia, la velocidad o el flujo de un fluido en la posición local de dicho al menos un electrodo integrado, mediante medición electroquímicade una reacción de reducción o de oxidación en la misma.
Description
Dispositivo y procedimiento de ensayo químico
microfluídico.
Esta invención se refiere a dispositivos y
procedimientos para llevar a cabo, de forma totalmente o
semi-automatizada, ensayos o reacciones
electroquímicos en microchips fluídicos.
En los últimos años, la miniaturización de
herramientas analíticas químicas y bioquímicas ha resultado ser un
campo en expansión. Los principales factores que fomentan el
desarrollo de aparatos químicos miniaturizados, son el deseo de un
consumo de analito reducido, un análisis rápido y una capacidad de
automatización mejorada. Estas necesidades son particularmente
evidentes en el sector de las ciencias biológicas, en el que los
diagnósticos biomédicos, los análisis genéticos, proteólisis y alta
capacidad de rendimiento en el descubrimiento de medicamentos, han
resultado ser crecientemente importantes. La necesidad de limitar el
consumo de analito se ha visto acentuada por el creciente número de
ensayos que se realizan, el uso de reactivos para análisis que
requieren que se mantenga tan bajo como sea posible con el fin de no
sólo reducir costes sino también limitar la producción de desechos.
En el caso de los diagnósticos biomédicos, se requiere con
frecuencia el análisis de volúmenes extremadamente pequeños y
resulta deseable la minimización del tiempo de análisis, como son
los procedimientos de manipulación simplificados que reducen las
manipulaciones y minimizan la contaminación cruzada de una muestra a
otra muestra. Con anterioridad, se han investigado dos estrategias
diferentes pero complementarias para conseguir estos objetivos: los
dispositivos microfluídicos y las matrices 2-D de
alta densidad con reactivos de afinidad inmovilizados.
En el campo de los sistemas microanalíticos, un
tema muy importante para el desarrollo de dispositivos
verdaderamente operativos consiste en la automatización de los
ensayos, puesto que la reproductibilidad de las mediciones y también
el número de análisis que se pueden realizar pueden ser así
mejorados significativamente. Para la automatización de las
mediciones utilizando microsistemas, el punto más crítico consiste
probablemente en el sistema de dispensación de reactivo. Hasta
ahora, se han desarrollado algunos dispositivos automatizados para
micro-procedimientos basados en redes paralelas
altamente densas, tales como matrices de
micro-puntos o de micro-cavidades.
En estos casos, los sistemas de suministro están generalmente
compuestos por una o varias agujas que permiten la aspiración y la
dispensación de los volúmenes requeridos de reactivos en puntos muy
precisos. En el caso de sistemas microfluídicos, un problema clave
adicional para la automatización de las mediciones consiste en el
llenado de microcanales y en el control del movimiento de los
reactivos en el interior de los mismos. Con anterioridad se han
desarrollado sistemas automatizados microfluídicos basados en
electroforesis capilar; por ejemplo, un analizador completo de ADN
fue implementado en un único dispositivo con una cámara de reacción
de cadena de polimerasa seguida de separación electroforética.
Se han desarrollado algunos procedimientos
analíticos automatizados, en los que se utilizan puntas de
micropipeta como fases sólidas de la reacción y para la manipulación
del reactivo. Esto se ha hecho inmovilizando biomoléculas, tales
como anticuerpos, sobre las paredes de las puntas, y utilizando
estas puntas para medir con pipeta los reactivos. Utilizando una
alternativa de este tipo, se pueden limitar los riesgos de
contaminación de una muestra a otra muestra. La conexión de los
dispositivos microfluídicos con la solución de muestra externa, ha
sido direccionada a través de diferentes medios, tal como conectando
el chip microfluídico a un capilar, y haciendo gotear a continuación
el capilar en la solución de muestra y bombeando la solución al
interior del microchip mediante flujo electroforético (documento WO
00/21666). En otros casos, el chip se ha conectado a un número de
bombas microjeringa con el fin de suministrar la muestra al interior
del microchip (documento WO 01/63270). Algunos dispositivos han
utilizado pulsos para permitir que la muestra entre en el chip con
gas o con alta tensión (documento US 6.395.232). Otros han utilizado
relleno capilar procedente de una punta de aguja con canal atacado
químicamente, para tener su canal sometido a muestreo por acción
capilar, y para realizar ensayos electroquímicos tales como
detección de glucosa (Sensor Actuator A, vol. 95, 2002,
108-113). Tales procedimientos no permiten ningún
control de los fluidos en el interior del canal.
El documento US 5.580.523 A describe un
sintetizador químico integrado que posee reactores que pueden ser de
tipo electroquímico.
Cuando se realizan pruebas analíticas, resulta
de principal importancia controlar la velocidad de flujo durante el
suministro de la muestra. En efecto, debido al volumen tan pequeño
del canal (del orden de picolitros a microlitros), pequeñas
variaciones en la velocidad de flujo de la muestra inducen una
variación drástica en el volumen que se transfiere a través del
canal. Si la reacción incluye inmuno-sorción o
fisi-sorción, por ejemplo, se puede producir una
desviación severa de la detección para la misma concentración de
muestra. Por esta razón, la presente invención tiene como objetivo
controlar y monitorizar el flujo de la solución de muestra a través
de medios electroquímicos.
La invención está definida por el alcance de las
reivindicaciones 1, 36 y 58 anexas, junto con las reivindicaciones
dependientes que definen realizaciones preferidas.
El aparato y los procedimientos relacionados de
la presente invención, son adecuados para realizar ensayos o
reacciones de forma automatizada o semiautomatizada en microchips.
Los microchips incluyen microcanales o matrices o redes de
microcanales, que permiten el manejo de la muestra y de los
reactivos, así como la consecución de reacciones seguidas de eventos
electroquímicos. Éstos pueden ser utilizados también para
manipulación de reactivos solamente, por ejemplo en el caso en que
se utilice el presente aparato para extraer o dispensar fluidos
desde un microchip.
Por lo general, los microchips incorporan
microcanales sellados con dos aberturas (una en cada extremo), y
pueden ser fabricados utilizando diferentes materiales incluyendo
los materiales conductores para su uso en ensayos
electroquímicos.
Se puede fabricar individualmente uno o varios
microchips individuales o interconectados y/o sobre el mismo
soporte. Éstos pueden ser utilizados individualmente o como matriz
de microestructuras independientes o interconectadas.
Con preferencia, el extremo inferior del
microchip incorpora al menos una punta conectada al (a los)
microcanal(es) que se pondrá en contacto con la solución de
muestra que se va a ser analizada o va a reaccionar. La parte
superior del microchip contiene con preferencia una salida para
el(los) microcanal(es)
que puede estar conectada con un dispositivo de control microfluídico automatizado que permita el llenado y/o el vaciado de los microcanales. En algunas realizaciones, el dispositivo de control fluídico puede ser una simple micropipeta para bombeo mecánico. Con preferencia, los microchips son susceptibles de desplazamiento (por ejemplo, desplazamiento secuencial) según las direcciones X, Y y/o Z, ya sea con medios automatizados o ya sea de forma manual.
que puede estar conectada con un dispositivo de control microfluídico automatizado que permita el llenado y/o el vaciado de los microcanales. En algunas realizaciones, el dispositivo de control fluídico puede ser una simple micropipeta para bombeo mecánico. Con preferencia, los microchips son susceptibles de desplazamiento (por ejemplo, desplazamiento secuencial) según las direcciones X, Y y/o Z, ya sea con medios automatizados o ya sea de forma manual.
El control del flujo en la microestructura
durante el muestreo, es importante para permitir resultados
reproducibles. Por esta razón, el aparato incorpora un electrodo
integral para monitorizar el flujo de fluido en la microestructura.
Se conoce bien el hecho de utilizar un electrodo, no sólo para
detectar si un canal está lleno o vacío, sino también para medir el
flujo de solución mediante amperometría. La detección de la
conductividad puede ser utilizada para medir el tiempo requerido
para que la solución atraviese la microestructura. Esto puede
hacerse disponiendo diferentes pares de electrodos a la entrada, en
diferentes lugares a lo largo de la microestructura, y a la entrada
o la salida de la microestructura. El control fluídico puede ser
realizado monitorizando la velocidad de flujo por medio de detección
amperométrica, habiéndose demostrado previamente que la corriente
detectada depende de la velocidad de flujo de acuerdo con la
ecuación de likowich:
I =
0,925nFcL(lD)^{2/3}(Fv/h^{2})^{1/3}
donde I es la corriente, n el
número de electrones intercambiados por molécula oxidizada, L es la
anchura del electrodo, l es la longitud del electrodo, D es el
coeficiente de difusión de la molécula oxidizada, Fv es la velocidad
de flujo, h es la altura media del canal, d es la anchura del
canal.
Se debe apreciar que esta clase de medición
electromecánica puede ser cuantitativa (es decir, cuando se utiliza
amperometría para monitorizar la concentración de una especie
electroactiva). Por lo tanto, la señal medida durante la carga de
muestra, durante las diversas etapas de un ensayo (incubación,
lavado, etc), o durante la adición de reactivos, puede ser utilizada
para ajustar la señal de detección obtenida al final del ensayo.
Como ilustración, en el caso de por ejemplo un ensayo
inmunosorbente, la corriente medida durante las etapas de lavado,
carga de la muestra o las adiciones de reactivo, varía de
microestructura en microestructura, y la señal obtenida al final del
ensayo es muy probable que sea diferente de microestructura en
microestructura. En efecto, la variación de la corriente medida
indica que las velocidades de flujo no eran iguales en todos los
microcanales, ni, posiblemente, en todas las etapas del ensayo. Como
consecuencia, el tiempo de estancia de las moléculas en las
microestructuras varía, lo que genera también variación en los
valores finales obtenidos para el ensayo. Con el control
electroquímico de las sustancias fluídicas, es posible entonces
corregir estas variaciones y con ello, mejorar la precisión y la
repetitividad de los ensayos.
De esta manera, el aparato y los procedimientos
de esta invención, proporcionan un medio para llevar a cabo análisis
con calibración interna del ensayo. Como ejemplo, fluirán muestras
con ligeros cambios de viscosidad por el interior de las
microestructuras a diferentes velocidades; de forma similar, se
pueden bombear soluciones o ser empujadas por el interior de la
microestructura a diversas velocidades dependiendo de la precisión
de la unidad de control microfluídico. Una gran ventaja del presente
aparato consiste en que estas variaciones pueden ser monitorizadas
por medio de la unidad electroquímica. El resultado final del
análisis puede ser así corregido teniendo en cuenta las variaciones
microfluídicas monitorizadas electrónicamente durante las diversas
etapas del ensayo. Tales mediciones y el posterior procesamiento de
datos, proporcionan por tanto una calibración interna, lo que mejora
considerablemente la precisión y la repetitividad de los
análisis.
Los microchips pueden contener también medios
para controlar la temperatura, para la minimización del ruido
electrónico, y para la minimización de la evaporación.
Con anterioridad al uso del aparato de acuerdo
con la invención, se dispensan los reactivos en el microcanal o en
una matriz de microestructuras. Las puntas de los microchips que
componen las entradas de la microestructura, se sumergen en
cavidades o depósitos, y el sistema de control fluídico permite el
llenado y/o el vaciado de la(s) microestructura(s) con
los reactivos. Utilizando esta técnica con implementaciones que
poseen una pluralidad de microestructuras, todas las
microestructuras pueden ser llenadas con los mismos o con diferentes
reactivos simultáneamente, y los riesgos de contaminación
muestra-a-muestra quedan así
limitados. Para algunas aplicaciones, la(s)
punta(s)
de microestructura puede(n) estar integrada(s) en un depósito en el que puede ser cargada la muestra.
de microestructura puede(n) estar integrada(s) en un depósito en el que puede ser cargada la muestra.
El sistema puede ser utilizado para llevar a
cabo reacciones o ensayos en microcanales. Se puede emplear en
presencia de una fase molecular en solución o fijado a la superficie
de la microestructura o en un material sólido integrado en la
microestructura, por ejemplo una membrana, un filtro, perlas o
similares.
Dependiendo de la reacción o del ensayo, la
detección puede ser realizada utilizando varios principios. El
transductor que se necesita para la medición de las señales, puede
estar colocado en contacto próximo con, o incluso integrado en, los
microchips.
El término "microchip", según se utiliza
aquí, se refiere a cualquier sistema que comprenda al menos una
estructura miniaturizada (o microestructura), que sea una cámara de
reacción o de separación o un conducto similar a una
micro-cavidad, un micro-canal, un
micro-orificio, y similares, sin limitación en
cuanto a forma y tamaño, pero que permitan manipulaciones
microfluídicas. En la presente invención, al menos una de tales
microestructuras miniaturizadas comprende al menos un electrodo para
llevar a cabo ensayo(s) electroquímico(s) (según se
define más adelante). El electrodo está conectado al aparato de
control fluídico, y se utiliza para diferentes eventos
electroquímicos (según se describe más adelante). En todos los
casos, el electrodo puede servir para comprobar si el canal se llena
o no homogéneamente durante las etapas de toma de muestra y/o de
ensayo, y para controlar si cada canal está vacío o si se ha
realizado un cambio de solución durante un experimento
multi-etapa. Los parámetros importantes, tal como la
velocidad de flujo, pueden ser controlados en cualquier momento
durante el ensayo con los medios electroquímicos. En este sentido,
la presencia del electrodo, conectado a la unidad de control
fluídico, es único y proporciona varias ventajas frente a
alternativas similares que utilizan detección óptica y en las que el
flujo no puede ser monitorizado de manera tan precisa.
El término "microcanal", según se utiliza
aquí, se refiere a un microcanal simple, una matriz de microcanales,
o una red de microcanales interconectados, sin limitación en cuanto
a número o configuración, pero que están sellados y que tienen una
sección transversal que permite la manipulación microfluídica.
Los microchips y microcanales son
preferentemente desechables, y pueden ser fabricados con diversos
materiales, tales como por ejemplo, vidrio, cuarzo, polímero (por
ejemplo, polietileno, poliestireno, tereftalato de polietileno,
polimetilmetacrilato, poliimida, policarbonato, poliuretano o
poliolefinas), una serie de polímeros o una combinación de los
mismos. También pueden contener elementos suplementarios tales como,
aunque sin limitación, membranas, cámaras con perlas, fase sólida,
sol-gel, electrodos, almohadillas conductoras o
bobinas para controlar la temperatura y/o el flujo electrocinético.
Los electrodos pueden ser utilizados para llevar a cabo mediciones
electroquímicas o para aplicar una alta tensión para transferir la
muestra a un espectrógrafo de masas por medio de alguna técnica de
electropulverización.
El término "punta" ha sido previsto para
que se refiera a un extremo de la(s) estructura(s)
miniaturiza-
da(s) contenida(s) en el microchip, desde la que se una muestra se carga en la estructura miniaturizada o bien se dispensa hacia fuera de la estructura miniaturizada. El término "extremo de conexión" (también mencionado como "extremidad de conexión"), está previsto que se refiera a la segunda extremidad de la estructura miniaturizada que está conectada a la unidad de control microfluídico del aparato de esta invención. Para mayor claridad, en el caso en que la estructura miniaturizada es un microcanal, la punta se refiere o bien a la entrada o bien a la salida del microcanal que no está conectada a la unidad de control microfluídico (también citada como "dispositivo de medición con pipeta" en relación con algunas realizaciones). La punta puede ser fabricada con diferentes características geométricas tal como dotada de una entrada de microcanal en la dirección del microcanal o perpendicular al mismo, o en la pared lateral del microcanal; también puede estar sumergida en un depósito o circundada por un depósito de fluido; finalmente, la punta se realiza con preferencia con el mismo cuerpo que el propio microchip, sin extensión hasta el sistema de conexión o capilar externo.
da(s) contenida(s) en el microchip, desde la que se una muestra se carga en la estructura miniaturizada o bien se dispensa hacia fuera de la estructura miniaturizada. El término "extremo de conexión" (también mencionado como "extremidad de conexión"), está previsto que se refiera a la segunda extremidad de la estructura miniaturizada que está conectada a la unidad de control microfluídico del aparato de esta invención. Para mayor claridad, en el caso en que la estructura miniaturizada es un microcanal, la punta se refiere o bien a la entrada o bien a la salida del microcanal que no está conectada a la unidad de control microfluídico (también citada como "dispositivo de medición con pipeta" en relación con algunas realizaciones). La punta puede ser fabricada con diferentes características geométricas tal como dotada de una entrada de microcanal en la dirección del microcanal o perpendicular al mismo, o en la pared lateral del microcanal; también puede estar sumergida en un depósito o circundada por un depósito de fluido; finalmente, la punta se realiza con preferencia con el mismo cuerpo que el propio microchip, sin extensión hasta el sistema de conexión o capilar externo.
El término "unidad de control
microfluídico" o "dispositivo de medición con pipeta"
significa un dispositivo que comprende tubos o capilares y que
permite la generación de un flujo molecular no turbulento, por
convección, migración o una combinación de ambas; la conexión entre
el microchip y la unidad de control microfluídico puede realizarse
afianzando el microchip de modo que las conexiones microfluídicas se
sitúen en posición alineada con respecto al(a los)
extremo(s) de conexión de la microestructura; la unidad de
control microfluídico proporciona un medio susceptible de generar un
flujo de moléculas mediante tracción o empuje de solución, y/o para
bloquear la solución en las estructuras miniaturizadas cuando esto
sea necesario durante una reacción o en el tiempo de espera. La
unidad de conexión microfluídica puede estar también ventajosamente
acoplada a depósitos de solución que contengan los reactivos
necesarios para llevar a cabo una reacción o un ensayo, así como
también agentes de bloqueo, amortiguadores, soluciones de lavado, y
similares.
El término "ensayo electroquímico" se
referirá a cualquier experimento electroquímico que haga uso de la
conductividad eléctrica y de la energía con el fin de llevar a cabo
una reducción, una oxidación o una reacción de transferencia iónica,
lo para llevar a cabo mediciones de conductimetría y/o de
impedancia, o para generar un campo eléctrico en una solución, como
por ejemplo para realizar mediciones de ionoforesis o de
afianzamiento de parche, o para inducir bombeo electrocinético o de
electro-osmosis, o para generar una
electropulverización según pueda ser utilizada, por ejemplo, para
transferir moléculas desde la punta de una estructura miniaturizada
hacia un espectrómetro de masas.
El aparato de esta invención comprende también
una "unidad electroquímica" que constituye el aparato
electrónico requerido para realizar cualquiera de los ensayos
mencionados anteriormente. Por ejemplo, puede incluir almohadillas
conductoras que permitan la conexión eléctrica entre la presente
solución en la(s) estructura(s)
miniaturizada(s) y el dispositivo utilizado para realizar el
ensayo electroquímico (por ejemplo, un potenciostato, una fuente de
energía eléctrica controlada, una unidad de medición de impedancia,
y similares).
La combinación de los elementos anteriores
permite la realización de ensayos electroquímicos precisos en
microchips: una estructura miniaturizada que comprende un medio de
punta para cargar y/o dispensar una muestra, así como también una
conexión a una unidad de control microfluídico, y al menos un
electrodo conectado a la unidad electroquímica que permite llevar a
cabo ensayo(s) electroquímico(s).
En algunas aplicaciones, se puede añadir
ventajosamente una especie electroactiva a la solución de muestra,
con el fin de seguir las sustancias microfluídicas mediante la
generación de una señal electroquímica, por ejemplo la corriente
resultante de la reducción y/o la oxidación de esta especie
electroquímica o de la resistencia a lo largo de la microestructura.
Esto se puede utilizar ventajosamente para proporcionar una
calibración interna del análisis realizado con el presente aparato,
puesto que los resultados finales pueden ser corregidos de acuerdo
con las variaciones de la señal electroquímica medida durante las
etapas microfluídicas de los ensayos.
El aparato de esta invención puede estar también
conectado ventajosamente a, o incluso integrado en, un ordenador,
permitiendo con ello el procesamiento de datos en línea y el control
computarizado de los ensayos o reacciones.
Este aparato se utiliza preferentemente para
realizar análisis o reacciones biológicas o químicas, tales como,
aunque sin limitación a ninguna clase de mediciones de
espectrometría de masas, ensayos diagnósticos in vitro o
in vivo, todas las clases de ensayos de afinidad o
toxicológicos y de caracterizaciones
físico-químicas, o la síntesis combinacional de
productos.
La invención va a ser descrita en lo que sigue
con mayor detalle, a título de ejemplo solamente, con referencia a
las figuras anexas, en las que:
La Figura 1 es una representación esquemática
que muestra algunos ejemplos de estructuras de microchip y de
microcanal y de conexiones de acuerdo con la invención;
La Figura 2 es una representación esquemática
que muestra una vista (A) lateral y una vista (B) en planta de una
realización de aparato de acuerdo con la presente invención;
La Figura 3 es una representación esquemática de
una realización de aparato de acuerdo con la invención, que
comprende una serie de microcanales conectados a un sistema
automatizado que permite tanto la aspiración de los reactivos como
el desplazamiento de los microchips en direcciones X, Y y Z;
La Figura 4 es una representación esquemática
del principio de un inmuno-ensayo de sándwich
realizado en un microchip situado en una realización de aparato de
acuerdo con la invención;
La Figura 5 es una representación esquemática de
la interconexión de una serie de microcanales con un espectrómetro
de masas que utiliza una realización de aparato de acuerdo con la
invención;
La Figura 6 es una serie de fotografías de una
realización de aparato de acuerdo con la presente invención, que se
utiliza para tomar una muestra situada en depósitos 18 de solución
(mencionada aquí como placa microconcentradora); la Figura 6A
muestra una vista general del aparato con un microchip que comprende
una serie de 8 microestructuras que está soportado en un sistema de
Plexiglás que permite la conexión con la unidad electroquímica (no
representada) por medio de almohadillas 15 eléctricas integradas en
el microchip, así como también la conexión con la unidad de control
microfluídico (representada sólo parcialmente) a modo de pequeños
orificios 10 de conexión y tubuladuras 10'; la Figura 6B muestra una
vista más cercana del microchip y de los sistemas de conexión con
las unidades de control electroquímico microfluídico; las Figuras 6C
y 6D muestran las mismas partes del aparato que las Figuras 6A y 6B,
pero en una posición en la que las puntas 3 de la microestructura
penetran en los depósitos de solución con el fin de tomar las
muestras deseadas;
La Figura 7 es una fotografía de una realización
de aparato de acuerdo con la presente invención, que comprende un
microchip que posee puntas de microestructura en la parte superior
del microchip y que están rodeadas por depósitos;
La Figura 8 muestra la secuencia operativa de un
ensayo multi-etapa realizado con una realización de
aparato de la invención, que comprende las etapas de: A) conectar un
microchip que tiene una punta de estructura rodeada por un depósito,
a una unidad electroquímica (no representada) y a una unidad 11 de
control microfluídico desde las que soluciones o incluso aire
31-34 pueden se bombeadas, aspiradas, o bloqueadas
en la microestructura; B) cargar una muestra en el depósito 28 de
solución; C) llenar la microestructura con la solución de muestra,
ya sea por capilaridad o ya sea por aspiración, utilizando la unidad
de control microfluídico, y dejando eventualmente que la solución de
muestra encubé dentro de la microestructura; D) vaciar la
microestructura bombeando ya sea aire o ya sea una solución 31 hacia
la microestructura, expeliendo con ello la solución de muestra hacia
el depósito 28 y llenando los tubos 10' de conexión con una o una
serie 32-34 de soluciones; E) dispensar estas
soluciones en la microestructura; F) realizar un ensayo
electroquímico (ya sea durante el bombeo de una o de todas las
soluciones 31-32 en el interior de la
microestructura o con el bloqueo de una o, secuencialmente, de cada
una de estos soluciones en el interior de la microestructura);
La Figura 9 muestra la secuencia operativa de un
ensayo multi-etapa realizado con una realización de
aparato de acuerdo con la invención, similar a la secuencia mostrada
en la Figura 8, pero donde la punta de la microestructura se pone
en contacto con la solución de muestra y, opcionalmente, donde la
etapa final consiste en dispensar la solución de analito en un
espectrómetro 25 de masas mediante la generación de una
electropulverización 26, y
La Figura 10 es un ejemplo del resultado de un
ensayo electroquímico realizado con una realización de aparato de
acuerdo con la invención, que muestra cómo se pueden utilizar
señales electroquímicas para determinar la precisión del flujo de
solución controlado por la unidad de control de sustancias
microfluídicas. Esta Figura muestra la evolución vatimétrica cíclica
de la detección de 500 \muM de metanol ferroceno bajo convección
forzada, con el microcanal que se ha presentado en la Figura 3a a 10
mV/s; el inserto muestra la evolución de la corriente de placa a 300
mV respecto a la velocidad de flujo entre 0,2 y 128 \muL/h.
El concepto básico de la invención puede ser
entendido con referencia a las Figuras anexas, a partir de las
cuales van a ser detalladas en lo que sigue las diversas
realizaciones de la invención. Se debe entender que cada uno de los
canales presentados en las Figuras tiene un electrodo integrado de
tal modo que permite el control de flujo según se describe aquí. Por
motivos de claridad, los electrodos no se representan siempre.
La Figura 1A y B, muestra un ejemplo de
microchip 1 con diversas configuraciones de microcanal de
estructuras 2 miniaturizadas (microcanales simples y redes de
microcanales interconectados). La Figura 1A muestra la situación en
la que se ha cortado el chip en forma triangular, con el extremo en
el borde del microcanal, y la 1B muestra el chip con un extremo del
canal sobre el lado del microcanal. Cada una de estas
microestructuras contiene una o una pluralidad de puntas 3 y de
extremidades 4 de conexión. Una de estas microestructuras muestra un
electrodo 5 integrado, mientras que otra de estas microestructuras
muestra bobinas 6 integradas. Las extremidades de punta de los
microchips contienen las entradas de microcanal. Esta Figura muestra
también cómo algunos de los electrodos 5 y de las bobinas 6 pueden
ser integrados en los canales.
La red de microcanales del lado izquierdo,
ilustra el hecho de que dos microcanales pueden ser puestos en
contacto con el fin de realizar la separación y/o la reacción de dos
soluciones que pueden ser bombeadas simultáneamente desde las puntas
microfluídicas. Según se muestra en el centro de la Figura 1, más
de dos microcanales son convergentes hacia una zona de contacto que
permite la separación y/o la reacción. En algunas realizaciones, las
puntas microfluídicas no están dispuestas en el mismo plano, sino
que están hechas en un cuerpo multi-capa que permite
una disposición según las tres dimensiones.
Los microcanales pueden tener también diferentes
propiedades superficiales para evitar o favorecer la adsorción de
algunos compuestos sobre las paredes.
Los microcanales pueden ser también modificados
con algunos compuestos porosos, tal como, por ejemplo, membranas de
policarbonato, Teflón microporoso, u otros polímeros, permitiendo la
difusión específica de gas o de líquido. Esto puede encontrar
aplicación, por ejemplo, cuando las reacciones o los ensayos
realizados en los microcanales producen gas que necesita ser
eliminado, o cuando se ha de realizar experimentos de transferencia
de iones en la interfaz entre dos líquidos. También, membranas para
separar físicamente dos soluciones o fases pueden estar integradas
ventajosamente en el dispositivo microchip. Adicionalmente, tal
material poroso puede ser utilizado también para purificar una
muestra por adsorción de un compuesto presente en la muestra.
En la presente invención, el sistema de control
fluídico puede ser, aunque sin limitación, un sistema de aspiración
(por ejemplo, incluyendo el bombeo mecánico o a presión), un
dispositivo de flujo de fuerza capilar, o un dispositivo de flujo
impulsado electrocinético. El dispositivo de control fluídico puede
permitir el llenado y/o el vaciado de los microcanales. El sistema
de control fluídico puede estar conectado a un dispositivo
automatizado que permita el desplazamiento secuencial de los
microchips en las direcciones X, Y y/o Z. En otra realización, el
dispositivo de control fluídico puede ser también una micropipeta
única que permita el bombeo mecánico y el desplazamiento manual de
los microchips.
En algunas realizaciones, el dispositivo de
desplazamiento manual o automatizado puede permitir la modificación
de la orientación del(de los) microca-
nal(es) con el fin de cambiar el ángulo de exposición de la(s) extremidad(es) de punta del(de los) microcanal(es).
nal(es) con el fin de cambiar el ángulo de exposición de la(s) extremidad(es) de punta del(de los) microcanal(es).
La Figura 2 muestra una representación
esquemática (A: vista lateral; B: vista en planta) de un aparato de
acuerdo con la presente invención. El microchip 1 comprende una
matriz de ocho estructuras miniaturizadas, estando cada una de ellas
compuesta por un microcanal 2, una punta 3, y un extremo 4 de
conexión. El microchip se sitúa en un portador 7 que se ha fabricado
de modo que permite la alineación precisa de los extremos 4 de
conexión con la unidad 11 de control fluídico por medio de
conductos, tubos y/o capilares 10, 10'. El aparato comprende además
conexiones 12 eléctricas que permiten la conexión de la unidad 13
electroquímica con los electrodos 14 integrados en las estructuras
miniaturizadas y con las almohadillas 15 eléctricas dispuestas en el
microchip (estas conexiones eléctricas han sido mostradas solamente
para una de las ocho microestructuras).
En una realización, una solución de muestra
puede ser cargada en las microestructuras del aparato mediante el
depósito de una gota de solución en cada punta 3 de microcanal. Los
microcanales 2 se llena a continuación por capilaridad o por
aspiración utilizando la unidad 11 de control fluídico (tras haber
afianzado el soporte 16' de conexión sobre los microchips con la
aplicación de una presión sobre los resortes 17 con el fin de
inducir estanquidad).
A continuación, la solución de muestra puede ser
recuperada desde la microestructura utilizando la unidad de control
fluídico (por ejemplo, mediante aspiración o bombeo de aire o de
otra solución). Las microestructuras pueden ser a continuación
llenadas y vaciadas de nuevo con el fin de realizar etapas de
análisis adicionales.
En otra realización, la solución de muestra
puede ser introducida en las microestructuras mediante bombeo
utilizando la unidad de control microfluídico, con el fin de estar
en condiciones de controlar la velocidad de flujo durante tal
introducción de muestra. A continuación, las puntas de las
microestructuras son utilizadas, ya sea como interfaces con los
depósitos de residuos, o ya sea como sistemas de dispensación.
La unidad electroquímica puede ser utilizada
también en cualquier etapa de llenado, vaciado o bloqueo de la
solución de muestra en las microestructuras con el fin de realizar
un ensayo electroquímico. En algunas aplicaciones, el ensayo
electroquímico (por ejemplo, reducción u oxidación de un compuesto
electroactivo, o mediciones de conductividad o de impedancia), se
lleva a cabo durante todas las etapas de llenado y de vaciado de los
análisis con el fin de obtener una señal que mida el control
apropiado de las sustancias microfluídicas en cada
microestructura.
En otra realización, el aparato se utiliza para
controlar el llenado de la muestra en el interior de la
microestructura. A este efecto, el chip puede ser colocado
ventajosamente en el aparato con anterioridad a que la punta entre
en contacto con la muestra. En este caso, la microestructura se ha
conectado ya a la unidad de control microfluídico con anterioridad a
la aplicación de la muestra. Puesto que el microchip está conectado
herméticamente a la unidad de control microfluídico, el aire queda
bloqueado en el interior de la microestructura y no puede escapar
(no hay posibilidad de ventilación). De esta manera, cuando la punta
de la microestructura se pone en contacto con la muestra, esta
muestra no puede llenar la microestructura (no puede ocurrir ningún
llenado capilar), y esto puede ser comprobado merced al electrodo
integrado y a la unidad electroquímica. Con el fin de permitir que
la muestra rellene la microestructura, es necesario aplicar una
retro-presión por medio de la unidad de control
microfluídico. En otra realización, el microchip puede ser también
desconectado de la unidad de control microfluídico (por ejemplo,
accionando un sistema de afianzamiento utilizado para asegurar la
conexión hermética al fluido entre la microestructura y la unidad de
control microfluídico), de modo que el aire sea susceptible de
escapar hacia fuera de la microestructura a través de su extremo de
conexión, permitiendo con ello el llenado de la microestructura por
capilaridad. Una vez llena, la unidad de control microfluídico se
conecta de nuevo de modo que, o bien bloquea la muestra en el
interior de la microestructura, o bien bombea o empuja esta muestra
y/u otras soluciones. Tal control del llenado de muestra es de gran
ayuda para fijar de forma precisa el punto de inicio de una reacción
(es decir, el tiempo igual a cero), que es crucial para la precisión
de experimentos que dependen del tiempo de reacción (como por
ejemplo, en pruebas enzimáticas). Este método de bloqueo que utiliza
el aparato de esta invención, permite mejorar la precisión de los
ensayos y su repetitividad.
En una realización adicional, el chip puede
tener una barrera hidrofóbica para evitar el llenado por capilaridad
de la muestra. Éste estará de nuevo controlado por el electrodo
situado en el interior del microcanal. En este caso específico, sin
embargo, el microchip no necesita estar conectado a la unidad de
control microfluídico durante la aplicación de la muestra a la punta
de la microestructura.
En algunas realizaciones, la unidad de control
microfluídico se utiliza durante el análisis con el fin de bloquear
una solución de analito en el interior de las microestructuras. La
unidad electroquímica puede ser utilizada entonces ventajosamente
para inducir un flujo molecular por aplicación de un potencial; en
un análisis de este tipo, el aparato de esta invención puede ser así
utilizado para realizar experimentos de electroforesis.
La Figura 3 muestra cómo los microchips pueden
ser conectados a una unidad 11 de control microfluídico, que en este
caso es un sistema de aspiración semiautomático similar a un
dispositivo de medición con pipeta, que permite la dispensación de
los reactivos en los microcanales 2, y el desplazamiento de los
microchips 1 según las direcciones X, Y y Z. Las puntas de as
microestructuras 3 se sumergen secuencialmente en una serie de
depósitos 18 de solución (representados aquí como cavidades de una
placa microconcentradora), que contienen varios reactivos,
amortiguadores y/o soluciones de lavado. Los microcanales 2 son así
rellenados sucesivamente con los reactivos, amortiguadores y/o
soluciones de lavado necesarios para las reacciones o los
ensayos.
En una realización preferida, la invención puede
ser aplicada al campo de la química combinatoria, con lo que se
injertan moléculas sobre la superficie de las microestructuras y se
combinan con otras moléculas para la síntesis de nuevos compuestos
que después son liberados y analizados.
En algunas realizaciones, en las que las
reacciones o los ensayos realizados en los microcanales son
endotérmicos, la punta puede ser calentada por incubación de los
microchips en una cámara equipada con termostato, o haciendo pasar
corriente a través de los electrodos integrados, según se muestra
esquemáticamente en la Figura 1. Al contrario, la temperatura de la
solución puede ser reducida con el fin de detener la reacción.
En algunas realizaciones, la invención puede ser
utilizada para realizar ensayos (bio)químicos homogéneos o
heterogéneos en los microcanales. Estos ensayos pueden incluir un
elemento de (bio)reconocimiento altamente específico tal
como, aunque sin limitación, una enzima, un anticuerpo, un antígeno,
un hapteno, un ácido nucleico, un oligonucleótico o un péptido.
También se puede lograr un enlace covalente en los microcanales con
compuestos químicos que permitan un (bio)reconocimiento
específico. En este caso, los reactivos necesarios para los ensayos
pueden ser colocados en una placa ELISA con anterioridad a las
mediciones. Los microcanales pueden ser así utilizados, por ejemplo,
para realizar inmunoensayos homogéneos o heterogéneos.
Los microcanales pueden contener también
características específicas para realizar una separación y/o
purificación. A este fin, al menos una porción del microcanal puede
contener un compuesto adsorbido covalentemente o físicamente, o una
fase heterogénea (como un gel, una membrana, perlas y
similares).
La Figura 4 resume el principio el principio y
las etapas sucesivas necesarias para llevar a cabo un inmunoensayo
en sándwich en microchips 1 que incorporan a menos un electro 14,
según se utilizan en la presente invención. El microcanal 2 se llena
en primer lugar con una solución de anticuerpo 20 específica para el
analito. El anticuerpo es así adsorbido en las paredes de los
microcanales. La superficie se bloquea a continuación por incubación
de agente 21 de bloqueo (por ejemplo, solución de BSA). Este agente
de bloqueo se adsorbe en los sitios de las paredes del canal que
permanecían libres tras la adsorción del anticuerpo 20. Esto evita
el enlace no específico que podría ocurrir en las siguientes etapas
del ensayo. Las muestras que van a ser analizadas son incubadas a
continuación, lo que conduce al enlace del analito 22 deseado con el
anticuerpo 20. La última etapa incluye incubar un anticuerpo 23
conjugado etiquetado específico para el analito. Entre cada etapa,
los canales son lavados normalmente con agua o con soluciones
amortiguadoras con el fin de eliminar los compuestos no fijados. A
continuación se puede llevar a cabo la detección del complejo de
sándwich. Se pueden utilizar diferentes principios de detección
dependiendo de la (bio)química del ensayo. Durante las etapas
que preceden a la detección del complejo de sándwich, se realiza un
ensayo electroquímico con el fin de determinar la eficacia de la
unidad de control microfluídico. Por ejemplo, las mediciones de
conductimetría permiten una evaluación de si se han llenado las
microestructuras completamente con la solución; de manera similar,
pueden ser realizadas mediciones amperométricas con el fin de
evaluar la eficacia de las diversas etapas del ensayo.
Los ensayos o las reacciones llevadas a cabo en
los microcanales pueden ser detectados utilizando varios principios
tales como, aunque sin limitación, luminiscencia (fluorescencia,
VV/Vis, bioluminiscencia, quimiluminiscencia, electroluminiscencia),
electroquímica o espectrometría de masas.
En algunas realizaciones, los microchips son
interconectados con un detector situado fuera de los microcanales.
En este caso, el detector puede ser, por ejemplo, un tubo
fotomultiplicador o un espectrómetro de masas.
Con anterioridad a la etapa de detección, la
solución contenida en el microcanal puede ser sometida a una
purificación y/o a una etapa de separación (por ejemplo, utilizando
cromatografía, membranas selectivas, filtros o separación
electroforética).
La Figura 5 muestra como los extremos 3 de punta
de los microchips 1 pueden ser interconectados con un espectrómetro
25 de masas para la detección de una molécula. Con la terminación
de, por ejemplo, una reacción inmunológica en los microcanales 2, el
complejo se desorbe y se extrae. El extremo 3 de punta se utiliza
entonces para inyectar la parte extraída en el espectrómetro de
masas mediante generación de una electropulverización 26. A este
fin, la solución debe estar en contacto con un electrodo y con una
unidad electroquímica que sirve para aplicar una alta tensión entre
la microestructura y el espectrómetro de masas. La Figura 5 muestra
ese electrodo 14, el cual puede estar situado en varias posiciones
en los microcanales o en el extremo 4 de conexión de la
microestructura. Cuando este electrodo está integrado en el
microcanal, se fabrica una almohadilla 15 conductora directamente
sobre el microchip; El electrodo se enchufa también a continuación
en la unidad electroquímica por medio de conexiones 12
eléctricamente conductoras (por ejemplo, cables apantallados).
En algunas realizaciones, el detector puede
estar integrado en los microcanales. En este caso, el transductor
puede ser, por ejemplo, un electrodo o un fotodiodo.
En otras realizaciones, no se utiliza la punta
de microcanal para llenar el microcanal con la solución que
interesa, sino que se utiliza para dispensar la solución hacia fuera
del microcanal, hacia otro aparato de separación, purificación o
detección. A este fin, la unidad de control microfluídico permite el
control del volumen de solución dispensada desde las puntas de la
microestructura. Por ejemplo, el microcanal puede ser utilizado como
interfaz de electropulverización para análisis MS. En otra
realización, el microchip puede ser colocado horizontalmente, y una
serie de depósitos de solución (por ejemplo, una placa
microconcentradora) puede ser situada verticalmente de tal modo que
permita una toma de muestra más fácil en las microestructuras, y una
dispensación posterior de la solución en el espectrómetro de
masas.
La Figura 6 presenta varias vistas de un ejemplo
de aparato de acuerdo con la presente invención, en el que los
depósitos 18 de solución se disponen en contacto con las puntas 3 de
microestructura con el fin de llenar una serie de microcanales con
soluciones de analito. Es evidente que, o bien el microchip o bien
los depósitos de solución, pueden ser desplazados en todas las
direcciones X, Y y Z. El microchip que soporta las estructuras se
sitúa en un portador que permite la interconexión con las unidades
de control electroquímicas y microfluídicas (no representadas) por
medio de conexiones 15 eléctricas y de tubuladuras 10'. En este
caso, el microchip puede incorporar una fase sólida de tal modo que
permita la desalación, un ensayo de afinidad específica, u otra
preparación de la muestra. Una solución de pulverización, compuesta
por ejemplo de metanol, acetonitrilo y solución acídica, puede ser
almacenada en los tubos 10' y puede servir para desorber muestras
que han sido previamente inmovilizadas en el microchip. En una
realización, se pueden disponer microperlas en un depósito entre el
chip y la unidad de control microfluídico con el fin de permitir un
pre-tratamiento de la muestra (como por ejemplo,
reacciones de desalación o de afinidad), con anterioridad a los
análisis por espectrometría de masas.
En alguna realización, la punta de la
microestructura constituye una entrada por el lado del microchip en
contacto con la solución de muestra que va a ser analizada. La
Figura 7 muestra un ejemplo de tal punta de microestructura
insertada en un aparato de la presente invención. En este ejemplo,
los depósitos 28 pueden estar integrados en la parte superior de las
puntas de microestructura de tal modo que permitan que la solución
de muestra sea dispensada a través de las puntas hacia las
microestructuras. La solución puede entrar entonces en la
microestructura, ya sea por acción capilar o ya sea por aspiración
desde el extremo de conexión. En algunas realizaciones, el microchip
puede ser conectado al dispositivo de control fluídico de tal modo
que el llenado capilar será impedido por la
retro-presión asegurada por el dispositivo de
control fluídico. Solamente cuando el dispositivo de control
fluídico está aspirando, la muestra puede entrar en el canal. La
Figura 7 muestra también la unidad 13 electroquímica con sus
conexiones 12 eléctricas, la cual se utiliza para llevar a cabo
el(los) ensa-
yo(s) electroquímico(s) en cada microestructura.
yo(s) electroquímico(s) en cada microestructura.
Las Figuras 8 y 9 ilustran la secuencia de un
ensayo realizado con un aparato de la invención, dependiendo de la
forma de la muestra y de los reactivos que se dispensan en las
microestructuras, y con dos diseños de puntas de microestructura
diferentes. En la Figura 8, se ha integrado un depósito en el
extremo de punta de la microestructura y asegura el contacto de la
solución con el chip. Resulta apreciable que este depósito puede ser
utilizado para recibir soluciones sucesivas para la realización de
ensayos multi-etapa tales como síntesis, análisis, y
así sucesivamente. En una realización, se pueden cargar diferentes
reactivos 32, 33 y 34 en el tubo 10' de conexión de flujo no
turbulento, y ser separados con un solvente de entrada o incluso con
una burbuja 31 de gas. El bombeo de los diferentes reactivos en el
interior del microchip puede hacer que ocurra una reacción, tal
como, aunque sin limitarse a, ELISA, ensayos de afinidad, etapas de
lavado, etapa de desalación, etc.
En algunas realizaciones, el reactivo 31 a 35
puede contener perlas que son bombeadas por medio de la unidad de
control microfluídico tal como para empaquetarlas en el extremo de
las tubuladuras (10') de conexión, o en una posición deseada en el
interior de la microestructura. Estas perlas pueden tener diversas
propiedades físico-químicas y pueden ser
funcionalizadas con moléculas, dependiendo del uso de estas perlas.
Tal adición de perlas puede ser utilizada ventajosamente, por
ejemplo, para desalar una solución, para llevar a cabo una reacción
de afinidad, o para sintetizar compuestos mediante química
combinatoria, en especial con moléculas previamente injertadas en
estas perlas. En determinadas aplicaciones, se puede colocar también
una membrana entre los tubos (10') de conexión y el extremo de
conexión de la microestructura (4), tal como para permitir una
filtración, o diferentes reacciones tales como adsorción, desorción,
desalación, inmunocaptura, ensayos enzimáticos, etcétera.
La integración de perlas, o de membranas, en el
interior del aparato de esta invención, es de interés particular en
el análisis de espectrometría de masas, mientras que por lo general
se requiere desalación sistemática de la muestra con anterioridad a
la inyección en el espectrómetro de masas. Las características
anteriores pueden ser así utilizadas ventajosamente en aplicaciones
en las que el presente aparato sirve, por ejemplo, para inyectar
muestras en un espectrómetro de masas mediante ionización de
electropulverización (ESI) desde el microchip, o para dispensar
muestras sobre una placa destinada a mediciones de espectrometría de
masas utilizando ionización de desorción de matriz asistida por
láser (MALDI).
En otra realización, el ensayo se realiza con la
punta colocada en contacto con la cavidad para la carga de la
muestra.
En otra realización, el contacto entre la
extremidad 4 de conexión de la microestructura y la unidad 11 de
control microfluídico no es hermético (véase la Figura 2), y permite
que el microchip sea llenado por acción capilar. Es importante
observar que el flujo de solución se detendrá en el extremo de la
microestructura. A este fin, se puede colocar opcionalmente una capa
hidrofóbica alrededor de la salida de la microestructura, evitando
con ello la contaminación cruzada del aparato. Tras el llenado de la
muestra, se puede aplicar presión en la parte superior del soporte
7' que sirve como conexión entre el microchip y la unidad de control
microfluídico tal como para inducir un sellado hermético y evitar
fugas de solución. En esta fase, se puede bombear una solución hacia
el, y a través del, microchip sin contaminar la unidad de control
microfluídico. A continuación pueden ser bombeados una sucesión de
diferentes analitos en el interior de las microestructuras tal como
para disponer una solución diferente como se ejemplifica en las
Figuras 3 y 4, así como también en las secuencias de las Figuras 8 y
9. La tubuladura fluídica deberá tener un diámetro interno tal que
pueda evitar la generación de flujos turbulentos, y que se puedan
bombear segmentos de diferentes soluciones hasta el chip, estando
dichos segmentos de solución separados por una burbuja de aire. Por
ejemplo, cada solución de lavado, soluciones de anticuerpo
secundario o de otro reactivo (tal como, por ejemplo, un substrato
enzimático), pueden ser pre-cargadas en los tubos
con un segmento de burbuja de aire para separación de las mismas. A
continuación, el bombeo de estas soluciones a través de las
microestructuras permite que se lleve a cabo el inmunoensayo de
sándwich completo sin ninguna manipulación y sin adición de reactivo
externo.
Como demostración del aparato de esta invención,
se han llevado a cabo experimentos mediante la conexión del
microchip a una bomba de jeringa que sirve como unidad de control
microfluídico con el fin de aplicar una convección forzada a una
serie de microestructuras. Solamente se ha integrado un microcanal
en el aparato de la invención, el cual es similar al mostrado en la
Figura 6, pero solamente con una conexión microfluídica. Los
microchips utilizados aquí son hojas de poliimida de 75 micras en
las que las estructuras que comprenden un microcanal de 100 x 60 x
10.000 \mum con una punta y con una extremidad de conexión en cada
extremo del microcanal, han sido fabricadas por ataque químico de
plasma. Estas microestructuras incorporan además microelectrodos de
oro y pistas conductoras que están conectadas a un potenciostato que
es la unidad electroquímica utilizada para realizar el ensayo
electroquímico que consiste aquí en la oxi-reducción
de una solución acuosa de 500 \muM de metanol ferroceno. La
respuesta vatimétrica a una velocidad de exploración de 10 mV/s en
función de la velocidad de flujo (establecida entre 0,2 y 128
\muL/h) inducida por una jeringa de 100 \muL, ha sido registrada
y se ha representado en la Figura 10. El inserto de la Figura 10
muestra además la evolución de la corriente de placa a un potencial
aplicado de 300 mV frente a plata/cloruro de plata, en función de la
velocidad de flujo. La intensidad de la corriente es fuertemente
dependiente de la velocidad de flujo debido a que la convección
forzada esta renovando constantemente la capa de difusión por encima
del electrodo.
Claims (67)
1. Un aparato de ensayo electroquímico
microfluídico, que comprende:
al menos un microchip, disponiendo el, o cada,
microchip citado de al menos un microcanal sellado que permite
manipulaciones microfluídicas y que posee: un extremo de punta
adaptado para la toma de una muestra fluido en, y/o la descarga de
una muestra de fluido desde, el citado microcanal; un extremo de
conexión microfluídica; y un electrodo integrado en dicho microcanal
de tal manera que está en contacto directo con un fluido presente en
dicho microcanal;
una unidad de control microfluídico que comunica
con el citado extremo de conexión microfluídica de dicho microcanal,
y que está adaptada para empujar, extraer o bloquear fluidos en el
citado microcanal;
que se caracteriza por una unidad
electroquímica adaptada para monitorizar, a través de dicho al menos
un electrodo integrado, la presencia, la velocidad o el flujo de un
fluido en la posición local de dicho al menos un electrodo
integrado, mediante medición electroquímica de una reacción de
reducción o de oxidación en la misma.
2. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se dispone una señal resultante de la monitorización de la
presencia de dicho fluido, para comprobar el resultado final del
ensayo.
3. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se dispone una señal resultante de la monitorización de la
velocidad o el flujo de dicho fluido, para calibrar o corregir el
resultado final del ensayo.
4. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, 2
ó 3, que comprende una pluralidad de microcanales previstos en uno
de una pluralidad de microchips, que permiten la medición
electroquímica simultánea en más de un microcanal.
5. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha unidad de control microfluídico comprende una bomba
o un sistema de medición con pipeta.
6. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además una válvula
dispuesta entre dicha unidad de control microfluídico y el citado
extremo de conexión microfluídica de dicho al menos un
microcanal.
7. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado
está hecho con polímero, vidrio, cuarzo o una combinación de los
mismos.
8. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado
es desechable.
9. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el, o cada, microchip citado
se produce mediante fotoablación láser, moldeo por inyección,
estampación, ataque químico de plasma, fusión elastómera, tecnología
de silicona, o una combinación de los mismos.
10. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además medios de soporte
adaptados para soportar el(los) cita-
do(s) microchip(s) en relación con la citada unidad de control fluídico, de una manera tal que asegura la conexión hermética al fluido entre ambos.
do(s) microchip(s) en relación con la citada unidad de control fluídico, de una manera tal que asegura la conexión hermética al fluido entre ambos.
11. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además un detector
dispuesto por fuera del, o de cada, microcanal citado, estando
dicho(s) detector(es) interconectado(s) con
el(los) citado(s) microchip(s).
12. Aparato de acuerdo con la reivindicación 11,
en el que dicho detector es un fotomultiplicador, un espectrómetro
de masas, o un sistema de resonancia magnética nuclear (NMR).
13. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho microchip comprende una
red o matriz de microcanales interconectados.
14. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se lamina o se encola una
capa de polímero para sellar el citado microcanal.
15. Aparato de acuerdo con la reivindicación 14,
que comprende una disposición de microcanales interconectados en la
que una pluralidad de microcanales convergen hacia un único
microcanal, con lo que dicha disposición comprende una única punta
de microcanal y una pluralidad de extremos de conexión
microfluídica, o una pluralidad de puntas de microcanal y un sólo
extremo de conexión microfluídica.
16. Aparato de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que dichos canales interconectados no están dispuestos en el
mismo plano de dicho microchip, sino que están fabricados en tres
dimensiones.
17. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que al menos una porción de las
paredes de dicho microcanal ha sido modificada con medios químicos,
biológicos o físicos, o mediante la provisión de material poroso o
mediante una combinación cualquiera de los que se mencionan
anteriormente.
18. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho microcanal comprende
una fase sólida.
19. Aparato de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicha fase sólida comprende moléculas, una membrana, un
gel, un sol-gel o perlas.
20. Aparato de acuerdo con la reivindicación 18
ó 19, que comprende además moléculas injertadas en al menos dicha
porción de paredes de dicho microcanal y/o en dicha membrana, gel,
sol-gel o perlas.
21. Aparato de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que dichas moléculas son proteínas, péptidos, antígenos,
anticuerpos, enzimas, oligonucleótidos, secuencias de ácido
nucleico, haptenos o una combinación de los mismos.
22. Aparato de acuerdo con la reivindicación 20
o la reivindicación 21, en el que dichas moléculas están injertadas
mediante adsorción física o química, mediante enlace covalente, o
mediante una combinación de los mismos.
23. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 22, en el que dicha membrana separa
físicamente dos soluciones o fases.
24. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta ha sido formada
en el borde de dicho microchip.
25. Aparato de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que dicha punta es ahusada hacia el extremo de dicho
microchip.
26. Aparato de acuerdo con la reivindicación 24
ó 25, en el que dicha punta posee una configuración piramidal,
paralelepipédica o cónica.
27. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta está adaptada
para generar una electropulverización por medio de dicho al menos un
electrodo integrado en el citado microcanal.
28. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta está integrada
en, o está circundada por, un depósito de fluido.
29. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha punta comprende un
electrodo.
30. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que un medio de soporte comprende
un sistema de afianzamiento para asegurar una conexión hermética al
fluido entre dicho(s) extremo(s) de conexión
microfluídica y la citada unidad de control microfluídico.
31. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho aparato y/o el citado
microchip pueden ser desplazados en dirección X, Y y Z, ya sea
manualmente o ya sea por medio de un dispositivo automatizado.
32. Aparato de acuerdo con la reivindicación 31,
en el que dicho dispositivo manual o automatizado permite la
modificación de la orientación del microchip con el fin de cambiar
el ángulo de orientación de dicha punta de microcanal.
33. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además una unidad de
control de temperatura, una cámara de aislamiento eléctrico (por
ejemplo, una jaula de Faraday), y/o una cámara de humedad controlada
que evita la evaporación.
34. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha unidad electroquímica,
dicha unidad de control microfluídico, y si están previstos, dichos
medios de soporte, se han integrado en una plataforma única, con el
fin de proporcionar un sistema portátil.
35. Aparato de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que se encuentra conectado además a,
y/o está integrado en, un ordenador.
36. Un procedimiento de realización de un ensayo
microfluídico con monitorización electroquímica in situ de la
presencia, velocidad o flujo de un fluido en un microcanal,
utilizando el aparato de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) disponer una muestra en contacto con la
citada punta de microcanal;
(b) llenar el citado microcanal con la citada
muestra, ya sea por acción capilar o ya sea por bombeo o aspiración
de la citada muestra por medio de dicha unidad de control
microfluídico;
(c) utilizar la citada unidad de control
microfluídico, tanto para arrastrar, empujar o bloquear la citada
muestra en el citado microcanal;
(d) accionar la citada unidad electroquímica
para monitorizar, a través de dicho al menos un electrodo integrado,
la presencia, la velocidad o el flujo de un fluido en la posición
local de dicho al menos un electrodo integrado, mediante medición
electroquímica de una reacción de reducción o de oxidación en la
misma, y
(e) opcionalmente, repetir las etapas (a) a (d)
anteriores.
37. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que la etapa (d) comprende monitorizar la
presencia de dicho fluido, y la señal obtenida en la etapa (d) se
utiliza para comprobar el resultado de dicho ensayo
microfluídico.
38. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que la etapa (d) comprende monitorizar la
velocidad o el flujo de dicho fluido, y la señal obtenida en la
etapa (d) se utiliza para calibrar o corregir el resultado de dicho
ensayo microfluídico.
39. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, 37 ó 38, en el que una pluralidad de muestras y/o
de otras soluciones se introducen en dicho microcanal utilizando la
citada unidad de control microfluídico.
40. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 39, en el que dichas otras soluciones son soluciones
de lavado, soluciones amortiguadoras, y/o soluciones de
reactivo.
41. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 40, en el que dicho fluido,
dicha(s) muestra(s), o la(s) citada(s)
otra(s) solu
ción(es) contienen uno de entre un anticuerpo, una enzima, un oligonucleótido, un hapteno, una molécula de ADN, una secuencia de ácido nucleico, o similar.
ción(es) contienen uno de entre un anticuerpo, una enzima, un oligonucleótido, un hapteno, una molécula de ADN, una secuencia de ácido nucleico, o similar.
42. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 41, que comprende además la etapa de
añadir una especie electroactiva a dicha(s) muestra(s)
o a la(s) otra(s) solución(es)
citada(s), y monitorizar las sustancias microfluídicas de las
mismas realizando un(os) ensayo(s)
electroquímico(s), por ejemplo midiendo la generación de una
corriente resultante de la reducción y/o la oxidación de dicha
especie electroactiva en la posición local de dicho al menos un
electrodo integrado.
43. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 42, en el que dicha monitorización electroquímica
in situ de la presencia, ausencia, velocidad o flujo de un
fluido en un microcanal, se realiza durante al menos una etapa de un
ensayo de afinidad para el que dicho al menos un electrodo integrado
sirve como medio de detección electroquímica para calibración o
comprobación.
44. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 42 ó 43, en el que dicha especie electroactiva
añadida es un compuesto de ferroceno.
45. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 44, en el que un software procesa los
datos obtenidos durante la monitorización electroquímica de las
sustancias microfluídicas para realizar dicha calibración interna de
la señal de detección final.
46. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 45, que comprende además la etapa de
poner dicha punta de microcanal en contacto con un depósito de
solución para permitir la toma o la descarga de una muestra y/o de
otra solución.
47. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 46, en el que dicha punta de microcanal
se utiliza como parte desechable del dispositivo de medición con
pipeta.
48. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 47, en el que se impide el llenado de
la muestra en dicho microcanal por acción capilar, ya sea por medio
de dicha unidad de control microfluídico o ya sea mediante la
presencia de una barrera hidrofóbica en dicha punta de
microcanal.
49. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 48, en el que dicha punta es ahusada
hacia el extremo del citado microchip.
50. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 49, en el que dicha punta ahusada se inserta en un
depósito de solución para la toma y/o la descarga de fluido.
51. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 49, en el que dicha punta se utiliza para generar una
electropulverización por medio de al menos un electrodo integrado en
el citado microcanal.
52. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 51, que comprende la etapa adicional de
inyectar dicha(s) muestra(s) o dicha(s)
otra(s) solución(es) contenida(s) en el citado
microcanal, en un dispositivo de purificación, separación y/o
detección, como por ejemplo un cromatógrafo, un espectrómetro, un
fotómetro, un gel, una columna, una membrana selectiva, un filtro, o
un aparato de separación electroforética.
53. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 52, en el que el ensayo realizado en
dicho microcanal se detecta o se sigue utilizando absorción de luz,
luminiscencia (por ejemplo fluorescencia, bioluminiscencia,
quimiluminiscencia, electroquimiluminiscencia), electroquímica o
espectrometría de masas.
54. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 53, en el que las señales electroquímicas medidas
para la citada monitorización electroquímica de la presencia,
ausencia, velocidad o flujo de un fluido en dicho microcanal, y
dicho resultado final de ensayo microfluídico, son obtenidos por
medio de dicho al menos un electrodo integrado.
55. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 54, para la realización de análisis y/o
síntesis químicos y/o biológicos.
56. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 55, en el que el resultado microfluídico final se
obtiene mediante análisis de espectrometría de masas.
57. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 56, en el que dicho aparato comprende medios para
desalar muestras con anterioridad a su inyección en un espectrómetro
de masas mediante generación de una electropulverización, o con
anterioridad a la dispensación de dichas muestras sobre una placa
matriz de ionización de desorción iónica asistida (MALDI).
58. Uso de un aparato de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 35 para realizar análisis y/o síntesis
químicos y/o biológicos.
59. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 en
análisis de espectrografía de masas.
60. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 ó 59
para realizar diagnósticos clínicos, humanos o veterinarios in
vitro.
61. Uso de acuerdo con la reivindicación 60 para
la realización de ensayos inmunológicos.
62. Uso de acuerdo con la reivindicación 58,
para llevar a cabo ensayos físico-químicos, ensayos
toxicológicos, ensayos de afinidad, ensayos microbiológicos y/o
ensayos celulares.
63. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 para
realizar mediciones de lipofilicidad, reacciones de transferencia de
iones, ensayos de solubilidad y/o pruebas de permeabilidad.
64. Uso de acuerdo con la reivindicación 58 para
realizar síntesis mediante química combinatoria.
65. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 58 a 64, para realizar análisis y/o síntesis
químicos y/o biológicos con calibración electroquímica interna del
resultado final del ensayo.
66. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 58 a 65, en el que la señal obtenida durante la
monitorización electroquímica in situ de (a) la presencia o
ausencia, o (b) la velocidad o el flujo de una especie
electroactiva, sirve (a) para comprobar o (b) para calibrar o
validar el resultado final del ensayo microfluídico,
respectivamente.
67. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 58 a 65 para realizar un análisis y/o una síntesis
completamente automatizados.
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