ES2271024T3

ES2271024T3 - Aditivos para verter para piensos que contienen acido d pantotenico y/o sus sales y proceso para su preparacion.

Info

Publication number: ES2271024T3
Application number: ES01940422T
Authority: ES
Inventors: Michael Binder; Matthias Moll; Dieter Greissinger; Alexander Moller; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-05-09
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2021-05-09
Also published as: DK1296566T3; ZA200300031B; US6479084B2; US20030044485A1; ATE335407T1; DE60122149D1; CN1449254A; US6596327B2; KR20030051592A; DE10032349A1; WO2002001964A1; US20020025563A1; BR0112158A; BR0112158B1; HUP0301559A2; DE60122149T2; HUP0301559A3; JP2004501661A; MXPA02012480A; EP1296566A1

Abstract

Reivindicaciones 1. Aditivos para verter para piensos, basados en licor de fermentación y que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales, caracterizados por comprender: a) ácido D-pantoténico y o una sal de éste en una cantidad de 20 a 80 % en peso (peso seco); b) un contenido de constituyentes que contienen cloruro < 3, 0 mg/g del aditivo; c) la biomasa formada durante la fermentación en una cantidad de = 0 a 100 %; y d) al menos la parte predominante de los otros constituyentes del licor de fermentación; y e) están presentes en forma sólida, en una distribución de tamaño de partícula de 20 a 2.000 nm, especialmente de 50 a 800 ìm, más especialmente de 150 a 600 ìm, y se pueden verter.

Description

Aditivos para verter para piensos que contienen ácido D pantoténico y/o sus sales y proceso para su preparación.

La invención se relaciona con aditivos para verter para piensos basados en licor de fermentación y que contienen ácido D-pantoténico y/o una sal de éste, y con un proceso para la preparación de dichos aditivos.

Estado de la técnica

El ácido pantoténico se produce en todo el mundo a una escala de varios miles de toneladas por año. Una gran parte del ácido pantoténico que se produce se usa para alimentar el ganado productivo como las aves de corral y los cerdos. Su demanda está creciendo.

El ácido pantoténico se puede producir por síntesis química o por métodos biotecnológicos mediante fermentación con microorganismos adecuados de soluciones nutrientes adecuadas. En el caso de la síntesis química, la DL-pantolactona es un precursor importante. Se prepara en un proceso multipasos a partir de formaldehído, isobutilaldehído y cianuro; en pasos posteriores del proceso, se resuelve la mezcla racémica, se condensa la D-pantolactona con \beta-alanina, y de este modo se obtiene ácido D-pantoténico.

La forma comercial típica es la sal de calcio del ácido D-pantoténico. La sal de calcio de la mezcla racémica del ácido D,L-pantoténico también es común.

La ventaja de la preparación mediante fermentación con microorganismos es que la forma estereoisomérica deseada, a saber la forma D, que carece de ácido L-pantoténico, se forma directamente.

Diversos tipos de bacterias, como, por ejemplo, Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes, y también levaduras, como, por ejemplo, Debaromyces castellii, son capaces de producir ácido D-pantoténico en condiciones de fermentación adecuadas, como se muestra en EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 y WO 97/10340. Son microorganismos especialmente adecuados los derivados de la Escherichia coli IFO3547 descritos allí, como, por ejemplo, las cepas FV5069/pFV31 o FV5069/pFV202.

En la preparación del ácido D-pantoténico por fermentación, según se describe en EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 y WO 97/10340, un microorganismo capaz de producir ácido D-pantoténico se cultiva en un medio nutriente adecuado y después el ácido D-pantoténico que se forma, se aísla, se purifica y se prepara en forma de la sal de calcio de una manera compleja.

Los medios nutrientes adecuados contienen una fuente de carbono, como, por ejemplo, glucosa o hidrolizado de fécula o sacarosa o melazas, precursores como por ejemplo, \beta-alanina, ácido D,L-pantoico o D,L-pantolactona, una fuente de nitrógeno, como, por ejemplo, sulfato de amonio, una fuente de fósforo, como, por ejemplo, fosfato de potasio y otras sales, oligoelementos y vitaminas y opcionalmente aditivos para medios complejos, como, por ejemplo, extracto de levadura. Después los microorganismos se incuban en ese medio a un valor de pH adecuado con aireación y agitación apropiadas, con lo cual secretan después el ácido D-pantoténico.

De acuerdo con el estado actual de la técnica, que se describe en WO96/33283 y EP-A-0 590857, la sal de calcio del ácido D-pantoténico se obtiene a partir del licor de fermentación que contiene ácido pantoténico por medio de una operación de aislamiento y purificación compleja. Después de separar primero la biomasa por filtración o centrifugación, el filtrado se trata posteriormente mediante purificación por medio de carbón activado o mediante cromatografía en columna. Después de la reacción de las soluciones resultantes con hidróxido de calcio, se deja cristalizar la sal de calcio deseada.

De acuerdo con WO 96/33283, el filtrado se decolora con carbón activado en la primera columna. Se ajusta a un valor de pH de 3,0 usando ácido clorhídrico concentrado y después se purifica el líquido continuamente en otras dos columnas empacadas con carbón activado. La elución del ácido D-pantoténico tiene lugar con ayuda de alcohol metílico. La neutralización subsiguiente usando Ca(OH)_{2} en polvo produce una solución de la cual se obtiene D-pantotenato de calcio por cristalización a 5ºC.

En el caso del método descrito en EP-A-0 590 857, primero se purifica el filtrado con ayuda de columnas intercambiadoras de cationes y de aniones. La elución tiene lugar con ácido clorhídrico. La fracción eluida se neutraliza después usando Ca(OH)_{2}; se le agrega carbón activado y se filtra todo. El filtrado que se obtiene se extrae después en un alcohol de bajo peso molecular (metanol, etanol, isopropanol), y se obtiene D-pantotenato de calcio por cristaliza-
ción.

El D-pantotenato de calcio preparado de la manera descrita se usa como un aditivo para piensos para la alimentación de animales.

EP-A-1 050 219 (estado de la técnica de acuerdo con Artile 54(3) EPC) provee de un aditivo para alimentos para animales, que contiene ácido D-pantoténico y sales de éste y 0 a 100% de la biomasa formada durante la fermentación con microorganismos productores de ácido D-pantoténico. Esta solicitud no dice nada acerca del contenido de cloruro de dicho aditivo. GB 598,177 da a conocer un proceso donde las bacterias del grupo Aerobacter aerogens producen 2,3-butilenglicol como producto principal y una cantidad muy pequeña de ácido D-pantoténico como subproducto.

El producto aislado contiene ácido D-pantoténico en una cantidad inferior al 1%. No se presta atención al contenido de cloruro.

En JP 58-205461 se describen alimentos para criar peces que contienen vitaminas recubiertas seleccionadas entre ácido ascórbico, ácido, pantoténico, ácido fólico y sus sales. US 2,864,701 apunta a preparaciones de ácido pantoténico estabilizadas que contienen un excipiente comestible y un carbonato de un metal alcalino. Estas preparaciones se producen mezclando el excipiente orgánico comestible, el ácido pantoténico y otros componentes y no están basadas en caldos de fermentación.

Objetivo de la invención

De acuerdo con el estado de la técnica, las sales del ácido D-pantoténico o del ácido D,L-pantoténico se obtienen por síntesis química o de los licores de fermentación y después se agregan en forma pura a los piensos.

El objetivo de la invención es proveer de formas de ácido D-pantoténico y sus sales, con bajo contenido de cloruro, más fáciles de procesar y de procesos para su preparación para los piensos.

Descripción de la invención

La invención proporciona aditivos para verter para piensos basados en licor de fermentación y que contienen ácido D-pantoténico y/o sales de éste, caracterizados por comprender:

a): ácido D-pantoténico y o una sal de éste en una cantidad de 20 a 80% en peso (peso seco);

b): un contenido de constituyentes que contienen cloruro < 3,0 mg/g del aditivo;

c): la biomasa formada durante la fermentación en una cantidad de \geq 0 a 100%; y

d): al menos la parte predominante de los otros constituyentes del licor de fermentación; y

e): están presentes en forma sólida, en una distribución de tamaño de partícula de 20 a 2.000 \mum, especialmente de 50 a 800 \mum, más especialmente de 150 a 600 \mum, y son para verter.

En una materialización preferida de la invención, el aditivo para verter para piensos que contiene ácido D-pantoténico y/o sus sales se caracteriza porque

: contiene además, en forma sólida, una cantidad de constituyentes que contienen cloruro en una concentración <2 mg por g de aditivo y especialmente < 1,5 mg por g de aditivo.

Los aditivos están en general comprimidos, granulados, en grano fino, pero en todos los casos en forma para verter, de acuerdo con los requisitos, y contienen cantidades variables de biomasa. La densidad aparente se encuentra entre 200 y 800 kg/m^{3}, especialmente entre aproximadamente 400 y 700 kg/m^{3}. Los aditivos se pueden verter fácilmente y son estables al almacenamiento.

Si la biomasa se separa, otros sólidos inorgánicos, por ejemplo que hayan sido agregados durante la fermentación, en general son eliminados. Además, el aditivo de acuerdo con la invención contiene al menos la parte predominante de las otras sustancias, especialmente orgánicas, que se hayan formado o agregado y estén disueltas en el licor de fermentación, en la medida en que no hayan sido separadas mediante procesos adecuados.

Dichas sustancias incluyen subproductos orgánicos que son producidos y secretados además del ácido D-pantoténico por los microorganismos utilizados en la fermentación. Incluyen L-aminoácidos, seleccionados del grupo constituido por L-metionina, L-lisina, L-valina, L-treonina, L-alanina o L-triptofano, especialmente L-valina. También incluyen ácidos orgánicos que tienen de uno a tres grupos carboxilo, como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico o ácido fumárico. Finalmente, también incluyen azúcares, como, por ejemplo, la trehalosa. Tales compuestos pueden ser deseables, en el sentido de que mejoran el valor nutricional del
aditivo.

Otra materialización de la invención es un proceso para la preparación de aditivos para piensos que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales, caracterizado porque

a): la concentración de iones cloruro en el fermentador de producción es < 300 mg/l,

b): la biomasa y/o una porción de los otros constituyentes se separan, opcionalmente total o parcialmente, de un licor de fermentación que contiene ácido D-pantoténico y se obtienen por fermentación,

c): opcionalmente se agrega a la solución resultante, o licor, el hidróxido u óxido de un metal alcalino o alcalinotérreo,

d): opcionalmente la mezcla resultante de acuerdo con a) o b) se concentra, y

e): se seca de manera adecuada, y

f): se obtiene un aditivo para verter para piensos que comprende ácido D-pantoténico y/o sus sales en una cantidad de 20 a 80% en peso (peso seco) y una distribución de tamaño de partícula entre 200 y 2.000 \mum mediante medidas adecuadas.

Se prefiere el proceso para la preparación de aditivos para piensos que contienen ácido pantoténico y/o sus sales, que se caracteriza porque

a): la biomasa y/o una porción de los constituyentes, se separan, opcionalmente total o parcialmente, de un licor de fermentación que contiene ácido D-pantoténico y se obtienen por fermentación,

b): opcionalmente la mezcla obtenida de esa manera se concentra, y

c): el aditivo para piensos que contiene pantotenato de amonio se transforma en una forma para verter mediante medidas adecuadas; y

d): se obtiene un aditivo para verter para piensos que tiene una distribución de tamaño de partícula entre 20 y 2.000 \mum mediante medidas adecuadas.

También se prefiere el proceso para la preparación de aditivos para piensos que tienen un contenido de ácido D-pantoténico y/o sus sales seleccionadas del grupo constituido por las sales de sodio, potasio, amonio, magnesio o calcio en el rango de de 20 a 80% en peso (materia seca) a partir de los licores de fermentación, caracterizado por los pasos

a): eliminación opcional de agua del licor de fermentación (concentración),

b): eliminación de la biomasa formada durante la fermentación en una cantidad de > 0 a 100%,

c): agregado opcional de uno o más hidróxidos u óxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos a los licores de fermentación obtenidos de acuerdo con a) y b), siendo la cantidad de compuestos agregada tal que la concentración total de éstos en el aditivo para piensos se encuentra en el rango de 20 a 80% en peso, y

d): obtención del aditivo para piensos en la forma de material pulverizado deseada o, preferentemente, en forma granular.

El aditivo para piensos de acuerdo con la invención se obtiene del licor de fermentación, opcionalmente después del agregado de ácido D-pantoténico y/o sus sales y opcionalmente después del agregado de sustancias auxiliares orgánicas o inorgánicas, mediante

a): secado y compactación, o

b): deshidratado por aspersión, o

c): deshidratado por aspersión y granulación, o

d): deshidratado por aspersión y granulación de aumento de tamaño.

En una forma preferida se prepara un licor de fermentación que contiene ácido D-pantoténico y/o sus sales, donde

a): la fermentación tiene lugar en un medio sustancialmente sin cloruro,

b): el licor de fermentación resultante, opcionalmente después de la separación de la biomasa y la concentración, se seca, se compacta, se deshidrata por aspersión, se granula por aspersión o se granula o aplica a un excipiente o se incluye en una matriz estabilizadora.

Existen licores de fermentación adecuados para el proceso de acuerdo con la invención que se obtienen usando microorganismos adecuados para la producción de ácido D-pantoténico y que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales. Las sales son generalmente la sal de sodio, potasio, amonio, magnesio o calcio.

Los microorganismos pueden ser hongos o levaduras, como, por ejemplo, Debaromyces castellii, o bacterias grampositivas, por ejemplo, del género Corynebacterium, o bacterias gramnegativas, como, por ejemplo, las de la familia Enterobacteriaceae. En el caso de la familia Enterobacteriaceae, se debe hacer mención especial al género Escherichia y a la especie Escherichia coli. Dentro de la especie Escherichia coli, se debe hacer mención a las cepas denominadas K-12, como, por ejemplo, las cepas MG1655 o W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press/ Washington D.C.)), a la cepa silvestre de la Escherichia coli IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) y a mutantes derivados de ellas. De las cepas producidas a partir de IFO3547, se destacan FV5069/pFV31 (EP-A-0 590 857) y FV5069/pFV202 (WO 97/10340). En el caso del género Corynebacterium, se puede hacer mención especial de la especie Corynebacterium glutamicum.

Los microorganismos descritos precedentemente se pueden cultivar a efectos de la producción de ácido D-pantoténico continuamente o discontinuamente mediante el proceso discontinuo o semicontinuo o semicontinuo repetido. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

El medio de cultivo que se vaya a usar debe satisfacer adecuadamente los requisitos de los microorganismos en cuestión. El medio de fermentación carece sustancialmente de constituyentes que contengan cloruro. De acuerdo con la invención, la concentración de iones cloruro en el fermentador de producción es < 300 mg/l, preferentemente < 200 mg/l y muy especialmente preferentemente < 150 mg/l. Se pueden usar como fuente de carbono azúcares y carbohidratos, como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas, como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos, como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, como, por ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, como, por ejemplo, ácido acético. Esas sustancias se pueden usar individualmente o en forma de una mezcla. Se pueden usar como fuente de nitrógeno compuestos orgánicos que contengan nitrógeno, como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de macerado de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, como sulfato de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o en forma de una mezcla. Se pueden usar como fuente de fósforo fosfato diácido de potasio o fosfato ácido de potasio o las sales de sodio correspondientes. El medio de cultivo también debe contener sales de metales, como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, se pueden usar además de las sustancias antedichas sustancias esenciales para el crecimiento, como aminoácidos y vitaminas. También se pueden agregar al medio de cultivo precursores del ácido D-pantoténico, como aspartato, \beta-alanina, cetoisovalerato, ácido cetopantoico o pantoico y opcionalmente sales de éstos. Las sustancias mencionadas se pueden agregar al cultivo en forma de una única carga, o se pueden introducir de manera adecuada durante el cultivo.

Para controlar el valor del pH, se usan amoníaco o agua amoniacal u otros compuestos básicos, como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o hidróxido de calcio. Si se necesitan compuestos ácidos para controlar el valor del pH, se pueden usar convenientemente ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para preparar directamente la sal de calcio del ácido pantoténico, se usa hidróxido de calcio en forma de una suspensión acuosa durante la fermentación. Para controlar el desarrollo de espuma, se pueden usar antiespumantes, como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, se agregan al medio, opcionalmente, sustancias adecuadas que tengan una acción selectiva, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente entre 20ºC y 45ºC y preferentemente entre 25ºC y 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se forma la máxima cantidad de ácido D-pantoténico. Ese objetivo se logra normalmente en un período entre 10 horas y 160 horas.

Los licores de fermentación obtenidos de ese modo generalmente tienen un contenido de materia seca entre 7,5 y 25% en peso y contienen de 2 a 20% en peso de ácido D-pantoténico. Son especialmente ventajosos los procesos de fermentación en los que está presente el ácido D-pantoténico en la materia seca en una cantidad de al menos 20% en peso cuando la fermentación se completa. También es ventajoso que la cantidad de azúcar en la fermentación sea limitada al menos al final de la fermentación, pero ventajosamente durante al menos 30% de la duración de la fermentación. Eso significa que la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantenga entre \geq0 y 3 g/l o se reduzca a esos valores durante ese tiempo.

Para la preparación de los aditivos de acuerdo con la invención, los licores de fermentación que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales son preferentemente liberados primero de toda o parte de la biomasa mediante métodos de separación conocidos, como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de éstos. Sin embargo, también es posible de acuerdo con la invención dejar toda la biomasa en el licor de fermentación. Después, la suspensión obtenida de esa manera se concentra preferentemente a no más de 60% en peso de materia seca y se trata hasta obtener un material pulverizado, por ejemplo con ayuda de una secadora por atomización o un liofilizador. El material pulverizado se convierte después en un producto granulado grueso, que se puede verter fácilmente, almacenable y en gran medida sin polvo mediante procesos adecuados de compactación o granulación. En la operación de granulación o compactación es ventajoso usar sustancias auxiliares convencionales orgánicas o inorgánicas, o excipientes, como almidón, gelatina, derivados de la celulosa o sustancias similares, que son convencionalmente empleados como aglutinantes, gelificantes o espesantes en el procesamiento de alimentos para animales o piensos, u otras sustancias como, por ejemplo, sílices, silicatos o estearatos.

Alternativamente, el producto se puede aplicar a un excipiente orgánico o inorgánico que sea conocido y empleado convencionalmente en el procesamiento de piensos, como, por ejemplo, sílices, silicatos, tortas de filtración, salvados, harinas, almidones, azúcares o similares, y/o estabilizado por medio de aglutinantes o espesantes convencionales. Ejemplos y procesos pertinentes se describen en la bibliografía (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817)

Los productos sólidos nuevos de acuerdo con la invención que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales y que se pueden preparar por el proceso descrito antes contienen de 20 a 80% en peso, preferentemente de 30 a 75% en peso de ácido D-pantoténico. Contienen en general constituyentes inorgánicos en una cantidad de 2,5 a 25% en peso y opcionalmente subproductos orgánicos en una cantidad de > 0 a 30% en peso. El contenido de la biomasa seca es de \geq 0 a 35% en peso. El contenido de agua es preferentemente < 5% en peso.

Los productos nuevos de acuerdo con la invención que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales y que se preparan mediante el proceso descrito antes, se distinguen por una distribución de tamaño de partícula de 20 \mum a 2.000 \mum, preferentemente de 50 \mum a 800 \mum y especialmente de 150 \mum a 600 \mum. El contenido de polvo muy fino (< 10 \mum) es aproximadamente de 0% en peso a 10% en peso, preferentemente de aproximadamente 0% en peso a 5% en peso. El producto se usa como un aditivo para piensos.

La concentración de ácido D-pantoténico se puede determinar por métodos conocidos (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)).

La distribución de tamaño de partícula se puede determinar por métodos de granulometría por difracción láser. Los métodos correspondientes se describen en el libro de texto en "Teilchengrössenmessung in der Laborpraxis" de R.H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998).

Ejemplos

La presente invención se explica más detalladamente a continuación por medio de ejemplos.Con ese fin, se llevaron a cabo pruebas utilizando la cepa de Escherichia coli 5069/pFV31 productora de ácido D-pantoténico, que fue depositada como FERM-BP 4395 de conformidad con el Tratado de Budapest en el Fermentation Reasearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology en 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Japón) (EP-A-0590857).

Las mediciones se llevaron a cabo en un granulómetro por difracción láser Cilas 920 de Quanto Chrome (Odelzhausen, Alemania). La evaluación de los resultados de la medición se llevó a cabo como se especifica en German Industrial Standard DIN 66141 para la representación de la distribución de tamaño de partícula.

Ejemplo 1 Preparación de la sal de calcio del ácido D-pantoténico en un licor de fermentación 1. Preparación del inóculo (banco de células madre)

Se sembró una muestra de Escherichia coli FV5069/pFV31 en agar LBG al que se habían agregado 50 \mug por ml de ampicilina. El cultivo en placas de agar se incubó durante 17 horas a 37ºC y después se almacenó en un refrigerador a + 4ºC. Después se multiplicaron en caldo LBG colonias aisladas seleccionadas. El caldo LBG tiene la composición siguiente: 10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 1 g/l de glucosa. El agar LBG contiene además 12 g/l de agar. Se pueden obtener de Gibco/BRL (Paisley, Escocia, Gran Bretaña) preparaciones prefabricadas como base para caldo LB o agar LB. Después del agregado de 1 g/l de glucosa, se obtienen los medios indicados. Se incubaron durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm 10 ml de los cultivos que estaban contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml, en un incubador ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). La suspensión de células se separó después por centrifugación durante 15 minutos a 4.000 rpm en una centrífuga J-6B de Beckmann (Hanover, Alemania) El sedimento de células se resuspendió en 10 ml de medio LBG al que se le había agregado 20% de glicerol; se introdujo 1 ml en condiciones asépticas en cada una de 10 alícuotas que se congelaron a -70ºC. Esos cultivos se usaron como banco de células madre.

Para la preparación de un banco de células de trabajo, se distribuyó medio LBG al que se le habían agregado 50 \mug/l de ampicilina en porciones de 10 ml en matraces Erlenmeyer de 100 ml que después se inocularon con 100 \mul del banco de células madre descrito antes. La incubación se llevó a cabo durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en un incubador ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).

Después de la incubación, la densidad óptica (DO) de la suspensión del cultivo se determinó a una longitud de onda de medición de 660 nm usando un fotómetro LP2W de Dr. Lange (Berlín, Alemania). Fue de 3,5. La suspensión de células se distribuyó después en condiciones asépticas en tubos estériles de polietileno de 30 ml de Greiner (Frickenhausen, Alemania) y se separó por centrifugación a 2.500 rpm durante 15 minutos usando una centrífuga J-6B de Beckmann (Hanover, Alemania). La biomasa que se separó se resuspendió en 10 ml de medio LBG al que se le había agregado 20% de glicerol. Después la suspensión de células se distribuyó en porciones de 500 \mul, en condiciones asépticas, en tubos estériles de 1 ml de Nalgene (Nueva York, EE.UU.) que se congelaron a -70ºC. Los lotes conservados preparados de ese modo se usaron como banco de células de trabajo.

2. Preparación de un licor de fermentación que contiene D-pantotenato de calcio

Para la preparación de un licor de fermentación que contuviera D-pantotenato de calcio, primero se multiplicó el banco de células de trabajo en un cultivo en un matraz en agitación, y este último se usó para inocular un pre-fermentador. El cultivo del pre-fermentador se usó para inocular el fermentador de producción.

Se usó medio SKA (Tabla 1) para el cultivo en matraz en agitación. El medio de SKA se preparó del modo siguiente: Se pesaron en un vaso de laboratorio de vidrio de 1 litro: 7,0 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 1,0 g de K_{2}HPO_{4}, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}0, 0,01 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,001 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}0, 0,005 g de Fe_{2}(SO_{4})_{3} y 20 g de agua de macerado de maíz, que se había ajustado previamente a pH 6,8 usando solución de amoníaco al 25%, y después se completó hasta 825 g con agua destilada. Esa solución salina que contenía agua de macerado de maíz se esterilizó en un autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Además, una solución que consistía en 25 g de glucosa y 0,002 g de clorhidrato de tiamina se completó hasta 125 g con agua destilada y se esterilizó por filtración. Se pesaron 10 g de CaCO_{3} en un matraz de 100 ml y se esterilizaron en un autoclave a 123ºC durante 20 minutos. Se obtuvo medio SKA combinando los dos componentes antedichos con la solución salina que contenía agua de macerado de maíz.

El medio SKA se distribuyó en porciones de 12,5 ml en matraces Erlenmeyer de 100 ml que después se inocularon con 0,5 ml de una suspensión de células. La suspensión de células utilizada fue un lote conservado de cultivo celular de trabajo diluido 1:100 con solución salina isotónica. La incubación se llevó a cabo durante 20 horas a 32ºC y 150 rpm en un incubador RC-1-TK de Infors AG (Bottmingen, Suiza). La densidad óptica determinada posteriormente a una longitud de onda de medición de 660 nm (DO 660) fue de 12,5.

Para la inoculación de 20 kg de medio de precultivo A1-102, que estaba contenido en un reactor de fermentación con agitación de 42 litros de Bioengineerring (Wald, Suiza, modelo LP-42), se diluyeron 0,5 ml de medio SKA 1:100 y se agregaron 50 ml de esa suspensión al fermentador. El medio de precultivo A1-102 contenía los constituyentes indicados en la Tabla 2. El cultivo se incubó durante 15,5 horas a una temperatura de 37ºC, con una aireación específica del volumen de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), a una presión parcial de oxígeno de 20% de saturación del aire y a un pH de 6,5, hasta que se alcanzó una DO 660 de 11,3.

Para la inoculación de 5.830 g del medio de cultivo principal M1-380, que estaba contenido en reactores de fermentación con agitación de 14 litros de B. Braun (BBI, Alemania/Melsungen, modelo Biostat E/ED), se agregaron 423 ml del segundo precultivo en medio A1-102. El medio de cultivo principal M1-380 contenía los constituyentes indicados en la Tabla 3. El cultivo se incubó primero durante 6,5 horas a una temperatura de 37ºC, con aireación específica del volumen de 0,75 vvm, con una agitación mínima de 400 rpm y a un pH de 6,5, hasta que se alcanzaron una DO 660 de 18,6 y una presión parcial de oxígeno de 2% de saturación del aire. Después el cultivo se incubó durante otras 41 horas a una temperatura de 37ºC, una presión parcial de oxígeno de 2% de saturación del aire y un valor de pH de 6,0, hasta que se alcanzó una DO 660 de 66,8. Después de un tiempo de fermentación de 13 horas, se introdujo \beta-alanina a una concentración de 152,7 g en 570 ml de H_{2}O durante 34,5 horas. Después de un tiempo de fermentación de 21,5 horas, se dosificó una solución de Ca(OH)_{2} al diez por ciento durante 26 horas para controlar el pH. Se introdujeron 3,43 kg de medio M2-257 que contenía una concentración de glucosa de 650,8 g/l y una concentración de clorhidrato de tiamina de 35,7 g/l en el transcurso de 41 horas.

Después se determinó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de medición de 660 nm usando un fotómetro digital tipo LP1W de Dr. Bruno Lange GmbH (Berlín, Alemania), y se determinó mediante HPLC la concentración de ácido D-pantoténico que se había formado (Hypersil APS 2 5 \mum, 250 x 5 mm, detección por IR).

Se determinó una concentración de D-pantotenato de calcio de 49,7 g/l, medida como ácido D-pantoténico, en la muestra de fermentación final después de 70,0 horas.

El contenido de ácido D-pantoténico se determinó con ayuda de un aparato de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) tipo M321 de Knauer (Berlín, Alemania) por medio de detección de IR (índice de refracción) usando una fase amino Hypersil APS2 de 5 \mum de tamaño de partícula.

TABLA 1 Composición del medio SKA

Componente	Concentración (por litro)
Glucosa	25,0 g
Agua de macerado de maíz	20,0 g
(NH_{4})_{2}SO_{4}	7,0 g
KH_{2}PO_{4}	0,5 g

TABLA 1 (continuación)

Componente	Concentración (por litro)
K_{2}HPO_{4}	1,0 g
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O	0,5 g
FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O	5 mg
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	10 mg
ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O	1 mg
CaCO_{3}	10 g
Clorhidrato de tiamina	2 mg
Structol	0,7 g

TABLA 2 Composición del medio A1-102

Componente	Concentración (por litro)
Glucosa	25,0 g
Agua de macerado de maíz	20,0 g
(NH_{4})_{2}SO_{4}	7,0 g
KH_{2}PO_{4}	0,5 g
K_{2}HPO_{4}	1,0 g
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O	0,5 g
FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O	10 mg
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	10 mg
Clorhidrato de tiamina	3 mg
Structol	0,6 g

TABLA 3 Composición del medio M1-380

Componente	Concentración (por litro)
Glucosa	18,0 g
Agua de macerado de maíz	40,0 g
\beta-Alanina	15,0 g
(NH_{4})_{2}SO_{4}	11,8 g
KH_{2}PO_{4}	0,6 g
K_{2}HPO_{4}	1,2 g

TABLA 3 (continuación)

Componente	Concentración (por litro)
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O	0,67 g
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	10 mg
Clorhidrato de tiamina	1,6 mg
Structol	0,6 g

Ejemplo 2 Preparación de D-pantotenato de calcio finamente dividido a partir de licor de fermentación

En primer lugar se separó la biomasa de un licor de fermentación que contenía D-pantotenato de calcio que había sido preparado de acuerdo con el proceso del Ejemplo 1 y que contenía aproximadamente 4,9% en peso de ácido D-pantoténico. Con ese fin, se filtraron 90 litros del licor de fermentación antedicho por filtración de flujo cruzado usando una membrana de microfiltración de 0,22 \mum en un equipo de filtración CERAFLO MSP005756 de Millipore (Bad Homburg, Alemania).

Después el licor tratado de ese modo se concentró hasta un contenido líquido de aproximadamente 30% de contenido seco en un rotavapor R-152 de Büchi, Suiza, entre 40 y 80ºC, al vacío. Después el licor concentrado de esa manera se deshidrató por aspersión para preparar la sal de calcio del ácido D-pantoténico. Con ese fin se usó una secadora por atomización Technikum de Niro (Copenhague, Dinamarca) del tipo Minor de NIRO que tiene una placa de atomización (120 mm de diámetro; velocidad de rotación 135 m/s) a una temperatura de entrada de 175ºC, una temperatura de salida de 80ºC y una capacidad de producción de gas de secado de 525 m^{3}/hora. Para una mejor descarga del producto, se agregó Sipernat 22 de Degussa-Hüls AG (Frankfurt am Main, Alemania) como auxiliar de pulverización a la corriente de gas de secado en una relación de 5% en peso, basada en la materia seca del concentrado.

El producto que contenía D-pantotenato de calcio preparado de ese modo tenía un contenido de ácido D-pantoténico de 48,5% en peso, se podía verter y tenía una densidad aparente de 460 kg/m^{3} con un tamaño medio de partícula de 34 \mum.

TABLA 4

Designación	Diámetro	Contenido [%]
Polvo fino	<10 \mum	10
Polvo	10-20 \mum	20
Material pulverizado/polvo	20-50 \mum	50
Material pulverizado	>50 \mum	20

Ejemplo 3 Preparación de D-pantotenato de calcio con un tamaño de partícula > 100 \mum mediante compactación en un compactador por laminación y tamizado

Un producto semejante a un polvo que contenía D-pantotenato de calcio, que había sido preparado de acuerdo con el proceso del Ejemplo 2 y que contenía aproximadamente 48,5% en peso de ácido D-pantoténico con un tamaño medio de partícula de 34 \mum, se compactó por medio de un compactador por laminación que tenía rollos semejantes a cigarros (Pharmapaktor de BEPEX de tipo L200/50 P) con una fuerza de compresión de 40 a 90 Newton. La velocidad de rotación de los rollos fue de 10 revoluciones por minuto. El producto compactado preparado de ese modo se dividió hasta una distribución de tamaño de partícula entre 200 a 400 \mum en tamices de trituración. El rendimiento de cada fracción de partículas se resume en la Tabla 5.

El producto compactado se distinguió por un contenido marcadamente inferior de polvo fino y un comportamiento de flujo sustancialmente mejor en comparación con el producto pulverulento inicial.

TABLA 5

Designación	Diámetro	Contenido [%]
Polvo fino	< 10 \mum	5
Polvo	10-50 \mum	5
Partículas finas	50-200 \mum	20
Tamaño medio de partícula	200-400 \mum	50
Partículas de mayor tamaño que el especificado	> 400 \mum	20

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La fracción de "tamaño medio de partícula" se aisló por tamizado y representa al producto. El producto preparado de ese modo tuvo un contenido de aproximadamente 40,7% en peso, medido como ácido D-pantoténico y tuvo una densidad aparente de 630 kg/m^{3}.

Ejemplo 4 Preparación de D-pantotenato de calcio con un tamaño medio de partícula de 200 a 400 \mum mediante granulación de aumento de tamaño en un granulador de lecho fluidizado 4.1 Uso de agua como aglutinante de la granulación

El producto pulverulento que contenía D-pantotenato de calcio, que había sido preparado a partir de una solución de fermentación que contenía D-pantotenato de calcio mediante deshidratación por aspersión de acuerdo con el proceso descrito en el Ejemplo 2, se procesó adicionalmente a continuación en un granulador de lecho fluidizado por rociado con una cantidad particular de agua.

Con ese fin, se colocaron 300 g del producto similar a un polvo que contenía D-pantotenato de calcio, preparado de acuerdo con el Ejemplo 2, en un aparato de laboratorio de lecho fluidizado Aeromatics de Niro (Copenhague, Dinamarca). A una temperatura del lecho fluidizado de 50ºC y una temperatura de gas de desecho de 30ºC, se rociaron 3 g de agua por minuto por medio de un dispositivo de dosificación. La temperatura del gas fluidizado fue de 70 a 80ºC. La distribución de tamaño de partícula del producto preparado de ese modo se muestra en la Tabla 6.

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TABLA 6

Designación	Diámetro	Contenido [%]
Polvo fino	< 10 \mum	1
Polvo	10-50 \mum	4
Partículas finas	50-200 \mum	20
Tamaño medio de partícula	200-400 \mum	75
Partículas de mayor tamaño que el especificado	> 400 \mum	0

\vskip1.000000\baselineskip

Se determinó que el contenido, medido como ácido D-pantoténico, era de 38,1% en peso. El producto se obtuvo prácticamente sin polvo. La densidad aparente fue de 310 kg/m^{3}. El producto fue muy fácil de verter.

4.2 Uso de un concentrado que contiene pantotenato de calcio como aglutinante de la granulación

Un producto pulverulento que contenía D-pantotenato de calcio, que había sido preparado a partir de una solución de fermentación que contenía D-pantotenato de calcio mediante deshidratación por aspersión de acuerdo con el proceso descrito en el Ejemplo 2, se procesó adicionalmente en otra prueba en un granulador de lecho fluidizado por rociado con una cantidad particular de solución concentrada de D-pantotenato de calcio que tenía un contenido de materia seca de aproximadamente 50% en peso.

Con ese fin, se colocaron 1.000 g de producto similar a un polvo que contenía D-pantotenato de calcio preparado de acuerdo con el proceso descrito en el Ejemplo 2 en un aparato de laboratorio de lecho fluidizado, que operaba de manera discontinua, de Glatt (Binzen, Alemania). A una temperatura del lecho fluidizado de aproximadamente 40 a 45ºC y una temperatura del aire de entrada de aproximadamente 80ºC, se rociaron aproximadamente 5 g del concentrado descrito antes por minuto en el interior del aparato de laboratorio de lecho fluidizado. La distribución de tamaño de partícula del producto preparado de ese modo se muestra en la Tabla 7.

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TABLA 7

Designación	Diámetro	Contenido [%]
Polvo fino	< 10 \mum	1
Polvo	10-50 \mum	2
Partículas finas	50-200 \mum	18
Tamaño medio de partícula	200-400 \mum	79
Partículas de mayor tamaño que el especificado	>400 \mum	0

\vskip1.000000\baselineskip

Se determinó que el contenido, medido como ácido D-pantoténico, era de 38,9% en peso. El producto se obtuvo prácticamente sin polvo. La densidad aparente fue de 400 kg/m^{3}.

Por medio del proceso descrito aquí, o por medio de un proceso de rociado, lecho fluidizado, agitación o mezclado diferentes, el concentrado que contenía D-pantotenato de calcio o ácido D-pantoténico se rocía sobre otras sustancias auxiliares o excipientes convencionales, orgánicos o inorgánicos, como sílices, silicatos, tortas de filtración, salvados, harinas, almidones, azúcares o similares y se granula, opcionalmente con el uso de aglutinantes, gelificantes u otros auxiliares de formulación.

Ejemplo 5 Preparación de D-pantotenato de calcio con un tamaño de partícula entre 100 y 400 \mum por mezclado y granulación en una secadora de vacío

En primer lugar se separó la biomasa de un licor de fermentación que contenía D-pantotenato de calcio que había sido preparado de acuerdo con el proceso del Ejemplo 1 y que contenía aproximadamente 4,9% en peso de ácido D-pantoténico. Con ese fin, se filtraron 90 litros del licor de fermentación antedicho mediante filtración de flujo cruzado usando una membrana de microfiltración de 0,22 \mum en un equipo de filtración CERAFLO MSP005756 de Millipore (Bad Homburg, Alemania).

Después el licor tratado de ese modo se concentró hasta un contenido de líquido de aproximadamente 50% en peso de contenido seco en un rotavapor R-152 de Büchi, Suiza, entre 40 y 80ºC, al vacío. El concentrado que contenía D-pantotenato de calcio preparado de ese modo que tenía un contenido de ácido D-pantoténico de 28,8 % en peso se mezcló después con sílice (Sipernat 22, Degussa-Hüls AG, Frankfurt, Alemania) con la ayuda de una secadora de vacío (tipo VT 130, Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Paderborn, Alemania) para formar un granulado que fluyera libremente. Primero se colocaron 15 kg de sílice (Sipernat 22, Degussa-Hüls AG, Alemania) en la secadora de vacío (tipo VT 130, Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Alemania), y después se agregaron 39,0 kg del concentrado que contenía D-pantotenato de calcio preparado antes a una velocidad de 2,0 kg por minuto en un vacío de 200 mbar, con el material a ser mezclado a una temperatura de 45ºC y con un comportamiento de agitación de 120 rpm (revoluciones por minuto). Después se continuó la operación de mezclado por otros 15 minutos mientras se aumentaba el vacío a 50 mbar. Después se secó el granulado que contenía D-pantotenato de calcio preparado de ese modo hasta un contenido de humedad residual de menos de 2% en peso en una secadora vibratoria de lecho fluidizado (Escher-Wyss, Linden, Alemania) que tenía una superficie de lecho fluidizado de 0,3 m^{2} con una temperatura del lecho de 65ºC y una capacidad de producción de gas de secado de 270 Nm^{3}/hora. La Tabla 8 muestra la distribución de tamaño de partícula promedio del producto.

TABLA 8

Designación	Diámetro	Contenido [%]
Polvo fino	< 10 \mum	1
Polvo	10-50 \mum	2
Partículas finas	50-125 \mum	6
Tamaño medio de partícula	200-400 \mum	89
Partículas por encima del tamaño especificado	> 400 \mum	2

Se determinó que el contenido, medido como ácido D-pantoténico, era de 32,6% en peso. El producto casi no tenía polvo. La densidad aparente fue de 650 kg/m^{3} después de secar.

Por medio del proceso descrito aquí, o por medio de un proceso de rociado, lecho fluidizado, agitación o mezclado diferentes, se puede rociar el concentrado que contiene D-pantotenato de calcio o ácido D-pantoténico sobre otras sustancias auxiliares o excipientes convencionales, orgánicos o inorgánicos, como sílices, silicatos, tortas de filtración, salvados, harinas, almidones, azúcares, y granularlo, opcionalmente con el uso de aglutinantes, gelificantes u otros auxiliares de formulación.

Claims

1. Aditivos para verter para piensos, basados en licor de fermentación y que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales, caracterizados por comprender:

e): están presentes en forma sólida, en una distribución de tamaño de partícula de 20 a 2.000 nm, especialmente de 50 a 800 \mum, más especialmente de 150 a 600 \mum, y se pueden verter.

2. Aditivos para piensos de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracterizan por contener, en forma sólida, un contenido de constituyentes que contienen cloruro en una concentración < 2 mg por g de aditivo y especialmente < 1,5 mg por g de aditivo.

3. Aditivos para piensos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracterizan por contener una o más sales seleccionadas del grupo constituido por la sal de sodio, potasio, amonio, magnesio o calcio del ácido D-pantoténico.

4. Aditivos para piensos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracterizan porque están en forma de un microgranulado que se formula para ser ventajoso en términos de manipulación.

5. Aditivos para piensos de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, que se caracterizan porque además contienen uno o más L-aminoácidos seleccionados del grupo constituido por L-metionina, L-lisina, L-valina, L-alanina, L-treonina o L-triptofano.

6. Un proceso para la preparación de aditivos para piensos que contengan ácido D-pantoténico y/o sus sales, que se caracteriza porque

b): la biomasa y/o una porción de los otros constituyentes adicionales se separan, opcionalmente total o parcialmente, de un licor de fermentación que contiene ácido D-pantoténico y se obtienen mediante fermentación,

e): se seca de manera adecuada, y

f): se obtiene un aditivo para verter para piensos que comprende ácido D-pantoténico y/o sus sales en una cantidad de 20 a 80% en peso (peso seco) y una distribución de tamaño de partícula de 200 a 2.000 \mum mediante medidas adecuadas.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque el óxido o el hidróxido se agrega en una relación estequiométrica entre 0,8 y 1,2, preferentemente entre 0,95 y 1,1, basada en el ácido D-pantoténico.

8. El proceso para la preparación de aditivos para piensos que contengan ácido D-pantoténico y/o sus sales de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque

a): la biomasa y/o una porción de los constituyentes se separan, opcionalmente total o parcialmente, de un licor de fermentación que contiene ácido D-pantoténico y se obtienen mediante fermentación,

b): opcionalmente la mezcla así obtenida se concentra, y

c): el aditivo para piensos que contiene pantotenato de amonio se convierte en una forma para verter mediante medidas adecuadas y

\newpage

9. Un proceso para la preparación de aditivos para piensos de acuerdo con la reivindicación 6 con un contenido de ácido D-pantoténico y/o sales de éste seleccionadas del grupo constituido por la sal de sodio, potasio, amonio, magnesio o calcio en el rango de 20 a 80% en peso (materia seca), a partir de licores de fermentación, que se caracteriza por los pasos de

b): eliminación de la biomasa formada durante la fermentación en una cantidad de \geq 0 a 100%,

c): agregado opcional de uno o más de los hidróxidos u óxidos de un metal alcalino o alcalinotérreo a los licores de fermentación obtenidos de acuerdo con a) y b), siendo la cantidad de compuestos agregada tal que la concentración total de éstos en el aditivo para piensos se encuentre en el rango entre 20 y 80% en peso, y

d): obtención de los aditivos para piensos en la forma de material pulverizado deseada o, preferentemente, en forma granular,

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque se obtiene un aditivo para piensos del licor de fermentación, opcionalmente después del agregado de ácido D-pantoténico y/o sus sales y opcionalmente después del agregado de sustancias auxiliares orgánicas o inorgánicas, mediante

a): secado y compactación, o

b): deshidratado por aspersión, o

c): deshidratado por aspersión y granulación, o

d): deshidratado por aspersión y granulación de aumento de tamaño.