JP2004501661A

JP2004501661A - Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含む注入可能な飼料添加物、およびその製法

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Publication number: JP2004501661A
Application number: JP2002506600A
Authority: JP
Inventors: ミヒャエル　ビンダー; マティアス　モル; ディーター　グライシンガー; アレクサンダー　メラー; ヴァルター　プフェッフェルレ
Original assignee: Evonik Degussa GmbH; Degussa GmbH; Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-05-09
Publication date: 2004-01-22
Also published as: CN100401908C; ATE335407T1; SK1132003A3; EP1296566B1; WO2002001964A1; US6479084B2; BR0112158A; BR0112158B1; ZA200300031B; DE60122149D1; KR20030051592A; US6368644B1; RU2275818C2; US6596327B2; US20020136801A1; HUP0301559A2; CN1449254A; US20030044485A1; DE10032349A1; DK1296566T3

Abstract

本発明は、発酵液をベースとし、かつＤ−パントテン酸および／またはその塩を含有する動物飼料添加物に関し、これは
ａ）これが発酵中に形成されるバイオマスを≧０〜１００％までの量で含有し；
ｂ）これが発酵液の別の主要成分を僅かでも含有し；
ｃ）これが固体形で、特に２０〜２０００μｍ、好ましくは５０〜８００μｍ、より好ましくは１５０〜６００μｍの粒度分布を示し、
ｄ）これが、固体形で塩化物−含有成分を、添加物１ｇあたり＜３ｍｇの濃度で含有する
ことを特徴とする。本発明はさらに、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する動物飼料添加物の製法を提供する。

Description

【０００１】
本発明は、発酵液をベースとし、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する注入可能な動物飼料添加物、およびそのような添加物の製法に関する。
【０００２】
従来技術
パントテン酸は年に数千トンの規模で世界中で製造されている。製造されたパントテン酸の大部分は家禽および養豚等の営利目的の家畜の餌に使用される。需要は増加している。
【０００３】
パントテン酸は、化学合成または好適な栄養溶液中での適当な微生物の発酵によるバイオテクノロジー法で製造できる。化学合成の場合、ＤＬ−パントテン酸が重要な前駆体である。多段階工程法を用いて、ホルムアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびシアニドから製造され；更なる処理工程において、ラセミ混合物を分割し、Ｄ−パントラクトンをβ−アラニンで凝縮し、これによりＤ−パントテン酸を取得する。
【０００４】
市販される典型的な形態は、Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩である。Ｄ，Ｌ−パントテン酸のラセミ混合物のカルシウム塩も一般的である。
【０００５】
微生物発酵による製造の利点は、所望の立体異性形、すなわちＬ−パントテン酸を含まないＤ形を直接製造できることである。
【０００６】
様々な細菌種、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｒｙｔｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、および酵母、例えばＤｅｂａｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉが、好適な発酵条件下にＤ−パントテン酸を製造でき、例えばＥＰ−Ａ−０４９３０６０、ＥＰ−Ａ−０５９０８５７およびＷＯ９７／１０３４０に記載される。特に好適な微生物はそこに記載されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＦＯ３５４７誘導体であり、例えば株ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１またはＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２である。
【０００７】
ＥＰ−Ａ−０４９３０６０、ＥＰ−Ａ−０５９０８５７およびＷＯ９７／１０３４０に記載されるように、発酵によりＤ−パントテン酸を製造する場合、Ｄ−パントテン酸を製造できる微生物を好適な栄養培地中で培養し、次に複雑な方法で、形成されるＤ−パントテン酸を単離し、精製し、カルシウム塩の形に製造する。
【０００８】
好適な栄養培地は、炭素源、例えばグルコースまたはスターチの加水分解物またはスクロースまたは糖蜜、前駆体、例えばβ−アラニン、Ｄ，Ｌ−パントイン酸またはＤ，Ｌ−パントラクトン、窒素源、例えば硫酸アンモニウム、リン酸源、例えばリン酸カリウムおよび他の塩、微量元素およびビタミンならびに場合により自然培地添加物、例えばイーストエキストラクトを含有する。微生物を次いで好適なｐＨ値で適当なエアレーションを行いながら培地中でインキュベートし、攪拌し、その結果Ｄ−パントテン酸が分泌される。
【０００９】
ＷＯ９６／３３２８３およびＥＰ−Ａ−０５９０８５７に記載される、近年の従来技術において、Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩がパントテン酸−含有発酵液から複雑な単離精製操作を経て取得されている。最初に濾過または遠心分離によりバイオマスを分離し、濾液をさらに活性炭またはカラムクロマトグラフィーで精製処理する。得られた溶液を水酸化カルシウムと反応させた後、所望のＣａ塩が晶出する。
【００１０】
ＷＯ９６／３３２８３によれば、濾液を最初のカラムにおいて活性炭により脱色する。濃塩酸でｐＨ値を３．０に調節し、次いで液体を、活性炭を充填した２種類のカラムで連続して精製する。Ｄ−パントテン酸の溶出をメチルアルコールを用いて実施する。その後、Ｃａ（ＯＨ）_２粉末による中和で溶液を得、５℃で結晶化することによりこの溶液からＤ−パントテン酸カルシウムを得る。
【００１１】
ＥＰ−Ａ−０５９０８５７に記載される方法の場合、濾液を最初に、陽イオン−および陰イオン−交換カラムで精製する。溶出を塩酸を用いて実施する。溶出フラクションを次にＣａ（ＯＨ）_２で中和する；活性炭を添加し、全体を濾過する。得られた濾液を次に低分子量アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール）で抽出し、結晶化することにより、Ｄ−パントテン酸カルシウムを得る。
【００１２】
記載の方法で製造したＤ−パントテン酸カルシウムを動物に与える飼料用の添加物として使用する。
【００１３】
本発明の課題
従来技術では、Ｄ−パントテン酸またはＤ，Ｌ−パントテン酸の塩を、化学合成または発酵液から得、これを純物質の形で飼料に添加していた。
【００１４】
本発明の課題は、Ｄ−パントテン酸およびその塩をより処理の実施し易い形で提供し、それを飼料用製品に製造する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明は、発酵液をベースとし、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する注入可能な動物飼料添加物を提供し、この飼料添加物は以下の特徴を有する：
ａ）発酵中に形成されるバイオマスを≧０〜１００％の量で含有する；
ｂ）発酵液の別の成分の主要部を僅かでも含有する；
ｃ）２０〜２０００μｍ、特に５０〜８００μｍ、さらに特に１５０〜６００μｍの粒度分布を有する固体形で、注入可能である。
【００１６】
本発明の好ましい形態において、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する注入可能な動物飼料添加物は、付加的に、固体形で、添加物１ｇに対して＜３ｍｇで、有利に添加物１ｇに対して＜２ｍｇで、および特に添加物１ｇに対して１．５ｍｇの濃度で塩化物−含有成分を含有する。
【００１７】
添加物は一般的に、圧縮され、造粒され、微細造粒されるが、時には注入形のものが必要とされ、これらは様々な量のバイオマスを含有する。みかけの密度は、２００〜８００ｋｇ／ｍ^３、特に約４００〜７００ｋｇ／ｍ^３である。添加物は容易に注入でき、貯蔵に安定である。
【００１８】
バイオマスを分離除去する場合、さらに、例えば発酵中に添加された無機固体も通常除去される。加えて本発明の添加物は、好適な方法で分離されない限り、形成または添加されかつ発酵液中に溶解している別の物質、特に有機物の主要部を僅かでも含有する。
【００１９】
このような物質には、発酵に使用する微生物がＤ−パントテン酸に加えて生成および分泌する有機副生成物が含まれる。これにはＬ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−バリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニンまたはＬ−トリプトファンから成る群より選択されるＬ−アミノ酸が含まれ、特にＬ−バリンである。これらはまた、１〜３個のカルボキシル基を有する有機酸を含み、例えば酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸またはフマル酸である。最後に、これらはまた、糖、例えばトレハロースを含む。このような化合物が添加物の栄養価を高めるのに必要である。
【００２０】
有利な形態において、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する発酵液が製造され、その際、
ａ）発酵は実質的に塩化物不含の培地で実施され、
ｂ）場合によりバイオマスの分離および濃縮後に、得られた発酵液を乾燥し、圧縮し、噴霧乾燥し、噴霧造粒または造粒するかあるいは安定なマトリクスに含有させるか包埋する。
【００２１】
本発明の方法に適した発酵液は、Ｄ−パントテン酸の製造に好適な微生物を使用することにより得られ、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する。塩は一般的にナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩である。
【００２２】
微生物は菌類または酵母であってよく、例えばＤｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｓｔｅｌｌｉｉまたはグラム陽性細菌、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはグラム陰性細菌、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのファミリーの細菌である。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのファミリーである場合、特にＥｓｃｈｅｉｃｈｉａ属およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ種が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ種の中でも、いわゆるＫ−１２株、例えばＭＧ１６５５またはＷ３１１０（Ｎｅｉｄｈａｒｄｅｔａｌ．：ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ．ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭＰｒｅｓｓ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．））またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ野生株ＩＦＯ３５４７（ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｅｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｆａｐａｎ）およびそれらの変異体が挙げられる。ＩＦＯ３５４７、ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１（ＥＰ−Ａ−０５９０８５７）およびＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２（ＷＯ９７／１０３４０）から製造される株が有利である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の場合、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが挙げられる。
【００２３】
前記微生物は、バッチまたは供給バッチあるいは反復バッチ法で、連続的または非連続的なＤ−パントテン酸の製造を目的として培養されてよい。公知の培養法の要約はＣｈｍｉｅｌのテキスト（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ１．ＥｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇｉｎｄｉｅＢｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（ＧｕｓｔａｖＦｉｓｃｈｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓのテキスト（ＢｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎｕｎｄｐｅｒｉｐｈｅｒｅＥｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（ＶｉｅｗｅｇＶｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載される。
【００２４】
使用する培地は、好適な方法における当該微生物の要求に合致するものでなければならない。発酵培地は、実質的に塩化物含有成分を含まない。本発明によれば、製造用発酵槽の塩化物イオン濃度は＜３００ｍｇ／ｌ、好ましくは＜２００ｍｇ／ｌおよび非常に好ましくは＜１５０ｍｇ／ｌである。炭素源として、糖および炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂および脂肪として、例えばダイズ油、ひまわり油、ラッカセイ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタノール、有機酸、例えば酢酸を使用する。これらの物質を単独であるいは混合物の形で使用してよい。窒素源として、有機窒素−含有化合物、例えばペプトン、イーストエキストラクト、ミートエキストラクト、麦芽エキス、コーンスチープリカー、ダイズ粉および尿素、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを使用する。窒素源を単独でまたは混合物の形で使用してよい。リン源として、リン酸ニ水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相当のナトリウム−含有塩を使用してよい。培地はまた、増殖に必要な金属塩を含有しなければならず、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄である。最後に、増殖必須成分、例えばアミノ酸およびビタミンを前記物質に加えて使用してよい。Ｄ−パントテン酸の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントイン酸またはパントイン酸、および場合によりその塩を培地に添加してもよい。前記物質を単独バッチの形で培地へ添加してもよく、あるいは培養中に好適な手段で供給してもよい。
【００２５】
ｐＨ値を制御するために、アンモニアまたはアンモニア水または他の塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化カルシウムを使用する。酸化合物がｐＨ値の制御に必要な場合、リン酸または硫酸を便宜的に使用する。パントテン酸のカルシウム塩を直接製造するために、水酸化カルシウムを水性懸濁液の形で発酵中に使用する。発泡を制御するために、脱泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、選択的作用を有する好適な物質、例えば抗生物質を場合により培地へ添加してよい。好気条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば空気を培地へ導入する。培地の温度は通常２０℃〜４５℃であり、好ましくは２５℃〜４０℃である。Ｄ−パントテン酸が最大量で形成されるまで培養する。この目的は１０時間〜１００時間の期間で達成されるのが一般的である。
【００２６】
このようにして得られた発酵液は、７．５〜２５質量％の乾燥質量を有し、２〜２０質量％のＤ−パントテン酸を含有するのが一般的である。Ｄ−パントテン酸が発酵終了時に乾燥状態で少なくとも２０質量％存在する発酵法が特に有利である。発酵中の糖の量が少なくとも発酵終了時には制限されているのが有利であるが、発酵中の少なくとも３０％であるのが好ましい。このことは、発酵培地中の使用可能な糖の濃度が、期間中≧０〜３ｇ／ｌに維持されるかまたは≧０〜３ｇ／ｌに低下されることを意味している。
【００２７】
本発明の添加物の製造において、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する発酵液は、公知の分離法、例えば遠心分離、濾過、デカンテーションまたはそれらを組み合わせることにより、バイオマスの全体または一部を最初に除くのが有利である。しかし、本発明では、発酵液中にバイオマス全部が残留していてもよい。このようにして得られる懸濁液を次に６０質量％を上回る乾燥質量に濃縮し、噴霧乾燥または凍結乾燥装置を用いて粉末へと加工するのが好ましい。粉末を次に、好適な圧縮法または造粒法により、粗い粒状の、容易に注入でき、貯蔵可能でありかつほとんどダストを含まない生成物へと変換する。造粒または圧縮操作中に、慣用の有機または無機助剤、またはキャリアー、例えばスターチ、ゼラチン、セルロース誘導体または類似の物質、食料または飼料の加工で常用される結合剤、ゲル化剤または増粘剤または別の物質、例えばシリカ、シリケートまてたはステアレートを使用するのが有利である。
【００２８】
また、生成物を飼料の加工において公知かつ常用の有機または無機キャリアーへ担持してもよく、例えばシリカ、シリケート、食餌、ブラン、小麦粉、スターチ、糖または類似物へ担持し、かつ／または常用の増粘剤および結合剤で安定化されていてよい。関連の例および方法は、文献に記載されている（ＤｉｅＭｕｅｈｌｅ＋Ｍｉｓｃｈｆｕｔｔｅｒｔｅｃｈｎｉｋ１３２（１００５）４９，ｐ．８１７）。
【００２９】
本発明の、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する新規固体生成物は、前記方法で製造でき、Ｄ−パントテン酸を２０〜８０質量％、有利には３０〜７５質量％含有する。一般的に、２．５〜２５質量％の量の無機成分および場合により＞０〜３０質量％の量の有機副生成物を含有する。乾燥バイオマスの含有量は≧０〜３５質量％である。水含量は有利に＜５質量％である。
【００３０】
本発明の新規生成物はＤ−パントテン酸および／またはその塩を含有し、前記方法で製造され、２０μｍ〜２０００μｍ、有利には５０μｍ〜８００μｍおよび特に１５０μｍ〜６００μｍの粒度分布により識別される。微細ダスト（＜１０μｍ）の含有量は約０質量％〜１０質量％、有利には約０質量％〜５質量％である。生成物を飼料添加物として使用する。
【００３１】
Ｄ−パントテン酸の濃度は、公知の方法で測定できる（Ｖｅｌｉｓｅｋ；ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＳｃｉｅｎｃｅ６０，５１５〜５６０（１９９２））。
【００３２】
粒度分布は、レーザー回折分光測定法により測定できる。相当の方法がテキスト“ＴｅｉｌｃｈｅｎｇｒｏｅｓｓｅｎｍｅｓｓｕｎｇｉｎｄｅｒＬａｂｏｒｐｒａｘｉｓ”（Ｒ．Ｈ．ＭｕｅｌｌｅｒａｎｄＲ．Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，ＷｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅＶｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔＳｔｕｔｔｇａｒｔ（１９９６））またはテキスト“ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＰａｒｔｉｃｌｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，ＶｅｒｌａｇＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９８））に記載される。
【００３３】
実施例
本発明を以下の実施例により詳細に説明する。この目的のために、試験はＤ−パントテン酸−産出株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ５０６９／ｐＦＶ３１を用いて実施され、これはＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅへ、ブダペスト条約に基づいてＦＥＴＭ−ＢＰ４３９５として寄託されている（ＡｇｅｎｃｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｃｉｅｎｃａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１−３，Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ（Ｊａｐａｎ）（ＥＰ−Ａ−０５９０８５７））。
【００３４】
測定を、ＱｕａｎｔｏＣｈｒｏｍｅ（Ｏｄｅｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＣｉｌａｓ９２０レーザー回折分光器を用いて実施した。測定結果の評価を、粒度分布の表示に関するドイツ工業標準ＤＩＮ６６１４１の規定により実施した。
【００３５】
例１
発酵液中でのＤ−パントテン酸のカルシウム塩の製造
１．接種物の製造（マスターセルバンク）
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１のサンプルを１ｍｌあたり５０μｇのアンピシリンを添加したＬＢＧアガーへ播種した。アガープレート培地を３７℃で１７時間インキュベートし、次いで冷蔵庫で＋４℃で貯蔵した。選択した各コロニーを次にＬＢＧブイヨン中で更に増殖させた。ＬＢＧブイヨンは以下の組成を有する：１０ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌイーストエキストラクト、５ｇ／ｌＮａＣｌおよび１ｇ／ｌグルコース。ＬＢＧアガーは、付加的に１２ｇ／ｌアガーを含有する。レディーメイド製品をＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ）からＬＢブロスまたはＬＢアガーとして入手できる。１ｇ／ｌのグルコースを添加した後、インキュベートし、培地を得る。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入った培養物１０ｍｌを３７℃で１６時間、ＫｕｒｈｎｅｒＡＧ（Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｓｗｅｔｚｅｒｌａｎｄ）社製のＥＳＲインキュベーターを用いて１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞懸濁液をＢｅｃｋｍａｎ（Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＪ−６Ｂ遠心機を用いて、４００ｒｐｍで１５分遠心することにより分離した。細胞ペレットを、２０％グリセロールを添加したＬＢＧ培地１０ｍｌへ再懸濁した；１ｍｌを滅菌条件下にそれぞれ１０個のアリコットへ分配し、−７０℃で凍結した。これらの培養物をマスターセルバンクとして使用した。
【００３６】
ワーキングセルバンクを製造するために、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢＧ培地を１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコへ１０ｍｌづつ分配し、次いで前記マスターセルバンク１００μｌと一緒にインキュベートした。インキュベートは、ＫｕｅｈｎｅｒＡＧ（Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＥＳＲインキュベーターを用いて、３７℃で１６時間、１８０ｒｐｍで実施された。
【００３７】
インキュベーション後、Ｄｒ．Ｌａｎｇｅ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＰ２Ｗ光度計を用いて、６６０ｎｍの測定波長で培養物懸濁液の光学密度（ＯＤ）を測定した。これは３．５であった。細胞懸濁液を滅菌条件下にＧｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製の滅菌した３０ｍｌのポリエチレンチューブへ導入し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ（Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＪ−６Ｂ遠心機を用いて、２５００ｒｐｍで１５分分離した。分離されたバイオマスを、グリセロール２０％を添加したＬＢＧ培地１０ｍｌへ再懸濁した。細胞懸濁液を次に５００μｌずつ、滅菌条件下に、Ｎａｌｇｅｎｅ（ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）社製の１ｍｌの滅菌チューブへ導入し、−７０℃で凍結した。このように製造された保存バッチをワーキングセルバンクとして使用した。
【００３８】
２．Ｄ−パントテン酸カルシウムを含有する発酵液の製造
Ｄ−パントテン酸カルシウムを含有する発酵液を製造するために、ワーキングセルバンクを最初に振とうフラスコ培養により増殖させ、前−発酵槽へ接種するために使用した。前−発酵槽培養物を、生成−発酵槽へ接種するのに使用した。
【００３９】
ＳＫＡ培地（表１）を使用して、振とうフラスコ培養を行った。ＳＫＡ培地は以下のようにして製造された：
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４　７．０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４　０．５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４　１．０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　０．５ｇ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ　０．０１ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　０．００１ｇ、Ｆｅ_２（ＳＯ_４）_３　０．００５ｇおよび予め２５％アンモニア溶液でｐＨ６．８に調節したコーンスチープリカー２０ｇを、１リットルのガラスビーカーに測り入れ、次いで脱塩水で８２５ｇとした。コーンスチープリカーを含む塩溶液をオートクレーブ中で１２１℃で２０分滅菌した。さらに、グルコース２５ｇおよびチアミン・ＨＣｌ０．００２ｇを含む溶液を脱塩水で１２５ｇとし、濾過滅菌した。ＣａＣＯ_３　１０ｇを１００ｍｌのフラスコに測り入れ、オートクレーブで１２３℃で２０分滅菌した。前記のコーンスチープリカーを含む塩溶液を有する２つの成分を組合せることにより、ＳＫＡ培地を得た。
【００４０】
ＳＫＡ培地を１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコへ１２．５ｍｌづつ分配し、細胞懸濁液０．５ｍｌと一緒にインキュベートした。使用した細胞懸濁液は、滅菌生理食塩水で１：１００に希釈したワーキングセル培養物の保存バッチであった。インキュベートを、ＩｎｆｏｒｓＡＧ（Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）社製のＲＣ−１−ＴＫインキュベーターを用いて、１５０ｒｐｍで、３２℃で２０時間実施した。その後、６６０ｎｍの波長で測定した光学密度（ＯＤ６６０）は、１２．５であった。
【００４１】
Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製の４２リットル攪拌反応発酵槽（ｗａｌｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｍｏｄｅｌＬＰ−４２）に入っているＡ１−１０２−前培養培地２０ｋｇをインキュベートするために、ＳＫＡ培地０．５ｍｌを１：１００に希釈し、その懸濁液の５０ｍｌを発酵槽へ添加した。前培養培地Ａ１−１０２は、表２に列挙した成分を含有した。培地を、０．５体積／体積／分（ｖｖｍ）の体積特異的な通気で、空気飽和の２０％の酸素分圧で、およびｐＨ６．５で、ＯＤ６６０が１１．３に達するまで、３７℃で１５．５時間培養した。
【００４２】
Ｂ．Ｂｒａｕｎ社製の１４リットル攪拌反応発酵槽（ＢＢＩ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，ｍｏｄｅｌＢｉｏｓｔａｔＥ／ＥＤ）中のＭ１−３８０本培地５８３０ｇをインキュベートするために、Ａ１−１０２培地中の第２前−培養物４２３ｍｌを添加した、Ｍ１−３８０本培地は、表３に列挙された成分を含有した。培地を最初に０．７５ｖｖｍの体積特異的通気により、４００ｒｐｍの最低攪拌速度で、ｐＨ６．５で、１８．６のＯＤ６６０および空気飽和の２％の酸素分圧に達するまで、３７℃で６．５時間培養した。培地を次いで、空気飽和の２％の酸素分圧および６．０のｐＨ値で、ＯＤ６６０が６６．８に達するまで、３７℃でさらに４１時間培養した。１３時間の発酵後、β−アラニンを、Ｈ_２Ｏ５７０ｍｌ中１５２．７ｇの濃度で、３４．５時間かけて供給した。２１．５時間の発酵時間後、１０％のＣａ（ＯＨ）_２溶液を２６時間かけて測り入れ、ｐＨを調節した。６５０．８ｇ／ｌのグルコース濃度および３５．７ｇ／ｌのチアミン・ＨＣｌ濃度を有するＭ２−２５７培地３．４３ｋｇを４１時間かけて供給した。
【００４３】
光学密度（ＯＤ）を次にＤｒ．ＢｒｕｎｏＬａｎｇｅＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製ＬＰ１Ｗタイプデジタル光度計を用いて、６６０ｎｍの測定波長で測定し、形成されたＤ−パントテン酸濃度をＨＰＬＣにより測定した（ＨｙｐｅｒｓｉｌＡＰＳ２５μｍ、２５０×５ｍｍ、ＲＩ検出）。
【００４４】
７０時間後の最終発酵サンプル中で、Ｄ−パントテン酸として測定して４９．７ｇ／ｌのＤ−パントテン酸カルシウム濃度が測定された。
【００４５】
Ｄ−パントテン酸の含量を、Ｋｎａｕｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＭ３２１タイプのＨＰＬＣ装置（高速液体クロマトグラフィー）を用いて、粒度５μｍのＨｙｐｅｒｓｉｌＡＰＳ２アミノフェーズを使用したＲＩ（屈折率）検出により測定した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
【表２】

【００４８】
【表３】

【００４９】
例２
発酵液からの微粉砕されたＤ−パントテン酸カルシウムの製造
本発明の例１で製造されかつ約４．９質量％のＤ−パントテン酸を含有するＤ−パントテン酸カルシウム含有発酵液から、最初に、バイオマスを分離した。この目的のために、前記発酵液９０リットルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＢａｄＨｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＣＥＲＡＦＬＯＭＳＰ００５７５６濾過装置中の０．２２μｍのマイクロフィルトレーションメンブレンを用いた十字流濾過により、濾過した。
【００５０】
このように処理した液を次に約３０％の乾燥含量を示す液体含量にまで、Ｂｕｅｃｈｉ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）社製のＲｏｔａｖａｐｏｒＲ１５２ロータリー蒸発装置中で、真空で、４０〜８０℃で濃縮した。こうして濃縮した液を次に噴霧乾燥して、Ｄ−パントテン酸カルシウム塩を製造した。この目的のために、霧化プレート（１２０ｍｍ直径；回転速度１３５ｍ／秒）を有するＮＩＲＯＭｉｎｏｒタイプのＮｉｒｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）社製Ｔｅｃｈｎｉｋｕｍ噴霧乾燥機を、注入口温度１７５℃および排出口温度８０℃で、５２５ｍ^３／時間の乾燥気体排気量で使用した。生成物のより好ましい流出の目的のために、Ｄｅｇｕｓｓａ−ＨｕｅｌｓＡＧ（ＦｒａｎｋｆｕｒｔａｍＭａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＳｉｐｅｒｎａｔ２２を乾燥気体流へ、濃縮物の乾燥質量に対して５質量％の割合で、粉末助剤として、添加した。
【００５１】
このように製造されたＤ−パントテン酸カルシウム含有生成物は、４８．５質量％のＤ−パントテン酸含量を示し、注入可能であり、４６０ｋｇ／ｍ^３の見かけ密度を有し、平均粒度が３４μｍであった。
【００５２】
【表４】

【００５３】
例３
ロール圧縮機および篩い分けによる、＞１００μｍの粒度を有するＤ−パントテン酸カルシウムの製造
本発明の例２の方法で製造されかつ約４８．５質量％のＤ−パントテン酸を含有し３４μｍの平均粒度を有するＤ−パントテン酸カルシウム含有ダスト様生成物を、シガー様ロールを有するロール圧縮機（ＢＥＰＥＸ社製Ｐｈａｒｍａｐａｋｔｏｒ、タイプＬ２００／５０Ｐ）により、４０〜９０ニュートンの圧縮力で圧縮した。ロールの回転速度は１分あたり１０回転であった。このように製造された圧縮生成物を次に微粉砕篩いで２００〜４００μｍの粒度分布にまで破壊した。各粒子フラクションの収量を表５に示す。
【００５４】
圧縮生成物は、微細ダストの非常に低い含量を特徴とし、粉末状の出発物質と比べて流れ挙動が改善されていた。
【００５５】
【表５】

【００５６】
“平均粒度”の欄は、篩い分けにより単離され、生成物を表す。このように製造された生成物は、Ｄ−パントテン酸として測定して、約４０．７質量％の含量を示し、みかけの密度は６３０ｋｇ／ｍ^３であった。
【００５７】
例４
流動床造粒機を用いた形成造粒による、平均粒度２００〜４００μｍのＤ−パントテン酸カルシウムの製造
４．１顆粒化結合剤としての水の使用
Ｄ−パントテン酸カルシウム含有発酵液から本発明の例２の噴霧乾燥により製造されたＤ−パントテン酸カルシウム含有粉末状生成物を、その後、特殊な量の水を噴霧することにより、さらに流動床造粒機中でさらに処理した。
【００５８】
この目的のために、本発明の例２で製造されたダスト様のＤ−パントテン酸カルシウム含有生成物３００ｇを、実験室用のＡｅｒｏｍａｔｉｃｓＮｉｒｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）社製流動床装置へ導入した。５０℃の流動床温度および３０℃の排気気体温度で、１分あたり３ｇの水を測量装置を介して噴霧した。流動気体温度は７０〜８０℃であった。こうして得られた生成物の粒度分布を表６に記載する。
【００５９】
【表６】

【００６０】
Ｄ−パントテン酸として測定された含量は、３８．１質量％であった。生成物はほぼダスト不含であった。みかけの密度は３１０ｋｇ／ｍ^３であった。生成物はかなり容易に注入できる。
【００６１】
４．２顆粒化結合剤としてのパントテン酸カルシウム濃縮物の使用
本発明の例２の噴霧乾燥により、Ｄ−パントテン酸カルシウム含有発酵液から製造された、Ｄ−パントテン酸カルシウム含有粉末状生成物を、別の試験において、流動床造粒機を用い、乾燥質量約５０質量％の含量を有する濃縮Ｄ−パントテン酸カルシウム溶液を特殊な量で噴霧することにより、さらに処理した。
【００６２】
この目的のために、本発明の例２の方法で製造されたダスト様Ｄ−パントテン酸カルシウム含有生成物１０００ｇを、Ｇｌａｔｔ（Ｂｉｎｚｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のバッチワイズで操作される実験室流動床装置中に導入した。約４０〜４５℃の流動床温度および約８０℃の注入口空気温度で、前記濃縮物を１分あたり約５ｇで、実験室用流動床装置へ噴霧した。こうして製造された生成物の粒度分布を表７に示す。
【００６３】
【表７】

【００６４】
Ｄ−パントテン酸として測定された含量は３８．９質量％であった。生成物はほぼダスト不含であった。みかけの密度は４００ｋｇ／ｍ^３であった。
【００６５】
ここに記載の方法により、または異なる噴霧、流動床、攪拌または混合法により、Ｄ−パントテン酸カルシウムまたはＤ−パントテン酸を含有する濃縮物を別の常用の有機または無機キャリアーあるいは補助物質、例えばシリカ、シリケート、食餌、ブラン、小麦粉、スターチ、糖または類似物へ噴霧し、場合により結合剤、ゲル化剤または他の配合助剤を用いて造粒する。
【００６６】
例５
真空乾燥機中での混合および造粒による、平均粒度１００〜４００μｍのＤ−パントテン酸カルシウムの製造
バイオマスを最初に、本発明の例１の方法で製造されかつ約４．９質量％のＤ−パントテン酸を含有するＤ−パントテン酸カルシウム含有発酵液から分離した。この目的のために、前記発酵液９０リットルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＢａｄＨｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＣＥＲＡＦＬＯＭＳＰ００５７５６濾過装置中で０．２２μｍのマイクロフィルトレーションメンブレンを用いて、十字流濾過により濾過した。
【００６７】
このように処理された液を次に約５０％の乾燥含量を示す液体含量にまで、Ｂｕｅｃｈｉ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）社製のＲｏｔａｖａｐｏｒＲ１５２ロータリー蒸発装置中で、真空中に４０〜８０℃で濃縮した。こうして製造されたＤ−パントテン酸含有濃縮物は、２８．８質量％のＤ−パントテン酸含量を示し、次に、乾燥機（タイプＶＴ１３０、ＧｅｂｒｕｅｄｅｒＬｏｅｄｉｇｅＭａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕＧｍｂＨ，Ｐａｄｅｒｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、シリカ（Ｓｉｐｅｒｎａｔ２２，Ｄｅｇｕｓｓａ−ＨｕｅｌｓＡＧ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、容易に流れ落ちる顆粒を形成した。シリカ（Ｓｉｐｅｒｎａｔ２２，Ｄｅｇｕｓｓａ−ＨｕｅｌｓＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｕ）１５ｋｇを最初に真空乾燥機（タイプＶＴ１３０、ＧｅｂｒｕｅｄｅｒＬｏｅｄｉｇｅＭａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に導入し、次いで前記のように製造したＤ−パントテン酸カルシウム含有濃縮物３９．０ｋｇを、２００ｍｂａｒの真空下に、４５℃の温度で材料を混合しかつ１２０ｒｐｍ（１分あたりの回転数）で攪拌しながら、１分あたり２．０ｋｇの速度で添加した。混合操作をさらに１５分継続し、その間５０ｍｂａｒの真空へ上昇させた。このように製造されたＤ−パントテン酸カルシウム含有顆粒を乾燥し、０．３ｍ^２の流動床表面積を有し、床温度が６５℃であり、乾燥気体注入速度が２７０Ｎｍ^３／時間である、振動性の流動床乾燥機（Ｅｓｃｈｅｒ−Ｗｙｓｓ，Ｌｉｎｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で２質量％を下回る残留湿含量まで乾燥させた。表８は、生成物の平均粒度を示すものである。
【００６８】
【表８】

【００６９】
Ｄ−パントテン酸として測定した含量は、３２．６質量％であった。生成物はほぼダスト不含であった。乾燥後のみかけの密度は６５０ｋｇ／ｍ^３であった。
【００７０】
ここに記載の方法、または別の噴霧、流動床、攪拌または混合法により、Ｄ−パントテン酸カルシウムまたはＤ−パントテン酸含有濃縮物を、別の常用の有機または無機キャリアーあるいは補助物質、例えばシリカ、シリケート、食餌、ブラン、小麦粉、スターチ、糖へ噴霧でき、場合により結合剤、ゲル化剤または他の配合助剤を用いて造粒できる。

Claims

発酵液をベースとし、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する、注入可能な飼料添加物において、
ａ）これが発酵中に形成されるバイオマスを≧０〜１００％までの量で含有し；
ｂ）これが発酵液の別の主要成分を僅かでも含有し；
ｃ）これが固体形で、特に２０〜２０００μｍ、好ましくは５０〜８００μｍ、より好ましくは１５０〜６００μｍの粒度分布を示し、注入が可能である
ことを特徴とする、発酵液をベースとし、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する、注入可能な動物飼料添加物。
付加的に、固体形で、塩化物−含有成分を、添加物１ｇに対して＜３ｍｇ、好ましくは添加物１ｇに対して＜２ｍｇ、特に添加物１ｇに対して１．５ｍｇの濃度で含有することを特徴とする、請求項１に記載の動物飼料添加物。
Ｄ−パントテン酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩の群から選択される１種以上を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載の動物飼料添加物。
Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を２０〜８０質量％（乾燥質量）で含有し、塩化物含量が添加物１ｇに対して＜３．０ｍｇ、好ましくは添加物１ｇに対して＜２．０ｍｇ、特に添加物１ｇに対して＜１．５ｍｇであることを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の動物飼料添加物。
取り扱い易く配合された微粒子の形をしていることを特徴とする、請求項１または２に記載の動物飼料添加物。
付加的に、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−スレオニンまたはＬ−トリプトファンから成る群より選択される１種以上のＬ−アミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の動物飼料添加物。
Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する飼料添加物の製法において、
ａ）バイオマスおよび／または別の成分部を、Ｄ−パントテン酸を含有しかつ発酵により製造された発酵液から、場合により完全にまたは部分的に除き、
ｂ）得られた溶液、または液へ、アルカリ土類金属あるいはアルカリ金属の水酸化物または酸化物を添加し、
ｃ）ａ）またはｂ）で得られた混合物を場合により濃縮し、および
ｄ）２０〜２０００μｍの粒度分布を有する注入可能な動物飼料添加物を好適な手段で取得する
ことを特徴とする、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する飼料添加物の製法。
酸化物または水酸化物をＤ−パントテン酸に対して０．８〜１．２、有利には０．９５〜１．１の化学量論的割合で添加することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
請求項１に記載の、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する飼料添加物の製法において、
ａ）バイオマスおよび／または別の成分部を、Ｄ−パントテン酸を含有しかつ発酵により製造された発酵液から、場合により完全にまたは部分的に除き、
ｂ）このようにして得られた混合物を場合により濃縮し、
ｃ）パントテン酸アンモニウムを含有する飼料添加物を、好適な方法で、注入可能な形に変換し、および
ｄ）２０〜２０００μｍの粒度分布を有する注入可能な動物飼料添加物を好適な手段で取得する
ことを特徴とする、Ｄ−パントテン酸および／またはその塩を含有する飼料添加物の製法。
Ｄ−パントテン酸および／またはそのナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩から成る群より選択される塩を、発酵液に対して約２０〜８０質量％（乾燥質量）の範囲で含有する請求項７に記載の動物飼料添加物の製法において、
ａ）場合により発酵液から水を除き（濃縮）、
ｂ）発酵中に形成された≧０〜１００％の量のバイオマスを除き、
ｃ）場合により前記化合物の１種以上をａ）およびｂ）で得られる発酵液へ添加し、この際、添加する化合物の量は、動物飼料添加物中での総濃度として、約２０〜８０質量％の量であり、
ｄ）所望の粉末、または有利には顆粒の形で動物飼料添加物を取得する
ことを特徴とする、請求項７に記載の動物飼料添加物の製法。
動物飼料添加物が、発酵液から、場合によりＤ−パントテン酸および／またはその塩の添加後に、ならびに場合により有機または無機助剤の添加後に、
ａ）乾燥および圧縮、または
ｂ）噴霧乾燥、または
ｃ）噴霧乾燥および造粒、または
ｄ）噴霧乾燥および成形造粒
により取得されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。