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Die
Erfindung betrifft rieselfähige
Tierfuttermittel-Additive
auf Fermentationsbrühe-Basis,
die D-Pantothensäure und/oder
eines ihrer Salze enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung dieser
Additive.
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Stand der
Technik
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Pantothensäure wird
weltweit in einer Größenordnung
von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Ein großer Teil
der produzierten Pantothensäure
wird für
die Ernährung
von Nutztieren wie Geflügel
und Schweinen verwendet. Der Bedarf steigt.
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Pantothensäure kann
durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt
werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe.
Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd
und Cyanid hergestellt; in weiteren Verfahrensschritten wird das
racemische Gemisch aufgetrennt und das D-Pantolacton mit β-Alanin zu D-Pantothensäure kondensiert.
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Die
typische Handelsform ist das Calciumsalz der D-Pantothensäure. Das Calciumsalz des racemischen
Gemischs der D,L-Pantothensäure
ist ebenfalls gebräuchlich.
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Der
Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt
in der direkten Bildung der gewünschten
stereoisomeren Form, nämlich
der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
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Verschiedene
Arten von Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli, Arthrobacter
ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes,
und auch Hefen, wie zum Beispiel Debaromyces castellii, können, wie
in EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340 gezeigt, unter
geeigneten Fermentationsbedingungen D-Pantothensäure produzieren. Besonders
gut geeignete Mikroorganismen sind die dort beschriebenen Derivate
von Escherichia coli IFO3547 wie zum Beispiel die Stämme FV5069/pFV31
oder FV5069/pFV202.
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Bei
der fermentativen Herstellung der D-Pantothensäure, wie sie in EP-A-0 493
060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340 beschrieben ist, wird ein zur
Produktion von D-Pantothensäure
befähigter
Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und die
gebildete D-Pantothensäure anschließend in
aufwendiger Weise isoliert, gereinigt und als Calciumsalz dargestellt.
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Geeignete
Nährmedien
enthalten eine Kohlenstoffquelle wie zum Beispiel Glucose oder Stärkemehlhydrolysat
oder Sucrose oder Melasse, Vorstufen wie zum Beispiel β-Alanin, D,L-Pantoinsäure oder
D,L-Pantolacton, eine Stickstoffquelle wie zum Beispiel Ammoniumsulfat,
eine Phosphorquelle wie zum Beispiel Kaliumphosphat und weitere
Salze, Spurenelemente und Vitamine und gegebenenfalls komplexe Medienzusätze wie
zum Beispiel Hefeextrakt. Die Mikroorganismen werden dann in diesem
Medium bei einem geeignetem pH-Wert unter entsprechender Belüftung und
Rührung
inkubiert, wobei sie dann D-Pantothensäure ausscheiden.
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Nach
dem derzeitigen Stand der Technik, der in WO 96/33283 und EP-A-0
590857 dargestellt ist, wird das Calciumsalz der D-Pantothensäure durch
eine aufwendige Isolierung und Reinigung aus der Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe gewonnen.
Nach einer ersten Abtrennung der Biomasse durch Filtration oder
Zentrifugation erfolgt die weitere Aufarbeitung des Filtrats durch
Reinigung mittels Aktivkohle oder durch Säulenchromatographie. Nach der
Umsetzung der so erhaltenen Lösungen
mit Calciumhydroxid lässt
man das gewünschte
Ca-Salz auskristallisieren.
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Gemäß der WO
96/33283 entfärbt
man das Filtrat mit Aktivkohle in der ersten Säule. Mit konzentrierter Salzsäure wird
ein pH-Wert von 3,0 eingestellt und die Flüssigkeit anschließend kontinuierlich über zwei
weitere mit Aktivkohle gepackte Säulen gereinigt. Die Elution
der D-Pantothensäure
erfolgt mit Hilfe von Methylalkohol. Nach der sich anschließenden Neutralisation
mit Ca(OH)2-Pulver erhält man eine Lösung, aus
der man das Calcium-D-pantothenat durch Kristallisation bei 5°C gewinnt.
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Bei
der in EP-A-0 590 857 beschriebenen Methode reinigt man das Filtrat
zunächst
mit Hilfe von Kationen- und Anionenaustauschersäulen. Die Elution erfolgt mit
Salzsäure.
Die eluierte Fraktion wird anschließend mit Ca(OH)2 neutralisiert,
mit Aktivkohle versetzt und abfiltriert. Das gewonnene Filtrat wird
dann in einem niedermolekularen Alkohol (Methanol, Ethanol, Isopropanol)
extrahiert und das Calcium-D-pantothenat durch Kristallisation gewonnen.
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Das
auf die beschriebene Weise hergestellte Calcium-D-pantothenat wird
als Zusatz in Futtermitteln für
die Tierernährung
verwendet.
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Gegenstand
der EP-A-1 050 219 (Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ) ist ein
Tierfuttermittel-Additiv, das D-Pantothensäure und deren Salze und 0 bis
100% der während
der Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Mikroorganismen
gebildeten Biomasse enthält.
In dieser Anmeldung finden sich keinerlei Angaben zum Chloridgehalt
des Additivs. Aus der
GB 598,177 ist
ein Verfahren bekannt, bei dem Bakterien aus der Gruppe Aerobacter
aerogens als Hauptprodukt 2,3-Butylenglykol und als Nebenprodukt
eine sehr kleine Menge D-Pantothensäure produzieren.
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Das
isolierte Produkt enthält
D-Pantothensäure
in einer Menge von weniger als 1%. Der Chloridgehalt wird nicht
beachtet.
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In
der JP 58-205461 wird ein Futtermittel für die Aufzucht von Fisch beschrieben,
das beschichtete Vitamine, die unter Ascorbinsäure, Pantothensäure, Folsäure und
deren Salzen ausgewählt
sind, enthält.
Die
US 2,864,701 richtet
sich auf stabilisierte Pantothensäurezusammensetzungen, die einen
eßbaren
Träger
und ein Alkalimetallcarbonat enthalten. Diese Zusammensetzungen
werden durch Mischen des eßbaren
organischen Trägers,
der Pantothensäure
und weiterer Komponenten hergestellt und basieren nicht auf Fermentationsbrühen.
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Aufgabe der
Erfindung
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Nach
dem Stand der Technik werden Salze der D-Pantothensäure oder D,L-Pantothensäure durch chemische
Synthese oder aus Fermentationsbrühen gewonnen und dann in reiner
Form Futtermitteln zugesetzt.
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Aufgabe
der Erfindung ist, leichter zu verarbeitende Zubereitungsformen
der D-Pantothensäure
und ihrer Salze mit geringem Chloridgehalt und Verfahren zu deren
Herstellung für
Futtermittel zur Verfügung
zu stellen.
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Beschreibung
der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung sind rieselfähige
D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltende Tierfuttermittel-Additive auf Fermentationsbrühe-Basis,
dadurch gekennzeichnet, daß sie:
- a) D-Pantothensäure und/oder eines ihrer Salze
in einer Menge von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse);
- b) einen Gehalt an chloridhaltigen Bestandteilen von < 3 mg/g des Additivs;
- c) die während
der Fermentation gebildete Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100%
und
- d) zumindest den überwiegenden
Teil der weiteren Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten
und
- e) in fester Form, in einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 μm, insbesondere
50 bis 800 μm,
speziell 150 bis 600 μm,
und rieselfähig
vorliegen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsweise
der Erfindung ist das rieselfähige
D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltende Tierfuttermittel-Additiv auf Fermentationsbrühe-Basis
dadurch gekennzeichnet, daß es
zusätzlich,
in fester Form, einen Anteil an chloridhaltigen Bestandteilen in
einer Konzentration < 2
mg pro g Additiv und insbesondere < 1,5
mg pro g Additiv enthält.
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Die
Additive liegen im allgemeinen je nach Anforderung in kompaktierter,
granulierter, feinkörniger, aber
in jedem Fall in rieselfähiger
Form vor und enthalten unterschiedliche Anteile an Biomasse. Die
Schüttdichte
liegt bei 200 bis 800 kg/m3, insbesondere
bei ca. 400–700
kg/m3. Die Additive sind gut rieselfähig und lagerstabil.
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Wird
die Biomasse abgetrennt, werden im allgemeinen weitere, zum Beispiel
während
der Fermentation zugesetzte anorganische Feststoffe entfernt. Daneben
enthält
das erfindungsgemäße Additiv
zumindest den überwiegenden
Teil der in der Fermentationsbrühe
gelöst
vorliegenden, weiteren gebildeten oder zugesetzten, insbesondere
organischen Stoffe, soweit sie nicht durch geeignete Verfahren abgetrennt
wurden.
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Zu
diesen Stoffen gehören
organische Nebenprodukte, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen
neben der D-Pantothensäure
erzeugt und aus geschieden werden. Dazu zählen L-Aminosäuren, aus
der Gruppe L-Methionin, L-Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Alanin oder L-Tryptophan,
insbesondere L-Valin. Dazu gehören
weiterhin organische Säuren,
die eine bis drei Carboxylgruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Apfelsäure oder
Fumarsäure.
Schließlich
gehören
dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose. Diese Verbindungen
sind insofern gegebenenfalls erwünscht,
als sie die nutritive Wertigkeit des Additivs verbessern.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, dadurch gekennzeichnet,
daß
- a) die Chloridionen-Konzentration im Produktionsfermenter < 300 mg/l ist,
- b) man aus einer durch Fermentation gewonnenen D-Pantothensäure-haltigen
Fermentationsbrühe,
gegebenenfalls vollständig
oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der weiteren Bestandteile
abtrennt,
- c) man die so erhaltene Lösung
bzw. Brühe
gegebenenfalls mit dem Hydroxid oder Oxid eines Erdalkali- oder
Alkalimetalls versetzt,
- d) man das gemäß a) oder
b) erhaltene Gemisch gegebenenfalls auf konzentriert und
- e) man es auf geeignete Weise trocknet und
- f) man durch geeignete Maßnahmen
ein rieselfähiges
D-Pantothensäure
und/oder deren Salze in einer Menge von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse)
enthaltendes Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung
von 200 bis 2000 μm
gewinnt.
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Bevorzugt
ist das Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden
Futtermittel-Additiven, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) aus einer durch Fermentation gewonnenen
D-Pantothensäure-haltigen
Fermentationsbrühe,
gegebenenfalls vollständig
oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Bestandteile
abtrennt,
- b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert und
- c) das Ammoniumpantothenat enthaltende Futtermittel-Additiv
durch geeignete Maßnahmen
in eine rieselfähige
Form überführt und
- d) durch geeignete Maßnahmen
ein rieselfähiges
Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 μm gewinnt.
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Bevorzugt
ist auch das Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel-Additiven
mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen ausgewählt
aus der Gruppe Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Magnesium- oder Calciumsalz
im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet
durch die Schritte
- a) gegebenenfalls Entfernen
von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
- b) Entfernen der während
der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100%,
- c) gegebenenfalls Zusatz von einem oder mehreren Hydroxiden
oder Oxiden eines Erdalkali- oder Alkalimetalls zu den gemäß a) und
b) erhaltenen Fermentationsbrühen,
wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, daß deren
Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel-Additiv im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%
liegt, und
- d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten
Pulver- oder bevorzugt Granulatform.
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Man
gewinnt das erfindungsgemäße Tierfuttermittel-Additiv aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls
nach Zusatz von D-Pantothensäure
und/oder deren Salzen und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen
oder anorganischen Hilfsstoffen durch
- a) Trocknen
und Kompaktieren oder
- b) Sprühtrocknen
oder
- c) Sprühtrocknen
und Granulieren oder
- d) Sprühtrocknen
und Aufbaugranulieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt man eine D-Pantothensäure und/oder
deren Salze enthaltende Fermentationsbrühe her, bei der
- a) die Fermentation in einem im wesentlichen chloridfreien Medium
abläuft,
- b) man die erhaltene Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach Abtrennung
der Biomasse und Aufkonzentrierung, trocknet, kompaktiert, sprühtrocknet,
sprühgranuliert
oder granuliert oder auf einen Träger aufzieht oder in eine stabilisierende
Matrix einbettet.
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Geeignet
für das
erfindungsgemäße Verfahren
sind Fermentationsbrühen,
die unter Verwendung von zur Produktion von D-Pantothensäure geeigneten
Mikroorganismen gewonnen werden und D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthalten.
Bei den Salzen handelt es sich im allgemeinen um das Natrium-, Kalium-,
Ammonium-, Magnesium- oder Calciumsalz.
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Bei
den Mikroorganismen kann es sich um Pilze oder Hefen, wie zum Beispiel
Debaromyces castellii, oder Gram-positive Bakterien zum Beispiel
der Gattung Corynebacterium oder Gram-negative Bakterien, wie zum
Beispiel die der Familie Enterobacteriaceae, handeln. Bei der Familie
der Enterbacteriaceae ist besonders die Gattung Escherichia mit
der Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia
coli sind die sogenannten K-12-Stämme wie zum Beispiel die Stämme MG1655
oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular
and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia
coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan)
und davon abgeleitete Mutanten zu nennen. Unter den aus IFO3547
hergestellten Stämmen
zeichnen sich wiederum FV5069/pFV31 (EP-A-0 590 857) und FV5069/pFV202
(WO 97/10340) aus. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere
die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen.
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Die
oben beschriebenen Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich
im Batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im Fed-Batch-Verfahren
(Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der D-Pantothensäure-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muß in
geeigneter Weise den Ansprüchen
der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Das Fermentationsmedium
ist im wesentlichen frei von chloridhaltigen Bestandteilen. Erfindungsgemäß beträgt die Chloridionen-Konzentration
im Produktionsfermenter < 300
mg/l, vorzugsweise < 200
mg/l und ganz besonders bevorzugt < 150
mg/l. Als Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln
oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische
stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen
Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen
enthalten wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die
für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich
können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu
den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
Vorstufen der D-Pantothensäure
wie Aspartat, β-Alanin,
Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure
oder Pantoinsäure
und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
Kontrolle des pH-Wertes werden Ammoniak oder Ammoniakwasser oder
andere basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid
oder Calciumhydroxid eingesetzt. Werden saure Verbindungen zur Kontrolle
des pH-Werts benötigt,
so können
zweckmäßigerweise
Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
eingesetzt werden. Zur direkten Darstellung des Calciumsalzes der
Pantothensäure
setzt man während
der Fermentation Calciumhydroxid in Form einer wäßrigen Suspension ein. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie zum
Beispiel Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
werden dem Medium gegebenenfalls geeignete selektiv wirkende Stoffe,
zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden
Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie zum Beispiel
Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt
normalerweise bei 20°C
bis 45°C
und vorzugsweise bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich die Maximalmenge an
D-Pantothensäure
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht.
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Die
so erhaltenen Fermentationsbrühen
haben üblicherweise
eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-% und enthalten 2 bis 20 Gew.-%
D-Pantothensäure.
Besonders vorteilhaft sind solche Fermentationsverfahren, bei denen
die D-Pantothensäure
zu mindestens 20 Gew.-% in der Trockenmasse nach Beendigung der
Fermentation vorliegt. Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation
zumindest am Ende, vorteilhaft jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer
zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, daß während dieser Zeit die Konzentration
an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≥ 0 bis 3 g/l
gehalten bzw. abgesenkt wird.
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Zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Additive
werden die D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise
zunächst
durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel Zentrifugation,
Filtration, Dekantieren oder eine Kombination hieraus vollständig oder
zum Teil von der Biomasse befreit. Es ist erfindungsgemäß jedoch
auch möglich,
die Biomasse gänzlich
in der Fermentationsbrühe
zu belassen. Anschließend
wird die auf diese Weise erhaltene Suspension vorzugsweise auf maximal 60
Gew.-% Trockenmasse aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe
eines Sprühtrockners
oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet.
Anschließend
wird dieses Pulver durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren
in ein gröberkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt. Vorteilhaft bei der Granulation
oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen
Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern
wie Stärke,
Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise
in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder
Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie
zum Beispiel Kieselsäuren,
Silikaten oder Stearaten.
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Alternativ
kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung
bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate,
Schrote, Kleien, Mehle, Stärken,
Zucker oder dergleichen aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert
werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur
(Die Mühle
+ Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
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Die
erfindungsgemäßen neuen
D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltenden festen Produkte, die man nach
dem oben beschriebenen Verfahren herstellen kann, enthalten 20–80 Gew.-%
und vorzugsweise 30–75
Gew.-% D-Pantothensäure. Sie
enthalten im allgemeinen anorganische Bestandteile in einer Menge
von 2,5–25
Gew.-% und gegebenenfalls organische Nebenprodukte in einer Menge
von > 0 bis 30 Gew.-%.
Der Gehalt an Biotrockenmasse beläuft sich auf ≥ 0 bis 35
Gew.-%. Der Wassergehalt ist bevorzugt < 5 Gew.-%.
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Die
erfindungsgemäßen neuen
D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltenden Produkte, die man nach den oben
beschriebenen Verfahren herstellt, zeichnen sich durch eine Korngrößenverteilung
von 20 μm
bis 2000 μm,
vorzugsweise 50 μm
bis 800 μm
und besonders bevorzugt 150 μm
bis 600 μm
aus. Der Feinststaubanteil (< 10 μm) liegt
bei ca. 0 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bevorzugt bei ca. 0 Gew.-% bis 5
Gew.-%. Das Produkt wird als Futtermittel-Additiv eingesetzt.
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Die
Konzentration an D-Pantothensäure
kann mit bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60,
515–560
(1992)) bestimmt werden.
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Die
Korngrößenverteilung
kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die
entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung
in der Laborpraxis" von
R. H. Müller
und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart
(1996), oder im Lehrbuch „Introduction
to Particle Technology" von
M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons
(1998), beschrieben.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert. Zu diesem
Zweck wurden Versuche mit dem D-Pantothensäure produzierenden Stamm Escherichia
coli 5069/pFV31 durchgeführt,
der als FERM-BP 4395 gemäß Budapester
Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science and Technology in 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Japan),
hinterlegt ist (EP-A-0590857).
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Die
Messungen wurden an einem Laserbeugungsspektrometer vom Typ Cilas
920 der Firma Quanto Chrome (Odelzhausen, Deutschland) durchgeführt. Die
Auswertung der Meßergebnisse
erfolgte nach der Vorschrift der Deutschen Industrienorm DIN 66141
zur Darstellung der Korngrößenverteilung.
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Beispiel 1
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Herstellung des Calciumsalzes
der D-Pantothensäure
in einer Fermentationsbrühe
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1. Herstellung von Inokulum
(master cell bank)
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Eine
Probe von Escherichia coli FV5069/pFV31 wurde auf LBG-Agar ausgestrichen,
der mit 50 μg
pro ml Ampicillin supplementiert worden war. Diese Agarplatten-Kultur
wurde 17 Stunden bei 37°C
inkubiert und dann im Kühlschrank
bei +4°C
aufbewahrt. Ausgewählte
Einzelkolonien wurden anschließend
in LBG-Bouillion weiter vermehrt. LBG-Bouillion hat folgende Zusammensetzung:
10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 1 g/l Glucose.
LBG-Agar enthält
zusätzlich
12 g/l Agar. Vorgefertigte Zubereitungen können von der Firma Gibco/BRL
(Paisley, Schottland, Großbritanien)
als LB Broth Base oder LB-Agar bezogen werden. Nach Zusatz von 1
g/l Glucose erhält
man dann die angegebenen Medien. Kulturen von 10 ml, die in 100
ml Erlenmeyerkolben enthalten waren, wurden 16 Stunden bei 37°C und 180
U/min auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz)
inkubiert. Im Anschluß wurde
die Zellsuspension auf einer Zentrifuge vom Typ J-6B der Firma Beckmann
(Hannover, Deutschland) 15 Minuten bei 4000 U/min abzentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 10 ml LBG-Medium, das mit 20% Glycerin supplementiert
worden war, resuspendiert, in 10 Aliquots je 1 ml unter sterilen
Bedingungen abgefüllt
und bei –70°C eingefroren.
Diese Kulturen wurden als „master"-Zellbank (master cell bank) verwendet.
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Für die Herstellung
einer Arbeitszellbank (working cell bank) wurde LBG-Medium, das
mit 50 μg/ml Ampicillin
supplementiert worden war, in 10-ml-Portionen auf 100-ml-Erlenmeyerkolben
verteilt und anschließend
mit 100 μl
der oben beschriebenen „master"-Zellbank beimpft.
Die Inkubation erfolgte über
einen Zeitraum von 16 Stunden bei 37°C und 180 U/min auf einem ESR-Inkubator
der Firma Kühner
AG (Birsfelden, Schweiz).
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Nach
der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der Kultursuspension
mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland)
bei einer Meßwellenlänge von
660 nm bestimmt. Sie betrug 3,5. Anschließend wurde die Zellsuspension
in sterilen 30-ml-Polyethylenröhrchen
der Firma Greiner (Frickenhausen, Deutschland) unter sterilen Bedingungen
abgefüllt
und bei 2500 U/min 15 Minuten mit einer Zentrifuge vom Typ J-6B
der Firma Beckmann (Hannover, Deutschland) abzentrifugiert. Die
abgetrennte Biomasse wurde in 10 ml LBG-Medium, das mit 20% Glycerin
supplementiert worden war, resuspendiert. Im Anschluß wurde die
Zellsuspension in 500-μl-Portionen in 1 ml
sterilen Röhrchen
der Firma Nalgene (New York, U.S.A.) unter sterilen Bedingungen
abgefüllt
und bei –70°C eingefroren.
Die auf diese Weise hergestellten Konserven wurden als Arbeitszellbank
(working cell bank) verwendet.
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2. Herstellung
einer Calcium-D-pantothenat-haltigen Fermentationsbrühe
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Zur
Herstellung einer Calcium-D-pantothenat-haltigen Fermentationsbrühe wurde
die Arbeitszellbank zunächst
in einer Schüttelkolbenkultur
vermehrt und diese zur Beimpfung eines Vorfermenters verwendet.
Die Kultur des Vorfermenters wurde zur Beimpfung des Produktionsfermenters
verwendet.
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Für die Schüttelkolbenkultur
wurde das SKA-Medium verwendet (Tabelle 1). Dieses SKA-Medium wurde
folgendermaßen
zubereitet: In einem 1-l-Becherglas wurden 7,0 g (NH4)2SO4, 0,5 g KH2PO4, 1,0 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4·7H2O, 0,01 g MnSO4·H2O, 0,001 g ZnSO4·7H2O, 0,005 g Fe2(SO4)3 und 20 g Maisquellwasser abgewogen,
das zuvor mit 25%iger Ammoniaklösung
auf pH 6,8 eingestellt worden war, und anschließend mit destilliertem Wasser
auf 825 g aufgefüllt.
Diese Maisquellwasser-haltige Salzlösung wurde im Autoklaven 20 Minuten
bei 121°C
sterilisiert. Weiterhin wurde eine Lösung aus 25 g Glucose und 0,002
g Thiamin·HCl
mit destilliertem Wasser auf 125 g aufgefüllt und durch Filtration sterilisiert.
10 g CaCO3 wurden in einem 100-ml-Kolben
abgewogen und im Autoklaven 20 Minuten bei 123°C sterilisiert. Durch Vereinigung
der beiden oben genannten Komponenten mit der Maisquellwasser-haltigen
Salzlösung
wurde das Medium SKA erhalten.
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Dieses
Medium SKA wurde in 12,5-ml-Portionen auf 100-ml-Erlenmeyerkolben verteilt und anschließend mit
0,5 ml einer Zellsuspension beimpft. Als Zellsuspension wurde eine
mit steriler physiologischer Kochsalzlösung 1:100 verdünnte Konserve
der Arbeitszellkultur verwendet. Die Inkubation erfolgte über einen
Zeitraum von 20 Stunden bei 32°C
und 150 U/min auf einem RC-1-TK-Inkubator
der Firma Infors AG (Bottmingen, Schweiz). Die im Anschluß daran
bestimmte optische Dichte bei einer Meßwellenlänge von 660 nm (OD 660) betrug
12,5.
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Zur
Inokulierung von 20 kg des Vorkulturmediums A1-102, das in einem
42-l-Rührreaktorfermenter
der Firma Bioengineering (Wald, Schweiz, Modell LP-42) enthalten
war, wurden 0,5 ml des SKA-Mediums 1:100 verdünnt und 50 ml dieser Suspension
in den Fermenter zugegeben. Das Vorkulturmedium A1-102 enthielt
die in Tabelle 2 aufgeführten
Bestandteile. Die Kultur wurde 15,5 Stunden bei einer Temperatur
von 37°C,
einer volumenspezifischen Belüftung
von 0,5 Volumen/Volumen/Minute (vvm), einem Sauerstoffpartialdruck
von 20% der Luftsättigung
und einem pH von 6,5 bis zum Erreichen einer OD 660 von 11,3 kultiviert.
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Zur
Inokulierung von 5830 g des Hauptkulturmediums M1-380, das in 14-l-Rührreaktorfermentern
der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat
E/ED) enthalten war, wurden 423 ml der zweiten Vorkultur in Medium
A1-102 zugegeben. Das Hauptkulturmedium M1-380 enthielt die in Tabelle
3 aufgeführten Bestandteile.
Die Kultur wurde zunächst
6,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer volumenspezifischen
Belüftung
von 0,75 vvm, einer minimalen Rührung
von 400 U/min und einem pH von 6,5 bis zum Erreichen einer OD 660
von 18,6 und einem Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung
kultiviert. Die Kultur wurde anschließend weitere 41 Stunden bei
einer Temperatur von 37°C,
einem Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung und einem pH-Wert von
6,0 bis zum Erreichen einer OD 660 von 66,8 kultiviert. Nach einer Fermentationszeit
von 13 Stunden wurde β-Alanin
in einer Konzentration von 152,7 g in 570 ml H2O über einen Zeitraum
von 34,5 Stunden zugefüttert.
Nach einer Fermentationszeit von 21,5 Stunden wurde eine zehnprozentige
Ca(OH)2-Lösung über einen Zeitraum von 26 Stunden
zur pH-Statisierung zudosiert. 3,43 kg des Mediums M2-257 mit einer
Glucose-Konzentration von 650,8 g/l und einer Thiamin·HCl-Konzentration
von 35,7 mg/l wurde innerhalb von 41 Stunden zugefüttert.
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Anschließend wurden
die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W
der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von
660 nm und die Konzentration an gebildeter D-Pantothensäure mittels
HPLC (Hypersil APS2 5 μm,
250 × 5
mm, RI-Detektion) bestimmt.
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In
der Fermentationsendprobe wurde nach 70,0 Stunden eine Calcium-D-pantothenat-Konzentration von
49,7 g/l, gemessen als D-Pantothensäure, festgestellt.
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Der
Gehalt an D-Pantothensäure
wurde mit Hilfe einer HPLC-Anlage (HPLC = Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie)
vom Typ M321 der Firma Knauer (Berlin, Deutschland) mittels RI-Detektion
(Brechungsindex-Detektion)
unter Verwendung einer Hypersil-APS2-Aminophase mit einer Korngröße von 5 μm bestimmt.
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Tabelle
1 Zusammensetzung
des Mediums SKA
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Tabelle
2 Zusammensetzung
des Mediums A1-102
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Tabelle
3 Zusammensetzung
des Mediums M1-380
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Beispiel 2
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Herstellung von feinteiligem
Calcium-D-pantothenat aus Fermentationsbrühe
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Aus
einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen
Fermentationsbrühe,
die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt worden war und
etwa 4,9 Gew.-% D-Pantothensäure
enthielt, wurde zunächst
die Biomasse abgetrennt. Hierzu wurden 90 l der oben genannten Fermentationsbrühe durch
Querstromfiltration mit einer 0,22-μm-Mikrofiltrationsmembran in einer Filtrationsanlage
CERAFLO MSP005756 der Firma Millipore (Bad Homburg, Deutschland)
abfiltriert.
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Anschließend wurde
die so behandelte Brühe
dann unter Vakuum bei 40–80°C in einem
Rotationsverdampfer (Rotavapor R-152 der Firma Büchi, Schweiz) auf einen Flüssigkeitsanteil
von etwa 30% Trockengehalt eingeengt. Die so eingeengte Brühe wurde
anschließend
zur Darstellung des Calciumsalzes der D-Pantothensäure sprühgetrocknet.
Hierzu wurde ein Technikumssprühtrockner
der Firma Niro (Kopenhagen, Dänemark)
vom Typ NIRO Minor mit Zerstäuberscheibe
(120 mm Durchmesser; 135 m/s Umlaufgeschwindigkeit) bei einer Eingangstemperatur
von 175°C,
einer Ausgangstemperatur von 80°C
und einem Trocknungsgasdurchsatz von 525 m3/h
eingesetzt. Zum besseren Produktaustrag wurde dem Trocknungsgasstrom
Sipernat 22 der Firma Degussa-Hüls
AG (Frankfurt am Main, Deutschland) als Pulverhilfsmittel in einem
Verhältnis
von 5 Gew.-%, bezogen auf Trockenmasse des Konzentrats, zugesetzt.
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Das
so hergestellte Calcium-D-pantothenat-haltige Produkt besaß einen
D-Pantothensäure-Gehalt von
48,5 Gew.-%, war rieselfähig
und hatte eine Schüttdichte
von 460 kg/m3 bei einer mittleren Korngröße von 34 μm.
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Beispiel 3
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Herstellung von D-Calcium-pantothenat
mit einer Korngröße > 100 μm durch Kompaktierung
im Walzenkompaktierer und Siebung
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Ein
Calcium-D-pantothensäure-haltiges
staubförmiges
Produkt, das nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt worden
war und etwa 48,5 Gew.-% D-Pantothensäure enthielt
und eine mittlere Korngröße von 34 μm hatte,
wurde mit einem Walzenkompaktor mit Zigarrenwalzen (Pharmapaktor
der Firma BEPEX vom Typ L200/50 P) mit einer Preßkraft von 40–90 Newton
kompaktiert. Die Drehzahl der Walzen betrug hierbei 10 Umdrehungen
pro Minute. Das so auf diese Weise hergestellte Kompaktat wurde
anschließend
in Zerkleinersieben auf eine Korngrößenverteilung von 200 bis 400 μm gebrochen.
Die Ausbeute in den einzelnen Kornfraktionen ist in Tabelle 5 zusammengefaßt.
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Das
Kompaktat zeichnete sich durch einen deutlich geringeren Feinstaubanteil
und ein wesentlich verbessertes Fließverhalten im Vergleich zum
pulverförmigen
Ausgangsprodukt aus.
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Die
Fraktion „Mittlere
Korngröße" wurde durch Siebung
isoliert und stellt das Produkt dar. Das auf diese Weise hergestellte
Produkt hatte einen Gehalt von ca. 40,7 Gew.-%, gemessen als D-Pantothensäure, und besaß eine Schüttdichte
von 630 kg/m3.
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Beispiel 4
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Herstellung von D-Calcium-pantothenat
mit einer mittleren Korngröße von 200
bis 400 μm
durch Aufbaugranulierung im Wirbelschichtgranulator
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4.1 Verwendung von Wasser
als Granulationsbindemittel
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Calcium-D-pantothensäure-haltiges
pulverförmiges
Produkt, welches nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren
durch Sprühtrocknung
aus einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen
Fermentationslösung
hergestellt worden war, wurde anschließend durch Aufsprühen einer
bestimmten Menge Wasser in einem Wirbelschichtgranulator weiter
verarbeitet.
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Hierzu
wurden 300 g des nach Beispiel 2 hergestellten staubförmigen Calcium-D-pantothensäure-haltigen
Produkts in einer Laborwirbelschichtanlage der Firma Aeromatics
Niro (Kopenhagen, Dänemark)
vorgelegt. Bei einer Wirbelschichttemperatur von 50°C und einer
Abgastemperatur von 30°C
wurde über
eine Düsenvorrichtung
3 g Wasser pro Minute eingesprüht.
Die Wirbelgastemperatur lag bei 70–80°C. Die Korngrößenverteilung
des auf diese Weise hergestellten Produkts ist in Tabelle 6 dargestellt.
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Der
bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 38,1 Gew.-%. Das
Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug 310 kg/m3. Das Produkt war sehr gut rieselfähig.
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4.2 Verwendung eines Calciumpantothenat-haltigen
Konzentrats als Granulationsbindemittel
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Ein
Calcium-D-pantothensäure-haltiges
pulverförmiges
Produkt, welches nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren
durch Sprühtrocknung
aus einer Calcium-D-Pantothensäure-haltigen
Fermentationslösung
hergestellt worden war, wurde in einem anderen Versuch durch Aufsprühen einer
bestimmten Menge an konzentrierter Lösung an Calcium-D-pantothenat
mit einem Trockenmassengehalt von etwa 50 Gew.-% in einem Wirbelschichtgranulator
weiter verarbeitet.
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Hierzu
wurden 1000 g des nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren
hergestellten staubförmigen
Calcium-D-Pantothensäure-haltigen
Produkts in einer diskontinuierlich arbeitenden Laborwirbelschichtanlage der
Firma Glatt (Binzen, Deutschland) vorgelegt. Bei einer Wirbelschichttemperatur
von ca. 40–45°C und einer
Zulufttemperatur von ca. 80°C
wurden über
eine Düsenvorrichtung
ca. 5 g des oben beschriebenen Konzentrats pro Minute in die Laborwirbelschichtanlage
eingesprüht.
Die Korngrößenverteilung
des auf diese Weise hergestellten Produkts ist in Tabelle 7 dargestellt.
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Der
bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 38,9 Gew.-%. Das
Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug 400 kg/m3.
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Nach
dem hier beschriebenen oder einem anderen Sprüh-, Fließbett-, Rühr- oder Mischverfahren wird das
D-Calcium-pantothenat-haltige
oder D-Pantothensäure-haltige Konzentrat
auf andere übliche
organische oder anorganische Träger-
oder Hilfsstoffe wie Kieselsäuren,
Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder dergleichen
gesprüht
und gegebenenfalls unter Einsatz von Binde-, Gelier- oder anderen
Formulierungshilfsmitteln granuliert.
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Beispiel 5
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Herstellung von D-Calcium-pantothenat
mit einer mittleren Korngröße von 100
bis 400 μm
durch Mischen und Granulierung in einem Vakuumtrockner
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Aus
einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen
Fermentationsbrühe,
die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt worden war und
etwa 4,9 Gew.-% D-Pantothensäure
enthielt, wurde zunächst
die Biomasse abgetrennt. Hierzu wurden 90 l der oben genannten Fermentationsbrühe durch
Querstromfiltration mit einer 0,22-μm-Mikrofiltrationsmembran in einer Filtrationsanlage
CERAFLO MSP005756 der Firma Millipore (Bad Homburg, Deutschland)
abfiltriert.
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Anschließend wurde
die so behandelte Brühe
dann unter Vakuum bei 40–80°C in einem
Rotationsverdampfer (Rotavapor R-152 der Firma Büchi, Schweiz) auf einen Flüssigkeitsanteil
von etwa 50 Gew.-% Trockengehalt eingeengt. Das so hergestellte
Calcium-D-pantothensäure-haltige
Konzentrat mit einem D-Pantothensäure-Gehalt von 28,8 Gew.-% wurde dann zur
Bildung eines freifließenden
Granulats mit Hilfe eines Vakuumtrockners (Typ VT130, Gebrüder Lödige Maschinenbau
GmbH, Paderborn, Deutschland) mit einer Kieselsäure (Sipernat 22 der Firma
Degussa-Hüls
AG, Frankfurt, Deutschland) vermischt. Zunächst wurden 15 kg der Kieselsäure (Sipernat
22 der Firma Degussa-Hüls
AG, Frankfurt, Deutschland) im Vakuumtrockner (Typ VT130, Gebrüder Lödige Maschinenbau
GmbH, Deutschland) vorgelegt und dann 39,0 kg des oben hergestellten
Calcium-D-pantothensäure-haltigen
Konzentrats mit einer Rate von 2,0 kg pro Minute unter einem Vakuum
von 200 mbar zugegeben, wobei das zu vermischende Material eine
Temperatur von 45°C
aufwies und die Rührerleistung
120 U/min (Umdrehungen pro Minute) betrug. Dann wurde unter Erhöhung des
Vakuums auf 50 mbar noch 15 Minuten weitergemischt. Das so hergestellte
Calcium-D-pantothensäure-haltige
Granulat wurde dann in einem Vibrationswirbelschichttrockner (Escher-Wyss,
Linden, Deutschland) mit einer Wirbelschichtoberfläche von
0,3 m2 bei einer Schichttemperatur von 65°C und einem
Trocknungsgasdurchsatz von 270 Nm3/Stunde auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt
von weniger als 2 Gew.-% getrocknet. Die mittlere Korngrößenverteilung
des Produkts ist in Tabelle 8 dargestellt.
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Der
bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 32,6 Gew.-%. Das
Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug nach der Trocknung
650 kg/m3.
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Nach
dem hier beschriebenen oder einem anderen Sprüh-, Fließbett-, Rühr- oder Mischverfahren kann
das D-Calcium-pantothenat-haltige
oder D-Pantothensäure-haltige Konzentrat
auf andere übliche
organische oder anorganische Träger-
oder Hilfsstoffe wie Kieselsäuren,
Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder dergleichen
gesprüht
und gegebenenfalls unter Einsatz von Binde-, Gelier- oder anderen
Formulierungshilfsmitteln granuliert werden.