ES2270152T3 - Isomeros posicionales del interferon alfa 2a pegilado. - Google Patents
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Abstract
Los isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado seleccionado de PEG-Lys(31), PEG-Lys(134), en donde el peso medio molecular de la porción de polietilenglicol (porción PEG) en dicho interferón pegilado es de 26.000 daltons a 66.000 daltons, especialmente de alrededor 40.000 daltons.
Description
Isómeros posicionales del interferón alfa 2a
pegilado.
La invención se refiere a isómeros posicionales
del interferón alfa 2a monopegilado, con un método para su
aislamiento y para su uso en la fabricación de medicamentos para el
tratamiento de enfermedades, especialmente para el tratamiento de
enfermedades virales.
El interferón alfa 2a juega un papel importante
para el tratamiento de la hepatitis C crónica, pero se limita en
esta eficacia por la vida media in vivo corta. Para mejorar
la vida media y eficacia del interferón alfa 2a se conjugó con una
porción de polietilenglicol. La pegilación cambia las propiedades
biológicas y fisicoquímicas de la proteína. Un efecto es el
incremento de la degradación proteolítica y el aclaramiento renal.
Este aumenta la vida media de la proteína pegilada en sangre. Otro
efecto es la distribución alterada en el cuerpo, dependiendo del
tamaño de la porción de PEG de la proteína. El interferón alfa 2a
pegilado con una porción de polietilenglicol grande (porción de
PEG) como una porción de polietilenglicol ramificada de 40 kDa.
en donde R y R' son
independientemente alquilo IFNerior; n y n' son enteros que tienen
una suma a partir de 600 a 1500; y la media del peso molecular de
las unidades de polietilenglicol en dicho conjugado es de alrededor
de 26,000 daltons a alrededor de 66,000
daltons;
tiene una actividad biológica mejorada y muestra
una absorción sostenida y un aclaramiento renal reducido,
resultando una fuerte presión antiviral partir de una a una
dosificación diaria, ver Perry M. C., et al. Drugs, 2001,
15, 2263-2288 y Lamb M. W., et al.
The Annals of Pharmacotherapy. 2002, 36,
933-938.
Véase también Monkarsh et al. Analytical
Biochemistry, 1997, 247, 434-440 (Positional Isomers
of Monopegylated interferon \alpha-2a) y Bailon
et al. Bioconjugate Chemistry, 2001, 12,
195-202 (Rational Design of a potent,
long-lasting form of interferon).
El método para la pegilación del interferón
alfa-2a se describe en la PE A 809 996. Desde que
esta pegilación se realiza por reacción de PEG2-NHS
de fórmula
con grupos de amina primaria como
por ejemplo lisina o el N-terminal del interferón
alfa una o más porciones de PEG pueden unirse y formar una mezcla
de interferones no pegilados, mono- y
múltiple-pegilados. El interferón alfa monopegilado
se puede aislar de una mezcla por métodos conocidos en la materia.
Además, desde que la molécula del interferón
alfa-2a muestra 12 sitios para la pegilación (11
lisinas y el N-terminal) es una mezcla de isómeros
posicionales. A partir de estos posibles doce isómeros, nueve se
aislaron y se caracterizaron, cada uno de éstos se conjugará a la
cadena de polietilenglicol ramificada a una lisina específica,
particularmente,
a Lys(31) para formar el interferón alfa
2a pegilado a Lys(31) [referido a como
PEG-Lys(31)],
a Lys(49) para formar el interferón alfa
2a pegilado a Lys(49) [referido como a
PEG-Lys(49)],
a Lys(70) para formar el interferón alfa
2a pegilado a Lys(70) [referido como a
PEG-Lys(70)],
a Lys(83) para formar el interferón alfa
2a pegilado a Lys(83) [referido como a
PEG-Lys(83)],
a Lys(112) para formar el interferón alfa
2a pegilado a Lys(112) [referido como a
PEG-Lys(112)],
a Lys(121) para formar interferón alfa 2a
pegilado a Lys(121) [referido como a
PEG-Lys(121)],
a Lys(131) para formar interferón alfa 2a
pegilado a Lys(131) [referido como a
PEG-Lys(131)],
a Lys(134) para formar interferón alfa 2a
pegilado a Lys(134) [referido como a
PEG-Lys(134)],
a Lys(164) para formar interferón alfa 2a
pegilado a Lys(164) [referido como a
PEG-Lys(164)].
Se ha encontrado que las
PEG-Lys(31) y
PEG-Lys(134) tienen actividades mayores en un
ensayo antiviral que en la mezcla, la actividad de
PEG-Lys(164) era igual a la mezcla, mientras
que las actividades de PEG-Lys(49),
PEG-Lys(70),
PEG-Lys(83),
PEG-Lys(112),
PEG-Lys(121) y
PEG-Lys(131) fueron inferiores.
La invención así se refiere a isómeros
posicionales nuevos del interferón pegilado alfa 2a, particularmente
con PEG-Lys(31) y
PEG-Lys(134), caracterizado en que la media
del peso molecular de la porción del polietilenglicol (porción de
PEG) en dicho interferón pegilado es de 26,000 daltons a 66,000
daltons, especialmente de alrededor de 40000 daltons.
Se ha desarrollado un método de cromatografía
para la separación de los isómeros posicionales del interferón
pegilado alfa 2a basado en las diferencias de cargas locales. Este
método consiste en dos pasos de separación por cromatografía de
intercambio iónico.
En una realización posterior la invención
concierne con un método para el aislamiento de los isómeros
posicionales de interferón alfa 2a Lys-pegilado que
consiste en
a) la separación de los isómeros posicionales
sobre una columna de cromatografía líquida preparatoria con una
matriz de intercambio catiónico débil; y
b) la separación posterior y purificación de las
fracciones del primer paso sobre una columna preparativa,
preferiblemente una columna HPLC con una matriz de intercambio
catiónico fuerte, en donde el peso molecular medio de la fracción
de polietilenglicol (fracción PEG) en dicho interferón pegilado es
de 26.000 daltons a 66.000 daltons.
El paso de separación a) sobre la matriz de
intercambio catiónico débil se condujo aplicando un gradiente de pH
lineal de alrededor de pH 3,8 a pH 8.0.
La separación del paso b) se condujo con un
gradiente de pH lineal de un tampón (A) de acetato de sodio a un
tampón (B) de fosfato de potasio partiendo de un pH inicial 4.2 a
alrededor de 4.6, preferiblemente de alrededor pH 4,4, a un pH
final pH de alrededor de 6.4 a alrededor 6.8, preferiblemente de pH
6,6, dichas soluciones tampón que contienen además más de 12% de
etanol y más de 1.5% dietilenglicol, preferiblemente 10% de etanol
y 1% dietilenglicol.
La elución de los isómeros pueden influenciarse
por la concentración inicial de solución tampón. La concentración
del tampón solución es de alrededor de 3 mM a alrededor de 15 mM de
acetato de sodio, preferiblemente de alrededor 3 a 7 mM, idealmente
de 3,4 mM o 6.8 mM.
La separación del paso b) es llevada a
temperatura ambiente o a una temperatura en el rango de alrededor de
27°C a alrededor de 35°C, preferiblemente a una temperatura de
alrededor de 30 a 32°C.
Este método puede también ser usado
analíticamente para, el análisis de la composición de los isómeros
de posiciona les obtenidos en la reacción de pegilación del
interferón alfa 2a.
Las muestras de proteína resultantes se
recogieron y analizaron por una variedad de métodos químicos de
proteínas como mapeo peptídico de espectrometría de masa, mapeo
peptídico cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa
(RP-HPLC), espectro de MALDI-TOF de
proteína indigesta, HPLC de exclusión de tamaño
(SE-HPLC) y SDS-PAGE e
identificado, ver los ejemplos de 2 a 6.
Primero, el peso molecular de cada isómero se
determinó mediante espectrometría de MALDI-TOF para
asegurar que las moléculas alfa 2a del interferón pegiladas seguían
siendo intactas después de la cromatografía IEC
(Cromatografía de Intercambio Iónico) y para
confirmar la monopegilación. Cada pico IEC se midió sin modificación
posterior. El espectro de todas las moléculas mostraron los picos
M^{+} anchos esperados con un máximo a 63 kDa y los picos
M^{2+} correspondientes a 32 kDa y los picos M^{3+} a 21 kDa
(Figura 5).
Segundo, cada isómero se digirió
proteolíticamente usando la proteasa
endo-Lys-C y los mapas peptídicos
MALDI-TOF resultantes se compararon con uno
derivado del estándar de referencia interferón alfa 2a pegilada.
La interpretación del espectro y la
identificación estructural de los isómeros posicionales se basan en
las consideraciones siguientes:
\newpage
1. La dipegilación de los isómeros puede
eliminarse a causa de la determinación del peso molecular de la
molécula entera (ver arriba).
2. La lisina sola de un isómero específico que
tiene el grupo polímero pegilado unido no se reconoce como lisina
mediante la proteína endo-Lys-C (2)
Nuevo England Journal of Medicine 2000, 343,
1666-1172. y, por consiguiente, la cadena
polipeptídica no se divide en la posición específica.
3. Se esperó por consiguiente que el mapa del
péptidico de un isómero específico careciera de los péptidos (y
sólo aquellos péptidos) que se relacionan con estas lisinas
pegiladas solas.
4. No se esperó detectar el pico de masa de los
péptidos que tienen el resido PEG unidos en los mapas peptídicos
MALDI-TOF como la proporción de masa escogida para
la mayoría de las detecciones precisas de las proporciones de
péptidos no pegilados de alrededor de 850 Da a 6000 Da. La porción
de PEG tiene ya un peso molecular de 40.000 Da. Sin embargo, los
péptidos pegilados se han detectado también usando el mismo digesto
y el trans ácido 3-indolacrílico como matriz. Para
cada isómero digerido Lys-C un pico amplio de unos
46 – 47 kDa se observó, confirmando la presencia de péptidos
monopegilados. Debido a la distribución de masa amplia inducida por
el residuo PEG, se puede realizar la identificación no directa de
los péptidos unidos en estos experimentos (datos no
demostrados).
demostrados).
Los mapas peptídicos resultantes se muestran en
la Figura 6. Los picos que se pierden en comparación con el
estándar se indican mediante flechas.
Excepto al espectro de las dos referencias del
interferón alfa-2a y el IFN alfa-2a
pegilado, no se han visto diferencias significantes. Debido al
hecho que el interferón alfa 2a pegilado es una mezcla de isómeros
pegilados diferentes, todos los picos peptídicos detectados para el
interferón se detectaron para el interferón alfa 2a pegilado,
también.
En el espectro de la proteína digerida
endo-Lys-C derivada de la fracción 1
del IEC los péptidos que comprenden los aminoácidos
24-31 y 32-49 se perdieron en la
región entre 850 y 6.000 Da, todos los otros picos están presentes.
Por consiguiente el residuo PEG debería unirse a la Lys 31.
Las otras fracciones se identificaron de la
misma manera. En cada cosa los péptidos pegilados se perdieron en
comparación con el espectro estándar de referencia. Para las
fracciones 3 y 4a sólo un pico peptídico se perdió, para el segundo
péptido 132 – 133 la masa es demasiado pequeña para que se detecte
en la ventana de masa definida. Sólo la fracción 4a no se puede
identificar con este método, no se pueden hacer conclusiones.
Para identificar el isómero 4a, un método
peptídico de mapeo de endo-Lys- C con detección
RP-HPLC/UV se desarrolló. La proteína se digerió
con la endoproteinas Lys-C como se describió para el
mapeo peptídico MALDI-TOF MSS. Se separaron los
péptidos mediante un gradiente de agua/acetonitrilo/TFA (ácido
acético trifluoro).
Con el estándar de referencia del interferón
alfa 2a pegilado, se observaron 13 picos. Todas las fracciones se
recogieron manualmente y se identificaron mediante espectrometría de
masa MALDI-TOF.
La asignación del sitio de pegilación de la
fracción 4a de IEC 4 se hizo comparando el cromatograma de la
muestra de con uno los obtenidos para el material de referencia. El
pico que contiene los dos péptidos 134 - 164 y 134 - 165 se pierde
claramente en el cromatograma de la muestra y por consiguiente la
fracción IEC puede asignarse al isómero que contiene el PEG a Lys
164. Los cromatogramas del estándar de referencia del interferón
alfa 2a pegilado (46 \mug/mL) y una de las fracciones 4a se
muestran en la Figura 7.
Una representación gráfica de los isómeros
posicionales del interferón alfa 2a 9-pegigilado se
aislaron y caracterizaron se dan en la Figura 9.
La actividad antiviral in vitro de los
isómeros aislados se analizaron mediante el efecto protector en
células (MDBK) de riñón bovino Madin-Dargby contra
la Infección por el virus estomatitis vesticular (VSV) y comparado
con el estándar del interferón alfa 2a pegilado de acuerdo con el
procedimiento descrito en J. Virol. 1981, 37,
755-758.
Una realización posterior de la invención se usa
por consiguiente uso de isómeros posicionales del interferón alfa
2a pegilado, pegilado a Lys(31) y Lys(134), para la
preparación de un medicamento para los usos inmunodulatorio,
antiviral y proliferativo. Los isómeros posicionales pueden usarse
posteriormente para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades virales, especialmente para el
tratamiento de la hepatitis C.
La presente invención también comprende
composiciones farmacéuticas en la base de los compuestos de la
fórmula I o sus sales y los métodos para producirlos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención usados en el control o la prevención de enfermedades que
comprenden un isómero posicional del IFN alfa 2a pegilado, o sea
PEG-Lys(31) o
PEG-Lys(134) y uno terapéuticamente inerte,
material de vehículo aceptable terapéuticamente y no tóxico. Las
composiciones farmacéuticas que se usarán pueden formularse y
dosificarse de una manera constante con buena práctica médico
teniendo en consideración la disfunción que se tratará, la
condición del paciente individual, el sitio de liberación del
isómero posicional del IFN alfa 2 a pegilado, el método de
administración y otros factores conocidos a los médicos.
A continuación se describen en más detalle, los
métodos y material usados en ele aislamiento y la caracterización
de los isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado.
El interferon alfa 2a pegilado
(PEG-IFN alfa 2a) usado para el aislamiento de los
isómeros se produjo en Hoffmann-La Roche Inc.
Mediante la conjugación de los grupos lisina
\varepsilon-amino en la superficie de la molécula
de interferón con una actividad unida a la porción del
polietilenglicol de peso molecular de 40.000 Da como se describe en
la PE A 809996 y en Bioconjugado Chem. 2001, 12,
195-202.
La pureza de las muestras durante la preparación
de los isómeros posicionales a partir de cada paso se comprobó
usando una columna de intercambio de catión fuerte analítica
(TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, tamaño de
partícula 10 \mum, diámetro de 7,5 mm, longitud 7,5 cm ). La
columna se pre-equilibró con acetato de sodio 3,4
Mm, 10% etanol y 1% dietilenglicol, ajustado a un p H 4,4 (tampón
A). Después de conducir las muestras de PEG-IFN, la
columna se lavó con tampón A, seguido por un gradiente lineal
ascendiente a 10 mM fosfato potásico dibásico, 10% etanol y 1%
dietilenglicol, ajustado a pH 6,6 (tampón B). La tasa de flujo fue
1,0 mL/min y la detección a 218 nm los resultaron se dieron en la
Figura 1.
En analogía al método descrito anteriormente el
método analítico siguiente se encontró para el análisis de la
composición de los isómeros posicionales obtenidos en la reacción de
pegilación del interferón alfa 2a.
Después de la separación del interferón alfa
monopegilado de la mezcla de reacción por métodos conocidos en la
materia, los isómeros posicionales se separaron por HPLC líquida
analítica (cromatografía líquida de alta presión) método en que una
columna cargada con una matriz de intercambio de catión fuerte como
por ejemplo fase SP-NPR no porosa con un tamaño de
partícula de 2,5 \mum de, TosoH Bioscience. La fase móvil consiste
de un tampón A (10% v/v de etanol; 1% v/v dietilenglicol; 2,3 mM de
acetato de sodio y 5,2 mM de ácido acético en agua purificada; no
se realizó ajuste de pH) y un tampón B (10% v/v en etanol; 1% v/v en
dietilenglicol; 16.4 mM KH_{2}PO_{4}; y 4,4 mM K_{2}HPO_{4}
en agua purificada, no se hizo ajuste de pH), los resultados se
describen en la Figura 8.
Los siguientes ejemplos ilustrarán más la
invención.
Ejemplo
1A
Se usaron unos dos pasos de purificación y
esquema de aislamiento y para preparar las isoformas monopegiladas
del interferón alfa 2a PEG.
a) El primer paso fue una separación de los
isómeros posicionales en una columna de cromatografía líquida de
baja presión preparativa con una matriz de intercambio de catión
débil (TOSOH-BIOSEP, Toyopearl
CM-650S, por ejemplo, lote de resina no. 82. El
diámetro de la columna siendo 16 mm, longitud 120 cm). Un gradiente
de pH lineal de concentración de acetato de sodio aumentando (25
mM, pH sobre 4,0, 75 mM a pH 7,8) se aplicó a una tasa de flujo de
0,7 mL/min. La detección fue a 280 nm. Con este paso cromatográfico
se pudieron recoger las especies 1, 2, 5, 6 y una mezcla de 3, 4,
4a, 7 y 8, ver la tabla 1.
b) Las fracciones se purificaron y separaron
posteriormente en el segundo paso de preparación. Una columna
preparativa con la misma matriz como la columna analítica de
intercambio de catión fuerte (Lote de Resina no. 82A que tiene una
capacidad de intercambio de ión de mayores 123 mEq/ml) como se
describió anteriormente pero dimensiones (30 mm i.d. y 70 mm
longitud), además se usó una tasa de flujo mayor y tiempos de paso
mayores. Como para el método analítico, la columna se preequilibró
con 3,4 mM de acetato de sodio, 10% etanol y 1% dietilenglicol,
ajustado a pH 4,4 (tampón A). Después de cargar las muestras de
PEG-IFN muestras, la columna se lavó con tampón A,
seguido por un gradiente lineal ascendiente a 10 mM de fosfato
potásico dibásico, 10% etanol y 1% dietilenglicol, ajustado a pH
6,6 (tampón B). La tasa de flujo fue 1,0 mL/min y la detección a
218 nm.
La concentración de proteína del isómero del IFN
alfa 2a PEG se determinó por espectofotometría, basado en la
absorción 280 nm de la porción de proteína del interferón alfa 2 a
PEG.
Un perfil de elución analítico de 180 \mug del
IFN alfa 2a PEG se muestra en la Figura 1. El resultado de este
método es una separación en 8 picos, 2 picos con separación basal y
6 con separación parcial. La disminución de la absorción de la
línea basal hacia el fin del cromatograma sugiere que no hay otra
especie monopegilada del IFN alfa 2a eluyendo un tiempo de
retención mayor.
Además, mirando cuidadosamente al cromatograma
de IEC un pico m cerca del límite de detección que es visible entre
los picos 2 y 3 que indicando la presencia de los isómeros
posicionales adicionales que deberían contribuir además a la
actividad específica de la mezcla de IFN del alfa 2 a PEG. Se
esperaron especies adicionales como la molécula del interferón alfa
2a que muestra 12 sitios para la pegilación (11 lisinas y el
N-terminal). Sin embargo, dada la abundancia baja
de estas especies, no se aislaron ni caracterizaron.
Muestras de isómeros derivados de los corridos
de la optimización de IEC se investigaron directamente después del
aislamiento (t=0) y después de dos semanas de almacenamiento a 5°C
(no se muestran los datos). Se observaron diferencias no
significativas para la proteína derivada de los picos IEC con
respecto al contenido de proteína como se determinó mediante
métodos de espectométricos; no hubo ningún cambio que se detectara
en el sitio de pegilación, el contenido del
oligo-IFN alfa 2a PEG, la cantidad de agregados y la
actividad del bioensayo. Teniendo en cuenta la abundancia relativa
de los isómeros individuales como se determinó mediante el método
IEC método como las actividades específicas como se determinó en el
ensayo antiviral la mayoría de la bioactividad específica de la
mezcla del IFN alfa 2a PEG usada para su aislamiento se recuperó
(aproximadamente el
93%).
93%).
La HPLC-IE analítica se usó para
comprobar la pureza de los isómeros individuales con respecto a la
contaminación con otros isómeros deposición en las fracciones de
IEC. Los picos 2, 3, 4, 4a, 5 y 7 tenían más de un 98% los picos 1
y 8 tenían 93% y el pico 6 tenían 88% de pureza.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos PEG se identificaron mediante la
comparación del espectro de Lys-C digerido los
isómeros y del estándar de referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones se caracterizaron mediante los
métodos descritos en los ejemplos de 2 a 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1B
- Equipo HPLC:
- HP1100
- Columna:
- SP-NPR, TosoH Bioscience, Tamaño de partícula: 2,5 \mum, no poroso, Orden#:13076
- Inyección:
- 5-10 \mug IFN monopegilado
\newpage
Tampón
A:
- 10% v/v
- Etanol
- 1% v/v
- Dietilenglicol
- 2,3 mM
- Na-Acetato
- 5,2 mM
- Ácido acético, en agua purificada, no ajuste de pH a
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón
B:
- 10% v/v
- Etanol
- 1% v/v
- Diethilenglicol
- 16,4 mM
- KH_{2}PO_{4}
- 4,4 mM
- K_{2}HPO_{4}, en agua purificada, sin ajuste de pH
\vskip1.000000\baselineskip
Gradiente:
- 0 Min
- 40%B
- 2 Min
- 40%B
- 2.1 Min
- 48%B
- 25 Min
- 6%B
- 27 Min
- 75%B
- 30 Min
- 75%B
- 34 Min
- 40%B
- 40 Min
- 40%B
\vskip1.000000\baselineskip
- Flujo:
- 1,0 mL/min
- Temperatura de Columna:
- 25°C
- Detección:
- 218 nm
Una cromatografía típica se da en la Figura
8.
Ejemplo
2
Se registró el espectro de masa en un
instrumento MALDI-TOF MS (PerSeptive Biosystems
Voyager-DE STR con extracción retardada). Cada
fracción de IEC (Cromatografía de intercambio iónico) se
desaló por diálisis, reducido con 0,02 M de
1,4-ditio-DL-treitol
(DTT) y alquilado con 0.2 M 4-vinil piridina. Luego
las proteínas se digirieron con la endoproteasa
Lys-C (Wako Biochemicals) en 0,25 M Tris
(tris(hidroximetil)-aminoetano a pH 8.5 con
un enzima aproximado a la proporción de proteína de 1:30. La
reacción se llevó a cabo toda la noche a 37ºC.
Una solución de 20 mg/ml de
\alpha-ciano-4-ácido
hidroxicinámico y 12 mg/ml de nitrocelulosa en acetona/isopropanol
40/60 (v/v) se usaron como matriz (aplicación del estrato grueso).
Primero, 0,5 \muL de matriz se pusieron en la diana y se pudieron
secar. Luego 1,0 \muL de muestra se añadió. Los espectros se
obtuvieron en ionización positiva lineal modo con un voltaje de
aceleración de 20.000 V y un voltaje de cuadrícula del 95%, al menos
190 tiros de laser cubrieron el lugar completo se acumularon para
cada espectro. Se usaron insulinas bovinas y bradiquinina
des-Arg^{1}-para la calibración
internas.
Ejemplo
3
Los péptidos se caracterizaron mediante de
cromatografía de mapeo peptídico líquida de alta resolución de fase
reversa (RP-HPLC). Las fracciones IEC se redujeron,
alquilaron y digerieron con la endoproteína Lyx-C
como se describió en el mapa peptídico MALDI-TOF MS.
El análisis de los isómeros digeridos se llevó a cabo mediante el
sistema HPLC Waters Alliance con una columna analítica Vydac
RP-C18 (5 \mum, 2.1 \times 250 mm) y una
precolumna con el mismo material de empaquetado. La elución se
realizó con un gradiente de acetonitrilo del 1% al 95% durante 105
min en agua con una proporción de flujo de 0,2 mL/min. Ambos
disolventes contienen TFA 0,1% (v/v). 100 \muL de cada muestra
digerida se inyectó y monitorizó a 215 nm.
Ejemplo
4
Se premezcló una solución de 18 mg/ml del
trans-ácido 3-indolacrílico en acetonitrilo/0.1% del
ácido trifluoroacético 70/30 (v/v) con el mismo volumen de solución
de muestra. Luego 1,0 \muL de la mezcla se aplicó a la superficie
de la diana. Se midieron 150-200 tiros de láser
típicamente en modo de ionización pasiva lineal. El voltaje de
aceleración se fijó a 25.000 V y el voltaje de la cuadrícula a 90%.
Se usó albúmina bovina M^{+} y M^{2+} para la calibración
externa.
Ejemplo
5
Se realizó la SE-HPLC con un
sistema Waters Alliance 2690 HPLC equipado con una columna SWXL G
4000 de gel TSK TosoHaas (7,8 \times 300 mm). Se eluyeron las
proteínas usando una fase móvil que contiene NaH_{2}PO_{4} 0,02
M, 0,15 M de NaCl, 1% (v/v) dietilenglicol, y 10% (v/v) etanol (pH
6.8) a una tasa de flujo 0,4 mL/min y se detectó a 210 nm. Las
cantidades de inyección fueron 20 \mug de cada isómero.
Se usaron las HPLC de exclusión de tamaño y
SDS-PAGE para determinar la cantidad de formas del
IFN alfa 2a PEG- oligo y agregados en las diferentes fracciones de
IEC. El material de referencia que contiene 2,3% de agregados y
2,2% de oligomeros (Figura 4).
Los picos 1, 4, 4a, 5, 6 y 8 contienen 0,7% de
las formas de IFN alfa 2a de oligopegilado, mientras que en los
picos 2, 3, y 7 el porcentaje de las formas de IFN alfa 2a
oligopegilado están bajo el límite de detección (0.2%). Se puede
ver en el caso de los agregados una tendencia diferente. En todos
los picos la cantidad de agregados es entre el 0,9%.
Ejemplo
6
Se realizaron SDS-PAGE bajo
condiciones reductoras y no reductoras usando geles de
Tris-Glicina del 16% (1.5 mm, 10 pocillos). Los
marcadores de peso molecular 12 Novex Mark 12 con una proporción de
masa de 2,5 a 200 kDa se usaron para la calibración, albúmina de
suero bovino (BSA) se usó como sensibilidad estándar (2 ng).
Aproximadamente 1 \mug de todas las muestras y 0,5 \mug de
estándar se aplicó al gel. Las condiciones de corrido fueron 125 V
y 6 W durante 120 min. Las proteínas se fijaron y tiñeron usando el
kit de tinción de plata SilverXpress de Novex.
Los geles que se registraron bajo condiciones no
reducidas para las fracciones de IEC 1-8 (Figura 2)
mostraron un patrón que se compara con el estándar de referencia
IFN alfa 2 a PEG.
Bajo condiciones de reducción, los geles
mostraron un incremento en la intensidad de las bandas menores
alrededor de 90 kDa comparado con el estándar. Entre los fragmentos
de la proteína de 6 y 10 kDa aparecen los picos 6, 7 y 8 (Figura
3). Ambas bandas juntas corresponden a aproximadamente el 1% del
material fijado. En las líneas isómero 1, 5, 6, 7, 8 pueden verse
bandas adicionales con más de 100 kDa que están también presente en
el estándar. Estas pueden asignarse a los oligómeros. Así
SDS-PAGE confirma los resultados del análisis
HPLC-SE.
En conjunto, los experimentos
PAGE-SDS y HPLC-RP indican que la
pureza de las fracciones de IEC pueden considerarse comparables con
el estándar de referencia del IFN alfa 2 a PEG.
La estructura de las especies de IFN alfa 2a PEG
derivado de las fracciones de IEC 9 se identificaron basándose en
los resultados de los métodos descritos anteriormente usando la
estrategia mencionado anteriormente.
\newpage
Ejemplo
7
La actividad antiviral se estimó por este efecto
protector en las células de riñón (MDBK) bovinas
Madin-Darby contra la Infección por el virus de
stomatis vesticular (VSV) y comparado con el estándar del IFN del
alfa 2a PEG. Los estándar de referencia y las muestras se diluyeron
en un Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM) que contienen suero
bovino fetal al 10% a una concentración final de 10 ng/mL
(concentración de inicio de ensayo). Cada muestra se ensayó por
cuadriplicado.
La protección antiviral de las células de riñón
bovinas Madin-Darby (MDBK) por el virus stomatis
vesicular se probaron de acuerdo con el método descrito en
Virol. 1981, 37, 755-758. Todos los
isómeros indujeron una actividad en el ensayo
anti-viral como se presenta en la Tabla 2. La
proporción de actividades entre 1061 y 339 U/\mug, indican que la
diferencia en las actividades específicas de la proteína en los
isómeros posicionales es significante. El como se conoce y los
resultados generados demasiado rápido permitirán la iniciación de
más investigaciones para establecer la relación entre estructura y
función entre los isómeros posicionales y los receptos IFN
alfa.
Ensayo Antiviral de PEG-IFN | ||
Pico | \hskip3cm | U/\mug |
PEG-IFN | 1061 \pm 50 | |
Pico 1 | 1818 \pm 127 | |
Pico 2 | 1358 \pm 46 | |
Pico 3 | 761 \pm 97 | |
Pico 4 | 339 \pm 33 | |
Pico 4a | 966 \pm 107 | |
Pico 5 | 600 \pm 27 | |
Pico 6 | 463 \pm 25 | |
Pico 7 | 513 \pm 20 | |
Pico 8 | 468 \pm 23 |
Los resultados se ilustraron posteriormente en
las siguientes figuras
Figura 1: IEC-HPLC Analítica de
180 \mug de -IFN alfa 2a PEG., Se usó una columna de intercambio
analítico fuerte analíticamente para comprobar la pureza de los
isómeros posicionales de cada paso de purificación
(TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 10 \mum
tamaño de partícula, 7,5 mm diámetro, 7,5 cm longitud).
Figura 2: A/B: Análisis SDS-PAGE
con Tris-glicina (16%), las muestras se sometieron a
electroforesis bajo condiciones no reductoras. En los geles se
tiñeron las proteínas con Silver Stain. Lanes: M, peso molecular de
las proteínas marcadoras/2, Pico 1/3, Pico 2/4, Pico 3/5, Pico 4/6,
Pico 4a/7, Pico 5/8, Pico 6/9, Pico 7/10, Pico 8/11, 1x estándar
IFN PEG-/12, 1,5x estándar IFN PEG-/C_{1}, estándar IFN.
Figura 3: A/B: SDS-PAGE análisis
con Tris-glicina (16%), las muestras se sometieron a
electroforesis bajo condiciones reductoras. En los geles se tiñeron
las proteínas con Silver Stain. Lanes: M peso, molecular con
proteínas marcadoras/2, Pico 1/3, Pico 2/4, Pico 3/5, Pico 4/6, Pico
4a/7, Pico 5/8, Pico 6/9, Pico 7/10, Pico 8/11, 1x
PEG-IFN estándar/12, 1,5x PEG-IFN
estándar/C_{1}, IFN estándar.
Figura 4: Se usaron los tamaños de exclusión
(SE-) HPLC para determinar la cantidad de formas IFN PEG oligo y se
agregaron en las diferentes fracciones de IEC. Se realizó
SE-HPLC con un TosoHaas TSK gel G 4000 SWXL columna
(7,8 \times 300 mm).
Figura 5: Se usó la espectrometría
MALDI-TOF para determinar el peso molecular de cada
isómero para asegurar que las moléculas PEG-IFN se
mantenían intactas después de la cromatografía IEC y para confirmar
la monopegilación.
Figura 6: Los mapas peptídicos de
Lys-C MALDI-TOF de estándar la
PEG-IFN referencia y los picos 1, 2, 3, 4, 4a, 5,
6, 7, 8. Los picos perdidos comparados al estándar se indican por
flechas.
Figura 7: Cromatogramas de
RP-HPLC de las digestiones de Lys-C
de la referencia del IFN PEG y pico 4a
Figura 8: HPLC Analítico de 5-10
\mug de la mezcla del-IFN alfa 2a PEG de isómeros
posicionales sobre una columna cargada con SP-NPR,
TosoH Bioscience, Tamaño de partícula: 2,5 \mum, no poro como se
describe en el Ejemplo 1B.
Figura 9: La estructura Ribbon del interferón
alfa-2a mostró los sitios de pegilación. Esta es la
estructura de elevada resolución del interferón humano
alfa-2a determinado con espectroscopia RMN see J.
Mol. Biol. 1997, 274, 661-675. Los
sitios de pegilación del interferón alfa-2a pegilado
se colorearon con rojo y se marcaron con un tipo de residuo y un
número de residuo.
Claims (14)
1. Los isómeros posicionales del interferón alfa
2a pegilado seleccionado de PEG-Lys(31),
PEG-Lys(134), en donde el peso medio
molecular de la porción de polietilenglicol (porción PEG) en dicho
interferón pegilado es de 26.000 daltons a 66.000 daltons,
especialmente de alrededor 40.000 daltons.
2. Un método para el aislamiento de isómeros
posicionales de la reivindicación 1, caracterizado en que el
interferón pegilado es
a) separado en sus isómeros posicionales sobre
una columna de cromatografía líquida preparativa con una matriz de
intercambio de catión; débil y
b) las fracciones se separaron posteriormente y
purificaron sobre una columna preparativa con una matriz de
intercambio catiónico.
3. Un método para el aislamiento de isómeros
posicionales de interferon alfa 2a Lys-pegilado,
caracterizado en que el interferón pegilado es
a) separado en sus isómeros posicionales sobre
una columna de cromatografía líquida preparativa con una matriz de
intercambio de catión; débil y
b) las fracciones se separaron posteriormente y
purificaron sobre una columna preparativa con una matriz de
intercambio catiónico, en donde el peso molecular medio de la
fracción de polietilenglicol (fracción PEG) en dicho interferon
pegilado es de 26.000 daltons a 66.000 daltons.
4. El método de acuerdo a la reivindicación 2 o
3, en donde el paso cromatográfico a) se conduce aplicando un
gradiente lineal de pH de alrededor de pH 3,8 a pH 8,0, de
concentración ascendente de acetato de sodio.
5. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2
ó 4, caracterizadas en que en el paso cromatográfico b) se
conduce con un gradiente lineal de un tampón de acetato de sodio (A)
a un tampón de fosfato de potasio (B) partiendo de un pH 4,2
inicial a alrededor de 4,6 a un pH final de alrededor pH 6,4 a
alrededor 6,8, dichas soluciones tampón contienen además un 12% de
etanol y más de un 1,5% de dietilenglicol.
6. El método de acuerdo a la reivindicación 5,
caracterizado en que los pasos cromatográficos se llevaron a
una temperatura de alrededor de 27° C a alrededor de 35° C,
preferiblemente a una temperatura de alrededor 30 a 32°C.
7. Composiciones farmacéuticas que comprenden
una posición de isómero pegilado de interferón alfa 2a de acuerdo
con la reivindicación 1 y un vehículo terapéuticamente inerte.
8. Composiciones farmacéuticas para el
tratamiento o profilaxis de disfunciones inmunomodulatorias tales
como enfermedades neoplásicas o disfunciones de infecciones que
comprenden un isómero posicional del interferón alfa 2a pegilado de
acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo terapéuticamente
inerte.
9. Un isómero posicional de interferon alfa 2a
pegilado, de conformidad con la reivindicación 1, para la
fabricación de medicamentos para uso en el tratamiento de
enfermedades.
10. El isómero posicional de la reivindicación 9
para la preparación de un medicamento para usos antiproliferativos,
antivirales e inmunomoduladores.
11. El isómero posicional de la reivindicación 9
para la preparación de medicamentos para el tratamiento de
enfermedades virales.
12. El uso de un isómero posicional de
interferon alfa 2a pegilado de conformidad con la reivindicación 1,
para la fabricación de medicamentos para empleo en el tratamiento o
profilaxis de enfermedades.
13. El uso de la reivindicación 12 para la
fabricación de medicamentos para usos antiproliferativos,
antivirales e inmunomoduladores.
14. El uso de la reivindicación 13 para la
preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades
virales.
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