ES2268054T3 - Nuevos polinucleotidos y polipeptidos del gen ifnalfa-17. - Google Patents

Nuevos polinucleotidos y polipeptidos del gen ifnalfa-17. Download PDF

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ES2268054T3 ES02742996T ES02742996T ES2268054T3 ES 2268054 T3 ES2268054 T3 ES 2268054T3 ES 02742996 T ES02742996 T ES 02742996T ES 02742996 T ES02742996 T ES 02742996T ES 2268054 T3 ES2268054 T3 ES 2268054T3
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Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende: a) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, o su secuencia de codificación, y que comprende al menos un SNP que consiste en g771c y 808Ins(a); o b) una secuencia de nucleótidos complementaria con un secuencia de nucleótidos en a);

Description

Nuevos polinucleótidos y polipéptidos del gen IFN\alpha-17.
Solicitudes relacionadas
La presente invención reivindica la prioridad a la Solicitud de Patente Francesa 0105516 presentada el 24 de abril de 2001 titulada "Nouveaux polynucléotides et polipéptidos du gène IFN\alpha-17".
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos polinucleótidos derivados de la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 que comprende nuevas SNP, y nuevos polipéptidos derivados a partir de la proteína IFN\alpha-17 natural silvestre que comprende mutaciones causadas por estas SNP, así como sus usos terapéuticos.
Técnica Relacionada
El gen del interferón \alpha-17, denominado de aquí en adelante en este documento IFN\alpha-17, se describe en las publicaciones:
\bullet
Olopade et al.: "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics; 14: 437-443; 1992.
\bullet
Lawn R. M. et al.; "DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes"; Science 212 (4499), 1159-1162 (1981).
La secuencia de nucleótidos de este gen se obtiene con el número de entrada V00532 en la base de datos del GenBank.
Se conoce el IFN\alpha por sus efectos celulares antiproliferativos y su participación en respuestas antivirales y antiparásitas.
También se sabe que el IFN\alpha inhibe la expresión de otras diversas citoquinas a nivel de las células madre hematopoyéticas, así como que inhibe la proliferación celular de ciertos tumores.
También se sabe que el IFN\alpha reduce la expresión de los receptores al EGF en carcinomas renales, inhibe la expresión de ciertos genes mitocondriales, inhibe la proliferación de fibroblastos, monocitos y linfocitos B, especialmente in vitro, y bloquea la síntesis de anticuerpos por linfocitos B.
También se sabe que el IFN\alpha induce la expresión de antígenos específicos a tumores en la superficie de las células tumorales y que también induce a los genes a colocarse bajo el control de las regiones promotoras del tipo ISRE (Ele-
mento Respuesta Estimulado por Interferón) actuando sobre los factores de transcripción específicos de estos ISRE.
Se sabe que el IFN\alpha está implicado en diferentes trastornos y/o enfermedades humanas, tales como diferentes cánceres como por ejemplo, carcinomas, melanomas, linfomas, leucemias y cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo tales como las que no están relacionadas con el sistema inmunológico tales como, por ejemplo, obesidad, enfermedades infecciosas tales como la hepatitis B y C y el SIDA, pulmonías, colitis ulcerativa, enfermedades del sistema nervioso central tales como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia y depresión, el rechazo de tejidos o transplantes, curación de heridas, anemia en pacientes dializados, alergias, asma, esclerosis múltiple, osteoporosis, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedades autoinmunes y trastornos, trastornos gastrointestinales o hasta trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
El IFN\alpha particularmente es usado para el tratamiento de ciertas leucemias, carcinomas causantes de metástasis renales así como tumores que aparecen después de una inmunodeficiencia, tales como el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA. El IFN\alpha es también eficaz contra otros tipos de tumores y contra ciertas infecciones virales. El IFN\alpha también es reconocido por la FDA (Food and Drug Administration) para el tratamiento de verrugas genitales o enfermedades venéreas.
Sin embargo, el IFN\alpha, y en particular el IFN\alpha-17, tiene numerosos efectos secundarios cuando se usan en composiciones farmacéuticas, tales como reacciones de hipersensibilidad aguda (urticaria, broncoconstricción, choque anafiláctico, etc.), arritmias cardíacas, hipotensión, ataques epilépticos, problemas con la función del tiroides, síndromes del tipo gripe (fiebres, sudores, mialgias) etc.
Además, los pacientes tratados con IFN\alpha pueden desarrollar anticuerpos que neutralizan estas moléculas, reduciendo así su eficacia.
Algunos documentos, tales como el documento de EE.UU. 4 780 530, Ullrich et al. "nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster"; Journal of molecular biology (1982) 156:467-486, el documento WO 01/25438, Hussain et al.; "identification of interferon alpha-7, alpha-14 and alpha-21 variants in the genome of a large human population"; Journal of Interferon and Cytokine Research (1996) 16: 853-859 y Sylvänen et al.; "Identification of individuals by analysis of biallelic DNA markers, using PCR and solid phase", Journal of Interferon and Cytokine Research (1996) 16:46-59, describe secuencias de nucleótidos o polipéptidos de diferentes variantes del interferón alfa o moléculas relacionadas, que pueden servir como agentes terapéuticos cuando se expresan en condiciones apropiadas.
Sin embargo, estos documentos no se refieren a los SNP específicos naturales, que están correlacionados con una diferencia en la actividad biológica de la molécula interferón alfa-17.
El inventor ha encontrado análogos del nuevo polipéptido y nuevo polinucleótido al gen de IFN\alpha-17 capaces de tener una funcionalidad diferente del tipo de la proteína IFN\alpha-17 silvestre natural.
Estos nuevos polipéptidos y polinucleótidos pueden ser usados especialmente para tratar o prevenir los trastornos o las enfermedades antes mencionadas y evitan todo o parte de las desventajas, que les son propias.
Breve sumario de la invención
La invención tiene como su primer objeto nuevos polinucleótidos que se diferencian de la secuencia de nucleótidos del gen de referencia de IFN\alpha-17 silvestre, porque comprende uno o varios SNP (Polimorfismo de Nucleótido Simple).
La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia humano está compuesto de 1873 nucleótidos y comprende una secuencia de codificación de 570 nucleótidos, a partir del nucleótido 639 (codon de iniciación) al nucleótido 1208 (codon de terminación).
El solicitante ha identificado 2 SNP en la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia.
Estos SNP son los siguientes: g771c, 808Ins(a).
Se sobrentiende, en el sentido de la presente invención, que la enumeración correspondiente a la colocación del SNP antes definido es en relación con la enumeración de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
Las letras a, t, c y g corresponden respectivamente a las bases nitrogenadas de adenina, timina, citosina y guanina.
La primera letra corresponde al nucleótido silvestre, mientras que la última letra corresponde al nucleótido mutado.
Así, el SNP g771 c corresponde a una mutación del nucleótido guanina (g) en la posición 771 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia en una citosina (c).
El SNP 808Ins(a) corresponde a la inserción del nucleótido adenina (a) en la posición 808 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia.
Estos SNP fueron identificados por el solicitante usando el procedimiento de determinación descrito en la solicitud de patente del solicitante FR 00 22894, titulada "Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applications" y presentada el 6 de diciembre de 2000, citada en este documento como referencia.
El procedimiento descrito en esta solicitud de patente permite la identificación de uno (o varios) SNP preexisten-
te(s) en al menos un individuo de una población aleatoria de individuos.
En el alcance de la presente invención, un fragmento de la secuencia de nucleótidos del gen IFN\alpha-17, que comprende, por ejemplo, la secuencia de codificación, fue aislado a partir de diferentes individuos en una población de individuos escogidos de una manera aleatoria.
La secuenciación de estos fragmentos fue llevada a cabo después sobre seguro a partir de estas muestras que tienen un perfil heterodúplex (que es un perfil diferente de él de la secuencia génica de IFN\alpha-17 silvestre de referencia) después del análisis por DHPLC ("Cromatografía Líquida de Alta Resolución por Desnaturalización").
El fragmento secuenciado de este modo entonces fue comparado con la secuencia de nucleótidos del fragmento del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia y los SNP conforme a la invención identificada.
Así, los SNP son naturales y cada uno de ellos está presente en ciertos individuos de la población mundial.
El gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia codifica para una proteína inmadura de 189 aminoácidos, correspondiente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, que será convertida en una proteína madura de 166 aminoácidos, por la división del péptido señal que incluye los 23 primeros aminoácidos.
La codificación de los SNP de la invención, es decir g771c y 808Ins(a), causa modificaciones, a nivel de la secuencia de aminoácidos, de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17. Estas modificaciones son las siguientes:
\bullet
El SNP g771 c causa una mutación del aminoácido glicina (G) en la posición 45 en la proteína inmadura del gen de IFN\alpha-17, correspondiente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, en arginina (R) y en la posición 22 de la proteína madura. En la descripción de la presente invención, se llamará indiferentemente G22R y G45R la mutación codificada por este SNP de acuerdo a si se refiere respectivamente a la proteína madura o a la proteína inmadura.
\bullet
El SNP 808Ins(a) causa una mutación del aminoácido histidina (H) en la posición 57 en la proteína inmadura del gen de IFN\alpha-17, correspondiente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, en glutamina (Q) y en la posición 34 de la proteína madura. Además, la inserción de una adenina en la posición 808 en la secuencia de nucleótidos causa un desplazamiento de marco en la traducción de la proteína, que causa el aspecto de un codon de terminación en la posición 58 de la secuencia de aminoácidos. Así, el SNP 808Ins(a) causa una detención de la traducción justo después de la glutamina 57. Como consecuencia, la proteína inmadura resultante es acortada y sólo está hecha de 57 aminoácidos. También se llama H57Q marco 57 a este polimorfismo. En la descripción de la presente invención, se llamará indiferentemente H34Q marco 34 y H57Q marco 57 a la mutación codificada por este SNP de acuerdo a si se refiere respectivamente a la proteína madura o a la proteína inmadura.
La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 corresponde a la proteína inmadura mutada (H57Q marco 57) codificada por la secuencia de nucleótidos ID SEQ NO. 1 que comprende el SNP 808Ins(a).
Cada uno de los SNP de la invención causa modificaciones de la conformación espacial de los polipéptidos conforme a la invención comparado con el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia.
Estas modificaciones pueden ser observadas por modelado molecular computacional, de acuerdo con métodos que son conocidos por cualquier persona experta en la técnica, aprovechando, por ejemplo, las herramientas de modelado de novo (por ejemplo, SEQ-FOLD/MSI), homología (por ejemplo, MODELER/MSI), minimización del campo de fuerza (por ejemplo, DISCOVER, DELPHI/MSI) y/o dinámica molecular (por ejemplo, CFF/MSI).
Se proporciona un ejemplo de tales modelos en lo sucesivo en este documento en la sección experimental.
El modelado molecular computacional muestra que la mutación G22R en la proteína madura mutada implica una modificación y un desplazamiento del bucle AB alrededor de la posición 22, causando la desaparición de puentes de hidrógeno.
Las figuras 1A y 1B muestran que el bucle AB se desdobla y sobresale.
En el IFN\alpha-17 silvestre natural, el resto G22 está muy cerca del resto R144. Se sabe que este resto R144 está implicado en la unión del interferón \alpha-2 (IFN\alpha-2) a su receptor. Siendo la estructura de IFN\alpha-2 y de IFN\alpha-17 muy similares, es probable que el resto R144 en IFN\alpha-17 esté implicado en la unión a su receptor.
Así, la proteína G22R mutada posee una conformación tridimensional diferente de la proteína IFN\alpha-17 silvestre natural.
El modelado molecular computacional también permite la predicción de que la presencia del aminoácido arginina en la posición 22 implica una modificación significativa de la estructura y de la función de la proteína IFN\alpha-17 silvestre natural, especialmente a nivel de la unión de IFN\alpha-17 a su receptor.
El genotipado de los polinucleótidos conforme a la invención puede ser llevado a cabo de tal manera que se determine la frecuencia alélica de estos polinucleótidos en una población.
La determinación de la funcionalidad de los polipéptidos de la invención puede ser llevada a cabo igualmente por un ensayo de su actividad biológica.
En cuanto a esto, es posible medir, por ejemplo, la transducción de señal, la maduración de células dendríticas, la liberación de citoquina por linfocitos T, la liberación de citoquina por monocitos,la actividadantiviral in vitro o in vivo, la actividad antiproliferativa celular en la línea celular Daudi Burkitt, la actividad antiproliferativa celular en la línea celular TF-1 de polipéptidos conforme a la invención y compararse con el IFN\alpha-17 silvestre, o el IFN\alpha-2 silvestre escogido como representativo del Intrón A, un producto comercial.
La invención también tiene como objeto el uso de polinucleótidos y de polipéptidos conforme a la invención así como de moléculas terapéuticas obtenidas y/o identificadas partiendo de estos polinucleótidos y polipéptidos, especialmente para la prevención y el tratamiento de ciertos trastornos humanos y/o enfermedades.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A representa un modelo de la proteína codificada de acuerdo con la invención que comprende SNP G45R y la proteína IFN\alpha-17 silvestre. La figura 1B representa una ampliación del modelo de la parte inferior de cada una de las proteínas representadas en la Figura 1A.
En las Figuras 1A y 1B, la cinta negra representa la estructura de la proteína IFN\alpha-17 silvestre y la cinta blanca representa la estructura de la proteína IFN\alpha-17 G22R mutada.
La figura 2 representa los resultados del ensayo para medir el efecto antiproliferativo de IFN\alpha-17 G45R mutado, en la línea celular TF-1. En esta figura, las abscisas corresponden a la concentración de IFN\alpha (ng/mL) y las ordenadas corresponden a la inhibición de la proliferación celular (%). El efecto antiproliferativo del IFN\alpha-17 G45R mutado (diamantes negros) es comparado con él de IFN\alpha-2 silvestre (cuadrados blancos).
La figura 3 representa los resultados del ensayo para medir el efecto antiproliferativo de IFN\alpha-17 G45R mutado, en la línea celular Daudi Burkitt. En esta figura, las abscisas corresponden a la concentración de IFN\alpha (ng/mL) y las ordenadas corresponden a la inhibición de la proliferación celular (%). El efecto antiproliferativo del IFN\alpha-17 G45R mutado (diamantes negros) es comparado con él de IFN\alpha-2 silvestre (cuadrados blancos). La figura 4 representa la tasa de supervivencia de ratones previamente infectados por el virus VSV y tratados con la proteína IFN\alpha-17 G45R mutada, en comparación con los tratados con IFN\alpha-2 silvestre, o los que no han sido tratados.
En esta figura, las abscisas corresponden al tiempo de supervivencia (días) y las ordenadas corresponden a la tasa de supervivencia relativa de ratones infectados con VSV. Los diamantes negros representan los datos para los ratones infectados con VSV tratados con IFN\alpha-17 G45R mutado, los cuadrados negros representan los datos para los ratones infectados con VSV tratados con IFN\alpha-2 silvestre, y los triángulos claros representan los datos para los ratones infectados con VSV que no han sido tratados.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Se entiende que la "secuencia de nucleótidos del gen silvestre de referencia" es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 del gen de IFN\alpha-17 humano.
Esta secuencia es obtenible de la GenBank con el número de entrada V00532 y está descrita en:
\bullet
Olopade et al.: "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genoinics; 14: 437-443; 1992.
\bullet
Lawn R. M. et al.; "DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes"; Science, 212 (4499), 1159-1162 (1981).
Se entiende que la "proteína IFN\alpha-17 silvestre natural" o "proteína IFN\alpha-17 silvestre" es la proteína madura codificada por la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 silvestre de referencia. La proteína IFN\alpha-17 inmadura silvestre natural corresponde a la secuencia del péptido mostrada en SEQ ID NO. 2.
Se entiende que el "polinucleótido" es un polirribonucleótido o un polidesoxirribonucleótido que puede ser un ADN modificado o no modificado o un ARN.
El término polinucleótido incluye, por ejemplo, un ADN monocatenario o biocatenario, un ADN compuesto a partir de una mezcla de una o varias regiones monocatenarias y de una o varias regiones bicatenarias, un ARN monocatenario o bicatenario y un ARN compuesto a partir de una mezcla de una o varias regiones monocatenarias y de una o varias regiones bicatenarias. El término polinucleótido también puede incluir un ARN y/o un ADN incluyendo una o varias regiones tricatenarias. Por polinucleótido es entendido igualmente los ADN y ARN que contienen una o varias bases modificadas de tal manera que tengan una estructura modificada por motivos de estabilidad o por otros motivos. Por base modificada es entendido, por ejemplo, bases insólitas tal como la inosina.
Se entiende que el "polipéptido" es un péptido, un oligopéptido, un oligómero o una proteína que comprende al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico normal o modificado, tal como en los casos de péptidos isostéricos, por ejemplo.
Un polipéptido puede estar compuesto de otros aminoácidos que los 20 aminoácidos definidos por el código genético. Un polipéptido igualmente puede estar compuesto de aminoácidos modificados por procesos naturales, tales como procesos de maduración post-translacionales o por procesos químicos, que son conocidos por cualquier persona experta en la técnica. Tales modificaciones están detalladas ampliamente en la bibliografía. Estas modificaciones pueden aparecer en cualquier lugar en el polipéptido: en la estructura del péptido, en la cadena de aminoácidos o hasta en los extremos carboxi- o amino-terminales.
Un polipéptido puede estar ramificado después de una ubiquitinación o ciclarse con o sin ramificación. Este tipo de modificación puede ser el resultado de procesos de post-translación naturales o sintéticos que son conocidos por cualquier persona experta en la técnica.
Por ejemplo, se entiende que las modificaciones de polipéptidos incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de hemo, fijación covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o de un derivado lipídico, la fijación covalente de un fosfatidilinositol, entrecruzamiento covalente o no covalente, ciclación, formación de puente disulfuro, desmetilación, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, \gamma-carboxilación, glicosilación incluyendo PEG-ilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesos proteolíticos, fosforilación, prenilación, racemización, seneloilación, sulfatación, adición de aminoácidos tales como la arginilación o la ubiquitinación. Tales modificaciones están ampliamente detalladas en la bibliografía: PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª ed., T. E. Creighton, Nueva York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, 1983, Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646, y Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62.
Se entiende que el "polinucleótido aislado" o "polipéptido aislado" es un polinucleótido o polipéptido respectivamente, tal como antes se define, que está aislado del cuerpo humano o que se produce de otra manera por un procedimiento técnico.
Se entiende que la "identidad" es la medida de la identidad de la secuencia del nucleótido o del polipéptido.
La identidad es un término conocido por cualquier persona experta en la técnica y está bien descrita en la bibliografía. Véase COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1998; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. y Griffin H.G., Ed, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y SEQUENCE ANALYSES IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987.
Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad y la semejanza entre dos secuencias están bien descritos igualmente en la bibliografía. Véase GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo H. y Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073.
Un polinucleótido que tiene, por ejemplo, una identidad de al menos el 95% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 es un polinucleótido que contiene en la mayor parte 5 puntos de mutación en 100 nucleótidos, comparado con dicha secuencia.
Estos puntos de mutación pueden ser una (o varias) sustitución(ones), adición(ones) y/o deleción(ones) de uno (o varios) nucleótido(s).
De la misma manera, un polipéptido que tiene, por ejemplo, una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 es un polipéptido que contiene en la mayor parte 5 puntos de mutación en 100 aminoácidos, comparado con dicha secuencia.
Estos puntos de mutación pueden ser una (o varias) sustitución(ones), adición(ones) y/o deleción(ones) de uno (o varios) aminoácido(s).
Los polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la invención que no son totalmente idénticos respectivamente con:
\bullet
la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 que comprende al menos uno de los siguientes SNP: g771c y 808Ins(a)
\bullet
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 que comprende el SNP G45R
\bullet
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 que comprende posiblemente SNP G45R es considerada como variantes de estas secuencias.
Por lo general, un polinucleótido de acuerdo con la invención posee la misma o prácticamente la misma actividad biológica que la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 que comprende al menos uno de los SNP: g771c y 808Ins (a).
De manera similar, por lo general un polipéptido de acuerdo con la invención posee la misma o prácticamente la misma actividad biológica que:
\bullet
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 que comprende el SNP G45R, y/o
\bullet
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 que comprende posiblemente el SNP G45R.
Una variante, de acuerdo con la invención, puede ser obtenida, por ejemplo, por mutagénesis dirigida o por síntesis directa.
Se entiende que "SNP" es cualquier variación natural de una base en una secuencia de nucleótidos. Un SNP, en una secuencia de nucleótidos, puede codificar, silenciar o no codificar.
Un SNP codificante es un polimorfismo incluido en la secuencia de codificación de una secuencia de nucleótidos que implica una modificación de un aminoácido en la secuencia de aminoácidos codificados por esta secuencia de nucleótidos. En este caso, el término SNP se aplica igualmente, por extensión, a una mutación en una secuencia de aminoácidos.
Un SNP silente es un polimorfismo incluido en la secuencia de codificación de una secuencia de nucleótidos que no implica una modificación de un aminoácido en la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos.
Un SNP no codificante es un polimorfismo incluido en la secuencia no codificante de una secuencia de nucleótidos. Este polimorfismo puede ser encontrado especialmente en un intrón, una área de empalme, un promotor de transcripción o una secuencia potenciadora de sitio.
Se entiende que el "SNP funcional" es un SNP, tal como se define antes, que está incluido en una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos, teniendo una funcionalidad.
Por "funcionalidad" se entiende la actividad biológica de un polipéptido o de un polinucleótido.
La funcionalidad de un polipéptido o de un polinucleótido de acuerdo con la invención puede consistir en una conservación, un aumento, una reducción o una supresión de la actividad biológica del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del gen de referencia silvestre o de esta última secuencia de nucleótidos.
La funcionalidad de un polipéptido o de un polinucleótido de acuerdo con la invención puede consistir igualmente en un cambio de la naturaleza de la actividad biológica del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del gen silvestre de referencia o de esta última secuencia de nucleótidos.
La actividad biológica, especialmente, puede estar relacionada con la afinidad o a la ausencia de afinidad de un polipéptido de acuerdo con la invención a un receptor.
Polinucleótido
La presente invención tiene por su primer objeto un polinucleótido aislado que comprende:
a)
una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95%, y más preferiblemente una identidad de al menos el 99% con la secuencia SEQ ID NO. 1 o su secuencia de codificación (desde el nucleótido 639 al nucleótido 1208),
se sobrentiende que esta secuencia de nucleótidos comprende al menos uno de los siguientes SNP codificantes: g771c y 808Ins(a), o
b)
una secuencia de nucleótidos complementaria con un secuencia de nucleótidos en a).
Conforme a la presente invención, la secuencia de nucleótidos en a) puede comprender el SNP g771c, o SNP 808Ins(a), o tanto los SNP g771c como 808Ins(a).
Se entiende, en el sentido de la presente invención, que la enumeración corresponde a la colocación de los SNP en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
La presente invención se refiere igualmente a un polinucleótido aislado que comprende:
a)
una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 o su secuencia de codificación, se sobrentiende que cada una de estas secuencias comprende al menos uno de los siguientes SNP codificantes: g771c y 808Ins(a), o
b)
una secuencia de nucleótidos complementaria con una secuencia de nucleótidos en a).
Preferiblemente, el polinucleótido de la invención consiste en la secuencia SEQ ID NO. 1 o su secuencia de codificación, se sobrentiende que cada una de estas secuencias comprende al menos uno de los siguientes SNP codificantes: g771c y 808Ins(a).
\newpage
De acuerdo con la invención, el polinucleótido antes definido comprende un solo SNP codificante seleccionado a partir del grupo que consiste en: g771c y 808Ins(a).
La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que consiste en una parte de:
a)
una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 o su secuencia de codificación, se sobrentiende que cada una de estas secuencias comprende al menos uno de los siguientes SNP: g771c y 808Ins(a), o
b)
una secuencia de nucleótidos complementaria con un secuencia de nucleótidos en a).
estando compuesto dicho polinucleótido aislado de al menos 10 nucleótidos.
Preferiblemente, el polinucleótido aislado, según se define anteriormente, está compuesto de 10 a 40 nucleótidos.
La presente invención también tiene como objeto un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido que comprende:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2,
se sobrentiende que cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) comprende el siguiente SNP codificante: G45R.
Se entiende, en el sentido de la presente invención, que la enumeración correspondiente a la colocación del SNP G45R es en relación a la enumeración de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2.
La presente invención también tiene como objeto un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido que comprende:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3,
Cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) del polipéptido antes definido también puede comprender al SNP G45R.
De acuerdo con un objeto preferido de la invención, el polipéptido antes definido comprende un SNP codificante simple como se define anteriormente.
Más preferiblemente, un polinucleótido aislado de acuerdo con la invención codifica para un polipéptido que comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 y que tiene el SNP G45R codificante.
Más preferiblemente, un polinucleótido aislado de acuerdo con los códigos de la invención para un polipéptido que comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, que tiene posiblemente también el SNP G45R codificante.
Preferiblemente un polinucleótido de acuerdo con la invención está compuesto de una molécula de ARN o ADN.
Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser obtenido por métodos sintéticos estándar de ADN o ARN.
Un polinucleótido de acuerdo con la invención que comprende SNP g771c puede ser obtenido igualmente por mutagénesis dirigida partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 modificando el nucleótido guanina (g) silvestre por el nucleótido citosina (c) mutado en la posición 771 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
Un polinucleótido de acuerdo con la invención que comprende SNP 808Ins(a) puede ser obtenido igualmente por mutagénesis dirigida partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen de IFN\alpha-17 añadiendo un nucleótido de adenina (a) en la posición 808 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
Los procesos de mutagénesis dirigida que pueden ser puestos en práctica de este modo son conocidos por cualquier persona experta en la técnica. La publicación de TA Kunkel en 1985 en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:488 puede ser mencionada especialmente.
Un polinucleótido aislado igualmente puede incluir, por ejemplo, secuencias de nucleótido que codifican para secuencias de aminoácidos pre-, pro- o pre-pro-proteicas o secuencias de aminoácidos marcadoras, tales como péptido hexa-histidina.
Un polinucleótido de la invención igualmente puede ser asociado con secuencias de nucleótidos que codifican para otras proteínas o fragmentos de proteína para obtener proteínas de fusión u otros productos de purificación.
Un polinucleótido de acuerdo con la invención igualmente puede incluir secuencias de nucleótidos tales como las secuencias no codificantes 5' y/o 3', tales como, por ejemplo, secuencias transcritas o no transcritas, secuencias traducidas o no traducidas, secuencias de señal de empalme, secuencias poliadeniladas, secuencias de unión de ribosoma o hasta secuencias que estabilizan a mRNA.
Una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótido o polinucleótido se define como una que puede hibridar con esta secuencia de nucleótidos, en condiciones rigurosas.
"Condiciones de hibridación rigurosas" son generalmente, pero no necesariamente, entendidas como las condiciones químicas que permiten una hibridación cuando las secuencias de nucleótidos tienen una identidad de al menos el 80%, preferiblemente mayor o igual al 90%, todavía más preferiblemente mayor o igual al 95% y lo más preferiblemente mayor o igual al 97%.
Las condiciones rigurosas pueden ser obtenidas de acuerdo con métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica y, por ejemplo, por una incubación de los polinucleótidos, a 42°C, en una solución que comprenda formamida del 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH = 7,6), Solución 5x Denhardt, sulfato de dextrano del 10% y 20 \mug de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0,1x SSC, a 65°C.
En la amplitud de la invención, cuando las condiciones de hibridación de rigurosas permiten la hibridación de las secuencias de nucleótidos que tienen una identidad igual al 100%, la secuencia de nucleótidos, según se considera, es estrictamente complementaria a la secuencia de nucleótidos como se describe en a).
Se entiende dentro del significado de la presente invención que la secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos comprende al menos un SNP antisentido de acuerdo con la invención.
Así, por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos comprende el SNP g771c, su secuencia de nucleótidos complementaria comprende el nucleótido g en el equivalente de la posición 771.
Identificación, hibridación y/o amplificación de un polinucleótido que comprende SNP
La presente invención también tiene como objeto el uso de:
a)
un polinucleótido que tiene, al menos, una identidad del 95% y una identidad particularmente del 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, o una secuencia de dicho polinucleótido compuesto de 10 a 40 nucleótidos, y/o
b)
un polinucleótido de acuerdo con la invención que comprende al menos un SNP
para identificar, hibridar y/o amplificar un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 90%, una identidad más preferiblemente del 95% y una identidad particularmente del 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 o, si fuera necesario, su secuencia de codificación (del nucleótido 639 al nucleótido 1208), se sobrentiende que cada una de estas secuencias comprende al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a).
Genotipado y determinación de la frecuencia de SNP
La presente invención igualmente tiene como objeto el uso de:
a)
un polinucleótido que tiene al menos, una identidad del 95% y una identidad particularmente del 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 o una secuencia de dicho polinucleótido compuesto de 10 a 40 nucleótidos, y/o
b)
un polinucleótido de acuerdo con la invención que comprende al menos un SNP para el genotipado de un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 90%, una identidad más preferiblemente del 95% y una identidad particularmente del 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1 o si fuera necesario su secuencia de codificación (del nucleótido 639 al nucleótido 1208), se sobrentiende que cada una de estas secuencias comprende al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a).
De acuerdo con la invención, el genotipado puede ser llevado a cabo en un individuo o en una población de individuos.
Dentro del significado de la invención, el genotipado es definido como un procedimiento para la determinación del genotipo de un individuo o de una población de individuos. El genotipo consiste en los alelos presentes en uno o varios sitios específicos.
Se entiende que la "población de individuos" es un grupo de individuos seleccionados de manera aleatoria o no aleatoria. Estos individuos pueden ser seres humanos, animales, microorganismos o plantas.
Por lo general, el grupo de individuos comprende al menos a 10 individuos, preferiblemente de 100 a 300 individuos.
Los individuos pueden ser seleccionados de acuerdo con su identidad étnica o de acuerdo con su fenotipo, especialmente los que están afectados por los trastornos y/o las enfermedades siguientes: carcinomas, melanomas, linfomas, leucemias y cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo tales como las que no están relacionadas con el sistema inmunológico tales como, por ejemplo, obesidad, enfermedades infecciosas, en particular, infecciones virales tales como hepatitis B y C y SIDA, pulmonías, colitis ulcerativa, enfermedades del sistema nervioso central tales como, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia y depresión, rechazo de tejidos o transplantes, curación de heridas, anemia en pacientes dializados, alergias, asma, esclerosis múltiple, osteoporosis, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedades y trastornos autoinmunes, trastornos gastrointestinales o hasta trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Un SNP funcional de acuerdo con la invención es preferiblemente genotipado en una población de individuos.
Múltiples tecnologías existen que puede ser puestas en práctica para el genotipo de SNP (véase especialmente Kwok Pharma-cogenomics, 2000, vol 1, págs. 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"). Estas tecnologías están basadas en uno de los cuatro de los siguientes principios: hibridación de oligonucleotido alelo específica, elongación de oligonucleotido por didesoxinucleótidos opcionalmente en presencia de desoxinucleótidos, ligado de oligonucleotidos alelo específicos o división de oligonucleotidos alelo específicos. Cada una de estas tecnologías puede ser acoplada a un sistema de detección tal como la medida de fluorescencia directa o polarizada, o la espectrometría de masas.
El genotipado puede ser llevado a cabo especialmente minisecuenciando con ddNTPs caliente (2 ddNTPs diferentes marcados con fluoróforos diferentes) y ddNTPs en frío (2 ddNTP no marcados diferentes), en conexión con un explorador de fluorescencia polarizado. El protocolo de minisecuenciación con la lectura de fluorescencia polarizada (Tecnología FP-TDI, siglas en inglés de "Fluorescence Polarization Template-Direct Dye-Terminator Incorporation") es conocido por cualquier persona experta en la técnica.
Puede ser llevado a cabo sobre un producto obtenido después de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN de cada individuo. Este producto de la PCR es seleccionado para cubrir la región génica del polinucleótido que contiene el SNP estudiado. Después de la última etapa del termociclador de la PCR, la placa se coloca sobre un explorador de fluorescencia polarizado para una lectura de las bases marcadas usando la excitación específica al fluoróforo y filtros de emisión. Los valores de intensidad de las bases marcadas se representan en un gráfico.
Para la amplificación por PCR, en el caso de un SNP de la invención, los cebadores sentido y antisentido, respectivamente, pueden ser seleccionados fácilmente por cualquier persona experta en la técnica de acuerdo con la posición de los SNP de la invención.
Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos sentido y antisentido para los cebadores de amplificación por PCR pueden ser, respectivamente:
SEQ ID NO. 4: Cebador sentido: TTCAAGGTTACCCATCTCAA
SEQ ID NO. 5: Cebador antisentido: TTAGTCAATCAGGATCATTGC
Las secuencias de nucleótidos permiten la amplificación de un fragmento que tiene una longitud de 655 nucleótidos, desde el nucleótido 591 al nucleótido 1245 en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
Se consigue entonces un análisis estadístico de la frecuencia de cada alelo (frecuencia alélica) codificada por el gen que comprende el SNP en la población de individuos, permitiendo la determinación de la importancia de su impacto y su distribución en los subgrupos diferentes y especialmente, si fuera necesario, los diversos grupos étnicos que constituyen esta población de individuos.
Los datos de genotipado son analizados para la estimación de la frecuencia de distribución de los diferentes alelos observados en las poblaciones estudiadas. Los cálculos de las frecuencias alélicas pueden ser llevados a cabo con ayuda de un software tal como SAS-suite® (SAS) o SPLUS® (MathSoft). La comparación de las distribuciones alélicas de SNP de la invención a través de los diferentes grupos étnicos de la población de individuos puede ser llevada a cabo mediante el software ARLEQUIN® y SAS-suite ®.
Los SNP de la invención como marcadores genéticos
Aunque las secuencias funcionales modificadoras de SNP de genes (por ejemplo el promotor, los sitios de empalme, la región codificante) probablemente están asociadas directamente con la sensibilidad de la enfermedad o la resistencia, todos los SNP (funcionales o no) pueden proporcionar marcadores valiosos para la identificación de uno o varios genes implicados en estos estados de enfermedad y, por consiguiente, pueden estar asociados indirectamente con estos estados de enfermedad (Véase Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22:231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1:39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899).
Así, la presente invención también se refiere a un banco de datos que comprende al menos uno de los SNP siguientes: g771c, 808Ins(a), en un polinucleótido del gen de IFN\alpha-17.
Se sobrentiende que dichos SNP se enumeran conforme a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.
Este banco de datos puede ser analizado para determinar asociaciones estadísticamente relevantes entre:
(i)
al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a), en un polinucleótido del gen de IFN\alpha-17, y
(ii)
una enfermedad o una resistencia a una enfermedad.
Más preferiblemente, la presente invención se refiere a un método para determinar asociaciones estadísticamente relevantes entre al menos un SNP seleccionado a partir del grupo que consiste en g771c, 808Ins(a), en el gen de IFN\alpha-17, y una enfermedad o resistencia a la enfermedad que comprende:
a)
Genotipar a un grupo de individuos;
b)
Determinar la distribución de dicha enfermedad o resistencia a la enfermedad dentro de dicho grupo de individuos;
c)
Comparar los datos del genotipo con la distribución de dicha enfermedad o resistencia a la enfermedad; y
d)
Analizar dicha comparación para asociaciones estadísticamente relevantes.
La presente invención también se refiere al uso in vitro de al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a), en un polinucleótido del gen de IFN\alpha-17, para desarrollar kits diagnósticos/pronósticos para una enfermedad o resistencia a una enfermedad.
Un SNP de la invención como se define anteriormente directamente o indirectamente puede estar asociado a una enfermedad o resistencia a una enfermedad.
Preferiblemente, estas enfermedades pueden ser las que están definidas según se mencionan anteriormente.
Vector de expresión y células huésped
La presente invención también tiene como objeto un vector recombinante que comprende al menos un polinucleótido de acuerdo con la invención.
Pueden ser usados numerosos sistemas de expresión, incluyendo sin restricción cromosomas, episomas, y virus derivados. Más particularmente, los vectores recombinantes usados pueden ser derivados de plásmidos bacterianos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos de cromosoma de levadura, virus tales como baculovirus, virus de papiloma tal como SV40, virus de vacuna, adenovirus, virus de la viruela del zorro, virus de pseudorabia, retrovirus.
Estos vectores recombinantes pueden ser derivados igualmente a partir de un fagómido o cósmido. La secuencia de nucleótidos puede ser insertada en el vector de expresión recombinante por métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica tales como, por ejemplo, los que están descritos en MOLECULAR CLONING: A LABORATO-
RY MANUAL, Sambrook et al., 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001.
El vector recombinante puede incluir las secuencias de nucleótidos que controlan la regulación de la expresión del polinucleótido así como la secuencia de nucleótidos que permite la expresión y la transcripción de un polinucleótido de la invención y la traducción de un polipéptido de la invención, siendo seleccionadas estas secuencias de acuerdo con las células huésped que sean usadas.
Así, por ejemplo, una señal de secreción apropiada puede ser integrada en el vector recombinante de modo que el polipéptido, codificado por el polinucleótido de la invención, será dirigido hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico, en la membrana o hacia el ambiente extracelular.
La presente invención también tiene como objeto una célula huésped que comprende un vector recombinante de acuerdo con la invención.
La introducción del vector recombinante en una célula huésped puede ser llevada a cabo de acuerdo con los métodos que son conocidos por cualquier persona experta en la técnica como los descritos en BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2ª ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, y MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra, tal como la transfección por fosfato de calcio, transfección por DEAE
dextrano, transfección, microinyección, transfección por lípidos catiónicos, electroporación, transducción o infección.
La célula huésped puede ser, por ejemplo, células bacterianas tales como las células de estreptococos, estafilococos, E. coli o Bacillus subtilis, células de hongos tales como células de levadura y célulasde Aspergillus, Streptomyces, células de insecto tales como célulasde Drosófila S2 y de Spodoptera Sf9, células de animal, tales como células CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 y células humanas del sujeto a tratar o hasta células de plantas.
Las células huésped pueden ser usadas, por ejemplo, para expresar un polipéptido de la invención o como un producto activo en composiciones farmacéuticas, como serán vistas en lo sucesivo en este documento.
Polipéptido
La presente invención también tiene como objeto un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95% y todavía más preferiblemente una identidad de al menos el 99% con:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2,
se sobrentiende que cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) contiene el SNP codificante siguiente: G45R.
El polipéptido de la invención igualmente puede comprender:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o
b)
la secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2,
se sobrentiende que cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) contiene el SNP codificante siguiente: G45R.
El polipéptido de la invención puede consistir más particularmente en:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o
b)
la secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2,
se sobrentiende que cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) contiene el SNP codificante siguiente: G45R.
La presente invención también tiene como objeto un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95% y todavía más preferiblemente una identidad de al menos el 99% con:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3,
se sobrentiende que cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) contiene el SNP codificante siguiente: H57Q marco 57.
El polipéptido de la invención puede comprender igualmente:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3.
El polipéptido de la invención puede consistir más particularmente en:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3.
Cada una de las secuencias de aminoácidos en a) y b) de dicho polipéptido también puede comprender el SNP G45R.
Preferiblemente, un polipéptido de acuerdo con la invención contiene un SNP codificante simple seleccionado a partir del grupo que consiste en: G45R, H57Q marco 57.
Más preferiblemente, el polipéptido de acuerdo con la invención comprende los aminoácidos 24 a 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, y tiene un SNP G45R codificante.
Más preferiblemente, el polipéptido de acuerdo con la invención comprende los aminoácidos 24 a 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3.
La presente invención igualmente tiene como objeto un procedimiento para la preparación del polipéptido anteriormente descrito, en el que una célula huésped previamente definida es cultivada en un medio de cultivo y dicho polipéptido es aislado del medio de cultivo.
El polipéptido puede ser purificado partiendo del medio de cultivo de las células huésped, de acuerdo con métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica tal como precipitación con ayuda de agentes caotrópicos tales como sales, en particular sulfato de amonio, etanol, acetona o ácido tricloroacético, extracción ácida; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de fosfocelulosa; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía de afinidad; cromatografía de hidroxiapatito o cromatografías de exclusión.
Se entiende que el "medio de cultivo" es el medio en el que el polipéptido de la invención es aislado o purificado. Este medio puede estar compuesto de medio extracelular y/o lisado celular. Las técnicas conocidas para cualquier persona experta en la técnica permiten igualmente a éste devolver una conformación activa al polipéptido, si la conformación de dicho polipéptido fuera cambiada durante el aislamiento o la purificación.
Anticuerpos
La presente invención también tiene como objeto un procedimiento para obtener un anticuerpo inmunoespecífico.
Se entiende que "anticuerpo" son los anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena simple, humanizados así como fragmentos Fab, incluyendo Fab o productos de la genoteca de expresión de inmunoglobulina.
Un anticuerpo inmunoespecífico puede ser obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido de acuerdo con la invención.
La invención también se refiere a un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de acuerdo con la invención, tal como se define anteriormente en este documento.
Un polipéptido de acuerdo con la invención, uno de sus fragmentos, un análogo, una de sus variantes o una célula que exprese este polipéptido también pueden ser usados para producir anticuerpos inmunoespecíficos.
El término "inmunoespecífico" significa que el anticuerpo posee una mejor afinidad para el polipéptido de la invención que para otros polipéptidos conocidos en la técnica anterior.
Los anticuerpos inmunoespecíficos pueden ser obtenidos por administración de un polipéptido de la invención, de uno de sus fragmentos, de un análogo o de un fragmento epitópico o a partir de una célula que exprese este polinucleótido en un mamífero, preferiblemente no humano, de acuerdo con métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, pueden ser usados métodos típicos para la producción de anticuerpos, partiendo de líneas celulares, tales como la técnica de hibridoma (Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) y la técnica de hibridoma EBV (Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (vol. 27, Simposios sobre Biología Molecular y Celular de la UCLA, Nueva Serie) (editores R.A. Reisfeld y S. Sell), págs. 77-96, Alan R. Litises, Inc. Nueva York, 1985, págs. 77-96).
Las técnicas de producción de anticuerpos de cadena simple como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 4.946.778 pueden ser usadas igualmente.
Animales transgénicos tales como ratones, por ejemplo, pueden ser usados igualmente para producir anticuerpos humanizados.
Agentes que interactuan con el polipéptido de la invención
La presente invención tiene como objeto igualmente un procedimiento para la identificación de un agente activante o inhibitorio de un polipéptido de acuerdo con la invención, que comprenda:
a)
preparar un vector recombinante que comprenda un polinucleótido de acuerdo con la invención que contenga al menos un SNP codificante,
b)
preparar células huésped que comprendan un vector recombinante de acuerdo con a),
c)
poner en contacto células huésped de acuerdo con b) con un agente para ser analizado, y
d)
determinar el efecto de activación o inhibición generado por el agente a analizar.
Un polipéptido de acuerdo con la invención también puede ser empleado en un procedimiento para seleccionar los compuestos que interactuan con él.
Estos compuestos pueden ser agentes de activación (agonistas) o de inhibición (antagonistas) de la actividad intrínseca de un polipéptido de acuerdo con la invención. Estos compuestos pueden ser igualmente ligandos o sustratos de un polipéptido de la invención. Véase Coligan et al., "Current Protocols in Immunology" 1 (2), Capítulo 5 (1991).
En general, para poner en práctica tal procedimiento, primero es deseable producir células huésped apropiadas que expresen un polipéptido de acuerdo con la invención. Tales células pueden ser, por ejemplo, células de mamíferos, levaduras, insectos tales como Drosophila o bacterias tales como E. coli.
Estas células o extractos de membrana de estas células entonces son puestos en presencia de compuestos que se analizan.
La capacidad de unión de los compuestos que se analicen con el polipéptido de la invención entonces puede ser observada, así como la inhibición o la activación de la respuesta funcional.
La etapa d) del procedimiento anterior puede ser puesta en práctica usando un agente que se analice directamente o indirectamente marcado. Esto también puede incluir un ensayo de competición, usando un agente marcado o no marcado y un agente de competición marcado.
Igualmente puede ser determinado si un agente que se analice genera una señal de activación o inhibición sobre células que expresen el polipéptido de la invención usando un medio de detección escogido de manera apropiada de acuerdo con la señal que se detecte.
Tales agentes de activación o inhibición pueden ser polinucleótidos, y en ciertos casos oligonucleotidos o polipéptidos, tales como proteínas o anticuerpos, por ejemplo.
La presente invención también tiene como objeto un procedimiento para la identificación de un agente activado o inhibido por un polipéptido de acuerdo con la invención, que comprende:
a)
preparar un vector recombinante que comprenda un polinucleótido de acuerdo con la invención que contenga al menos un SNP codificante,
b)
preparar células huésped que comprendan un vector recombinante de acuerdo con a),
c)
colocar células huésped de acuerdo con b) en presencia de un agente que se analice, y
d)
determinar el efecto de activación o inhibición generado por el polipéptido en el agente que se analice.
Un agente activado o inhibido por el polipéptido de la invención es un agente que responde, respectivamente, mediante una activación o una inhibición en presencia de este polipéptido.
Los agentes, activados o inhibidos directamente o indirectamente por el polipéptido de la invención, pueden consistir en polipéptidos tales como, por ejemplo, receptores membranales o nucleares, quinasas y más preferiblemente quinasas de tirosina, factores de transcripción o polinucleótidos.
Detección de enfermedades
La presente invención también tiene como objeto un procedimiento para analizar las características biológicas de un polinucleótido de acuerdo con la invención y/o de un polipéptido de acuerdo con la invención en un sujeto, que comprenda al menos uno de lo siguiente:
a)
Determinar la presencia o la ausencia de un polinucleótido de acuerdo con la invención en el genoma de un sujeto;
b)
Determinar el nivel de expresión de un polinucleótido de acuerdo con la invención en un sujeto;
c)
Determinar la presencia o la ausencia de un polipéptido de acuerdo con la invención en un sujeto;
d)
Determinar la concentración de un polipéptido de acuerdo con la invención en un sujeto; y/o
e)
Determinar la funcionalidad de un polipéptido de acuerdo con la invención en un sujeto.
Estas características biológicas pueden ser analizadas en un sujeto o en una muestra de un sujeto.
Estas características biológicas pueden permitir llevar a cabo un diagnóstico genético y determinar si un sujeto está afectado o en peligro de afectación o, de otra forma, si presenta una resistencia parcial al desarrollo de una enfermedad, una indisposición o un trastorno vinculado a la presencia de un polinucleótido de acuerdo con la invención y/o un polipéptido de acuerdo con la invención.
Estas enfermedades pueden ser trastornos y/o enfermedades humanas, tales como cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades inmunológicamente relacionadas y/o enfermedades autoinmunes y trastornos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, y trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Dichos cánceres y tumores incluyen carcinomas que comprenden carcinomas causantes de metástasis renales, melanomas, linfomas que comprenden linfomas foliculares y linfoma de células T cutáneo, leucemias que comprenden leucemia de células pilosas, leucemia crónica linfocítica y leucemia crónica mieloide, cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune que comprende el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA.
Dichas enfermedades infecciosas incluyen infecciones virales que comprenden hepatitis crónica B y C y VIH/
SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
Dichas enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas pueden incluir el rechazo de tejidos o transplantes, alergias, asma, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
Dichas enfermedades del metabolismo pueden incluir enfermedades tales como no inmune-asociadas, tales como la obesidad.
Dichas enfermedades del sistema nervioso central pueden incluir la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión.
Dichas enfermedades y trastornos también pueden incluir la curación de heridas, anemia en paciente dializado, y osteoporosis.
Este procedimiento también permite el diagnóstico genético de una enfermedad o de una resistencia a una en-
fermedad vinculada a la presencia, en un sujeto, del alelo mutante codificado por SNP de acuerdo con la in-
vención.
Preferiblemente, en la etapa a), se va a detectar la presencia o la ausencia de un polinucleótido, que contenga al menos un SNP codificante tal como antes se define.
La detección del polinucleótido puede ser llevada a cabo partiendo de muestras biológicas del sujeto que se estudie, tales como células, sangre, orina, saliva, o partiendo de una biopsia o una autopsia del sujeto que se estudie. El ADN genómico puede ser usado para la detección directamente o después de una amplificación por PCR, por ejemplo. El ARN o cDNA igualmente pueden usarse de una manera similar.
Es posible entonces comparar la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de acuerdo con la invención con la secuencia de nucleótidos detectada en el genoma del sujeto.
La comparación de las secuencias de nucleótidos puede ser llevada a cabo secuenciando, por métodos de hibridación de ADN, por la diferencia de movilidad de los fragmentos de ADN en un gel de electrofóresis con o sin agentes desnaturalizantes o por la diferencia de las temperaturas de fusión (véase Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Tales modificaciones en la estructura de la secuencia de nucleótidos en un punto exacto pueden ser reveladas igualmente por análisis de protección de nucleasa, tales como RNasa y la nucleasa S 1, por digestión enzimática o también por agentes de división química. Véase Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 85: 4397-4401. Pueden ser usadas sondas de oligonucleotido que comprendan un fragmento del polinucleótido de la invención igualmente para levar a cabo el rastreo.
Pueden ser usados muchos métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica para determinar la expresión de un polinucleótido de la invención e identificar la variabilidad genética de este polinucleótido (Véase Chee et al., Science (1996), Vol 274, págs. 610-613).
En la etapa b), el nivel de expresión del polinucleótido puede ser medido cuantificando el nivel de ARN codificado por este polinucleótido (y codificando para un polipéptido) de acuerdo con métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica tales como, por ejemplo, por PCR, RT-PCR, protección con RNasa, Northern blot, y otros métodos de hibridación.
En la etapa c) y d) la presencia o la ausencia así como la concentración de un polipéptido de acuerdo con la invención en un sujeto o una muestra de un sujeto puede ser llevada a cabo por métodos conocidos tales como, por ejemplo, por radioinmunoensayo, análisis de unión competitiva, inmunotransferencia y análisis ELISA.
Consecutivamente para la etapa d), la concentración determinada del polipéptido de acuerdo con la invención puede ser comparada con la concentración de proteína silvestre natural encontrada por lo general en un sujeto.
Una persona experta en la técnica puede identificar el umbral superior o inferior por el que aparece la sensibilidad o, al contrario, la resistencia a la enfermedad, la indisposición o el trastorno mencionado antes, con ayuda de publicaciones de la técnica anterior o por análisis convencional o ensayos, tales como los que antes se han mencionado.
En la etapa e), la determinación de la funcionalidad de un polipéptido de acuerdo con la invención puede ser llevada a cabo por métodos conocidos por cualquier persona experta en la técnica tales como, por ejemplo, por análisis in vitro como los antedichos o por uso de células huésped que expresen dicho polipéptido.
Compuestos terapéuticos y tratamientos de enfermedades
La presente invención también tiene como objeto un compuesto terapéutico que contenga, por vía del agente activo, un polipéptido de acuerdo con la invención.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido de acuerdo con la invención, para la fabricación de un compuesto terapéutico requerido para la prevención o el tratamiento de diferentes trastornos humanos y/o enfermedades. Estas enfermedades pueden ser trastornos y/o enfermedades humanas, tales como cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades inmunológicamente relacionadas y/o enfermedades autoinmunes y trastornos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, y trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Dichos cánceres y tumores incluyen carcinomas que comprenden carcinomas causantes de metástasis renales, melanomas, linfomas que comprenden linfomas foliculares y el linfoma de células T cutáneo, leucemias que comprenden la leucemia de células pilosas, leucemia crónica linfocítica y leucemia crónica mieloide, cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune que comprende el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA.
Dichas enfermedades infecciosas incluyen infecciones virales que comprenden hepatitis crónica B y C y VIH/
SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
Dichas enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas puede incluir el rechazo de tejidos o transplantes, alergias, asma, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
Dichas enfermedades del metabolismo pueden incluir enfermedades tales como no inmune-asociadas tales como la obesidad.
Dichas enfermedades del sistema nervioso central pueden incluir a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión.
Dichas enfermedades y trastornos también pueden incluir la curación de heridas, anemia en paciente dializado, y osteoporosis.
Preferiblemente, un polipéptido de acuerdo con la invención también puede ser usado para la fabricación de un compuesto terapéutico requerido para la prevención o el tratamiento de diferentes trastornos humanos y/o enfermedades, tales como ciertas infecciones virales tales como la hepatitis crónica B y C, leucemias tales como la leucemia de células pilosas y leucemia crónica mieloide, mielomas múltiples, linfomas foliculares, tumores carcinoides, melanomas malignos, carcinomas causantes de metástasis renales, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, así como tumores que aparecen después de una deficiencia inmune, tales como el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA, y verrugas genitales o enfermedades venéreas.
Ciertos de los compuestos que permiten obtener el polipéptido de acuerdo con la invención así como los compuestos obtenidos o identificados por o a partir de este polipéptido pueden ser usados de la misma manera para el tratamiento terapéutico del cuerpo humano, es decir, como un compuesto terapéutico.
Esto es el motivo por el que la presente invención también tiene como objeto un medicamento que contenga, por vía del agente activo, un polinucleótido de acuerdo con la invención que contenga al menos un SNP codificante anteriormente definido, un vector recombinante previamente definido, una célula huésped anteriormente definida, y/o un anticuerpo antes definido.
La invención también se refiere al uso de un polinucleótido de acuerdo con la invención que contiene al menos un SNP codificante anteriormente definido, un vector recombinante antes definido, una célula huésped anteriormente definida, y/o un anticuerpo antes definido para la fabricación de un medicamento requerido para la prevención o el tratamiento de diferentes trastornos humanos y/o enfermedades. Estas enfermedades pueden ser trastornos y/o enfermedades humanas, tales como cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades inmunológicamente relacionadas y/o enfermedades autoinmunes y trastornos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, y trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Dichos cánceres y tumores incluyen carcinomas que comprenden carcinomas causantes de metástasis renales, melanomas, linfomas que comprenden linfomas foliculares y el linfoma de células T cutáneo, leucemias que comprenden la leucemia de células pilosas, leucemia crónica linfocítica y leucemia crónica mieloide, cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune que comprende el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA.
Dichas enfermedades infecciosas incluyen infecciones virales que comprenden la hepatitis crónica B y C y VIH/
SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
Dichas enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas puede incluir el rechazo de tejidos o transplantes, alergias, asma, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
Dichas enfermedades del metabolismo pueden incluir enfermedades tales como no inmune-asociadas tales como la obesidad.
Dichas enfermedades del sistema nervioso central pueden incluir la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión.
Dichas enfermedades y trastornos también pueden incluir la curación de heridas, anemia en paciente dializado, y osteoporosis.
Preferiblemente, la invención se refiere al uso de un polinucleótido de acuerdo con la invención que contiene al menos un SNP antes definido, un vector recombinante antes definido, una célula huésped anteriormente definida, y/o un anticuerpo antes definido, para la fabricación de un medicamento requerido para la prevención o el tratamiento de diferentes trastornos humanos y/o enfermedades, tales como ciertas infecciones virales tales como la hepatitis crónica B y C, leucemias como la leucemia de células pilosas y leucemia crónica mieloide, mielomas múltiples, linfomas foliculares, tumores carcinoides, melanomas malignos, carcinomas causantes de metástasis renales, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, así como tumores que aparecen después de una deficiencia inmune, tales como el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA, y verrugas genitales o enfermedades venéreas.
La dosificación de un polipéptido y de los otros compuestos de la invención, útiles como agente activo, depende de la opción del compuesto, la indicación terapéutica, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del sujeto y el juicio del doctor.
Cuando se usa como agente activo, un polipéptido de acuerdo con la invención generalmente se administra en una dosis que está en el intervalo entre 1 y 15 M UI (Unidad Internacional). La dosis recomendada puede ser administrada por vía subcutánea o intramuscular, entre 1 y 5 veces por semana, durante 1 a 12 meses.
La invención también tiene como un objeto una composición farmacéutica que contenga, como agente activo, al menos un compuesto anteriormente mencionado tal como un polipéptido de acuerdo con la invención, un polinucleótido de acuerdo con la invención que contenga al menos un SNP antes definido, un vector recombinante antes definido, una célula huésped anteriormente definida, y/o un anticuerpo antes definido, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En estas composiciones farmacéuticas, el agente activo está presente ventajosamente en dosis fisiológicamente eficaces.
Estas composiciones farmacéuticas pueden ser, por ejemplo, sólidas o líquidas y estar presentes en formas farmacéuticas actualmente usadas en la medicina humana tales como, por ejemplo, comprimidos simples o revestidos, gelcaps, gránulos, caramelos, supositorios y preparaciones preferiblemente inyectables y polvos para injectables. Estas formas farmacéuticas pueden prepararse de acuerdo con métodos habituales.
El(los) agente(s) activo(s) puede(n) ser incorporado(s) en excipientes empleados por lo general en composiciones farmacéuticas tales como talco, goma arábiga, lactosa, almidón, dextrosa, glicerol, etanol, estearato de magnesio, mantequilla de cacao, vehículos acuosos o no acuosos, sustancias grasas de origen animal o vegetal, derivados parafínicos, glicoles, varios agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes, conservantes.
\newpage
El(los) agente(s) activo(s) de acuerdo con la invención puede(n) ser empleado(s) solos o en combinación con otros compuestos tales como compuestos terapéuticos como otras citoquinas tales como interleuquinas o interferones, por ejemplo.
Las diferentes formulaciones de las composiciones farmacéuticas están adaptadas de acuerdo con el modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por diferentes rutas de administración conocidas para cualquier persona experta en la técnica.
La invención igualmente tiene como un objeto una composición diagnóstica que contiene, como agente activo, al menos un compuesto anteriormente mencionado tal como un polipéptido de acuerdo con la invención, un polinucleótido de acuerdo con la invención, un vector recombinante antes definido, una célula huésped anteriormente definida, y/o un anticuerpo antes definido, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.
Esta composición diagnóstica puede contener, por ejemplo, un excipiente apropiado como los generalmente usados en la composición diagnóstica, tales como tampones y conservantes.
La presente invención igualmente tiene como un objeto el uso:
a)
de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de acuerdo con la invención, y/o
b)
de un polinucleótido de acuerdo con la invención, y/o
c)
de una célula huésped del sujeto que se trate, previamente definida,
para preparar un compuesto terapéutico requerido para aumentar la expresión o la actividad, en un sujeto, de un polipéptido de acuerdo con la invención.
Así, para tratar un sujeto que necesita un aumento de la expresión o de la actividad de un polipéptido de la invención, son posibles varios métodos.
Es posible administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la invención, con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Es, de la misma manera, posible aumentar la producción endógena de un polipéptido de la invención por la administración al sujeto de un polinucleótido de acuerdo con la invención. Por ejemplo, este polinucleótido puede ser insertado en un vector de expresión retroviral. Tal vector puede ser aislado partiendo de células que han sido infectadas por un vector de plásmido retroviral que contiene el ARN que codifica para el polipéptido de la invención, de tal manera que las células transformadas producen partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Véase "Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches", Capítulo 20, en Human Molecular Genetics, Strachan y Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996).
Conforme a la invención, será usado preferiblemente un polinucleótido que contenga al menos un SNP codificante como antes se define.
Es igualmente posible administrar al sujeto sus propias células huésped que le pertenecen, habiendo sido antes tomadas y modificadas estas células huésped para expresar el polipéptido de la invención, como se describe antes.
La presente invención igualmente se refiere al uso:
a)
de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo inmunoespecífico antes definido, y/o
b)
de un polinucleótido que permita la inhibición de la expresión de un polinucleótido de acuerdo con la invención,
para preparar un compuesto terapéutico requerido para reducir la expresión o la actividad, en un sujeto, de un polipéptido de acuerdo con la invención.
Así, es posible administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de inhibición y/o de un anticuerpo tal como antes se define, posiblemente en combinación, con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Es igualmente posible reducir la producción endógena de un polipéptido de la invención por la administración al sujeto de un polinucleótido complementario de acuerdo con la invención que permita la inhibición de la expresión de un polinucleótido de la invención.
Preferiblemente, puede ser usado un polinucleótido complementario que contenga al menos un SNP codificante como antes se define.
La presente invención también se refiere al uso de una proteína IFN\alpha-17 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un paciente que tiene un trastorno o una enfermedad causada por una variante de IFN\alpha-17 vinculado a la presencia en el genoma de dicho paciente de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95% (preferiblemente, una identidad del 97%, más preferiblemente una identidad del 99% y una identidad particularmente del 100%) con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, con tal de que dicha secuencia de nucleótidos comprenda uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a).
Preferiblemente, dicho medicamento es usado para la prevención o el tratamiento de una de las enfermedades seleccionadas a partir del grupo que consiste en cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades inmunológicamente relacionadas y/o enfermedades autoinmunes y trastornos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, y trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Dichos cánceres y tumores incluyen carcinomas que comprenden carcinomas causantes de metástasis renales, melanomas, linfomas que comprenden linfomas foliculares y linfoma de células T cutáneo, leucemias que comprenden la leucemia de células pilosas, leucemia crónica linfocítica y leucemia crónica mieloide, cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune que comprende el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA.
Dichas enfermedades infecciosas incluyen infecciones virales que comprenden la hepatitis crónica B y C y VIH/
SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
Dichas enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas pueden incluir el rechazo de tejidos o transplantes, alergias, asma, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
Dichas enfermedades del metabolismo pueden incluir enfermedades tales como no inmune-asociadas tales como la obesidad.
Dichas enfermedades del sistema nervioso central pueden incluir la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión.
Dichas enfermedades y trastornos también pueden incluir la curación de heridas, anemia en paciente dializado, y osteoporosis.
Compuestos miméticos de un polipéptido IFN\alpha-17 que comprende el SNP g771c de la invención
La presente invención también se refiere a un nuevo compuesto que tiene una actividad biológica sustancialmente similar a la del polipéptido de:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2;
a condición de que dichas secuencias de aminoácidos en a) y b) comprendan a SNP G45R.
Dicha actividad biológica puede ser evaluada, por ejemplo, midiendo la maduración de células dendríticas, la liberación de citoquina por linfocitos T CD4 + o CD8 +, la liberación de citoquina por monocitos,la actividadantiviral in vitro o in vivo, la actividad antiproliferativa celular en la línea celular TF-1, o la actividad antiproliferativa celular en la línea celular Daudi Burkitt como se describe en la parte experimental.
Como se menciona en la sección experimental, en comparación con el IFN\alpha-2 silvestre, el IFN\alpha-17 G45R mutado posee:
-
una capacidad más alta para estimular la liberación de IFN-\gamma por linfocitos T CD4 +
-
una capacidad más alta para estimular IFN-\gamma y la liberación de IL-10 por linfocitos T CD8 +
-
una capacidad inferior para estimular la liberación de IL-10 y IL-12 por monocitos
-
una actividad antiproliferativa similar en células TF-1
-
una actividad antiproliferativa más alta en células de la línea celular Daudi Burkitt
-
una actividad antiviral in vitro más alta en un cultivo de células infectado por VS
-
una actividad antiviral in vivo más alta en un modelo de ratón EMCV.
Como se menciona en la sección experimental también, el IFN\alpha-17 G45R mutado posee una actividad antiproliferativa celular inferior en la línea celular Daudi Burkitt en comparación con la de IFN\alpha-17 silvestre.
Un nuevo compuesto de la invención, como antes se define, puede poseer una actividad biológica sustancialmente similar a la del IFN\alpha-17 G45R mutado.
Dicho compuesto también puede tener una actividad biológica tal como la liberación de IFN-\gamma por linfocitos CD4 + o T CD8 +, la liberación de IL-10 por linfocitos T CD8 +, actividad antiviral in vitro, o actividad antiviral in vivo, que es aún más alta que la de IFN\alpha-17 G45R mutado.
Dicho compuesto también puede tener una actividad biológica tal como la liberación de IL-10 y IL-12 por monocitos, que es aún inferior que la del IFN\alpha-17 G45R mutado.
Dicho compuesto puede ser un compuesto bioquímico, tal como un polipéptido o péptido por ejemplo, o un compuesto orgánico químico, tal como un mimético de péptido sintético, por ejemplo.
La presente invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención que contiene el SNP G45R, para la identificación de un compuesto tal como se define anteriormente.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para la identificación de un compuesto de la invención, que comprende las etapas siguientes:
a)
Determinar la actividad biológica del compuesto que se analice, tal como maduración de células dendríticas, liberación de citoquina por linfocitos T CD4 + o CD8 +, liberación de citoquina por monocitos, actividad antiproliferativa celular en la línea celular TF-1, actividad antiproliferativa celular en la línea celular Daudi Burkitt,actividadantiviral in vitro o in vivo, por ejemplo;
b)
Comparar:
i)
la actividad determinada en la etapa a) del compuesto que se analice, con
ii)
la actividad del polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o de la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; a condición de que dichas secuencias de aminoácidos comprendan el SNP G45R; y
c)
Determinar en base a la comparación llevada a cabo en la etapa b) si el compuesto que se analiza tiene una actividad sustancialmente similar, o más reducida o más alta, comparada con la del polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o de la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; a condición de que dichas secuencias de aminoácidos comprendan el SNP G45R.
Preferiblemente, el compuesto que se analiza puede ser identificado previamente a partir de genotecas combinatorias del péptido sintético, rastreando con alta resolución, o puede ser diseñado según un diseño de fármacos automatizado para tener la misma estructura tridimensional que la del polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, o de la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; a condición de que dichas secuencias de aminoácidos comprendan el SNP G45R.
Los métodos para identificar y diseñar compuestos son conocidos por cualquier persona experta en la técnica.
Las publicaciones que se refieren a estos métodos pueden ser, por ejemplo:
-
Silverman R. B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action". Academic Press, 1ª ed. (15 de enero, 1992).
-
Anderson S y Chiplin J. (2002). "Structural genomics; shaping the future of drug design" Drug Discov. Today. 7(2):105-107.
-
Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). "The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today. 7(2):109-116.
-
Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1):5-14.
-
Kauvar L.M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6): 709.
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Los compuestos de la invención pueden ser usados para la preparación de un medicamento requerido para la prevención o el tratamiento de una de las enfermedades seleccionadas a partir del grupo que consiste en cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades venéreas, enfermedades inmunológicamente relacionadas y/o enfermedades autoinmunes y trastornos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, y trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia.
Dichos cánceres y tumores incluyen carcinomas que comprenden carcinomas causantes de metástasis renales, melanomas, linfomas que comprenden linfomas foliculares y linfoma de células T cutáneo, leucemias que comprenden la leucemia de células pilosas, leucemia crónica linfocítica y leucemia crónica mieloide, cánceres hepáticos, de cuello, cabeza y riñones, mielomas múltiples, tumores carcinoides y tumores que aparecen después de una deficiencia inmune que comprende el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA.
Dichas enfermedades infecciosas incluyen infecciones virales que comprenden la hepatitis crónica B y C y VIH/
SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
Dichas enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas puede incluir el rechazo de tejidos o transplantes, alergias, asma, psoriasis, reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
Dichas enfermedades del metabolismo pueden incluir tales enfermedades no inmune-asociadas tales como la obesidad.
Dichas enfermedades del sistema nervioso central pueden incluir la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esquizofrenia y depresión.
Dichas enfermedades y trastornos también pueden incluir la curación de heridas, anemia en paciente dializado, y osteoporosis.
Preferiblemente, los compuestos de la invención pueden ser usados para la preparación de un medicamento requerido para la prevención o el tratamiento de una de las enfermedades seleccionadas a partir del grupo que consiste en ciertas infecciones virales tales como la hepatitis crónica B y C, leucemias tales como la leucemia de células pilosas y leucemia crónica mieloide, mielomas múltiples, linfomas foliculares, tumores carcinoides, melanomas malignos, carcinomas causantes de metástasis renales, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, así como tumores que aparecen después de una deficiencia inmune, tales como el Sarcoma de Kaposi en el caso del SIDA, y verrugas genitales o enfermedades venéreas.
Sección experimental
Ejemplo 1
Modelado de una proteína codificada por un polinucleótido de la secuencia de nucleótidos que contiene SNP G45R y de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos del gen de referencia silvestre
En una primera etapa, la estructura tridimensional de IFN\alpha-17 fue construida partiendo de la de IFN\alpha-2, cuya estructura está disponible en la base de datos PDB (código 1ITF) y usando el software Modeler (MSI, San Diego, CA).
El fragmento de polipéptido maduro entonces fue modificado de tal manera que reproducía la mutación G45R.
Mil etapas de minimización molecular fueron llevadas a cabo sobre este fragmento mutado usando los programas AMBER y DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.).
Dos ciclos de cálculos dinámicos moleculares fueron llevados a cabo entonces con el mismo programa y los mismos campos de fuerza.
En cada caso, fueron calculadas 50.000 etapas a 300°K, terminadas por 300 etapas de equilibrado.
El resultado de este modelado se visualiza en las Figuras 1A y 1B.
Ejemplo 2
Expresión de IFN\alpha-17 silvestre natural y IFN\alpha-17 G45R mutado en levadura a) Clonación de IFN\alpha-17 silvestre natural y IFN\alpha-17 mutado en el vector de expresión eucariota pPicZ\alpha-topo
Las secuencias de nucleótidos que codifican para la parte madura del IFN\alpha-17 silvestre natural y IFN\alpha-17 G45R mutado se amplifican por PCR usando como plantilla el ADN genómico de un individuo que es heterocigoto para el SNP.
Los cebadores de PCR que permiten tal amplificación son:
SEQ ID NO. 6: Cebador sentido: TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
SEQ ID NO. 7: Cebador antisentido: TCAATCCTTCCTCCTTAATATTTITTGC
Los productos de la PCR son insertados en el vector de expresión eucariota pPicZ\alpha-TOPO bajo el control del promotor híbrido AOX1 inducible por metanol (TOPO®- clonación; Invitrogen Corp.).
Este vector permite la expresión heteróloga de proteínas eucariotas en la levadura Pichia pastoris.
Después de la comprobación de la secuencia de nucleótidos de la región del vector que codifica para las proteínas recombinantes, el vector se linealiza por la enzima de restricción Pme1, y se transforma la cepa de levadura P. pastoris (Invitrogen) con estos vectores de expresión recombinantes.
b) Expresión heteróloga en P. pastoris y purificación de las proteínas IFN\alpha-17 silvestre y IFN\alpha-17 G45R mutado
Dos precultivos saturados de 50 mL de medio BMGY (Peptona del 2%, extracto de levadura del 1%, YNB del 1,34%, glicerol del 1%, fosfato de potasio 100 mM, 0,4 mg/Litro de biotina a pH 6,0) que contiene un clon que codifica para la proteína IFN\alpha-17 silvestre o que codifica para la proteína IFN\alpha-17 G45R mutado, fueron llevados a cabo durante 24-48 horas a 30°C a una agitación de 200 rotaciones por minuto (revoluciones por minuto).
Cuando el cultivo alcanzó una densidad celular de saturación (correspondiente a una densidad óptica de 12 medido a una longitud de onda de 600 nm), esto se usa para inocular, a 5 OD/mL, 250 mL de medio BMMY (Peptona del 2%, extracto de levadura del 1%, YNB del 1,34%, metanol del 0,5%, fosfato de potasio 100 mM, 0,4 mg/Litro de biotina a pH 6,0).
El metanol entonces induce a la expresión de la proteína a una concentración final del 1%, durante 24 horas a 30°C, con una agitación del matraz de cultivo a 180 revoluciones por minuto.
Debido a la presencia de la secuencia del péptido de señal del "factor alfa", corriente arriba de la secuencia de codificación, las proteínas son secretadas por las levaduras en el medio de cultivo. El factor alfa es dividido naturalmente durante el tratamiento.
La suspensión se centrifuga y la proteína se purifica por HPLC partiendo del sobrenadante obtenido.
En una etapa pre-comenzada, una ultrafiltración (Labscale, corte de 5000 Da, Millipore) seguido de una diálisis proporciona una concentración de diez veces la del sobrenadante de levadura en un tampón de Tris-Cl 50 mM, pH 9,0, NaCl 25 mM.
La primera etapa cromatográfica permite la recuperación de la proteína por afinidad en una columna de azul de sepharose (Amersham Pharmacia). La presencia de la proteína en las fracciones recogidas es verificada, por un lado por electrofóresis de SDS PAGE y por otra parte por immuno-detección mediante un anticuerpo específico dirigido contra la proteína IFN\alpha-17. En esta etapa, la pureza de la proteína de interés es más alta que el 75%.
En una segunda etapa de purificación, una filtración de gel permite el cambio de tampón de las fracciones recogidas correspondientes a las proteínas IFN\alpha-17 contra Tris 50 mM, pH 9,0, NaCl 25 mM.
La última etapa de purificación consiste en una separación de las proteínas en una columna de cromatografía de intercambio iónico.
Las fracciones que contienen la proteína recombinante son inyectadas en una columna de intercambio aniónico (ResourceQ 6.0 mL, Pharmacia) equilibrada de antemano en tampón Tris 50 mM pH 9, NaCl 25 mM. La elución de las proteínas se lleva a cabo por la migración de un gradiente de NaCl entre 0,025 y 1 M en tampón Tris 50 mM a
pH 9.
La pureza de la proteína de interés es estimada en el gel SDS/PAGE y las concentraciones de las proteína fueron medidas por densitometría (Quantity one, Biorad) y ensayo de BCA (ácido bicinconínico y sulfato de cobre,
Sigma).
Las proteínas IFN\alpha-17 silvestre y IFN\alpha-17 G45R mutado purificadas obtenidas de acuerdo con este protocolo, eventualmente aumentado para producir una cantidad de proteínas más alta, se usan para el análisis funcional descrito más abajo.
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Ejemplo 3
Evaluación de la actividad inmunomoduladora de IFN\alpha-17 silvestre natural y IFN\alpha-17 G45R mutado
Los IFN tipo I (IFN-\alpha y IFN-\beta) son capaces de modular ciertas funciones del sistema inmunológico. Se ha demostrado que aumentan la maduración de las células dendríticas (CD): aumento en la expresión de moléculas MHC clase I (HLA-ABC) y II (HLA-DR), aumento en la expresión de las moléculas implicadas en el co-estímulo de los linfocitos T, moléculas CD80, CD86 y CD83 y aumento de la función de estimulación de linfocitos T.
a) Efecto de IFN\alpha-17 G45R mutado en la maduración de células dendríticas
La actividad inmunomoduladora de IFN\alpha-17 G45R mutado primero fue investigada en la maduración de células dendríticas y fue comparado a la de IFN\alpha-2 silvestre escogido como el representante del producto comercial Intrón A.
Para hacer esto, primero fueron generadas células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica en adultos cultivadas en presencia de GM-CSF y citoquinas IL-4. Después de la purificación usando un kit de purificación de células CD14 +, estas células dendríticas fueron colocadas en presencia de 100 ng/mL de IFN\alpha-2 silvestre o IFN\alpha-17 G45R mutado y sus fenotipos fueron determinados por análisis FACS dirigido a la búsqueda de la expresión de moléculas MHC clase I y II y los marcadores CD40, CD80, CD86, CD83 y CD1. El estado de maduración de estas células dendríticas también ha sido comparado al obtenido sin tratamiento de IFN\alpha, para proporcionar un control de células dendríticas no estimuladas.
El valor de la mediana de las medidas de intensidad de fluorescencia para cada marcador y para las tres condiciones experimentales, expresadas como unidad aleatoria, se presenta en la tabla siguiente:
HLA ABC HLA DR CD40 CD80 CD86 CD83 CD1a
No IFN\alpha 142 155 246 40 24 21 65
IFN\alpha-17 G45R mutado 165 189 316 50 32 19 49
IFN\alpha-2 silvestre 179 276 491 87 57 26 51 
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de este de ensayo demuestran que la proteína IFN\alpha-17 G45R mutado es capaz de estimular la maduración de células dendríticas.
b) Efecto de IFN\alpha-17 G45R mutado sobre la liberación de citoquina por linfocitos T
La actividad inmunomoduladora de IFN\alpha-17 G45R mutado también fue investigada midiendo la liberación de citoquina por linfocitos T puestos en presencia de proteína IFN\alpha-17 mutada y con o sin un antígeno fuerte (SEB) para imitar una respuesta inmune contra una agresión. Este ensayo también fue realizado en presencia de IFN\alpha-2 silvestre usado como control y escogido como representante del producto comercial Intrón A.
Para hacer esto, fueron aisladas células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de donantes sanos y fueron estimuladas durante 16 horas en un medio apropiado que contenía anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o SEB. En cada cultivo fueron añadidos 4 \mug/mL de IFN\alpha-2 silvestre o IFN\alpha-17 G45R mutado. Después del estímulo, los linfocitos T fueron marcados extracelularmente por anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD69 o anticuerpos anti-CD3, anti-CD8 y anti-CD69, y fueron marcados intracelularmente con anticuerpos específicos dirigidos contra citoquinas del tipo Th1 (IFN-\gamma) o citoquinas del tipo Th2 (IL-10). Las células fluorescentes fueron analizadas usando el software FACScalibur y CellQuest.
Los resultados obtenidos indican que IFN\alpha-17 G45R mutado y IFN\alpha-2 silvestre no estimulan la liberación de IL-10 y IFN-\gamma y, por lo tanto, no activan a los linfocitos T en ausencia de SEB.
Al contrario, IFN\alpha-17 G45R mutado y IFN\alpha-2 silvestre estimulan la liberación de citoquinas (IL-10 y IFN-\gamma) por linfocitos T SEB-activados como se muestra en la tabla más abajo. Esta tabla representa la liberación de citoquina por linfocitos T en presencia de SEB, expresado como porcentaje de células CD4 + CD69 + o células CD8 + CD69 + para los linfocitos T CD4 + y linfocitos T CD8 +, respectivamente, y el porcentaje de células CD69 + sobre las células totales.
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Linfocitos T IFN-\gamma IL-10 células CD69+ /total
Control negativo 11,9 7,5 1,26
CD4+ CD69+ IFN\alpha-17 G45R 37,27 20,06 2,94
IFN\alpha-2 silvestre 19,6 24,68 2,7
Control negativo 8,73 0,65 4,69
CD8+ CD69+ IFN\alpha-17 G45R 36,7 7,02 9,54
IFN\alpha-2 silvestre 16,37 4,26 10,02 
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran claramente que IFN\alpha-17 G45R mutado estimula fuertemente la liberación de citoquina (IFN-\gamma y IL-10) por linfocitos T CD4 + y linfocitos T CD8 + previamente activados por el antígeno SEB. En este ensayo, la producción del interferón g por linfocitos T CD4 + es más alta en presencia de IFN\alpha-17 G45R mutado que en presencia de IFN\alpha-2 silvestre y la producción del interferón \gamma y IL-10 por linfocitos T CD8 + es más alta en presencia de IFN\alpha-17 G45R mutado que en presencia de IFN\alpha-2 silvestre.
c) Efecto de IFN\alpha-17 G45R mutado sobre la liberación de citoquina por monocitos
Finalmente, la actividad inmunomoduladora de IFN\alpha-17 G45R mutado fue investigada midiendo la liberación de citoquina por monocitos en ausencia o en presencia de un agente tóxico bacteriano (LPS). Este ensayo también fue realizado en presencia de IFN\alpha-2 silvestre usado como control y escogido como representante del producto comercial Intrón A.
Para hacer esto, células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) fueron aisladas a partir de donantes sanos y su fenotipo fue analizado para determinar la cantidad relativa de células CD64 + CD4dim (CD64 y CD4dim son marcadores para monocitos de sangre). Después del cultivo de una noche, estos PBMC fueron incubados en el medio de cultivo solo (no células estimuladas) o en presencia de LPS (células estimuladas). En cada cultivo, fueron añadidos 4 \mug/mL de IFN\alpha-2 silvestre o IFN\alpha-17 G45R mutado. Después del cultivo, las células fueron marcadas extracelularmente por anti-CD64 y anti-CD4dim, y fueron marcadas intracelularmente con anticuerpos específicos dirigidos contra citoquinas del tipo Th1 (TNF-\alpha), IL-12 y IL-10.
Las células fluorescentes fueron analizadas usando el software FACScalibur y CellQuest.
Los resultados obtenidos indican que IFN\alpha-17 G45R mutado y IFN\alpha-2 silvestre no estimulan la liberación de citoquinas (IL-10, IL-12 y TNF-\alpha) en ausencia de LPS.
Al contrario, en presencia de LPS, los monocitos liberan citoquinas. La liberación de IL-10 y IL-12 por monocitos en presencia de LPS además aumenta en presencia de IFN\alpha-2 silvestre pero no en presencia de IFN\alpha-17 G45R mutado como se muestra en la tabla más abajo. Esta tabla representa la liberación de citoquina por monocitos en presencia de LPS, expresado como porcentaje de células CD64 + CD4dim, y porcentaje de células CD4dim CD64 + sobre las células totales.
IL-10 IL-12 TNF-\alpha CD64+/total Células CD4dim
No IFN\alpha 16,21 8,52 13,88 3,1
IFN\alpha-17 G45R 17,47 8,3 40,92 2,86
IFN\alpha-2 silvestre 49,34 34,48 50,87 2,71 
\vskip1.000000\baselineskip
Así, la ausencia de efecto sinérgico observado en presencia de IFN\alpha-17 G45R mutado y LPS sugiere que IFN\alpha-17 G45R mutado puede tener una acción inmunodepresiva.
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Ejemplo 4
Evaluación de la actividad antiproliferativa in vitro de IFN\alpha-17 G45R mutado sobre la línea celular de eritroleucemia TF-1
El efecto de IFN\alpha-17 G45R mutado también fue evaluado con la línea celular de eritroleucemia TF-1. Este ensayo fue también realizado en presencia de IFN\alpha-2 silvestre usado como control y escogido como representante del producto comercial Intrón A.
Para hacer esto, fueron puestas células TF-1 en contacto de concentraciones crecientes de IFN\alpha-21 mutado o IFN\alpha-2 silvestre (de 0,001 a 1000 ng/mL) y fue medida la proliferación de células.
Los resultados, representados en la Figura 2, indican que IFN\alpha-17 G45R mutado tiene un débil efecto antiproliferativo sobre las células TF-1, y este efecto es similar al del IFN\alpha-2 silvestre, sugiriendo que la toxicidad hematológica de IFN\alpha-17 G45R mutado no es superior a la de IFN\alpha-2 silvestre.
Ejemplo 5
Evaluación de la capacidad de IFN\alpha-17 G45R mutado para inducir la antiproliferación de la línea celular del linfoma humano de Daudi Burkitt
Estos análisis son llevados a cabo con dos proteínas diferentes IFN\alpha-17, es decir IFN\alpha-17 G45R mutado y IFN\alpha-17 silvestre natural. Las células (la línea celular del linfoma humano de Daudi Burkitt, en lo sucesivo en este documento llamada "células Daudi"), cultivadas previamente en un medio RPMI 1640 (suplementado con suero de becerro fetal del 10% y L-Glutamina 2 mM), se inoculan en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 4,10^{4} células/pocillo.
En cada pocillo, las células Daudi son puestas en contacto con concentraciones crecientes de: proteínas IFN\alpha-17 silvestre natural o IFN\alpha-17 G45R mutado.
Las concentraciones de IFN\alpha-17 estudiadas (proteína silvestre natural o mutada) son incluidas entre 0,003 pM y 600 nM (concentraciones finales en los pocillos).
Las células Daudi entonces se incuban durante 66 h a 37°C en CO_{2} del 5% después de que el reactivo Uptiblue (Uptima) se añada a los cultivos. La velocidad de proliferación celular se cuantifica midiendo la fluorescencia emitida a 590 nm (excitación 560 nm) después de un período adicional de incubación de 4 horas.
La actividad antiproliferativa de IFN\alpha-17 silvestre natural o IFN\alpha-17 G45R mutado está basada en las medidas de IC_{50}, correspondiente a la concentración de proteína IFN\alpha-17, en picomolar (pM), que inhiben el 50% del crecimiento celular.
Cuatro experimentos similares fueron llevados a cabo, siendo cada uno repetido cuatro veces. Para cada experimento, los valores de IC_{50} son mencionados en la tabla siguiente:
Experimento IC_{50} (pM) Relación
IFN\alpha-17 silvestre IFN\alpha-17 G45R
1 0,32 1,51 5
2 0,60 7,20 12
3 0,22 1,53 7
4 0,81 10,99 14
El valor promedio de IC_{50} medido para el IFN\alpha-17 silvestre es 0,49 pM, mientras que el valor promedio de IC_{50} medido para el IFN\alpha-17 G45R mutado es 5,31 pM. Así, la relación del promedio correspondiente al valor del IC_{50} para el IFN\alpha-17 mutado respecto al valor para el IFN\alpha-17 silvestre natural alcanza 10,80 (con una desviación típica de 3,46).
Este ensayo demuestra que la actividad antiproliferativa celular es fuertemente inhibida (aproximadamente en un intervalo comprendido entre 5 a 15 veces menos) en el caso de IFN\alpha-17 G45R mutado comparando con el IFN\alpha-17 silvestre.
También han sido realizados experimentos similares independientes con el IFN\alpha-2 silvestre para comparar el efecto antiproliferativo de IFN\alpha-17 G45R mutado respecto a la proliferación de células Daudi con el efecto de IFN\alpha-2 silvestre. Para hacer esto, fueron cultivadas células Daudi en presencia de concentraciones de IFN\alpha-17 G45R mutado o IFN\alpha-2 silvestre en el intervalo de 0,001 a 10 ng/mL.
Fueron llevados a cabo tres experimentos similares. Los resultados de un experimento representativo son representados en la Figura 3.
Estos resultados demuestran que la actividad antiproliferativa celular de IFN\alpha-17 G45R mutado sobre la línea celular de Daudi Burkitt es más alta que la del IFN\alpha-2 silvestre.
Ejemplo 6
Evaluación de la actividad antiviral de IFN\alpha-17 G45R mutado
Los IFN juegan un papel importante en la defensa antiviral. La actividad antiviral de IFN es, en parte, debida a sistemas enzimáticos inducidos por los IFN, tales como:
\bullet
La 2'5' oligoadenilato sintetasa, una enzima que cataliza la síntesis del oligómero adenosina. Estos oligómeros activan la Rnasa L, una endorribonucleasa que destruye el ARN viral una vez activado.
\bullet
Las proteínas Mx (GTPasas) que inhiben la síntesis y/o la maduración de transcripciones virales. Esta actividad principalmente es ejercida sobre el virus de la gripe.
\bullet
La proteína PKR (o quinasa p68) que es activada por el ARN bicatenario. La PKR activada inhibe la síntesis de proteínas.
Otros mecanismos también inducen la actividad antiviral de los IFN tales como, en el caso de los retrovirus, la inhibición de la entrada de partículas virales en las células, la replicación, unión, salida de las partículas y el poder infeccioso de partículas virales.
Finalmente, los IFN ejercen una actividad antiviral indirecta modulando ciertas funciones del sistema inmunológico, en particular, favoreciendo la respuesta a la mediación celular (incluyendo un aumento de las moléculas clase MHC I y II, aumento de la producción de IL-12 y IFN-\gamma, aumento de las actividades de CTL, entre otros).
La actividad antiviral de IFN\alpha-17 G45R mutado ha sido evaluada tantoen cultivos celulares in vitro como in vivo en modelo de ratón. Ambos análisis se han llevado a cabo en paralelo con IFN\alpha-2 silvestre usado como control escogido como el representante del producto comercial Intrón A.
a) Actividad antiviralen cultivo celular in vitro
Este ensayo permite la evaluación de la actividad antiviral de IFN\alpha-17 G45R mutado y IFN\alpha-2 silvestre en un cultivo celular usando el virus de la estomatitis vesicular (VSV).
Para hacer esto, se cultivan células epiteliales humanas WISH durante 24 horas en presencia de concentraciones decrecientes de IFN\alpha-17 G45R mutado o IFN\alpha-2 silvestre. Entonces, las células son infectadas por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) durante 24 a 48 horas adicionales y se mide la lisis de las células.
El efecto antiviral del diferente IFN\alpha analizado se determina comparando el valor de IC_{50} correspondiente a la concentración de IFN que inhibe el 50% de la lisis de las células inducida por el VSV.
Un experimento similar fue llevado a cabo dos veces, y los valores de IC_{50} medidos en un experimento representativo se presentan en la tabla siguiente:
IFN\alpha-2 silvestre IFN\alpha-17 G45R mutado
IC_{50} (ng/mL) 4 2
Así, en el cultivo celular infectado por VSV, el IFN\alpha-17 G45R mutado exhibe una actividad antiviral, siendo esta actividad antiviral más alta que la de IFN\alpha-2 silvestre.
b) Actividad antiviral in vivo en modelo de ratón
Este ensayo in vivo es realizado en un modelo de ratón EMCV (Virus de la Encefalomiocarditis).
Los IFN humanos exhiben una actividad antiviral dependiente de la dosis en ratón que es, en general, de 100 a 1.000 veces menor que la exhibida por la misma cantidad de IFN de ratón (Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644).
La inyección intraperitoneal de ratones con el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) da lugar a una enfermedad mortal rápidamente progresiva caracterizada por la implicación del sistema nervioso central y la encefalitis (Finter NB (1973). Front Biol. 2:295-360). Ambos interferón a de ratón y humano han mostrado ser eficaces en la protección de ratones contra la infección mortal por EMCV (Tovey y Maury (1999). J. IFN Cytoquine Res. 19: 145-155).
Grupos de 20 ratones, Swiss de seis semanas, fueron infectados intraperitonealmente (ip) con 100 x LD_{50} EMCV y fueron tratados una hora más tarde, y luego una vez diariamente durante 3 días a partir de entonces con preparaciones de 2 \mug de IFN\alpha-17 G45R mutado o IFN\alpha-2 silvestre. Un grupo control fue realizado con animales que habían sido tratados con excipiente sólo. Los animales fueron seguidos diariamente respecto a la supervivencia durante 21 días.
Los resultados son representados en la Figura 4 e indican que la tasa de supervivencia relativa de los ratones que habían sido tratados con IFN\alpha-17 G45R mutado es mucho más alta que la tasa de supervivencia de los ratones no tratados, y aún más alta que la observada para los ratones que habían sido tratados con IFN\alpha-2 silvestre. Estos datos demuestran la fuerte actividad antiviral de IFN\alpha-17 G45R mutado in vivo en modelo de ratón.
Todos estos resultados demuestran que IFN\alpha-17 G45R mutado posee propiedades biológicas únicas.
<110> Genodyssee
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos polinucleótidos y polipéptidos del gen de IFNa-17
\vskip0.400000\baselineskip
<130> IFN\alpha-17
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1873
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
2 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcaaggtta cccatctcaa 
\hfill
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttagtcaatc aggatcattg c 
\hfill
21

Claims (27)

1. Un polinucleótido aislado que comprende:
a)
una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, o su secuencia de codificación, y que comprende al menos un SNP que consiste en g771c y 808Ins(a); o
b)
una secuencia de nucleótidos complementaria con un secuencia de nucleótidos en a);
2. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos en a) tiene una identidad de al menos el 99% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.1.
3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende el SNP g771c.
4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 que tiene el SNP G45R codificante.
5. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3;
6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha secuencia de aminoácidos también contiene el SNP G45R codificante.
7. El uso de un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una secuencia de dicho polinucleótido aislado compuesto de 10 a 40 nucleótidos, para identificar, hibridar y/o amplificar un polinucleótido que tiene una identidad del 90 al 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, o su secuencia de codificación, con tal de que cada una de estas secuencias comprenda al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a).
8. El uso de un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una secuencia de dicho polinucleótido aislado compuesto de 10 a 40 nucleótidos, para el genotipado de un polinucleótido que tiene una identidad del 90 al 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1, o su secuencia de codificación, con tal de que cada uno de estas secuencias comprenda al menos uno de los siguientes SNP: g771c, 808Ins(a).
9. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. Una célula huésped, caracterizada porque comprende un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Un método para separar un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 en un medio de cultivo y separar dicho polipéptido del medio de cultivo.
12. Un polipéptido aislado caracterizado porque se codifica por el polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
13. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2;
a condición de que la secuencia de aminoácidos en a) o b) contenga el SNP G45R.
14. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95% con:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2;
a condición de que la secuencia de aminoácidos en a) o b) contenga el SNP G45R.
15. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con:
a)
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; o
b)
la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos incluidos entre las posiciones 24 y 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2;
a condición de que la secuencia de aminoácidos en a) o b) contenga el SNP G45R.
16. Un polipéptido aislado que comprende los aminoácidos de 24 a 189 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, y que tiene el SNP G45R.
17. Un polipéptido aislado que comprende los aminoácidos de 24 a 57 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3.
18. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17, que tiene el SNP G45R codificante.
19. Un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18.
20. Un método para identificar a un agente entre uno o varios compuestos que se analizan que activa o inhibe la actividad de un polipéptido aislado que comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 y que tiene SNP G45R, comprendiendo dicho método:
a)
proporcionar células huésped que comprenden el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9;
b)
poner en contacto dichas células huésped con dichos compuestos que se analizan,
c)
determinar el efecto de activación o inhibición respecto a la actividad de dicho polipéptido mediante el que dicho agente de activación o inhibición es identificado.
21. Un método para identificar a un agente entre uno o varios compuestos que se analizan que activan o inhiben la actividad de un polipéptido aislado que comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3, posiblemente también teniendo el SNP G45R codificante, comprendiendo dicho método:
a)
proporcionar células huésped que comprenden el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9;
b)
poner en contacto dichas células huésped con dichos compuestos que se analizan,
c)
determinar el efecto de activación o inhibición sobre la actividad de dicho polipéptido mediante el que dicho agente de activación o inhibición es identificado.
22. Un método para analizar las características biológicas de un sujeto, que comprende realizar al menos una de las etapas siguientes:
a)
Determinar la presencia o la ausencia del polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el genoma de un sujeto;
b)
Determinar el nivel de expresión del polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un sujeto;
c)
Determinar la presencia o la ausencia del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 en un sujeto;
d)
Determinar la concentración del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 en un sujeto; o
e)
Determinar la funcionalidad del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 en un sujeto.
23. Un agente terapéutico que comprende uno o varios compuestos seleccionados a partir del grupo que consiste en: un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9; una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, comprendiendo dicho vector recombinante; un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18; un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19.
\newpage
24. El uso de uno o varios compuestos seleccionados a partir del grupo que consiste en: un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9; una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10; que comprende dicho vector recombinante; un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18; un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 para la preparación de un medicamento para impedir o tratar una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste en cánceres y tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades inmunológicamente y autoinmunológicamente relacionadas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del metabolismo, enfermedades del sistema nervioso central, trastornos relacionados con tratamientos de quimioterapia, curación de heridas, anemia en paciente dializado, y/o osteoporosis.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que dichas enfermedades infecciosas comprenden infecciones virales incluyendo hepatitis crónica B y C y VIH/SIDA, pulmonías infecciosas, y enfermedades venéreas, tales como verrugas genitales.
26. Un método para determinar asociaciones estadísticamente relevantes entre al menos un SNP seleccionado a partir del grupo que consiste en g771c y 808Ins(a), en el gen de IFN\alpha-17, y una enfermedad o resistencia a una enfermedad que comprende:
a)
Hacer el genotipado de un grupo de individuos;
b)
Determinar la distribución de dicha enfermedad o resistencia a la enfermedad dentro de dicho grupo de individuos;
c)
Comparar los datos del genotipo con la distribución de dicha enfermedad o resistencia a la enfermedad; y
d)
Analizar dicha comparación para asociaciones estadísticamente relevantes.
27. Un método para diagnosticar o determinar un pronóstico de una enfermedad o una resistencia a una enfermedad que comprende detectar in vitro al menos un SNP seleccionado a partir del grupo que consiste en g771c y 808Ins(a), en el gen de IFN\alpha-17.
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