JP2004533240A - ＩＦＮα−１７遺伝子の新規のポリヌクレオチドおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、新規のＳＮＰを含むＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規のポリヌクレオチド、ならびに本発明の少なくとも１つのＳＮＰにより引き起こされる少なくとも１つの突然変異を包含する天然野生型ＩＦＮα−１７タンパク質に由来する新規のポリペプチドに、ならびにそれらの治療的使用に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、仏国特許出願第0105516号（2001年4月24日提出）（表題「Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene IFNa-17」）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
（産業上の利用分野）
本発明は、新規のＳＮＰを含むＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規のポリヌクレオチド、ならびにこれらのＳＮＰにより引き起こされる突然変異を包含する天然野生型ＩＦＮα−１７タンパク質に由来する新規のポリペプチドに、ならびにそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロンα１７遺伝子（本明細書中では以後、ＩＦＮα−１７と呼ぶ）は、以下の出版物に記載されている：
−Olopade et al.: “Mapping of the shortest region of overlap of deletion of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia”; Genomics; 14: 437-443; 1992。
【０００４】
−Lawn R.M. et al.; “DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes”; Science 212 (4499), 1159-1162 (1981)。
【０００５】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankデータベースにおいて寄託番号Ｖ00532で入手可能である。
【０００６】
ＩＦＮαは、それらの細胞抗増殖作用、ならびに抗ウイルスおよび抗寄生生物性応答におけるそれらの関与に関して既知である。
【０００７】
ＩＦＮαは、造血性幹細胞のレベルでのいくつかのその他のサイトカインの発現を阻害すること、ならびにある種の腫瘍の細胞増殖を抑制することも既知である。
【０００８】
ＩＦＮαは、腎臓癌におけるＥＧＦに対する受容体の発現を低減し、ある種のミトコンドリア遺伝子の発現を抑制し、繊維芽細胞、単球およびＢリンパ球の増殖を、特にin vitroで抑制し、そしてＢリンパ球による抗体の合成を遮断することも既知である。
【０００９】
ＩＦＮαは、腫瘍細胞の表面での腫瘍特異的抗原の発現を誘導し、そしてＩＳＲＥ型（インターフェロン刺激性応答素子）のプロモーター領域の制御下に置かれる遺伝子を、これらのＩＳＲＥの特異的転写因子に作用することにより、誘導することも既知である。
【００１０】
ＩＦＮαは、異なる障害および／またはヒト疾患、例えば異なる癌、例えば癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、ならびに肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、心臓血管性疾患、代謝性疾患、例えば免疫系に関連しない疾患、例えば肥満症、感染性疾患、例えばＢ型およびＣ型肝炎、ならびにエイズ、肺炎、潰瘍性結腸炎、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、神経分裂病およびうつ病、組織または器官移植片の拒絶、創傷の治癒、透析患者における貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、慢性関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患および障害、胃腸障害に、あるいは化学療法処置に関連した障害にさえも関与する、ということが既知である。
【００１１】
ＩＦＮαは、ある種の白血病、転移性腎臓癌、ならびにエイズの症例におけるカポジ肉腫のような免疫不全後に出現する腫瘍の治療のために特に用いられる。ＩＦＮαは、その他の種類の腫瘍に対して、そしてある種のウイルス感染に対しても有効である。ＩＦＮαは、性器疣または性病の治療のためにＦＤＡ（食品医薬品局）にもみとめられている。
【００１２】
しかしながらＩＦＮα、特にＩＦＮα−１７は、それらが製剤組成物中に用いられる場合、多数の副作用、例えば急性過敏症（蕁麻疹、気管支収縮、アナフィラキシーショック等）の反応、不整脈、低血圧、癲癇発作、甲状腺機能に伴う問題、インフルエンザ様症候群（発熱、発汗、筋肉痛）等を有する。
【００１３】
さらにＩＦＮαで治療される患者は、抗体を生じてこれらの分子を中和し、したがってそれらの有効性を低減する。
【００１４】
天然野生型ＩＦＮα−１７タンパク質と異なる機能性を有し得るＩＦＮα−１７との新規のポリペプチドおよび新規のポリヌクレオチド類似体を本発明人は見出した。
【００１５】
これらの新規のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは特に、前記の障害または疾患を治療または予防するために、そしてそれらに結び付けられる欠点の全部または一部を回避するために用いられ得る。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は、その第一の目的として、1または数個のＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型性）を含むという点で、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列と異なる新規のポリヌクレオチドを有する。
【００１７】
ヒト対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列は1873個のヌクレオチドで構成され、ヌクレオチド６３９（開始コドン）からヌクレオチド１２０８（終止コドン）までの570個のヌクレオチドのコード配列を含む。
【００１８】
本出願人は、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列中の2つのＳＮＰを同定した。
【００１９】
これらのＳＮＰは、以下の：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）である。
【００２０】
本発明の意味において、前記のＳＮＰの位置決定に対応するナンバリングは、配列番号１のヌクレオチド配列のナンバリングに呼応する、と理解される。
【００２１】
文字ａ、ｔ、ｃおよびｇは、それぞれ窒素塩基アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンに対応する。
【００２２】
最初の文字が野生型ヌクレオチドに対応するのに対して、最後の文字は突然変異化ヌクレオチドに対応する。
【００２３】
したがってＳＮＰｇ７７１ｃは、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列の位置７７１のヌクレオチドグアニン（ｇ）のシトシン（ｃ）への突然変異に相当する。
【００２４】
ＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）は、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列の位置８０８でのヌクレオチドアデニン（ａ）挿入に対応する。
【００２５】
これらのＳＮＰは、出願人の特許出願FR 00 22894（表題“Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and its applications”）（2000年12月6日提出）（参照により本明細書中に引用される）に記載された確定方法を用いて本出願人により同定された。
【００２６】
この特許出願に記載された方法は、個体の無作為集団からの少なくとも1つの個体における1つ（または数個）の先在ＳＮＰ（単数または複数）の同定を可能にする。
【００２７】
本発明の範囲において、例えばコード配列を含むＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列の断片は、無作為様式で選択された個体の集団中の異なる個体から単離された。
【００２８】
次にこれらの断片のシーケンシングは、ＤＨＰＬＣ（「変性高速液体クロマトグラフィー」）による分析後、ヘテロ二重らせんプロフィール（即ち、参照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子配列のものと異なるプロフィール）を有するある種のこれらの試料に関して実行した。
【００２９】
この方法でシーケンシングされた断片は次に、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子の断片のヌクレオチド配列および同定された本発明にしたがうＳＮＰと比較された。
【００３０】
したがってＳＮＰは天然であり、それらの各々は世界の人口の特定の個体中に存在する。
【００３１】
対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子は、最初の23個のアミノ酸を含むシグナルペプチドの切断により、166個のアミノ酸の成熟タンパク質に転換する配列番号２のアミノ酸配列に対応する189個のアミノ酸の未熟タンパク質をコードする。
【００３２】
本発明のコードＳＮＰ、即ちｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ（ａ）は、アミノ酸配列のレベルで、ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の修飾を引き起こす。これらの修飾は、以下のものである：
−ＳＮＰｇ７７１ｃはＩＦＮα−１７遺伝子の未熟タンパク質中の位置４５のアミノ酸グリシン（Ｇ）の突然変異を引き起こす。それは、配列番号２のアルギニン（Ｒ）及び成熟タンパク質の位置２２に対応する。本発明の説明において、それぞれ成熟タンパク質を指すかまたは未熟タンパク質を指すかによってこのＳＮＰによりコードされる突然変異を、区別せずにＧ２２ＲおよびＧ４５Ｒと呼ぶ。
【００３３】
−ＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）はＩＦＮα−１７遺伝子の未熟タンパク質中の位置５７のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）の突然変異を引き起こす。それは配列番号２のアミノ酸配列のグルタミン（Ｑ）ならびに成熟タンパク質の位置３４に対応するさらにヌクレオチド配列上の位置８０８のアデニンの挿入は、タンパク質の翻訳のフレームシフトを引き起こし、これがアミノ酸配列の位置５８の終止コドンの出現を生じる。したがってＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）は、グルタミン５７直後の翻訳停止を引き起こす。結果的に、生じる未熟タンパク質は短縮され、57個のアミノ酸のみから作られる。この多型性は、Ｈ５７Ｑフレーム５７とも呼ばれる。本発明の説明において、それぞれ成熟タンパク質を指すかまたは未熟タンパク質を指すかによってこのＳＮＰによりコードされる突然変異を、区別せずにＨ３４Ｑフレーム３４およびＨ５７Ｑフレーム５７と呼ぶ。
【００３４】
配列番号３のアミノ酸配列は、ＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）を含むヌクレオチド配列によりコードされる突然変異化未熟タンパク質（Ｈ５７Ｑフレーム５７）に対応する。
【００３５】
本発明のＳＮＰの各々は、野生型参照ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較して、本発明にしたがうポリペプチドの空間的配座の修飾を引き起こす。
【００３６】
これらの修飾は、例えばde novoでモデリングツール（例えばSEQFOLD/MSI）、相同（例えばMODELER/MSI）、力場の最小化（例えばDISCOVER, DELPHI/MSI）、および／または分子力学（例えばCFF/MSI）を使用し、当業者に周知である方法にしたがって、コンピューター分子モデリングにより観察され得る。
【００３７】
このようなモデルの一例は、本明細書中で後に実験の節で示される。
【００３８】
コンピューター分子モデリングは、突然変異化成熟タンパク質上の突然変異Ｇ２２Ｒが位置２２周囲のＡＢループの修飾および置換を包含し、これが水素結合の消失を引き起こす、ということを示す。
【００３９】
図１Ａおよび１Ｂは、ＡＢループが折りたたまれず、そして突き出ていることを示す。
【００４０】
天然野生型ＩＦＮα−１７上では、Ｇ２２残基はＲ１４４残基に非常に近い。このＲ１４４残基は、インターフェロンα−２（ＩＦＮα−２）とその受容体との結合に関与することが既知である。ＩＦＮα−２およびＩＦＮα−１７の構造は非常に類似し、ＩＦＮα−１７中のＲ１４４残基はその受容体との結合に関与すると思われる。
【００４１】
したがってＧ２２Ｒ突然変異化タンパク質は、天然野生型ＩＦＮα−１７タンパク質と異なる三次元配座を保有する。
【００４２】
コンピューター分子モデリングは、位置２２のアミノ酸アルギニンの存在が構造の、ならびに特にＩＦＮα−１７とその受容体との結合レベルでの天然野生型タンパク質ＩＦＮα−１７の機能の、有意の修飾に関与する、という予測も可能にする。
【００４３】
本発明にしたがうポリヌクレオチドのゲノタイプ化は、集団中のこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を確定するといったような方式で実行され得る。
【００４４】
本発明のポリペプチドの機能性の確定は、それらの生物学的活性の試験により、同様に実行され得る。
【００４５】
この点において、例えば本発明に従うポリペプチドのシグナル伝達、樹状細胞成熟、Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroまたはin vivo抗ウイルス活性、ダウジ バーキット細胞株における細胞抗増殖活性、ＴＦ−１細胞株における細胞抗増殖活性を測定し、そして市販製品であるイントロンＡの代表的なものとして選択されるＩＦＮα−１７または野生型ＩＦＮα−２と比較し得る。
【００４６】
本発明は、一目的のために、本発明に従うポリヌクレオチドのおよびポリペプチドの使用、ならびに特にある種のヒト障害および／または疾患の予防および治療のために、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドから出発して得られるかおよび／または同定される治療用分子の使用も有する。
【００４７】
本発明の詳細な説明
定義
「対照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトＩＦＮα−１７遺伝子の配列番号１のヌクレオチド配列と理解される。
【００４８】
この配列は、寄託番号V00532でGenBankで入手可能であり、そして以下に記載されている：
−Olopade et al.: “Mapping of the shortest region of overlap of deletion of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia”; Genomics; 14: 437-443; 1992。
【００４９】
−Lawn R.M. et al.; “DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes”; Science 212 (4499), 1159-1162 (1981)。
【００５０】
「天然野生型ＩＦＮα−１７タンパク質」または「野生型ＩＦＮα−１７タンパク質」とは、対照野生型ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされる成熟タンパク質と理解される。天然野生型未熟タンパク質ＩＦＮα−１７は、配列番号２で示されるペプチド配列に対応する。
【００５１】
「ポリペプチド」とは、修飾化または非修飾化ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドと理解される。
【００５２】
ポリヌクレオチドという用語は、例えば一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、1または数個の一本鎖領域(単数または複数)のおよび1または数個の二本鎖領域(単数または複数)の混合物で構成されるＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ならびに1または数個の一本鎖領域(単数または複数)のおよび1または数個の二本鎖領域(単数または複数)の混合物で構成されるＲＮＡを包含する。ポリヌクレオチドという用語は、1または数個の三重鎖領域を含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡも包含し得る。ポリヌクレオチドとは同様に、安定性という理由のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するような方式で修飾された1または数個の塩基を含有するＤＮＡおよびＲＮＡと理解される。修飾化塩基とは、例えば普通でない塩基、例えばイノシンと理解される。
【００５３】
「ポリペプチド」とは、例えばアイスステリックペプチドの場合のように、正常または修飾化ペプチド結合により互いに連結された少なくとも2つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはタンパク質と理解される。
【００５４】
ポリペプチドは、遺伝暗号により限定される20個のアミノ酸以外のアミノ酸で構成され得る。ポリペプチドは同様に、翻訳成熟過程のような天然過程により、または当業者に周知の化学的過程により修飾されたアミノ酸で構成され得る。このような修飾は、文献中で十分に詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチド中、ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中のどこでも、あるいはカルボキシ−またはアミノ末端でさえ、出現し得る。
【００５５】
ポリペプチドは、ユビキチン化後に分枝されるか、または分枝を伴ってまたは伴わずに環状であり得る。この種類の修飾は、当業者に周知である天然または合成翻訳後過程の結果であり得る。
【００５６】
例えばポリペプチド修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ヌクレオチドのまたはヌクレオチド誘導体の共有的固定、脂質または脂質誘導体の共有的固定、ホスファチジルイノシトールの共有的固定、共有的または非共有的架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン生成、ピログルタメート生成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、例えばＰＥＧイル化、ＧＰＩアンカー生成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、スルフェート化、アミノ酸付加、例えばアルギニル化またはユビキチン化を含む、と理解される。このような修飾は、以下の文献中に十分に詳述されている：PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2^nd Ed., T.E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al. “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646およびRattan et al. “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62。
【００５７】
「単離ポリヌクレオチド」または「単離ポリペプチド」とは、ヒト身体から単離されるかまたはそうでなければ技術的過程により産生されるそれぞれ前記のようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドと理解される。
【００５８】
「同一性」とは、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列同一性の測定値と理解される。
【００５９】
同一性とは、当業者に周知の用語であり、文献中に十分に記載されている(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994;およびSEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Aademic Press, 1987参照)。
【００６０】
2つの配列間の同一性および類似性を確定するために一般に用いられる方法は、同様に文献中に十分に記載されている(GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994およびCarillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073参照)。
【００６１】
例えば配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチドは、前記の配列と比較して、100ヌクレオチドに亘って最多で5つの点の突然変異を含有ポリヌクレオチドである。
【００６２】
これらの点の突然変異は、1つ(または数個)のヌクレオチド(単数または複数)の1つ(または数個)の置換(単数または複数)、付加(単数または複数)および／または欠失(単数または複数)であり得る。
【００６３】
同様に、例えば配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、100アミノ酸に亘って最多で5つの点の突然変異を含有ポリペプチドである。
【００６４】
これらの点の突然変異は、1つ(または数個)のアミノ酸(単数または複数)の1つ(または数個)の置換(単数または複数)、付加(単数または複数)および／または欠失(単数または複数)であり得る。
【００６５】
それぞれ以下の：
−少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ(ａ)を含む配列番号１のヌクレオチド配列、
−ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む配列番号２のアミノ酸配列、
−おそらくはＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む配列番号３のアミノ酸配列
と全体的に同一であるというわけではない本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これらの配列の変異体と考えられる。
【００６６】
通常、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つのＳＮＰ：ｇ７７１および８０８Ｉｎｓ(ａ)を含む配列番号１のヌクレオチド配列と同一のまたは実際的に同一の生物学的活性を保有する。
【００６７】
同様にして、通常、本発明のポリペプチドは、以下の：
−ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む配列番号２のアミノ酸配列、および／または
−おそらくはＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む配列番号３のアミノ酸配列
と同一のまたは実際的に同一の生物学的活性を保有する。
【００６８】
本発明の変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発により、または直接合成により得られる。
【００６９】
「ＳＮＰ」とは、ヌクレオチド配列中の塩基の任意の天然変異と理解される。ＳＮＰは、ヌクレオチド配列に関しては、コード、サイレントまたは非コードであり得る。
【００７０】
コードＳＮＰは、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列中にアミノ酸の修飾を包含するヌクレオチド配列のコード配列中に含まれる多型性である。この場合、ＳＮＰという用語は、拡大解釈することにより、同様に、アミノ酸配列中の突然変異にも当てはまる。
【００７１】
サイレントＳＮＰは、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列中にアミノ酸の修飾を包含しないヌクレオチド配列のコード配列中に含まれる多型性である。
【００７２】
非コードＳＮＰは、ヌクレオチド配列の非コード配列中に含まれる多型性である。この多型性は特に、イントロン、スプライシングゾーン、転写プロモーターまたは部位エンハンサー配列中に見出され得る。
【００７３】
「機能的ＳＮＰ」とは、機能性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中に含まれる前記のようなＳＮＰと理解される。
【００７４】
「機能性」とは、ポリペプチドのまたはポリヌクレオチドの生物学的活性と理解される。
【００７５】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能性は、野生型対照遺伝子の、またはこの後者のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生物学的活性の保存、増大、低減または抑制に存する。
【００７６】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能性は同様に、対照野生型遺伝子の、またはこの後者のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生物学的活性の性質の変化に存する。
【００７７】
生物学的活性は特に、受容体との本発明のポリペプチドの親和性または親和性の非存在に結び付けられ得る。
【００７８】
ポリヌクレオチド
本発明は、その第一の目的のために、以下の：
ａ)配列番号１の配列またはそのコード配列(ヌクレオチド６３９〜ヌクレオチド１２０８)と少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、さらに好ましくは少なくとも99％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、少なくとも1つの以下のコードＳＮＰ：ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ（ａ）を含むヌクレオチド配列、または
ｂ)ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列
を含む単離ポリヌクレオチドを有する。
【００７９】
本発明にしたがって、ａ)のヌクレオチド配列は、ＳＮＰｇ７７１ｃまたはＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）あるいはＳＮＰｇ７７１ｃおよびＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）の両方を含み得る。
【００８０】
本発明の意味においては、ナンバリングは、配列番号１のヌクレオチド配列中のＳＮＰの位置確定に対応する。
【００８１】
本発明は同様に、以下の：
ａ)配列番号１のヌクレオチド配列またはそのコード配列であって、これらの配列の各々が少なくとも1つの以下のコードＳＮＰ：ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むと理解されるヌクレオチド配列、あるいは
ｂ)ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列
を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００８２】
好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列またはそのコード配列から成り、これらの配列の各々は、少なくとも1つの以下のコードＳＮＰ：ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むと理解される。
【００８３】
本発明によれば、前記のポリヌクレオチドは、ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ(ａ)からなる群から選択される単一コードＳＮＰを含む。
【００８４】
本発明は、以下の：
ａ)配列番号１のヌクレオチド配列またはそのコード配列であって、これらの配列の各々が少なくとも1つの以下のコードＳＮＰ：ｇ７７１ｃおよび８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むと理解されるヌクレオチド配列、あるいは
ｂ)ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列
の一部から成る単離ポリヌクレオチドにも関する。
【００８５】
前記の単離ポリヌクレオチドは、少なくとも10のヌクレオチドで構成される。
【００８６】
好ましくは前記の単離ポリヌクレオチドは、10〜40ヌクレオチドで構成される。
【００８７】
本発明は、その目的のために、以下の：
ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号２のアミノ酸の配列の位置２４および１８９間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々がコードＳＮＰ：Ｇ４５Ｒを含むと理解される単離ポリヌクレオチドも有する。
【００８８】
本発明の意味において、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒの位置確定に対応するナンバリングは、配列番号２のアミノ酸配列のナンバリングに呼応する、と理解される。
【００８９】
本発明は、その目的のために、以下の：
ａ)配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号３のアミノ酸の配列の位置２４および５７間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド
も有する。
【００９０】
前記のポリペプチドのａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々は、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む。
【００９１】
本発明の好ましい目的によれば、前記のポリペプチドは、前記のような単一コードＳＮＰを含む。
【００９２】
さらに好ましくは、本発明の単離ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしてコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有するポリペプチドをコードする。
【００９３】
さらに好ましくは、本発明の単離ポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含み、おそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒも有するポリペプチドをコードする。
【００９４】
好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子で構成される。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドは、標準ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法により得られる。
【００９６】
ＳＮＰｇ７７１ｃを含む本発明のポリヌクレオチドは同様に、配列番号１のヌクレオチド配列の位置７７１の突然変異化ヌクレオチドシトシン(ｃ)により野生型ヌクレオチドグアニン(ｇ)を修飾することにより、ＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列から出発して、部位特異的突然変異誘発により得られる。
【００９７】
ＳＮＰ８０８Ｉｎｓ（ａ）を含む本発明のポリヌクレオチドは同様に、配列番号１のヌクレオチド配列の位置８０８にアデニンヌクレオチド(ａ)を付加することによりＩＦＮα−１７遺伝子のヌクレオチド配列から出発して、部位特異的突然変異誘発により得られる。
【００９８】
このようにして実行され得る部位特異的突然変異誘発の過程は、当業者に周知である。“Proc. Natl. Acad. Sci. USA”82:488における1985年のTA Kunkelの発表は、特に言及され得る。
【００９９】
単離ポリヌクレオチドは同様に、例えばプレ−、プロ−またはプレ−プロ−タンパク質アミノ酸配列あるいはマーカーアミノ酸配列、例えば6−ヒスチジンペプチドを含み得る。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは同様に、融合タンパク質またはその他の精製物質を得るために、その他のタンパク質またはタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列と関連し得る。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドは同様に、５‘および／または３’非コード配列、例えば転写化または非転写化配列、翻訳化または非翻訳化配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列のようなヌクレオチド配列を、あるいはｍＲＮＡを安定化する配列さえも包含し得る。
【０１０２】
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、緊縮（ストリンジェント）条件下でこのヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るものと定義される。
【０１０３】
「緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは限定するわけではないが、ヌクレオチド配列が少なくとも80％の、好ましくは90％以上の、さらに好ましくは95％以上の、最も好ましくは97％以上の同一性を有する場合に、ハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件、と一般的に理解される。
【０１０４】
緊縮条件は、当業者に周知の方法により、例えば50％ホルムアミド、5 x ＳＳＣ（150 mMのＮａＣｌ、15 mMのクエン酸三ナトリウム）、50 mMのリン酸ナトリウム(ｐＨ＝7.6)、5 x デンハート溶液、10％硫酸デキストランおよび20 μg変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で4℃でポリヌクレオチドをインキュベートし、その後、65℃で0.1 x ＳＳＣでフィルターを洗浄することにより得られる。
【０１０５】
本発明の範囲内では、緊縮ハイブリダイゼーション条件が100％の同一性を有するヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする場合、ヌクレオチド配列はａ)で記載されたようなヌクレオチド配列と厳密に相補的であると考えられる。
【０１０６】
本発明の意味の範囲内では、一ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は少なくとも1つの本発明のアンチセンスＳＮＰを含む、と理解される。
【０１０７】
したがって例えばヌクレオチド配列がＳＮＰｇ７７１ｃを含む場合、その相補的ヌクレオチド配列は、位置７７１と等価の位置にヌクレオチドｇを含む。
【０１０８】
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅
本発明は、その目的のために、配列番号１のヌクレオチド配列との、あるいは必要な場合には、そのコード配列(ヌクレオチド６３９〜ヌクレオチド１２０８)(これらの配列は各々、少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むと理解される)との80〜100％同一性（好ましくは少なくとも90％同一性、さらに好ましくは95％同一性、特に100％同一性）を有するポリヌクレオチドの全部または一部を同定し、ハイブリダイズし、および／または増幅するために、以下の：
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列との80〜100％同一性（好ましくは少なくとも90％同一性、さらに好ましくは95％同一性、特に100％同一性）を有するポリヌクレオチド、および／または
ｂ）少なくとも1つのＳＮＰを含む本発明のポリヌクレオチド
の全部または一部の使用も有する。
【０１０９】
ＳＮＰのゲノタイプ化および頻度の確定
本発明は同様に、その目的のために、配列番号１のヌクレオチド配列との、あるいは必要な場合には、そのコード配列(ヌクレオチド６３９〜ヌクレオチド１２０８)(これらの配列は各々、少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むと理解される)との80〜100％同一性（好ましくは少なくとも90％同一性、さらに好ましくは95％同一性、特に100％同一性）を有するポリヌクレオチドの全部または一部のゲノタイプ化のために、以下の：
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列との80〜100％同一性（好ましくは少なくとも90％同一性、さらに好ましくは95％同一性、特に100％同一性）を有するポリヌクレオチド、および／または
ｂ）少なくとも1つのＳＮＰを含む本発明のポリヌクレオチド
の全部または一部の使用も有する。
【０１１０】
本発明によれば、ゲノタイプ化は、個体または個体の集団に関して実行され得る。
【０１１１】
本発明の意味の範囲内では、ゲノタイプ化は、個体または個体の集団のゲノタイプの確定のための過程と定義される。ゲノタイプは、１つまたはそれ以上の特定遺伝子座に存在する対立遺伝子から成る。
【０１１２】
「個体の集団」とは、無作為または非無作為方式で選択される個体の一群と理解される。これらの個体は、ヒト、動物、微生物または植物であり得る。
【０１１３】
通常は、個体の群は、少なくとも10の個体、好ましくは100〜300の個体を含む。
【０１１４】
個体は、それらの種族により、またはそれらの表現型により、特に以下の障害および／または疾患に影響を及ぼされるものにより選択され得る：癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、ならびに肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、心臓血管性疾患、代謝性疾患、例えば免疫系に関連しない疾患、例えば肥満症、感染性疾患、特にウイルス感染、例えばＢ型およびＣ型肝炎ならびにエイズ、肺炎、潰瘍性結腸炎、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、神経分裂病およびうつ病、組織または器官移植片の拒絶、創傷の治癒、透析患者における貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、慢性関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患および障害、胃腸障害、あるいは化学療法処置に関連した障害。
【０１１５】
本発明の機能的ＳＮＰは、好ましくは個体の一集団においてゲノタイプ化される。
【０１１６】
ＳＮＰをゲノタイプ化するために実行され得る多数の技法が存在する(特にKwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. “High-throughput genotyping assay approaches”参照)。これらの技法は、4つの以下の原理のうちの1つに基づいている：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチド伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの結繋、あるいは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの切断。これらの技法の各々は、直接または分極蛍光の測定、あるいは質量分析法といった検出系と連結され得る。
【０１１７】
ゲノタイプ化は特に、分極蛍光スキャナーと一緒に、熱ｄｄＮＴＰ（異なるフルオロフォアにより標識された2つの異なるｄｄＮＴＰ）および冷ｄｄＮＴＰ（2つの非標識化ｄｄＮＴＰ）を用いてミニシーケンシングすることにより、実行され得る。分極蛍光の読取りを伴うミニシーケンシングプロトコール(ＦＰ−ＴＤＩ技法または蛍光分極鋳型−直接染料−ターミネーター取込み)は、当業者に周知である。それは、各個体のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による増幅後に得られる物質に関して実行され得る。このＰＣＲ産物は、試験されたＳＮＰを含有するポリヌクレオチド遺伝子領域に及ぶよう選択される。ＰＣＲサーモサイクラー中での最終工程後、フルオロフォア特異的励起および発光フィルターを用いることによる標識化塩基の読取りのために、プレートを分極化蛍光スキャナー上に載せる。標識化塩基の強度値がグラフで報告される。
【０１１８】
ＰＣＲ増幅のために、本発明の一ＳＮＰの場合、本発明のＳＮＰの位置によって当業者により、それぞれセンスおよびアンチセンスプライマーが容易に選択され得る。
【０１１９】
例えばＰＣＲ増幅のためのセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、それぞれ以下のとおりである：
配列番号４：センスプライマー：TTCAAGGTTACCCATCTCAA
配列番号５：アンチセンスプライマー：TTAGTCAATCAGGATCATTGC
ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列中のヌクレオチド５９１からヌクレオチド１２４５までの655ヌクレオチドの長さを有する断片の増幅を可能にする。
【０１２０】
個体の集団中のＳＮＰを含む遺伝子によりコードされる各対立遺伝子の頻度(対立遺伝子頻度)の統計学的分析が次に達成され、これが、異なる亜群における、特に、必要な場合には、個体のこの集団を構成する多様な種族群におけるそれらの衝撃およびそれらの分布の重要性の確定を可能にする。
【０１２１】
試験集団で観察された異なる対立遺伝子の分布頻度を概算するために、ゲノタイプ化データが分析される。対立遺伝子頻度の算定は、ＳＡＳ−ｓｕｉｔｅ(登録商標)(SAS)またはＳＰＬＵＳ(登録商標)（MathSoft）のようなソフトウエアの助けを借りて実行され得る。個体の集団の異なる種族群と交差する本発明のＳＮＰの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウエアＡＲＬＥＱＵＩＮ(登録商標)およびＳＡＳ−ｓｕｉｔｅ(登録商標)により実行され得る。
【０１２２】
遺伝子マーカーとしての本発明のＳＮＰ
遺伝子の機能的配列(例えばプロモーター、スプライシング部位、コード領域)を修飾するＳＮＰは疾患感受性または耐性に直接関連すると思われるが、一方、すべてのＳＮＰ(機能的または非機能的)が、これらの疾患状態に関与する1または数個の遺伝子の同定のための有益なマーカーを提供し得るし、したがってこれらの疾患状態に間接的に関連し得る(Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22: 231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1: 39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899参照)。
【０１２３】
したがって本発明は、ＩＦＮα−１７遺伝子のポリヌクレオチド中に少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)を含むデータバンクにも関する。
【０１２４】
前記のＳＮＰは配列番号１のヌクレオチド配列にしたがって番号付けされる、ということは十分理解される。
【０１２５】
このデータバンクは、以下の：
(ｉ)ＩＦＮα−１７遺伝子のポリヌクレオチド中の少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)、および
(ｉｉ)疾患または疾患に対する耐性
間の統計学的関連性を確定するために分析され得る。
【０１２６】
さらに好ましくは本発明は、ＩＦＮα−１７遺伝子中のｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)から成る群から選択される少なくとも1つのＳＮＰと疾患または疾患に対する耐性との間の統計学的関連性を確定するための方法であって、以下の：
ａ）個体の群をゲノタイプ化し、
ｂ）前記個体群内の前記疾患または疾患に対する耐性の分布を確定し、
ｃ）ゲノタイプデータを前記疾患または疾患に対する耐性の分布と比較し、そして
ｄ）統計学的関連性に関して前記比較を分析する
ことを包含する方法に関する。
【０１２７】
本発明は、疾患または疾患に対する耐性に関する診断／予後キットを開発するための、ＩＦＮα−１７遺伝子のポリヌクレオチド中の少なくとも1つの以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)の使用に関する。
【０１２８】
前記のような本発明のＳＮＰは、疾患または疾患に対する耐性に、直接または間接的に関連し得る。
【０１２９】
好ましくは、これらの疾患は前記のように定義されるものであり得る。
【０１３０】
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、その目的のために、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターも有する。
【０１３１】
多数の発現系、例えば染色体、エピソームおよび誘導化ウイルスが用いられ得るが、これらに限定されない。特に、用いられる組換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入素子、酵母染色体素子、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネ痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスに由来し得る。
【０１３２】
これらの組換えベクターは同様に、コスミドまたはファジミド誘導体であり得る。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法により、例えばMOLECULAR CLONING: A LABORATORY MENUAL, Sambrook et al., 4^th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001に記載された方法により、組換え発現ベクター中に挿入され得る。
【０１３３】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチドの発現および転写を、そして本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含み得るが、これらの配列は用いられる宿主細胞によって選択される。
【０１３４】
したがって例えば適切な分泌シグナルは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが小胞体の管腔の方向に、膜上の細胞周囲間隙の方向に、または細胞外環境の方向に向けられるよう、組換えベクター中に組み込まれ得る。
【０１３５】
本発明は、その目的のために、本発明の組換えベクターを含む宿主細胞も有する。
【０１３６】
宿主細胞中の組換えベクターの導入は、当業者に周知の方法により、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, DMGPPおよびMOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL(上記)に記載された方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、電気穿孔、形質導入または感染により実行され得る。
【０１３７】
宿主細胞は、例えば細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ球菌属、大腸菌または枯草菌、真菌属の細胞、例えば酵母細胞ならびにアスペルギルス属、ストレプトミセス属の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２の、そしてスポドプテラSpodopteraＳｆ９の細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞および治療される被験者のヒト細胞、または植物細胞でもあり得る。
【０１３８】
宿主細胞は、本明細書中で後述されるように、例えば本発明のポリペプチドを発現するために、または製剤組成物中に活性物質として用いられ得る。
【０１３９】
ポリペプチド
本発明は、その目的のために、以下の：
ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号２のアミノ酸の位置２４および１８９間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列
であって、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々がコードＳＮＰ：Ｇ４５Ｒを含有すると理解されるアミノ酸配列の全部または一部との少なくとも80％同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、さらに好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドも有する。
【０１４０】
本発明のポリペプチドは同様に、以下の：
ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号２のアミノ酸の位置２４および１８９間に含まれるアミノ酸を含有するアミノ酸配列
であって、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々がコードＳＮＰ：Ｇ４５Ｒを含有すると理解されるアミノ酸配列の全部または一部を含み得る。
【０１４１】
本発明のポリペプチドは特に、以下の：
ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号２のアミノ酸の位置２４および１８９間に含まれるアミノ酸を含有するアミノ酸配列
であって、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々がコードＳＮＰ：Ｇ４５Ｒを含有すると理解されるアミノ酸配列の全部または一部からなる。
【０１４２】
本発明は、その目的のために、以下の：
ａ)配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号３のアミノ酸の位置２４および５７間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列
であって、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列の各々がコードＳＮＰ：Ｈ５７Ｑフレーム５７を含有すると理解されるアミノ酸配列の全部または一部との少なくとも80％同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、さらに好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドも有する。
【０１４３】
本発明のポリペプチドは同様に、以下の：
ａ)配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号３のアミノ酸の位置２４および５７間に含まれるアミノ酸を含有するアミノ酸配列
の全部または一部を含み得る。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは特に、以下の：
ａ)配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ)配列番号３のアミノ酸の位置２４および５７間に含まれるアミノ酸を含有するアミノ酸配列
の全部または一部から成り得る。
【０１４５】
前記ポリペプチドのａ)およびｂ)下のアミノ酸配列の各々は、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒも含み得る。
【０１４６】
好ましくは本発明のポリペプチドは、Ｇ４５Ｒ、Ｈ５７Ｑフレーム５７からなる群から選択される単一コードＳＮＰを含有する。
【０１４７】
さらに好ましくは本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜１８９を含み、コードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する。
【０１４８】
さらに好ましくは本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜５７を含む。
【０１４９】
本発明は同様に、その目的のために、前記の宿主細胞が培地中で培養され、そして前記のポリペプチドが培地から単離される前記のポリペプチドの製造方法を有する。
【０１５０】
ポリペプチドは、当業者に周知の方法により、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノール、アセトンまたはトリクロロ酢酸の助けによる沈降、酸抽出；イオン交換クロマトグラフィー；ホスホセルロースクロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたは排除クロマトグラフィーにより、宿主細胞の培地から出発して精製され得る。
【０１５１】
「培地」とは、本発明のポリペプチドが単離され、または精製される培地と理解される。この培地は、細胞外培地および／または細胞溶解物で構成され得る。当業者に周知の技法は同様に、前記のポリペプチドのコンホメーションが単離または精製中に変更された場合、これらがポリペプチドに活性コンホメーションを戻すのを可能にする。
【０１５２】
抗体
本発明は、その目的のために、免疫特異的抗体の産生方法も有する。
【０１５３】
「抗体」とは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、ヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片、例えばＦａまたは免疫グロブリン発現ライブラリー産物と理解される。
【０１５４】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチドを用いた動物の免疫感作により得られる。
【０１５５】
本発明は、前記のような本発明のポリペプチドに対する免疫特異的抗体にも関する。
【０１５６】
本発明のポリペプチド、その断片の1つ、類似体、その変異体の1つ、またはこのポリペプチドを発現する細胞も、免疫特異的抗体を産生するために用いられ得る。
【０１５７】
「免疫特異的」という用語は、抗体が当業界で既知のその他のペプチドより良好な本発明のポリペプチドに対する親和性を保有する、ということを意味する。
【０１５８】
免疫特異的抗体は、当業者に周知の方法による、哺乳類における、好ましくは非ヒトにおける、本発明のポリペプチドの、その断片の1つの、類似体の、またはエピトープ断片の、あるいはこのポリヌクレオチドを発現する細胞の投与により産生され得る。モノクローナル抗体の調製のためには、細胞株から出発する、例えばハイブリドーマ技法（Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72）、ならびにＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole et al., “The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer,” in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series）（eds. R.A. Reisfeld and S. Sell）, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96）といったような抗体産生のための典型的方法が用いられ得る。
【０１５９】
例えば米国特許第4,946,778号に記載されているような一本鎖抗体産生の技法が同様に用いられ得る。
【０１６０】
例えばトランスジェニック動物、例えばマウスは同様に、ヒト化抗体を産生するために用いられ得る。
【０１６１】
本発明のポリペプチドと相互作用する作用物質
本発明は同様に、その目的のために、本発明のポリペプチドを活性化または抑制する作用物質の同定方法であって、以下の：
ａ）少なくとも1つのコードＳＮＰを含有する本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターの調製、
ｂ）ａ)による組換えベクターを含む宿主細胞の調製、
ｃ）ｂ)による宿主細胞と試験される作用物質との接触、ならびに
ｄ）試験される作用物質により生成される活性化または抑制作用の確定
を包含する方法を有する。
【０１６２】
本発明のポリペプチドは、それと相互作用する化合物をスクリーニングするための方法にも用いられ得る。
【０１６３】
これらの化合物は、本発明のポリペプチドの固有の活性の活性剤(アゴニスト)または阻害剤(アンタゴニスト)であり得る。これらの化合物は同様に、本発明のポリペプチドのリガンドまたは基質であり得る(Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2), Chapter 5 (1991)参照)。
【０１６４】
概して、このような方法を実行するためには、先ず、本発明のポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を産生するのが望ましい。このような細胞は、例えば哺乳類、酵母、昆虫、例えばショウジョウバエ、または細菌、例えば大腸菌の細胞であり得る。
【０１６５】
これらの細胞またはこれらの細胞の膜抽出物が次に、試験される化合物の存在下に置かれる。
【０１６６】
次に、試験される化合物と本発明のポリペプチドとの結合能力、ならびに機能的応答の抑制または活性化が観察され得る。
【０１６７】
前記の方法の過程ｄ)は、直接的または間接的に標識される試験さるべき作用物質を用いて実行され得る。それは、標識化または非標識化作用物質ならびに標識化競合体作用物質を用いることによる競合試験も包含する。
【０１６８】
同様に、試験される作用物質が、検出されるシグナルにより適切に選択される検出手段を用いることにより本発明のポリペプチドを発現する細胞において活性化または抑制シグナルを生じるか否かが確定され得る。
【０１６９】
このような活性剤または阻害剤はポリヌクレオチドであり得るし、そしてある種の場合には、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチド、例えばタンパク質または抗体であり得る。
【０１７０】
本発明は、その目的のために、本発明のポリペプチドにより活性化または抑制される作用物質の同定方法であって、以下の：
ａ）少なくとも1つのコードＳＮＰを含有する本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターの調製、
ｂ）ａ)による組換えベクターを含む宿主細胞の調製、
ｃ）試験される作用物質の存在下にｂ)による宿主細胞を置くこと、ならびに
ｄ）試験される作用物質に及ぼすポリペプチドにより生成される活性化または抑制作用の確定
を包含する方法も有する。
【０１７１】
本発明のポリペプチドにより活性化または抑制される作用物質は、このポリペプチドの存在下での活性化または抑制によりそれぞれ応答する作用物質である。
【０１７２】
本発明のポリペプチドにより直接的にまたは間接的に活性化または抑制される作用物質は、ポリペプチド、例えば膜または核受容体、キナーゼ、さらに好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子あるいはポリヌクレオチドから成り得る。
【０１７３】
疾患の検出
本発明は、目的のために、被験者における本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの生物学的特性の分析方法であって、以下の：
ａ）被験者のゲノム中の本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在を確定し、
ｂ）被験者における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを確定し、
ｃ）被験者における本発明のポリペプチドの存在または非存在を確定し、
ｄ）被験者における本発明のポリペプチドの濃度を確定し、および／または
ｅ）被験者における本発明のポリペプチドの機能性を確定する
過程の少なくとも１つを包含する方法も有する。
【０１７４】
これらの生物学的特性は、被験者においてまたは被験者からの試料中で分析され得る。
【０１７５】
これらの生物学的特性は、遺伝子診断を実行することを、そして被験者が、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの存在に関連した疾患、不快または障害の発症の影響を受け、または影響される危険があり、あるいは反対にそれらに対する部分的耐性を示すか否かを確定することを可能にし得る。
【０１７６】
これらの疾患は、障害および／またはヒト疾患、例えば癌および腫瘍、感染性疾患、性病、免疫学的関連疾患および／または自己免疫疾患および障害、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患、ならびに化学療法慮地に関連した障害であり得る。
【０１７７】
前記の癌および腫瘍としては、転移性腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む癌が挙げられる。
【０１７８】
前記の感染性疾患としては、ウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含むウイルス感染が挙げられる。
【０１７９】
前記の免疫学的および自己免疫学的関連疾患としては、組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられ得る。
【０１８０】
前記の代謝性疾患としては、非免疫関連疾患、例えば肥満症が挙げられ得る。
【０１８１】
前記の中枢神経系の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病が挙げられ得る。
【０１８２】
前記の疾患および障害は、創傷の治癒、透析患者における貧血、および骨粗鬆症も包含し得る。
【０１８３】
この方法は、本発明のＳＮＰによりコードされる突然変異体対立遺伝子の、被験者中での、存在に関連した疾患の遺伝子診断または疾患に対する耐性も可能にする。
【０１８４】
好ましくは過程ａ)においては、前記のような少なくとも1つのコードＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの存在または非存在が検出されるよう意図される。
【０１８５】
ポリヌクレオチドの検出は、試験される被験者からの生物学的試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から開始して、あるいは試験される被験者の生検または剖検から開始して、実行され得る。ゲノムＤＮＡは、直接的または例えばＰＣＲ増幅後の検出のために用いられ得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは同様に、類似の方法で用いられ得る。
【０１８６】
次に、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、被験者のゲノム中で検出されたヌクレオチド配列と比較することが出来る。
【０１８７】
ヌクレオチド配列の比較は、シーケンシングにより、ＤＮＡハイブリダイゼーション法により、変性剤を用いたまたは用いない電気泳動ゲル上でのＤＮＡ断片の移動度差により、あるいは融解温度差により実行され得る(Myers et al., Science (1985) 230: 1242参照)。的確な点でのヌクレオチド配列の構造中のこのような修飾は同様に、ヌクレアーゼ保護試験、例えばＲＮアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼにより、酵素消化により、あるいは化学的切断剤によっても明示され得る(Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401参照)。本発明のポリヌクレオチド断片を含むオリゴヌクレオチドプローブは同様に、シーケンシングを実施するために用いられ得る。
【０１８８】
当業者に周知の多数の方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を確定するために、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝子可変性を同定するために用いられ得る(Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613参照)。
【０１８９】
過程ｂ)において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者に周知の方法により、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロットおよびその他のハイブリダイゼーション法により、このポリヌクレオチドによりコードされる(そしてポリペプチドをコードする)ＲＮＡのレベルを定量することにより、測定され得る。
【０１９０】
過程ｃ）およびｄ）において、被験者または被験者からの試料中の本発明のポリペプチドの存在または非存在、ならびに濃度は、周知の方により、例えばラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ検定により確定され得る。
【０１９１】
過程ｄ）に続いて、本発明のポリペプチドの確定濃度が、被験者において通常見出される天然野生型タンパク質濃度と比較され得る。
【０１９２】
前記で引き起こされた疾患、不快または障害に対する感受性、または反対に耐性を生じるより高いまたは低い閾値を、従来技術出版物の助けを借りて、または例えば前記のような慣用的試験または検定により、当業者は同定し得る。
【０１９３】
過程ｅ)では、当業者に周知の方法により、例えば前記のようなin vitro試験により、または前記のポリペプチドを発現する宿主細胞の使用により、本発明のポリペプチドの機能性の確定が実行され得る。
【０１９４】
治療用化合物および疾患の治療
本発明は、その目的のために、活性作用物質として、本発明のポリペプチドを含有する治療用化合物も有する。
【０１９５】
本発明は、異なるヒト障害および／または疾患の予防または治療を意図された治療用化合物の製造のための本発明のポリペプチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害および／またはヒト疾患、例えば癌および腫瘍、感染性疾患、性病、免疫学的関連疾患および／または自己免疫疾患および障害、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患、ならびに化学療法慮地に関連した障害であり得る。
【０１９６】
前記の癌および腫瘍としては、転移性腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む癌が挙げられる。
【０１９７】
前記の感染性疾患としては、ウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含むウイルス感染が挙げられる。
【０１９８】
前記の免疫学的および自己免疫学的関連疾患としては、組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられ得る。
【０１９９】
前記の代謝性疾患としては、非免疫関連疾患、例えば肥満症が挙げられ得る。
【０２００】
前記の中枢神経系の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病が挙げられ得る。
【０２０１】
前記の疾患および障害は、創傷の治癒、透析患者における貧血、および骨粗鬆症も包含し得る。
【０２０２】
好ましくは本発明のポリペプチドは、異なるヒト障害および／または疾患、例えばある種のウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリーセル白血病および慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、類癌腫、悪性黒色腫、転移性腎臓癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびにエイズの症例におけるカポジ肉腫のような免疫不全後に出現する腫瘍、ならびに性器疣または性病の予防または治療のために意図された治療用化合物の製造のためにも用いられ得る。
【０２０３】
本発明のポリペプチドを生成することを可能にするある種の化合物、ならびにこのポリペプチドによりまたはそれから生成または同定される化合物は、同様に、ヒト身体の治療的処置のために、即ち治療用化合物として用いられ得る。
【０２０４】
これが、本発明が、一目的のために、活性作用物質として、少なくとも1つの前記のコードＳＮＰを含有する本発明のポリヌクレオチド、前記の組換えベクター、前記の宿主細胞および／または前記の抗体を含有する薬剤も有する理由である。
【０２０５】
本発明は、異なるヒト障害および／または疾患の予防または治療を意図された薬剤の製造のための、少なくとも1つの前記のコードＳＮＰを含有する本発明のポリヌクレオチド、前記の組換えベクター、前記の宿主細胞および／または前記の抗体の使用にも関する。これらの疾患は、障害および／またはヒト疾患、例えば癌および腫瘍、感染性疾患、性病、免疫学的関連疾患および／または自己免疫疾患および障害、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患、ならびに化学療法処置に関連した障害であり得る。
【０２０６】
前記の癌および腫瘍としては、転移性腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む癌が挙げられる。
【０２０７】
前記の感染性疾患としては、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含むウイルス感染が挙げられる。
【０２０８】
前記の免疫学的および自己免疫学的関連疾患としては、組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられ得る。
【０２０９】
前記の代謝性疾患としては、非免疫関連疾患、例えば肥満症が挙げられ得る。
【０２１０】
前記の中枢神経系の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病が挙げられ得る。
【０２１１】
前記の疾患および障害は、創傷の治癒、透析患者における貧血、および骨粗鬆症も包含し得る。
【０２１２】
好ましくは本発明は、異なるヒト障害および／または疾患、例えばある種のウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリーセル白血病および慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、類癌腫、悪性黒色腫、転移性腎臓癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびにエイズの症例におけるカポジ肉腫のような免疫不全後に出現する腫瘍、ならびに性器疣または性病の予防または治療のために意図された治療用化合物の製造のための、少なくとも1つの前記のコードＳＮＰ含有する本発明のポリヌクレオチド、前記の組換えベクター、前記の宿主細胞および／または前記の抗体の使用にも関する。
【０２１３】
活性作用物質として有用な本発明のポリペプチドおよび本発明のその他の化合物の投与量は、化合物の選択、治療適応症、投与方式、処方物の性質、被験者の性質および医師の判断によっている。
【０２１４】
それが活性作用物質として用いられる場合、本発明のポリペプチドは一般に、1〜15 M IU(国際単位)の範囲の用量で投与される。推奨用量は、1〜12ヶ月間、1〜5回、皮下または筋肉内経路により投与され得る。
【０２１５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、少なくとも1つの前記のコードＳＮＰを含有する本発明のポリペプチド、前記の組換えベクター、前記の宿主細胞および／または前記の抗体のような少なくとも1つの前記の化合物を活性作用物質として、製薬上許容可能な賦形剤と共に含有する製剤組成物も、一目的として有する。
【０２１６】
これらの製剤組成物中では、活性作用物質は、生理学的有効用量で有益に存在する。
【０２１７】
これらの製剤組成物は、例えば固体または液体であり得るし、あるいはヒト薬剤に一般に用いられる製剤形態、例えば被覆錠剤、ゲルキャップ、顆粒、カラメル、座薬、ならびに好ましくは注射用調製物および注射用粉末中に存在し得る。これらの製剤形態は、通常の方法により調製され得る。
【０２１８】
活性作用物質(単数または複数)は、製剤組成物中に通常用いられる賦形剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性ビヒクル、動物または植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤または乳化剤、防腐剤中に混入され得る。
【０２１９】
本発明の活性作用物質(単数または複数)は、単独で、またはその他の化合物、例えば治療用化合物、例えばその他のサイトカイン、例えばインターロイキンまたはインターフェロンと組合せて用いられ得る。
【０２２０】
製剤組成物の異なる処方物は、投与方式によって適合される。
【０２２１】
製剤組成物は、当業者に既知の投与の異なる経路により投与され得る。
【０２２２】
本発明は同様に、一目的のために、活性作用物質として、少なくとも1つの前記の化合物、例えば本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドの全部または一部、前記の組換えベクター、前記の宿主細胞および／または前記の抗体を、適切な製薬上許容可能な賦形剤と共に含有する診断用組成物を有する。
【０２２３】
この診断用組成物は、例えば適切な賦形剤、例えば緩衝剤および防腐剤のような診断用組成物中に一般的に用いられるものを含有し得る。
【０２２４】
本発明は同様に、一目的として、本発明のポリペプチドの、被験者中での、発現のまたは活性の増大を増大するよう意図された治療用化合物を調整するための、以下の：
ａ）治療的有効量の本発明のポリペプチドの、および／または
ｂ）本発明のポリヌクレオチドの、および／または
ｃ）前記の治療される被験者からの宿主細胞の
使用を有する。
【０２２５】
したがって、本発明のポリペプチドの発現のまたは活性の増大を必要とする被験者を治療するためには、いくつかの方法が考えられる。
【０２２６】
治療的有効量の本発明のポリペプチドを、製薬上許容可能な賦形剤とともに、被験者に投与することができる。
【０２２７】
同様に、被験者への本発明のポリヌクレオチドの投与により、本発明のポリペプチドの内因性産生を増大することが可能である。例えばこのポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクター中に挿入され得る。このようなベクターは、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターにより感染されていた細胞から出発して、形質導入細胞が、当該遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するような方式で、単離され得る(Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)参照)。
【０２２８】
本発明にしたがって、少なくとも1つの前記のようなコードＳＮＰを含有するポリヌクレオチドが、好ましくは用いられる。
【０２２９】
同様に、被験者に、彼に属する宿主細胞を投与することが可能であるが、これらの宿主細胞は、前記のような本発明のポリペプチドを発現するよう、あらかじめ採取され、修飾されていた。
【０２３０】
本発明は同様に、本発明のポリペプチドの、被験者中での、発現または活性を低減するよう意図された治療用化合物を調製するために、以下の：
ａ）治療的有効量の前記の免疫特異的抗体の、および／または
ｂ）本発明のポリヌクレオチドの発現の抑制を可能にするポリヌクレオチドの
使用に関する。
【０２３１】
したがって、治療的有効量の前記のような阻害剤および／または抗体を、おそらくは製薬上許容可能な賦形剤と組合せて、被験者に投与され得る。
【０２３２】
同様に、本発明のポリヌクレオチドの発現の抑制を可能にする本発明の相補的ポリヌクレオチドの被験者への投与により、本発明のポリペプチドの内因性産生を低減し得る。
【０２３３】
好ましくは、前記のような少なくとも1つのコードＳＮＰを含有する相補的ポリヌクレオチドが用いられ得る。
【０２３４】
本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列(ただし、前記のヌクレオチド配列は以下のＳＮＰ：ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ(ａ)のうちの１つを含む)との95％同一性（好ましくは97％同一性、さらに好ましくは99％同一性、特に100％同一性）を有するヌクレオチド配列の前記の患者のゲノム中の存在に関連したＩＦＮα−１７変異体により引き起こされる障害または疾患を有する患者の予防または治療のための薬剤の調製のためのＩＦＮα−１７タンパク質の使用にも関する。
【０２３５】
好ましくは前記の薬剤は、癌および腫瘍、感染性疾患、性病、免疫学的関連疾患および／または自己免疫疾患および障害、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患ならびに化学療法処置と関連した障害からなる群から選択される疾患のうちの1つの予防または治療のために用いられる。
【０２３６】
前記の癌および腫瘍としては、転移性腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む癌が挙げられる。
【０２３７】
前記の感染性疾患としては、ウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含む感染が挙げられる。
【０２３８】
前記の免疫学的および自己免疫学的関連疾患としては、組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられ得る。
【０２３９】
前記の代謝性疾患としては、非免疫関連疾患、例えば肥満症が挙げられ得る。
【０２４０】
前記の中枢神経系の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病が挙げられ得る。
【０２４１】
前記の疾患および障害は、創傷の治癒、透析患者における貧血、および骨粗鬆症も包含し得る。
【０２４２】
本発明のＳＮＰｇ７７１ｃを含むＩＦＮα−１７ポリペプチドの模倣化合物
本発明は、以下の：
ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の位置２４および１８９間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列
であるが、但し、ａ)およびｂ)のアミノ酸配列がＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含むアミノ酸配列
のポリペプチドのものと実質的に同様の生物学的活性を有する新規の化合物にも関する。
【０２４３】
前記の生物学的活性は、例えば実験の部に記載されたような樹状細胞成熟、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitroまたはin vivo抗ウイルス活性、ＴＦ−１細胞株における細胞抗増殖活性、またはダウディ バーキット細胞株における細胞抗増殖活性を測定することにより、評価され得る。
【０２４４】
実験の節で言及されているように、野生型ＩＦＮα−２との比較において、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７は、以下の：
−ＣＤ４＋Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ放出を刺激するより高い能力
−ＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０放出を刺激するより高い能力
−単球によるＩＬ−１０およびＩＬ−１２放出を刺激するより低い能力
−ＴＦ−１細胞における同様の抗増殖活性
−ダウディ バーキット細胞株におけるより高い抗増殖活性
−ＶＳに感染された細胞培養中のin vitroでのより高い抗ウイルス活性
−ＥＭＣＶマウスモデルにおけるin vivoでのより高い抗ウイルス活性
を保有する。
【０２４５】
これも実験の節で言及されるように、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７は、野生型ＩＦＮα−１７のものと比較して、ダウディ バーキット細胞株におけるより低い細胞抗増殖活性を保有する。
【０２４６】
前記のような本発明の新規の化合物は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７のものと実質的に同様の生物学的活性を保有し得る。
【０２４７】
前記の化合物は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ放出、ＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＩＬ−１０放出、in vitroでの抗ウイルス活性、またはin vivoでの抗ウイルス活性のような生物学的活性も有し得るが、これは、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の活性より高くさえある。
【０２４８】
前記の化合物は、単球によるＩＬ−１０およびＩＬ−１２放出のような生物学的活性も有し得るが、これは、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の活性より低くさえある。
【０２４９】
前記の化合物は、生化学的化合物、例えばポリペプチドまたはペプチド、または有機化学化合物、例えば合成ペプチド模倣物であり得る。
【０２５０】
本発明は、前記のような化合物の同定のための、Ｇ４５Ｒ ＳＮＰを含有する本発明のポリペプチドの使用にも関する。
【０２５１】
本発明は、本発明の化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）試験される化合物の生物学的活性、例えば樹状細胞成熟、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、ＴＦ−１細胞株における細胞抗増殖活性、ダウディ バーキット細胞株における細胞抗増殖活性、in vitroまたはin vivo抗ウイルス活性を確定し、
ｂ）以下の：
ｉ）試験される化合物の過程ａ)で確定された活性を、
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の、または配列番号２の位置２４〜１８９の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸配列はＧ４５Ｒ ＳＮＰを含む)のポリペプチドの活性と比較し、そして
ｃ）過程ｂ)で実行された比較に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列の、または配列番号２の位置２４〜１８９の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸配列はＧ４５Ｒ ＳＮＰを含む)のポリペプチドの活性と比較して、試験される化合物が実質的に同様の活性を有するか、あるいはそれより低いまたは高い活性を有するかを確定する過程を包含する方法にも関する。
【０２５２】
好ましくは試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、ハイスループットスクリーニングから予め同定され、あるいは配列番号２のアミノ酸配列の、または配列番号２のアミノ酸配列の位置２４および１８９間に含有されるアミノ酸を含むアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸配列はＧ４５Ｒ ＳＮＰを含む)のポリペプチドの構造と同一の三次元構造を有するようコンピューター支援薬剤設計により設計され得る。
【０２５３】
化合物を同定し、設計するための方法は、当業者に周知である。
【０２５４】
これらの方法を照会する出版物を以下に示す：
−Silverman R.B. (1992). “Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”. Academic Press, 1^st edition (January 15, 1992).
−Anderson S and Chiplin J. (2002). “Structural genomics; shaping the future of drug design” Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
−Selick HE, Beresford AP, Tarbit ,MH. (2002). “The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery”. Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
−Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). “Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis”. Comput. Chem. 26(1): 5-14.
−Kauvar L.M. (1996). “Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects” 14(6): 709.
本発明の化合物は、癌および腫瘍、感染性疾患、性病、免疫学的関連疾患および／または自己免疫疾患および障害、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患ならびに化学療法処置と関連した障害からなる群から選択される疾患のうちの1つの予防または治療のために意図された薬剤の製造のために用いられ得る。
【０２５５】
前記の癌および腫瘍としては、転移性腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む癌が挙げられる。
【０２５６】
前記の感染性疾患としては、ウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣が挙げられる。
【０２５７】
前記の免疫学的および自己免疫学的関連疾患としては、組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎が挙げられ得る。
【０２５８】
前記の代謝性疾患としては、非免疫関連疾患、例えば肥満症が挙げられ得る。
【０２５９】
前記の中枢神経系の疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病が挙げられ得る。
【０２６０】
前記の疾患および障害は、創傷の治癒、透析患者における貧血、および骨粗鬆症も包含し得る。
【０２６１】
好ましくは本発明の化合物は、ある種のウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリーセル白血病および慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、類癌腫、悪性黒色腫、転移性腎臓癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびにエイズの症例におけるカポジ肉腫のような免疫不全後に出現する腫瘍、ならびに性器疣または性病からなる群から選択される疾患のうちの1つの予防または治療のために意図された薬剤の製造のために用いられ得る。
【０２６２】
実験の部
【実施例１】
【０２６３】
ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含有するヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の、ならびに野生型対照遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のモデリング
第一段階において、その構造がＰＤＢデータベースで利用可能なＩＦＮα−２の構造(コード１ＩＴＦ)から出発して、ソフトウエアModeler（MSI, San Diego, CA）を用いることにより、ＩＦＮα−１７の三次元構造を構築した。
【０２６４】
次に、突然変異Ｇ４５Ｒを再現するような方法で、成熟ポリペプチド断片を修飾した。プログラムＡＭＢＥＲおよびＤＩＳＣＯＶＥＲ（MSI: Molecular Simulations Inc.）を用いることにより、この突然変異化断片に関して、多数の分子最小化過程を実行した。
【０２６５】
次に、2回の分子動力学計算実施を、同一プログラムおよび同一力場を用いて実行した。
【０２６６】
各々の場合、50,000過程を300°Ｋで算定し、300平衡過程により終結させた。
【０２６７】
このモデリングの結果を、図１Ａおよび１Ｂで可視化する。
【実施例２】
【０２６８】
酵母における天然野生型ＩＦＮα−１７およびＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の発現
ａ）真核生物発現ベクターｐＰｉｃＺα−ｔｏｐｏ中での天然野生型ＩＦＮα−１７および突然変異化ＩＦＮα−１７のクローニング
天然野生型ＩＦＮα−１７およびＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の成熟部分をコードするヌクレオチド配列を、ＳＮＰに関するヘテロ接合体である個体からの鋳型ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲにより増幅する。
【０２６９】
このような増幅を可能にするＰＣＲプライマーを以下に示す：
配列番号６：センスプライマー：TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
配列番号７：アンチセンスプライマー：TCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC
メタノールにより誘導可能なハイブリッドプロモーターＡＯＸ１の制御下で、ＰＣＴ産物を真核生物発現ベクターｐＰｉｃＺα−ＴＯＰＯ中に挿入する(ＴＯＰＯ^TM−クローニング；Invtrogen Corp.)。
【０２７０】
このベクターは、酵母Pichia pastoris中での真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
【０２７１】
組換えタンパク質をコードするベクターの領域のヌクレオチド配列の検査後、ベクターをＰｍｅ１制限酵素により線状化し、P. pastoris酵母株(Invitrogen)をこれらの組換え発現ベクターで形質転換する。
【０２７２】
ｂ）酵母Pichia pastoris中での異種発現ならびに野生型ＩＦＮα−１７およびＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質の精製
野生型ＩＦＮα−１７タンパク質をコードするクローンまたはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質をコードするクローンを含有するＢＭＧＹ培地（2％ペプトン、1％酵母抽出物、1.34％ＹＮＢ、1％グリセロール、100 mMリン酸カリウム、0.4 mg/Lビオチン、ｐＨ6.0）50 mLの2回の飽和予備培養を、200回転／分（rpm）の撹拌で、30℃で24〜48時間実行した。
【０２７３】
培養が飽和細胞密度（600 nmの波長で測定された光学濃度12に対応する）に達したら、それを用いて、5 OD/mLでＢＭＭＹ培地（2％ペプトン、1％酵母抽出物、1.34％ＹＮＢ、0.5％メタノール、100 mMリン酸カリウム、0.4 mg/Lビオチン、ｐＨ6.0）250 mL 250 mLに接種する。
【０２７４】
次に、180 rpmで培養フラスコを撹拌しながら、30℃で24時間、最終濃度1％のメタノールにより、タンパク質の発現を誘導する。
【０２７５】
コード配列の上流の「α因子」のシグナルペプチド配列の存在のために、タンパク質は、培地中で酵母により分泌される。α因子は、プロセシング中に自然に切断される。
【０２７６】
懸濁液を遠心分離し、得られた上清から出発して、ＨＰＬＣにより、タンパク質を精製する。
【０２７７】
開始前段階では、限外濾過（Labscale, 切断5000 Da, Millipore）とその後の透析は、50 mMトリス−Ｃｌ、ｐＨ9.0、25 mMＮａＣｌの緩衝液中の10倍濃度の酵母上清を可能にする。
【０２７８】
第一クロマトグラフィー処理過程は、ブルーセファロースカラム（Amersham Pharmacia）上の親和性によるタンパク質回収を可能にする。収集分画中のタンパク質の存在を、一方でＳＤＳ ＰＡＧＥ型の電気泳動により、そして他方ではＩＦＮα−１７タンパク質に対して向けられる特異的抗体による免疫検出により立証する。この段階では、当該タンパク質の純度は75％より高い。
【０２７９】
第二精製過程では、ゲル濾過は、50 mMトリス、ｐＨ9.0、25 mMＮａＣｌに対するＩＦＮα−１７タンパク質に対応する収集分画の緩衝液交換を可能にする。
【０２８０】
精製の最終過程は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でのタンパク質の分離からなる。
【０２８１】
組換えタンパク質を含有する分画を、トリス50 mM、ｐＨ9、ＮａＣｌ25 mM緩衝液中で予め平衡させた陰イオン交換カラム（ResourceＱ6.0 mL、Pharmacia）上に注入する。トリス50 mM、ｐＨ9緩衝液中での0.025および1 MＮａＣｌ間の勾配の移動により、タンパク質の溶離を実行する。
【０２８２】
当該タンパク質の純度をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で概算し、そして濃度計（Quantity one, Biorad）およびＢＣＡ検定（ビシンコニン酸および硫酸銅、Sigma）によりタンパク質濃度を測定した。
【０２８３】
このプロトコールにより生成され、より多量のタンパク質を製造するために終局的に増大された精製野生型ＩＦＮα−１７およびＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質を、下記の機能的試験のために用いる。
【実施例３】
【０２８４】
天然野生型ＩＦＮα−１７およびＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の免疫調整活性の評価
ＩＦＮ型(ＩＦＮαおよびＩＦＮβ)は、免疫系のある種の機能を調整し得る。それらは、樹状細胞(ＤＣ)成熟を増大することが実証されている：ＭＨＣクラスＩ(ＨＬＡ−ＡＢＣ)およびＩＩ(ＨＬＡ−ＤＲ)分子の発現における増大、Ｔリンパ球、ＣＤ８０、ＣＤ86およびＣＤ８３分子の同時刺激に関与する分子の発現における増大、ならびにＴリンパ球の刺激機能における増大。
【０２８５】
ａ）樹状細胞成熟に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の作用
先ずＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の免疫調整活性を樹状細胞成熟に関して調べ、市販イントロンＡ物質の代表として選択された野生型ＩＦＮα−2と比較した。
【０２８６】
そうするために、樹状細胞を先ず、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４サイトカインの存在下で培養した成体末梢血単球から生成した。ＣＤ１４＋細胞精製キットを用いた精製後、これらの樹状細胞を100 ng/mLの野生型ＩＦＮα−２またはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の存在下に置いて、それらの表現型を、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、ならびにＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＤ１ａマーカーの発現を調べることを目指すＦＡＣＳ分析により確定した。これらの樹状細胞の成熟状態も、非刺激化樹状細胞を有する対照を提供するためにＩＦＮα処理をせずに得られたものと比較した。
【０２８７】
各マーカーに関する、そして3つの実験条件に関する蛍光強度の測定値の中央値を、以下の表に示す：
【０２８８】
【表１】

【０２８９】
この試験の結果は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質が樹状細胞成熟を刺激し得ることを実証する。
【０２９０】
ｂ）Ｔリンパ球によるサイトカイン放出に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の作用
突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質の存在下に置かれたＴ細胞によるサイトカイン放出を測定することにより、そして攻撃に対する免疫応答を模倣するために強力抗原(ＳＥＢ)を用いてまたは用いずに、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の免疫調整活性も調べた。この試験は、対照として用いられそしてイントロンＡ市販物質の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下でも実施した。
【０２９１】
そうするために、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)を健常ドナーから単離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体またはＳＥＢを含有する適切な培地中で16時間刺激した。各培養中に、4 μg/mLの野生型ＩＦＮα−２またはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７を付加した。刺激後、リンパ球を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ６９抗体または抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６９抗体を用いて細胞外標識し、そしてＴｈ１型サイトカイン(ＩＦＮ−γ)またはＴｈ２型サイトカイン(ＩＬ−１０)に対して向けられる特異的抗体を用いて細胞内標識した。蛍光細胞を、FACScaliburおよびCellQuestソフトウエアを用いて分析した。
【０２９２】
得られた結果は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７および野生型ＩＦＮα−２はＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ放出を刺激せず、したがってＳＥＢの非存在下でＴリンパ球を活性化しない、ということを示す。
【０２９３】
それに対比して、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７および野生型ＩＦＮ−２は、以下の表に示したように、ＳＥＢ活性化Ｔリンパ球によるサイトカイン(ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ)放出を刺激する。この表は、それぞれＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球に関するＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞またはＣＤ８＋ＣＤ６９細胞のパーセンテージ、ならびに全細胞におけるＣＤ６９＋細胞のパーセンテージとして表される、ＳＥＢの存在下でのＴリンパ球によるサイトカイン放出を示す。
【０２９４】
【表２】

【０２９５】
これらの結果は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７が、ＳＥＢ抗原により予め活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出(ＩＦＮγおよびＩＬ−１０)を強力に刺激する、ということを明らかに実証する。この試験では、ＣＤ４＋Ｔリンパ球によるインターフェロンγ産生は野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の存在下においてより高く、そしてＣＤ８＋Ｔリンパ球によるインターフェロンγおよびＩＬ−１０産生は野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の存在下でより高い。
【０２９６】
ｃ)単球によるサイトカイン放出に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の作用
最後に、細菌毒性作用物質(ＬＰＳ)の非存在下または存在下での単球によるサイトカイン放出を測定することにより、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の免疫調整活性を調べた。この試験は、対照として用いられそしてイントロンＡ市販物質の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下でも実施した。
【０２９７】
そうするために、ヒト末梢血単核球(ＰＢＭＣ)を健常ドナーから単離し、それらの表現型を分析して、相対量のＣＤ６４＋ＣＤ４ｄｉｍ細胞を確定した(ＣＤ６４およびＣＤ４ｄｉｍは、血液単球のためのマーカーである)。一夜培養後、これらのＰＢＭＣを培地単独（非刺激細胞）中で、またはＬＰＳの存在下で（刺激細胞）インキュベートした。各培養中に、4 μg/mLの野生型ＩＦＮα−２またはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７を付加した。培養後、細胞を、抗ＣＤ６４および抗ＣＤ４ｄｉｍを用いて細胞外標識し、そしてＴｈ１型サイトカイン(ＩＦＮ−α)、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０に対して向けられる特異的抗体を用いて細胞内標識した。
【０２９８】
蛍光細胞を、FACScaliburおよびCellQuestソフトウエアを用いて分析した。
【０２９９】
得られた結果は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７および野生型ＩＦＮα−２は、ＬＰＳの非存在下ではサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−α）放出を刺激しない、ということを示す。
【０３００】
それに対比して、ＬＰＳの存在下では、単球はサイトカインを放出する。ＬＰＳの存在下での単球によるＩＬ−１０およびＩＬ−１２放出はさらに、以下の表に示したように、野生型ＩＦＮα−２の存在下では増大されるが、しかしＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の存在下では相ではない。この表は、ＣＤ６４＋ＣＤ４ｄｉｍ細胞のパーセンテージ、ならびに全細胞におけるＣＤ４ｄｉｍＣＤ６４＋細胞のパーセンテージとして表される、ＬＰＳの存在下での単球によるサイトカイン放出を示す。
【０３０１】
【表３】

【０３０２】
したがって、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７およびＬＰＳの存在下で観察された相乗作用の非存在下は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７が免疫抑制作用を有し得る、ということを示唆する。
【実施例４】
【０３０３】
ＴＦ−１赤白血病細胞株に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７のin vitro抗増殖活性の評価
Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の作用を、ＴＦ−１赤白血病細胞株においても評価した。この試験も、対照として用いられそしてイントロンＡ市販物質の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下で実施した。
【０３０４】
そうするために、ＴＦ−1細胞を漸増濃度の突然変異化ＩＦＮα−２１または野生型ＩＦＮα−２（0.001〜1000 ng/mL）と接触して置いて細胞増殖を測定した。
【０３０５】
図２に提示した結果は、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７がＴＦ−１細胞に及ぼす弱抗増殖作用を有し、そしてこの作用は野生型ＩＦＮα−２の作用と類似することを示すが、これは、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の血液学的毒性が野生型ＩＦＮα−２より高くないことを示唆する。
【実施例５】
【０３０６】
ヒトダウディ バーキットリンパ腫細胞株の抗増殖を誘導するＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の能力の評価
2つの異なるＩＦＮα−１７タンパク質、即ちＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７および天然野生型ＩＦＮα−１７に関して、これらの試験を実行した。ＲＰＭＩ1640培地（10％ウシ胎仔血清および2 mMのＬ−グルタミンを補足）中で予め培養した細胞（ヒトダウディ バーキットリンパ腫細胞株、本明細書中では以後、「ダウディ細胞」と呼ぶ）を、4.10⁴細胞／ウエルの細胞密度で、96ウエルプレート中に接種した。
【０３０７】
各ウエル中では、ダウディ細胞を漸増濃度の天然野生型ＩＦＮα−１７またはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質と接触して置いた。
【０３０８】
試験したＩＦＮα−１７(天然野生型または突然変異化タンパク質)の濃度は、0.003 Pm〜600 nM(ウエル中の最終濃度)に含まれる。
【０３０９】
次にダウディ細胞を5％ＣＯ₂下で37℃で66時間インキュベートし、その後、アプティブルーUptiblue（Uptima）を培養に付加した。4時間の付加的インキュベーション時間後の590 nm(励起560 nm)で発光される蛍光を測定することにより、細胞増殖速度を定量する。
【０３１０】
天然野生型ＩＦＮα−１７またはＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖活性は、細胞増殖の50％を阻害するＩＦＮα−17の濃度（ピコモル（pM））に対応するＩＣ50の測定値に基づいている。
【０３１１】
4つの同様の実験を実行し、各々、4回反復した。各実験に関して、ＩＣ50値を以下の表に記述する：
【０３１２】
【表４】

【０３１３】
野生型ＩＦＮα−１７に関して測定された平均ＩＣ50値は0.49 pMであり、一方、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７に関して測定された平均ＩＣ50値は5.31 pMである。したがって天然野生型ＩＦＮα−１７に関する値を上回る突然変異化ＩＦＮα−１７に関するＩＣ50の値に対応する平均比は、10.80に達する(標準偏差3.46)。
【０３１４】
この試験は、野生型ＩＦＮα−１７との比較により、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の場合、細胞抗増殖活性が強度に抑制される(約5分の1〜15分の1の範囲)、ということを実証する。
【０３１５】
ダウディ細胞増殖に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖作用を野生型ＩＦＮα−２の作用と比較するために、野生型ＩＦＮα−2を用いた同様の非依存性実験も実施した。そうするために、ダウディ細胞を、0.001〜10 ng/mLの範囲のＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７または野生型ＩＦＮα−２の濃度の存在下で培養した。
【０３１６】
3つの同様の実験を実行した。代表的一実験結果を、表3に示す。
【０３１７】
これらの結果は、ダウディ バーキット細胞株におけるＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の細胞抗増殖活性が野生型ＩＦＮα−２の場合より高い、ということを実証する。
【実施例６】
【０３１８】
Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗ウイルス活性の評価
ＩＦＮは、抗ウイルス防御において重要な役割を演じる。ＩＦＮ抗ウイルス活性は、一部は、以下のようなＩＦＮ誘導性酵素系に帰因する：
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する酵素である２‘５’オリゴアデニレートシンテターゼ。これらのオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＬを活性化し、これが一旦活性化されたウイルスＲＮＡを破壊する。
【０３１９】
−ウイルス転写体の合成および／または成熟を抑制するＭｘタンパク質(ＧＴＰアーゼ)。この活性は主に、インフルエンザウイルスにおいて発揮される。
【０３２０】
−二本鎖ＲＮＡにより活性化されるＰＫＲタンパク質(またはｐ６８キナーゼ)。活性化ＰＫＲはタンパク質合成を阻害する。
【０３２１】
ＩＦＮ抗ウイルス活性は、その他のメカニズム、例えばレトロウイルスの場合には、細胞中へのウイルス粒子進入抑制、複製、結合、粒子の流出およびウイルス粒子の感染力によっても誘導される。
【０３２２】
最後に、ＩＦＮは、免疫系のある種の機能を調整することにより、特に細胞媒介に対する応答を促進する(例えばＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の増大、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ産生の増大、ＣＴＬ活性の増大等)ことにより、間接的抗ウイルス活性を発揮する。
【０３２３】
Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗ウイルス活性は、細胞培養中でin vitroに、そしてマウスモデルにおいてin vivoに評価されている。両試験を、対照として用いられ、イントロンＡ市販物質の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２と平行して実行した。
【０３２４】
ａ）細胞培養中でのin vitro抗ウイルス活性
この検定は、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)を用いた細胞培養中でのＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７および野生型ＩＦＮα−２の抗ウイルス活性の評価を可能にする。
【０３２５】
そうするために、ＷＩＳＨヒト上皮細胞を、漸減濃度のＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７または野生型ＩＦＮα−２の存在下で、24時間培養する。次に、さらに24〜48時間、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)のウイルスを細胞に感染させて、細胞溶解を測定する。
【０３２６】
ＶＳＶにより誘導された細胞溶解の50％を抑制するＩＦＮ濃度に対応するＩＣ50値を比較することにより、試験される異なるＩＦＮαの抗ウイルス作用を確定する。
【０３２７】
同様の実験を2回実行し、代表的一実験で測定されたＩＣ50値を以下の表に示す：
【０３２８】
【表５】

【０３２９】
したがって、ＶＳＶに感染した細胞培養において、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７は抗ウイルス活性を示し、このウイルス活性は野生型ＩＦＮα−２の場合より高い。
【０３３０】
ｂ）マウスモデルにおけるin vivoでの抗ウイルス活性
このin vivo試験を、ＥＭＣＶ(脳心筋炎ウイルス)マウスモデルで実施する。
【０３３１】
ヒトＩＦＮは、マウスにおいて用量依存性抗ウイルス活性を示し、これは、概して、同量のマウスＩＦＮにより示されるものの100分の1〜1,000分の1である（Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644）。
【０３３２】
脳心筋炎ウイルス(ＥＭＣＶ)を用いたマウスの腹腔内注入は、中枢神経系関与および脳炎を特徴とする迅速進行性致命的疾患を生じる（Finter NB (1973). Front Biol. 2: 295-360）。マウスおよびヒトインターフェロン−αは、致死的ＥＭＣＶ感染に対してマウスを防御するのに有効であることが示されている（Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19: 145-155）。
【０３３３】
20匹の6週齢Swissマウスの群に、100 x ＬＤ50ＥＭＣＶを腹腔内（ip）感染させて、1時間後に、そしてその後3日間、1日1回、2 μgのＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７または野生型ＩＦＮα−２調製物で処置した。対照群は、賦形剤のみで処置されていた動物を用いて実施した。21日間、生存に関して毎日動物を追跡調査した。
【０３３４】
結果を図4に提示するが、これは、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７で処置されていたマウスの相対生存率が非処置マウスの生存率より非常に高く、野生型ＩＦＮα−2で処置されていたマウスに関して観察されたものより高くさえある、ということを示す。これらのデータは、マウスモデルにおけるin vivoでのＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の強力な抗ウイルス活性を実証する。
【０３３５】
これらの結果はすべて、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７が独自の生物学的特性を保有することを実証する。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】図１Ａは、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを含む本発明のコードタンパク質および野生型ＩＦＮα−１７タンパク質のモデルを表す。図１Ｂは、図１Ａで表されたタンパク質の各々の下方部分のモデルの大写しを表す。
【０３３７】
図１Ａおよび１Ｂにおいて、黒色リボンは野生型ＩＦＮα−１７タンパク質の構造を表し、白色リボンはＧ２２Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質の構造を表す。
【図２】ＴＦ−１細胞株に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖作用を測定するための試験結果を表す。この図では、横座標はＩＦＮα（ng/mL）の濃度に対応し、縦座標は細胞増殖の抑制（％）に対応する。Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖作用（黒色菱形）は、野生型ＩＦＮα−２の作用（白色四角形）と比較される。
【図３】ダウディ バーキット細胞株に及ぼすＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖作用を測定するための試験結果を表す。この図では、横座標はＩＦＮα（ng/mL）の濃度に対応し、縦座標は細胞増殖の抑制（％）に対応する。Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７の抗増殖作用（黒色菱形）は、野生型ＩＦＮα−２の作用（白色正方形）と比較される。
【図４】野生型ＩＦＮα−２で処理されたもの、または処置されていなかったものとの比較における、ＶＳＶウイルスによりあらかじめ感染され、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７タンパク質で処置されたマウスの生存率を表す。
【０３３８】
この図では、横座標は生存時間（日）に対応し、縦座標はＶＳＶ感染マウスの相対的生存率に対応する。黒色菱形はＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７で処置されたＶＳＶ感染マウスに関するデータを表し、黒色正方形は野生型ＩＦＮα−２で処置されたＶＳＶ感染マウスに関するデータを表し、そして中白三角形は処置されなかったＶＳＶ感染マウスに関するデータを表す。

Claims (47)

1. 以下の：
   ａ)配列番号１のヌクレオチド配列であるが、但しこのようなヌクレオチド配列はｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含む；または
   ｂ)ａ）下のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列
   の全部または一部を含む単離ポリヌクレオチド。
2. 配列番号１のヌクレオチド６３９〜１２０８を含むが、但し当該配列がｇ７７１、８０８Ｉｎｓ（ａ）から成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを含有する請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
3. 前記ポリヌクレオチドが少なくとも10のヌクレオチドで構成される請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
4. 配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、コードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
5. 配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
6. 前記アミノ酸がコードＳＮＰ、Ｇ４５Ｒも含有することを特徴とする請求項５記載のポリヌクレオチド。
7. 配列番号１のヌクレオチド配列との80〜100％同一性を有するポリヌクレオチドの全部または一部を同定または増幅するための方法であって、適切なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることを包含し、前記ポリヌクレオチドが請求項１記載のポリヌクレオチドを含む方法。
8. 配列番号１のヌクレオチドと80〜100％同一性を有するポリヌクレオチドの全部または一部をゲノタイプ化するための方法であって、被験者または被験者集団のゲノムＤＮＡ中の注目の領域を増幅し、そして７７１、８０８からなる群から選択される配列番号１のヌクレオチド中の少なくとも１つの位置における対立遺伝子を確定する過程を包含する方法。
9. ゲノタイプ化がミニシーケンシングにより実行される請求項８記載の方法。
10. 請求項１記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
11. 請求項１０記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
12. ポリペプチドの分離方法であって、培地中で請求項１１記載の宿主細胞を培養し、そして培地から前記ポリペプチドを分離することを包含する方法。
13. 請求項１記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
14. 配列番号２のアミノ酸の全部または一部を含み、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド。
15. 配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜１８９を含み、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する請求項１３記載のポリペプチド。
16. 配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含む単離ポリペプチド。
17. 配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜５７を含む請求項１６記載のポリペプチド。
18. 配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸２４〜５７を含み、コードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する請求項１６記載のポリペプチド。
19. 免疫特異的抗体を得るための方法であって、請求項１３記載のポリペプチドで動物を免疫感作し、そして前記動物から前記抗体を収集することを包含する方法。
20. 請求項１９記載の方法に起因する免疫特異的抗体。
21. 試験される１つまたはそれ以上の化合物から配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、ＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチドの活性を活性化または阻害する作用物質を同定する方法であって、以下の：
    ａ）請求項１０記載の組換えベクターを含む宿主細胞を提供し、
    ｂ）前記宿主細胞と試験される前記化合物とを接触させ、
    ｃ）前記ポリペプチドの活性に及ぼす活性化または阻害作用を確定し、それにより前記活性剤または阻害剤が同定される
    ことを包含する方法。
22. 試験されるべき１つまたはそれ以上の化合物からその活性が配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含みそしてＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチドにより強化または抑制される作用物質を同定する方法であって、以下の：
    ａ）請求項１０記載の組換えベクターを含む宿主細胞を提供し、
    ｂ）前記宿主細胞と試験される前記化合物とを接触させ、
    ｃ）前記作用物質の活性に及ぼす強化または抑制作用を確定し、それにより前記強化または抑制剤が同定される
    ことを包含する方法。
23. 試験される１つまたはそれ以上の化合物から配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含み、おそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒも有する単離ポリペプチドの活性を活性化または阻害する作用物質を同定する方法であって、以下の：
    ａ）請求項１０記載の組換えベクターを含む宿主細胞を提供し、
    ｂ）前記宿主細胞と試験される前記化合物とを接触させ、
    ｃ）前記ポリペプチドの活性に及ぼす活性化または阻害作用を確定し、それにより前記活性剤または阻害剤が同定される
    ことを包含する方法。
24. 試験されるべき１つまたはそれ以上の化合物からその活性が配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含みそしておそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒも有する単離ポリペプチドにより強化または抑制される作用物質を同定する方法であって、以下の：
    ａ）請求項１０記載の組換えベクターを含む宿主細胞を提供し、
    ｂ）前記宿主細胞と試験される前記化合物とを接触させ、
    ｃ）前記作用物質の活性に及ぼす強化または抑制作用を確定し、それにより前記強化または抑制剤が同定される
    ことを包含する方法。
25. 被験者の生物学的特性の分析方法であって、以下の：
    ａ）被験者のゲノム中の請求項１記載のポリヌクレオチドの存在または非存在を確定し、
    ｂ）被験者における請求項１記載のポリヌクレオチドの発現レベルを確定し、
    ｃ）被験者における請求項１３記載のポリペプチドの存在または非存在を確定し、
    ｄ）被験者における請求項１３記載のポリペプチドの濃度を確定し、あるいは
    ｅ）被験者における請求項１３記載のポリペプチドの機能性を確定する
    過程のうちの少なくとも１つを実行することを包含する方法。
26. ｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含む配列番号１のヌクレオチドの全部または一部を含む単離ポリペプチド、または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含む宿主細胞；配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしてＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしておそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドのうちの１つに特異的である抗体、からなる群から選択される１つまたはそれ以上の化合物を含む治療薬。
27. 癌および腫瘍、感染性疾患、免疫学的および自己免疫学的関連疾患、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患ならびに化学療法処置と関連した障害からなる群から選択される疾患を個体において予防または治療するための方法であって、治療的有効量の請求項２６記載の作用物質と製薬上許容可能な賦形剤とを前記個体に投与することを包含する方法。
28. 前記癌および腫瘍が転移性腎臓癌、黒色腫、濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む請求項２７記載の方法。
29. 前記代謝性疾患が非免疫関連疾患、例えば肥満症を含む請求項２７記載の方法。
30. 前記感染性疾患が慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むウイルス感染、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含む請求項２７記載の方法。
31. 前記中枢神経系の疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病を含む請求項２７記載の方法。
32. 前記免疫学的および自己免疫学的関連疾患が組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎を含む請求項２７記載の方法。
33. 創傷の治癒、透析患者における貧血、および／または骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を個体において予防または治療するための方法であって、治療的有効量の請求項２６記載の作用物質と製薬上許容可能な賦形剤とを前記個体に投与することを包含する方法。
34. 請求項１３記載のポリペプチドの被験者における活性を増大または低減するための方法であって、配列番号１のヌクレオチドの全部または一部を含む単離ポリヌクレオチドであるが、但し、ヌクレオチド配列がｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含むポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含み、治療される前記被験者から得られたものであってよい宿主細胞；配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしてＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしておそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドのうちの１つに特異的である抗体、のうちの１つまたはそれ以上の治療的有効量と製薬上許容可能な賦形剤を投与することを包含する方法。
35. 請求項１記載のポリヌクレオチドの前記個体のゲノム中での存在に関連した障害または疾患を個体において予防または治療するための方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列の全部または一部を含み、そしてｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを有する単離ポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；前記ポリヌクレオチドのうちの１つを含む組換えベクター；前記組換えベクターを含む宿主細胞；配列番号２のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしてＳＮＰ Ｇ４５Ｒを有する単離ポリペプチド；配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含み、そしておそらくはコードＳＮＰ Ｇ４５Ｒも有する単離ポリペプチド；前記ポリペプチドのうちの１つに特異的な抗体、のうちの１つまたはそれ以上の治療的有効量と製薬上許容可能な賦形剤を投与することを包含する方法。
36. ＩＦＮα−１７遺伝子中のｇ７７１、８０８Ｉｎｓ（ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと疾患または疾患に対する耐性との間の統計学的に関連性を確定するための方法であって、以下の：
    ａ）個体の群をゲノタイプ化し、
    ｂ）前記個体群内の前記疾患または疾患に対する耐性の分布を確定し、
    ｃ）ゲノタイプデータを前記疾患または疾患に対する耐性の分布と比較し、そして
    ｄ）統計学的関連性に関して前記比較を分析する
    過程を包含する方法。
37. 疾患の予後または疾患に対する耐性を診断または確定するための方法であって、ＩＦＮα−１７遺伝子中のｇ７７１ｃ、８０８Ｉｎｓ（ａ）から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを検出することを包含する方法。
38. 試験される１つまたはそれ以上の化合物からのＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７遺伝子産物の活性と実質的に同様の生物学的活性を有する一化合物の同定方法であって、以下の：
    ａ）前記化合物の生物学的活性、例えば樹状細胞成熟、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、ＴＦ−１細胞株における細胞抗増殖活性、ダウディ バーキット細胞株における細胞抗増殖活性、in vitroまたはin vivo抗ウイルス活性を確定し、
    ｂ）前記化合物の過程ａ)で確定された活性とＧ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７遺伝子産物の活性とを比較し、
    ｃ）過程ｂ)で実行された比較に基づいて、Ｇ４５Ｒ突然変異化ＩＦＮα−１７遺伝子産物の場合と比較して、前記化合物が実質的に同様の活性を有するか、あるいはそれより低いまたは高い活性を有するかを確定する
    過程を包含する方法。
39. 前記試験されるべき化合物が合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、ハイスループットスクリーニングから同定されたものであるか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列の位置２４および１８９間に含有されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のポリペプチドの構造と同一の三次元構造を有するようコンピューター支援薬剤設計により設計されたものであり、但し、前記アミノ酸配列はＧ４５Ｒ ＳＮＰを含む請求項３８記載の方法。
40. 請求項３９記載の方法により同定された化合物。
41. 癌および腫瘍、感染性疾患、免疫学的および自己免疫学的関連疾患、心臓血管性疾患、代謝性疾患、中枢神経系疾患ならびに化学療法処置と関連した障害からなる群から選択される疾患を個体において予防または治療するための方法であって、治療的有効量の請求項４０記載の化合物と製薬上許容可能な賦形剤とを前記個体に投与することを包含する方法。
42. 前記癌および腫瘍が転移性腎臓癌、黒色腫、濾胞性リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ヘアリーセル白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頚部、頭部および腎臓の癌、多発性骨髄腫、類癌腫およびエイズの症例におけるカポジ肉腫を含めた免疫不全後に出現する腫瘍を含む請求項４１記載の方法。
43. 前記感染性疾患がウイルス感染、例えば慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、感染性肺炎ならびに性病、例えば性器疣を含む請求項４１記載の方法。
44. 前記免疫学的および自己免疫学的関連疾患が組織または器官移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性結腸炎を含む請求項４１記載の方法。
45. 前記中枢神経系の疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病およびうつ病を含む請求項４１記載の方法。
46. 前記代謝性疾患が非免疫関連疾患、例えば肥満症を含む請求項４１記載の方法。
47. 創傷の治癒、透析患者における貧血、および／または骨粗鬆症からなる群から選択される疾患を個体において予防または治療するための方法であって、治療的有効量の請求項４０記載の化合物と製薬上許容可能な賦形剤とを前記個体に投与することを包含する方法。

Images